KAPSAICINOVÝ RECEPTOR SPECIFICKÝ IONTOVÝ KANÁL

Transkript

1 Pùvodní práce PSYHIATRIE ROÈÍK SUPPLEMETUM 4 KAPSAIIOVÝ REEPTOR SPEIFIKÝ IOTOVÝ KAÁL PRO DETEKI BOLESTIVÝH PODÌTÙ APSAII REEPTOR A SPEIFI PROTEI FOR THE DETETIO OF PAIFUL STIMULI VIKTORIE VLAHOVÁ 1, KLÁRA SUŠÁKOVÁ 1, ALLA LYFEKO 1, DAMIE P. KUFFLER 2, LADISLAV VYKLIKÝ 1 1 Fyziologický ústav AV ÈR, Praha 2 Institute of eurobiology, UPR, San Juan PR, USA SOUHR Bolest je pøirozenou reakcí somatosenzorického systému vyvolanou podnìty, jež mohou zpùsobit poškození organizmu. Bývá prvním symptomem onemocnìní, zvláštì zánìtlivého pùvodu. Ve své chronické podobì, èasto bez objektivnì zjistitelných pøíèin, má bolest rozsáhlý vliv na kvalitu života a mùže být utrpením, které pøedstavuje lékaøský, etický a sociální problém. Studium molekulárních mechanizmù bolesti smìøuje k poznání struktury a funkce specifických receptorù a iontových kanálù, jež jsou exprimovány na primárních nociceptivních neuronech. Molekulárnì biologické techniky teprve v nedávné dobì umožnily studovat strukturu tìchto proteinù a stanovit jejich výluènou úlohu v transdukci a pøenosu bolestivé signalizace. Jedním z nejdùležitìjších experimentálních modelù pro studium mechanizmù nocicepce jsou heterologní expresní systémy, jež umožòují jednotlivì zkoumat specifické receptory, které se pøi vzniku bolesti rozhodujícím zpùsobem uplatòují. Pøedkládané výsledky charakterizují funkèní a farmakologické vlastnosti rekombinantního kapsaicinového receptoru, iontového kanálu, který je specificky aktivován bolestivými podnìty, a naznaèují smìr výzkumu zamìøeného na hledání možností jeho farmakologického ovlivnìní. Klíèová slova: vaniloidní receptor, nocicepce, neurony ganglií zadních koøenù míšních SUMMARY The role of pain is to alert the organism to actual or potential tissue damage. It serves a protective function as it is the first symptom of many diseases, especially of inflammatory origin. In its chronic form, pain is maladaptive and has a significant impact on quality of life. The present research on the molecular mechanisms underlying the activation of pain pathways is directed toward understanding the structure and function of specific receptors and ion channels that are expressed by primary nociceptive neurons. The techniques of molecular biology enabled great progress in studying the structure of these specialized proteins and in determining their unique role in the transduction of noxious signals. One of the most important experimental models for the study of molecular mechanisms of nociception are heterologous expression systems in which cda encoding various proteins is used to express those proteins in host cells where they can be more easily studied. This technique has greatly facilitated the investigation of channel structure-function relationships and ion channel regulation. The present results characterize the functional and pharmacological properties of the recombinant vanilloid receptor, and its ion channels that are specifically activated by noxious stimuli. The results are discussed in the context of research aimed at developing more target-specific and effective drugs for the alleviation of pain. Key words: vanilloid receptor, nociception, dorsal root ganglia neurones Vlachová V, Sušánková K, Lyfenko A, Kuffler DP, Vyklický L. Kapsaicinový receptor specifický iontový kanál pro detekci bolestivých podnìtù. Psychiatrie 2002;6(Suppl.4):6 13. Úvod Rekombinantní kapsaicinový receptor VR1: model ke studiu periferních mechanizmù bolesti Receptory a iontové kanály, jež jsou exprimovány na periferních zakonèeních primárních senzorických neuronù, svými vlastnostmi urèují, zda bolestivý podnìt bude pøeveden na vzruchovou aktivitu oznamující organizmu jeho bezprostøední ohrožení. V prùbìhu druhé poloviny minulého století byla farmakologickými a elektrofyziologickými pøístupy prokázána existence receptorù specifických pro nociceptivní neurony. Poèátkem osmdesátých let se experimentálním modelem ke studiu bunìèných a molekulárních mechanizmù nocicepce staly izolované neurony zadních koøenù míšních pøechovávané v podmínkách tkáòových kultur (Baccaglini et al., 1983). Bylo prokázáno, že kapsaicin (8-methyl--vanilyl-6-nonenamid), algogenní látka obsažená v rùzných druzích pálivé papriky, depolarizuje nìkteré malé senzorické neurony a vyvolává v nich vzruchovou aktivitu. Pøedpokládalo se, že právì tato skupina neuronù pøedstavuje nociceptory a že jejich farmakologická selektivita k algogenùm je dùsledkem exprese specific- 6

2 PSYHIATRIE ROÈÍK SUPPLEMETUM 4 Pùvodní práce kých (kapsaicinových) receptorù. Jejich vlastnosti byly studovány pøedevším farmakologicky a pomocí elektrofyziologické techniky patch clamp, jež umožnila snímání aktivity iontových kanálù (Hamill et al., 1981). Velikost a citlivost neuronù na kapsaicin se staly hlavními kritérii pøi identifikaci nociceptorù mezi neurony ganglií zadních koøenù míšních pìstovaných v podmínkách tkáòových kultur. iontového kanálu (lapham et al., 2001; Jahnel et al., 2001; Kedei et al., 2001). Hydrofilní -konec VR1 tvoøí vìtší polovinu proteinu (432 aminokyselin), je orientován intracelulárnì, obsahuje oblasti bohaté na prolin a tøi ankyrinové úseky, které spojují tento membránový protein s cytoskeletem. -konec receptoru smìøuje také do nitra buòky, je však podstatnì kratší než -konec (154 aminokyselin). Rozpoznat, které strukturní oblasti kapsaicinového (vaniloidního) receptoru urèují jeho funkci, je cílem mnoha laboratoøí. Elektrofyziologickými technikami jsme se zamìøili na studium mechanizmù, jež vedou k aktivaci a senzitizaci tohoto receptoru. VR1 Obrázek 1: Imunohistochemické znaèení neuronù ganglií zadních koøenù míšních potkana. eurony jsou znaèené primární králièí polyklonální protilátkou proti -konci VR1. (A) fázový kontrast, (B) fluorescence. Mìøítko: 20 µm. Šipka oznaèuje neurony, které exprimují kapsaicinový receptor. Právì z proto, že exprese kapsaicinové citlivosti je výluènì omezena na primární nociceptory, molekulární identifikace kapsaicinového (vaniloidního) receptoru se stala v roce 1997 jedním z nejvýznamnìjších biomedicínských objevù (aterina et al., 1997). Pøedpokládalo se totiž, že poznání struktury a farmakologických vlastností tohoto specializovaného membránového proteinu by mohlo vést k cílenému hledání látek, jimiž by mohly být léèeny rùzné bolestivé stavy u lidí. Laboratoø prof. D. Juliuse v San Francisku (Kalifornie, USA), ve které byl kapsaicinový receptor poprvé vyklonován, jej oznaèila jako vaniloidní receptor typu 1 (VR1), provedla jeho funkèní porovnání s pøirozenì se vyskytujícím receptorem a publikovala sekvenci tohoto receptoru v genové bance Gen-Bank pod èíslem AF ( MD=search&DB=nucleotide). Struktura a funkce kapsaicinového receptoru Kapsaicinový receptor VR1 je protein o 838 aminokyselinách a molekulové hmotnosti kda. Šest transmembránových domén struktury β-listu, jedna kratší hydrofobní klièka mezi pátou a šestou transmembránovou doménou a cytoplazmaticky orientovaný - i -konec øadí tento receptor k velké skupinì pøíbuzných TRP (transient receptor potential) iontových kanálù. Tyto kanály mají kromì podobné primární struktury charakteristickou také propustnost pro monovalentní a vápníkové kationty. Pøedpokládá se, že kapsaicinový receptor, podobnì jako ostatní TRP kanály, je homotetramerem, v nìmž kratší hydrofobní klièky ètyø podjednotek vytváøejí pór pøedstavující selektivní filtr Obrázek 2: (Vlevo) Pøedpokládaná struktura kapsaicinového receptoru VR1. a intracelulární stranì receptoru jsou vyznaèena potenciální fosforylaèní místa ( ). ysteinové zbytky v oblasti póru ( ) jsou pøístupné z extracelulární strany. (Vpravo) Kvarterní strukturu kapsaicinového receptoru dosud neznáme. a jeho strukturu mùžeme usuzovat pouze z analogie s jinými iontovými kanály, jež se podaøilo krystalizovat a analyzovat s vysokým rozlišením (Kv tøída draslíkových kanálù). Hypotetický model pøedpokládá, že prvý až ètvrtý segment receptoru tvoøí jeden celek, jehož konformace se mìní v závislosti na membránovém potenciálu. Z nìho do intracelulárního prostoru vychází dlouhá -terminála. 5. transmembránový segment je spøažen se 6. segmentem klièkou, která smìøuje dovnitø a spoleènì s klièkami ostatních podjednotek vytváøí selektivní filtr, jímž procházejí kationty pøi otevøení kanálu. Konformace této èásti je pro funkci receptoru rozhodující a mohou se na ní uplatòovat pøímé vlivy, nebo vlivy zprostøedkované nepøímo, tj. zmìnami nìkterých jiných èástí receptoru, jako je segment 6 a na nìj navazující terminála karboxylového konce. Metody Tkáòové kultury a transfekce VR1 Pro doèasnou expresi potkaního vaniloidního receptoru a jeho mutantù byla použita bunìèná linie HEK293T. Jedná se o lidské embryonální ledvinné buòky, jež obsahují na svém povrchu T antigen z viru SV40, který slouží pro zvýšení úèinku vstupu plazmidové DA do tìchto bunìk. Buòky byly pìstovány na sklíèku ( bunìk/sklíèko) pokrytém poly-l-lyzinem v objemu 1 ml média OPTIMEM (Gibco BRL, ìmecko). K transfekci byl použit gen potkaního VR1 zaklonovaný do vektoru pcda3 (InVitrogen, arlsbad, A) v místech restrikèních enzymù BstX I a ot I (poskytnutý prof. D. Juliusem, Kalifornie, USA). Pro identifikaci pozitivnì transfekovaných bunìk byly buòky transfekovány souèasnì genem pro zelený fluorescenèní protein (GFP). Pro transfekci bylo použito standardní transfekèní èinidlo Lipofectamine 2000 (Invitrogen, ìmecko) podle protokolu doporuèovaného výrobcem. Pokusy byly provádìny první až druhý den po transfekci. Imunofluorescenèní barvení HEK293T buòky narostlé na podložním sklíèku byly opláchnuty 1 ml sterilního roztoku PBS (137 mm al, 2,7 7

3 Pùvodní práce PSYHIATRIE ROÈÍK SUPPLEMETUM 4 mm Kl, 4,3 mm a 2 HPO 4.7 H 2 O, 1,4 mm KH 2 PO 4, ph = 7,3), po dobu 30 minut fixovány 1 ml 4% paraformaldehydem a 5 minut permeabilizovány 0,5% roztokem Tritonu v PBS. Sklíèka byla opláchnuta 3 po dobu 10 minut v 1 ml sterilního roztoku PBS. Buòky fixované na mikroskopických sklíèkách byly poté pøi pokojové teplotì 30 minut kolébány v 1 ml roztoku PBS s pøidaným BSA (0,25% bovinní sérum albumin) a 0,25% želatinou. Médium bylo odsáto a sklíèka položena na parafilm. Po pøidání 200 µl primární protilátky naøedìné 1 : 100 v roztoku PBS s 0,25% BSA a 0,25% želatinou byly buòky inkubovány pøes noc pøi 4. Druhý den ráno byl roztok odsán a sklíèka 3 omyta po dobu 10 minut v PBS. a 1 hodinu byla pøidána sekundární protilátka (1 : 1000) s navázanou fluorescenèní látkou FIT (fluoresceinizothiokyanát), která je naøedìna v roztoku PBS s 0,25% BSA a 0,25% želatinou. Sklíèka byla opìt omyta 3 po dobu 10 minut v PBS a plochou s narostlými buòkami položena na kapku glycerolu na podložní mikroskopické sklíèko. Preparáty byly pozorovány v konfokálním mikroskopu Bio- Rad MR-600 (Kalifornie, USA) pøipojeném na inverzní fluorescenèní mikroskop ikon Diaphot (Japonsko). Elektrofyziologické mìøení Membránové proudy byly snímány zesilovaèem Axopatch 1D (Axon Instruments, USA). Roztoky byly aplikovány systémem umožòujícím jejich rychlou výmìnu a øízený ohøev (Dittert et al., 1998). Extracelulární roztok obsahoval (mm): al, 160; Kl, 2,5; al 2, 1; Mgl 2, 2; HEPES, 10; glukóza, 10; ph bylo nastaveno na hodnotu 7,3 pomocí aoh. Intracelulární roztok ve snímací pipetì (IS) obsahoval: (mm): glukono-delta-lakton, 125; sl, 15; EGTA, 5; HEPES, 10; ATP, 2; al, 2; al 2, 0,5; ph bylo nastaveno na hodnotu 7,3 pomocí soh. 8 Výsledky Heterologní exprese rekombinantního kapsaicinového receptoru VR1 Funkèní vlastnosti kapsaicinového receptoru byly studovány na rekombinantním receptoru VR1 exprimovaném v HEK293T buòkách. Výhoda heterologního expresního systému spoèívá pøedevším v tom, že (1) je možné studovat vlastnosti daného receptoru bez nežádoucího úèinku ostatních receptorù, které jsou exprimovány v primárních senzorických neuronech, (2) je možné zkoumat rùzné varianty, mutanty èi konstrukty genu receptoru. Abychom ovìøili a lokalizovali expresi vaniloidního receptoru v HEK293T buòkách, použili jsme imunohistochemickou techniku, jíž byly buòky oznaèeny primární králièí polyklonální protilátkou proti -konci VR1, pøesnìji proti peptidu GSLKPEDAEVF- KDSMVPGEK (obr. 3). Membrána tìchto bunìk byla pøi aplikaci protilátky permeabilizována (Tritonem X-100), ponìvadž -konec je orientován cytoplazmaticky. Specifická vazba primární protilátky ES membránový proud (na) Obrázek 3: HEK293T buòky transfekované vaniloidním receptorem VR1 znaèené imunohistochemicky primární králièí polyklonální protilátkou (-konec VR1) byla prokázána aplikací oslí sekundární protilátky s navázanou žlutozelenou fluorescenèní barvou FIT, kterou je možné pozorovat ve fluorescenèním mikroskopu. HEK293T buòky transfekované genem rvr1 vykazují srovnatelné elektrofyziologické vlastnosti jako neurony ganglií zadních koøenù míšních, jež exprimují kapsaicinový receptor endogennì. Vaniloidní receptor lze aktivovat (a) kapsaicinem, (b) snížením hodnoty ph extracelulárního prostøedí (< 6,5) a (c) teplem vyvolávajícím u èlovìka bolest. Tyto tøi rùzné podnìty aktivují VR1 receptor prostøednictvím odlišných mechanizmù (a zøejmì také rùzných receptorových domén) a kombinací tìchto stimulù je dosaženo výrazného zvýšení odpovìdí. Kapsaicinový receptor je aktivován vaniloidy a kanabinoidy Kapsaicin je první chemickou látkou, jejíž fyziologické vlastnosti vedly k objevu kapsaicinového receptoru. Kapsaicin aplikován na izolované neurony ganglií zadních koøenù míšních vyvolává depolarizaèní membránové proudy, které pøi jeho opakovaném podání desenzitizují. K této desenzitizaci zøejmì dochází pùsobením fosfatáz, jež jsou ph 6,1 kapsaicin 1 µm ES 1 na Obrázek 4: Membránový proud snímaný elektrofyziologickou technikou patch clamp z HEK293T buòky transfekované receptorem VR1. Teplota extracelulárního roztoku (ES) byla lineárnì zvyšována z 25 na 50 (horní záznam). Pøi pøekroèení prahu pøibližnì 43 byla vyvolána strmá proudová odpovìï odrážející masivní aktivaci receptorù (a). Z grafu teplotní závislosti membránového proudu (dolní graf) je patrný práh aktivace 42. (b) Snížení hodnoty ph extracelulárního prostøedí (trvání aplikace je vyznaèeno nad záznamem) aktivuje VR1 receptor. Pøítomnost zvýšené koncentrace protonù zpùsobí senzitizaci odpovìdí vyvolaných nocicepèním horkem. Kapsaicin v koncentraci blízké maximální úèinné koncentraci (1 µm) aktivuje VR1 receptory a zvýšená teplota aplikovaná po dosažení rovnovážného stavu zvyšuje proudovou odpovìï pøibližnì na dvojnásobek (c). (d) a kontrolní odpovìdi zaznamenané po 30 s od pøedchozí aplikace je ve srovnání se záznamem (a) zøejmé snížení amplitudy zpùsobené desenzitizací receptorù.

4 PSYHIATRIE ROÈÍK SUPPLEMETUM 4 Pùvodní práce aktivovány v dùsledku zvýšení intracelulární koncentrace vápníkových iontù vstupujících do buòky pøi otevøení iontového kanálu (Docherty et al., 1996). Proudové odpovìdi vyvolané kapsaicinem jsou charakteristické svou pomalou kinetikou aktivace a deaktivace (èasová konstanta pøibližnì 3 s) v porovnání s jinými ligandem øízenými receptory. Dosud existují rozporné údaje o tom, zda doména receptoru pøedstavující rozpoznávací místo, na nìž se kapsaicin musí navázat, aby došlo k otevøení kanálu, leží na extracelulární nebo intracelulární stranì receptoru. Kapsacin a jeho agonisté jsou hydrofobními látkami, které se snadno rozpouštìjí v tucích, ale jen nepatrnì ve vodì. Je tudíž možné, že kapsaicin musí projít plazmatickou membránou døíve, než se mùže setkat se svým vazebným místem. Tato alternativa je v souladu s dlouhou èasovou konstantou aktivace kapsaicinových odpovìdí a se závìry zcela nedávné práce Jordta a Juliuse (2002), v níž autoøi ukázali, že bodové mutace v cytosolické oblasti spojující transmembránové domény TM2 a TM3 mohou vést k vyøazení citlivosti receptoru na kapsaicin. Specifickými se jeví mutanty S512Y a Y512A (zámìna serinu za tyrozin a zámìna tyrozinu za alanin), které vedou k vyøazení citlivosti receptoru ke kapsaicinu, aniž by došlo ke zmìnì jeho citlivosti k nocicepènínu teplu nebo snížení ph. aproti tomu naše starší práce (Vlachová et al., 1993) ukázala, že kapsaicin i ve vysoké koncentraci (50 µm) aplikovaný intracelulárnì mikroelektrodou pro mìøení membránových proudù, nemá žádný vliv na citlivost neuronu ke kapsaicinu, který byl aplikován z vnìjší strany. Podobné pokusy jsme provedli na rekombinantních vaniloidních receptorech s obdobnými výsledky. Tento rozpor je nutné vysvìtlit, ponìvadž znalost pøesné lokalizace vazebného místa pro kapsaicin je nezbytná pøi vyhledávání nových látek, které by mohly pøedstavovat potenciální analgetika s pøesnì vymezenými úèinky. Znalost umístìní vazebného místa je dùležitá i k vyjasnìní otázky, které látky se uplatòují jako pøirození agonisté vaniloidního receptoru. edávné studie naznaèují, že by tuto úlohu mohly plnit nìkteré produkty lipooxygenázy a endogenní agonista kanabinoidního receptoru anandamid (arachidonyl-etanolamid) (Zygmunt et al., 1999; Hwang et al., 2000). Obrázek 5 ukazuje, že rekombinantní vaniloidní receptor lze aktivovat anandamidem, pøirozenì se vyskytující látkou. Kapsaicinový receptor je aktivován nocicepèním horkem ocicepèní teplo nad 43 vyvolává v malých neuronech ganglií zadních koøenù míšních depolarizaèní membránový proud nesený kationty vèetnì a 2+, který dosahuje svého maxima pøi 52 (esare et al., 1996). Tento membránový proud je pozorován ve stejných neuronech, které jsou citlivé též na kapsaicin (Kirschstein et al., 1997). Stejné vlastnosti, tj. citlivost ke kapsaicinu a strmou proudovou odpovìï pøi aplikaci nocicepèních teplot, jež je charakterizována vysokým teplotním koeficientem (Q 10 20; Vyklický et al., 1999), vykazují také rekombinantní receptory VR1 v heterologním expresním systému. Zvýšení teploty nad 53 vede k trvalým zmìnám VR1 receptoru, které se projevují snížením prahu teploty pro jeho vyvolání nebo dokonce klidovým membránovým proudem pøi pokojové teplotì. Tím mùže vznikat spontánní vzruchová aktivita, jež vede k bolesti, kterou poci ujeme pøi mírném popálení (Lyfenko et al., 2002). Obrázek 6 ukazuje zmìnu citlivosti senzoru pro nocicepèní teplo (VR1) krátkodobým pùsobením nadmìrného horka nad 56. U HEK293T bunìk transfekovaných tímto receptorem dochází k výraznému snížení teplotního prahu pro vyvolání membránového proudu (ze 43 na 33 ). Experimentální výsledky na neuronech ganglií zadních koøenù míšních ukazují, že u bunìk, které byly vystaveny nadmìrnému horku, dochází ke snížení energetické bariéry, která musí být pøekonána, aby mohlo dojít k aktivaci iontových kanálù. Tento úèinek je specifický a zøejmì postihuje pouze tu èást receptoru, která slouží k detekci nocicepèního tepla, ponìvadž citlivost receptoru na kapsaicin je nezmìnìna (Lyfenko et al., 2002). Zatím otevøenou zùstává otázka, která doména receptoru odpovídá za otevøení kanálu teplem v rozsahu, který je èlovìkem vnímán bolestivì. membránový proud (na) anandamid 10 µm 1 na Obrázek 5: Endogenní látka ananandamid aktivuje rekombinantní kapsaicinový receptor exprimovaný v HEK293T buòkách. Membránový proud vyvolaný nocicepèním horkem v kontrolním extracelulárním roztoku (a) je výraznì senzitizován v pøítomnosti 10 µm anandamidu (b). Tato senzitizace pøetrvává i po 1 minutì, kdy je látka promývána kontrolním extracelulárním roztokem (c). Z grafu proudovì-teplotní závislosti je patrné, že následující odpovìï na tepelný podnìt je významnì senzitizována již pøi fyziologických teplotách (>37 ). Kapsaicinový receptor je citlivý na kyselost zevního prostøedí Klinická zkušenost ukazuje, že pøi zánìtech dochází ke snížení extracelulárního ph z fyziologické hodnoty 7,3 na hodnoty až o nìkolik jednotek nižší. V exsudátech vznikajících pøi zánìtlivých kloubních procesech byl zjištìn pokles ph až na 5, což vedlo k domnìnce, že protony mohou být jediným mediátorem, který se uplatòuje pøi vzniku impulzní aktivity v primárních nociceptorech (Lindahl, 1961). Snížení ph pod 6,1 vyvolává u velkého poètu malých a støedních neuronù zadních koøenù míšních pøetrvávající kationtový proud podobnì jako kapsaicin, což 9

5 Pùvodní práce PSYHIATRIE ROÈÍK SUPPLEMETUM 4 10 membránový proud (na) Kapsaicinový receptor je citlivý na napìtí Všechny dosavadní práce o kapsaicinovém receptoru se shodují v tom, že proudy, které procházejí jeho kanálem, jsou neseny kationty, vèetnì a 2+, a že na pozitivních membránových potenciálech dochází k jeho výraznému usmìrnìní. apì ové vztahy tohoto proudu lze obtížnì studovat u neuronù, ponìvadž na pozitivních membránových potenciálech dochází k aktivaci napì ovì závislých draslíkových a vápníkových kanálù, což ztìžuje nebo znemožòuje kvantitativní hodnocení. Tento problém jsme pøekonali pøenesením genu kódujícího VR1 do nedráždivých bunìk HEK293T. Obrázek 8A ukazuje odpovìdi vyvolané sérií 20 mv skokù od 140 do +80 mv u jedné buòky HEK, která byla transfekována VR1 a její membránový potenciál byl udržován na 70 mv. Hyperpolarizaèní pulzy nevyvolávaly žádný membránový proud. Výrazný proud se objevil až na pozitivních membránových potenciálech. Proudovì-napì- ová závislost (obr. 8B) ukazuje strmost jeho usmìrnìní. Záznamy rovnìž ukazují, že proudy vyvolané depolarizaèdokazuje, že vysoká koncentrace protonù je schopna aktivovat stejné receptory a indukovat bolest (Bevan et al., 1991). Petersenová a LaMotte (1993) zjistili, že i malé snížení hodnoty ph extracelulárního prostøedí, které samo o sobì nevyvolává v izolovaných neuronech ganglií zadních koøenù míšních žádný membránový proud, dramaticky zvyšuje membránový proud vyvolaný kapsaicinem. Podobnì snížení extracelulárního ph výraznì zvyšuje odpovìdi vyvolané nocicepèním teplem, aniž by podstatnì zmìnilo teplotní práh pro jeho vyvolání. Teprve výrazné snížení ph, které samo o sobì vyvolává membránový proud, vede k posunu tohoto prahu do oblasti fyziologických hodnot (obr. 7). Tyto nálezy ukázaly, že nositelem proudu je stejný receptor, který má dvì odlišné domény, z nichž jedna váže kapsaicin a druhá protony. S pøihlédnutím k fyzikálním vlastnostem aminokyselin, které receptor vytváøejí, bylo zøejmé, že pouze negativnì nabité aminokyseliny mohou pøi své protonaci pozmìnit konformaci proteinu a tak ovlivnit funkci iontového kanálu. Ponìvadž pouze kyselina asparagová (D) a glutamová (E) splòují tento pøedpoklad, jejich nahrazování neutrální aminokyselinou glutaminem (Q) v receptoru VRe stalo membránový proud (pa) MP -70 mv 2 na Obrázek 6: Krátkodobé pùsobení teploty pøekraèující 56 vyvolává trvalé funkèní zmìny kapsaicinového receptoru exprimovaného v HEK293T buòkách. (A) (a) Proudová odpovìï vyvolaná aplikací teplotního stimulu Teplotní práh pro aktivaci kapsaicinového receptoru je 43 (šipka). (b) Teplotní stimulace vyvolá funkèní zmìny, které se projeví posunem prahu do oblasti fyziologických teplot (c). Šipka oznaèuje amplitudu odpovìdi vyvolanou pøi teplotì 43. (B) Graf proudovì-teplotní závislosti záznamu (a) pøed popálením ( ), b, prùbìh aktivace a deaktivace receptorù pøi popálení (teèkovaná èára až do teploty 47 opisuje pøedešlý prùbìh aktivace). (c), zmìnìný prùbìh aktivace VR1 receptorù po popálení ( ). klíèem k odhalení domény, která je ke kyselému prostøedí citlivá. Pomocí technik bodových mutací Jordt et al. (2000) zjistili, že tìmito kritickými aminokyselinami jsou dva zbytky kyseliny glutamové v pozici 600 a 648, jejichž náhrada za glutamin vede ke zvýšení membránového proudu vyvolaného kapsaicinem, ale tento proud nelze ovlivnit snížením ph. Lokalizace tìchto dvou aminokyselinových zbytkù na extracelulární stranì receptoru není pøekvapující, ponìvadž zmìny ph se na jeho funkci uplatòují pouze pøi aplikaci kyselých roztokù z vnìjší strany. ph 5,4 ph 6,1 ph 6,1 0,5 na Obrázek 7: Snížení hodnoty ph extracelulárního roztoku (ph 6,1) pùsobí na kapsaicinový receptor dvìma mechanizmy: protony vaniloidní receptor jednak senzitizují tak, že úèinek teplotního podnìtu (A) je oproti kontrole mnohonásobnì zvýšen, jednak ve vyšších koncentracích (ph 5,4) tento receptor pøímo aktivují (). Závislost proudové odpovìdi na teplotì je zobrazena v (B), deaktivace je vyznaèena šipkou. eurony ganglií zadních koøenù míšních novorozeného potkana (podle Vlachová et al., 2001). membránový proud (pa) ph 5,4 ph 7,3

6 PSYHIATRIE ROÈÍK SUPPLEMETUM 4 Pùvodní práce ními pulzy jsou následovány dovnitø smìøujícím proudem, který vzniká v dùsledku pøetrvávajícího otevøení kanálu v okamžiku zmìny membránového potenciálu na negativní hodnotu ( 70 mv). Tyto proudy (tail currents) mají exponenciální charakter a jejich èasová konstanta odráží prùmìrné trvání otevøení kanálu vyvolaného depolarizaèním pulzem. Tyto proudy se vyskytují u všech HEK293T bunìk transfekovaných VR1 (n = 98) a neexistují u bunìk, jež transfekovány nebyly. Výsledky dokazují, že aktivace VR1 mùže být usnadnìna pøi depolarizaci buòky jakéhokoliv pùvodu, aniž by k aktivaci tohoto receptoru došlo pøímo, tj. chemicky nebo vysokou teplotou. Doménu receptoru, která urèuje jeho citlivost k napìtí, zatím neznáme, ale podle analogie s jinými TRP kanály lze oèekávat, že leží v oblasti transmembránových segmentù. Kapsaicinový receptor je citlivý na svùj oxidoredukèní stav Kyselost není jediným faktorem, který ovlivòuje funkci kapsaicinového receptoru ze zevní strany. Obrázek 1 ukazuje, že v klièce mezi 5. a 6. transembránovým segmentem jsou tøi cysteinové zbytky (616, 621 a 634). ysteiny mezi sebou mohou vytváøet disulfidické mùstky, které jsou jedním z hlavních faktorù, které stabilizují nativní strukturu proteinù. Disulfidické mùstky jsou velmi pevné, ponìvadž pøedstavují kovalentní vazbu. Tuto vazbu lze však snadno povolit redukèními èinidly, jako je napøíklad dithiothreitol (DTT) (Means et al., 1971). Obrázek 9 ukazuje, že DTT koncentraènì závisle a rychle vratnì zvyšuje odpovìdi vyvolané nocicepèním horkem a kapsaicinem, aniž by sám o sobì vyvolával jakýkoliv membránový proud pøi pokojové teplotì. To dokazuje, že pomìr mezi cysteiny v oxidovaném stavu (s vytvoøenými disulfidickými mùstky) a v redukovaném stavu (s volnými SH skupinami) rozhoduje o pravdìpodobnosti otevøení kanálu VR1 receptoru (Vyklický et al., 2002). Uvolnìní disulfidických mùstkù mùže vysvìtlit vznik akutní bolesti pøi náhlé lokální anoxii, napø. Buergerovì chorobì nebo koronární insuficienci. Bodovými mutacemi je nutné prokázat, které z uvedených cysteinových zbytkù jsou pro funkci VR1 receptoru rozhodující. -70 mv 80 mv -140 mv 1 na 10 ms Obrázek 8: HEK293T buòky transfekované kapsaicinovým receptorem VR1 jsou aktivované depolarizaèními pulzy (nahoøe), pøi nichž je klidový membránový potenciál 70 mv vystøídán na 50 ms jiným membránovým potenciálem (postupnì z 140 mv na +80 mv). (B) Proudovì-napì ová závislost, v níž je zobrazena maximální vyvolaná odpovìï (A, šipka) pøi daném membránovém potenciálu. MP -70mV dithiothreitol 2 mm kapsaicin 1 µm kapsaicin 1 µm DTT 3 mm MP -70mV odmytí 0,2 na membránový proud (na) membránový potenciál (mv) odmytí Obrázek 9: (A) Redukèní èinidlo dithothreitol (DTT) zvyšuje membránovou odpovìï vyvolanou bolestivým teplem na HEK293 buòkách transfekovaných genem rvr1. (B) Diagram ukazuje vztah membránového proudu a zvyšující se teploty u kontroly, v pøítomnosti 2 mm DTT a po odmytí. () Zvýšení membránové odpovìdi vyvolané bolestivým teplem v pøítomnosti kapsaicinu je koncentraènì závislým zpùsobem zvýšeno aplikací DTT na neuronu ganglií zadních koøenù míšních (podle Vyklický et al., 2002). membránový proud (-na) DTT 10 mm kapsaicin 1 µm DTT 2 mm DTT 60 mm kapsaicin 1 µm odmytí 200 pa Aktivitu kapsaicinového receptoru lze øídit z intracelulární strany Aktivita iontového kanálu je významnì ovlivòována fosforylaèním stavem kapsaicinového receptoru. Threoninové a serinové zbytky na vnitøní stranì VR1 receptoru (obr. 2) jsou potenciálními místy fosforylace, tj. procesu, pøi nìmž se jedna molekula fosforu uvolní z ATP a naváže na receptor. Tím je vyvolána zmìna konformace proteinu, což vede k výrazným zmìnám pravdìpodobnosti otevøení nebo vodivosti kanálu. Existuje množství receptorù, které prostøednictvím G-proteinù aktivují intracelulární enzymy, jež prostøednictvím fosforylace z cytoplazmatické strany øídí aktivitu iontových kanálù. Z hlediska nocicepce zvláš významnou roli hraje proteinkináza (PK), která se mùže aktivovat bradykininem uvolòovaným pøi zánìtlivých procesech. Bradykinin, který se váže na receptor B 2, aktivuje PK nepøímo prostøednictvím G-proteinù. PK lze též aktivovat pøímo forbolestery, napøíklad PMA (forbol-myristát-acetát), který prostupuje plazmatickou membránou a v koncentraci 1 µm dramaticky zvyšuje membránový proud vyvolaný nocicepèním teplem a snižuje práh jeho aktivace v neuronech zadních koøenù míšních (esare et al., 1996). Lze pøedpokládat, že proces senzitizace prostøednictvím proteinkinázy je (podobnì jako všechny ostatní enzymové reakce) 11

7 Pùvodní práce PSYHIATRIE ROÈÍK SUPPLEMETUM 4 dìjem teplotnì závislým. V pøípadì aktivace vaniloidního receptoru jde však zøejmì o proces mnohem úèinnìjší, protože sám receptor je pøi vyšších teplotách specificky aktivován (obr. 10). Pomocí techniky terèíkového zámku a techniky bodových mutací umazaki et al. (2002) zjistili, že pouze dvojitá mutace S502A a S800A (náhrada serinu za alanin) vede k vymizení této PMA navozené potenciace a snížení prahu membránového proudu vyvolaného horkem. a vnitøní stranì receptoru VR1 je rovnìž nìkolik aminokyselinových zbytkù, kde mùže probíhat fosforylace prostøednictvím proteinkinázy A (PKA) (aterina et al., 1997). a objasnìní jejich fyziologické úlohy se pracuje v jiných laboratoøích a nedávné výsledky ukazují, že tuto úlohu hraje serinový zbytek S502, jenž je lokalizován na intracelulární klièce mezi 2. a 3. transmembránovým segmentem (Rathee et al., 2002). 12 membránový proud (-na) PMA 1 µm kapsaicin 0,1 µm PMA 1 µm + kapsaicin 0,1 µm Obrázek 10: Záznamy proudových odpovìdí neuronu ganglií zadních koøenù míšních jsou snímány v kontrolním extracelulárním roztoku pøi souèasné stimulaci nocicepèním teplem 50 (a). Forbol myristát acetát (PMA) kapsaicinové receptory mùže jednak sám aktivovat (b), jednak mùže výraznì senzitizovat odpovìdi vyvolané horkem i kapsaicinem (b a c). Míra senzitizace proudových odpovìdí vyvolaných teplem je nejvýraznìji zvýšena pøi teplotách blízkých fyziologickým (1 µm PMA vyvolá až osminásobnì zvýšenou aktivitu receptorù) (). Diskuze PMA 1 µm + kapsaicin 0,1 µm kapsaicin 0,1 µm aše výsledky pøispívají k vytváøení funkèního modelu polymodálního nociceptoru, který u savcù hraje významnou roli pøi detekci a transdukci signálù fyzikální a chemické podstaty, ohrožujících integritu organizmu. Kapsaicinový receptor mùže hrát klíèovou úlohu pøi vzniku chronické bolesti, jež je èastým symptomem onemocnìní a mùže pøedstavovat nejvìtší lidské utrpení. Existuje øada otázek, na nìž hledáme odpovìdi v souèasném výzkumu patogeneze bolesti. K nim patøí i fyziologická úloha kapsaicinového receptoru. ení pochyby tom, že všechny živoèišné druhy reagují obrannými reflexy, aby unikly podnìtùm potenciálnì poškozující intenzity. Živoèichové, vèetnì èervù, unikají pøed teplotou, která u èlovìka vyvolává bolest. Rozdíly v prahu I heat (PMA)/I heat () PMA 0,5 na n = 22 0,5 na pro vyvolání obranného reflexu horkem jsou u èlovìka, ptákù a amfibií zanedbatelné. Významným mezidruhovým rozdílem je však citlivost na kapsaicin a jeho analogy, které u èlovìka vyvolávají palèivou bolest a u savcù únikové chování, jež lze považovat za bolestivou reakci. Kapsaicin je však zcela neúèinný u nižších živoèišných druhù. To ukazuje, že periferní mechanizmy nocicepce jsou ve fylogenezi rozdílné a že v periferních zakonèeních primárních senzorických neuronù existuje vìtší poèet odlišných proteinových struktur, které plní tuto úlohu. V tomto ohledu jsou velmi významné studie na myších, u nichž byl genetickou manipulací vyøazen gen pro kódování receptoru VR1 (aterina et al., 2000; Davis et al., 2000). Tato zvíøata (knock out animals, VR1 -/- varianta) zcela ztratila citlivost na kapsaicin, ale jejich reakce na nocicepèní teplo zùstala zachována a podstatnì se nelišila od normálních myší. ejvýznamnìjším nálezem tìchto studií bylo však zjištìní, že se u zvíøat postrádajících gen pro expresi VR1 nevyvinula pøecitlivìlost na tepelné podnìty pøi experimentálnì navozeném místním zánìtu. Tato hyperalgezie je pro normální zvíøata zcela charakteristická. Zatím není zcela jasné, zda se receptor, který je citlivý na nocicepèní teplo, ale necitlivý na kapsaicin, exprimuje v dùsledku genového zásahu, anebo zda existuje také u normálních zvíøat. Souèasné techniky zatím nedovolují jeho identifikaci pøi souèasném výskytu s receptorem VR1. Kapsaicinový receptor, který je exprimován u savcù, je strukturálnì pøíbuzný senzoru na nocicepèní teplo v neuronech zadních koøenù míšních kuøat, která jsou na kapsaicin necitlivá. Membránový proud, který lze u kuøat vyvolat nocicepèním horkem, lze však blokovat capsazepinem a rutheniovou èervení, jež jsou antangonisty kapsaicinového receptoru (Marin-Burgin et al., 2000). Molekulární struktura kuøecího senzoru pro nocicepèní teplo byla již identifikována. Jde o ortolog receptoru VR1, s nímž vykazuje 68% identitu a 79% podobnost (Jordt et al., 2002). Tato práce rovnìž dokazuje, že pøesunutí úseku aminokyselin z potkaního VR1 do ortologního kuøecího receptoru vede k získání jeho citlivosti ke kapsaicinu a že pro dosažení této funkèní zmìny je dùležitých pouze 8 aminokyselinových zbytkù. Jiným živoèišným druhem který není citlivý na kapsaicin, ale reaguje obrannými reflexy na nocicepèní teplo, jsou amfibie. Žáby pøi ponoøení dolních konèetin do vody nad 40 odpovídají jejich odtažením a mají dobøe vyvinutý stírací reflex, jehož studiem se zabývali neurofyziologové na poèátku minulého století (Seèenov, 1961). Ke kapsaicinu jsou žáby zcela necitlivé. I když molekulární strukturu receptorù, které se uplatòují v transdukci nocicepèních signálù u žáby, zatím neznáme, naše studie ukazuje, že receptory pro nocicepèní teplo a pro kyseliny mají zcela odlišné vlastnosti, než je tomu u savcù a u ptákù (Kuffler et al.,

8 PSYHIATRIE ROÈÍK SUPPLEMETUM 4 Pùvodní práce 2002, v tisku). Bolestivé teplo u žab vyvolává v neuronech zadních koøenù míšních depolarizaèní membránové proudy, které jsou neseny monovalentními i divalentními kationty. Tyto proudy však nelze ovlivnit chemickými látkami, které u savcù a ptákù funkci analogického receptoru blokují nebo modulují. Receptor však mùže být též ortologem VR1, ponìvadž se k nìmu váže protilátka konstruovaná proti karboxylovému konci VR1. Slabé kyseliny (ph 5) vyvolávají v žabích neuronech zadních koøenù míšních charakteristické depolarizaèní proudy, které jsou neseny selektivnì a + a patøí do zcela odlišné kategorie iontových kanálù. Výsledky prezentované v této studii charakterizují specifické funkèní vlastnosti rekombinantního vaniloidního receptoru a uvádìjí kontext s jejich fyziologickým významem. Prokazují souèasnì, že heterologní expresní systémy mohou být úèinným experimentálním modelem ke studiu molekulární podstaty bolesti. Èlánek vznikl za podpory projektu S L00B122 MŠMT ÈR, Grantové agentury Èeské republiky 305/00/1639 a ATO LG LITERATURA RDr. Viktorie Vlachová, DrSc. Fyziologický ústav AV ÈR Vídeòská Praha 4 Tel.: Fax: vlachova@biomed.cas.cz Baccaglini PI, Hogan PG. Some rat sensory neurons in culture express characteristics of differentiated pain sensory cells. Proc atl Acad Sci USA 1983;80: Bevan S, Yeats J. Protons activate a cation conductance in a subpopulation of rat dorsal root ganglion neurones. J Physiol (Lond) 1991;433: aterina MJ, Leffler A, Malmberg AB, Martin WJ, Trafton J, Petersen- -Zeitz KR, Koltzenburg M, Basbaum AI, Julius D. Impaired nociception and pain sensation in mice lacking the capsaicin receptor. Science 2000;288: aterina MJ, Schumacher MA, Tominaga M, Rosen TA, Levine JD, Julius D. The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. ature 1997;389: esare P, Mcaughton P. A novel heat-activated current in nociceptive neurons and its sensitization by bradykinin. Proc atl Acad Sci USA 1996;93: lapham DE, Runnels LW, Strubing. The TRP ion channel family. at Rev eurosci 2001;2: Davis JB, Gray J, Gunthorpe MJ, Hatcher JP, Davey PT, Overend P, Harries MH, Latcham J, lapham, Atkinson K, Hughes SA, Rance K, Grau E, Harper AJ, Pugh PL, Rogers D, Bingham S, Randall A, Sheardown SA. Vanilloid receptor-1 is essential for inflammatory thermal hyperalgesia. ature 2000;405: Dittert I, Vlachová V, Knotková H, Vitásková Z, Vyklický L, Kress M, Reeh PW. A technique for fast application of heated solutions of different composition to cultured neurones. J eurosci Methods 1998;82: Docherty RJ, Yeats J, Bevan S, Boddeke HW. Inhibition of calcineurin inhibits the desensitization of capsaicin-evoked currents in cultured dorsal root ganglion neurones from adult rats. Pflugers Arch 1996; 431: Hamill OP, Marty A, eher E, Sakmann B, Sigworth FJ. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch 1981;391: Hwang SW, ho H, Kwak J, Lee SY, Kang J, Jung J, ho S, Min KH, Suh YG, Kim D, Oh U. Direct activation of capsaicin receptors by products of lipoxygenases: endogenous capsaicin-like substances. Proc atl Acad Sci U S A 2000;97: Jahnel R, Dreger M, Gillen, Bender O, Kurreck J, Hucho F. Biochemical characterization of the vanilloid receptor 1 expressed in a dorsal root ganglia derived cell line. Eur J Biochem 2001;268: Jordt SE, Julius D. Molecular basis for species-specific sensitivity to hot chili peppers. ell 2002;108: Jordt SE, Tominaga M, Julius D. Acid potentiation of the capsaicin receptor determined by a key extracellular site. Proc atl Acad Sci USA 2000;97: Kedei, Szabo T, Lile JD, Treanor JJ, Olah Z, Iadarola MJ, Blumberg PM. Analysis of the native quaternary structure of vanilloid receptor 1. J Biol hem 2001;276: Kirschstein T, Busselberg D, Treede RD. oexpression of heat-evoked and capsaicin-evoked inward currents in acutely dissociated rat dorsal root ganglion neurons. eurosci Lett 1997;231: Kuffler DP, Lyfenko A, Vyklický L, Vlachová V. ellular mechanisms of nociception in the frog. J europhysiol 2002; v tisku. Lindahl O. Pain: a chemical explanation. Acta Rheumat Scand 1962; 8: Lyfenko A, Vlachová V, Vyklický L, Dittert I, Kress M, Reeh PW. The effects of mild heat injury on membrane currents induced by noxious heat in cultured DRG neurones from neonatal rats. Pain 2002;95: Marin-Burgin A, Reppenhagen S, Klusch A, Wendland JR, Petersen M. Low-threshold heat response antagonized by capsazepine in chick sensory neurons, which are capsaicin-insensitive. Eur J eurosci 2000;12: Means GE, Feeney RE. hemical Modification of Proteins. San Francisco: Holden-Day, Inc., 1971; 254. umazaki M, Tominaga T, Toyooka H, Tominaga M. Direct phosphorylation of capsaicin receptor VR1 by protein kinase epsilon and identification of two target serine residues. J Biol hem 2002;277: Petersen M, LaMotte RH. Effect of protons on the inward current evoked by capsaicin in isolated dorsal root ganglion cells. Pain 1993;54: Rathee PK, Distler, Obreja O, euhuber W, Wang GK, Wang SY, au, Kress M. PKA/AKAP/VR-1 Module: A common link of Gs-mediated signaling to thermal hyperalgesia. J eurosci 2002;22: Seèenov IM. Refleksi golovnovo mozga, Moskva, 1961; 99 pp. Vlachová V, Lyfenko A, Orkand RK, Vyklický L. The effects of capsaicin and acidity on currents generated by noxious heat in cultured neonatal rat DRG neurones. J Physiol 2001;533(3): Vlachová V, Vyklický L. apsaicin-induced membrane currents in cultured sensory neurons of the rat. Physiol Res 1993;42: Vyklický L, Lyfenko A, Sušánková K, Teisinger J, Vlachová V. Reducing agent dithiothreitol facilitates activity of capsaicin receptor. euroscience 2002;111: Vyklický L, Vlachová V, Vitásková Z, Dittert I, Kabát M, Orkand RK. Temperature coefficient of membrane currents induced by noxious heat in sensory neurones in the rat. J Physiol (Lond) 1999;517: Zygmunt PM, Petersson J, Andersson DA, huang H, Sorgard M, Di Marzo V, Julius D, Hogestatt ED. Vanilloid receptors on sensory nerves mediate the vasodilator action of anandamide. ature 1999;400: