N Laboratoř hydrobiologie a mikrobiologie

Transkript

1 ÚSTAV TECHOLOGIE VODY A PROSTŘEDÍ Laboratoř hydrobiologie a mikrobiologie ázev úlohy: Metody IDEXX využívající technologii definovaného substrátu Vypracováno v rámci projektu: Inovace a restrukturalizace předmětu Laboratoř hydrobiologie a mikrobiologie PIGA číslo projektu Řešitel C_VŠCHT_2015_013 ifis číslo projektu doc. RDr. Jana Říhová Ambrožová, Ph.D Spoluřešitelé Ing. Dana Vejmelková, Ph.D. Ing. Vladimíra Škopová Rok zpracování:

2 Metody IDEXX využívající technologii definovaného substrátu Oblast použití: Tato metoda platí pro stanovení koliformních bakterií, Escherichia coli, enterokoků a bakterií Pseudomonas aeruginosa v dezinfikovaných i nedezinfikovaných vodách (povrchových, pitných, podzemních, odpadních apod.). Mez detekce a mez stanovitelnosti: Teoretická mez detekce je 1 KTJ/100 ml. Mez stanovitelnosti jsou 3 KTJ/100 ml pro 95% pravděpodobnost kladného výsledku za podmínek použití 100 ml vzorku. Pracovní rozsah: Pro Quanti-Tray (51 komůrek)platí rozsah koncentrací 1 až 200 organismů ve 100 ml. Pro Quanti- Tray/2000 (96 komůrek) je rozsah koncentrací od 1 do organismů ve 100 ml vzorku. Stanovený ukazatel: Metoda Colilert je testem průkaznosti na přítomnost koliformních bakterií a Escherichia coli v pitné vodě. Existuje verze Colilert-18 umožňující zjištění výsledků přítomnosti koliformních bakterií a Escherichia coli již po 18 h expozice. Metoda odpovídá požadavkům stanovení ukazatele dle ČS E ISO pro stanovení koliformních bakterií a Escherichia coli. (Metoda Colisure se používá v případě detekce koliformních bakterií a Escherichia coli v odpadních, zakalených a znečištěných vodách.) Metoda Enterolert-E je metoda detekce enterokoků ve vodě (Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis), její použití je v souladu s požadavky normy ČS ISO Existuje verze Enterolert-DW určená přímo pro pitnou vodu. Metoda Pseudalert je určená pro detekci bakterií Pseudomonas aeruginosa v souladu s požadavky normy ČS ISO Podstata zkoušky: Metody jsou založené na podstatě klasických metod nejvíce pravděpodobnějšího počtu, tzv. MP (Most Probable umber). amísto standardního nasazení vzorků s činidlem do zkumavek dle modelu MP zde probíhá rozdělení směsi vzorku a činidla do plat Quanti-Tray (popř. Quanti- Tray/2000). Směs je rozdělena do jednotlivých komůrek automaticky zatavovačkou Quanti-Tray Sealer. Po inkubaci je počet pozitivních komůrek pomocí přiložené tabulky převeden na nejpravděpodobnější koncentraci organismů (MP). Obecně jsou použité metody rychlé, snadné a v mnoha případech i přesné na určení počtu koliformních bakterií a Escherichia coli (Colilert), enterokoků (Enterolert), Pseudomonas aeruginosa (Pseudalert). Pozitivní reakce je dána vybarvením komůrek plata (popř. plastové lahvičky v případě metody P/A), které je způsobeno reakcí na přítomnost specifického enzymu. 2

3 Vyhodnocení testů je založeno na následujících barevných reakcích: U koliformních bakterií a Escherichia coli je indikace založena na přítomnosti enzymu -galaktosidázy. Přítomné bakterie Escherichia coli používají enzym -glukoronidázu na štěpení metyl-umbelliferyl--d-glukuronidu, což se projevuje v UV 365 nm modrou fluorescencí. U metody Colisure je enzym -glukoronidáza využit na štěpení chlorofenyl red--dgalaktopyranosidu. U enterokoků je využíváno reakce na přítomnost enzymu -glukosidázy. U pseudomonád se využívá detekce přítomných bakterií v UV 365 nm. Doba a teplota kultivace se řídí typem použitého substrátu. Přístroje a pomůcky: Pipety s možností aplikace objemu 1 a 10 ml, jednorázové špičky. Bunsenův kahan. Zatavovačka IDEXX, gumové podložky (součást sady k zatavovačce). Plata Quanti-Tray a Quanti-Tray/2000. Sterilní plastové lahvičky. Termostaty (na požadované teploty dle ukazatele). UV lampa pracující při 365 nm. MP tabule pro vyhodnocení výsledků (viz příloha 1 a 2). Chemikálie: Používané chemikálie jsou stupně čistoty ch.č. nebo p.a. Voda se používá destilovaná nebo demineralizovaná bez specifických požadavků na jakost. Tato voda se používá i pro potřeby ředění vzorku. Reakční činidla pro Colilert: WP020 (20 reakcí), WP0200 (200 reakcí). Reakční činidla pro Colilert-18: WP (20 reakcí), WP (200 reakcí). Reakční činidla pro Colisure: WCLS20 (20 reakcí), WCLS200 (200 reakcí). Reakční činidla pro Enterolert: WET020 (20 reakcí), WET0200 (200 reakcí). Reakční činidla pro Pseudalert: WET020 (20 reakcí), WET0200 (200 reakcí). Protipěnivý roztok (WAFDB) o objemu 20 ml, který lze aplikovat až na 400 vzorků. Postup zkoušky: ejprve se předehřeje zatavovací zařízení Quanti-Tray Sealer. Do sterilní (plastové) lahvičky se nalije 100 ml neředěného popř. patřičně naředěného vzorku vody. K ředění je možné použít destilovanou vodu. K objemu 100 ml se přidá obsah činidla (média) pro detekci cílového organismu (WP020 a WP200 pro Colilert, WP a WP pro Colilert-18, WCLS20 a WCLS200 pro Colisure, WET020 a WET200 pro Enterolert). V některých případech, kdy vzorek stále pění, lze použít i protipěnivý roztok. 3

4 Po promíchání a rozpuštění obsahu v lahvičce se celý objem přelije do plata Quanti-Tray (popř. Quanti-Tray/2000). Plato se umístní do gumové podložky dodávané k zatavovačce (typ plata musí odpovídat typu použité gumové podložky, jinak dojde k vylití obsahu plata do zařízení). Plato s gumovou podložkou se vloží do předehřátého zařízení zatavovačky a zataví se (viz obr. 1). Zatavená plata se po určitou dobu kultivují v termostatu při teplotě určené cílových organismem: o Colilert se kultivuje po dobu 24 h při teplotě (± 0,5) C, u Colilert-18 je doba zkrácena na 18 h. Colisure, který se vyhodnocuje po 24 h lze odečíst i po 48 h. o Enterolert-E a Enterolert-DW se kultivuje při teplotě 41 (± 0,5) C po dobu 24 h. o Pseudalert se kultivuje při teplotě 38 (± 0,5) C po dobu 24 h. Obr. 1. Vzhled použitých plat. Vlevo pro 51 komůrek, vpravo pro 96 komůrek. Vyhodnocení zkoušky: Pravděpodobný počet mikroorganismů se zjistí převedením počtu pozitivních reakcí v komůrkách plata Quanti-Tray (51 komůrek) a Quanti-Tray/2000 (49 velkých komůrek a 48 malých komůrek) na index MP dle převodních tabulek dodávaných výrobcem (zde příloha 1 a 2). Pozitivní reakci u metody Colilert a Colilert-18 vykazuje žluté zabarvení komůrek, což je indikace přítomnosti koliformních bakterií. Escherichia coli modře fluoreskuje pod UV lampou při 365 nm. U metody Colisure je pozitivní reakcí změna barvy z původně žlutě zabarvených komůrek na fialovočervenou. Přítomné bakterie Escherichia coli se vyznačují pod UV lampou při 365 nm modrou fluorescencí. Pozitivní reakci u metody Enterolert-E vykazuje modrou fluorescenci pod UV lampou při 365 nm. U metody Enterolert-DW je změna barvy komůrek z původní modré na zelenou indikací pozitivní reakce. Pozitivní reakci u metody Pseudalert vykazuje modrou fluorescenci pod UV lampou při 365 nm. Uvádění výsledků: Výsledky se uvádí jako MP na 100 ml vzorku. V případě ředěného vzorku je nutné použité ředění ve výsledku zohlednit. 4

5 Příloha 1 MP tabule pro vyhodnocení pozitivních reakcí při použití plata s 51 komůrkami (zdroj: 5

6 Příloha 2 MP tabule pro vyhodnocení pozitivních reakcí při použití Quanti-Tray/2000 (zdroj: 6

7 Příloha 2 MP tabule pro vyhodnocení pozitivních reakcí při použití Quanti-Tray/2000 (zdroj: - pokračování 7

8 Příklad 1 Vyhodnocení testu Enterolert-DW Zadání: Zjistěte početní zastoupení enterokoků ve vzorku odpadní vody. Do lahvičky na 100 ml aplikujte objem 10 ml z původního vzorku. Řešení: Při přípravě vzorku, ředění a kultivaci se postupuje dle pokynů uvedených v tomto návodu. Po ukončení doby kultivace se přistoupí k vyhodnocení zkoušky. Spočítají se pozitivní velké komůrky a pozitivní malé komůrky. Pozitivní komůrky mají žlutozelenou barvu, negativní komůrky jsou modře zabarvené (nezreagovaly). Dle přílohy 2 se zjistí odpovídající MP index. V tomto případě, byly označeny všechny negativní komůrky symbolem, ty jsou z vyhodnocení vyloučeny. Počet velkých pozitivních komůrek je 38 (do počtu se započítává i ta, skrz kterou se nalévá vzorek), počet malých pozitivních komůrek je 15. Po odečtu z MP tabule: 100,8 MP/100 ml. utné je uvažovat i použitý objem vzorku (zde 10 ml). Výsledek je MP/100 ml. Plato po ukončení kultivace. Plato po ukončení kultivace vyznačené negativní komůrky. 8

9 Příklad 2 Vyhodnocení testu Colilert Zadání: Zjistěte početní zastoupení koliformních bakterií a Escherichia coli u vzorku odpadní vody. Do lahvičky na 100 ml aplikujte objem 10 ml z původního vzorku. Řešení: Postupuje se dle pokynů uvedených v tomto návodu. Po ukončení doby kultivace se přistoupí k vyhodnocení zkoušky. Spočítají se pozitivní velké komůrky a pozitivní malé komůrky. Pozitivní mají žlutou barvu a jsou koliformními bakteriemi. Plato se přiloží pod UV lampu a spočítají se modře svítící komůrky, které jsou E. coli. Dle přílohy 2 se zjistí odpovídající MP index. Počet pozitivních (žlutých) komůrek indikujících přítomnost koliformních bakterií je 49 velkých a 41 malých, po odečtu z MP tabule: 1203,3 MP/100 ml. Po vystavení plata UV lampě, modře fluoreskující indikující přítomnost E. coli, je 48 velkých a 19 malých, po odečtu z MP tabule: 260,3 MP/100 ml. utné je uvažovat i použitý objem vzorku (zde 10 ml). Výsledek je MP/100 ml koliformních bakterií a MP/100ml E. coli. Plato po ukončení kultivace pozitivní komůrky jsou žlutě zabarvené a indikují přítomnost koliformních bakterií. Plato pod UV lampou, modře fluoreskující komůrky indikují přítomnost Escherichia coli. 9

10 Příklad 3 Vyhodnocení testu Pseudalert Zjistěte početní zastoupení pseudomonád ve vzorku odpadní vody. Do lahvičky na 100 ml aplikujte objem 10 ml z původního vzorku. Řešení: Postupuje se dle pokynů uvedených v tomto návodu. Po ukončení doby kultivace se přistoupí k vyhodnocení zkoušky. Po ukončení doby kultivace se přistoupí k vyhodnocení zkoušky. Plato se vystaví UV lampě a spočítají se pozitivní velké komůrky a pozitivní malé komůrky, které fluoreskují modře. Dle přílohy 2 se zjistí odpovídající MP index. V tomto případě, byly označeny všechny velké negativní komůrky symbolem, ty jsou z vyhodnocení vyloučeny. Počet velkých pozitivních komůrek je 40 (do počtu se započítává i ta, skrz kterou se nalévá vzorek), počet malých pozitivních komůrek je 5. Po odečtu z MP tabule: 85,7 MP/100 ml. utné je uvažovat i použitý objem vzorku (zde 10 ml). Výsledek je 857 MP/100 ml. Plato po ukončení kultivace. Plato pod UV lampou, modře fluoreskující komůrky indikují přítomnost pseudomonád. 10

11 Použitá literatura: Říhová Ambrožová, J Mikrobiologie v technologii vod. Skriptum VŠCHT Praha, 252 pp., ISB (2. přepracované vydání), AA 26,32 (on-line, ) 11