MENDELOVA ZEMĚDĚLSKÁ A LESNICKÁ UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA DIPLOMOVÁ PRÁCE

Transkript

1 MENDELOVA ZEMĚDĚLSKÁ A LESNICKÁ UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA DIPLOMOVÁ PRÁCE BRNO 2009 EVA LOUSOVÁ

2 Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav chovu a šlechtění zvířat Vybrané faktory ovlivňující kvalitu spermatu mužů při umělém oplození Diplomová práce Vedoucí práce: prof. Ing. Ladislav Máchal, DrSc. Vypracoval: Eva Lousová Brno 2009

3

4 PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Vybrané faktory ovlivňující kvalitu spermatu mužů při umělém oplození vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana AF MZLU v Brně. dne. podpis diplomanta.

5 PODĚKOVÁNÍ Děkuji prof. Ing. Ladislavu Máchalovi, DrSc. za odborné vedení, připomínky a rady při zpracovávání diplomové práce. Poděkování patří také vedoucí embryologické a andrologické laboratoře Centra asistované reprodukce Fakultní nemocnice Brno as. RNDr. Janě Žákové, PhD. za cenné odborné rady a pomoc. Děkuji také prof. MUDr. Pavlu Ventrubovi, DrSc. přednostovi gynekologicko porodnické kliniky Fakultní nemocnice Brno za poskytnutí potřebných dat k vypracování práce.

6 ABSTRAKT Práce je zaměřena na mužskou neplodnost a některé faktory, které ji mohou ovlivňovat. Je hodnocen vliv onkologického onemocnění a léčby na kvalitu spermatu a možnosti využití kryokonzervovaného spermatu k umělému oplození. Dále byly stanoveny hladiny homocysteinu, kyseliny listové a vitaminu B12 v seminální plazmě v závislosti na výsledku spermiogramu. Na reprodukční schopnost muže má rovněž vliv i přítomnost varikokély. Hodnoceny jsou výsledky mikrochirurgické operace varikokély na kvalitu spermatu posouzením hodnot spermiogramu. Na zamražení spermatu před léčbou bylo odesláno za dobu 12ti let 695 mužů. Ke stanovení hladiny homocysteinu byly použity vzorky seminální plazmy získané od 90 mužů. Posouzení vlivu mikrochirurgické varikokelektomie bylo provedeno na souboru 42 mužů. Z rozboru dat byly zjištěny těžké patologie ve spermatu mužů před onkologickou léčbou tak i zhoršení hodnot spermiogramu po léčbě. Nejvýraznější patologie byly nalezeny v souboru mužů s tumorem varlat. Po léčbě onkologického onemocnění bylo evidováno zhoršení hodnot spermiogramu v necelých 50 %. Studie hladin kyseliny listové, homocysteinu a vitaminu B12 ukázala vyšší hladiny homocysteinu, vitaminu B12 a kyseliny listové v seminální plazmě u mužů s normospermií a nižší hladiny homocysteinu u azoospermiků Po operaci jsme sledovali zlepšení výsledků spermiogramu alespoň v jednom ze tří posuzovaných parametrů (koncentrace, motilita a morfologie spermií) u 78,57 % mužů. Lze shrnout, že parametrů ovlivňujících tvorbu a zrání spermií je celá řada a prokázat jejich skutečnou důležitost a vliv je velmi obtížné. Klíčová slova: neplodnost, mužské pohlavní orgány, spermie, spermiogram, varikokéla

7 ABSTRACT This study is focused on male infertility and some factors that may affect this disorder.the main objectives of the study were to assess the effect of oncological disease and its treatment on sperm quality and possibilities of cryopreserved sperm utilization for in vitro fertilization. The level of homocysteine, folic acid nad vitamine B12 in seminal plasma were determined in relation to the spermiogram result. Male reproducion ability is also influenced by the presence of varicocele. Therefore the influence of microsurgical operation of varicocele on sperm quality was evaluated through spermiogram value determinations. During the last 12 years sperm from 695 men was tested and cryopreserved before therapy. 90 samples of seminal plasma were used to determine the level of homocysteine. Assessment of microsurgical varicocelectomy results was performed on a complex of 42 men. Data analysis displayed severe pathologies in male sperm before oncological therapy as well as deterioration of spermiogram values after the treatment. The most significant pathologies were found in men with testicular tumor. Almost 50% of spermiogram values displayed deterioration after treatment of oncological disease. Analysis of folic acid, homocysteine and vitamine B12 levels showed higher value in seminal plasma of men with normospermia and lower value of homocysteine in men with azoospermia. After operations we indicated improvement of spermiogram results in 78,57% of men tested. The improvement was observed in at least one of the three evaluated parameters (concentration, motility, sperm morphology). We can conclude that there is a number of parameters influencing production and development of sperm. To prove their real importance is rather difficult. Key words : infertility, male reproductive organs, sperm, spermiogram, varicocele

8 OBSAH 1. ÚVOD CÍL PRÁCE LITERÁRNÍ PŘEHLED Samčí pohlavní soustava Pohlavní žláza Vývodné pohlavní cesty Přídatné žlázy Kopulační orgán Řízení pohlavní činnosti samců Spermatogeneze Ejakulát Spermie Seminální plazma Laboratorní metody hodnocení ejakulátu Makroskopické vyšetření ejakulátu Mikroskopické vyšetření ejakulátu Vlivy ovlivňující kvalitu ejakulátu MATERIÁL A METODIKA Materiál Metodika Stanovení spermiogramu Kryokonzervace spermatu Rozmražení spermatu Stanovení homocysteinu Mikrochirurgická varikokelektomie VÝSLEDKY A DISKUZE Hodnocení vlivu léčby u onkologických pacientů Stanovení hladin homocysteinu, vitaminu B 12 a kyseliny listové v závislosti na výsledku spermiogramu Posouzení vlivu mikrochirurgické varikokelektomie ZÁVĚR

9 7. SEZNAM LITERATURY SEZNAM POUŽITÝCH OBRÁZKŮ, TABULEK A GRAFŮ

10 1. ÚVOD Plodnost jako základní biologická a užitková vlastnost umožňuje rozmnožování a zachování rodu. Pojem plodnost vyjadřuje schopnost produkovat oplodnění schopné pohlavní buňky. Plodnost je základním předpokladem pro udržení a rozšiřování populace. Úroveň reprodukce je ukazatelem pohody organismu v daném prostředí. Je ukazatelem vyrovnanosti vnějšího a vnitřního prostředí organismu jako celku. Tato kritéria jsou ve své podstatě shodná s definicí zdraví. Plodnost je ovlivněna různými faktory mezi které patří například genetická determinace, druhová a plemenná příslušnost, ale i vnější prostředí a další. Posouzením míry vlivu vnějšího prostředí jak na reprodukci zvířat tak i lidí se v poslední době zabývají četné studie. Vlivy prostředí ohrožují více mužskou část populace, protože muži produkují spermie nepřetržitě. Pokud jsou negativní vlivy vnějšího prostředí odstraněny, je u mužů naději na zlepšení. V současné době je v České republice přibližně % nedobrovolně bezdětných párů. Odhaduje se, že ze 40 % se na neplodnosti podílí žena, stejně tak ze 40 % muž a ve 20 % se podílí oba současně. Mezi faktory ovlivňující produkci spermií patří mimo jiné hormonální poruchy, vliv nemoci, zranění, neprůchodnost vývodných cest, věk, výživa, stres, působení chemických látek atd. K závažným onemocněním, které mají vliv na reprodukci patří nádorové onemocnění. A to jak primárním působením nádoru, tak i sekundárně působením onkologické léčby. I přes rozvoj nových metod léčby patří nádorové onemocnění stále mezi nejčastější příčinu smrti. Postihnout může každého, nezávisle na tom zda je mladý, starý, bohatý či chudý. Je velkým břemenem jak pro samotného pacienta tak i pro jeho okolí. Se zvyšující se úrovní znalostí a možností léčby přibývá pacientů, které se podaří vyléčit. Často ovšem za cenu trvalých následků, které mohou ovlivnit kvalitu jejich dalšího života. Patří sem mimo jiné i poruchy reprodukčních funkcí až trvalá neplodnost z důvodu nevratného zničení zárodečných buněk. Dnešní moderní metody asistované reprodukce dovedou zachovat pacientům vyléčeným po onkologickém onemocnění šanci na vlastní rodinu. Jednou z možností je kryokonzervace spermatu před radikální léčbou nemoci jako je radioterapie, chemoterapie, orchidectomie. V současné době je 10

11 tato možnost stále více využívána. Metodika se dostala do povědomí lékařů většiny onkologických oborů. Nezastupitelný vliv na reprodukci má i metabolismus aminokyselin a to vzhledem k tomu, že řada fyziologických procesů v lidských gonádách je na metabolismus aminokyselin vázána. Jednou z nich je například homocystein. Je to neesenciální aminokyselina obsahující thiolovou funkční skupinu. V organismu vzniká jako meziprodukt při metabolismu methioninu, při metabolismu S-adenosylmethioninu a může být remetylován na methionin. Homocystein může být přeměněn v transulfurační cestě na cystein, glutathion, taurin a anorganický sulfát. Zvýšené hodnoty homocysteinu (hyperhomocysteinemie) poškozují řadu orgánových systémů a jsou rizikovým faktorem vzniku různých patologií včetně reprodukčních poruch. Homocystein je významným rizikovým faktorem kardiovaskulárních a dalších onemocnění. Kromě onkologického onemocnění a metabolismu aminokyselin má vliv na reprodukční schopnost muže i přítomnost varikokély. První zmínky o varikokéle uvádí ve své práci již Aula Cornelia Celsa, pocházející z doby 42 let před n.l. Přesněji definovali varikokélu jako anatomicko-klinický syndrom pánové Ivanissevich a Gregorini v roce Incidence varikokély se pohybuje kolem 15 % v běžné mužské populaci. Varikokéla vzniká na podkladě defektů malých žilních chlopní, které za normálních okolností napomáhají odtoku krve od varlat. Projevuje se přítomností rozšířených žilních pletení v šourku, v kterých dochází k hromadění krve. V důsledku toho dochází ke zvýšení teploty varlat. Následkem může být snížená tvorba spermií neboť už zvýšení teploty o jeden stupeň může negativně ovlivnit schopnost varlete vytvářet spermie. U varikokély dochází k venózní hypertenzi (porucha mikrocirkulace) a vlivem toho k hypoxii až ischemii varlete a k poruše spermiogeneze. Nejčastěji se varikokéla vyskytuje na levé straně, méně často oboustranně a vzácně i osamoceně na pravé straně. Nejedná se o vážný zdravotní problém, ale kromě snížených hodnot spermiogramu může být toto onemocnění provázeno i bolestivostí v oblasti varlat. Řešením tohoto problému je chirurgické uzavření žil. Odtok krve poté zajistí jiné žíly. Mikrochirurgické provedení varikokelektomie znamená pro pacienta minimální vstup do těla rovnající se 2 3 cm řezu a minimální hospitalizaci. Studie ukazují, že u pacientů majících varikokélu nebyla nalezena přítomnost chlopní v žilách. 11

12 Vliv jednotlivých faktorů, které mohou ovlivnit plodnost mužů se odráží v kvalitě spermií. Studium spermií nám umožnil objev z roku 1677, kdy Leeuwenhoekův žák Hamm z Leidenu spermie poprvé popsal. Spermie byla pokládána za čile se pohybující útvar s charakteristickou stavbou, který v ejakulátu parazituje. Podle toho vznikl i název spermatozoon animaculus seminis semenná zvířátka. Až roku 1780 na základě pokusů s umělou inseminací byla Spallanzanim dokázána oplodňovací schopnost semene. Nepřisuzoval ji však spermiím, ale chemickému vlivu semenné plazmy na oocyt. Tento názor vyvrátili roku 1842 pánové Prevost a Dumas, kteří dokázali fertilizační schopnost spermií. Studium morfologických vlastností spermií a bližší poznání jejich struktur umožnil rozvoj mikroskopie. Většina prvních poznatků o tvaru a základních strukturách spermií pochází z klasických prací na sklonku 19. a začátku 20. stol. z období světelného mikroskopu. Zejména se jedná o práce Leydiga, Jensena, Bendu, Retziusa. V dalším studiu morfologie hrála významnou roli elektronová mikroskopie. Prostřednictvím transmisního a rastrovacího elektronového mikroskopu bylo umožněno detailní poznání ultrastrutury a funkce spermie a jejich jednotlivých částí. 12

13 2. CÍL PRÁCE Cílem práce je zhodnotit vliv vybraných faktorů na mužskou plodnost. Sledování bylo prováděno u mužů odeslaných na vyšetření do andrologické laboratoře Centra asistované reprodukce FN Brno na Obilním trhu. V práci je hodnocena 12ti letá činnost onkologické spermabanky. Zároveň je posouzen vliv onkologického onemocnění na kvalitu spermatu před léčbou a s odstupem několika měsíců až let po léčbě tohoto onemocnění. V práci je také vyhodnoceno stanovení hladiny homocysteinu, kyseliny listové a vitaminu B12 v seminální plazmě a výsledky jsou porovnány s výsledkem spermiogramu. Vyhodnoceny jsou i výsledky mikrochirurgické operace varikokély na kvalitu spermatu posouzením hodnot spermiogramu. 13

14 3. LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Samčí pohlavní soustava Samčí pohlavní soustava je tvořena pohlavní žlázou (varle), vývodnými pohlavními cestami (nadvarle, chámovody), přídatnými žlázami (měchýřkovité žlázy, bulbouretrální Cowperovy žlázy a prostata) a kopulačním orgánem (pyj) (Jelínek, 2003) Pohlavní žláza U samců tvoří pohlavní žlázy párové orgány varlata, jejichž prvořadou funkcí je produkce pohlavních buněk spermií a tvorby pohlavního hormonu - testosteronu. Varle (testis) je uloženo v šourku (scrotum), které umožňuje vytvoření příznivého teplotního prostředí pro vývoj spermií u savců. Varlata se vyvíjejí na stropě břišní dutiny muže a před nebo po narození sestupují do šourku. Sestup varlat je řízen hormonálně, odpovědný je luteinizační hormon. Nesestoupení varlat do šourku označujeme jako kryptorchismus. Teplota uvnitř šourku se udržuje o 3 5 C nižší než teplota tělesná. Tato nižší teplota je nutnou podmínkou pro správný rozvoj procesu spermatogeneze a životnost spermií ve varleti a nadvarleti (Jelínek, 2003). Na povrchu varlete je tuhé vazivové pouzdro tunica albuginea, z něhož odstupují vazivová septa septula testis, která rozděluje parenchym varlete na lalůčky lobuli testis. V nich jsou mnohonásobně stočeny semenotvorné kanálky tubuli semiferi contorti (Holibková, Laichman, 2006). Tyto kanálky začínají slepě při periferii lalůčků, mají silně zvlněný průběh a vzájemně mezi sebou anastomozují. Délka jednoho stočeného semenotvorného kanálku po rozvinutí všech kliček je v průměru cm, takže celková délka v obou varlatech dosahuje značných hodnot, tj. od 600 do 1000 m (Marvan, 2007). Semenotvorné kanálky přecházejí při zadním obvodu varlete v síť rete testis, ze které vystupuje vývodných kanálků. Tyto kanálky přecházejí do kanálků nadvarlete ductuli efferentes testis (Holibková, Laichman, 2006). Mezi kanálky je intersticium varlete, které tvoří řídké kolagenní vazivo, bohatě vaskularizované. Obsahuje fibrocyty a migrující buněčné elementy. Na bazální membránu lalůčků nasedají modifikované buněčné elementy, myoidní buňky. 14

15 Důležitou součástí intersticiálního vaziva jsou endokrinní intersticiální buňky Leydigovy. Mají průměr µm, velké oválné jádro, zpravidla uložené excentricky. V elektronovém mikroskopu je zřetelné bohatě vinuté hladké hladké endoplazmatické retikulum, mitochondrie tubulárního typu, tukové kapénky a proteinové inkluze krystaloidního tvaru, označované jako Reinkeho krystaly. Leydigovy buňky syntetizují a produkují mužský pohlavní hormon testosteron. Semenotvorné kanálky jsou vystlány zárodečným epitelem, který je tvořen dvěma druhy buněk. Jednak jsou to podpůrné buňky Sertoliho a semenotvorné buněčné elementy. Podpůrné Sertoliho buňky jsou velké buněčné elementy, které nasedají na bazální membránu a zasahují až k povrchu epitelu. Mají velké nepravidelné jádro s četnými záhyby karyolemy. Jejich cytoplazma obsahuje hladké endoplazmatické retikulum, lipidové kapénky a proteinové krystaloidní inkluze (krystaly Charcot Boettcherovy) (Malínský, Lichnovský, 2006). Význam podpůrných buněk spočívá v tom, že jsou oporou spermatogenních buněk, mají význam pro jejich výživu, fagocytují produkty rozpadu spermatogenních buněk a tvoří ochrannou bariéru v procesu spermatogeneze. Kromě toho se významně podílejí na procesu metamorfózy spermatid ve zralé spermie (Holibková, Laichman, 2006; Marvan, 2007). Spermatogenní buňky jsou v zárodečném epitelu zastoupeny nejpočetněji a představují ve skutečnosti různá vývojová stadia spermií (Marvan, 2007) Vývodné pohlavní cesty Vývodné pohlavní cesty slouží k odvodu spermií, jako jejich dočasný rezervoár a k odvodu výměšků přídatných pohlavních žláz. Tvoří je několik vývojově, morfologicky i funkčně odlišných oddílů, které na sebe navazují. Jsou to přímé kanálky, varletní síť, odvodné kanálky varlete, vývod varlete, chámovod a močová trubice. Přímé kanálky vznikají spojením stočených semenotvorných kanálků ještě uvnitř lalůčků varlete. Jsou vystlány jednovrstevnatým kubickým až cylindrickým epitelem a po krátkém průběhu vyúsťují do varletní sítě. Varletní síť se skládá se soustavy nepravidelných štěrbinovitých prostorů a kanálků, které jsou navzájem síťovitě spojeny a uloženy ve středovém vazivu varlete. Dutinky a kanálky varletní sítě slouží jako sběrací systém spermií a vystýlá je jednovrstevnatý kubický nebo dlaždicový epitel. Odvodné kanálky varlete fungují jako převodný systém. Vytupují z varletní sítě v podobě rovných trubiček, které na hlavovém konci opouštějí varle. Po výstupu 15

16 z varlete se odvodné kanálky spirálovitě stáčejí a tvoří kuželovité lalůčky, spojené vazivem v hlavu nadvarlete. Epitel vystýlající odvodné kanálky je víceřadý až vícevrstevný cylindrický a obsahuje vysoké buňky s kinociliemi, dále buňky s mikroklky a nižší sekreční buňky. Kmitáním řasinek jsou ještě nepohyblivé spermie rovnoměrně a plynule dopravovány z varietní sítě do vývodu nadvarlete. Buňky s mikroklky zase resorbují látky, které vznikají ve varleti při metamorfóze spermatid ve spermie. Sekreční buňky naopak do lumenu kanálku vyměšují různé živiny, potřebné pro výživu spermií (Marvan, 2007). Nadvarle (epididymis) je důležitý úsek vývodných cest, v němž se spermie shromaždují a funkčně dozrávají. Je to orgán kyjovitého tvaru, který nasedá na zadní obvod varlete. Rozlišujeme na něm tři části: hlavu (caput), tělo (corpus) a ocas (cauda). Na jeho povrchu je tuhé pouzdro. Do nadvarlete vystupují vývodné kanálky varlete, které vytvářejí lalůčky lobuli epididymidis a spojují se v mnohonásobně stočený vývod nadvarlete, na který navazuje chámovod ductus deferens. Hlava nadvarlete je rozšířená a pevně připojená k hlavovému konci varlete, který široce překrývá. Skládá se z lalůčků, složených kliček odvodných kanálků varlete. Na přechodu hlavy a těla nadvarlete se všechny odvodné kanálky vzájemně spojují v jednotný vývod nadvarlete. Tělo nadvarlete navazuje plynule na hlavu a má tvar úzkého protáhlého oblouku, volně připojeného k varleti. Před dosažením ocasního konce varlete se tělo nadvarlete zřetelně rozšiřuje a přechází v ocas nadvarlete. Ten má tupě zaoblený kuželovitý tvar a o 2 3 cm přesahuje ocasní konec varlete. Spermie vytvořené ve varleti přicházejí do hlavy nadvarlete, kde se zahušťují a jsou zde fagocytovány poškozené a přestárlé spermie. Během průchodu spermií nadvarletem se mění jejich metabolická aktivita. V hlavě nadvarlete spermie vykazují intenzívní respiraci a sníženou glykolýzu, zatímco v ocasu nadvarlete je poměr obrácený. V těle nadvarlete se spermie setkávají se sekrety bohatými na tuky a další látky, které zvyšují odolnost jejich povrchových membrán. Morfologickým výrazem funkčního dozrávaní spermií je odloučení protoplazmatické kapky od spermie. Spermie v nadvarleti zůstavají nepohyblivé a jejich celková metabolická aktivita je nízká. Nacházejí se zde v klidovém stavu označovaném jako anabióza, který umožňuje prodloužení životnosti spermií. Doba průchodu spermií celým nadvarletem trvá 8 11 dní (Holibková, Laichman, 2006; Jelínek, 2003; Marvan, 2007). 16

17 Chámovod (ductus deferens) je to 40 cm dlouhý, silnostěnný, 3 mm široký kanálek, který se kanálem tříselním dostává do dutiny břišní. Zahýbá na zadní stěnu močového měchýře, kde se kříží s močovodem. Posléze se spojuje s vývodem semenných váčků a jako vstřikovací trubička ductus ejaculatorius ústí do prostatické části mužské močové trubice (Holibková, Laichman, 2006) Semenný provazec (Funiculus spermaticus) jeho hlavní součástí je chámovod, cévy a nervy nadvarlete a varlete a m. cremaster. Je to protáhlý útvar kuželovitého tvaru. Rozšířenou základnou začíná na hlavě nadvarlete a zúženým pólem zasahuje do poševního kanálu. Po vstupu do břišní dutiny semenný provazec končí. Cévy a nervy pokračují dorzálním směrem, zatímco chámovod se od nich odděluje a zahýbá kaudálně do pánevní dutiny. Mužská močová trubice (urethra maskulina) měří asi 20 cm. Vystupuje z močového měchýře, prochází prostatou, prostupuje svalovým dnem pánevním a nakonec prochází houbovitým tělesem pyje a vyúsťuje na žaludu pyje jako ostium externum. Má esovitý průběh a slouží jako odvodná cesta pohlavní a močová (Holibková, Laichman, 2006). Obr. 1: Pohlavní žláza a vývodné pohlavní cesty 17

18 3.1.3 Přídatné pohlavní žlázy Sekrety vylučované přídatnými pohlavními žlázami tvoří jednak přirozené ředidlo spermií, jednak obsahují látky, které slouží k výživě spermií a konečně upravují spermiím prostředí během jejich průchodu močovou trubicí a v pohlavním ústrojí samice. Patří k nim semenné váčky, předstojná žláza a bulbouretrální žláza (Marvan, 2007; Jelínek, 2003). Semenné váčky nebo také měchýřkovitá žláza (vesiculae seminales) jsou to párové žlázky, protáhlého tvaru, dlouhé asi 5 cm. Uloženy jsou na zadní stěně močového měchýře. Jejich vývod ductus excretorius se spojuje s chámovodem. Tuboalveolární žlázky semenných váčků produkují sekret, důležitý pro životnost spermií. Má alkalickou reakci, která umožňuje pohyblivost spermií. Předstojná žláza (prostata) je to nepárový orgán velikosti kaštanu. Baze prostaty basis prostatae naléhá na močový měchýř, hrot apex prostatae míří dopředu a dolů. Skládá se ze souboru žlázek, které tvoří tři laloky. Středním lalokem prochází prostatická část mužské močové trubice. Tuboalveolární žlázky prostaty produkují sekret charakteristického zápachu, mírně kyselé reakce (ph 6,4). Má význam pro schopnost spermií oplodnit vajíčko. Obsahuje zinek, prostaglandiny, polyamidy a další významné složky (Holibková, Laichman, 2006). Bulbouretrální žláza (Cowperovy žlázy, glandula bulbourethralis) je párová a leží na močové trubici před jejím výstupem z pánve. Sekret je převážně vylučován na konci ejakulace, je zásaditý a tvoří ochranu spermií neutralizací zbytků kyselé moči v uretře. Částečně se podílí také na lubrikaci. Nepatrný podíl na celkovém objemu ejakulátu tvoří i sekret uretrálních žlázek (Littreovy žlázy) nacházejících se ve stěně močové roury. Je alkalický (ph 7,2 8,5) a obsahuje anorganické soli. Upravuje ph uretry a je vylučován jako předspermiová frakce ejakulátu (Marvan, 2007; Věžník a kol., 2004) Kopulační orgán Kopulačním orgánem je pyj (penis), který umožňuje deponovat semeno do pohlavního ústrojí samice při kopulaci a je současně i odvodnou cestou moči mimo tělo. Pyj má válcovitý tvar a skládá se z fixované části kořene pyje a volné části těla pyje. Kořen pyje je pomocí dvou ramen pevně připojen na kaudální zaoblenou plochu obou sedacích kostí a přechází v tělo. To je ve své kaudální části uloženo v řídkém podkožím vazivu 18

19 krajiny hráze a v mezinoží. Kraniální konec pyje je volný, zakončený žaludem a v ochablém stavu ukryt ve zvláštním kožním vaku, v předkožce (Marvan, 2007). Podkladem pyje jsou tři topořivá tělíska: párová corpora cavernosa penis a nepárové houbovité corpus spongiosum penis. Topořivá tělesa se skládají ze systému dutinek, do kterých ústí přívodné tepénky aa.helicinae. Při erekci se (omezením odtoku krve žilami a zvýšením přítoku tepnami) dutinky plní krví a celý orgán se zvětšuje. Dochází tak ke ztopoření což umožňuje imisi a ejakulaci (Holibková, Laichman, 2006). Pomocné svaly pyje jsou dva párové svaly a to příčně pruhovaný napřimovač pyje a hladký zatahovač pyje. Obr. 2: Mužská pohlavní soustava Řízení pohlavní činnosti samců Pohlavní funkce a celý proces rozmnožování jako složité biologické děje jsou výsledkem činnosti specializovaných pohlavních orgánů, avšak jejich řízení podléhá extragenitálním strukturám hypotalamohypofyzárnímu systému. Reprodukční funkce jsou tedy řízeny souhrou nervového a endokrinního systému. Regulační mechanismy jsou součástí geneticky zafixovaného vnitřního řídícího systému, který je ovlivňován vnějším činitelem časem, který je zodpovědný za druhově a individuálně typický průběh reprodukčních dějů. 19

20 Řídícím orgánem pravidelného průběhu pohlavních funkcí je centrální nervový systém (CNS) jmenovitě hypotalamus a adenohypofýza (hypotalamo-hypofyzární sytém). Kůra koncového mozku prostřednictvím smyslových orgánů přijímá a zaznamenává podněty z vnějšího i vnitřního prostředí, zpracovává je a dále předává do hypotalamu. Hypotalamus je nevýrazná část mozku, která však centruje významné funkční aktivity. V hypotalamu jsou dvě místa, které mají klíčový význam pro řízení pohlavní činnosti. Jsou označována jako přední a zadní sexuální centra. S četnými nervovými buňkami nakupenými do skupin, tzv. jader představuje hypotalamus vlastní centrum pro řízení pohlavní činnosti. Na kontrole sexuální aktivity se podílí sekrecí gonadoliberinu (GnRH gonadotropin releasing hormon). Jde o dekapeptid, který zabezpečuje uvolnění obou gonadotropních hormonů z hypofýzy. Důležité je jeho pulzační uvolňování, které však u samců není pravidelné. Hypofýza (podvěsek mozkový) je řazena do žláz s vnitřní sekrecí, je součástí diencefala. Dělí se na přední a zadní lalok. Adenohypofýza (přední lalok) řídí celou dalších žláz mezi nimi i gonády. Zadní lalok neurohypofýza vylučuje některé hormony, které jsou do ní transportovány po vytvoření v jiné části mozku hypotalamu. Pod vlivem hypotalamických GnRH se ve specializovaných buňkách adenohypofýzy vytvářejí dva gonadotropní hormony folitropin (FSH) a lutropin (LH). Chemicky se jedná o vysokomolekulární glykoproteidy s poměrně vysokou molekulovou hmotností a jsou pohlavně nespecifické. Folikuly stimulující hormon u samců stimuluje růst semenotvorných kanálků a tvorbu spermií, činnost Sertoliho buněk a produkci hormonu inhibinu. Luteinizační hormon u samců také označovaný jako intersticiální buňky stimulující hormon (ICSH) působí na intersticiální buňky (Leydigovy) a stimuluje tvorbu specifického pohlavního hormonu testosteronu. Gonadální hormony (sexageny) Leydigovy buňky představují strukturální základ pro inkreční aktivitu parenchymu varlat. Zde se tvoří několik typů pohlavních hormonů (androgenů), z nichž nejvýznamnějším je testosteron. Testosteron je steroid a spolu s dalšími androgeny vytvářenými ve varlatech řídí vznik pohlaví a sexuální diferenciaci, stimuluje tvorbu sekundárních pohlavních znaků, růst pohlavního údu, růst a sekreční funkci přídatných pohlavních žláz, formování pohlavního pudu a samčího pohlavního chování. Testosteron se tvoří v intersticiálních buňkách varlat a uvolněný přechází do semenotvorných kanálků. Je vázán specifickými vazebnými proteiny (ABP) na 20

21 recepčních místech Sertoliho buněk. Do krevní plazmy přechází ve vazbě na transportní protein, β-globulin a dostává se tak k cílovým tkáním v organismu. Hladiny testosteronu jsou značně kolísavé. Inhibin je peptid, který byl prokázán v parenchymu varlat semenotvorných kanálcích, v lymfě a sekretech z rete testis. Jeho přítomnost byla též potvrzena v ejakulátu. Je vytvářený v podpůrných buňkách semenotvorných kanálků varlete Sertoliho buňky a jeho účinnost je řazena do zpětnovazebních mechanismů, tzn. Že zpětně působí na hypofýzu a brzdí tvorbu FSH. Účinek pohlavních hormonů na výše nadřazená centra (adenohypofýzu a hypotalamus) označujeme jako zpětná vazba a jejím principem je, že ovlivňuje pozitivně nebo negativně jejich činnost, tj. stimulují nebo brzdí produkci nadřazených hormonů (Jelínek, 2003; Věžník a kol., 2004). Obr. 3: Neurohumorální řízení (Věžník a kol.2004) 21

22 3.2 Spermatogeneze Vývoj a dozrávání samčích pohlavních buněk je složitý vývojový proces. V prenatálním období nediferencované kmenové buňky gonocyty intenzivně proliferují a procházejí mnoha generacemi buněčného cyklu. Mitotickým dělením těchto primordiálních, fetálních, zárodečných buněk vznikají spermatogonie mateřské semenné buňky. Po pubertě probíhá plynulá spermatogeneze, při které dochází během buněčného cyklu k postupnému diferencování spermatogonií a vývoji dalších stadií (Malínský, Lichnovský, 2006). Proces spermatogeneze se uskutečňuje v pravidelných cyklech a probíhá kontinuálně v průběhu celého reprodukčního období života. Pravidelné cykly následují za sebou v přesných časových intervalech, přičemž každý cyklus začíná asi o ¼ délky cyklu později než předcházející (Jelínek, 2003). Průběh spermatogeneze neprobíhá ve všech kanálcích rovnoměrně, nýbrž v jednotlivých kanálcích ve vlnovitých cyklech, takže proto jsou na průřezu kanálky patrny různé generace vyvíjejících se pohlavních buněk. Jeden cyklus určitého vývojového stadia trvá přibližně 16 dní a vývoj zralé spermie zahrnuje čtyři cykly (Vacek, 2005). Vývoj od nediferencované spermatogonie až po zralou spermii trvá asi 64 dní a prochází několika etapami: A. Spermatocytogeneze je to období, ve kterém dochází k rozmnožování buněk mitotickým a meiotickým dělením. Zahrnuje tyto fáze: 1. fáze rozmnožování probíhá ve stadiu spermatogonií, které se intenzivně mitoticky dělí při bazální membráně semenotvorného kanálku. Spermatogonie se s dělením současně diferencují. Dvě nestejně velké dceřinné buňky, které vznikly mitózou, se ve fázi G 0 buněčného děleni diferencují na spermatogonii A, která opět vstupuje do dalšího buněčného cyklu, a na druhou výše diferencovanou spermatogonii intermediálního typu, která po několikanásobném dělení dá vzniknout B-spermatogoniím. Spermatogonie A představují nejstarší buněčný element. Leží u bazální membrány kanálků s relativně velkým oválným jádrem, jejichž chromatin je rozptýlen. Tyto buňky mají význam rezervních, většinou dočasně neproliferujících elementů. Spermatogonie intermediální zůstávají při bázi kanálků a od předešlých se odlišují oválnou strukturou jádra bohatšího na chromatin a protáhlým tvarem buněčného těla. 22

23 Pokračují v proliferaci, prochází opakovaným buněčným cyklem a proto udržují konstantní populaci těchto elementů v zárodečném epitelu. Spermatogonie B tvar buňky je sférický. Vyčleňuje se z buněčného cyklu a zahajuje proces spermatogeneze. Spermatogonie B v kontaktu se Sertoliho buňkami se přestávají mitoticky dělit a vstupují do profáze miózy, během níž se zvětšují ve velké buňky spermiocyty. 2. fáze růstu je charakterizována růstem spermatogonií B a změnami na jejich jádře. Výsledkem jsou primární spermatocyty. Primární spermatocyty (spermatocyty I. řádu) jsou největšími buňkami v semenotvorných kanálcích. Zaujímají střední vrstvu epitelu. V jádře jsou dva pohlavní chromozomy X a Y. 3. fáze zrání, miózy je charakterizování dvěma po sobě následujícími děleními a výsledkem je redukce počtu chromozomů na polovinu diploidní se mění na haploidní a rekombinace genetických vloh. Při prvním dělení z primárních spermatocytů vzniknou sekundární spermatocyty a z nich při druhém zracím dělení čtyři spermatidy s haploidním počtem chromozomů. Prvé zrací dělení je charakteristické značně dlouhou profází (až 22 dní), ve které probíhají tato stadia: Leptotene chromozomy se spiralizují a dehydratuji, jejich hmota se kondenzuje v jádru a jsou patrné jako štíhlá vlákna. Zpočátku připomínají klubíčka, ale pak se přesouvají a vytvářejí útvar v podobě růžice, tzv. leptotenní buket. Zygotene přikládají se k sobě homologií chromozomy a dochází k jejich splývání konjugaci. Vzniklé útvary se nazývají bivalenty. Pachytene bivalentní chromozomy se zkracují, ztlušťují, přičemž každý chromozom se podélně rozštěpí na dvě chromatidy. Každý bivalent je tvořen 4 chromatidami, tzv. tetráda. Mezi odpovídajícími úseky cromatid homologiích chromozomů probíhá crossing-over, jehož podstatou je výměna genetického materiálu. Diplotene homologií chromozomy se oddělují, ale jejich chromatidy ještě zůstavají spojeny v místech tzv. chiasmatech, kdy se dokončuje ještě výměna genetického materiálu 23

24 Diakineze bivalentní chromozomy e dále zkracují a chromozomy zůstavají spojeny jen svými centromerami. Následují další fáze jako při mitóze. Metafáze I - rozpustí se jaderná membrána, zaniká jádro a tvoří se dělící vřeténko. Bivalentní chromozony se uspořádají do ekvatoriální roviny. Anafáze I - homologií chromozomy se přesouvají k opačnému pólu buňky jako diády s dvěma chromatidami, protože jejich centromery se nerozdělily. Telofáze I vznikají dva sekundární spermatocyty s polovičním haploidním počtem chromozomů. Po krátké interfázi následuje druhé zrací dělení, které je podobné mitóze. Centromery sekundárních spermatocytů se rozdělí a diody se rozpadnou ve dvě skupiny monád neboli v jednoduché chromozómy, které přecházejí do vzniklých spermatid. Obsah DNA je ve spermatidách poloviční. Sekundární spermatocyty (spermatocyt II. řádu) každý sekundární spermatocyt je již nositelem X nebo Y chromozomu. Spermatidy - jsou charakterizované přítomností vždy jen jednoho sexchromozomu X chromozom nebo Y chromozom, poměr spermatid se zřetelem na sexchromozomy je 50:50. B. Spermiohistogeneze v tomto období se již buňky nedělí. Je to proces přeměny kulaté spermatidy ve zralou spermii. Jaderný chromatin se silně kondenzuje a jádro se přeměňuje na hlavičku spermie. Z Golgiho komplexu vzniká plochý váček akrosom, který se čepičkovitě přikládá na apikální část jádra. Postupně se v něm hromadí hydrolytické enzymy a jiné látky a přeměňuje se v akrozóm. Centrioly se stěhují do krčku, distální ventrikl představuje bazální tělísko osového vlákna, kolem něhož se difenercují chordy. Mitochondrie vytvoří šroubovitě uspořádanou pochvu ve spojovacím oddíle. Jádro se prodlužuje, zmenšuje. Cytoplazma se odlučuje jako reziduální tělísko a celá spermie je kryta cytoplazmatickou membránou. Během celého procesu diferenciace zárodečných buněk jsou buněčné elementy spojeny tenkými plazmatickými můstky. Teprve s posledním stadiu při vzniku samostatné spermie se jednotlivé buněčné elementy oddělují a část původní cytoplazmy tvoří tzv. reziduální tělíska (Marvan, 2007; Malínský, Lichnovský, 2006; Jelínek, 2003) 24

25 3.3 Ejakulát Obr. 4: Vývoj spermií Ejakulát (sperma, semeno, chám) je produktem pohlavní žlázy testis, vývodných kanálků varlete, nadvarlete a přídatných pohlavních žláz. Je tvořen spermiemi a seminální plazmou (Malínský, Lichnovský, 2006) Spermie Spermie byla při svém objevení považována za primitivní zárodky parazitující v semeně. V roku 1780 na základě svých pokusů s inseminací dospěl Spallanzani k mylnému závěru, že ne spermie, ale chemismus semenné plazmy má vlivy na vajíčko. Až v roce 1824 Prevost a Dumas dokázali fertilizační schopnost spermie, ale až s rozvojem elektronové mikroskopie se dospělo k detailnímu poznání struktury a funkce spermie a jejích jednotlivých částí (Kliment, 1989). Spermie svou morfologickou stavbou představují buňky připravené k samostatnému životu a cílené funkci. Je to vysoce specializovaná buňka, přizpůsobená svou stavbou k přenosu genetické informace při oplození. Jaderný chromatin je velmi koncentrován 25

26 v hlavičce, cytoplazmatické složky se značně redukovaly a transformovaly v bičík, sloužící k aktivní lokomoci. Velikost a tvar spermií je druhově rozdílný a hlavním společným znakem je pohyblivost a schopnost oplození (Malínský, Lichnovský, 2006; Jelínek, 2003). U většiny samců má hlavička tvar tenisové rakety. Apikální část je zaoblená, mírně asymetrická, bazální část něco zúžená a vklenutá. Při bázi je hlavička tlustí a k apikální části se klínovitě zužuje. Je třeba zdůraznit, že i v rámci jednoho druhu existuje tvarová variabilita. Pro každého samce však je tvar hlavičky spermií relativně konstantní a pravděpodobně je geneticky kódován (Věžník a kol., 2004). Spermie se skládá z: hlavičky, středního oddílu (krček, spojovací oddíl) a bičíku (hlavní část a terminální část) Obr. 5: Stavba spermie Hlavička je oválného tvaru, oploštělá, při pohledu ze strany má hruškovitý tvar. Základ tvoří jádro se silně kondenzovaným chromatinem. Na povrchu je kryta cytoplazmatickou membránou a pod ní se nachází vakovitý útvar akrosom, který čepičkovitě nasedá na apikální oploštělou část jádra. Vnější a vnitřní list akrozomové 26

27 čepičky tvoří při své bázi intimní spojení obou listů se sníženým obsahem akrozomální hmoty, takže se jeví při barvení světlejší a označuje se ekvatoriální segment. Akrosom vzniká z Golgiho aparátu a obsahuje velké množství lytických enzymů (hyaluronidáza, proakrozín, akrozín a další), které při oplození umožňují spermii proniknout do vajíčka. Při bazální části hlavičky je podobný světlejší útvar označovaný jako postakrozomální pochva (Malínský, Lichnovský, 2006). Bazální část hlavičky je prohloubená v podobě implantační jamky hlavičky, do níž se vkládá hlavice bičíku, která slouží ke spojení bičíku s hlavičkou (Marvan, 2007). Krček hlavní součástí krčku je proximální ventrikl, kolem něhož je uloženo 9 příčně žíhaných provazců, označovaných jako segmentované chordy. V distální části krčku, na hranici se spojovacím oddílem, je distální ventrikl, který je orientován v podélné ose a představuje bazální tělísko osového vlákna bičíku. Spojovací oddíl jeho středem probíhá osové vlákno axonema, které má stejnou ultrastrukturu jako axonema kinocilie na obvodu 9 párů mikrotubulů a uprostřed dvojice centrálních tubulů. K periferním dvojicím mikrotubulů se přikládá 9 podélně probíhajících tmavých provazců hladké chordy, které jsou plynulým pokračováním žíhaných chord v krčku. Jsou tvořeny kontraktilními proteiny a uplatňují se při pohybu bičíku. Zevně od hladkých chord jsou uloženy mitochondrie, které tvoří souvislou vrstvu, šroubovitě probíhající v celém spojovacím oddíle a označovanou jako mitochondriální pochva (Malínský, Lichnovský, 2006). Jedna mitochondrie tvoří cca tři čtvrtiny závitu. Mitochondrie tvoří závitnici o závitech s pravotočivým směrem vinutí (Věžník a kol., 2004). Hlavní část bičíku v osové části má stejné uspořádání jako ve spojovacím oddíle. V zevní vrstvě nacházíme místo mitochondrií fibrózní pochvu z homogenní silně kontrastní hmoty. Skládá se ze dvou poloobloukovitých žeber, se kterými splývají dvě hladké chordy, číslo 3 a 8, a tvoří dva podélné sloupce, které rozdělují hladké chordy na dvě asymetrické poloviny. Toto uspořádání způsobuje při kontrakci vlnitý pohyb bičíku (Malínský, Lichnovský, 2006). Terminální část bičíku je tvořena volným ukončením nepropojených, na povrchu nefixovaných osových mikrotubulů a volných dubletů. V této části již nejsou hladké chordy, které se v distální části bičíku zužují a vytrácejí (Věžník a kol., 2004). Má tedy prakticky stejnou ultrastrukturu jako kinocilie, poněvadž je tvořena pouze axonemou a na povrchu je ohraničena cytoplazmatickou membránou (Malínský, Lichnovský, 2006). 27

28 Celá spermie (tj hlavička i všechny oddíly bičíku) je pokryta nepřerušovanou dvouvrstevnou cytoplazmatickou membránou, která představuje základní ochranu spermie. Je acidorezistentní, vysoce permeabilní a citlivá na změny osmotického tlaku (Jelínek, 2003). Celková délka spermie je asi µm, z toho hlavička 5 µm, střední oddíl 5 µm, hlavní část 45 µm a terminální část 5µm (Malínský, Lichnovský, 2006). Obr. 6: Lidská spermie Chemické složení spermie: Chemické složení spermie je značně rozdílné. Je to podmíněno specifikou daného druhu a úlohou jednotlivých částí spermie v procesu oplození. Více než polovina hmotnosti spermie je tvořena bílkovinami, jejichž základní stavební jednotkou jsou aminokyseliny. 28

29 Cytoplazmatická membrána, pokrývající celou spermii obsahuje bílkovinu podobnou keratinu, vázanouna lipidy. Je bohatá na cystin, histidin a arginin. Membrána má vysokou schopnost permeability, která zabezpečuje látkovou výměnu spermií. Akrozóm, pokrývající přední část hlavičky, je složen z mukopolysacharidů, obsahuje i lipidy a hořčík a četné enzymy uplatňující se v procese oplodnění. Hlavička spermie je tvořena jádrem, které je vyplněno chromatinem obsahujícím převážně deoxyribonukleovou kyselinu (DNA). Ta je vázana na bazický protein s nápadně velkým množstvím argininu. Arginin tvoří % všech proteinů v jádře. V rámci každého druhu jsou nepatrné hmotnostní rozdíly mezi androspermiemi, nesoucími chromozom Y a gynospermií, nesoucí chromozom X. Bičík spermií, vzhledem ke své složité a rozdílné stavbě jednotlivých částí má i rozmanitou chemickou stavbu. Mitochondriální oddíl obtáčený spirálou mitochondrií je bohatý na lipidy. Fibrily bičíku sestávají převážně z proteinu.důležitou složkou bičíku spermie je plazmalogen. V kontraktilních proteinech fibril se nachází také protein Dynin, označovaný také jako spermozin, umožňující pohyb spermie. Minerální látky tvořící jen asi 1-2 % hmotnosti spermie jsou nejčastěji zjišťovány ve formě fosforečnanů. Enzymy byly prokázány jak ve spermiích tak i v semenné plazmě. Pokud se týká spermií je nejbohatším zdrojem akrozom a dále mitochondriální oddíl. Akrozom obsahuje mimo jiné hyaluronidázu, akrozin, proakrozin, aspartát aminotransferázu, alanin aminotransferázu a další enzymy Seminální plazma Seminální plazma obsahuje převážně sekrety přídatných žláz, a to v semenných váčcích, prostatě, Cowperových žlázkách. Malé množství se tvoří i ve vývodných cestách a to chámovodech, ampulách chámovodu a v uretře. Nepatrný podíl je i z nadvarletních kanálků. Uvolnění semenné plazmy je reflektorické a záleží ve značné míře na stupni sexuálního podráždění. Seminální plazma je po ejakulaci dočasně vhodným biologickým prostředím pro spermie, ochraňuje cytoplazmatické membrány spermií, udržuje jejich tvar, zabezpečuje jejich rozptýlení, zamezuje aglutinaci spermií, udržuje vnitrobuněčný osmotický tlak, po určitou dobu má pufrovací schopnost, kterou vyrovnává a udržuje chemickou reakci ve fyziologických hranicích, které jsou odlišné u jednotlivých druhů samců (Kliment, 1989). Má alkalickou reakci o ph 7,1 7,8. Ejakulát není homogenní tekutinou a má tři složky. 29

30 Prvá složka je tvořena především sekretem prostaty, je řídká a mléčného vzhledu. Obsahuje kyselou fosfatázou a fibrinolyzin. Druhá složka je objemově největší a obsahuje ve velkém množství normální spermie. Třetí složka je tvořena především sekrety semenných váčků, je rosolovité povahy, obsahuje fruktózu a prostaglandiny. Z formovaných elementů se v této složce vyskytují převážně nefunkční abnormální formy spermií (Malínský, Lichnovský, 2006). 3.4 Laboratorní metody hodnocení ejakulátu Základní vyšetření spermatu je bezprostředně po jeho odběru a kontrola aktivity spermií se provádí rovněž před zmrazením spermatu a po zmrazení. Podmínkou zdárného vyšetření a posouzení semene je standardizace teploty po celou dobu vyšetření. Zahájení analýz semen je limitováno časem kolikvace ejakulátu. Hranice tohoto enzymatického procesu je stanovena 60 minutami Makroskopické vyšetření ejakulátu Při makroskopickém vyšetření se stanoví objem ejakulátu, barva, konzistence, pach, ph a obsah cizích příměsí. Konzistence a viskozita Posuzuje je pomocí skleněné tyčinky nebo injekční stříkačky. Hodnotí se plynulost odkapávání semene a schopnost vláknění. Objem Není-li ejakulát získán do kalibrované zkumavky, měří objem se buď přelitím do kalibrovaného odměrného válce a nebo kalibrovanou stříkačkou. Normální objem ejakulátu muže se pohybuje od 2 do 6 ml. Pro srovnání například normální objem býka je kolem 4 ml, u hřebce 20 ml, ale u kance až 100 ml a pes 2 ml. Velikost objemu je ovlivněna frekvencí styků a sexuální vybaveností. Objem menší než 2 ml se považuje za projev parvospermie a je třeba vyjasnit její příčinu. Barva Posuzuje se proti světlu. Barva spermatu by měla být bělavá nebo šedobílá nebo i mírně nažloutlá. Jako nevhodná barva je sperma zbarveno silně žlutozeleně nebo zeleně což 30

31 svědčí pro příměs hnisu, moče nebo mikroorganismů. Nevhodná je i příměs krve v ejakulátu. Pach Posuzuje se čichem na okraji sběrače. Správné sperma má pach připomínající pach kravského mléka. Nazelenalé sperma může páchnout po moči a hnilobný zápach odpovídá příměsi hnisu v ejakulátu. Při rutinním vyšetřování se nehodnotí. Stanovení ph semene Pro srovnatelnost vyšetření je třeba dodržet časový termín pro stanovení ph, který odpovídá úplnému zkapalnění. Ke stanovení ph je možné použít buď indikátorových papírků nebo ph metrů. Normální hodnoty se u mužů pohybují mezi 7,2 7,8. Obsah cizích příměsin Mohou to být chlupy, nečistoty z předkožky, hnis Mikroskopické vyšetření ejakulátu Při mikroskopickém hodnocení vzorku ejakulátu se hodnotí koncentrace spermií, motilita spermií a morfologie spermií. Stanovení koncentrace spermií Základním postupem pro zjištění koncentrace spermií a množství spermií v ejakulátu je hematocytometrická metoda. Koncentrace spermií v ejakulátu se stanoví počítáním v Burkerově nebo Maklerově komůrce. V Burkerově komůrce se spočítají všechny spermie ležící uvnitř středního čtverečku o velikosti 1/16 mm 2 a dále všechny spermie, které se hlavičkami dotýkají dvou ze čtyř stěn čtverečku. Takto se spočítají spermie v 10 čtverečcích. V Maklerově komůrce se spočítají spermie v 10 čtvercích a výsledný počet se udává v mil/ml. Názory na koncentraci spermií u tzv, normálních ejakulátů mužů procházely trvalou korekcí dle předkládaných analýz jednotlivých autorů. Světová zdravotnická organizace přijala pro koncentraci spermií dolní konvenční hodnotu 20x10 6 spermií v ml. 31

32 Stanovení motility spermií Pro rutinní laboratorní analýzy lze využít jednoduché klasifikační metody stanovení motility spermií, spočívající v užití jednoduché kategorizace pohybu spermií: a) rychle a progresivně se pohybující spermie b) pomalý až líný progresivní pohyb spermií c) neprogresivní pohyb spermií d) nepohyblivé spermie Spermie kategorií a) a b) se pohybují cíleně vpřed a rozdělení spočívá jen v rozdílmé rychlosti pohybu spermií. Kategorie c) pokrývá jak spermie v necíleném pohybu tak spermie v pohybu na kruhu, ale i oscilačním. Podle WHO se pro normální ejakulát muže počítá s motilitou větší jak u 50 % spermií v klasifikaci stupňů a),b) nebo více jak 25% spermií v kategorii progresivního pohybu a). Morfologické hodnocení ejakulátu Je zaměřeno na stanovení paliativních a kvantitativních rozdílů v normálně a patologicky utvářených spermiích, spermií destruovaných stejně jakož i průkazu buněčných útvarů uvolněných z vývojové řady spermiogeneze, buněk přídatných žláz a vývodných cest pohlavního systému a konečně granulocytů, lymfocytů, monocytů, fagocytů a dalších buněk krevní řady. Kvalita morfologického vyšetření spočívá již na bezchybném provedení nátěru semen na podložní sklo. Vlastní provedení nátěru je zcela shodné s provedením nátěru krevního. Nátěr má být tenký, aby v krátké době oschnul. K diferenciaci morfologických abnormalit na spermiích je nejlépe použít barvící metody s dobrým rozlišením strukturálních detailů. Za klasické postupy se považuje barvení: Hematoxylin-Eosin, Papanicolau a May- Grumwald-Giemsa. Barvení podle May-Grumwald-Giemsy: Na nátěr se navrství roztok May-Grumwald po dobu 3 min. Po této době se doplní stejným množstvím destilované vody a nechat působit 1 minutu. Poté roztok slijeme a převrstvíme roztokem Giemsy. Důkladně opláchneme destilovanou vodou. Prohlížíme v imerzi. Výsledek barvení: Hlavička spermií se barví světle až tmavo-modře, oblast akrozomu akrozomu růžově 32

33 Jádra buněk červeno-fialově, plazma buněk lymfoidní řady světle modrá. Lymfoidní azurová granulace purpurově červeně. Myeloidní azurová granulace fialová až fialovo-hnědá. Neutrofilní granula hnědá až hnědorůžová. Eozinofilní granula oranžová až cihlově červená. Bazofilní granula ultramarinově modrá až modrofialová. Erytrocyty růžově. 1. Morfologické abnormality na hlavičce spermie Projevují se nejčastěji na tvaru, akrozomu a nukleoplazmě hlavičky spermie. Změny tvaru hlavičky mohou se projevit v tvaru a uspořádání akrozomálního systému, v tvaru, velikosti hlavičky a formě její báze. Na nerovnoměrné rozdělení DNA poukazuje malá a obrovská hlavička (mikrocefalie a makrocefalie). Dále je možné pozorovat vyšší procento malformací hlaviček jako jsou zúžené, hruškovité, oválné, citronovité, hruškovité. Změny na akrozómu cytoplazmatická membrána a akrozomální systém jsou citlivé na osmotické změny vnějšího prostředí. Vyšší počet malformací způsobuje proces hlubokého zmrazení. Mezi nejčastější změny na spermiích patří různé anomálie na akrozomu. Nejčastěji jde o svlečený akrozom, různý stupeň napučení akrozomu, vlnité zřasení okraje akrozomu a vakuoly. Na akrozomu se vyskytují i další malformace, které souvisí s nerovnoměrným rozdělením akrozomové hmoty(kondenzace na předním okraji, granulace akrozomu, perzistujici akroblast) a nerovnoměrná barvitelnost akrozomu. Změny vnitřní struktury nukleoplazmy malformace zadní části nukleoplazmy se nejčastěji vyskytují v podobě nerovnoměrného barvení a nerovnoměrného rozdělení jaderné hmoty. Patří sem spermie s granulovanou nukleoplazmou, pravé vakuoly a mikrovakuoly. Granulovaná nukleoplazma granulární struktura chromatinu je porucha diferenciace nukleoplazmy na začátku fáze kaudální manžety. Vakuoly patří meziprimární změny nukleoplazmy a nejčastěji se nachází na apikálním okraji nukleoplazmy a v ekvatoriálním segmentu hlavičky spermie. Odchylky na bázi hlavičky např. plochá, hluboko vtáhnutá, široká nebo úzká a abaxiálně nasazený bičík. 2. Morfologické abnormality na bičíku spermie Do komplexu změn je možné zahrnout různé degenerativní změny na jednotlivých částích bičíka spermie. Důležité jsou hlavně anomálie na mitochondriálním oddíl. Tyto změny se hodnotí jako vážný diagnostický defekt. 33

34 Nejčastější malformaci na mitochondriálním oddíle bičíka je jeho zkrácení, prodloužení, zúžení a přerušení. Aplázie abaxiálního fibrilárního souboru bičíka býčí spermie představuje anomálii, kterou popsal Blom a označil ji Dag defekt, podle jména postihnutého býka. Mezi tvarové změny bičíka patří zdvojený bičík, torze bičíka v různém stupni, různě stočený nebo svinutý bičík, nalomený bičík a další anomálie. 3. Nezralé spermie Patří sem spermie se zadrženou protoplazmatickou kapkou, které pochází z vývojového stadia spermatogenetického cyklu. Nezralé formy spermií mají protoplazmatickou kapku uloženou proximálně na krčku spermie. Postupným dozráváním se kapka posouvá distálně. Obr. 7: Morfologické hodnocení spermií 34