UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ. Katedra farmakologie a toxikologie

Transkript

1 UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ Katedra farmakologie a toxikologie STUDIUM ZMĚNY REAKTIVAČNÍ ÚČINNOSTI A MOŽNOSTI PROSTUPU PŘES HEMATOENCEFALICKOU BARIÉRU PO ZAVEDENÍ FLUORU DO STRUKTURY OXIMOVÉHO REAKTIVÁTORU ACETYLCHOLINESTERASY Study of change of reactivation potency and also ability of penetration throught the blood-brain barrier of newly prepared (fluorinated) acetylcholinesterase reactivator Diplomová práce Vedoucí diplomové práce: PharmDr. Marie Vopršalová, CSc. Školitel specialista: PharmDr. Jana Ţďárová Karasová Hradec Králové 2010 Ing. Pavel Jurczyk 1

2 Prohlašuji, ţe tato práce je mým původním autorským dílem. Veškerá literatura a další zdroje, z nichţ jsem při zpracování čerpal, jsou uvedeny v seznamu pouţité literatury a v práci řádně citovány. Místo a datum: Podpis: 2

3 Tato diplomová práce vznikla v laboratoři katedry toxikologie, Fakulty vojenského zdravotnictví Univerzity obrany v Hradci Králové ve spolupráci s PharmDr. Janou Ţďárovou Karasovou. 3

4 Chtěl bych poděkovat PharmDr. Marii Vopršalové, CSc. za odborné vedení, konzultace a čas, který věnovala mé práci. Chtěl bych téţ velmi poděkovat PharmDr. Janě Ţďárové Karasové za pomoc při práci v laboratoři, ochotu a pomoc při realizaci mé diplomové práce. Také bych rád poděkoval kolektivu katedry toxikologie, Fakulty vojenského zdravotnictví Univerzity obrany za příjemné pracovní prostředí. 4

5 OBSAH 1. SEZNAM POUŢITÝCH ZKRATEK 7 2. ÚVOD 9 3. CÍL PRÁCE TEORETICKÁ ČÁST Charakteristika NPL Fyzikálně-chemické vlastnosti NPL Brány vstupu NPL do organismu Mechanismus účinku NPL Cholinesterasy Aktivní místo AChE Fáze účinku NPL Klinické příznaky akutní intoxikace NPL Diagnóza otravy NPL Terapie otravy NPL Obecné zásady terapie Anticholinergika Reaktivátory AChE MATERIÁL A METODIKA Chemikálie Zvířata Roztoky pro biochemické stanovení Substrát Kalibrační roztok Biochemické stanovení aktivity cholinesteras In vivo experiment Kalibrace Princip metody Statistické hodnocení výsledků VÝSLEDKY DISKUSE ZÁVĚR

6 9. ABSTRAKT ABSTRACT POUŢITÁ LITERATURA

7 1. SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK AČR armáda České republiky ACh acetylcholin AChE; EC acetylcholinesterasa ATChJ acetylthiocholin jodid BuCh butyrylcholin BuChE; EC butyrylcholinesterasa BuTChJ butyrylthiocholin jodid CO 2 oxid uhličitý CNS centrální nervový systém DTNB 5,5`-dithiobis(2-nitrobenzoová) kyselina GIT gastrointestinální systém HCl kyselina chlorovodíková HEB hematoencefalická bariéra i.m. intramuskulární aplikace i.v. intravenózní aplikace 7

8 LD 50 dávka toxické látky, která způsobuje smrt u 50 % testované populace NPL nervově paralytická látka OF organofosforový PNS periferní nervový systém Tris tris-(hydroxymethyl)aminomethan 8

9 2. ÚVOD Otázka zamoření ţivotního prostředí chemickými škodlivinami se v poslední době opět dostává do popředí zájmu nejen vzhledem k ekologickým problémům, ale také protoţe havárie, nebo úmyslné zasaţení chemických závodů či skladů s běţně vyráběnými látkami můţe mít účinky srovnatelné s pouţitím chemických zbraní. Nervově paralytické látky (NPL) jsou jednou z největších hrozeb moderního světa. Tyto látky jsou charakteristické rychlým nástupem účinku, vysokou toxicitou a vysokou letalitou pro všechny teplokrevné organismy, včetně lidí. Typickými zástupci této skupiny látek jsou např.: tabun, sarin, soman, VX látka a další. Tyto látky jiţ byly zneuţity v mnoha válečných konfliktech, jako např.: válka v Koreji, Indočíně, Iráku, Iránu apod. (Bajgar 2006). Z chemického hlediska se jedná o organofosforové (OF) sloučeniny způsobující ireverzibilní inhibici ţivotně důleţitého enzymu acetylcholinesterasy (AChE; EC ), který je nezbytný pro kontrolu přenosu nervových vzruchů. AChE rozkládá neurotransmiter acetylcholin (ACh) na cholinergních nervových zakončeních a brání tak nadměrné stimulaci cholinergních receptorů jak v centrálním nervovém systému (CNS) tak i v periferním nervovém systému (PNS). Mnoţství tohoto enzymu v organismu je však velmi malé. Rychle se tedy vyčerpá a její syntéza de novo probíhá velice pomalu. V současnosti existuje několik terapeutických přístupů v léčbě intoxikace OF sloučeninami, ale ţádný z nich není univerzálně účinný vůči všem známým NPL, nebo proti všem jejich účinkům (Delfino et al. 2009). V terapii otravy způsobené NPL se osvědčilo podání kombinace anticholinergika (nejčastěji atropin) které tlumí muskarinové projevy intoxikace NPL v důsledku nahromadění neurotransmiteru ACh v synaptické štěrbině a oximu (např. obidoxim), jenţ je schopen reaktivovat, tedy znovuobnovit aktivitu jiţ inhibované AChE. AChE tak můţe znovu rozkládat nahromaděný ACh. 9

10 V současnosti se nejčastěji pouţívají k terapii Alzheimerovy choroby léky nazývané jako tzv. kognitiva, jenţ zlepšují pozornost a paměťové schopnosti především svými cholinomimetickými účinky. Tyto látky (rivastigmin, galantamin) zlepšují transmiterové funkce ACh inhibicí AChE, která ACh štěpí, čímţ ho je v mozku relativní nedostatek (Lincová a Farghali 2007). OF sloučeniny se v současnosti široce pouţívají v zemědělství (jako pesticidy) především v zemích třetího světa. Tyto pesticidy jsou sice asi o dva řády méně toxické, neţ bojové NPL, ale i tak způsobují řadu otrav a úmrtí. Eyer odhaduje počet intoxikací OF pesticidy na více neţ 3 miliony za rok s počtem mrtvých a zraněných asi 300 tisíc za rok (Eyer 2003). Se sarinem je spojen dosud největší teroristický útok, v němţ bylo pouţito chemické látky. Došlo k tomu v roce 1994 v japonském městě Matsumoto a o rok později v tokijském metru. Při těchto teroristických akcích, zorganizovaných japonskou náboţenskou sektou Óm Shinrikjó (nejvyšší pravda Óm), bylo intoxikováno více neţ lidí, z nichţ 12 zasaţených zemřelo (Kassa 2003). 10

11 3. CÍL PRÁCE Cílem této práce bylo porovnat reaktivační účinnost fluorovaného oximového reaktivátoru AChE K22836 s dalšími běţně pouţívanými oximovými reaktivátory AChE (např.: HI-6, obidoxim, trimedoxim) a nově syntetizovaným oximem K203, coţ je nefluorovaný analog oximového reaktivátoru K Dále jsme se snaţili zjistit jeho terapeutické moţnosti v CNS srovnáním se standardně pouţívanými nefluorovanými oximovými reaktivátory AChE ve snaze nalézt účinnější antidotum, které by lépe pronikalo do CNS. Toto antidotum by mohlo slouţit především jako první pomoc příslušníkům AČR při zasaţení NPL. Dále by mohlo být uţitečné i např. pro pracovníky v zemědělství, kteří se dostávají do kontaktu s organofosforovými inhibitory, jako jsou např. (insekticidy, pesticidy) apod. Jako modelovou otravnou látku jsme si zvolili tabun. Intoxikace způsobené tabunem jsou velmi obtíţně léčitelné v důsledku výskytu volného elektronového páru umístěného na dimethylamidové skupině, jenţ prakticky znemoţňuje atak nukleofilních činidel (oximů) (Kassa a kol. 2008). Experiment byl prováděn na potkanech, kterým byl intramuskulárně (i.m.) injekčně aplikován atropin v dávce 21 mg/kg v kombinaci s různými oximovými reaktivátory AChE v terapeutických dávkách, odpovídajících 5 % LD 50. Po 5 minutách jim byl také i.m. aplikován tabun v dávce 1LD 50 (180 μg/kg). Sledovali jsme účinnost této terapie (podle míry reaktivace inhibované AChE a butyrylcholinesterasy (BuChE, EC ) v různých částech těla potkanů) standardní spektrofotometrickou metodou dle Ellmana (Ellman et al. 1961) za pomocí 5,5`-dithiobis(2-nitrobenzoové) kyseliny (DTNB) modifikovaným postupem podle Bajgara (Bajgar 1972). Našim cílem bylo zjistit, zda zavedení atomu fluoru do oximového relativně účinného reaktivátoru K203 zlepší jeho prostup do mozku, a tím zvýší jeho reaktivační účinnost v CNS oproti standardně pouţívaným nefluorovaným oximovým reaktivátorům AChE při intoxikaci tabunem in vivo. 11

12 4. TEORETICKÁ ČÁST 4.1. Charakteristika NPL Jedná se o chemické sloučeniny s přímým účinkem na nervový systém CNS i PNS, jehoţ činnost narušují (Kassa 2003). Z chemického hlediska jde o organické sloučeniny fosforu, jenţ ve své molekule obsahují fosforylovou (P=O) nebo thiofosforylovou (P=S) vazbu. Vyznačují se vysokou toxicitou vůči savcům. Jsou nejvýznamnější a nejnebezpečnější skupinou bojových chemických látek. Vedle vysoké toxicity jsou charakteristické také rychlým nástupem účinku a průnikem do organismu všemi branami vstupu. Jejich syntéza je poměrně snadná i levná a jsou vojensky i teroristicky snadno zneuţitelné (Patočka a kol. 2004). Organické sloučeniny fosforu byly známy jiţ od počátku 20. století. Německý chemik Gerhard Schrader (pracovník koncernu I. G. Farben) popsal v roce 1935 na základě vlastní zkušenosti významné toxické účinky u N,Ndimethylamidofosforylfluoridu při výzkumu nových insekticidů. Přitom bylo zjištěno, ţe tato snadno dostupná látka má velmi vysokou toxicitu pro člověka (Bajgar 2006). Schraderův výzkum otevřel cestu k cílené syntéze vojensky pouţitelných OF sloučenin, známých podle svého mechanismu účinku téţ jako NPL. V jedné z prvních skupin látek se systémovými účinky obsahující deriváty alkylesterů N,N-dimethylamidofosforečné kyseliny byl i tabun, poprvé připravený Langem a Krűgerovou Po zahájení poloprovozní výroby a ověření ve vojenských zařízeních byl postaven závod v Dyhernfurthu (nyní je tato lokalita na území Polska s názvem Brzeg Dólny), který fungoval od dubna 1942 do začátku roku Podle různých pramenů bylo vyrobeno aţ tun tabunu, z čehoţ bylo údajně tun naplněno do munice (Bajgar 2006). V roce 1939 byl syntetizován sarin, pojmenovaný podle svých objevitelů (Schrader, Ambros, Ritter a Linde). Koncem 2. světové války připravil R. Kun pinakolylový analog sarinu soman, podstatně jedovatější neţ sarin. V této 12

13 době britská skupina B. C. Launderse z Cambridgské Univerzity připravila diisopropylfluorofosfát (Bajgar 2006). Na německý výzkum vědci po válce navázali v USA, kde byla v letech v Newportském vojenském závodě ve státě Indiana vyráběna látka VX (Bajgar 2006). Sloučeniny stejné základní struktury se pouţívají v průmyslu jako změkčovadla, hydraulické kapaliny, zpomalovače hoření u elektrických zařízení, ve veterinární medicíně jako antiparazitika, či v humánní medicíně jako léčiva či jako sloučeniny k výzkumu nervových funkcí (Gupta 2006). Nejvíce se tyto látky pouţívají v zemědělství jako insekticidy (látky k hubení hmyzu). Jsou sice méně toxické, neţ bojové NPL v důsledku strukturálních rozdílů u receptorů AChE u hmyzu a savců, ale mohou vést k podobným smrtícím účinkům, pokud se pouţijí ve velkých mnoţstvích, nebo ve vyšších koncentracích (Worek et al. 2004). K otravám s následným úmrtím pak většinou dochází při špatné manipulaci, nebo při sebevraţedných pokusech Fyzikálně-chemické vlastnosti NPL NPL dělíme na dvě velké skupiny, které jsou obecně označovány jako G látky a V látky. G látky: Patří mezi ně: tabun (GA O-ethyldimethylamidokyanofosfát), sarin (GB O-isopropylmethylfluorofosfonát), cyklosarin (GF cyklohexylmethylfluorofosfonát) a soman (GD O- pinakolylmethylfluorofosfonát). Jsou to bezbarvé kapaliny při pokojové teplotě podobné vodě bez výraznějšího zápachu, relativně rozpustné ve vodě a dobře rozpustné v organických rozpouštědlech. Jejich teplota varu se pohybuje v rozmezí od 158 C (sarin) do 298 C (VX). Jsou relativně těkavé, a proto u nich hrozí vysoké riziko intoxikace prostřednictvím inhalace jejich par (Sidell et al. 1997). Střední letální koncentrace v ovzduší vedoucí po 1 minutové expozici ke smrti 50 % exponovaných nechráněných osob se pohybuje mezi 0,03 a 0,08 13

14 mg.l -1. Střední smrtelná dávka při zamoření nechráněné kůţe se pohybuje mezi 0,7 aţ 7 mg.kg -1 hmotnosti exponovaného jedince. V terénu vydrţí bez ztráty toxicity hodin (Patočka a kol. 2004). V látky: Patří mezi ně látka VX (O-ethyl-S-/2-diisopropyl-aminoethyl/- methylthiofosfonát). V chemicky čistém stavu bezbarvá, méně pohyblivá kapalina bez výraznějšího zápachu. VX látka je velmi málo těkavá, takţe vydrţí ve vodě a v terénu velmi dlouhou dobu (týdny aţ měsíce), neţ dojde k jejímu kompletnímu rozptýlení. U této látky tedy hrozí malé riziko inhalace, ale větší riziko při absorpci přes kůţi (Sidell et al. 1997). Ve vodě je špatně rozpustná, zato v organických rozpouštědlech a tucích je rozpustná velmi dobře. Střední letální koncentrace aerosolu VX látky v ovzduší vedoucí po 1 minutové expozici ke smrti 50 % exponovaných nechráněných osob se pohybuje kolem 0,036 mg.l -1. Střední smrtelná dávka při zamoření nechráněné kůţe se pohybuje kolem 0,07 mg.kg -1 hmotnosti exponovaného jedince (Patočka a kol. 2004). Podobné vlastnosti má látka VR (O-iso-butyl-S-(2-diethylaminoethyl)- methylthiofosfonát), coţ je Ruský analog látky VX vyvinutý na území tehdejšího SSSR. Další látky této skupiny jsou např.: CVX (čínský analog VX), VE, VG a VM (Marrs et al. 2007). Mezi NPL řadíme také látku GP. V literatuře je někdy uváděna pod zkratkou GV. Svými fyzikálně-chemickými vlastnostmi se příliš neliší od ostatních NPL. Svým chemickým sloţením se pohybuje mezi G a V látkami [dimethylamido-o-(2-dimethylamino-ethyl)-fluorofosfonát]. Jde o látku se střední těkavostí. Nebezpečné jsou všechny brány vstupu. Její střední smrtelná dávka při zamoření nechráněné kůţe se pohybuje kolem 1,36 mg.kg -1 hmotnosti exponovaného jedince (Patočka a kol. 2004). V terénu vydrţí déle neţ G látky (dny), ale není tak stálá jako VX. Její těkavost je vyšší neţ u VX látky, ale niţší neţ u G látek. Chemickou strukturu některých NPL znázorňuje obrázek 1. 14

15 Obrázek 1. Chemická struktura vybraných NPL. Všechny NPL existují jako optické izomery. Tabun, sarin, cyklosarin, VX a VR mají 1 chirální fosforový atom, zatímco soman má ještě druhé centrum chirality na uhlíkovém atomu pinakolylové skupiny. Tyto stereoizomery interagují s AChE různě. Díky tomu mají jednotlivé stereoizomery odlišné toxikologické vlastnosti. Jednotlivé nespecifikované směsi stereoizomerů kaţdé NPL tak nemusí mít přesně definovatelné vlastnosti (Benschop a De Jong 1988) Brány vstupu NPL do organismu Pronikání NPL do organismu umoţňuje koncentrační rozdíl NPL uvnitř organismu a ve vnějším prostředí. Organismus je od vnějšího prostředí oddělen bariérou, která je po stránce morfologické i funkční značně diferencovaná. Výsledné mnoţství NPL které do organismu pronikne tak závisí na formě dané látky a místu, kterým tato NPL do organismu proniká. Poškození organismu prostřednictvím NPL můţe být způsobeno těmito mechanismy: 15

16 Zasaţení dýchacích orgánů (inhalace), kdy NPL pronikají do plic ve formě par a jemných aerosolů. Průnik přes poškozenou kůţi následkem odření, poranění, popálení a poleptání. Zasaţení (kontaminace) neporušené kůţe. Zasaţení (kontaminace) oční spojivky. Zasaţení zaţívacích orgánů (ingesce) po poţití zamořených potravin nebo vypití zamořené vody (perorální otrava). Zasaţení jiných orgánů lymfatického a krevního systému po kontaktu se zamořenou technikou a materiálem, při poranění střepinami chemické munice (parenterální intoxikace). Brána vstupu NPL do organismu ovlivňuje distribuci a metabolismus NPL. Má vliv na rychlost jejich absorpce, zasaţení ţivotně důleţitých orgánů, na způsob a rychlost detoxikace NPL v organismu apod. (Patočka a kol. 2004) Mechanismus účinku NPL NPL ovlivňují cholinergní přenos nervového vzruchu, který je na synapsi zprostředkován chemickou látkou (neuromediátorem) ACh, jenţ pracuje jako kationický neurotransmiter. ACh je syntetizován z exogenně dodávaného cholinu (potravou), který je acetylován pomocí acetyltransferasy. ACh je uvolněn z presynaptického nervu jako odpověď na akční potenciál. Difunduje přes synapsi, naváţe se na ACh receptor. Navázáním se změní konformace (prostorové uspořádání) ACh receptoru a membrána se stane propustná pro K + ionty, které začnou proudit do buňky a vzniklý elektrický potenciál se dál šíří po nervovém vlákně jako elektrický impuls k další synapsi. Neuromediátor musí být ihned po navázání na receptor a ukončení přenosu nervového vzruchu rozloţen. Chemický rozklad neuromediátoru probíhá prostřednictvím katalytického působení enzymu AChE. Po rozloţení ACh se receptor vrací do původního stavu (Patočka a kol. 2004, Quinn 1987). 16

17 Cholinesterasy AChE i BuChE patří mezi cholinesterasy. AChE je selektivní vůči ACh, protoţe hydrolyzuje ACh rychle, zatímco BuChE jej hydrolyzuje pomalu. Fyziologická funkce AChE je dobře známa. Působí především na cholinergních receptorech v CNS i PNS a má důleţitou roli při procesu přenosu nervových impulsů, neboť rozkládá ACh. BuChE je známá jako plasmatická cholinesterasa nebo pseudocholinesterasa. Je neselektivní. Je vyráběna játry a nachází se především v plasmě. Fyziologická funkce BuChE není ještě plně objasněna. Pravděpodobně participuje na základních stupních vývoje nervového systému (Vellom et al. 1993) Aktivní místo AChE Aktivní místo AChE je tvořeno katalytickou triádou obsahující: serin, glutamovou kyselinu a histidin. Tato triáda je podobná u dalších serinových hydrolas a proteas, kde je aspartát místo glutamové kyseliny (Sussman et al. 1991). Katalytická triáda je umístěna na dně hluboké a úzké prohlubně enzymu AChE. Na stěně prohlubně jsou aromatické zbytky aminokyselin (tryptofan, glutamová kyselina a phenylalanin), jenţ interagují s kvarterními amoniovými ionty (tzv. cholinové vazebné místo) (Ordentlich et al. 2004). Velký dipólový moment v aktivním místě AChE vede k její vysoké katalytické účinnosti. Její obrat převyšuje 10 4.s -1. Difúze ACh k aktivnímu místu AChE je tedy stupněm limitu míry tohoto procesu (Quinn, 1987). Mechanismus reakce zahrnuje nukleofilní atak serinu katalytické triády AChE fosforovým atomem OF sloučeniny. Na rozdíl od acetylované AChE, která se rychle sama regeneruje uvolněním octové kyseliny, je fosforylovaná AChE stabilní. Po fosforylaci aktivního místa AChE je tento enzym ireversibilně inhibován. Serin katalytické triády tak nemůţe dále hydrolyzovat ACh (Marrs et al. 2007, Worek et al. 2004). 17

18 Počítačové studie fosforylace AChE sarinem prokázala, ţe reakce ve skutečnosti zahrnuje 2-stupňový adičně-eliminační mechanismus. Adice však určuje rychlost vazby inhibitoru na nativní AChE (Wang et al. 2008). OF sloučeniny inhibují BuChE podobným mechanismem. Efekty této inhibice v organismu jsou však neznámé, protoţe ani fyziologická funkce BuChE není ještě zcela známá. OF sloučeniny se také kovalentně váţí na další serinové esterasy, jako karboxylesterasa, neuropatická cílová esterasa, trypsin a chymotrypsin (Worek et al. 2005). Vazba NPL na esterasy nevyvolává na rozdíl od inhibice AChE ţádné klinické příznaky intoxikace, takţe tyto esterasy působí jako vychytávači (scavengery) NPL. Tyto látky na sebe váţí část dávky NPL, která vstoupila do vnitřního prostředí intoxikovaného organismu. Je to velmi důleţitý děj, protoţe se předpokládá, ţe pouze malá část z celkové dávky NPL se dostane na místo toxického účinku (AChE na cholinergních synapsích CNS a PNS (Patočka a kol. 2004, Bajgar a kol. 1991a). Reakce OF sloučeniny s AChE zahrnuje zformování Michaelisova komplexu OF inhibitor-ache. OF sloučenina se naváţe na atom kyslíku katalytické triády serinu a AChE je tak inaktivována. Spontánní znovuobnovení aktivity (reaktivace), tzn. hydrolýza fosforylované AChE spočívající v eliminaci OF sloučeniny probíhá velice pomalu, stejně jako syntéza AChE de novo. Reaktivaci inhibované AChE můţeme urychlit pomocí reaktivátorů, coţ jsou z chemického hlediska nukleofilní sloučeniny (Marrs et al. 2007). Jejich účinek však závisí na rychlosti procesu nazývaného stárnutí (dealkylace). U fosforylované AChE dojde ke zlomu mezi uhlíkovým atomem a kyslíkovým atomem navázaným na fosforový atom OF sloučeniny (v případě tabunu ke zlomu vazby mezi fosforem a dusíkem) s následným odštěpením alkylu (v případě tabunu dimethylaminové skupiny). Inhibovaná AChE po této reakci nemůţe být účinně reaktivována spontánně, nebo působením nukleofilních činidel. Nelze ji poté reaktivovat. Je v tzv. nereaktivovatelné formě (Marrs et al. 2007). Rychlost dealkylace inhibované AChE závisí na době kontaktu enzymu s NPL a na chemické struktuře inhibitoru. Z NPL nejrychleji dealkyluje AChE inhibovaná somanem (poločas dealkylace je přibliţně 10 minut), AChE 18

19 inhibovaná sarinem dealkyluje pomaleji (poločas dealkylace je asi 3 hodiny). AChE inhibovaná tabunem má poločas dealkylace asi 19 hodin, zatímco u látky VX je proces dealkylace nejpomalejší (poločas dealkylace je přibliţně 1,5 dne). Tento fakt významně ovlivňuje efekt léčby intoxikací těmito látkami (Worek et al. 2005) Fáze účinku NPL Po vstupu NPL do organismu zde probíhají čtyři hlavní fáze účinku NPL: resorpce, transport, metabolizace a vlastní toxický efekt. Vlastní toxický efekt je realizován jen zlomkem podané dávky NPL (podle druhu látky 1 50 %). Při expozici NPL je kromě i.v. podání pozorováno zpoţdění, které je způsobeno průnikem NPL biologickými bariérami. Krevním oběhem je NPL zanesena na místo metabolického a toxického účinku. Před dosaţením cílové AChE mohou být OF sloučeniny v těle aţ několikrát biotransformovány. Většina OF sloučenin (pesticidy a další sloučeniny, ale nejde o NPL) nevykazuje ţádnou, nebo jen malou anticholinesterasovou aktivitu jednotlivých nemetabolických forem. Biotransformace netoxických OF sloučenin na aktivní metabolity se děje např. změnou thiofosforylové vazby na fosforylovou. Tímto způsobem fosfothioláty a fosfodithioláty, jenţ jsou obvykle slabé AChE inhibitory (díky nízké elektronegativitě síry ve srovnání s kyslíkem) jsou přeměněny na své oxidované formy, jenţ jsou extrémně toxické anticholinesterasové sloučeniny. Jde o tzv. letální syntézu. (Jokanovic 2001). Další důleţité metabolické reakce jsou ty, jenţ vedou k detoxikaci OF sloučenin. Tyto procesy zahrnují zlom jedné fosforové vazby za tvorby negativně nabité molekuly, nebo zvýšení rozpustnosti OF sloučenin ve vodě, dělající jejich vylučování snadnější a sniţující jejich poločas v organismu (Tang et al. 2006). Většina NPL má relativně krátký poločas působení. NPL jsou rychle degradovány nebo rozptýleny na neletální koncentrace (Cannard 2006). U NPL byly pozorovány i účinky nesouvisející přímo se zásahem do cholinergního přenosu nervového vzruchu, označované jako nespecifické nebo 19

20 necholinergní. Dlouhodobé účinky, pozorovatelné týdny aţ měsíce byly zaznamenány po trvalé expozici nízkých dávek NPL, nebo pozdním efektům akutní expozice těmito látkami (Rafai et al. 2007). Nespecifické účinky NPL se obvykle manifestují později. Mezi nejvýznamnější nespecifické účinky NPL patří účinek charakterizovaný: obecnou stresogenní reakcí, zásah do metabolismu nukleových kyselin a bílkovin vedoucí aţ k mutagennímu efektu, ovlivnění imunity, hepatotoxický efekt, zásah do vodního a minerálního metabolismu, zásah do ledvinných funkcí. Významný je i podíl nespecifických účinků NPL, vedoucích k morfologickému poškození nervové tkáně. Jde o velmi závaţné důsledky akutní intoxikace NPL. Bezprostřední příčinou poškození neuronů po akutní intoxikaci NPL se jeví nadměrné vyplavení glutamátu v důsledku stimulace glutamátergních neuronů, tzv. receptorů N-methyl-D-aspartátu (NMDA receptory). Aktivace NMDA receptorů vede k nadměrné akumulaci vápníku uvnitř neuronů a následné neuronální smrti. V důsledku morfologického poškození některých oblastí mozku zůstávají po akutní intoxikaci NPL dlouhodobé neurologické následky, které mohou být patrné i několik let po akutní expozici NPL (Patočka a kol. 2004). NPL inhibují také jiné enzymy neţ AChE. Extrémně zvýšené koncentrace inhibitorů cholinesteras mohou způsobit přímé účinky na cholinergní receptory blokádou iontových kanálů. NPL mohou ovlivnit také další neurotransmisní cesty, jako dopaminergní a noradrenergní (Marrs et al. 2007). Nedávná studie matematicky modelovala smrtící účinek několika vysoce toxických OF sloučenin uţitých jako NPL. Bylo zjištěno, ţe primárním mechanismem účinku je opravdu inhibice AChE. Méně neţ 10% jejich toxicity můţe být přisuzováno alternativním mechanismům účinku (Maxwell et al. 2006). 20

21 4.5. Klinické příznaky akutní intoxikace NPL Klinickým důsledkem nadměrného dráţdění cholinergních receptorů jsou v závislosti na jejich lokalizaci a typu: muskarinové, nikotinové a centrální klinické příznaky, které jsou charakteristické pro akutní fázi intoxikace. Souboru klinických příznaků intoxikace NPL v důsledku nadměrného dráţdění cholinergních receptorů se také říká akutní cholinergní krize (Patočka a kol. 2004). Muskarinové příznaky. Projeví se při nadměrné stimulaci muskarinových receptorů umístěných na efektorových orgánech. Intoxikace se projeví zúţením zornic (mióza), na ciliárním svalu (porucha akomodace), ve spojivkách a nosní sliznici (překrvení a otok), na slinných, slzných a potních ţlázách (zvýšené slinění, slzení a pocení), na sliznici a hladké svalovině dýchacích cest (zvýšená sekrece bronchiálních ţlázek, zúţení bronchů), na hladké svalovině trávicího traktu a močového měchýře (zvýšená střevní peristaltika, bolesti aţ kolikovitého charakteru). Na srdci je v důsledku zvýšeného tonu parasympatiku pozorována bradykardie a pokles krevního tlaku. Nikotinové příznaky. Projeví se při nadměrné stimulaci nikotinových receptorů umístěných v autonomních gangliích a na neuromuskulárních spojích. Jsou způsobené zvýšenou koncentrací ACh na nikotinových receptorech na nervosvalových ploténkách a sympatických gangliích, jsou charakterizovány svalovou ochablostí, třesem a záškuby jednotlivých příčně pruhovaných svalů, postupně se rozšiřující na všechny kosterní svaly těla. Svalové fascikulace brzy přecházejí v intenzivní tonicko-klonické křeče, které mohou vyústit aţ v ochrnutí (paralýzu) kosterního svalstva. Tento stav je obzvláště nebezpečný především v případě paralýzy dýchacího svalstva a následného výrazného omezení dýchání. 21

22 Centrální příznaky. Jsou charakterizovány depresemi dechových a kardiovaskulárních center v oblasti prodlouţené míchy, bolestmi hlavy, úzkostí, nadměrnou emoční labilitou, napětím, neklidem, závratěmi, depresivními stavy, zmateností, poruchami hybnosti a nezřídka i bezvědomím. Bezprostřední příčinou smrti v případě těţkých aţ smrtelných intoxikací bývá akutní respirační insuficience daná poruchou funkce dechových center a paralýzou dýchacích svalů včetně bránice. Těţká dechová nedostatečnost postupně vede k zástavě dechu s následnou zástavou srdce. V případě překonání akutní cholinergní krize je klinický obraz těţké akutní intoxikace NPL charakterizován celkovým metabolickým rozvratem především v důsledku dlouhodobé hypoxie a acidózy. Celé měsíce po akutní těţké intoxikaci NPL mohou přetrvávat především neurologické a neuropsychické příznaky, mezi nimiţ dominují zvýšená únava, poruchy spánku, emoční labilita, úzkostné aţ depresivní stavy a především poruchy paměti, učení a koncentrace (Patočka a kol. 2004). Specifickou komplikací otrav NPL můţe být remise otravy daná buď vyplavením NPL z depotních míst (zvláště u somanu), nebo uvolněním NPL z vazby na bílkoviny krevní plasmy Diagnóza otravy NPL V místě vstupu NPL tkáň nedráţdí a bezprostředně většinou nevyvolávají ani nepříjemné subjektivní pocity. Ze subjektivních pocitů bývá prakticky vţdy přítomný pocit tíţe na hrudi, bolest hlavy, neklid a úzkost, velmi často nauzea. Z objektivních příznaků je u intoxikace NPL (zejména látek řady G) pozorována mióza, zvýšená sekrece a sníţení aktivity krevních cholinesteras (Bajgar a kol. 1991a). Velmi důleţité je také sledovat hromadný výskyt podobných případů intoxikace v určité oblasti. V diferenciální diagnóze je nutno myslet na vyloučení tetanie, epilepsie a otravy kyanovodíkem či ostatními křečovými jedy. Diagnózu nám potvrdí laboratorní vyšetření sníţené aktivity krevních cholinesteras 22

23 (plasmatické BuChE či erytrocytární AChE). Z nespecifických laboratorních vyšetření je moţné uvést leukocytózu a zvýšenou aktivitu jaterních aminotransferas. Definitivní potvrzení diagnózy ukáţí specializovaná vyšetření (test reaktivovatelnosti inhibovaných cholinesteras v krvi (odliší otravu NPL od otravy karbamáty), volná NPL či metabolity v krvi) (Bajgar a kol. 1991a, Patočka a kol. 2004). Aktivita AChE či BuChE má zásadní význam pro stanovení diagnózy při otravě inhibitory cholinesteras. Aktivita těchto enzymů v krvi poměrně přesně odráţí stupeň expozice organismu NPL. Stanovení aktivity AChE v erytrocytech nebo v celé krvi má pro diagnostiku otrav NPL větší význam neţ stanovení aktivity BuChE v plazmě nebo v séru. Stupeň aktivity AChE v krvi lze povaţovat za indikátor poškození organismu při otravě organofosfáty. Sníţení aktivity na: 70 % normálních hodnot je pozorováno u latentní otravy. Nevyvolává ţádné zřetelně viditelné symptomy intoxikace % normálních hodnot je u lehké formy otravy. Intoxikace organismu je doprovázena muskarinovými příznaky, jako např.: mióza, zvýšené slzení, zvýšené slinění a nebo zvýšená střevní peristaltika % normálních hodnot se vyskytuje u středně těţké otravy. Typickými příznaky jsou např.: svalová ochablost, třes, záškuby jednotlivých příčně pruhovaných svalů, zmatenost aţ bezvědomí apod % normálních hodnot indikuje těţké poškození organismu. Toto poškození končí ve většině případů úmrtím intoxikované osoby (Moretto 1998). Návrat k normálním hodnotám při neléčené otravě (syntézou enzymu de novo) se u AChE erytrocytů pohybuje kolem 3 % na den, u BuChE je poněkud rychlejší a závisí na funkční schopnosti jaterního parenchymu (Bajgar a kol. 1991a). Stupeň dealkylace inhibované AChE je moţno zjistit tzv. testem reaktivovatelnosti. Principem metody je dvojí stanovení aktivity AChE v jednom materiálu, přičemţ druhé stanovení je provedeno v přítomnosti reaktivátoru cholinesterasy. Jestliţe je aktivita v druhém vzorku stejná nebo dokonce niţší, došlo jiţ k vzniku kovalentní vazby mezi AChE a inhibitorem. Jestliţe je však 23

24 nově zaznamenaná aktivita v přítomnosti reaktivátoru vyšší, znamená to, ţe AChE je moţno reaktivovat. Tento test je důleţitý, protoţe můţe být doporučeno opakované podání reaktivátoru (autoinjektor). Pokud je jiţ enzym v nereaktivovatelném stavu, není podání reaktivátoru účinné (Bajgar a kol. 1991a) Terapie otravy NPL Obecné zásady terapie Při léčbě jedinců intoxikovaných NPL postupujeme obdobně, jako při otravě jakoukoli jinou toxickou látkou. Především musíme vynést, nebo vyvézt intoxikovanou osobu ze zasaţené oblasti. Také musíme trvalé kontrolovat ţivotní funkce postiţené osoby, tzn. začít a udrţovat vhodnou ventilaci pomocí některého z křísících přístrojů, případně doplnit umělé dýchání oxygenoterapií a regulovat vznikající acidózu (pomocí infuze s bikarbonátem sodným). Musíme také sledovat a udrţovat pravidelnou činnost srdce postiţeného (Kassa 2003). Neprodleně také podáváme vhodná antidota (anticholinergika a reaktivátory AChE) tyto léčiva jsou aplikována intramuskulárně (i.m.) pomocí autoinjektoru do stehenního svalu. (Marrs et al. 2007). Terapii je vhodné doplnit antikonvulzivy působícími na úrovni CNS, dochází pak ke zmírnění křečí a spasmu svalů. Nejčastěji se v těchto případech pouţívá diazepam, ale lze pouţít i jiné obdobně působící látky (Delfino et al. 2009). Musíme zabránit kontaminaci zachraňujících osob během léčby a transportu pomocí ochranných obleků, vybavení individuální ochrany a kompletní dekontaminace oběti (Sidell et al. 1997). Pokud dojde k zasaţení kůţe a očí NPL, je nutné co nejdříve provést dekontaminaci zasaţených míst. Dekontaminaci lze provádět buď chemickou cestou (častěji), popř. lze ji provést i enzymatickou cestou. Pro dekontaminaci kůţe má AČR připraven pro kaţdého příslušníka Individuální protichemický balíček vzor 80, obsahující desprach, mikromletý bentonit (valchářskou hlinku), 24

25 pro nějţ je charakteristická vysoká absorpční schopnost. V případě zasaţení očí stejnou sluţbu zajistí co nejdelší výplach očí 1 2 % bikarbonátem sodným, fyziologickým roztokem, borovou vodou nebo alespoň nezamořenou čistou vodou (Patočka a kol. 2004) Anticholinergika Anticholinergika (funkční antidota) zabraňují navázání nahromaděného ACh na cholinergní receptory tak, ţe tyto receptory samy zablokují (antagonizují účinek nahromaděného ACh). Nejvíce pouţívané anticholinergikum je atropin. Je účinný při léčbě intoxikací způsobených všemi OF sloučeninami. Atropin antagonizuje účinek nahromaděného ACh především na periferních muskarinových receptorech. Málo působí na nikotinových receptorech. Slabě také ovlivňuje centrální příznaky intoxikace, neboť obtíţně prochází přes hematoencefalickou bariéru (HEB). Podáváme jej v i.m. nebo i.v. v dávce 2-4 mg opakovaně v minutových intervalech. Pokud je to moţné, je výhodné podávat atropin v infuzi. Tolerance organismu otráveného NPL je vůči atropinu tak vysoká, ţe prakticky není moţné intoxikovaného jedince předávkovat (Patočka a kol. 2004). V podávání atropinu pokračujeme do prvních příznaků atropinizace (rozšíření zornic mydriáza, zčervenání kůţe, suchost sliznic, tachykardie). Celková dávka atropinu můţe dosáhnout aţ 100 mg za 24 hod. Léčbu je vhodné doplnit podáváním i jiných anticholinergik s převahou centrálního účinku. Zvláště u intoxikací somanem a sarinem je kombinování atropinu s anticholinergiky s převahou centrálního účinku uţitečné (Patočka a kol. 2004). V AČR je zaveden jako druhé anticholinergikum benaktyzin, pro nějţ je charakteristický centrální antimuskarinový účinek. Na základě experimentálních výsledků se jako další vhodná anticholinergika s převahou centrálního účinku jeví biperiden nebo skopolamin (Patočka a kol. 2004). Nevýhodou všech anticholinergik je, ţe nebrání inhibici AChE OF inhibitory, ale jen antagonizují účinky nahromadění ACh. 25

26 Reaktivátory AChE Reaktivátory AChE (kauzální antidota) umoţní návrat k normálnímu přenosu cholinergního nervového vzruchu reaktivací inhibované AChE. Principem reaktivace AChE je odtrţení NPL od inhibované AChE (komplex NPL-AChE) přímým působením oximu. Principem reakce je nukleofilní atak oximu (oxim musí být v neionizované formě) na fosforový atom inhibované AChE. Různé oximy se mezi sebou liší v optimální dávce pro reaktivaci, v toxicitě a efektivitě. Všechny oximy mají 3 velké nedostatky: Oximy jsou kvarterní amonné ionty. Jako hydrofilní sloučeniny se těţko dostávají přes HEB do CNS. Jejich koncentrace (zvláště u biskvarterních oximů) v mozku jsou jen 1-2% jejich plasmatických hladin. Mohou tak reaktivovat jen malý podíl inhibované AChE v CNS. (Petroianu et al. 2007, Lorke et al. 2008). Oximy nereaktivují zestárlé fosforylované enzymy. Včasná terapie tak hraje klíčovou roli pro prognózu intoxikované osoby. Na rozdíl od atropinu nejsou oximy účinné proti všem OF sloučeninám. Kaţdý oxim má dobrou reaktivační schopnost jen vůči některým OF sloučeninám. Po chemické stránce jsou oximy mono-pyridinium-mono-aldoximy (monokvarterní - pralidoxim), nebo biskvarterní bis-pyridinium-bis-aldoximy (obidoxim, methoxim), nebo bis-pyridinium-mono-aldoximy (HI-6, K sloučeniny), (Kalasz et al. 2009). Nejběţnějšími ve světě dosud pouţívanými reaktivátory jsou pralidoxim (2-pyridiniumaldoxim-N-methyljodid), známý téţ pod označením 2-PAM a obidoxim (bis-/4-pyridiniumaldoxim-n-methyl/ether dichlorid). Ve své práci srovnávám také účinnost dalšího oximu označovaného jako HI-6. Oxim HI-6 je v současnosti nejširokospektřejší a nejúčinnější reaktivátor AChE. Jeho aplikace je účinná např. po intoxikaci sarinem, somanem, cyklosarinem, VX, ale je málo účinný na reaktivaci tabunem inhibované AChE (Kassa a kol. 2007). 26

27 Tento oxim se ve formě hydrochloridu rozkládá ve vodném roztoku a musí být skladován jako lyofylizovaný prášek (Kassa 2002). AČR jako jedna z mála armád na světě má k dispozici lékovou formu oximu HI-6 připravenou k pouţití při zasaţení NPL. Chemickou strukturu vyjmenovaných reaktivátorů AChE znázorňuje obrázek 2. HON=HC N CH 3 I HON=HC N 2 Cl O N CH=NOH pralidoxim obidoxim HON=HC N 2 Cl CH=NOH HON=HC N CH 2 N CH=NOH N 2 Br trimedoxim methoxim CH=NOH N O N 2 Cl CONH 2 HI-6 Obrázek 2. Chemická struktura vybraných reaktivátorů AChE. 27

28 V mé diplomové práci hodnotím také reaktivační účinnost oximu K203 ((E)-1-(4-carbamoylpyridinium)-4-(4-hydroxyiminomethylpyridinium)-but-2-en dibromid). Jde o nejlepší v současnosti známý reaktivátor na léčbu tabunem inhibované AChE (Kalasz et al. 2009). Tento oxim byl syntetizován na katedře toxikologie Fakulty vojenského zdravotnictví Univerzity obrany v Hradci Králové (Musílek a kol. 2007). Výše jmenované oximy porovnávám s oximem K22836, coţ je fluorovaný analog oximu K203. Oxim K22836 byl připraven na spolupracujícím pracovišti Research Institute of Chemical Technology (Korea). Tento oxim je díky fluorovému atomu lipofilnější neţ dříve zmíněné oximy a tudíţ by měl lépe pronikat do CNS. Dopad zavedení fluoru do struktury tohoto oximu vzhledem k jeho reaktivační účinnosti je dosud neznámý. Chemická struktura posledních dvou oximů je patrná z obrázku 3. CONH 2 CONH 2 HON=HC N 2 Br N F HON=HC N 2 Br N K203 Obrázek 3.: Chemická struktura oximů K203 a K K22836 Na rozdíl od anticholinergik, jejichţ opakované podávání aţ do příznaků atropinizace je velmi důleţité, opakované podávání reaktivátorů AChE bývá zvláště u otravy NPL s rychlou dealkylací (soman) inhibované AChE diskutabilní. Ideálním testem k ověření oprávněnosti opakované terapie reaktivátory AChE je laboratorně provedený test reaktivovatelnosti erytrocytární AChE z krevního vzorku zasaţeného. 28

29 5. MATERIÁL A METODIKA 5.1. Chemikálie OF inhibitor tabun o čistotě ~ 98 % byl získán z institutu VTUO Brno (Česká Republika). Roztok tabunu pouţitého ve studii byl připravený těsně před pouţitím. Dávka 1 LD 50 byla stanovena standardním testem toxicity. Oximy (HI- 6, obidoxim, trimedoxim a K203 o čistotě %) byly připraveny na Katedře toxikologie, Fakulty vojenského zdravotnictví Univerzity obrany v Hradci Králové. Oxim K22836 byl připraven v Research Institute of Chemical Technology, Medicinal Science Division (Daejon, Korea). Ostatní chemikálie čistoty p.a. byly zakoupeny od firmy Sigma-Aldrich (Praha, Česká Republika) Zvířata Pokusy byly prováděny na samcích laboratorních potkanů kmene Wistar o váze g (Anlab, Praha, Česká Republika). Zvířata byla udrţována v klimatizované místnosti (stálá teplota 22 ± 2 0 C, vlhkost 50 ± 10 %, světelný cyklus 12 hod. světlo/ 12 hod. tma), krmena byla standardní peletovou dietou a vodou ad libitum. Zvířata byla rozdělena do 7 skupin po 6 jedincích. Hmotnostní rozpětí jednotlivých zvířat ve skupinách nepřekročilo ± 10 g. Experiment probíhal pod dohledem Etické komise Fakulty vojenského zdravotnictví Univerzity obrany v Hradci Králové. Personál manipulující se zvířaty byl předem proškolen a získal osvědčení o způsobilosti pracovat s laboratorními zvířaty podle 17 odst. 1 zákona č. 207/2004 Sb., o ochraně, chovu a vyuţití pokusných zvířat. 29

30 5.3. Roztoky pro biochemické stanovení 0,1M Tris pufr zásobní roztok pro přípravu Tris pufru byl připraven rozpuštěním 24,2 g 1,1,1-tris-(dihydroxymethyl)-aminometanu ve 1000 ml destilované vody, z tohoto roztoku bylo odebráno 250 ml a doplněno na objem 950 ml destilovanou vodou, v tomto objemu bylo ustáleno ph na 7,6 pomocí kyseliny chlorovodíkové (HCl) a doplněna destilovaná voda na konečný objem 1000 ml. Zásobní roztok Tritonu X-100 byl připraven tak, ţe k 1000 g destilované vody bylo přidáno 0,12 g Tritonu X ,02M Tris pufr k 100 ml 0,1M Tris pufru bylo přidáno 370 ml zásobního roztoku Tritonu X-100, v tomto objemu bylo ustáleno ph na 7,6 přidáním příslušného mnoţství zásobního roztoku pro přípravu Tris pufru, poté byl doplněn zásobní roztok Tritonu X-100 na konečný objem 500 ml. Tímto postupem byl získán 0,02M Tris pufr, který je zároveň přibliţně 0,01 % roztokem Tritonu X-100. Zásobní roztok DTNB byl připraven tak, ţe 0,1 g DTNB bylo rozpuštěno za stálého míchání v 100 ml 0,1M Tris pufru o ph 7,6. Tento roztok lze ke stanovení pouţívat jen 3 dny, pokud je uchováván v lednici při teplotě +4 0 C a je chráněn před světlem. V čase potřeby je připravena směs zásobního roztoku DTNB a 0,1M Tris pufru v poměru 135:40 (DTNB :Tris pufr). Takto připravený roztok můţe být pouţíván pouze v den přípravy, během stanovení jej chráníme před slunečními paprsky (jejich vlivem dochází ke štěpení DTNB a vzniku barevného TNB -, coţ zanáší chybu do následného spektrofotometrického stanovení) Substrát Pro stanovení aktivity AChE je pouţíván specifický substrát, acetylthiocholin jodid (ATChJ). Zásobní roztok ATChJ se připraví rozpuštěním 29 mg ATChJ v 10 ml destilované vody. Takto připravený zásobní roztok je uchováván v dávkách 1 ml při teplotě C. V době potřeby je obsah 30

31 mikrozkumavky roztaven a zásobní roztok je zředěn v poměru 1:10 (roztok ATChJ : destilovaná voda). Pro stanovení aktivity BuChE je obdobným způsobem pouţíván specifický substrát, butyrylthiocholin jodid (BuTChJ) Kalibrační roztok Biochemické stanovení aktivit cholinesteras je kalibrováno pomocí cystein chloridu. Zásobní roztok cysteinu je připraven rozpuštěním přesného mnoţství této látky (0,03152 g) v 200 ml destilované vody. Zásobní roztok je rozdělen na dávky 1 ml do mikrozkumavek a je skladován při teplotě C aţ do doby, kdy je pouţit ke kalibraci Biochemické stanovení aktivity cholinesteras Aktivita AChE v plné krvi, BuChE v plasmě, AChE i BuChE v mozku a AChE v bránici byla měřena spektrofotometricky, metodou dle Ellmana (Ellman et al. 1961) za pomocí DTNB modifikovaným postupem podle Bajgara (Bajgar 1972). Pro stanovení absorbance byl pouţit Spektrofotometr Helios Alpha (Elektron Corporation, Oxford, Velká Británie). Byla modifikována vlnová délka na 436 nm, tak aby nedocházelo k výrazným interferencím s hemoglobinem při standardní vlnové délce 412 nm. Odebraná heparinizovaná krev byla hemolyzována v poměru 1:20 v 0,02M Tris pufru o ph 7,6. Hemolýza probíhala 4 min. před vlastním měřením. Plasma byla připravena centrifugací krve při 3000 ot./min. při 10 0 C. Centrifugace probíhala 10 minut na přístroji Universal R320, Hettich, Německo. Části mozků a bránic byly homogenizovány (homogenizátor DI-25 BASIC, IKA WERKE, Německo) v 0,02M Tris pufru (v poměru 1:10) a homogenát byl pouţit k měření aktivity AChE. Stejným postupem byla měřena i aktivita BuChE, byl zde však pouţit jiný substrát (BuTChJ). Výsledky byly vyhodnoceny v jednotkách μkat/ml. 31

32 5.7. In vivo experiment Atropin v terapeutické dávce (21 mg/kg) byl i.m. aplikován v kombinaci s reaktivátorem (HI-6, trimedoxim, K203, K22836) 5 minut před vlastní intoxikací tabunem. Otravná látka v dávce odpovídající 1 LD 50 (180 μg/kg) byla aplikována do svalu pravého zadního stehna zvířete. Kontrolní skupině byl podán atropin a za 5 min. byl i.m. aplikován fyziologický roztok. Zvířata byla usmrcena dekapitací 30 min. po intoxikaci tabunem, jako anestézie byl pouţit CO 2. Po dekapitaci byla odebrána krev, mozek a bránice. Plasma byla připravena centrifugací krve při 3000 ot./min. při 10 0 C. Centrifugace probíhala 10 minut na přístroji Universal R320, Hettich, Německo. Do jednorázové plastové kyvety (V ~ 2,5 ml) bylo napipetováno 1,7 ml roztoku DTNB v 0,1M Tris pufru o ph 7,6, 100 μl krevního hemolyzátu, plasmy nebo 100 μl homogenátu tkání (mozky a bránice). Reakce byla zahájena přidáním 200 μl substrátu pro daný enzym, tzn. ATChJ pro AChE nebo BTChJ pro BuChE (výsledná koncentrace v kyvetě 10-3 M) a absorbance byla měřena při 436 nm za laboratorní teploty. Před odečtem výsledků probíhala v kyvetě reakce po dobu 4 minut, aby došlo k úplnému zreagování volných thiolů obsaţených v krvi či homogenátech s DTNB, protoţe by mohly být naměřeny falešně pozitivní výsledky. U mozků stačilo ke zreagování volných thiolů zpoţdění pouze 2 minuty, u bránic 8 minut Kalibrace Před vlastní kalibrací je připravena cysteinová kalibrační řada. Základní roztok cysteinu je ředěn vţdy v poměru 1 : 1 (koncentrovanější roztok cysteinu : destilovaná voda). Takto vznikne řada o čtyřech různých koncentracích, přičemţ základní roztok je 0,2 μm. Kalibrační řada: 0,2 μm 0,1 μm 0,05 μm 0,025 μm 32

33 Pro kalibraci se do kyvety místo krevního hemolyzátu nepipetuje stejný objem (0,2 ml) roztok cysteinu z připravené kalibrační řady. Přidá se roztok DTNB v pufru a reakce se odstartuje přidáním příslušného substrátu (ATChJ). Měří se proti slepě připravenému vzorku, v něm je ATChJ (cystein) nahrazen destilovanou vodou Princip metody Princip této kolorimetrické metody spočívá v reakci kyseliny DTNB s SHskupinou thiocholinu za vzniku barevné reakce. Jako substráty se pouţívají estery thiocholinu. Při stanovení aktivity AChE se pouţívá ATChJ, u BuChE se pouţívá BuTChJ. Tento substrát je příslušnou esterázou (AChE, BuChE) štěpen na thiocholin a příslušnou kyselinu. SH- skupina thiocholinu se naváţe na DTNB a jeho zbytek, 5-merkapto-2-nitrobenzoová kyselina je fotometricky měřena. Výhoda této metody je specifita reakce, jednoduchost provedení a vysoká citlivost (Bajgar 1972) Statistické hodnocení výsledků Počet zvířat ve skupině byl 6. Aktivity enzymu v krevním hemolyzátu byly vyjádřeny jako průměr a směrodatná odchylka. 33

34 6. VÝSLEDKY Aktivita cholinesteras (AChE i BuChE) byla měřena u sedmi skupin potkanů. První kontrolní skupině potkanů byl aplikován pouze atropin (v dávce 21 mg/kg) bez reaktivátoru AChE a po pěti minutách fyziologický roztok. Druhé kontrolní skupině potkanů byl aplikován atropin (v dávce 21 mg/kg) bez současného podání reaktivátoru AChE. Po pěti minutách ji byl aplikován tabun v dávce 1 LD 50 (180 μg/kg). Zbývajícím pěti skupinám potkanů byly aplikovány atropin (v dávce 21 mg/kg) a současně s ním různé reaktivátory AChE v uţívané terapeutické dávce pro potkany (kaţdá skupina potkanů dostala pouze jeden reaktivátor). Po pěti minutách byl těmto pěti skupinám potkanů aplikován tabun v dávce 1 LD 50 (180 μg/kg). Aktivity cholinesteras byly měřeny u všech skupin potkanů, včetně obou kontrolních skupin. Tab. č. 1 zobrazuje přehled jednotlivých reaktivátorů AChE a aplikovaných dávek (dávky ekvimolární) u jednotlivých skupin potkanů. Tab. č. 1: Přehled reaktivátorů cholinesteras a jejich použitých koncentrací u jednotlivých skupin potkanů. Skupina Aplikovaný oxim Kontrolní skupina č.1 - (bez otravy) Kontrolní skupina č.2 - (intoxikovaná) 3 HI-6 chlorid (18,9 mg/kg) 4 Obidoxim (18 mg/kg) 5 Trimedoxim (22,3 mg/kg) 6 K203 (22,9 mg/kg) 7 K22836 (23,8 mg/kg) Výsledky aktivit cholinesteras v plné krvi, plasmě, mozku a bránici u jednotlivých skupin potkanů jsou znázorněny v grafech č

35 Aktivita AChE (ukat/l) Graf č. 1: Srovnání aktivit AChE v plné krvi u jednotlivých skupin potkanů. PLNÁ KREV , ,74 7,38 10,19 9,787 11,07 9, Skupina KS č. 1 (bez otravy) KS č. 2 (otrávená) Sk. č. 3 (HI-6 chlorid) Sk. č. 4 (Obidoxim) Sk. č. 5 (Trimedoxim) Sk. č. 6 (K203) Sk. č. 7 (K22836) Aktivita neinhibované AChE v plné krvi měla hodnotu 18,29 μkat/l. Inhibovaná AChE v plné krvi byla 6,74 μkat/l (36,9 %). Zřetelnou reaktivační účinnost měly oximy: K203 (aktivita 11,07 μkat/l, tzn. zlepšení o 23,6 % oproti intoxikované skupině), obidoxim (aktivita 10,19 μkat/l, tzn. zlepšení o 18,8 % oproti intoxikované skupině), trimedoxim (aktivita 9,787 μkat/l, tzn. zlepšení o 16,6 % oproti intoxikované skupině) a K22836 (aktivita 9,443 μkat/l, tzn. zlepšení o 14,7 % oproti intoxikované skupině). Prakticky neúčinný byl oxim HI- 6 chlorid s hodnotou aktivity 7,38 μkat/l (zlepšení jen o 3,4 % oproti intoxikované skupině). 35

36 Aktivita BuChE (ukat/l) Graf č. 2: Srovnání aktivit BuChE v plasmě u jednotlivých skupin potkanů. PLASMA 2 1,658 1,5 1 0,9033 0,89 0,5 0,41 0,4233 0,502 0, Skupina KS č. 1 (bez otravy) KS č. 2 (otrávená) Sk. č. 3 (HI-6 chlorid) Sk. č. 4 (Obidoxim) Sk. č. 5 (Trimedoxim) Sk. č. 6 (K203) Sk. č. 7 (K22836) Aktivita neinhibované BuChE v plasmě činila 1,658 μkat/l. Inhibovaná BuChE v plasmě měla hodnotu 0,41 μkat/l (24,7 %). Signifikantně účinné byly jen: obidoxim s aktivitou 0,9033 μkat/l (zlepšení o 29,8 % oproti intoxikované skupině) a trimedoxim s aktivitou 0,89 μkat/l (zlepšení o 24,16 % oproti intoxikované skupině). Zbývající oximy byly prakticky neúčinné. Oxim K203 vykazoval aktivitu 0,502 μkat/l (zlepšení o 5,6 % oproti intoxikované skupině), HI-6 chlorid vykazoval aktivitu 0,4233 μkat/l (zlepšení o 0,8 % oproti intoxikované skupině) a K22836 měl aktivitu jen 0,3717 μkat/l, coţ je dokonce méně o 2,3 % neţ u intoxikované skupiny. 36

37 Aktivita AChE (ukat/l) Graf č. 3: Srovnání aktivit AChE v mozku u jednotlivých skupin potkanů. MOZEK , ,35 12,36 15,47 21,71 29,34 11,89 0 Skupina KS č. 1 (bez otravy) KS č. 2 (otrávená) Sk. č. 3 (HI-6 chlorid) Sk. č. 4 (Obidoxim) Sk. č. 5 (Trimedoxim) Sk. č. 6 (K203) Sk. č. 7 (K22836) Aktivita neinhibované AChE v mozku byla 131,4 μkat/l. Inhibovaná AChE tamtéţ měla hodnotu 15,35 μkat/l (11,7 %). Zřetelně nejúčinnější byl oxim K203 s hodnotou aktivity 29,34 μkat/l (zlepšení o 10,6 % oproti intoxikované skupině). Jistou účinnost vykazoval i trimedoxim s hodnotou aktivity 21,71 μkat/l (zlepšení o 4,8 % oproti intoxikované skupině). Zbývající 3 oximy: Obidoxim s hodnotou aktivity 15,47 μkat/l (zlepšení o 0,1 % oproti intoxikované skupině), HI-6 chlorid s hodnotou aktivity 12,36 μkat/l (zhoršení o 2,3 % oproti intoxikované skupině) a oxim K22836 s hodnotou aktivity 11,89 μkat/l (zhoršení o 2,7 % oproti intoxikované skupině). 37

38 Aktivita BuChE (ukat/l) Graf č. 4: Srovnání aktivit BuChE v mozku u jednotlivých skupin potkanů. MOZEK 12 10,29 8 5,387 5,31 5,388 5,865 6,19 5, Skupina KS č. 1 (bez otravy) KS č. 2 (otrávená) Sk. č. 3 (HI-6 chlorid) Sk. č. 4 (Obidoxim) Sk. č. 5 (Trimedoxim) Sk. č. 6 (K203) Sk. č. 7 (K22836) Aktivita neinhibované BuChE v mozku byla 10,29 μkat/l. Inhibovaná BuChE tamtéţ měla hodnotu 5,387 μkat/l (52,4 %). Nejúčinnější byl oxim K203 s hodnotou aktivity 6,19 μkat/l (zlepšení o 7,8 % oproti intoxikované skupině). Za ním následoval trimedoxim s hodnotou aktivity 5,865 μkat/l (zlepšení o 4,6 % oproti intoxikované skupině). Zbývající tři oximy byly neúčinné: Obidoxim s hodnotou aktivity 5,388 μkat/l (stejně jako intoxikovaná skupina), HI-6 chlorid s hodnotou aktivity 5,31 μkat/l (zhoršení o 0,8 % oproti intoxikované skupině) a oxim K22836 s nejniţší hodnotou aktivity 5,168 μkat/l (zhoršení o 2,2 % oproti intoxikované skupině). 38