Molekulární mechanismy diferenciace a morfogeneze Miloš Grim

Transkript

1 Molekulární mechanismy diferenciace a morfogeneze Miloš Grim Anatomický ústav 1. lékařské fakulty Univerzita Karlova v Praze

2 Struktura přednp ednášky Jak byl a je studován n vývoj organizmu, deskriptivní embryologie, experimentáln lní embryologie, vývojová biologie Buněč ěčné aktivity za vývoje: proliferace, apoptosa,, migrace, epithelo- mesenchymová transformace buněk, diferenciace, schopnost adherovat,, růst, r interakce buněk Signáln lní molekuly Transkripční faktory

3 Embryonální vývoj Proces, kterým z oplozeného vajíčka vzniká nový jedinec Mechanizmy embryonálního vývoje Proliferace, migrace a diferenciace buněk Vývoj tvaru - morfogeneze Růst 1. Deskriptivní embryologie přinesla popis: oplození, rýhování, gastrulace, Vznik zárodečných listů: ektoderm, mesoderm, entoderm, co vzniká ze zárodečných listů, Poznání základního stavebního plánu organizmu chorda, neurální trubice, somity, somatopleura, splanchnopleura

4 Základní stavební plán organizmu

5 2. Experimentální embryologie studovala kauzalitu (otázka proč?) Mechanizmy diferenciace buněk a morfogeneze embryonální indukce, determinace, autodiferenciace a podminěná diferenciace, nerovnoměrný růst, migrace buněk - značkování, chiméry, studium regenerace Teorie poziční informace ( L. Wolpert) Metody ultrastrukturální, biochemické, histochemické a imunohistochemické postupy - řídící faktory, obtížnost jejich izolace

6 Embryonáln lní chiméra japonské křepelky (Q) a bíléb leghornky (C) transplantace somitu, myogenní buňky v končetin etině HH 29 C Q C Q QCPN Ab

7 ED 3 Q C Embryonáln lní chiméra japonské křepelky (Q) a bíléb leghornky (C) transplantace základu z končetiny Q C C ED 17 Q Grim M, Halata Z. Anat Embryol 202: 401, 2000

8 3. Vývojová biologie (molekulární biologie + genetika + morfologie) pořadí nukleotidů kóduje molekulu proteinu, poznávání biologických dějů na úrovni genů a proteinů, vývoj studován na molekulární úrovni jako řízený děj, techniky molekulárního klonování (klon = jakýkoliv soubor přesných kopií čehokoliv vzniklý nepohlavním rozmnožováním) izolace genů a manipulace s nimi, impakt v lékařství, prevence vrozených vad, vývoj léků, funkční genomika. a) poznání molekulárních mechanizmů mezibuněčné signalizace, b) poznání jak signály z buněčných interakci ovlivňují genovou expresi c) poznání transkripčních faktorů jako regulátorů genové exprese pochopení mechanizmů diferenciace a morfogeneze

9 Technika in situ hybridizace (ISH) MyoD HH 25 umožň žňuje prokázat přítomnost tomnost určit ité genové sekvence v genomu.. Je založena na vzájemn jemné afinitě komplementárn rních sekvencí nukleových kyselin. Uměle připravené jednovláknov knové sondy hybridizují s příslušným úsekem nukleové kyseliny. K jejich přípravp pravě se používá nukleotidů značených digoxigeninem, který lze v další ším m průběhu reakce vizualizovat pomocí protilátky. tky. S komplementárn rně připravenou RNA (antisens( antisens- sondou) tvoří mrna stabilní hybrid a tak umožň žňuje prokázat mrna vytvořenou v průběhu transkripce exprimovaného genu.

10 In situ hybridizace (ISH) mrna VEGF v řezech v kombinaci s imunohistochemickým průkazem endothelu krevních cév c Nanka et al. Dev Dyn 235:723, 2006

11 Využit ití reportérov rového genu lacz ke studiu buněk neuráln lní lišty Wnt1-lacZ ED 9.5 Xgal Bgal Sieber-Blum, M. Grim,, Y.F. Hu, and V. Szeder: Dev.. Dyn. 231: 258, 2004

12 Cre-lox systém: trvalá exprese reportérov rového genu v buňkách neuráln lní lišty myš Wnt1-cre / + myš R26R / + Cre-rekombináza loxp loxp Wnt1 promotor (specifický pro neuráln lní lištu tu) R26R STOP promotor r (ubikvit( ubikvitérní) β-gal loxp loxp Wnt1-cre / R26R myš β-gal R26R STOP promotor β-gal Cre-re rekombináza rozpozná loxp a vystřihne označený STOP β-galaktozidáza je exprimována konstitutivně

13 Buněčné aktivity za vývoje: proliferace - dělení buněk, trvale se obnovující buněčné populace, statické populace diferenciace buněk - využití genetické informace různým způsobem, embryonální kmenová buňka (totipotentní), orgánové kmenové buňky (pouze (multipotentní) epithelo-mesenchymová transformace migrace - buňky se mohou pohybovat. schopnost adherovat buněčná smrt - apoptosis růst organizmu růst velikosti a počtu buněk, růst objemu mezibuněčné hmoty. Základní uspořádání organismu vzniká ve velmi malém měřítku. Růst miniaturu zvětšuje do dospělé velikosti, vyžaduje regulaci genové aktivity.

14 Proliferující buňky ve vlasových folikulech (zeleně)

15 Apoptosis Halata et al. Anat Embryol 209: 335, 2005

16 Epithelo-mesenchymov mesenchymová transformace buněk neuráln lní lišty B.M. Carlson (1999) ISH mrna Slug Prep.. M. Pleschnerová, Anat. ústav 1. LF UK HH 10

17 Migrace buněk (embryonáln lní buňky během b gastrulace, buňky neuráln lní lišty, germináln lní buňky, myogenní buňky, atd.) aktinový motor generuje pohyb buněk permisivní contact-guidance + chemorepelentní molekuly Permisivní prostřed edí: na trasách migrace fibronectin, laminin, kolagen IV, v interstitiu hyaluronová kyselina, na povrchu buněk integriny Chemorepelentní prostřed edí (proteoglykany, chondrotinsulfát Parakrinní signáln lní systémy migrace Scatter factor /c-met receptor Steel factor (stem cell factor) ) / Kit protein c-kit gen koduje transmembránový nový tyrosin kinasový receptor Steel gen koduje jeho ligandu Steel factor Stromal derived factor 1/ jeho CXCR4 receptor

18 Migrace buněk - buňky neurální lišty in vivo in vitro

19 Sítě filament aktinu - červeně, jádra - modře (buňky in vitro) Prep.. E. Krejčí, Anat. ústav 1. LF UK

20 Permisivní contact-guidance migrujících ch buněk k neuráln lní lišty fibronektin tenascin HNK-1

21 Piebaldism (defekty pigmentace, sterilita, anemie) mutace KIT genu a podobná mutace Kit genu u myši Gilbert SF: Developmental biology, 6th Edit., 2000

22 Mnohobuněčný organizmus: koordinovaný klon buněk se stejnou genetickou výbavou (genomem), ale rozdílnou diferenciací jeho buněk. Vznik mnohobuněčného organizmu je podmíněn schopností jeho buněk využít genetickou informaci různým způsobem, t.zn. vytvořit cca 200 typů specializovaných buněk. Genom však neobsahuje návod k realizaci prostorového uspořádání buněk. Neobsahuje topografickou mapu, neobsahuje informaci k poskládání buněk do určitého tvaru. K realizaci tohoto úkolu je nutný dialog mezi buňkami. Tento dialog (interakce buněk) je zprostředkován molekulami na jejich povrchu a v mezibuněčném materiálu. Interakce buněk jsou zdrojem signálů. Buňky na ně reagují změnou genové exprese = epigenetické faktory vývoje.

23 Signální molekuly (růstové faktory, cytokiny, hormony, neurotransmitery) působí mezi buňkami a indukují expresi transkripčních faktorů a jim podřízených genů. a) mají své specifické receptory a signální dráhu, v cytoplasmatické membráně. Receptory mají nitrobuněčnou složku zajišťující přenos signálu do jádra, které odpovídá změnou genové exprese b) za vývoje jsou zodpovědné za mechanizmus embryonální indukce: lokální signalizace určují, které typy buněk se budou diferencovat na určitém místě a v určitém čase c) In vitro lokální embryonální signalizaci lze nahradit složením media - přidáním růstových faktorů a signálních molekul lze cíleně navodit proliferaci a diferenciaci buněk

24

25 Diferenciace buněk k neuráln lní lišty Signální molekuly na trasách migrace buněk neurální lišty indukují expresi transkripčních faktorů a jim podřízených genů: nediferencované multipotentní buňky jsou postupně transformovány v sady bipotentních a unipotentních buněk s lokálně specifickou identitou

26 Typy buněk, které se diferencují z neuráln lní lišty v oblasti trupu B.M. Carlson (1999) HNK-1 Neurony spinálních ganglií, autonomních ganglií, eneterické neurony, Schwannovy buňky, melanocyty, buňky dřeně nadledvin

27 Další typy buněk, které se diferencují z neuráln lní lišty pouze v hlavové oblasti Jiang et al., Dev Biol 241:106, 2002 Ectomesenchym: osteoblasty, fibroblasty, chondroblasty,

28 Sonic hedgehog (Shh) nejsilněji působící dosud známá molekula odpovědná za embryonální indukci. Shh je jednak vázán na povrch buněk, které ho tvoří, jednak je část jeho molekuly Prep.: H Kolesová proteolyticky odštěpována a difunduje do okolí. Uvolňuje se např. z primitivního uzlu, z chorda dorsalis, z bazální ploténky neurální trubice, ze zóny polarizační aktivity základu končetiny. Shh podmiňuje např. ventralizaci neurální trubice, dorsoventrální polaritu somitů, polarizaci končetiny..

29 Kostní morfogenetický protein (BMP) původně izolován z tvořící se kosti jako faktor stimulující osteogenezu, je však tvořen i v základech celé řady dalších orgánů, kde se uplatňuje jako induktivní signál v průběhu jejich vývoje, ovlivňuje buněčnou odpověď na jiné růstové faktory. Wnt glykoproteiny -určují polaritu ambrya, podmiňují dorzalizaci, Růstové faktory více než 100 proteinů produkovaných řadou různých buněk; stimulují proliferaci buněk, jejich diferenciaci a přežívání, působí na buňky, které mají příslušné receptory, většinou se uplatňují jako lokální mediátory, některé přítomny i v cirkulaci. Příklady: NGF EGF PDGF FGF VEGF TGFbeta

30 Transkripční faktory proteiny jejichž společnou vlastností je schopnost vazby na specifické sekvence DNA - promotory a enhancery. Působí v jádře jako regulátory genové exprese, většinou iniciují transkripci, je známo více než 100 TF Hox geny, homeotické geny (homeosis = přeměna jedné části segmentálně uspořádaného úseku těla ve druhou), výskyt u všech eukaryotických organizmů Pax geny - 9 genů, exprese zejména v axiálních strukturách MyoD, myf-5, mrf-4, myogenin geny myogenních determinačních faktorů Tbx5 - gen identity horní končetiny, jeho mutace u člověka: Holtové-Oramův syndrom Ptx1 - gen identity dolní končetiny

31 Homeosis = přeměna jedné části segmentálně uspořádaného úseku těla ve druhou

32 Exprese genu Pax-3 3 za myogeneze

33 Pax3 mutace u myši i (splotch( mutace) Sp 1H Sp /+ 1H /+ ED 13.5 Sp 1H Sp 1H / Sp 1H Franz T et al., Anat. Embryol.. 187: 153, 1993 Pax3 mutace u člověka: Waardenburgův syndrom (defekty pigmentace, defekty svalů končetin, kardiovaskulární defekty, hypertelorismus, rozštěp patra

34 Myostatin a jeho vývojový význam Mutace genu pro myostatin: nadměrn rná proliferace svalových buněk Blokáda receptoru pro myostatin, Nadexprese folistatinu, antagonisty myostatinu