Úloha cytoskeletu v morfogenezi rostlinných buněk

Transkript

1 Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta Katedra experimentální biologie rostlin Shrnutí dizertační práce Úloha cytoskeletu v morfogenezi rostlinných buněk Lenka Havelková Vedoucí dizertační práce: RNDr. Kateřina Schwarzerová, Ph.D. Praha 2010

2 Práce byla vypracována za podpory následujících grantových projektů: Ministerstvo školství, mládeže a tělovýchovy České republiky: MSM , LC06034, COST OC158 a KONTAKT ME668 Grantová agentura Univerzity Karlovy: 195/2004 Grantová agentura České republiky: 522/06/1030 2

3 1. Úvod Cytoskelet je vysoce dynamická trojrozměrná síť proteinů, která je základní složkou všech eukaryotických buněk. Cytoskeletální vlákna, tj. mikrofilamenta a mikrotubuly, zajišťují přenos signálů, tok informací i stavebního materiálu, pohyb nebo kotvení proteinů a organel v buňce, ale i pohyb celých buněk a organismů. Proteinové polymery cytoskeletu protínají cytoplasmu buněk, kde plní své četné funkce, uplatňují se při dělení buněk, růstu a vývoji pletiv a orgánů. Funkční cytoskeletální síť musí podléhat neustálé reorganizaci. Řízená výstavba, odbourávání a transport podjednotek cytoskeletálních vláken se účastní všech životních projevů buněk. Reorganizace cytoskeletu se účastní i tzv. asociované proteiny, které jsou nezbytné pro jeho správnou funkci. Cytoskelet je struktura velmi konzervovaná, většina poznatků platí tedy pro živočišné i rostlinné buňky, existují však i funkce a struktury typické pouze pro rostliny. Cytoskelet se účastní veškeré morfogeneze rostlin (pro přehled viz Mathur a Hülskamp, 2002). Rostlinné buňky jsou nepohyblivé a jejich uspořádání v pletivech a tvar rostlinných orgánů jsou dány přesně orientovaným dělením a řízeným růstem buněk. Na obou těchto procesech se podílí jak mikrofilamenta, tak mikrotubuly. Cytoskelet současně zajišťuje také buněčnou morfogenezi, tvorbu složitých tvarů jednotlivých, často různě specializovaných buněk (Mathur, 2006). Během všech růstových a vývojových procesů je zároveň nezbytná vzájemná interakce a koordinace obou zúčastněných cytoskeletálních struktur. Té se účastní některé proteiny asociované s cytoskeletem (pro přehled viz Petrášek a Schwarzerová, 2009). Protože jsou rostliny jako celek organizmy vázané na jedno stanoviště, jsou na flexibilitu cytoskeletu kladeny vysoké nároky také z hlediska reakce na podněty z prostředí. Díky své významné úloze v buňkách cytoskelet je velmi intenzivně studován. Rozvoj poznatků umožnil zejména nástup moderních biochemických, mikroskopických a zvláště molekulárně biologických metod. Ale právě kvůli obrovské šíři dějů, kterých se cytoskelet účastní, zůstává stále řada neznámých. V této práci jsem se pokusila přispět k objasnění úlohy cytoskeletu a proteinů s ním spolupracujících v několika situacích dotýkajících se morfogeneze rostlinných buněk i celistvých rostlin. Práce je členěna do čtyř nezávislých kapitol, jejichž pojítkem je úloha cytoskeletu v různých morfogenních procesech, jimiž jsou interakce mikrofilament a mikrotubulů, působení růstového retardantu ancymidolu v kontextu tvorby buněčné stěny, role aktinu ve vývoji somatických embryí a její ovlivnění latrunkulinem B a reakce buněk kořenů na toxické působení hliníku. 3

4 2. Úloha ARP2/3 komplexu v interakci mikrofilament a mikrotubulů Mikrofilamenta a mikrotubuly tvoří v buňce dvě nezávislé a přesto velice úzce provázané sítě, jejichž vzájemná interakce je oblastí s řadou neznámých. ARP2/3 je konzervovaný proteinový komplex, složený se sedmi podjednotek, asociovaný s mikrofilamenty (Goley a Welch, 2006; Mathur, 2005). Jeho primární funkce je spojena s dynamikou aktinové sítě (nukleace, větvení vláken aktinu), ale zdá se, že ARP2/3 komplex by mohl být zapojen i do interakce mezi mikrofilamenty a mikrotubuly. Ke studiu funkce a lokalizace tohoto komplexu u rostlin jsem využila jednu z jeho podjednotek, protein ARPC2, který by mohl být pojítkem mezi mikrofilamenty a mikrotubuly, a tabákovou buněčnou linii BY-2. Z buněk BY-2 byla získána sekvence NtARPC2, která byla dále využita k izolaci proteinu, přípravě protilátky a fúzována s GFP. Fúzní protein GFP-APRC2 tranzientně overexprimovaný v buňkách BY-2 vytvářel síť vláken, která částečně kolokalizovala s mikrotubuly, méně však s aktinem. Kosedimentační analýza proteinu ARPC2 s aktinem a mikrotubuly in vitro ukázala, že protein ARPC2 je schopen přímé vazby jak na aktinová filamenta, tak na mikrotubuly. Vizualizace ARPC2 a ARP2 podjednotek ARP2/3 komplexu v buňkách BY-2 pomocí nepřímé imunofluorescence ukázala jejich lokalizaci ve formě drobných, charakteristicky uspořádaných teček, které dekorovaly mikrofilamenta a kolokalizovaly i s mikrotubuly. Uvedené výsledky naznačují, že ARP2/3 komplex má kromě své nukleační aktivity ještě další funkce. Mohl by sloužit jako kroslinkující faktor mezi aktinem a mikrotubuly. Za vazbu na mikrotubuly by pak mohla být přímo zodpovědná ARPC2 podjednotka komplexu. 3. Ancymidol jako inhibitor biosyntézy celulózy Ancymidol je retardant rostlinného růstu s inhibičním účinkem na biosyntézu giberelinů, jehož hlavním efektem je redukce dlouživého růstu rostlin. Byla však popsána také tvorba tvarových malformací ke giberelinům necitlivých buněk BY-2 vlivem působení ancymidolu (Boříková et al., 2003). Protože tvar udává rostlinným buňkám buněčná stěna, zaměřili jsme při studiu působení ancymidolu právě na ni. Majoritní složka buněčné stěny, celulóza, je syntetizována vně buněk celulóza-syntázovými komplexy (Cosgrove, 2005). Jejich pohyb a s ním související směr ukládání celulózních mikrofibril buněčných stěn je řízen mikrotubulárním cytoskeletem (Wasteneys a Fujita, 2006). Ke studiu na giberelinech nezávislého mechanizmu účinku ancymidolu byly využity buňky BY-2 a semenáčky tabáku Nicotiana benthamiana. Ancymidol způsoboval v koncentracích µm tvarové změny buněk BY-2. Míra těchto změn byla úměrná použité koncentraci, s přibývajícím počtem a velikostí malformací klesala viabilita buněk. V 1 mm koncentraci ancymidolu však nedocházelo k tvorbě výdutí, ale k 4

5 inhibici prodlužovacího růstu buněk a poruchám tvorby nové buněčné přepážky po rozdělení buněk. Tyto efekty ancymidolu nesouvisely s jeho antigiberelinovým působením. Vliv ancymidolu na buňky BY-2 byl velice podobný vlivu běžně používaných inhibitorů syntézy celulózy (isoxabenu, DCB). V malformovaných částech buněk BY-2 byla poškozena jednak orientace mikrotubulů a jednak ukládání celulózních mikrofibril. Vzniku malformací nebylo možné zabránit stabilizací mikrotubulů taxolem. Ancymidol také inhiboval biosyntézu celulózy v protoplastech buněk BY-2. Ancymidol má tedy dvojí roli, je inhibitorem biosyntézy giberelinů v rostlinách a zároveň působí na giberelinech zcela nezávisle jako jako inhibitor syntézy celulózy. 4. Úloha izoforem aktinu v somatické embryogenezi smrku Somatická embryogeneze je proces vzniku embryí ze somatických, který odpovídá svými vývojovými fázemi embryogenezi zygotické, a používá se jak ke studiu embryogeneze, tak k množení různých užitkových rostlin (von Arnold et al., 2002). Je to velice komplexní proces, ovlivňovaný mnoha endogenními i exogenními faktory, při kterém dochází k vývoji embrya přesně lokalizovaným dělením, růstem, diferenciací a řízeným odumíráním buněk. Všechny tyto procesy jsou velice úzce spjaty s dynamikou cytoskeletu. V řízení polarity buněk, dělení, růstu, transportu i programované buněčné smrti hraje důležitou roli aktin (Smertenko et al., 2003). V různých fázích vývoje embrya a rostliny se uplatňují různé izoformy aktinu i četné asociované proteiny. Aktinové drogy, jakou je latrunkulin B (Morton et al., 2000), depolymerují aktin v buňkách, ale mohou být i výborným nástrojem ke studiu embryogeneze, jejímu ovlivnění i případnému komerčnímu využití. Jako materiál pro výzkum embryogeneze posloužila somatická embrya smrku. Aplikace nízkých dávek latrunkulinu B ( nm) během maturace somatických embryí způsobovala odumření buněk suspenzorů, zatímco buňky meristematických center ošetření přežívaly. To naznačilo různou citlivost aktinu v těchto dvou typech buněk. Ošetření latrunkulinem ve výsledku urychlilo vývoj dobře vyvinutých embryí a eliminovalo embrya nedostatečně vyvinutá. Byly izolovány čtyři smrkové geny pro aktin. Analýzou jejich exprese během maturace byly odhaleny tři izoformy, které jsou exprimovány více v buňkách suspenzoru a jejichž exprese v průběhu maturace klesá. Tento pokles byl významnější po ošetření latrunkulinem B. Sekvenční analýza ukázala substituci aminokyselin v oblasti vazebného místa pro latrunkulin B v jedné z izoforem aktinu specifických pro suspenzor, která může měnit vazebnou afinitu izoformy k latrunkulinu. 5

6 Latrunkulin B urychloval zrání studovaných embryí smrku a pomáhal selektovat embrya bez vývojových vad, a to přednostní degradací citlivého aktinu suspenzorů a urychlením odumření suspenzoru. 5. Časné projevy toxického působení hliníku na rostliny Kationty hliníku značně limitují růst rostlin na kyselých půdách (vzniklých přirozenou acidifikací nebo v důsledku lidské činnosti). Reakce rostlin na toxické působení hliníku je komplexní proces, kterého se účastní mnoho buněčných struktur a jehož výsledkem je velice rychlá zástava růstu kořene. Vlivem hlinitých iontů a kyselého prostředí dochází ke změnám vlastností buněčné stěny, dynamiky mikrotubulů nebo poškození membrán (Kochian et al., 2005). Která z ovlivněných buněčných struktur je přímo zodpovědná za rychlou zástavu růstu kořene není jasné. V této práci jsme se zaměřili na velmi časné symptomy toxického působení hliníku ve vztahu k mikrotubulárnímu cytoskeletu a plazmatické membráně. Pro tento účel jsme použili hydroponicky pěstované semenáčky Arabidopsis thaliana. Tyto semenáčky vykazovaly omezený růst kořenů již v prvních minutách po ošetření hliníkem. Měření fluidity na izolované plazmatické membráně ukázalo, že hliník způsobuje rychlou rigidizaci membrány, která může být částečně odstraněna aplikací benzylalkoholu, membránového fluidizéru. Aplikace benzylalkoholu na kořeny rostlin ošetřených hliníkem částečně obnovila jejich růst. Byla pozorována inhibice endocytózy v kořenech po 10 minutách a naprostá ztráta endocytózy po 20 minutách působení hliníku. Kortikální mikrotubuly byly hliníkem stabilizovány a naproti tomu působením nízkého ph došlo k jejich rozpadu během 30 minut. Při použití drog ovlivňujících endocytózu a dynamiku mikrotubulů bylo prokázáno, že inhibice endocytózy vedla k zpomalení růstu kořenů, zatímco změna dynamiky mikrotubulů růst kořenů v prvních 30 minutách působení neovlivňovala. Uvedené výsledky ukazují, že hliník způsobuje v první fázi působení značné snížení fluidity membrán a inhibici endocytózy. Oba tyto jevy vedou ve výsledku k rychlé inhibici růstu kořenů. 6. Závěry Byla popsána schopnost proteinu ARPC2, podjednotky ARP2/3 komplexu, vazby na mikrotubulární cytoskelet. Tyto výsledky společně s lokalizačními experimenty proteinů ARPC2 a ARP2 naznačily možnost, že ARP2/3 komplex může být přímým zprostředkovatelem interakce mezi mikrofilamenty a mikrotubuly v procesech spojených s 6

7 přestavbou mikrotubulárního cytoskeletu v koordinaci s růstem závislým na aktinu v rostlinné buňce. Bylo prokázáno, že vliv růstového retardantu ancymidolu na vznik tvarových malformací buněk BY-2 spočívá v jeho dosud nepopsaném inhibičním účinku na syntézu celulózy. Mikrotubulární cytoskelet v tomto procesu hrál pasivní roli a nebyl za tvarové malformace přímo zodpovědný. Bylo zjištěno, že během zrání somatických embryí smrku jsou buňky meristematické a buňky suspenzorové odlišně citlivé vůči latrunkulinu B, a to zřejmě díky odlišnému složení aktinových izoforem v těchto buňkách. Aplikace velmi nízkých koncentrací latrunkulinu B tak vede k selektivní smrti buněk suspenzoru a následně k selekci kvalitních a zdravých embryí. Toxické působení hliníku způsobuje rychlou zástavu růstu kořenů. Bylo zjištěno, že mezi její bezprostřední příčiny patří rigidizace plazmatické membrány kořenových buněk a zástava endocytózy. K časným efektům působení hliníku patří též stabilizace kortikálních mikrotubulů, která nepřispívá k rychlé zástavě růstu kořenů, avšak zřejmě hraje důležitou roli během pozdních efektů působení Al na morfologii kořene. 7

8 8

9 Charles University in Prague Faculty of Science Department of Experimental Plant Biology Summary of the Ph.D. thesis The role of cytoskeleton in morphogenesis of plant cells Lenka Havelková Supervisor: RNDr. Kateřina Schwarzerová, Ph.D. Prague

10 This work was financially supported by following projects: Ministry of Education, Youth and Sports of the Czech Republic: MSM , LC06034, COST OC158 and KONTAKT ME668 Grant agency of Charles University: 195/2004 Czech Science Foundation: 522/06/

11 1. Introduction Cytoskeleton is highly dynamic spatial network of proteins, which is an essential component of eukaryotic cells. Cytoskeletal filaments, i.e. microfilaments and microtubules, mediate the signal transduction, the flow of information and building material, the movement or anchoring of proteins and organelles as well as the movement of whole cells and organisms. Cytoskeleton takes part in the cell division, growth as well as tissues and organs development. Functional cytoskeletal network is a subject of continuous reorganization. Controlled growth, degradation and transport of cytoskeletal subunits are involved in all processes in living cells. Associated proteins are required for proper function and organization of cytoskeletal filaments. Cytoskeleton is a highly conserved structure, therefore, many its structural and functional aspects apply for animal as well as plant cells. However, there are functions and structures specific for plants or animals only. Cytoskeleton is involved in the plant morphogenesis (for review see Mathur a Hülskamp, 2002). Plant cells are non-motile and the organization of their tissues and organs are given by the strict control of oriented cell division and growth. Both microfilaments and microtubules are involved in these processes. Further, cell morphogenesis and development of complex cell shapes of specialized cells are controlled by the cytoskeleton (Mathur, 2006). During all of growth and development processes, the interaction and coordination of involved cytoskeletal structures is required. Proteins associated with the cytoskeleton participate in these processes (for review see Petrášek a Schwarzerová, 2009). Due to its important roles, the cytoskeleton is intensively studied. Modern biochemical, microscopic and molecular methods contributed substantially to our understanding of the cytoskeleton functions. Because of wide range of actions in which cytoskeleton takes part, there is still lot of unanswered questions. In my work I attempted to contribute to elucidation of the role of cytoskeleton and its associated proteins in several situations related to the plant cell and whole plants morphogenesis. This thesis is divided into four independent chapters connected through the role of the cytoskeleton in plant cell morphogenesis. Actin-microtubule interactions, the effect of growth retardant ancymidol in context of cell wall formation, the role of actin in development of Norway spruce somatic embryos, and root cells response to toxic influence of aluminium are studied. 11

12 2. The role of ARP2/3 complex in actin - microtubule interaction Microfilaments and microtubules form two independent but well cooperating networks in cells. Molecular basis of their mutual interactions is not still elucidated. ARP2/3 is a conserved protein complex associated with microfilaments, which consists of seven subunits (Goley a Welch, 2006; Mathur, 2005). Primary function of ARP2/3 complex is connected with actin dynamics, because the complex nucleates and branches actin. ARP2/3 complex, however, is suspected to be involved in actin - microtubule interaction as well. In this work we used the protein ARPC2, one of ARP2/3 complex subunits, to study the function and localization of the plant ARP2/3 complex. Our results suggested that ARPC2 interacts with both actin and microtubules. Nucleotide sequence of NtARPC2 was obtained from BY-2 cells. NtARPC2 was further used for protein isolation, antibody production and fusion with GFP. Fusion protein GFP-APRC2 transiently overexpressed in BY-2 cells formed network of filaments of unknown nature. These filaments partly colocalized with microtubules, however, not with actin filaments. Cosedimentation assay of ARPC2 with actin and microtubules in vitro showed that protein ARPC2 was capable of direct binding to both actin filaments and microtubules. Indirect immunofluorescence visualisation of ARPC2 and ARP2 subunit of ARP2/3 complex showed their localization in fine and characteristically organized dots, which decorated actin filaments and colocalized with microtubules in BY-2 cells. Our results suggest that besides actin nucleation activity of ARP2/3 complex, the complex has also another function in actin-microtubule interaction. It is possible that ARP2/3 complex acts as a cross-linking factor between actin and microtubules and ARPC2 is the component directly responsible for binding to microtubules. 3. Cellulose synthesis inhibitory action of ancymidol impairs plant cell expansion. Ancymidol is a plant growth retardant with inhibitory effect on gibberellins biosynthesis. The main effect of ancymidol action is the reduction of plant elongation. Ancymidol induced cell shape malformations of BY-2 cells, and this action was, however, gibberellins insensitive (Boříková et al., 2003). In the study of ancymidol action we focused on the cell wall and the cytoskeleton, because these structures are responsible for the shaping of plant cells. Cellulose, the major component of cell walls, is synthesised on the cell surface by cellulose-synthase complexes (Cosgrove, 2005). The orientation of deposited cellulose microfibrils is under the control of cortical microtubules (Wasteneys a Fujita, 2006). To study gibberellin - independent mechanism 12

13 of ancymidol action we used BY-2 cells and tobacco Nicotiana benthamiana seedlings as an experimental material. Ancymidol in µm concentrations induced cell shape malformations of BY-2 cells. The size and number of malformations as well as the cell viability decrease was concentrationdependent. The viability of cells decreased with increasing rate of malformations occurrence in the cell culture. Nevertheless, 1 mm ancymidol did not induce cell malformations but inhibited cell elongation and prevented the formation of cell plate between newly divided cells. These effects of ancymidol were independent on gibberellins. Cell shape malformations induced by ancymidol resembled the effect of commonly used inhibitors of cellulose biosynthesis (isoxaben, DCB). In malformed parts of BY-2 cells, orientation of cortical microtubules was changed and the deposition of cellulose microfibrils was impaired. Taxol-mediated stabilisation of microtubules, however, did not prevent the formation of cell shape malformation. In regenerating protoplast of BY-2 cells, ancymidol inhibited cellulose regeneration. Here we report the dual action of ancymidol. Ancymidol inhibits gibberellins biosynthesis in plants. In higher concentrations, however, ancymidol inhibits cellulose synthesis. 4. The role of actin isoforms in somatic embryogenesis in Norway spruce Somatic embryogenesis is defined as a process of embryos formation from somatic cells, whose developmental stages correspond to zygotic embryogenesis. Somatic embryogenesis is widely used for studying of embryogenesis and for vegetative propagation of plants as well (von Arnold et al., 2002). Embryogenesis is a multi-step process influenced by number of endogenous and exogenous factors, where embryo develops by the sequence of controlled cell division, cell growth, cell differentiations and programmed cell death. Entirely all these processes are related to the cytoskeletal dynamics, where especially actin filaments play important roles in the cell polarity control and programmed cell death (Smertenko et al., 2003). Different actin isoforms and associated proteins participate in various developmental stages of embryos development. Latrunculin B is widely used as an anti-actin drug that depolymerises actin (Morton et al., 2000) and thus represents a suitable tool for studies of embryogenesis. In this study we used somatic embryos of Norway spruce as an experimental material for the research for the study of embryogenesis. Application of low doses of latrunculin B ( nm) during somatic embryos maturation killed predominantly suspensor cells while leaving cells in meristematic centres alive. This indicated differential sensitivity of actin in these two cell types. The treatment resulted in faster development of more advanced embryos and the elimination of insufficiently developed ones. 13

14 We isolated four spruce actin genes that encoded different actin isoforms and analysed their expression during embryo maturation. We detected three actin isoforms, which were expressed predominantly in suspensor cells and their expression decreased during maturation. This expression decline was enhanced by latrunculin B treatment. Sequence analysis revealed amino acid substitutions in latrunculin B-binding site in one of the suspensor-specific actin isoforms, which may be responsible for its altered binding affinity to latrunculin B. We hypothesized that this altered affinity of one of suspensor-specific actin isoforms may be responsible for higher sensitivity of suspensor cells to latrunculin B treatment. Latrunculin B blocked suspensor development, accelerates maturation of embryos and selects high quality embryos. 5. Early effects of aluminium toxicity to plants Aluminium toxicity is the main limiting factor for plant growth on acid soil. The toxic influence of aluminium has probably multiple targets in root cells. Aluminium treatment results in rapid cessation of root growth. Aluminium affects the cell wall, microtubule dynamics and plasma membrane (Kochian et al., 2005). It is not well understood which of these structures is responsible for rapid cessation of root growth. In this study we focused on early symptoms of aluminium toxicity in microtubule cytoskeleton and plasma membrane. For this purpose we used hydroponic cultivation of Arabidopsis thaliana seedlings. The root growth was inhibited within first minutes of aluminium treatment. Measurements of fluidity of plasma membranes isolated from Arabidopsis showed that aluminium caused rapid rigidization of membranes. Application of membrane fluidizer benzyl alcohol was capable of partial restoration of both membrane fluidity and the root growth. Further, we observed endocytosis inhibition in roots affected by aluminium within 10 minutes and the loss of endocytosis within 20 minutes of the treatment. Further we analysed the organization of cortical microtubules in root cells and we observed that cortical microtubules were stabilized by aluminium treatment within first 30 minutes and disrupted during prolonged exposition to aluminium. Using drugs affecting endocytosis and microtubule dynamics we showed that vesicle trafficking, but not microtubule stabilization, inhibited root growth within first 30 minutes of aluminium application. Therefore we We concluded that aluminium-induced loss of membrane fluidity and endocytosis inhibition were responsible for root growth inhibition within minutes of aluminium treatment. Aluminium effect on microtubules played probably an important role as a late effect of aluminium toxicity (within hours). 14

15 6. Conclusions The capability of ARPC2 protein (subunit of ARP2/3 complex) to bind microtubules was described in this study. Our results indicated that ARP2/3 complex may mediate direct interaction between microfilaments and microtubules in processes where the coordination of microtubule reorganization and actin mediated growth was required. We showed that cell-malforming effect of growth retardant ancymidol was based on its inhibitory action on cellulose synthesis. Microtubules played a passive role in this process and were not directly responsible for changes of the cell shape induced by ancymidol. Meristematic and suspensors cells in maturating somatic embryos differed in sensitivity to latrunculin B, probably due to different composition of actin isoforms in these cells. Application of low doses of latrunculin B resulted in selective death of suspensor cells and thus contributed to the development of high-quality embryos. Aluminium caused rapid cessation of root growth of Arabidopsis thaliana seedlings. We showed that the immediate reason of root growth cessation was plasma membrane rigidization and loss of endocytosis in root cells. Aluminium stabilized cortical microtubules within minutes and induced their loss within hours of treatment. However, the effect of aluminium on microtubules was not responsible for rapid root growth cessation, but probably played an important role as a late effect of aluminium toxicity. 15

16 results Publikace a prezentace výsledků / Publication and presentation of Publikace / Publications: Hofmannová, J., Schwarzerová, K., Havelková, L., Boříková, P., Petrášek, J., Opatrný, Z. (2008): A novel, cellulose synthesis inhibitory action of ancymidol impairs plant cell expansion. Journal of Experimental Botany 59(14): Schwarzerová, K., Vondráková, Z., Fischer, L., Boříková, P., Bellinvia, E., Eliášová, K., Havelková, L., Fišerová, J., Vágner, M., Opatrný, Z. (2010): The role of actin isoforms in somatic embryogenesis in Norway spruce. BMC Plant Biology 10:89. Havelková, L. - Kobrlová, J., Křepelová, A., Fišer, R., Vosolsobě, S., Novotná, Z., Martinec, J., Schwarzerová K.: Aluminum-induced root growth cessation is associated with loss of membrane fluidity and endocytosis inhibition. Manuscript. Přednáška / Lecture: Havelková, L., Schwarzerová, K., Nanda, G., Bellinvia, E., Petrášek, J., Fischer, L., Fišerová, j. (2009): ARP2/3 protein complex is involved in actin microtubule interaction. XVII th Cytoskeletal club, Book of abstract, p. 23. Vranov nad Dyjí, Czech republic. 16

17 Seznam použité literatury / Refferences Boříková, P., Pokorná, J., Opatrný, Z. (2003): Is the lethal and malforming effect of the potential anti-gibberellin retardant ANC on the tobacco BY-2 cell line mediated by the cytoskeleton? Cell Biology International 27, Coolbaugh RC, Hirano SS, West CA. (1978): Studies on the specificity and site of action of a- cyclopropyl-a-[p-methoxyphenylj-5-pyrimidine methyl alcohol (ancymidol), a plant growth regulator. Plant Physiology 62, Goley, E.D., Welch, M.D. (2006): The ARP2/3 complex: an actin nucleator comes of age. Nature Reviews Molecular Cell Biology 7, Kochian, L.V., Pineros, M.A. and Hoekenga, O.A. (2005): The physiology, genetics and molecular biology of plant aluminum resistance and toxicity. Plant Soil 274, Mathur, J. ( 2005): The ARP2/3 complex: giving plant cells a leading edge. BioEssays 27, Mathur, J. ( 2006): Local interactions shape plant cells. Current Opinion in Plant Biology 18, Mathur, J., Hülskamp, M. (2002): Microtubules and Microfilaments in Cell Morphogenesis in Higher Plants. Current Biology 12, Morton, W.M., Ayscough, K.R., McLaughlin, P.J. (2000): Latrunculin alters the actinmonomer subunit interface to prevent polymerization. Nature Cell Biology 2, Petrášek, J., Schwarzerová, K. (2009): Actin and microtubule cytoskeleton interactions. Current opinion in plant biology 12, Smertenko, A.P., Bozhkov, P.V., Filonova, L.H., von Arnold, S., Hussey, P.J. (2003): Reorganisation of the cytoskeleton during developmental programmed cell death in Picea abies embryos. Plant Journal 33, von Arnold, S., Sabala, I., Bozhkov, P., Dyachok, J., Filonova, L. (2002): Developmental pathways of somatic embryogenesis. Plant Cell Tissue and Organ Culture 69, Wasteneys, G.O., Fujita M. (2006): Establishing and maintaining axial growth: wall mechanical properties and the cytoskeleton. Journal of Plant Research 119,

18 Abstrakty publikací / Abstracts of publications A novel, cellulose synthesis inhibitory action of ancymidol impairs plant cell expansion Hofmannová, J., Schwarzerová, K., Havelková, L., Boříková, P., Petrášek, J., Opatrný, Z. Journal of Experimental Botany 59(14): , The co-ordination of cell wall synthesis with plant cell expansion is an important topic of contemporary plant biology research. In studies of cell wall synthesis pathways, cellulose synthesis inhibitors are broadly used. It is demonstrated here that ancymidol, known as a plant growth retardant primarily affecting gibberellin biosynthesis, is also capable of inhibiting cellulose synthesis. Its ability to inhibit cellulose synthesis is not related to its anti-gibberellin action and possesses some unique features never previously observed when conventional cellulose synthesis inhibitors were used. It is suggested that ancymidol targets the cell wall synthesis pathway at a regulatory step where cell wall synthesis and cell expansion are coupled. The elucidation of the ancymidol target in plant cells could potentially contribute to our understanding of cell wall synthesis and cell expansion control. 18

19 The role of actin isoforms in somatic embryogenesis in Norway spruce Schwarzerová, K., Vondráková, Z., Fischer, L., Boříková, P., Bellinvia, E., Eliášová, K., Havelková, L., Fišerová, J., Vágner, M., Opatrný, Z. BMC Plant Biology 10:89, Background: Somatic embryogenesis in spruce is a process of high importance for biotechnology, yet it comprises of orchestrated series of events whose cellular and molecular details are not well understood. In this study, we examined the role of actin cytoskeleton during somatic embryogenesis in Norway spruce line AFO 541 by means of anti-actin drugs. Results: Application of low doses ( nm) of latrunculin B (Lat B) during the maturation of somatic embryos predominantly killed suspensor cells while leaving the cells in meristematic centres alive, indicating differential sensitivity of actin in the two cell types. The treatment resulted in faster development of more advanced embryos into mature somatic embryos and elimination of insufficiently developed ones. In searching for the cause of the differential actin sensitivity of the two cell types, we analysed the composition of actin isoforms in the culture and isolated four spruce actin genes. Analysis of their expression during embryo maturation revealed that one actin isoform was expressed constitutively in both cell types, whereas three actin isoforms were expressed predominantly in suspensor cells and their expression declined during the maturation. The expression decline was greatly enhanced by Lat B treatment. Sequence analysis revealed amino-acid substitutions in the Lat B-binding site in one of the suspensor specific actin isoforms, which may result in a different binding affinity for Lat B. Conclusions: We show that manipulating actin in specific cell types in somatic embryos using Lat B treatment accelerated and even synchronized the development of somatic embryos and may be of practical use in biotechnology. 19

20 Aluminum-induced root growth cessation is associated with loss of membrane fluidity and endocytosis inhibition Havelková, L. - Kobrlová, J., Křepelová, A., Fišer, R., Vosolsobě, S., Novotná, Z., Martinec, J., Schwarzerová K. Manuscript in preparation. Aluminum (Al) toxicity is the main limiting factor in crop production on acid soils. The main symptom of Al toxicity is a rapid inhibition of root growth, but the mechanism of root growth cessation remains unclear. Here we examined the earliest changes in the plasma membrane, endocytosis, and cortical microtubule organization in the root tip cells of Arabidopsis thaliana. Al suppressed root growth within 2 minutes, inhibited endocytosis within 10 minutes of exposure and stabilized cortical microtubules within the first 30 minutes. Spectrofluorometric measurements of the plasma membrane isolated from Arabidopsis plants and labeled with the fluorescent probe laurdan showed that Al induced a reduction in membrane fluidity. Application of the membrane fluidizer, benzyl alcohol, restored partially membrane fluidity and also partially restored root growth during first 30 minutes of Al treatment. Using the inhibitor of vesicle trafficking brefeldin A and microtubule-stabilizing compound taxol we showed that vesicle trafficking, but not microtubule stabilization inhibits root growth within first 30 minutes after application. We concluded that Al-induced loss of membrane fluidity and endocytosis inhibition occurred very early during Al toxicity in plant roots and were responsible for root growth inhibition within minutes of Al treatment. 20