Substrát: látka, která se mění účinkem enzymu. NAD, NADP, FMN, FAD, koenzym Q, pyridoxalfosfát prostherická skupina: kofaktor vázán pevně

Transkript

1 Enzymy

2 Enzymy katalyzátory živé buňky proteiny jednoduché nebo složené (holo)enzym = apoenzym + koenzym (kofaktor) apoenzym: proteinová část kofaktor: nízkomolekulová neaminokyselinová struktura nezbytně nutná pro funkci daného enzymu koenzym: kofaktor vázán slabě, schopen přecházet z jedné bílkovinné složky enzymu na druhou NAD, NADP, FMN, FAD, koenzym Q, pyridoxalfosfát prostherická skupina: kofaktor vázán pevně FAD, hem, kyselina lipoová, biotin, kobalamin, železo, zinek, hořčík, molybden Substrát: látka, která se mění účinkem enzymu

3 Specifita enzymové katalýzy enzym katalyzuje jen jednu z četných termodynamicky možných přeměn látky specifitu zprostředkuje bílkovinná část Izoenzymy enzymy, které katalyzují stejnou reakci a jsou i jinak velmi podobné, mají odlišnou geneticky určenou primární strukturu např. LDH podjednotky A a B, molekula ze 4 podjednotek 5 forem A 4, A 3 B, A 2 B 2, AB 3, B 4 Laktátdehydrogenáza (LDH) Triviální název: Laktátdehydrogenáza Systematický název: L-laktát : NAD + -oxidoreduktáza Enzymové číslo: (klasifikační)

4 Substrátová specifita Zámek a klíč

5 Aktivní místo enzymu malá oblast enzymové molekuly, která obsahuje místo pro vazbu substrátu a katalytické místo pro přeměnu substrátu na produkt

6 6 tříd Rozdělení enzymů EC 1 Oxidoreduktázy EC 2 Transferázy EC 3 Hydrolázy EC 4 Lyázy EC 5 Izomerázy EC 6 Ligázy (syntázy) oxidačně/redukční reakce přenos (funkčních) skupin - z donoru na akceptor hydrolytické štěpení štěpení chemické vazby jiným způsobem než hydrolýzou či redoxní reakcí (eliminační reakce) často za vzniku dvojných vazeb nebo adici na dvojné vazby intramolekulární změny (izomerační reakce) (geometrické, strukturní) spojují dvě molekuly kovalentní vazbou na tvorbu vazby energie ATP EC 3 hydrolázy EC 3.4 hydrolázy působící na peptidových vazbách EC hydrolázy z polypeptidu odštěpují amino-terminální aminokyselinu EC hydrolázy odštěpují amino-terminální konec z tripeptidu

7 Enzymy Aktivační energie: minimální energie potřebná k převedení látky do stavu schopného chemické reakce Enzymy: snižují aktivační energii reakce

8 Enzymová katalýza stěny krabice bariéry aktivační energie pro čtyři reakce; snížení aktivační energie pro reakci 1 Mechanismus působení přenašečů analogie s aktivační energií u chemických reakcí a jejím snížením působením enzymů

9 JEDNOTKY ENZYMOVÉ AKTIVITY U (z angl. unit): takové množství enzymu, které katalyzuje přeměnu 1 molu substrátu za minutu za standardních podmínek (tj. nasycení enzymu substrátem, udaná teplota a ph) Katal: takové množství aktivity, které přemění 1 mol substrátu za 1 sekundu za standardních podmínek 1 kat = U 1 U = 16,67 nkat Číslo přeměny: počet molekul substrátu, které se přemění za 1 minutu jednou molekulou enzymu

10 REGULACE ENZYMOVÉ AKTIVITY vliv ph ph optimum vliv teploty teplotní optimum aktivace enzymy často produkovány v neaktivní formě tzv. proenzymu (zymogenu). aktivace proteolytickým štěpením (např. kyselé prostředí žaludku: pepsinogen pepsin) nebo allosterická aktivace (změna aktivního místa). inhibice reverzibilní a ireverzibilní

11 KINETIKA podle Michaelise a Mentenové Michaelisova konstanta koncentrace substrátu, při níž se dosáhne poloviny maximální rychlosti Rovnice Michaelise a Mentenové Číslo přeměny počet molekul substrátu přeměněných jednou molekulou enzymu za jednotku času

12 Lineární transformace Lineweaver-Burk rovnici Michaelise a Mentenové (rovnice hyperboly) lze převést na rovnici přímky

13 INHIBICE ENZYMŮ

14 ALOSTERICKÉ ENZYMY Sigmoidní závislost [v] - [S] složeny z více podjednotek podjednotky se vzájemně ovlivňují kooperativní efekt: vazba substrátu na podjednotku změny u ostatních podjednotek změna jejich afinity k substrátu

15 Alosterické enzymy

16 Alosterický aktivátor usnadňuje vazbu substrátu posun saturační křivky k nižším koncentracím substrátu saturační křivka méně sigmoidní, při vysoké koncentraci aktivátoru hyperbola Alosterický inhibitor znesnadňuje vazbu substrátu posun saturační křivky k vyšším koncentracím substrátu zesílení sigmoidního efektu

17 AKTIVACE A INHIBICE FOSFORYLACÍ

18 Cytoskelet a extracelulární matrix Kožní buňka byla fixována a obarvena Coomassie-modří, která barví všechny proteiny.

19 Tři typy proteinových filament, která vytvářejí cytoskelet aktinová filamenta střední filamenta mikrotubuly značeno různými fluorescenčními barvivy

20 Aktinová vlákna (A) (B) (C) (A) elektronmikroskopický snímek aktinových vláken (B) uspořádání aktinových molekul v aktinovém filamentu (vlákno je dvojšroubovice se závitem opakujícím se každých 37 nm), silné interakce mezi vlákny zabraňují rozvolnění šroubovice (C) shodné podjednotky aktinového filamenta zobrazeny stejnou barvou (zdůraznění těsných interakcí mezi každou aktinovou molekulou a čtyřmi dalšími molekulami s ní sousedícími)

21 Polymerace aktinu Aktinové monomery v cytosolu nesou ATP hydrolyzován na ADP krátce po zapojení monomerů do rostoucího aktinového vlákna. Molekuly ADP zachyceny uvnitř aktinového vlákna bez možnosti výměny za ATP, dokud se aktinové monomery, který je nesou, neoddělí od filamenta a nedostanou se zpět do monomerní formy.

22 Myosiny (A) (B) (C) myosin I: jednořetězcová molekula s jednou globulární hlavičkou a koncem, který se může vázat k jiné molekule nebo k buněčné organele; napojená molekula či organela tažena podél drah, vytýčených aktinovými vlákny myosin II: složen ze dvou identických myosinových molekul, má dvě globulární hlavičky a konec ve formě stočené šroubovice myosinové vlákno: konce myosinu II se mohou navzájem spojovat a vytvářet myosinové vlákno, hlavy myosinu II trčí navenek; holá oblast uprostřed vlákna složená pouze z konců vláken

23 Funkce myosinu v eukaryontních buňkách Hlavičky myosinů se pohybují po aktinových filamentech směrem k jejich plus-koncům. krátký konec molekuly myosinu I obsahuje vazebná místa pro různé buněčné složky, včetně membrán (A) pohyb membránových váčků podél aktinových vláken (C) pohyb aktinovým filamentem vzhledem k plasmatické membráně malá vlákna složená z molekul myosinu II schopna posunovat aktinová vlákna proti sobě místní zkracování svazků aktinových vláken (B)

24 Svazky aktinových vláken v buňkách Aktinové buněčné struktury (A) Mikroklky na povrchu střevní výstelky. (B) Kontraktilní svazky v cytoplasmě. (C) Listovité (lamellipodia) a prstovité (filopodia) výběžky na vedoucím okraji pohybující se buňky. (D) Kontraktilní prstenec během buněčného dělení.

25 Stavba středního filamenta Elektronmikroskopický snímek hotová střední filamenta o průměru 10 nm Schéma (A) monomer proteinu středního filamenta složený ze střední tyčinkovité oblasti a z globulárních oblastí na obou koncích (B) páry monomerů se spojují do dimerů (C) dva dimery se spojují paralelně s určitým posunem a vytvářejí tetramer (D) tetramery se uspořádávají spojením svých konců (E) tetramery se skládají do stočené struktury připomínající lano (zobrazeno také rozvinutí do plochy)

26 Extracelulární matrix a organizace buněk do tkání Histologický snímek tenkého střeva u myši

27 TKÁNĚ Tkáně tvoří buňky s vnitřní sítí cytoskeletálních filament extracelulární matrix cévy, nervy a další komponenty Rozdělení tkání svalové epitelové (epiteliální) pojivové nervové

28 TKÁNĚ buňky mnohobuněčného organismu uspořádány do spolupracujících uskupení tkání (např. nervové, pojivové, svalové, epitelové) tvořeny buňkami s jejich vnitřní sítí cytoskeletálních filament a extracelulární matrix extracelulární matrix dává podpůrným tkáním pevnost buňky navzájem spojeny pomocí extracelulární matrix nebo přímým kontaktem spoje mezi buňkami v pružných a pohyblivých tkáních živočichů přenášejí síly z cytoskeletu jedné buňky do sousední nebo z cytoskeletu buňky na extracelulární matrix stejně jako se budova neobejde bez rozvodných sítí, telefonních linek a dalšího vybavení, potřebuje živočišná tkáň krevní cévy, nervy a další komponenty vytvářené mnoha specializovanými buněčnými typy

29 Organizace buněk ve tkáních Příčný řez stěnou savčího střeva tkáň epitelová, pojivová, svalová tkáně složeny z organizovaného shluku buněk, navzájem spojených na základě mezibuněčných adhezí, pomocí extracelulární matrix nebo oběma způsoby

30 Tři klíčové faktory, které udržují buněčnou organizaci tkání signály od ostatních buněk selektivní mezibuněčná vazba genová exprese uchování charakteru, přenos na potomstvo

31 Tři klíčové faktory, které udržují buněčnou organizaci tkání Tkáně jsou propojením mnoha buněčných typů, které musí zůstat odlišné jeden od druhého v průběhu koexistence ve stejném prostředí. Buňky téměř všech dospělých tkání neustále umírají a jsou nahrazovány novými; v průběhu buněčné a tkáňové obnovy musí zůstat organizace tkáně zachována. Umožněno třemi faktory: Buněčná komunikace: Každý typ specializovaných buněk neustále kontroluje své okolí a vnímá signály od ostatních buněk, podle toho přizpůsobuje svoji proliferaci a vlastnosti; nové buňky vznikají pouze tehdy a tam, kde jich je třeba. Selektivní mezibuněčná adheze: Různé buněčné typy mají tendence selektivně se vázat homofilní vazbou k ostatním buňkám stejného typu, vytvářet kontakty s určitými jinými buněčnými typy nebo se specifickými složkami extracelulární matrix. Selektivní adheze zabraňuje chaotickému promíchání různých buněčných typů v tkáni. Buněčná paměť: Speciální formy genové exprese vyvolané signály působícími v průběhu embryonálního vývoje jsou stabilně udržovány, takže si buňky autonomně uchovávají svůj určitý charakter a přenášejí ho na své potomstvo.

32 SVALOVÉ TKÁNĚ epitelové tkáně pojivové tkáně nervové tkáně

33 Kosterní svalová buňka Mnohojaderné buňky (svalová vlákna), 50 μm v průměru, dlouhé i několik centimetrů; četné myofibrily, s pravidelným uspořádáním vláken aktinu a myosinu (příčně pruhovaný vzhled myofibril). Elektronmikroskopický snímek podélného řezu kosterní svalové buňky králíka při malém zvětšení (pravidelné uspořádání sarkomer, kontraktilních jednotek myofibril).

34 Sarkomery Detail snímku kosterní svalové buňky (dvě paralelní myofibrily s jednou celou sarkomerou a dvěma polovinami sarkomer). Schematické zobrazení sarkomery, původ tmavých a světlých pruhů, viditelných pod mikroskopem. Z-disky na obou stranách sarkomery jsou místy, kam se upínají aktinová vlákna; uprostřed silná vlákna, každé sestává z mnoha molekul myosinu II.

35 Svalový stah Myosinová a aktinová vlákna sarkomery se překrývají symetricky na obou stranách od středové linie sarkomery; aktinová vlákna ukotvena svými plus-konci na Z-disku; myosinová vlákna bipolární. Během stahu se aktinová a myosinová vlákna vzájemně posunují, aniž by se sama zkracovala; posunování poháněno myosinovými hlavičkami, kráčejí směrem k plus-koncům aktinových vláken.

36 Cyklus změn, pomocí nichž dochází ke kráčení molekul myosinu podél aktinového vlákna

37 PŘIPOJENÍ Na začátku cyklu je myosinová hlavička bez navázaného nukleotidu pevně spojena s aktinovým vláknem v tzv. rigorové konfiguraci (podle rigor mortis, což je mrtvolná tuhost). V aktivně se zkracujícím svalu je tato fáze velmi krátká a obvykle se ukončí navázáním ATP. UVOLNĚNÍ Molekula ATP se váže k velkému zářezu na zadní straně hlavičky, tedy co nejdále od aktinového vlákna, a okamžitě způsobuje drobnou změnu v konformaci těch domén, které tvoří aktin-vázající místo. To snižuje afinitu hlavičky vůči aktinu a dovoluje mu pohyb podél vlákna. (Prostor tady nakreslený mezi hlavičkou a aktinem zdůrazňuje tuto změnu, i když ve skutečnosti zřejmě zůstává hlavička velmi blízko aktinu.) NAKLONĚNÍ Zářez se uzavře kolem molekuly ATP jako škeble a spustí tak mohutnou změnu tvaru, která vede k tomu, že se hlavička posune podél vlákna o přibližně 5 nm. Dojde k hydrolýze ATP, ale ADP a Pi zůstávají vázány k proteinu. SILOVÝ ZÁBĚR Slabá vazba myosinové hlavičky na novém místě na aktinovém vlákně způsobí uvolnění anorganického fosfátu z hydrolýzy ATP, za současného pevného navázání hlavičky na aktinové vlákno. Toto uvolnění fosfátu spouští silový záběr, což je silotvorná změna tvaru molekuly, při níž hlavička získá zpět svoji původní konformaci. Během silového záběru ztrácí hlavička navázaný ADP, a vrací se tak na start nového cyklu. PŘIPOJENÍ Na konci cyklu se myosinová hlavička opět octne v těsném sevření s aktinovým vláknem v rigorové konfiguraci. Všimněte si, že hlavička se po aktinovém vlákně posunula do nové polohy.

38 svalové tkáně EPITELOVÉ TKÁNĚ pojivové tkáně nervové tkáně

39 Střední filamenta zpevňují živočišné buňky vrstva epiteliálních buněk natažena vnějšími silami (vznikajícími např. růstem nebo pohybem okolní tkáně) síť tvořená středními filamenty a desmosomy roztažena bude omezovat míru natažení pokud by v epitelu byly přítomny pouze desmosomy bez středních filament, stejné vnější síly by způsobily silnou deformaci buněk, vedoucí až k roztržení plasmatické membrány a poškození epitelu

40 Souhrnné schéma hlavních typů mezibuněčných spojů v epitelech živočichů Těsné spoje jsou charakteristické pro epitely; ostatní spoje v modifikované podobě také v různých mimoepiteliálních tkáních.

41 Těsné spoje bariéra proti difúzi (A) malé značené molekuly přidané na jednu stranu epitelu nemohou projít přes těsné spoje, které pevně připojují sousední buňky k sobě. (B) elektronmikroskopický snímek buněk epitelu s přídavkem malé značené molekuly (tmavě obarvená) na apikální stranu (vlevo) i bazolaterální stranu (vpravo); značené molekuly zastaveny těsnými spoji. (C) model struktury těsného spoje ukazuje, jak jsou buňky pravděpodobně připojeny k sobě proteiny ve vnější vrstvě lipidové dvojité vrstvy plasmatické membrány. (C)

42 Molekuly kadherinu zprostředkovávají mechanické připojení jedné buňky k druhé Dvě stejné molekuly kadherinů v plasmatických membránách sousedních buněk se vzájemně vážou; intracelulárně jsou prostřednictvím spojníkových proteinů připojeny k cytoskeletálním vláknům.

43 Adhezní pásy (pásové desmosomy) epiteliálních buněk tenkého střeva (mechanické spoje) Blízko vrcholu každé buňky pod cytoplasmatickým povrchem plasmatické membrány kontraktilní svazek aktinových filament spojený se svazkem aktinových filament v sousedních buňkách pomocí kadherinových molekul, které procházejí buněčnými membránami.

44 Ohýbající se epiteliální list tvoří trubici nebo váček Kontrakce svazku aktinových filament, která jsou mezi buňkami propojena mechanickými spoji, způsobuje zúžení epiteliálních buněk na jejich apikální straně. Podle toho, zda je kontrakce orientována podle jedné osy nebo rovnoměrně ve všech směrech, se epitel stáčí buď do trubice nebo invaginuje a vytváří váček. Tvorba nervové trubice; elektronmikroskopický snímek ukazuje kolmý řez trupem dvoudenního kuřecího embrya (část epitelu, který pokrývá povrch embrya, zesílila, apikální kontrakcí se stočila do trubice a připravuje se k oddělení, aby se z ní stala samostatná vnitřní struktura). Tvorba čočky; část povrchového epitelu pokrývajícího zárodečný základ oční sítnice se vydul a nakonec se odštěpil jako samostatný čočkový váček uvnitř očního pohárku.

45 Desmosomy (A) spojení dvou buněk v epidermis čolka a přichycení keratinových filament (B) desmosom na cytoplasmatickém povrchu každé z membrán destička z intracelulárních příchytných proteinů, na vnitřní straně intermediární filamenta (keratinová), na vnější straně proteiny z kadherinové rodiny (procházejí membránou a vážou obě buňky k sobě); pevnost v tahu hojné na exponovaných epitelech (kůže) (C) lidská epidermis se svazky keratinových filament, procházejí cytoplasmou jedné z hlouběji uložených buněk k desmosomům, kterými je buňka spojena se svými sousedy; mezi sousedními buňkami otevřené kanály, přes metabolicky aktivní tkáň volně difundují živiny

46 Hemidesmosom ukotvuje keratinová filamenta epiteliální buňky k bazální membráně Epiteliální buňky musí být, kromě pevného připojení jedna k druhé, ukotveny ke tkáním ležícím pod nimi. Ukotvení je zprostředkováno integriny proteiny bazální plasmatické membrány epiteliálních buněk. Vně se vážou k lamininu v bazální lamině; uvnitř buňky ke keratinovým filamentům struktura podobá polovině desmosomu hemidesmosomy.

47 Mezerové spoje Tenký řez mezerovým spojem mezi dvěma buňkami v kultuře na snímku z elektronového mikroskopu. Interagující plasmatické membrány dvou sousedních buněk. Přiložené dvojné vrstvy lipidů prostoupeny proteinovými komplexy (konexony) složenými ze šesti stejných proteinových podjednotek, tzv. konexinů. Dva konexony se spojují a přemosťují štěrbinu mezi buňkami a vytváří mezi nimi pro vodu propustný kanál.

48 svalové tkáně epiteliální tkáně POJIVOVÉ TKÁNĚ nervové tkáně

49 Pojivové tkáně Buňky Mezibuněčná hmota Kloubní chrupavka kolagen chondrocyt proteoglykan

50 Kolagen Molekula: tři dlouhé polypeptidové řetězce v každé třetí poloze glycin pravidelná struktura možnost vzájemného ovíjení dlouhá pravidelná trojšroubovice kolagenová vlákna kolagenová fibrila trojšroubovicová molekula kolagenu jednoduchý polypeptidový řetězec kolagenu

51 Kolagen V exrtacelulární hmotě uspořádání s rozmanitou orientací (paralelní svazky, sítě, vrstvy s různou orientací ). sekrece v podobě prokolagenu přídavné peptidy zabraňují uspořádání do fibril po odštěpení kolagenázou (extracelulárně) fibrily pouze vně buňky

52 Hyperelastická kůže James Morris, muž s elastickou kůží, na fotografii přibližně z roku Abnormálně roztažitelná kůže je příznakem genetického syndromu, který je důsledkem chyby v sestavování nebo zesíťování kolagenu. U některých jedinců je příčinou nepřítomnost kolagenázy, která přeměňuje prokolagen na kolagen.

53 Elastin volné a nečleněné polypeptidové řetězce kovalentně spojeny do elastické síťoviny příčinou elasticity schopnost molekul proteinu reverzibilně se rozvinout při napětí natahování a stahování bez roztržení (kůže, tepny, plíce)

54 Molekulové spojení extracelulární matrix a cytoskeletu u živočišné buňky (A) schéma a (B) fotografie molekuly fibronektinu (C) transmembránové spojení zprostředkované integrinovou molekulou: molekula integrinu přenáší napětí přes plasmatickou membránu uvnitř buňky je připojena k cytoskeletu a vně přes fibronektin k extracelulární matrix; plasmatická membrána tedy nemusí být pevná

55 Proteoglykanový agregát z chrupavky Elektronmikroskopický snímek agregátu rozprostřeného do plochy (mnoho volných podjednotek ve skutečnosti také velkých proteoglykanových molekul). Schematický nákres obřího agregátu, ukazující jeho stavbu z GAG a proteinů. Molekulová hmotnost komplexu i více než 100 MDa; zaujímá prostor ekvivalentní bakterii, ( cm 3 ).

56 Kyselina hyaluronová, relativně jednoduchý GAG Tvořena jedním dlouhým řetězcem z více než opakujících se disacharidových jednotek, každá záporný náboj. Jedním ze sacharidových monomerů každého disacharidu aminocukr. Mnoho GAG obsahuje další záporně nabité postranní skupiny, převážně sulfáty.

57 svalové tkáně epitelové tkáně pojivové tkáně NERVOVÉ TKÁNĚ

58 Signalizace v nervových buňkách Signál změna membránového potenciálu pasivní šíření signálu nevhodné aktivní signální mechanismus Akční potenciál (nervový impuls) putující vlna elektrického vzruchu na konec axonu (nervového zakončení) Přeměna elektrického signálu v chemický nervové mediátory Přeměna chemického signálu v elektrický Vzrušivá a tlumivá synapse excitační a inhibiční mediátory

59 Akční potenciál červená křivka klidový membránový potenciál: 60 mv akční potenciál: po depolarizaci membrány asi o 20 mv membránový potenciál 40 mv prahová hodnota pro spuštění akčního potenciálu po spuštění akčního potenciálu, rychlá depolarizace membrány membránový potenciál +40 mv po průchodu akčního potenciálu návrat ke klidové hodnotě 60 mv zelená křivka ukazuje, jak by se membránový potenciál po počátečním depolarizačním podnětu postupně vracel ke své klidové hodnotě, pokud by v plasmatické membráně nebyly žádné napěťově ovládané iontové kanály

60 Tok iontů a akční potenciál akční potenciál spuštěn krátkým elektrický impulsem depolarizace membrány otevření a následná inaktivace elektricky ovládaných sodných kanálů ani při opětovné stimulaci nemůže membrána vytvořit další akční potenciál, dokud se kanály nevrátí z inaktivované do uzavřené konformace

61 Šíření akčního potenciálu podél axonu (A) napětí, které by bylo možné zaznamenat z řady intracelulárních elektrod umístěných v pravidelných vzdálenostech od sebe podél axonu akční potenciál neslábne (B) změny v Na + -kanálech a tocích proudu dávají vznik membránovému potenciálu; oblast axonu s depolarizovanou membránou: Akční potenciál se může šířit jen dopředu, inaktivace sodných kanálů brání šíření depolarizace opačným směrem.

62 Přeměna signálů v synapsi Akční potenciál v nervovém zakončení otevření elektricky ovládaných Ca 2+ - kanálů v plasmatické membráně vápenaté ionty do zakončení nervové buňky. Zvýšená koncentrace Ca 2+ v nervovém zakončení stimuluje synaptické váčky k fúzi s presynaptickou membránou, při níž se uvolní v nich obsažený nervový mediátor do synaptické štěrbiny Uvolněný nervový mediátor se váže na chemicky regulované iontové kanály v plasmatické membráně postsynaptické buňky a otevírá je. Výsledné toky iontů mění membránový potenciál postsynaptické buňky, a tím převedou chemický signál zpět do elektrické podoby.

63 Metody buněčné a molekulární biologie

64 Studium morfologie - mikroskopie Optická mikroskopie Fluorescenční a konfokální mikroskopie Fluorofory a immunocytochemie Elektronová mikroskopie Rastovací elektronová mikroskopie (SEM) = odražené elektrony = kontury povrchů Transmisní elektronová mikroskopie (TEM) = procházející elektrony = složený vzorků Mikroskopie atomárních sil (AFM) Sledování kontur povrchu pomocí atomárních hrotů

65 Optická mikroskopie Rozlišovací schopnost: vzdálenost dvou bodů, které mikroskop zobrazí jako dva samostatné body. Je dána zářením, kterým objekt osvětlujeme, a vlastnostmi objektivu. Okulár pouze zvětšuje obraz tvořený objektivem. Obecně platí, že není možné rozlišit body bližší než polovina vlnové délky záření. U světla se to tedy rovná zhruba 250nm.

66 Vzpřímené a invertované mikroskopy

67 Fázový kontrast - sledování buněk Buňky jsou nízko kontrastním objektem Pro zvýšení kontrastu se využívá fázového filtru - filtr obsahuje fázový prstenec pro posun světla Princip: při přechodu objektem dochází k posunu fáze procházejícího světla fázová destička umožňuje posun o ¼ fáze při sumaci dochází k změně v intenzitě světla

68 Fluorescenční mikroskopie Fluorescenční mikroskop umožňuje analýzu pomocí fluorescenčního značení Mikroskop obsahuje (navíc): Zdroj světla (Hg výbojka) tvořící bíle světlo Excitační filtry (úprava procházejícíce světla) Emisní filtry (úprava vyžarujícího světla) Detektor (CCD čip) Epifluorescence mikroskopy s optickou sestavou kde excitační i emisní paprsek prochází objektivem

69 Fluorescence a fluorofory Fluorescence: jev při kterém dochází k absorpci fotonu a následně jeho emisi vyzářením Energie emitovaného fotonu se snižuje přechodem mezi energetickými hladinami vlnová délka emitovaného světla je delší než absorbovaného fotonu Látky s fluorescenčními vlastnostmi se nazývají fluorofory Photobleaching = vysvědcování látek v důsledku poškození světlem

70 Fluorescence a fluorofory Fluorofory mají typické absorpční a emisní spektra Vhodnou konjugací k detekčním molekulám dojde k jejich vizualizaci Fluorescenční proteiny zelený (GFP) a žlutý (YFP)

71 Fluorescence a fluorofory

72

73 Sledování živých buněk

74 Sledování živých buněk

75 Konfokální mikroskopie Zvýšení rozlišení pomocí ztenčení řezu a tím zaostření Využívá se pro to volitelná šíře štěrbiny pro emitované světlo Zdroj záření = laser

76 Výhody konfokální mikroskopie Nižší šum mezi kanály použití laserů umožňuje přesnější excitaci při vhodné vlnové délce Snížení šumu díky tenčím řezům i snížení zamlžení snímků Tvorba 3D obrazců skládáním tenkých řezů informace o výšce a plasticitě objektů Fluorescence Konfokál

77 Elektronová mikroskopie Rastrovací elektronová mikroskopie (SEM): Elektronové dělo produkuje proud elektronů Magnetické čočky usměrňují paprsek Detektor snímá odražené elektrony od vzorku Transmisní elektronová mikroskopie (TEM): Elektrony procházející přes vzorek jsou promítány na detektoru

78 SEM TEM

79 Mikroskopie atomárních sil (AFM) Tvorba obrazu pomocí extrémně ostrého mikrohrotu zakončeného atomem Skenovací mód udržuje konstantní sílu mezi skenovaným povrchem a hrotem nosiče.

80 METODY STUDIA nukleových kyselin

81 PCR - Polymerase Chain Reaction - polymerázová řetězová reakce rychlé a selektivní namnožení konkrétní nukleotidové sekvence obsažené v jakékoli DNA velice citlivá metoda, umožňuje detekci jediné kopie DNA ve vzorku tím, že tuto sekvenci namnoží do té míry, že ji můžeme po separaci gelovou elektroforézou a obarvení snadno detegovat Na základě znalosti sekvence DNA, kterou chceme amplifikovat, nasyntetizovány oligonukleotidy (primery), každý komplementární k sekvenci jednoho řetězce dvojšroubovice na opačných koncích úseku, který má být amplifikován. Oligonukleotidy slouží jako primery pro syntézu DNA in vitro pomocí DNA-polymerázy, ohraničují amplifikovaný segment.

82 PCR 1. krok PCR začíná s dvouřetězcovou DNA, na začátku každého cyklu je třeba od sebe oddělit oba řetězce krátkým zvýšením teploty. 2. krok Po denaturaci reakční roztok ochlazen v přítomnosti velkého nadbytku obou primerů, které nasedají na obě komplementární sekvence DNA. 3. krok Z obou primerů jsou syntetizovány nové řetězce DNA v přítomnosti DNA polymerázy a všech čtyř deoxyribonukleostidtrifosfátů. Další cyklus znovu zahájen denaturací zvýšenou teplotou, dojde k oddělení nasyntetizovaných řetězců DNA. Založeno na použití speciální DNA-polymerázy, která byla izolována z termofilní bakterie není denaturována vysokou teplotou v 1. kroku. t = 94 C t 60 C (primery) t = 72 C

83 PCR

84 Cycler

85 Detekce - elektroforéza Barvení - ethidium bromid

86 Real Time Quantitative PCR detekce produktu PCR v průběhu reakce (pomocí fluorescenční molekuly) kvalitativní (detekce určité sekvence) kvantitativní (počet kopií) - přírůstek množství DNA v reakční směsi v reálném čase 2 způsoby: interkalační barvivo typu SYBRgreen nespecifické; jakékoli zvýšení množství DNA TaqMan sonda oligonukleotid obsahující na jednom konci fluorescenční barvu, na druhém zhášeč fluorescence při degradaci sondy DNA polymerasou se uvolní fluorescenční barvivo a zvýší se intenzita fluorescence specifičtější; při použití různých fluorescenčních barviv o rozdílných excitačních vlnových délkách umožňuje i sledování exprese více genů zároveň

87 Real Time Quantitative PCR Amplifikační křivka: esovitě zakřivený tvar 3 části: 1. background" fáze amplifikátu tak málo, že jeho fluorescence ještě nedosahuje měřitelných hodnot; 2. exponenciální fáze množství produktu exponenciálně roste (asi 4-8 cyklů) 3. plató fáze saturace systému, množství amplifikovaného produktu se dále nemění, fluorescenční signál zůstává konstantní. Čím dříve amplifikační křivka dosáhne exponenciální fáze, popř. překročí určitý fluorescenční práh umístěný do této fáze, tím více startovních templátových molekul bylo přítomno ve vzorku na počátku reakce. C T (threshold cycle): rovný cyklu, kdy amplifikační křivka překročí fluorescenční práh umístěný do exponenciální fáze reakce

88

89 Absolutní kvantifikace determinace výchozího počtu kopií cílových molekul (např. při detekci specifických mikroorganismů) lineární vztah mezi logaritmem startovního počtu templátových kopií a C T příslušné amplifikační křivky amplifikace vzorku o neznámé koncentraci společně s diluční sérií standardů o známé koncentraci kalibrační přímka (standard curve) lze odečíst výchozí koncentraci neznámého vzorku Relativní kvantifikace ke stanovení míry genové exprese zpravidla nevyžaduje sestrojení kalibrační přímky porovnání relativní změny genové exprese (relativní expresní poměr) v testovaném vzorku oproti kontrolnímu vzorku (např. mrna neovlivněných buněk) C T amplifikační křivky daného genu se vždy normalizuje oproti C T housekeeping genu Při kvantifikaci mrna (měření genové exprese) před vlastní PCR reversní transkripce (RT-PCR) přepis mrna do tzv. cdna, která je následně amplifikována.

90 METODY STUDIA proteinů

91 ELEKTROFORÉZA Princip Použití dělení nabitých částic na základě různých elektroforetických pohyblivostí analytické i preparativní

92 Faktory ovlivňující pohyb iontů F E hnací elektrostatická síla F qe E F F brzdící síla vnitřního tření daná Stokesovou rovnicí F 6π F rv F E = F F q náboj [C] qe v 6π r E intenzita el. pole [Vm 1 ] F síla v rychlost [ms 1 ] r poloměr částice [m] η viskozita [Pa s] Rychlost pohybu iontu ve stejnosměrném elektrickém poli přímo úměrná intenzitě pole a nepřímo viskozitě

93 Elektroforetická pohyblivost nabité částice [m 2 s 1 V 1 ] rychlost částice v elektrickém poli o jednotkové intenzitě μ v E 6π q ηr Elektroforetická pohyblivost nabité částice souvisí s intenzitou elektrického pole, nábojem, tvarem, difúzí, teplotou, viskozitou prostředí možnost interakce částic navzájem (agregace) a s prostředím Amfolyty: molekuly obsahují kyselou i zásaditou skupinu; vlastnosti slabé kyseliny i zásady Amfoterní povaha proteinů: v důsledku vnitřní ionizace mají proteiny kladné i záporné náboje Izoelektrický bod: ph, při kterém je celkový počet kladných a záporných nábojů stejný, molekula je navenek elektroneutrální

94 Parametry separace náboj velikost tvar Koncentrace gelu nižší dělení pouze podle náboje vyšší nebo gradient dělení také podle velikosti a tvaru Vliv ph - ovlivňuje náboj, stabilitu, aktivitu "kyselá" (kyselé ph): + "alkalická" (alkalické ph): + Směr migrace závisí na pi proteinů všechny nemusí "putovat gelem"

95 SDS-PAGE ELFO na PAGE v přítomnosti SDS (Sodium Dodecyl Sulphate dodecylsíran sodný) SDS se váže na proteiny, uděluje jim uniformní záporný náboj

96

97 Vyhodnocení relativní mobilita vztažená ke konci gelu graf závislosti logm r (MW) x R F

98 WESTERN BLOTTING 1. elektroforéza rozdělení proteinů, např. SDS-PAGE 2. blotting přenos na membránu, např. elektroforeticky 3. detekce (většinou imunodetekce)

99 CHROMATOGRAFIE

100 1. Podle skupenství mobilní a stacionární fáze chromatografie mobilní stacionární typ chromatografie fáze fáze (systém) plynová plynná pevná plyn - tuhá látka gas gas-solid chrom. chromatography GSC GC plynná kapalná plyn - kapalina gas-liquid chrom. GLC kapalinová kapalná pevná kapalina - tuhá látka liquid liquid-solid chrom. chromatography LSC LC kapalná kapalná kapalina - kapalina liquid-liquid chrom. LLC

101 2. Podle provedení na sloupcích (kolonách) CC (column chromatography) na tenké vrstvě TLC (thin layer chromatography) na tenké vrstvě gelu TGLC (thin gel layer chromatography) na papíře PC (paper chromatography) 3. Podle proměnlivosti podmínek izokratická (konstantní) gradientová

102 4. Podle druhu rovnovážných sil adsorpční (mobilní fáze - pevný adsorbent) rozdělovací (zakotvená kapalná fáze, mobilní plynná nebo kapalná) hydrofobní ionexová (výměna iontů - na iontoměničích) permeační (gelová filtrace) afinitní

103 Ionexová chromatografie Iontoměnič - ionex - pevné (nerozpustné) látky (výjimečně kapaliny) schopné vyměňovat ionty s kapalnými fázemi (většinou vodnými roztoky) Anex výměna aniontů bazické funkční skupiny Katex výměna kationtů kyselé funkční skupiny

104 Ionexová chromatografie start 2. absorpce látek ze vzorku 3. začátek desorpce 4. konec desorpce 5. regenerace ionexu dělené látky ionty startovního pufru ionty elučního činidla ionex

105 Gelová chromatografie gelová permeační chromatografie, gelová filtrace vliv rozměry molekul malé molekuly pronikají do nitra částic, zpožďují se omezená difúze - nízká difúzní konstanta u velkých molekul

106 Afinitní chromatografie založena na specifické interakci mezi látkou (protein, nukleová kys.) a ligandem kovalentně vázaným na povrchu nosiče Postup imobilizace ligandu adsorpce vzorku desorpce vzorku (eluce)

107 SPEKTROFOTOMETRIE zabývá se kvantitativním studiem spekter měřením množství světla látkou propuštěného, odraženého nebo pohlceného v závislosti na vlnové délce

108 Při interakci elektromagnetického záření (světla) vhodné vlnové délky s částicemi látky dochází k využití energie fotonu (absorpci) pro excitaci valenčních elektronů. Intenzita prošlého světla (I) je menší než intenzita světla na látku dopadajícího (I o ). Transmitance (T) zeslabení intenzity světla po průchodu roztokem látky, tedy množství světla určité vlnové délky, které prošlo vzorkem. Určena poměrem I/I o. Absorbance (A) záporný dekadický logaritmus transmitance T I I 0 A log 10 I I 0

109 Lambert-Beerův zákon vztah mezi koncentrací látky v roztoku a absorbancí A log 10 Při dané vlnové délce je absorbance přímo úměrná koncentraci látky (c) a tloušťce absorbující vrstvy (l) délce optické dráhy neboli šířce kyvety. Molární extinkční (absorpční) koeficient ε je specifický pro danou látku a vlnovou délku. I I 0 c l

110 Použití: měření absorpčních spekter (širší spektrum vlnových délek) kvantitativní stanovení (při jedné anebo několika vlnových délkách). kinetika jednoduchých, například enzymových reakcí široké uplatnění chemie, fyzika, biochemie, biologie i medicína Klinická biochemie: Stanovení koncentrací látek obsažených v tekutinách reakce látky s příslušným indikátorem například za vzniku barevné sloučeniny spektrofotometrické zjištění koncentrace sledované látky

111 ELISA Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay založena na vysoce specifické interakci antigenu a protilátky, přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navázán enzym (nejčastěji peroxidáza nebo alkalická fosfatáza), který katalyzuje chemickou přeměnu substrátu přidaného do reakční směsi na barevný nebo fluoreskující produkt. Komplex protilátky s antigenem je imobilizován na pevný povrch (nejčastěji mikrotitrační destičku). Stanovení: spektrofotometrické fluorimetrické Koncentrace produktu úměrná koncentraci antigenu nebo protilátky ve vzorku