COSY + - podmínky měření a zpracování dat ztráta rozlišení ve spektru. inphase dublet, disperzní. antiphase dublet, absorpční

Transkript

1 y x COSY 90 y chem. posuv J vazba 90 x : : inphase dublet, disperzní inphase dublet, disperzní antiphase dublet, absorpční antiphase dublet, absorpční diagonální pík krospík podmínky měření a zpracování dat ztráta rozlišení ve spektru

2 y x x DQF-COSY Pravidla fázových cyklů Δ 1 Δ 3 Δ 1 1. Při změně fáze pulsu o získává koherenční cesta fázový posun Δ 2. Jestliže fázový cyklus používá kroky 360 /, je spolu s cestou Δ vybrány i cesty s Δ ( 1,2, Δ 2

3 y x x DQF-COSY a 2 Δ 0 Δ

4 y x x DQF-COSY a sin Ω # $ % sin &'$ % 90 x ( 2 ( sin Ω # $ % sin &'$ % krospík diagonální pík Oba se stejnou fází

5 korelace vodíkových signálů po vazbách COSY HO O O H O HO O H H OH H H OH OH H 3 C CH 3 5 krospík = existuje J vazba mezi danými vodíky, vidíme jen přímé sousedy

6 x TOCSY spinlock y Spinlock z spinlock y = x y magnetizace uzamčena v ose y chemický posuv se nevyvíjí J vazba zůstává aktivní všechny spiny efektivně cítí stejné magnetické pole a mají vyrovnané energetické hladiny polarizace se volně přelévá mezi všemi spiny spojenými J vazbou

7 COSY versus TOCSY identifikace spinových systémů postranní řetězce krospík = vodík patří do daného spinového systému, nepřerušené sítě J vazeb

8 Heteronukleární korelace HMQC x I (φ) (ψ) φ rec S dekapling HSQC x x y y x I x (φ) (ψ) x φ rec S dekapling φ = x, -x; ψ = x, x, -x, -x; φ rec = x, -x, -x, x

9 HMQC versus HSQC vývoj v nepřímé doméně ovlivněn J vazbami mezi vodíky

10 NMR biomolekul vysoce selektivní odezva, rozlišení jednotlivých atomů široký rozsah fyzikálně-chemických vlastností molekuly v roztoku, blíže fyziologickému prostředí peptidy a proteiny nukleové kyseliny oligosacharidy Dostupné informace identifikace substrátu prostorová struktura molekuly dynamické chování molekuly komplexační rovnováhy identifikace místa interakce ligand - substrát struktura komplexu...

11 Měřená jádra (R. Hrabal)

12 Řešení prostorové struktury NMR vzorek (izotopové obohacení) NMR spektrometr pulsní sekvence NMR spektra obecné informace o molekule (primární struktura, koval. vazby,...) extrahování experimentálních dat zpracování všech informací a predikce struktury validace konečného souboru struktur

13 Příprava vzorku proteinu Neznačený vzorek o příslušné koncentraci kontrola správného sbalení proteinu kontrola dostatečně vysoké koncentrace sledování dlouhodobé stability 15 N obohacený vzorek kontrola čistoty proteinu kontrola správného sbalení proteinu kontrola dostatečně vysoké koncentrace některé komplexační studie (např. titrace ligandem) 13 C/ 15 N ( 13 C/ 15 N/ 2 H) obohacený vzorek strukturní studie Koncentrace a objem mm / mm µl Exprese proteinů v minimálním médiu ( 15 NH 4 Cl, 15 NH 4 SO 4 jediný zdroj dusíku, izotopově obohacené růstové médium 13 C-glukoza, 13 C-glycerol jediný zdroj uhlíku)

14 1 H spektrum Kontrola správného sbalení proteinu 15N-1 H korelace, HSQC čerstvý vzorek vzorek po 5 dnech (R. Hrabal)

15 Další požadavky na vzorek vzorek musí zůstat aktivní a nedenaturovaný po celou dobu NMR experimentů rozpouštědlo ph pufr teplota aditiva koncentrace stabilita H 2 O kompromis mezi minimalizací chemické výměny labilních vodíků s vodou a optimem pro studovaný protein (4-7) fosfátový pufr neobsahuje žádné vodíky acetátový pufr nutno připravit deuterovaný podle požadavků studovaného materiálu (5 40 C) nutno připravit deuterovaná, vyvarovat se vysokých koncentrací, omezit soli mm vzorek nesmí podléhat agregaci, koagulaci, sebezničení,... alespoň několik týdnů (1 týden a opakovaná příprava)

16 Přiřazování signálů proteinu aminokyselina i-1 aminokyselina i Neznačené proteiny pouze 1 H experimenty (COSY, TOCSY, NOESY) pouze malé proteiny, pracné 13 C a 15 N obohacené proteiny série 3D experimentů (HNCA, HN(CO)CA, CBCANH,...) názvy podle korelovanýcj jader, přenos polarizace out-and-back, out-and-stay větší molekuly, snadněji interpretovatelná spektra

17 Strategie založené na J-vazbách HNCA HN(CO)CA HNCO HN(CA)CO CBCANH / HNCACB CBCA(CO)NH

18 HNCA experiment out-and-back H N N(t 1 ) Cα(t 2 ) N H N (t 3 )

19 HNCA experiment krospík na vlastní a předchozí reziduum

20 HN(CO)CA experiment out-and-back H N N C Cα(t 1 ) C N(t 2 ) H N (t 3 )

21 HN(CO)CA experiment krospík pouze na předchozí reziduum

22 Postup přiřazení signálů páteře Začátek: N-H souřadnice z 15 N, 1 H-HSQC i-2 i-1 i

23 Postup přiřazení signálů páteře praxe

24 CBCANH experiment out-and-stay Hα,β Cα,β (t 1 ) N(t 2 ) H N (t 3 ) HNCACB experiment out-and-back H N N Cα,β (t 1 ) N(t 2 ) H N (t 3 )

25 CBCANH / HNCACB pozice Cβ bývá charakteristicná pro danou AA

26 CBCA(CO)NH experiment out-and-stay Hα,β Cα,β (t 1 ) C N(t 2 ) H N (t 3 ) HN(CO)CACB experiment out-and-back H N N C Cα,β (t 1 ) C N(t 2 ) H N (t 3 )

27 CBCA(CO)NH / HN(CO)CACB pozice Cβ bývá charakteristicná pro danou AA

28 Postup přiřazení signálů páteře

29 Postranní řetězce 15 N, 1 H-HSQC-TOCSY H N (t 1 ) N(t 2 ) H N H i (t 3 ) relativně dlouhý mixing time

30 Postranní řetězce HCCH-TOCSY H(t 1 ) C(t 2 ) C H(t 3 ) kratší mixing time HCCH-COSY méně signálů

31 Experimentální protokol Rozhoduje: velikost proteinu stabilita proteinu požadované experimentální informace dostupnost experimentálního času... Příklad 1 HNCA, HN(CO)CA HCCH-TOCSY editované NOESY Příklad 2 HNCACB, CBCA(CO)NH 15 N, 1 H-HSQC-NOESY, 13 C, 1 H-HMBC-NOESY a další kombinace...