VÝZNAM NĚKTERÝCH FAKTORŮ PREANALYTICKÉ FÁZE V MOLEKULÁRNÍ BIOLOGII

Rozměr: px

Začít zobrazení ze stránky:

Download "VÝZNAM NĚKTERÝCH FAKTORŮ PREANALYTICKÉ FÁZE V MOLEKULÁRNÍ BIOLOGII"

Jiřina Slavíková
před 8 lety
Počet zobrazení:

1 VÝZNAM NĚKTERÝCH FAKTORŮ PREANALYTICKÉ FÁZE V MOLEKULÁRNÍ BIOLOGII Plíšková L., Hrochová K., Kutová R. Ústav klinické biochemie a diagnostiky FN Hradec Králové

2 PREANALYTICKÁ FÁZE V MOLEKULÁRNÍ BIOLOGII Preanalytická chyba cokoli, co se objeví před vlastní analýzou a má vliv (zhoršení) na výsledek (53 75 %, Plebani ,9 %) Soustředíme se především na některé faktory, které mají v mol.biologii zásadní vliv na výsledek

na výsledek (53 75 %, Plebani 2007 61,9 %) Soustředíme se

3 TYPICKÉ OBLASTI PREANALYTICKÉ FÁZE K minimalizaci preanalytické variability poskytuje laboratoř svým klientům soubor potřebných informací o přípravě pacienta, odběru materiálu, skladování a transportu vzorku. Příprava pacienta Odběr materiálu Uchování a transport Uchování a úprava vzorku v laboratoři

pacienta, odběru materiálu, skladování a transportu vzorku.

4 PŘÍPRAVA PACIENTA Dieta, fyzická zátěž, stres Načasování odběru monitorování léčby zásadní při odběru krve na průkaz bakterií Informovaný souhlas extrahumánní x humánní genom

5 TYPICKÉ OBLASTI PREANALYTICKÉ FÁZE Příprava pacienta Odběr materiálu Uchování a transport Uchování a úprava vzorku v laboratoři

6 ODBĚR MATERIÁLU identifikace, shoda s žádankou, žádanka. lokalizace odběru důležité u patogenů odběr ze stejného místa jako pro mikroskopii vhodný odběrový materiál - inhibice (heparin, aktivní uhlí, formaldehyd) - vazba na konkrétní metodu (výtěžnost DNA borélie monitorování ) množství odebraného materiálu zvýšení citlivosti, možnost izolace virové DNA, bakteriální DNA, virové RNA

odběrový materiál - inhibice (heparin, aktivní uhlí, formaldehyd) - vazba na konkrétní metodu

7 TYPICKÉ OBLASTI PREANALYTICKÉ FÁZE Příprava pacienta Odběr materiálu Uchování a transport Uchování a úprava vzorku v laboratoři

8 UCHOVÁNÍ A TRANSPORT Interval mezi odběrem vzorku a příjmem do laboratoře uchování před transportem teplota, doba transport forma transportu, teplota, doba souvisí se stabilitou DNA/RNA Obecně platí: teplota 4 8 st. C, do 72 hod, při delším skladování zamrazit (jak poté dodat do laboratoře?)

transportu, teplota, doba souvisí se stabilitou DNA/RNA Obecně platí:

9 UCHOVÁNÍ A TRANSPORT Nejméně validních informací (laboratorní příručky, internet, publikace) Informace v kitech - v rámci protokolu odběr, centrifugace, transport, stabilita, dále izolace, PCR, detekce např. kity Qiagen - artuscmv, artushbv, artushcv plná krev dodat chlazenou, plasma -20 st. C ne heparin - artus EBV, HSV žádná informace experimentální testování stability

10 UCHOVÁNÍ A TRANSPORT EBV (kopie/ml) CMV (kopie/ml) Teplota Den odběru, izolace a PCR 5. den izolace a PCR 2 8 st. C 9x10 4 7x10 4 2x st. C 7x10 2 1x10 3 2x10 3 VZV (Ct) 2 8 st. C 19,27 19,79 16,49 HBV DNA IU/ml 2 8 st. C RT 3x10 4 2x10 4 2x10 4 HCV (IU/ml) 2 8 st. C 5x10 5 8x10 5 5x den izolace a PCR RT 7x10 4-9x10 4 Pravidla Laboratorní příručka - 5 dnů

C 19,27 19,79 16,49 HBV DNA IU/ml 2 8 st.

11 TYPICKÉ OBLASTI PREANALYTICKÉ FÁZE Příprava pacienta Odběr materiálu Uchování a transport Uchování a úprava vzorku v laboratoři

12 UCHOVÁNÍ A ÚPRAVA VZORKU V LABORATOŘI Preanalytická fáze až analytická fáze příjem, centrifugace, alikvotace teplota a doba skladování materiálu (experimentální ověření - předchozí) teplota a doba skladování NA Testování stability DNA u vybraných patogenů pomocí rt PCR, kde je měřitelná hodnota (Ct hodnota nebo absolutní kvantita)

(experimentální ověření - předchozí) teplota a doba skladování NA Testování

13 VLIV SKLADOVÁNÍ (1 ROK) NA STABILITU DNA HSV1 DNA (likvor) Mycobacterium TBC (DNA) Analýza po izolaci DNA Analýzy po skladování měsíců 190 kopií/ml HSV neprokázána opakovaně Ct = 36,48 Ct = 40,12 (cut-off = 38) Testování 30 vzorků.

skladování 12 24 měsíců 190 kopií/ml HSV neprokázána

14 PREANALYTICKÁ FÁZE ANALYTICKÁ FÁZE Kde je hranice? Část preanalytické fáze prováděné v laboratoři zasahuje do vlastní analýzy - průkaz DNA bakterií při léčbě ATB (zvolit centrifugaci) - zvolit vhodnou extrakci pro DNA/RNA (mikroorganismus, typ biolog.materiálu) Informace spolupráce s klinikem

analýzy - průkaz DNA bakterií při léčbě ATB (zvolit centrifugaci) -

15 Odběr materiálu humánní genom dle požadovaného typu vyšetření typ materiálu DNA RNA typ odběrových zkumavek Informace v laboratorní příručce

16 ODBĚR MATERIÁLU - HUMÁNNÍ GENOM vhodný typ odběrového materiálu dle typu vyšetření DNA x RNA DNA - germline mutace, somatické mutace, volná plazmatická DNA nádorová fetální RNA total RNA, small RNA, mirna, expresní profily, mutace nesrážlivá krev/kd- vhodný antikoagulační prostředek EDTA, citrát/ NE heparin suchá výtěrovka/konzervační medium tkáň nativní, fixovaná

total RNA, small RNA, mirna, expresní profily, mutace nesrážlivá krev/kd- vhodný

17 LOKALIZACE ODBĚRU HUMÁNNÍ GENOM Somatické mutace - hematoonkologie KD, periferní krev, uzliny, CSF - onkologie nádorová tkáň, fixovaný nátěr počet nádorových buněk ovlivňuje výsledek vyšetření

18 ODBĚR MATERIÁLU - HUMÁNNÍ GENOM vhodný typ odběrového materiálu dle typu vyšetření DNA x RNA DNA - germline mutace, somatické mutace, volná plazmatická DNA nádorová fetální RNA total RNA, small RNA, mirna, expresní profily, mutace nesrážlivá krev- vhodný antikoagulační prostředek EDTA, citrát/ NE heparin KD, tkáň, CSF,..

DNA nádorová fetální RNA total RNA, small RNA, mirna, expresní profily, mutace

19 TYPICKÉ OBLASTI PREANALYTICKÉ FÁZE- humánní genom Příprava pacienta Odběr materiálu Uchování a transport Uchování a úprava vzorku v laboratoři

20 UCHOVÁNÍ A TRANSPORT interval mezi odběrem vzorku a příjmem do laboratoře Uchování před transportem teplota, doba RNA nesmí se mrazit! Transport forma transportu, teplota, doba definováno v laboratorní příručce dle obecného doporučení dle experimentálních dat

21 TYPICKÉ OBLASTI PREANALYTICKÉ FÁZE Příprava pacienta Odběr materiálu Uchování a transport Uchování a úprava vzorku v laboratoři

22 UCHOVÁNÍ A ÚPRAVA VZORKU V LABORATOŘI - DLE TYPU VYŠETŘENÍ příjem, centrifugace, alikvotace teplota a doba skladování (DNA- stabilní, možné opakovaně mrazit X RNA velmi nestabilní, nemrazit) preanalytika až analytika - prolínání - separace buněk, izolace DNA/RNA, reverzní transkripce) - většina komerčních kitů začíná rt PCR preanalytiku neřeší

23 Stabilita RNA- kvantifikace fúzního transkriptu BCR/ABL metodou rt PCR st. RT čas (h)

24 ZÁVĚR Chyby v preanalytické fázi Rozvoj metod molekulární biologie 21.století Náročné metody Individuální přístup k vzorkům

26 ZÁVĚR Chyby v preanalytické fázi Rozvoj metod molekulární biologie 21.století Náročné metody Individuální přístup k vzorkům Standardizace metod v laboratoři Standardizace metod mezi laboratořemi př.- European LeukemiaNet (ELN) snaha o standardizaci preanalytické fáze u metody kvantifikace fúzního transkriptu BCR/ABL u CML pacientů

27 děkuji Vám za pozornost

Podobné dokumenty

Externí kontrola kvality sekvenačních analýz

Externí kontrola kvality sekvenačních analýz Radka Bolehovská 1, Lenka Plíšková 2, Kateřina Hrochová 2 Úsek molekulární biologie, 1 Ústav klinické mikrobiologie 2 Ústav klinické biochemie a diagnostiky