Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav biologie rostlin

Transkript

1 Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav biologie rostlin Vliv syntetických brassinosteroidů na růstové a hormonální reakce řepky olejné (Brassica napus L.) a pšenice seté (Triticum aestivum L.) Doktorská disertační práce Školitel: prof. RNDr. Jan Hradilík, CSc. Vypracovala: Ing. Eva Vlašánková Brno 28

2 Ráda bych na tomto místě poděkovala všem, kteří se podíleli na dokončené mé disertační práce. Především kolektivu pracovníků Ústavu biologie rostlin - mému školiteli Prof. RNDr. Janu Hradilíkovi, CSc. za odborné vedení. Poděkování patří také Ing. Mgr. Marku Klemšovi, PhD. za stanovení kyseliny abscisové a cytokininů, Ing. Zuzaně Mikušové za pomoc při vyhodnocování vzorků polního pokusnictví, Dr.Ing. Heleně Fišerové a Mgr.Vilému Reinöhlovi, CSc. za pomoc při konečném zpracování práce. Dále děkuji pracovníkům Ústavu experimentální botaniky AV ČR v Praze za stanovení indolyl-3-octové kyseliny, v neposlední řadě také RNDr. Ladislavu Kohoutovi,DrSc. z Ústavu organické chemie a biochemie AV ČR v Praze za poskytnutí cenných rad během řešení této práce. Také děkuji pracovníkům Výzkumného ústavu pícninářství v Troubsku, za poskytnutí ploch pro polní pokusy a pomoc při sklizni a Zemědělskému družstvu Střelice za poskytnutí pozemku pro pokusy.

3 Prohlášení Prohlašuji, že jsem předloženou disertační práci na téma Vliv syntetických brassinosteroidů na růstové a hormonální reakce řepky olejné (Brassica napus L.) a pšenice seté (Triticum aestivum L.) vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. V Brně dne Ing. Eva Vlašánková

4 OBSAH SUMMARY ÚVOD LITERÁRNÍ PŘEHLED HISTORIE OBJEVU BRASSINOSTEROIDŮ VÝSKYT BRASSINOSTEROIDŮ V ROSTLINÁCH VLIV BRASSINOSTEROIDŮ NA ROSTLINY Vliv brassinosteroidů na růst rostlin Vliv brassinosteroidů na vývoj rostlin Klíčení semen Diferenciace elementů cévních svazků Květní indukce Senescence Vzájemné působení brassinosteroidů s ostatními fytohormony Auxiny Ethylen Gibereliny Cytokininy Kyselina abscisová Vliv stresu a BRs na změny obsahu ethylenu a kyseliny abscisové Stres způsobený suchem (nedostatkem vody) Stres způsobený zaplavením substrátu POUŽITÍ BRASSINOSTEROIDŮ V POLNÍM POKUSNICTVÍ TESTY PRO DETEKCI BRASSINOSTEROIDŮ Fazolový test (bean second-internode bioassay) Rýžový test (rice-lamina inclination test) TOXICITA BRASSINOSTEROIDŮ CÍL PRÁCE MATERIÁL A METODIKA POUŽITÉ BRASSINOSTEROIDY ROSTLINNÝ MATERIÁL LABORATORNÍ POKUSY Morfologické pokusy Máčení semen v roztocích brassinosteroidů Regenerace adventivních pupenů na hypokotylním pahýlu lnu ovlivněném BRs Ovlivnění růstu kotylárních pupenů po aplikaci BRs na děložní list... 27

5 4.3.2 Vliv brassinostroidů na změny hladin fytohormonů Pěstební podmínky Stresové faktory Kvantitativní stanovení fytohormonů POLNÍ POKUSY VÝSLEDKY A DISKUSE LABORATORNÍ POKUSY Morfologické pokusy Máčení semen v roztocích brassinosteroidů Regenerace adventivních pupenů na hypokotylním pahýlu lnu ovlivněném BRs Ovlivnění růstu kotylárních pupenů u rostlin lnu po aplikaci brassinosteroidů na děložní list Vliv exogenní aplikace BRs na endogenní hladiny ostatních fytohormonů Vliv brassinosteroidů na obsah IAA v listech Vliv brassinosteroidů na produkci ethylenu Vliv brassinosteroidů na změny hladiny ABA Vliv brassinosteroidů na změny obsahů cytokininů Vliv exogenní aplikace brassinosteroidů na endogenní hladiny ostatních fytohormonů při vystavení rostlin stresovým podmínkám Stres způsobený suchem (nedostatkem vody) Stres způsobený zaplavením substrátu Vliv exogenní aplikace brassinosteroidů na množství sušiny POLNÍ POKUSY ZÁVĚR SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY PŘÍLOHY SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK ANOTACE... 17

6 SUMMARY Morphological experiments on model plants of pea (Pisum sativum L.) and flax (Linum usitatissimum L.) showed that individual plant species reacted to various concentrations of brassinosteroids (BRs) differently. All tested concentrations of BRs (esp. 24-epibrassinolide 24-EPI) inhibited root and epicotyle growth in flax, whereas in pea the root and epicotyle growth was stimulated by decreasing concentrations of BRs. Application of BRs on flax stumps showed that the applied compounds did not possess auxin character. Their application resulted in increased number of adventitious sprouts, esp. with 24-EPI. Similar results were also obtained in experiments with application of BRs on one cotyledon of flax, whereby BR 1 as well as 24-EPI inhibited cotylar growth of the treated cotyledon. Monitoring of certain phytohormone levels after the application of BRs onto rape plants (Brassica napus L.) and wheat (Triticum aestivum L.) led to the finding that the IAA level was substantially influenced neither by BR 4 nor 24-EPI, but ethylene production was increased (mostly by 24-EPI). The quantity of ABA increased a few hours after BR 4 application but decreased gradually later on to the level of untreated control. During the monitoring of cytokinin content after application of BRs, the most distinctive effect observed was the decreased quantity of 6-bezylaminopurine in both plants with both BR 4 and 24-EPI. Hitherto presented results confirmed the positive influence of 24-EPI and its new synthetic analogues in coping with stress factors in plants of rape caused by drought or flooding. All applied compounds caused greater accumulation of dry-weight, kept the ethylene production and endogenous level of abscisic acid on a low level for certain time after treatment. The observed changes of ABA and ethylene levels are in accord with the presumption that the less-stressed plants exhibit lower endogenous content of ABA and produce less ethylene. From the two monitored times of application, 7 days before stress and 5 after the stress had begun, the more effective appeared to be the latter application of BRs. The results of field experiments with BRs reflex the climate changes. The yield of rape and wheat was positively influenced in the climatically worse year. BRs promoted plant regeneration and helped to cope with periods of drought and high temperature.

7 1 ÚVOD Přestože jsou brassinosteroidy známy již 3 let, mezi rostlinné regulátory růstu byly zařazeny až v roce Syntézou a studiem účinku brassinosteroidů se zabývá mnoho pracovišť po světě. Zájem o ně je především pro jejich vysokou biologickou aktivitu za použití velmi nízkých koncentrací. Jelikož získání přírodních brassinosteroidů je velmi obtížné a nákladné, jsou syntetizovány a zkoumány nové látky, odvozené od brassinosteroidů přirozeně se vyskytujících v rostlinách. Význam studia účinků brassinosteroidů potvrzují rozsáhlé práce, kdy bylo objeveno, že po jejich aplikaci je podpořen jak buněčný růst, tak i buněčné dělení s následným prodlužovacím růstem. Podpora buněčného růstu brassinosteroidy je spojena s jejich synergickým vztahem s auxiny. Vzájemné spolupůsobení podporuje také zvýšenou produkci ethylenu. Zvláště významný je antistresový účinek brassinosteroidů, který se projevuje zvýšenou odolností vůči stresu suchem, vysokým a nízkým teplotám, stresu zasolení substrátu, nedostatku živin, působení herbicidů apod. Z dosavadních publikovaných prací je známý také jejich příznivý účinek na zvýšení výnosu. V některý zemích již byly brassinosteroidy povoleny pro využití v praxi. Předkládaná disertační práce se zabývá vlivem exogenní aplikace nových syntetických brassinosteroidů (analoga brassinolidu) a přírodního 24-epibrassinolidu na obsahy ostatních fytohormonů (auxinů, kyseliny abscisové, cytokininů a ethylenu) v optimálních pěstebních podmínkách a při vystavení rostlin stresu (suchem a zaplavením substrátu) u rostlin řepky olejné (Brassica napus L.) a pšenice seté (Triticum aestivum L.). Prvotní morfologické pokusy na rostlinách hrachu setém (Pisum sativum L) a lnu setém (Linum usitatissimum L.) měly ukázat fyziologickou charakteristiku nových látek. V polním pokusnictví byl sledován vliv brassinosteroidů na výnos a výnosotvorné prvky u řepky olejné (Brassica napus L.) a pšenice seté (Triticum aestivum L.). 7

8 2 LITERÁRNÍ PŘEHLED 2.1 HISTORIE OBJEVU BRASSINOSTEROIDŮ K objevení brassinosteroidů došlo po několikaletém, metodicky rozdílném výzkumu na dvou pracovištích, téměř ve stejnou dobu. Bylo to v USA a Japonsku. V roce 1941 Mitchell a Whitehead z Beltsvilského zemědělského výzkumného centra (BARC) objevili, že pyl kukuřice (Zea mays L.) obsahuje látky, které podporují růstovou aktivitu u rostlin (YOKOTA, 1999). Během několika let byl zkoumán pyl z více jak šedesáti rostlinných druhů (MANDAVA et MITCHELL, 1971). MITCHELL et al. (197) při hledání nových fytohormonů v pylu různých rostlinných druhů používali fazolový test s růstovou odezvou fazolového stonku (kombinaci jeho zduření a zakřivení) (viz. fazolový test v kap ). Pro pokusy byl použit fazol obecný (Phaseolus vulgaris L., cv. Pinto). Zvláště výrazná reakce se projevila u nezpracovaného lipidového extraktu pylu řepky olejky (Brassica napus L.), a to při použití 1 µg sledované látky oproti kontrole. Tyto látky byly pojmenovány brassiny. WORLEY et MITCHELL (1971) pozorovali na rostlinách fazolu po ošetření brassinem zrychlený růst internodií, a to i internodií nad a pod ošetřeným místem. Buňky se nejen rychleji zvětšovaly, ale urychlilo se také jejich dělení, což vedlo k výrazným anatomickým změnám cévních svazků. Pylové extrakty několika dalších rostlinných druhů vykazovaly buď podobný účinek jako brassiny nebo neměly žádný účinek (MITCHELL et al., 1971; MANDAVA et MITCHELL, 1971). Protože pyl z řepky byl bohatým zdrojem brassinu a jeho dostupnost byla relativně snadná, byl vybrán pro další detailní chemické a biologické studie. MANDAVA et MITCHELL (1972) pozorovali, že aktivní složka brassinu obsahuje převážně glukosyl estery mastných kyselin. Pozdější práce ukázaly, že ačkoliv glukosyl estery mastných kyselin podporují prodlužování, nemají dostatečnou biologickou aktivitu srovnatelnou s purifikovaným brassinem (GROVE et al., 1978). MILBORROW et PRYCE (1968) prosazovali názor, že tato biologická aktivita je způsobena gibereliny. Následné histologické studie ukázaly, že rostliny ošetřené brassiny mají jinou růstovou odezvu než ošetřené kyselinou giberelovou. 8

9 Tabulka 1. Rostlinné druhy obsahující brassiny (YOKOTA, 1999). Fazolový test na druhém internodiu pouze pyl Rýžový test Aesculus hippocastanum L. (jírovec maďal) Arachis hypogaea L. (podzemnice olejná) - semeno Alnus glutinosa (L.) Gaertn. (olše lepkavá) Camellia sasanqua Thunb. (kamélie) - list Brassica napus L. (řepka olejka) Camellia sinensis (L.) O. Kuntz. (čajovník čínský) - list Camellia sinensis (L). O.Kuntz. (čajovník čínský) Cocculus trilobus (Thund.) DC. (jahodníček trojlaločný) - list Carduus nutans L. (bodlák nící) Corylopsis glabrescens F. et S. (lískovníček olysávající) - list Crataegus sp. (hloh) Disanthus cercidifolius Maxim. (dvoukvětec zmarlikolistý) - list Echium vulgare L. (hadinec obecný) Distylium racemosum S. et Z. - list, hálky Pyrus communis L. (hrušeň obecná) Dolichos lablab L. (dlouhatec) - semeno Rhus sp. (škumpa) Glycine max (L.) Merr. (sója luštinatá) - semeno Robinia pseudoacacia L. (trnovník akát) Hamamelis japonica S. et Z. (vilín japonský) - list Secale cereale L. (žito seté) Phaseolus vulgaris L. (fazol obecný) - výhon Sinapis arvensis L. (hořčice polní) Pisum sativum L. (hrách setý) semeno Sysimbrium irio L. Pittosporum tobira (Thunb.) Ait. (pitospora) - list Typha sp. (orobinec) Viburnum awabuki K. Koch (kalina awabuki) - list Ulmus sp. (jilm) Vicia faba L. (bob obecný) - semeno Zea mays L. (kukuřice setá) MANDAVA et al. (1978) vyvinuli velké úsilí na izolaci a identifikaci aktivní složky z brassinů. Pro pokusy bylo použito 227 kg pylu řepky (Brassica napus L.), který byl extrahován do 2-propanolu. Extrakt byl rozdělen do tetrachlormethanu, methanolu a vody. V methanolové frakci byla objevena látka s biologickou aktivitou, proto byla dále chromatografována na řadě objemných silikagelových kolon, během těchto procesů se množství materiálu zredukovalo na 1 g. Ty byly dále čištěny sloupcovou chromatografií a HPLC až bylo získáno 1 mg krystalické látky, která byla nazvána brassinolid ((2S,22R,23R,24S)-2α,3α,22,23-tetrahydroxy-24-methyl-B-homo-7-oxa-5αcholestan-6-one) (Obr. 1.) (GROVE et al., 1979). OH HO HO HO H O O Obr. 1. Struktura brassinolidu. 9

10 V Japonsku jsou první zmínky o objevu nových rostlinných růstových regulátorů v roce 1968 v distyliu (Distylium racemosum S. et Z.), v Japonsku známém jako Isunoki. Látky byly objeveny v hálkách na mladých listech a pupenech, způsobených mšicí Neothoracaphis yanonis. V napadených místech se začaly tvořit zduřeniny, které se velmi rychle zvětšovaly. Prof. Munakata z University Nagoya našel v hálkách aktivní látky, které byly nazvány Distylium faktor, a izoloval je do neutrální frakce methanolových extraktů (později byly nalezeny aktivní látky i ve zdravých listech nenapadených mšicí). Aktivita této frakce byla testována rýžovým testem na rýži seté (Oryza sativa L.) (viz. rýžový test v kap ). Distylium faktory vykazovaly v rýžovém testu stejnou aktivitu jako indolyl-3-octvá kyselina (IAA), ovšem již v setinových koncentracích. Následně byly testovány methanolové extrakty dalších rostlinných druhů (tab.1) na obsah Distylium faktorů. Po objevu brassinosteroidů byly v rostlině Distylium racemosum S. et. Z. objeveny 4 brassinosteroidy v malém množství, okolo 15 ng v 1 kg (ABE et MARUMO, 1991). O dva roky později než brassinolid byl na tokyjské universitě objeven v hálkách kaštanu (Castanea crenata spp.) druhý ze skupiny brassinosteroidů - castasteron ((22R, 23R, 24S)-2α, 3α, 22, 23-tetrahydroxy-24-methyl-5α-cholestan-6-one) (Obr. 2.) (YOKOTA et al., 1982). OH HO HO HO H O Obr. 2. Struktura castasteronu. 1

11 2.2 VÝSKYT BRASSINOSTEROIDŮ V ROSTLINÁCH Ve všech vyšších rostlinných druzích, které byly zkoumány, byly brassinosteroidy (BRs) objeveny (BAJGUZ et TRETY, 23). BRs jsou obsaženy ve všech rostlinných orgánech, a to i v kořenech (KIM et al., 2). U nižších rostlin byla přítomnost BRs potvrzena u 3 rodů: zelené řasy (Hydrodictyon reticulatum (L.) Lagerh.), játrovky (Marchantia polymorfa L.) a přesličky rolní (Equisetum arvense L.) (BAJGUZ et TRETY, 23). Brassinosteroidy se v rostlinách vyskytují jen ve velmi nízkých koncentracích (nanogramech). Jejich obsah je různý dle rostlinného druhu, jeho stáří (mladá pletiva obsahují vyšší množství BRs než zralá pletiva) a typu orgánu (nejvíce jsou BRs obsaženy v pylu a nevyvinutých semenech). Z BRs je u rostlin nejvíce rozšířen castasteron, následován brasinolidem a typhasterolem. Pokusy se značeným 14 C 24-epibrassinolidem ukázaly, že jeho transport probíhá z kořenů do prýtu (pravděpodobně xylémem). Transport z listů byl pouze nepatrný. Pohyb BRs v rostlině je tedy akropetální (NISHIKAWA et al., 1994). 2.3 VLIV BRASSINOSTEROIDŮ NA ROSTLINY Vliv brassinosteroidů na růst rostlin Rozsáhlé studie ukázaly, že BRs mají schopnost stimulovat růst jak celých rostlin, tak i jejich segmentů. Aplikace BRs v nm a µm koncentracích vyvolává růst u jednoděložných i dvouděložných rostlin (MANDAVA, 1988; CLOUSE, 1996; SASSE, 1991). Po aplikaci BRs na rostliny je typickým projevem jak buněčný růst tak i buněčné dělení s následným prodlužovacím růstem. Indolové auxiny ani cytokininy (kinetin) nikdy nevyvolávají u rostlin obě reakce zároveň (tzn. buněčné dělení a buněčný růst). Gibereliny způsobují buněčný růst ne však buněčné dělení (WORLEY et MITCHELL, 1971). Reakce rostliny závisí také na stáří ošetřených pletiv. Pokusy na segmentech listů pšenice ukázaly, že mladší pletiva jsou na exogenní aplikaci BRs citlivější než pletiva vyzrálá (SASSE, 1985). 11

12 První pokusy po objevení BRs probíhaly na rostlinách fazolu obecném (Phaseolus vulgaris L., cv. Pinto) a rýže seté (Oryza sativa L.). Reakce na aplikaci BRs se u fazolu obecného (Phaseolus vulgaris L.) projevovala především tvorbou zduřenin, zakřivení (ohybů) a štěpení druhého internodia (WORLEY et MITCHELL, 1971). U rýže seté (Oryza sativa L.) podporovaly BRs odklon čepele listu (TAKENO et PHARIS, 1982). V nízkých koncentracích způsobovaly BRs zakřivení řapíků děložních listů i hypokotylů u klíčních rostlin ředkve seté (Raphanus sativus L.) (TAKATSUTO et al., 1983). Nízké koncentrace BRs podporovaly růst kořenů u Arabidopsis (MÜSSING et al., 23). Při vysokých dávkách brassinolidu na mladé rostliny okurky seté (Cucumis sativa L.) (KATSUMI, 1991) nebo 24-epibrassinolidu (24-EPI) na pšenici setou (Triticum aestivum L.) a fazol obecný (Phaseolus vulgaris L.) (RODDICK et IKEKAWA, 1992) došlo k inhibici prodlužovacího růstu výhonů, což bylo patrně zprostředkováno vyšší produkcí ethylenu. Zejména byl inhibován růst bočních (laterálních) kořenů u pšenice seté (Triticum aestivum L.), fazolu obecném (Phaseolus vulgaris L.) a kukuřice seté (Zea mays L.) (RODDICK et IKEKAWA, 1992). I když BRs i auxiny vyvolávají prodlužovací růst, rychlost reakce rostlin na tyto látky je rozdílná. Růst po aplikaci auxinu začíná již po 1-15 minutách a po 3-45 minutách dojde k maximální rychlosti růstu (TAIZ, 1984). ZUREK et al. (1994) pozorovali počátek růstu po aplikaci BRs nejdříve za 45 min, jeho rychlost se neustále zvyšovala až po dobu několika hodin Vliv brassinosteroidů na vývoj rostlin Klíčení semen V řadě prací bylo pozorováno, že BRs podporují klíčení semen: řeřichy seté (Lepidium sativum L.) (JONES-HELD et al., 1996), podzemnice olejné (Arachis hypogaea L.) (SASSE et al., 1995), řepky olejky (Brassica napus L.) (CHANG et CAI, 1998), rýže seté (Oryza sativa L.) (DONG et al., 1989; ANURADHA et RAO, 23), pšenice seté (Triticum aestivum L.) (SAIRAM et al., 1996), rajčete jedlého (Lycopersicon lycopersicum (L.) Karsten ex. Farw.) (VARDHINI et RAO, 2) a tabáku virginského ( Nicotiana tabacum L.) (LEUBNER-METZGER, 21). Při klíčení semen dochází ke změnám obsahu jednotlivých 12

13 endogenních BRs, například v semenech ředkve seté (Raphanus sativus L.) ke zvýšení obsahu castasteronu a brassinolidu (SCHMIDT et al., 1991) Diferenciace elementů cévních svazků Pro první pokusy účinku BRs na cévní svazky byla použita explantátová kultura slunečnice hlíznaté (Helianthus tuberosus L.). Po exogenní aplikaci BRs CLOUSE et ZUREK (1991) pozorovali zrychlení diferenciace tracheid. Účinek BRs byl zkoumán také na explantátové kultuře mezofylových buněk ostálky sličné (Zinnia elegans Jacq.). Biosyntéza endogenních BRs i giberelinů (GA) byla nejdříve inhibována aplikací uniconazolu (rostlinný inhibitor, patřící do skupiny triazoly). Po ošetření uniconazolem se zpomalila diferenciace tracheid. Následné ošetření kultury brassinolidem nebo 28-homobrassinolidem obnovilo rychlejší diferenciace tracheid (k tomuto ovšem nedošlo po aplikaci GA) (IWASAKI et SHIBAOKA, 1991). YAMAMOTO et al. (1997) objevili, že brassinolid je nezbytná látka pro diferenciaci tracheid při vstupu do jejich poslední fáze, tj. tvorby sekundární stěny, a je také přítomen při buněčné smrti. Při srovnání rostlin huseníčku rolního (Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.) s mutanty cpd Arabidopsis (u kterých je biosyntéza BRs inhibována) bylo pozorováno, že u mutantů dochází ke změně rovnováhy tvorby xylému a floému. Diferenciace floému byla vyšší na úkor tvorby xylému (SZEKERES et al., 1996) Květní indukce SUGE (1986) pozoroval, že brassinosteroidy podporovaly kvetení u dlouhodenní rostliny ředkve seté (Raphanus sativus L.). U krátkodenní rostliny Perilla frutescence L. nebyly vypozorovány žádné změny po aplikaci BRs. Postřik BRs na list zvýšil násadu květů u jahodníku obecného (Fragaria vesca L.) (PIPATTANAWONG et al., 1996). Pokusy skupiny YOSHIOK et al. (199) ukázaly, že při ošetření révy vinné (Vitis vinifera L.) BRs v podzimních měsících se zvýšila květní násada, zatímco při ošetření v zimních měsících se květní násada snížila. 13

14 Senescence BRs hrají důležitou roli při regulaci procesu stárnutí rostlin. Studium zrání oplodí rajčete jedlého (Lycopersicon lycopersicum (L.) Karsten ex. Farw) přineslo poznatek, že po ošetření 24-epibrassinolidem nebo 28-homobrassinolidem, dojde ke zvýšení produkce lykopenu, sacharidů a ethylenu, kdežto obsah kyseliny abscisové klesá, tzn. urychluje se zrání (VARDHINI et RAO, 22). Ošetření rýže seté (Oryza sativa L.) brassinosteroidy urychlilo zrání a výrazně zvýšilo obsah škrobu v zrnu (FUJII et SAKA, 21b). MANDAVA et al. (1981) pozorovali, že BRs zrychlovaly proces stárnutí u explantátové kultury řepeně (Xanthium ssp.) a šťovíku (Rumex ssp.). V oddělených dělohách okurky seté (Cucumis sativus L.) došlo k zrychlení destrukce chloroplastů (ZHAO et al., 199). Později bylo objeveno, že zrychlená senescence je doprovázena zvýšením peroxidázové aktivity, akumulací malondialdehydu a ponížením aktivity superoxid dismutasy a katalásy (HE et al., 1996). U mutantů Arabidopsis det2 s deficitem BRs došlo ke zpomalení stárnutí chloroplastů a oddálení kvetení (LI et al., 1996) Vzájemné působení brassinosteroidů s ostatními fytohormony Po objevení brassinosteroidů jako látek ovlivňujících růst, začal být jejich vliv na rostliny srovnáván s ostatními fytohormony Auxiny V mnoha pracích bylo pozorováno, že mezi BRs a auxiny je velmi silný synergický vztah. Například YOPP et al., (1981) pozorovali podporu buněčného růstu při aplikaci BRs a auxinů u Vigna angularis (Willd.) Ohwi & Ohashi, epikotylů hrachu setého (Pisum sativum L.) a apexů fazolu obecného (Phaseolus vulgaris L.). Produkce ethylenu u etiolovaných hypokotylů vigny (Vigna radiata L. syn. Phaseolus aureus L.) je také projevem synergického vztahu BRs a auxinu (ARTECA et al., 1983). Tento synergismus byl závislý na sekvenci ošetření rostlin, a projevoval se v případech, kdy byly rostliny nejdříve ošetřeny BRs a následně auxiny. 14

15 COHEN et MEUDT (1983) pozorovali, že 24-epibrassinolid neměl vliv na hladinu indolyl-3-octové kyseliny (IAA) v rostlinných pletivech fazolu (Phaseolus vulgaris L.) a také neovlivnil rychlost transportu ani jeho metabolismus. Ovšem KURAPOV (1996) pozoroval, že při ošetření ječmene setého (Hordeum vulgare L.) 24-epibrassinolidem se výrazně zvýšil obsah IAA. Ke stejným závěrům došli i EUN et al. (1989) na etiolovaných hypokotylech tykve velkoplodé (Cucurbita maxima Duch.). Také u rostlin bavlníku (Grossypium hirsutum L.) vyvolal brassinolid navýšení množství IAA (LUO et al., 1988). V pokusech sledovaných KARNACHUK et al. (22) byl pozorován zvýšený obsah IAA po aplikaci 1-6 M 24-epibrassinolidu u huseníčku rolního (Arabidopsis thaliana (L.) Heynh) pěstovaných ve tmě. TAKENO et PHARIS (1982) se domnívali, že účinek BRs na rostlinu je zprostředkován narůstající hladinou auxinu. Dalším zkoumáním (SASSE, 199; SASSE, 1991a) ale bylo zjištěno, že auxin nebyl pro BRs zprostředkovatelem, ale měl vliv na celkovou reakci rostlin. BAO et al. (24) na Arabidopsis thaliana ekotypu Columbia sledovali synergismus účinku BRs a IAA na růstu a vývoji laterálních kořenů. Na rostlinách byla aplikována samostatně IAA, samostatně brassinolid a kombinace těchto látek. Při aplikaci samotné IAA o koncentraci 2 nm se na rostlinách neprojevila její účinnost, až při dávce 5 nm se výrazně zvýšil počet laterálních kořenů. Po ošetření roztokem 1 nm brassinolidu došlo ke zvýšení počtu postranních kořenů 1,6x na cm délky hlavního kořene. Hustota bočních kořínků po kombinaci 1nM brassinolid s 1, 5 a 2 nm IAA se zvýšila 2,64x (1 nm), 2,7x (5 nm) a 1,95x (2 nm). Z pokusu tedy vyplynulo, že při nižší koncentraci IAA má její kombinace s brassinolidem vyšší synergický efekt. Z dalších pokusů na kořenech Arabidopsis bylo objeveno, že BRs mají vliv na transport auxinů. Nízké koncentrace brassinolidu (1 a 5 nm) zvýšily akropetální transport auxinů v kořenech pouze nepatrně, ale po aplikaci 25 nm byl jejich přesun zvýšen až o 2 % (BAO et al., 24). Látky antiauxinové povahy (např. kyselina 2,3,5-trijodbenzoová) ve vysokých koncentracích inhibovaly účinek také brassinosteroidů (TAKENO et PHARIS, 1982; CAO et CHEN, 1995; KIM et al., 2) Ethylen Další důkaz o synergistickém vztahu mezi IAA a BRs byl pozorován při studiu ethylenu na etiolovaných hypokotylních segmentech vigny (Vigna radiata L.). 15

16 Kombinované ošetření BRs a IAA výrazně zvyšovalo produkci ethylenu oproti kontrole i oproti oddělené aplikaci a to významně především u koncentrace 2 µm BRs v kombinaci s 1 µm IAA (ARTECA et al., 1983; ARTECA et al., 1985). SCHLAGNHAUFER et al. (1984) objevili, že brassinolid samostatně i společně s IAA stimuluje produkci ethylenu ve fázi přeměny prvního meziproduktu S-adenosylmethioninu na 1-aminocyklopropan-1-karboxylovou kyselinu (ACC). Pokus byl prováděn na segmentech vigny (Vigna radiata L.). Stejný účinek byl pozorován i na etiolovaných segmentech stejné rostliny (YI et al., 1999) a také na kořenech kukuřice seté (Zea mays L.) (LIM et al., 22). Při pokusech na etiolovaných segmentech Vigna radiata L. za nízké hladiny světla byl tento efekt potlačován (ARTECA, 1995). BRs vyvolaly epinastii u listů a řapíků rajčete jedlého (Lycopersicon lycopersicum (L.) Karsten ex. Farw.), zprostředkovanou biosyntézou ethylenu. Prekursorem ethylenu je ACC, které se hromadí v listech i jejich řapících (ARTECA, 1995). Také pokusy na explantátové kultuře jabloně třešňolisté (Malus prunifolia (Willd.) Borkh) var. Marubakaido potvrdily zvýšení produkce ethylenu po aplikaci brassinosteroidu (28-homocastasteronu) (PEREIRA-NETTO et al., 26). Produkce ethylenu byla zvyšována při aplikaci brassinolidu a 24-epibrassinolidu nebo 24-epibrassinolidu v kombinaci s retardanty růstu. Pokusnou rostlinou byla rýže setá (Oryza sativa L.), na kterou byly látky aplikovány několik dní před tvorbou klasu a produkce ethylenu byla sledována ve stádiu mléčné zralosti (SAKA et al., 1992). KORABLEVA et al. (22) pozorovali vysoký stimulační efekt tvorby ethylenu v prvních 7 dnech po aplikaci 24-epibrassinolidu (1 µg.l -1 ) na lilek brambor (Solanum tuberosum L., cv. Nevskii). 24-epibrassinolid byl aplikován v průběhu hluboké dormance. Aplikace brassinolidu na rostliny kukuřice seté (Zea mays L.) o koncentraci 1-7 M zvýšila produkci ethylenu o 11 % (CHANG et al., 24) Gibereliny V pokusech na mladých rostlinkách vigny (Vigna radiata L.) byly porovnávány rozdíly růstu epikotylů mezi ošetřením BRs a GA 3. BRs vykazovaly účinek už při nízkých koncentracích s vysokou odezvou růstu. Retardanty růstu s účinkem pro gibereliny, neovlivnily reakci BRs, což dokázalo nezávislost obou fytohormonů v rostlinách (GREGORY et MANDAVA, 1982). K podobným závěrům došla i SASSE (1987) při pokusech 16

17 na segmentech hrachu setého (Pisum sativum L.) a RADI & MAEDA (1988) experimentující s kořenovými řízky rýže seté (Oryza sativa L.). Po ošetření hypokotylů okurky seté (Cucumis sativa L.) 24-epibrassinolidem se zvýšil endogenní obsah GA 3 (XU et al.,199). V práci BOUQUIN et al. (21) bylo na rostlinách Arabidopsis zjištěno, že BRs působí jako regulátor syntézy giberelinů pro Arabidopsis Cytokininy V pracích KISLIN et SEMICHEVA (1991) a KOZICK et KISLIN (1991) sledovali autoři vliv BRs na endogenní obsah cytokininů. Zjistili, že BRs ovlivnily skladbu cytokininů v listech ječmene setého (Hordeum vulgare L.). Rostliny byly ošetřeny roztokem 24-epibrassinolidu v dávce 1-5 mg.ha -1, výsledky byly vyhodnoceny po 6-12 dnech. Došlo ke zvýšení obsahu zeatin ribosidu (ZR) za současného snížení trans-zeatinu (Z). V ošetřených listech byl stanoven také dihydrozeatin ribosid (DHZR), dihydrozeatin (DHZ) a izopentenyladenin, tyto cytokininy však nebyly obsaženy v kontrolních rostlinách. UPRETI et MURTI (24) pozorovali vliv epibrassinolidu a homobrassinolidu na obsah zeatin ribosidu v rostlinách fazolu (Phaseolus vulgaris L., cv. Arka Suvidha). Pro pokusy byly použity dvě koncentrace BRs 1 a 5 µm aplikací postřikem. Koncentrace 1 µm měla jen nepatrný vliv na hladiny ZR v kořenových hlízkách v porovnání s kontrolou. Naproti tomu aplikace koncentrací 5 µm mírně zvyšovala obsah ZR oproti neošetřené kontrole především u epibrassinolidu. Také v rostlinách huseníčku rolního (Arabidopsis thaliana (L.) Heynh) pěstovaných ve tmě, byl po aplikaci 24-epibrassinolidu výrazně zvýšen obsah zeatin ribosidu. Oproti tomu obsah trans-zeatinu se zvýšil pouze nepatrně (KARNACHUK et al., 22) Kyselina abscisová Vliv aplikace exogenních BRs na endogenní hladiny kyseliny abscisové (ABA) je velmi různorodý (EUN et al., 1989; KRIPACH et al., 1999;.KOZICK et KISLIN, 1991). Obsah ABA byl zvýšen po ošetření brassinolidem v rostlinách bavlníku (Grossypium hirsutum L.) (LUO et al., 1988) a v hypokotylech okurky seté (Cucumis sativa L.) 17

18 po aplikaci 24-epibrassinolidu (XU et al.,199). KORABLEVA et al. (22) pozorovali zvýšení obsahu ABA v hlízách brambor (Solanum tuberosum L., cv. Nevskii) po aplikaci 24-epibrassinolidu (1-1 µg.l -1 ). Obsah ABA byl zvýšen v hluboké dormanci hlíz, i po jejím skončení až do klíčení. Zvýšení obsahu ABA oproti kontrole bylo také pozorováno u huseníčku rolního (Arabidopsis thaliana (L.) Heynh) pěstovaném ve tmě po aplikaci 24-epibrassinolidu o koncentraci 1-6 M (KARNACHUK et al.,22). Po ošetření hypokotylů okurky seté (Cucumis sativa L.) 24-epibrassinolidem se zvýšil endogenní obsah ABA (XU et al.,199). Bylo popsáno také snížení hladiny ABA po aplikaci BRs. V práci EUN et al. (1989) 24-epibrassinolid snížil obsah ABA v etiolovaných hypokotylech tykve velkoplodé (Cucurbita maxima Duch.). Také u ječmene setého (Hordeum vulgare L.) ošetření 24-epibrassinolidem na začátku kvetení snížilo množství ABA (ve srovnání s kontrolou). Rostliny byly analyzovány ve fázi mléčné zralosti (KOZICK et KISLIN, 1991; KURAPOV et al., 1992). Oproti tomu v pokusech skupiny UPRETI et MURTI (24) na fazolu (Phaseolus vulgaris L.) nebyl pozorován významný vliv aplikace BRs na změny obsahu ABA a to při použití 1 a 5 µm roztoků epibrassinolidu a homobrassinolidu. MAZETS (1997) zkoumal změny obsahu IAA, ABA a ZR v rostlinách pšenice seté (Triticum aestivum L. cv. Chinese Spring), po aplikaci brassinolidu, 24-epibrassinolidu a homobrassinolidu. Objevil, že jednotlivé BRs mají výrazně odlišné účinky na obsah všech tří sledovaných fytohormonů. HAUBRICK et al. (26) sledovali zavírání průduchů u bobu (Vicia faba L. cv. Longpod) po aplikaci brassinolidu a ABA. Všechny použité koncentrace brassinolidu (,1;,5; 1 a 5 µm) vyvolaly zavírání průduchů zatímco u neošetřené kontroly zůstaly průduchy otevřené. Všechny sledované koncentrace brassinolidu také inhibovaly otvírání průduchů oproti neošetřené kontrole. Účinek ABA byl stejný jako brassinolidu. 18

19 2.3.4 Vliv stresu a brassinosteroidů na změny obsahu ethylenu a kyseliny abscisové Stres způsobený suchem (nedostatkem vody) Brassinosteroidy jsou v literatuře často uváděny jako látky, které zvyšují toleranci k různým typům stresu, jako jsou vysoké a nízké teploty, stres zasolením a také stres suchem (SASSE et al., 1997). 24-epibrassinolid zvyšoval toleranci ke stresu suchem u Arabidopsis thaliana (L.) Heynh a řepky olejky (Brassica napus L.). Rostliny byly vysety na agar s 1 µm 24-epibrassinolidu (24 EPI), po několika dnech byly vysazeny do písku a ponechány bez vody. Reakce na stres byla sledována procentem přežití. Kontrolní rostliny (bez aplikace 24-epibrassinolidu) Arabidopsis thaliana po 72 hodinách bez vody vykazovaly přežití 28 % oproti semenáčkům ošetřených 24-EPI, kdy přežití dosáhlo 8 %. Po 8 dnech bez dodávky vody byl úhyn markantnější u obou variant (7 % přežitých u kontroly a 35 % s aplikací 24-EPI). Rostlin řepky přežilo po 36 hodinách bez ošetření 6 % oproti ošetřeným 24-EPI s přežitím 9 % (KAGALE et al., 27). K objevu kyseliny abscisové jako stresového hormonu došlo v roce 1969, když WRIGHT et HIRON zjistili až 4 násobné zvýšení obsahu ABA v listech pšenice (Triticum aestivum L.) po půl hodině vadnutí a také u listů fazolu (Phaseolus vulgaris L.), které byly sušeny horkým vzduchem. Obsah ABA je ve většině rostlinných pletiv obsažen v nízkých koncentracích v rozmezí 1 5 ng na 1g čerstvé hmotnosti. UPRETI et MURTI (24) pozorovali v kořenových hlízkách fazolu (Phaseolus vulgaris L. cv. Arka Suvidha) vliv stresu suchem při použití BRs na změny hladin ABA a trans-zeatin ribosidu. Pro pokus byly použity dvě koncentrace (1 a 5 µm) a dva BRs (epibrassinolid a homobrassinolid), rostliny byly stresovány 4 a 8 dní. Výsledkem pokusů bylo zjištění, že při aplikaci BRs před počátkem stresu suchem, dojde ke zvýšení obsahu ABA a to výrazně u rostlin stresovaných po dobu 8 dní. Stres suchem snižoval obsah ZR u neošetřených rostlin oproti nestresované kontrole. U rostlin ošetřených BRs a stresovaných, se obsah ZR také snížil, ovšem ne tak výrazně jako u rostlin neošetřených BRs. Velmi podobný trend akumulace ABA a snižování obsahu cytokininů při stresu suchem byl sledován také v listech fazolu (Phaseolus vulgaris L.) (UPRETI et al., 1998). 19

20 APELBAUM et YANG (1981) sledovali na pšenici seté (Triticum aestivum L. cv. Anza) vliv sucha na produkci ethylenu. Rostliny pšenice pěstované v optimálních podmínkách produkují pouze velmi malé množství ethylenu. Listy odstraněné z rostlin a uložené do vlhka produkovaly pouze,3-,6 nl.g -1.h -1 po 24 hodin od oddělení. Při zvýšení vodního deficitu (měřeném úbytkem váhy) se pomalu začala zvyšovat produkce ethylenu a maxima bylo dosaženo při deficitu 9 %, kdy byla produkce ethylenu 37 nl.g -1.h -1 během 4 hodin. CHEN et al. (22) srovnávali vliv stresu na dva kultivary pšenice seté (Triticum aestivum L.). Rozdíl těchto kultivarů byl v resistenci vůči suchu (cv s nízkou odolností a cv. 54 s poměrně vysokou odolností proti suchu). Cv. 54 produkoval u kontrolních rostlin vyšší množství ethylenu (o 8 %) oproti cv Zvýšení tvorby ethylenu u stresovaných rostlin bylo především u cv. 54 a to 24 hodin po počátku stresu (u cv.8139 nebylo zvýšení významné). U obou kultivarů došlo po 48 hodinách k významnému snížení produkce ethylenu na hranici blízkou nule Stres způsobený zaplavením substrátu Vliv brassinosteroidů na rostliny při vystavení stresu zaplavení substrátu nebyl patrně doposud příliš zkoumán neboť není dostupná literatura k této problematice. ZHANG et ZHANG (1994) objevili, že vlivem zamokření substrátu (při kterém je zaplavením substrátu způsoben nedostatek kyslíku pro kořeny) dojde k akumulaci ABA v listech a následně k uzavírání průduchů u hrachu setého (Pisum sativum L.). Navrhli teorii, že ke zvýšení obsahu ABA v mladých listech dojde vlivem syntézy a exportu ze starších listů, u kterých došlo vlivem stresu ke ztrátě turgoru s následným vadnutím. ELSE et al. (1996) se snažili ověřit jinou příčinu uzavírání průduchů. Došli k závěru, že při stresu zamokření substrátu dojde k inhibici transportu látek floémem, takže pouze ABA akumulovaná v listech může přispívat k uzavření průduchů. Její vliv je však omezený. Podle pokusů autora TARDIEU et al. (1996) na slunečnici (Helianthus annuus L.) bylo uzavírání průduchů zprostředkováno pouze ABA obsaženou v xylému. U rostlin tolice vojtěšky (Medicago sativa L.) došlo ke zvýšení obsahu ABA bezprostředně po vystavení rostlin stresovým podmínkám zamokření. Během sledovaných 1 dnů došlo ke zvýšení obsahu ABA v listech 3x oproti kontrolním rostlinám. V kořenech však ke změnám hladiny ABA nedošlo (CASTONGUAY et al., 1993). V práci AHMED et al. 2

21 (26) sledovali vliv zamokření substrátu na Vigna radiata L.cv. KPS 1 změnou obsahu ABA v listech. Zamokření probíhalo po dobu 8 dní. První den zamokření nedošlo ke změně obsahu ABA oproti kontrole. K nejvyššímu obsahu ABA (7x vyšší oproti kontrole) došlo druhý den po počátku stresu. Následné dny už se obsah ABA v listech pouze snižoval. U rostlin fazolu (Phaseolus vulgaris L.) (WADMAN-VAN SCHRAVENDIJK et VAN ANDEL, 1986) došlo ke zvyšování produkce ABA po 6 hodinách stresu. Při stresu zamokření substrátu dojde nedostatkem kyslíku v kořenech ke zvýšené tvorbě ACC následně přeměněném na ethylen (BRADFORD et YANG, 198). Vliv zamokření na zvýšenou produkci ethylenu bylo pozorováno již 24 hodin po počátku stresu ve stoncích a listech slunečnice (Helianthus annuus L.) (KAWASE, 1974), rajčete (Lycopersicon lycopersicum (L.) Karsten ex. Farw.) (JACKSON et CAMPBELL, 1976) a bobu obecném (Vicia faba L) (ELBELTAG et HALL, 1974). Další pokusy na fazolu obecném (Phaseolus vulgaris L.) ukázaly, že po počátku stresu zamokření substrátu docházelo ke zvýšení produkce ethylenu již za 2 hodiny, maxima bylo dosaženo po 5 hodinách (o 35 % oproti kontrole). (WADMAN-VAN SCHRAVENDIJK et VAN ANDEL, 1986). Také rostliny Lycopersicon lycopersicum (L.) Karsten ex. Farw. pěstované v anaerobním prostředí kořenů zvyšovaly syntézu prekursoru ethylenu, 1-aminocyklopropan-1-karboxylovou kyselinu (ACC), v kořenech. Odtud byl transportován do výhonů, kde následovala zvýšená produkce ethylenu (BRADFORD et YANG, 198). Při pokusech na Lepidium latifolium L. byl srovnáván vliv zamokření na produkci ethylenu z kořenů a listů. Kořeny produkovaly výrazně vyšší obsah ethylenu než listy. Bylo to především 7 den po počátku stresu (CHEN et al., 22). 2.4 POUŽITÍ BRASSINOSTEROIDŮ V POLNÍM POKUSNICTVÍ MITCHELL et GREGORY (1972) chtěli dokázat, že brassiny by měly zvyšovat výnos a vitalitu semen. V roce 1975 USDA (United States Department of Agriculture) zahájilo výzkum vlivu brassinů na rostliny jak ve skleníkových tak polních pokusech. Polní pokusy probíhaly na hlavních pěstitelských plodinách (pšenice, kukuřice, sója a brambory). Cílem výzkumu bylo i sledování vlivu aplikace v závislosti na fenologické fázi rostlin. Postřik BRs na mladé rostliny zvýšil u některých druhů výnos: salát setý (Lactuca sativa L.) %, ředkev setá (Raphanus sativus L.) 2 %, paprika roční (Capsicum 21

22 annum L.) 9 %, fazol obecný (Phaseolus vulgaris L.) 6 %. U rajčete jedlého (Lycopersicon lycopersicum (L.) Karsten ex. Farw.) a kukuřice seté (Zea mays L.) STEFFENS (1991) nepozoroval žádný efekt postřiku BRs. V jiných pokusech byl epibrassinolid aplikován na kvetoucí rostliny (Japonsko), což zvýšilo výnos např. u rýže seté (Oryza sativa L.) o 11 %, množství semen řepky olejky (Brassica napus L.) a sóji luštinaté (Glycine max (L.) Merr.) o 1-2 %. U pšenice seté (Triticum aestivum L.) se zvýšil obsah sušiny zhruba o 3 % a množství semen v klasu také o 3 %. V pokusech bylo pozorováno, že ke zvýšení produkce dochází při vyšších stresových podmínkách a BRs by mohly být nazývány stresovými hormony (IKEKAWA et ZHAO, 1991). V roce 1985 začalo ve výzkumu BRs spolupracovat Japonsko s Čínou. Mezi vědeckými pracovišti byly značné rozdíly. Číňané měli pozitivnější výsledky oproti Japoncům. Důvodem bylo patrně rozdílné zemědělství, půdní podmínky, používané kultivary, klima apod. Bylo pozorováno, že aplikace brassinolidu během kvetení zvýšila výnos pšenice seté (Triticum aestivum L.) o 1-2 %, a také zvyšovala resistenci vůči chorobám. U tabáku virginského (Nicotiana tabacum L.) zvyšovaly BRs hmotnost kořenů o 15-9 %, listovou plochu o 1-2 % a obsah nikotinu o 4-7 %. Mezi dalšími sledovanými rostlinami byl meloun vodní (Citrullus lanatus (Thunb.) Mat. et Nakai.) a okurka setá (Cucumis sativa L.), se zvýšením výnosu po aplikaci brassinolidu o 1-2 %, u hroznů révy vinné (Vitis vinifera L.) o 66 a 3 % (dle koncentrace použité látky) (IKEKAWA et ZHAO, 1991). Polní pokusy probíhaly také v Rusku, Bělorusku, Německu, Moldávii, Uzbekistánu a na Ukrajině. Mezi pokusnými rostlinami byla rýže setá (Oryza sativa L.), pšenice setá (Triticum aestivum L.), žito seté (Secale cereale L.), kukuřice setá (Zea mays L.), pohanka setá (Fagopyrum esculentum Moench.), oves setý (Avena sativa L.), sója luštinatá (Glycine max (L.) Merr.) a hrách setý (Pisum sativum L.). U všech těchto druhů se zvýšil výnos o 6-63 % (nejčastěji o 17-2 %) v závislosti na roku, lokalitě a metodě aplikace. Lepších výsledků bylo dosaženo v suchých oblastech než v optimálních podmínkách s úrodnou půdou (KHRIPACH et al., 1999). Některé přípravky již byly registrovány pro polní pokusnictví. V Číně byl jako fytohormon používaný ve výrobě schválen 28-homobrassinolid, který je uznán pro rostliny tabáku virginského (Nicotiana tabacum L.), cukrové třtiny (Sacharum officinarum L.), semena řepky olejky (Brassica napus L.) a čajovníku čínského (Camellia sinensis (L.) 22

23 O. Kunz.). V Rusku a Bělorusku byl jako růstový regulátor pro lilek brambor (Solanum tuberosum L.), rajče jedlé (Lycopersicon lycopersicum (L.) Karsten ex. Farw.), okurku setou (Cucumis sativa L.), papriku roční (Capsicum annum L.) a ječmen setý (Hordeum vulgare L.) povolen 24-epibrassinolid (KHRIPACH et al., 1997). 2.5 TESTY PRO DETEKCI BRASSINOSTEROIDŮ Fazolový test (bean second-internode bioassay) MITCHELL et al. (197) zavedli pro BRs pokusy na druhém internodiu fazolového stonku (Phaseolus vulgaris L.). Pokud je druhé internodium odděleno, dochází po aplikaci nižší dávky BRs (,1 µg) k jejich prodlužování, zakřivování a bobtnání, při vyšší dávce BRs (,1 µg) k rozštěpení internodií (YOKOTA, 1999) Rýžový test (rice-lamina inclination test) Test byl zaveden v roce 1965 prof. Maedavou z University Nagoya původně pro auxiny. Pro brassinosteroidy se však projevil jako vysoce citlivý. Brassinosteroidy vykazovaly aktivitu již při koncentraci,5 µg.ml -1, naproti tomu u kyseliny indolil-3-octové (IAA) se slabá odezva projevila až u koncentrace 5 µg.ml -1 (RAO et al., 22). Při testu je sledován úhel odklonu mezi listovou čepelí a pochvou. Metodika rýžového testu je popsána v publikaci ABE et MARUMO (1991). 2.6 TOXICITA BRASSINOSTEROIDŮ Akutní toxicita LD 5 nastává při dávce vyšší než 1 g.kg -1 při orálním podání myším a 2 g.kg -1 potkanům (jak orální tak kožní aplikaci). Amesův test mutagenicity byl negativní a,1 % roztok a nezpůsobil podráždění očí u králíků (IKEKAWA et ZHAO, 1991). 23

24 3 CÍL PRÁCE Cílem práce bylo testování nových syntetických brassinosteroidů, především: sledování morfologických účinků, změny obsahu endogenních hladin fytohormonů po exogenní aplikaci brassnosteroidů, účinek při stresu suchem a zamokřením substrátu, vliv na výnosové faktory v polním pokusnictví. 24

25 4 MATERIÁL A METODIKA 4.1 POUŽITÉ BRASSINOSTEROIDY V pokusech bylo pracováno s brassinosteroidy syntetizovanými skupinou RNDr. Ladislava Kohouta, CSc. z Ústavu organické chemie a biochemie, Akademie věd České republiky. V prvním roce pokusů bylo experimentováno se třemi novými syntetickými brassinosteroidy (analogy brassinolidu), v následujícím roce přibyl ještě čtvrtý. Brassinosteroidy byly označeny číselně BR 1, BR 2, BR 3 a BR 4. Do současné doby byl patentován pouze BR 1 (2α,3α,17β-trihydroxy-5α-androstan-6-on). Jako kontrolní látka byl použit 24-epibrassinolid (24-EPI). 4.2 ROSTLINNÝ MATERIÁL HRÁCH SETÝ (Pisum sativum L.) Vladan Raná až velmi raná odrůda. Výška cm, tenká, pevná, podklesávající lodyha, menší list i palist. Lusk 7 cm, tupě ukončený. Zrno v technické zralosti barvy tmavě zelené. HTS 21 g. LEN SETÝ (Linum usitatissimum L.) Atalante Středně raná modrokvětá, technická odrůda lnu olejného. Vysoká odolnost proti poléhavosti a fuzarióze. Dosahuje vysokého výnosu semene barvy hnědé, HTS 6,61 g. Registrace ŘEPKA OLEJNÁ (Brassica napus L. var. napus ) Orkan Polopozdní ozimá odrůda středního vzrůstu. K přednostem této odrůdy patří velmi dobrá olejnatost, s dobrou odolností proti poléhání i vyzimování, vysoká odolnost k houbovým chorobám. Poskytuje vysoké a vyrovnané výnosy ve všech oblastech pěstování. Minimální obsah kyseliny erukové a glukosinulátů. Registrace , Udržovatel OleoBras s.r.o. 25

26 PŠENICE SETÁ (Triticum aestivum L.) V pokusech byly srovnávány dvě odrůdy - Nela a Sulamit. Nela (HE 2394 x Selekta) Středně raná odrůda, rostliny nízké, velmi dobře odnožující (výnos je tvořen především hustotou porostu). Potravinářská pšenice, pekařská jakost A. Vysoký a stabilní výnos, zrno středně veliké, HTZ 45g. Přednosti výrazné nemá Pěstitelská rizika náchylnost k napadání listovými skvrnitostmi, rzi pšeničnou a travní. Registrace 1998, udržovatel PLANT SELECT, spol. s r.o. Sulamit (Hana x Zdar x Alidos) Středně raná odrůda, rostliny středně vysoké, středně až méně odnožující (výnos je tvořen především počtem zrn v klasu a HTZ). Potravinářská pšenice, pekařská jakost E, HTZ 43g. Přednosti odolnosti proti porůstání zrna, odolnosti proti poléhání, odolnost proti napadení rzí plevovou. Pěstitelská rizika náchylnost k napadení rzí pšeničnou, menší odolnost proti napadení rzí travní a listovými skvrnitostmi. Registrace 2, udržovatel SELGEN, a.s. 4.3 LABORATORNÍ POKUSY ROSTLINNÝ MATERIÁL Pro laboratorní pokusy byly použity rostliny: Hrách setý (Pisum sativum L.) odrůda Vladan Len setý (Linum usitatissimum L.) odrůda Atalante Řepka olejná (Brassica napus L. var. napus) odrůda Orkan Pšenice setá (Triticum aestivum L.) odrůda Sulamit 26

27 4.3.1 Morfologické pokusy Máčení semen v roztocích brassinosteroidů Pro pokus byla použita semena hrachu a lnu, která byla máčena v roztoku destilované vody s brassinosteroidem. Zkoušeny byly tři BRs (BR 1, BR 2 a BR 3) každý ve čtyřech koncentracích: 1,9.1-7 M; 9,5.1-8 M; 4, M a 2, M. Jako kontrola byl použit roztok 24-epibrassinolidu (24 EPI) o stejných koncentracích jako zkoumané BRs a destilovaná voda. Semena byla do roztoků ponořena na 24 hodin, následně byla nabobtnalá vyseta do pěstebního substrátu (hrách - perlit, len rašelina s pískem). Nádoby byly uzavřeny hliníkovou folií a umístěny do termostatu (BT 12) se stálými kultivačními podmínkami ve tmě při teplotě 24 C. Po 14 dnech byl pokus vyhodnocen sledováním délky růstu kořenů a epikotylů Regenerace adventivních pupenů na hypokotylním pahýlu lnu ovlivněném brassinosteroidy U rostlin lnu byl odstraněn epikotyl i kotylární pupeny. Na hypokotylní pahýl, v podmínkách in vitro, byl aplikován agarový bloček s BR o koncentraci 1,9.1-7 M. Jako kontroly zde byly rostliny s neošetřeným pahýlem a rostliny s aplikací agarového bločku s obsahem 24-EPI o koncentraci 1,9.1-7 M. U rostlin byly sledovány délky jednotlivých adventivních pupenů a jejich množství na jedné rostlině. Pokus byl vyhodnocen po 14 dnech Ovlivnění růstu kotylárních pupenů po aplikaci brassinosteroidu na děložní list Rostliny lnu byly pěstovány ve skleníku ve výsevním substrátu (Klasmann seedling substrat) při teplotě 22+4 C. Sedmidenním rostlinám byl odstraněn epikotyl a na jeden děložní list byl nanesen agarový bloček s BR o koncentraci 1,9.1-7 M. Kontrolou byly dekapitované rostliny s neošetřenými dělohami. U rostlin byl sledován vliv 27

28 BR na růst úžlabního pupene jak u ošetřené tak i u neošetřené dělohy. Pokus byl vyhodnocen po 14 dnech Vliv brassinostroidů na změny hladin fytohormonů Pěstební podmínky Skleník První pokusy pro sledování fytohormonů probíhaly ve skleníku. Pro experiment byly použity rostliny řepky, semena byla vyseta do substrát (substrát Klasmann : ornice : písek 1 : 1 : 1) a pěstována při teplotě 22+4 C a 12-ti hodinové světelné periodě. V pěstebních podmínkách skleníku docházelo k velkým teplotním a vlhkostním výkyvům. Klimabox Následné pokusy s řepkou probíhaly v řízených podmínkách klimaboxu při teplotách 2/18 C (den/noc), světelné periodě 11/13 (den/noc), 6-7 % relativní vzdušné vlhkosti. Další pokusnou rostlinou pěstovanou v klimaboxu byla pšenice kultivovaná při teplotách 18/16 C (den/noc), světelné periodě 11/13 hodin, 6-7 % relativní vzdušné vlhkosti Stresové faktory Pokusné rostliny řepky ozimé pěstované ve skleníku byly vystaveny dvěma variantám stresu sucho (nedostatek vody) a zaplavení substrátu. Stres suchem byl vyvolán nedostatečnou zálivkou. Rostliny byly udržovány v trvale zavadlém stavu. Při stresu zamokření substrátu byly květníky s rostlinami ponořeny do vody až do výšky 1 cm pod jejich okraj. Experimentováno byl se dvěma termíny ošetření BRs. První varianta aplikace látek byla 7 dní před počátkem stresu, druhá varianta aplikace proběhla 5 dní po počátku stresu. Testovány byly čtyři syntetické brassinosteroidy o koncentraci 1,9.1-7 M. BRs byly aplikovány postřikem na list v dávce,5 ml na rostlinu ve fázi 4 listů (foto 5.). Kontrolní varianty byly zvoleny 4 stresované rostliny bez aplikace BRs, stresované rostliny 28

29 ošetřené 24-epibrassinolidem, rostliny s postřikem BRs bez stresu, nestresovaná a neošetřená kontrola. Opakování experimentu probíhalo v řízených podmínkách klimaboxu. Pro umožnění vyššího počtu opakování pokusu byl vybrán pouze jeden brassinosteroid (BR 4). Látky byly aplikovány ve fázi 4. listů ve formě postřiku na list pouze v termínu 5 dní po počátku stresu. Kontrolou zde byl 24-epibrassinolid (24-EPI), rostliny neošetřené vystavené působení stresu bez jakékoliv aplikace BRs (KS) a nestresovaná kontrola (K). Pokusy byly založeny také s pšenicí ozimou. Experimenty probíhaly pouze v podmínkách klimaboxu, se stejnými použitými brassinosteroidy i kontrolami a aplikacemi jako u rostlin řepky pěstovaných v klimaboxu. Látky byly aplikovány ve fázi 4-5 listu (foto 6.). Reakce rostlin byla sledována změnou produkce ethylenu, obsahu kyseliny abscisové a množství sušiny Kvantitativní stanovení fytohormonů Stanovení auxinů Pro stanovení indolyl-3-octové kyseliny byly odebrány vzorky listů ze sledovaných rostlin o navážce cca 2 g, přelity tekutým dusíkem a uskladněny při -3 C do doby lyofilizace (CHRIST LOC 1m). Volná IAA byla stanovena z methanolového extraktu. Po jeho extrakci diethyletherem a odpaření do sucha byl získaný materiál dále čištěn pomocí HPLC na polyvinylpyrrolidonových kolonách za použití fluorimetrické detekce. Jako interní standard byla použita 3 H-IAA (EDER et al., 1988). Hladina auxinu byla stanovena na hmotnost sušiny v ng.g -1. Vzorky byly odebírány v termínech 27 hodin, 7 a 14 dní po aplikaci brassinosteroidů. Obsah IAA v listech byl stanoven na ÚEB AV ČR v Praze. Stanovení kyseliny abscisove metodou RIA (radio imuno assay) Navážka cca,5 g čerstvé hmotnosti z průměrného vzorku listů byla přelita tekutým dusíkem, uzavřena v plastovém pouzdru a uskladněna při -3 C do doby lyofilizace. Následně byl vzorek homogenizován ve vychlazené třecí misce pomocí 29

30 tekutého dusíku a mořského písku (čerstvá hmotnost : destilovaná voda - 1 : 1). Pro analytické stanovení byla ABA extrahována vytřepáním homogenátu do vodné frakce po dobu 12 hodin při 4 C. Centrifugací se oddělila volná ABA (zůstala v supernatanu). Do vlastní RIA se ze vzorku odebírá 5 µl. Vlastní RIA analýza proběhla podle metodiky QUARRIE et al. (1988) s použitím monoklonální protilátky MAC 252 (Monoclonal Antibidy Centre, Cambridge, UK) a radioaktivně značené 3 H-ABA o specifické aktivitě 1,9 TBq.mmol -1 (Amersham Pharmacia Biotech). 3 H-aktivita byla měřena technikou kapalné scintilace na scintilačním spektrofotometru PACKARD 2 CA, výsledky byl přepočteny na obsah ABA v analytu v pg pomocí programu Securia PACKARD. Kalibrační křivka byla sestrojena za použití standardní ABA (+/- cis, trans-aba, Sigma). Vzorky na stanovení ABA v rostlinách byly odebírány 5 hodin, 24 hodin, 7. a 15. den po aplikaci BRs. Množství ABA bylo vyjádřeno v ng.g -1 sušiny. Metody stanovení cytokininů Endogenní hladiny cytokininů byly stanoveny po jejich extrakci, purifikaci a HPLC separací metodou ELISA. Extrakce: Lyofilizovaný rostlinný materiál byl homogenizován v tekutém dusíku, převeden do 8 ml modifikované Bieleskiho fixáže (metanol : chloroform : voda = 13 : 5 : 2) a extrahován přes noc při 2 C. Následující den byl homogenát na třepačce po dobu 1 hod a při teplotě 4 C, po té byl doplněn o poloviční objem vodou s nízkou vodivostí (milli Q voda) (BIELESLKI, 1964) a centrifugován 2 minut při 4 C a 35 G. Tím se dosáhne oddělení supernatanu obsahujího cytokininy (vodný methanol) od chloroformu (obsahuje lipidy, lipofilní barviva aj.). Sediment byl rehomogenizován v 1 ml 1% methanolu, vytřepán 1 hod při 3 rpm a 4 C, centrifugován 2 minut při 4 C a 35 G a přidán k supernatantu. Purifikace: Po odpaření vodného methanolu následovalo štěpení ribotidů cytokininů kyselou fosfatázou v,4 M acetátamonném pufru o ph 6,5 (na ribosidy stanovitelné ELISA testem), iontoměničová chromatografie a chromatografie na reverzní fázi (MACHÁČKOVÁ et al., 1993). Iontoměničová chromatografie na fosfocelulóze ph 3, purifikovala 3

31 cytokininový extrakt od látek s negativním nábojem. Cytokininy a jejich ribosidy s parciálním nábojem kladným byly zachyceny na P-celulóze a po té eluovány,2 M amoniakem. Po úpravě ph na 6,5 pokračovala purifikace chromatografií na reverzní fázi na diethylaminoethylcelulóze spojené s C18 kolonou (Sep-Pak), na které byly cytokininy zachyceny a eluovány methanolem. Eluát byl před nástřikem na HPLC filtrován. HPLC separace: Na HPLC (od firmy Ecom, UV 26 nm) probíhala separace cytokininových bazí (trans-zeatin, izopentenyladenin, 6-benzyladenin, meta-topolin) a jejich ribosidů na koloně Nucloeosil 5 - C18 sorbentem s 25 x 4,6 µm, 5 µm s průtokem mobilní fáze 1 ml.min -1 (složení mobilní fáze A: acetonitril, B:,15 % TFA, gradient mobilní fáze: 1 min 15 % A; 1 2 min 22 % A, 2 25 min 22% A). Cytokininy byly jímány dle příslušných retenčních časů. Frakce byly opařeny do sucha. Metoda ELISA: Na stanovení cytokininů byly použity polyklonální protilátky vůči jednotlivým frakcím cytokininů (STRNAD et al. 199; STRNAD 1996). Do jamek mikrotitrační destičky byla pipetována protilátka (15 µl) v roztoku uhličitanového pufru (5 µl MAb v 15 ml uhličitanového pufru na 1 desku) a nechána inkubovat přes noc při 4 C. Následující den byly desky 3x promyty redestilovanou vodou (4 C) a potaženy roztokem BSA (2 µl) v TBS pufru a inkubovány 1 hod při 25 C a po té promyty 2x redestilovanou vodou (25 C). Po promytí byl do jamek pipetován TBS pufr (5 µl), standardy a vzorky v TBS (5 µl) a do všech jamek kromě kontroly (5 µl) tracer (konjugát alkalické fosfatázy a stanovovaného cytokininu v BSA). Do jamek blanku byl pipetován BSA (1 µl) a TBS (5 µl), do jamek pro maximální vazbu TBS (1 µl). Deska byla inkubována 1 hod při laboratorní teplotě a následně 4x promyta TBS pufrem. Na závěr byl pipetován substrát PNPP (para-nitrofenylfosfát rozpuštěný v uhličitanovém pufru: 1 mg.ml -1 ). Po hodinové inkubaci byla barevná reakce zastavena 5 M NaOH (5 µl). Desky byly změřeny spektrofotometricky při vlnové délce 45 nm. Obsah cytokininů je nepřímo úměrný absorbanci naměřené v roztocích jednotlivých jamek mikrotitrační desky v porovnání s řadou standardů, minimální a maximální vazbou protilátky, příslušné absorbance vzorků byly odečteny z kalibrační křivky. Obsah cytokininů byl v rostlinách sledován 5. a 15. den po aplikaci BRs a vyjádřen v ng.g -1 čerstvé hmotnosti. 31

32 Stanovení produkce ethylenu Pro sledování produkce ethylenu byly rostliny v květináčích umístěny do 5-ti litrových lahví v 5 ti opakováních a uzavřeny na 3 hodiny pryžovým uzávěrem (foto 7. a 8.). Následně byl z každé lahve odebrán 1 ml ovzduší tuberkulinovou stříkačkou. Pro stanovení ethylenu byly vzorky analyzovány na plynovém chromatografu firmy Fissons Instruments, Itálie, GC-FID 8 (vybavený 5 m kapilární kolonou HP PLOT Al 2 O 3 S deaktivovanou; tloušťka vrstvy 15 µm; ID,53 mm). Teplota na nástřiku kolony byla 23 C, teplota kolony 4 C a teplota detektoru 2 C pro stanovení plynných uhlovodíků. Metodika práce dle FIŠEROVÁ et HRADILÍK (1994) a FIŠEROVÁ et al. (21). Množství produkovaného ethylenu bylo sledováno po dobu 15 dní a vyjádřeno v nl ethylenu.l -1.g -1 sušiny. 4.4 POLNÍ POKUSY ROSTLINNÝ MATERIÁL Polní pokusy byly prováděny na: Řepce olejné (Brassica napus L.var. napus) odrůda Orkan Pšenici seté (Triticum aestivum L.) odrůdy Sulamit a Nela STANOVIŠTĚ Pokusy probíhaly na polních stanovištích Výzkumného ústavu pícninářství v Troubsku a Zemědělského družstva Střelice. ZPŮSOB APLIKACE BRASSINOSTEROIDŮ Na maloparcelkové pokusy o velikosti 15m 2 byly aplikovány jednotlivé roztoky brassinosteroidů o koncentraci 1,9.1-7 M. Pro jednu sledovanou variantu byla použity dvě maloparcelky. 32

33 V prvním roce experimentů na řepce byly zkoušeny 3 syntetické brassinosteroidy (BR 1, BR 2 a BR 3), jako kontrola byl použit 24-epibrassinolid (24-EPI) a kontrolní rostliny bez ošetření (K). Při opakování pokusů v druhém roce, byly experimenty rozšířeny o čtvrtou látku (BR 4). Množství aplikované látky bylo do úplného smočení listů. Pozorování probíhala ve dvou po sobě následujících vegetačních obdobích. Řepka ozimá (Brassica napus L.var. napus) Aplikace BRs na rostliny proběhla dvakrát během vegetace. První postřik byl aplikován na rostliny řepky ve fázi 5.internodium viditelné (foto 19.), druhý ve fázi, kdy je 3% květů na stonku otevřeno (foto 2.), kontrolou byly neošetřené rostliny (K). U řepky byl sledován vliv BRs na výšku nadzemní části, počet šešulí na rostlině, hmotnost sušiny šešulí na rostlinu, rozvětvení rostlin (sledování probíhala 21 dní po druhém postřiku) a výnos. Po prvním roce pokusů byla semena řepky odeslána na rozbory do Výzkumného ústavu olejnin Opava, OSEVA PRO s.r.o.. Analyzováno bylo 5 vzorků (BR 1, BR 2, BR 3, 24-EPI a kontrola). Ve vzorcích bylo stanovováno - klíčivost (mechanicky), sušina, množství sinapinu (spektrofotometricky), glukosinolátů (metodou HPLC), stanovení tuků (extrakčně) a mastných kyselin (GLC). Pšenice ozimá (Triticum aestivum L.) Při experimentech s aplikací BRs byl první postřik proveden na rostliny pšenice ve fázi začátek sloupkování (foto 24. a 25.), druhý ve fázi praporcový list (foto 26., 27. a 28.). Jako kontrola byly neošetřené rostlin (K). V následném roce bylo kromě opakování pokusu ve stejných termínech aplikace BRs zkoušeny také dva nové jednotlivé postřiky. První varianta aplikace ve fázi začátek sloupkování a druhá varianta ve fázi metání (foto 29. a 3.). Na rostlinách byl sledován vliv BRs na počet klasů, poměr hlavních a vedlejších klasů, počet zrn v hlavním klasu, hmotnost tisíce zrn a výnos. (Počet klasů a poměr hlavních a vedlejších klasů byl stanovován na řádek pokusné parcelky o šířce 1,5, kdy z jednotlivého políčka byly náhodně vytipovány 3 řádky x 2 parcelky). 33

34 4.5 ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDKŮ Pokusy byly prováděny v různém počtu opakování dle náročnosti a možnosti počtu analýz od jednoho vzorku (analýza IAA) až po 3 opakování (HTZ u pšenice). Jednotlivé hodnoty byly zprůměrovány a byla vypočtena střední chyba. Výsledky jsou zpracovány převážně graficky. 34

35 5 VÝSLEDKY A DISKUSE 5.1 LABORATORNÍ POKUSY Morfologické pokusy Máčení semen v roztocích brassinosteroidů Semena byla namočena v roztocích brassinosteroidů (4 druhy) 24 hodin. Základní roztok s obsahem BRs 1,9.1-7 M byl dále rozředěn destilovanou vodou na poloviční, čtvrtinovou a osminovou koncentraci. Po 14-ti dnech byl pokus vyhodnocen změřením délky kořenů a epikotylů. Výsledky Pisum sativum L. odrůda Vladan Vyšší koncentrace brassinosteroidů (1,9.1-7 M) inhibovala dlouživý růst převážně epikotylů, významně především u rostlin ošetřených 24-EPI (graf 1.) Společně se snižující se koncentrací použitých brassinosteroidů se snižovala i inhibice růstu epikotylů (graf ). Pouze nepatrně vyšší stimulační efekt na růst epikotylů byl dosažen po aplikaci nejnižší koncentrace 24-EPI (2,4.1-8 M, graf 4.). Růst kořenů byl inhibován pouze nejvyšší použitou koncentrací BRs (1,9.1-7 M) kromě statisticky nevýznamné stimulace látkou BR 3 (graf 1.). Snižování koncentrace BRs vedlo k změně inhibice ve stimulaci růstu kořenů, která byla při použití nejnižší koncentrace statisticky významná (2,4.1-8 M, graf 4.). Ve všech sledovaných pokusech byl účinek 24-EPI jak na inhibici tak na stimulaci růstu vyšší, než u nových syntetických brassinosteroidů. Linum usitatissimum L. odrůda Atalante Reakce rostlin lnu na máčení semen v roztocích brassinosteroidů byla naprosto odlišná od rostlin hrachu. Roztok BR 2 stimuloval růst epikotylů ve všech sledovaných koncentracích (graf 5.-8.). Významný stimulační vliv na délku kořene měl pouze roztok 35

36 BR 1 v nižších koncentracích (4,8.1-8 M a 2,4.1-8 M, graf 7. a 8.). Ostatní použité BRs i 24-EPI inhibovaly růst jak kořenů tak epikotylů ve všech použitých koncentracích. Diskuse Vyšší koncentrace brassinosteroidů inhibovaly klíčení především u hrachu. Se snižující se koncentrací použitých BRs se zvyšoval růst kořenů i epikotylů. O BRs je známo, že působí synergisticky s auxinem a stimulují prodlužování buněk (SASSE, 199). BR a IAA mají podobný efekt na stimulaci prodlužovacího růstu. Vliv BRs na prodlužování adventivních kořenů nebyl zaznamenán, ale odnožování bylo stimulováno zvyšující se koncentrací BR. (RODDICK et GUAN, 1991). Také HAYAT et al. (2) sledovali vliv různých koncentrací brassinosteroidu (28-homobrassinolidu) na nárůst čerstvé hmotnosti rostlin hořčice (Brassica juncea L.). Ve svých pokusech na hořčici pozoroval zvýšení objemu čerstvé hmotnosti po aplikaci vyšší koncentrace brassinosteroidu a to u koncentrace 1-6 M než u rostlin ošetřených nižší koncentrací BR 1-1 M. (mm) 1 8 kořen epikotyl (mm) 1 8 kořen epikotyl BR 1 BR 2 BR 3 24-EPI K varianta BR 1 BR 2 BR 3 24-EPI K varianta Graf 1. Vliv BRs o koncentraci 1,9.1-7 M na délku Graf 2. Vliv BRs o koncentraci 9,5.1-8 M na délku kořenů a epikotylů klíčních rostlin Pisum sativum L. kořenů a epikotylů klíčních rostlin Pisum sativum L. 36

37 (mm) 1 8 kořen epikotyl (mm) 1 8 kořen epikotyl BR 1 BR 2 BR 3 24-EPI K varianta BR 1 BR 2 BR 3 24-EPI K varianta Graf 3. Vliv BRs o koncentraci 4,8.1-8 M na délku Graf 4. Vliv BRs o koncentraci 2,4.1-8 M na délku kořenů a epikotylů klíčních rostlin Pisum sativum L. kořenů a epikotylů klíčních rostlin Pisum sativum L. (mm) 12 1 kořen epikotyl (mm) 12 1 kořen epikotyl BR 1 BR 2 BR 3 24-EPI K varianta BR 1 BR 2 BR 3 24-EPI K varianta Graf 5. Vliv BRs o koncentraci 1,9.1-7 M na délku Graf 6. Vliv BRs o koncentraci 9,5.1-8 M na délku kořenů a epikotylů klíčních rostlin Linum usitatissimu L. kořenů a epikotylů klíčních rostlin Linum usitatissimu L. 37

38 (mm) 12 1 kořen epikotyl (mm) 12 1 kořen epikotyl BR 1 BR 2 BR 3 24-EPI K varianta BR 1 BR 2 BR 3 24-EPI K varianta Graf 7. Vliv BRs o koncentraci 4,8.1-8 M na délku Graf 8. Vliv BRs o koncentraci 2,4.1-8 M na délku kořenů a epikotylů klíčních rostlin Linum usitatissimu L. kořenů a epikotylů klíčních rostlin Linum usitatissimu L Regenerace adventivních pupenů na hypokotylním pahýlu lnu ovlivněném brassinosteroidy Na hypokotylní pahýly lnu byly aplikovány agarové bločky s obsahem BRs o koncentraci 1,9.1-7 M. Po 14 dnech byl pokus vyhodnocen měřením délky jednotlivých adventivních pupenů a jejich počtem. Výsledky Hypokotylní pahýly ošetřené BRs vykazovaly vyšší počet adventivních pupenů oproti kontrole a to především u 24-EPI (graf 9.). Všechny použité roztoky BRs působily inhibičně na růst adventivních pupenů. Diskuse BRs se svým působením mohou podobat auxinům, v tomto případě by byl růst adventivních pupenů na stonku rostlin lnu (Linum usitatissimum L.) inhibován nebo mohou působit jako gibereliny či cytokininy a růst pupenů stimulovat (ŠEBÁNEK et al., 1983). Brassinosteroidy statisticky průkazně ve srovnání s neošetřenou kontrolou pozitivně ovlivnily tvorbu adventivních pupenů pod místem ošetření hypokotylních pahýlů lnu. 38

39 Ke zvýšenému počtu adventivních pupenů došlo především u rostlin s aplikací 24-EPI. Z pokusu tedy vyplývá, že použité BRs o koncentraci 1,9.1-7 M nemají auxinový charakter. Ovlivnění růstu adventivních pupenů brassinosteroidy není zcela jednoznačné. U hypokotylních pahýlů fazole (Phaseolus aureus Roxb.) byl inhibován růst adventivních pupenů při ošetření BRs, zatímco na hypokotylech sóji (Glycine max (L.) Merr.) byl růst po aplikaci BRs stimulován (KHRIPACH et al., 1999). počet pupenů (ks) BR 1 BR 2 24-EPI K varianta Graf 9. Vliv BRs na regeneraci adventivních pupenů na hypokotylních pahýlech Linum usitatissimum L. Foto 1. a 2. Po aplikaci 24-EPI na hypokotylní pahýly Linum usitatissimum L. se zvýšila regenerace adventivních pupenů. 39

40 Ovlivnění růstu kotylárních pupenů u rostlin lnu po aplikaci brassinosteroidu na děložní list Na rostliny lnu byl po odstranění epikotylu aplikován agarový bloček s obsahem BRs 1,9.1-7 M na jeden děložní list. Po 14-ti dnech byl pokus vyhodnocen sledováním růstu kotylárních pupenů. Výsledky Brassinosteroidy BR 1, BR 3 a 24-EPI měly inhibiční vliv na růst pupenu u ošetřené dělohy. Pouze u aplikace látky BR 2 byl tento vliv výrazně stimulační (graf 1., foto 3.). Diskuse Stimulace růstu kotyláru u dělohy s aplikací BR 2 vypovídá o auxinovém charakteru použitého brassinosteroidu. Naopak inhibice růstu kotyláru u dělohy ošetřené jak BR 1 tak 24-EPI ukazuje na antiauxinový účinek těchto dvou brassinosteroidních látek. Pokusy ŠEBÁNEK et al. (1983) ukazují, že u rostlin lnu po dekapitaci epikotylu a aplikaci IAA na děložní list, dojde k stimulaci růstu kotyláru u dělohy ošetřené. Naopak aplikace TIBA inhibuje růst u ošetřené dělohy a stimuluje růst u dělohy neošetřené. délka úžlabních pupenů (mm) kotylár u ošetřené dělohy BR kotylár u neošetřené dělohy BR 1 BR 2 BR 3 24-EPI K varianta Graf 1. Vliv BRs na růst kotylárních pupenů u rostlin Linum usitatissimum L. 4

41 Foto 3. Stimulace kotyláru ošetřené dělohy látkou BR 2. Foto 4. Inhibice kotyláru u dělohy s aplikací BR Vliv exogenní aplikace brassinosteroidů na endogenní hladiny ostatních fytohormonů Rostliny ve fázi 4. listu byly ošetřeny postřikem brassinosteroidu na list. Následně byly v časovém sledu odebírány vzorky pro analýzy jednotlivých fytohormonů Vliv brassinosteroidů na obsah IAA v listech Výsledky Brassica napus L. odrůda Orkan Aplikace brassinosteroidů postřikem na list nevyvolaly u rostlin řepky významné rozdíly v obsahu indolyl-3-octové kyseliny (IAA) oproti kontrole (graf 11.). Triticum aestivum L. odrůda Sulamit U rostlin pšenice se obsah IAA v listech 7 dní po aplikaci 24-EPI mírně navýšil (graf 12.). Při následných odběrech po dalších 7 dnech došlo ovšem k prudkému snížení obsahu IAA. Pro omezené možnosti provedení analýz na ÚEB AV ČR v Praze bylo stanovení provedeno pouze jedenkrát. 41

42 Diskuse V pokusech s rostlinami řepky (Brassica napus L.) nebyl pozorován významný vliv exogenní aplikace BRs na změnu obsahu IAA v listech. Také COHEN et MEUDT (1983) nepozorovali žádný vliv aplikace 24-epibrassinolidu na obsah IAA v internodiích fazolu (Phaseolus vulgaris L.). Oproti tomu při aplikaci 24-EPI na rostliny ječmene setého (Hordeum vulgare L.) došlo ke zvýšení obsahu IAA (KURAPOV et al., 1996) a stejně tak i u huseníčku rolního (Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.) po dávce 1-6 M 24-EPI (KARNACHUK et al., 21). Stejná reakce byla pozorována také u mnou sledovaných rostlin pšenice (Triticum aestivum L.) po ošetření 24-EPI. ng IAA/g sušiny BR 4 24-EPI K 27 hod 7.den 14.den doba od aplikace Graf 11. Vliv BRs na obsah IAA v listech Brassica napus L. ng IAA/g sušiny BR 4 24-EPI K 27 hod 7.den 14.den doba od aplikace Graf 12. Vliv BRs na obsah IAA v listech Triticum aestivum L. 42

43 Vliv brassinosteroidů na produkci ethylenu Výsledky Brassica napus L. odrůda Orkan Množství uvolněného ethylenu bylo u rostlin pěstovaných ve skleníku bylo vyšší oproti rostlinám pěstovaným v klimaboxu (graf 13., 14.). U kontrolních rostlin (bez aplikace BRs) byla produkce ethylenu vlivem rozdílných pěstebních podmínek skleníku a klimaboxu odlišná až o 92 %. U rostlin řepky pěstovaných ve skleníku došlo 3 hodiny po aplikaci látky s označením BR 1 ke zvýšení produkce ethylenu v porovnání s kontrolou (K) i ostatními sledovanými BRs (graf 13.). Oproti tomu látka BR 3 snižovala množství uvolňovaného ethylenu ve srovnání s kontrolou téměř po celou dobu sledování pokusu (15 dní). Také 24-EPI měl vliv na snížení produkce ethylenu, pouze 24 hodin po aplikaci došlo ke zvýšení. Při pokusech na řepce v klimaboxu nebyly z počátku pozorovány významné statistické rozdíly mezi rostlinami ošetřenými BRs a kontrolou (graf 14.). Následně 9., 11. a 15. den po aplikaci se zvýšila tvorba ethylenu u rostlin ošetřených 24-EPI. Triticum aestivum L. odrůda Sulamit Experimenty s rostlinami pšenice v prostředí klimaboxu ukázaly, že použité BRs zvyšují produkci ethylenu. Ke zvýšení došlo především 3 hodiny po aplikaci BR 4 a 24-EPI (graf 15.). Od 9. dne po aplikaci se začalo množství uvolňovaného ethylenu u všech rostlin ošetřených BRs snižovat a 15. den již nebyly rozdíly mezi rostlinami ošetřenými BRs a kontrolními. Diskuse Pěstební podmínky při experimentech s řepkou měly významný vliv na produkci ethylenu během pokusů. Již při počátku pokusu byl třicetinásobný rozdíl mezi hodnotami ethylenu produkující kontrolní rostliny pěstované ve skleníku a v klimaboxu. Zvýšená tvorba ethylenu u rostlin pěstovaných ve skleníku byla způsobena nestálým pěstebním prostředím, především docházelo k velkým teplotním výkyvům, které způsobují zvýšenou tvorbu ethylenu v rostlinách. 43

44 Při pokusech v klimaboxu bylo pozorováno zvýšení produkce ethylenu u rostlin ošetřených BRs v porovnání s kontrolou. K významnějšímu nárůstu došlo až 4. den po aplikaci BRs a tento trend se u 24-EPI udržel až do konce pokusu. PEREIRA-NETTO et al. (26) také ve své práci popisují zvýšení produkce ethylenu po aplikaci syntetického brassinosteroidu na jabloň třešňolistou (Malus prunifolia (Willd.) Borkh). Produkce ethylenu byla stimulována především 4. až 8. den po aplikaci brassinosteroidu. Naproti tomu KORABLEVA et al. (22) uvádějí, že u hlíz brambor (Solanum tuberosum L. cv. Nevskii) ošetřených roztokem 24-epibrassinolidu, byla nejvyšší produkce ethylenu zaznamenána prvních sedm dní po aplikaci. U rostlin pšenice zvýšily některé použité brassinosteroidy (BR 4, 24-EPI) produkci ethylenu především bezprostředně po aplikaci (3 hodiny). V řadě publikovaných pracích autoři popisují zvýšení stimulace biosyntézy ethylenu po aplikaci brassinosteoidů (ARTECA et al., 1985; SAKURAI et FUJIOKA, 1993; LIM et al., 22). Naproti tomu aplikace látky BR 4 množství produkovaného ethylenu rostlinou pšenice neovlivnila. Také EUN et al. (1989) uvádí, že exogenní aplikací brassinosteroidů u rostlin tykve velkoplodé (Cucurbita maxima Duch.) nebyla ovlivněna biosyntéza ethylenu. nl ethylenu/l/g sušiny BR 1 BR 2 BR 3 BR 4 24-EPI K 3 hod 24 hod 48 hod 3.den 4.den 5.den 7.den 9.den 11.den 13.den 15.den doba od aplikace Graf 13. Vliv BRs na produkci ethylenu Brassica napus L. pěstovaných ve skleníku. 44

45 nl ethylenu/l/g sušiny hod 24 hod 48 hod 4. den 9. den 11. den 15. den 3 hod 24 hod 48 hod 4. den 9. den 11. den 15. den BR 4 24-EPI K doba od aplikace Graf 14. Vliv BRs na produkci ethylenu Brassica napus L. pěstovaných v klimaboxu. nl ethylenu/l/g sušiny hod 24 hod 48 hod 4.den 9.den 11.den 15.den 3 hod 24 hod 48 hod 4.den 9.den 11.den 15.den BR 4 24-EPI K doba od aplikace Graf 15. Vliv BRs na produkci ethylenu u Triticum aestivum L. pěstované v klimaboxu Vliv brassinosteroidů na změny hladiny ABA Výsledky Brassica napus L. odrůda Orkan Přípravek BR 4 zvýšil obsah ABA v listech řepky odebraných 5 hodin po jeho aplikaci (graf 16.). Při dalších odběrech po 24 hodinách došlo ke snížení produkce ABA na stejné hodnoty jako u ostatních sledovaných variant. Mezi jednotlivými variantami brassinosteroidů nebyly nalezeny významné statistické rozdíly. 45

46 Triticum aestivum L. odrůda Sulamit Listy pšenice obsahovaly o 4 % nižší množství kyseliny abscisové než bylo analyzováno z listů řepky. Také v listech pšenice brassinosteroid s označením BR 4 zvýšil obsah ABA 5 hodin po jeho postřiku na rostliny. Následně ovšem došlo ke snížení na úroveň 24-EPI a kontroly (graf 17.). Diskuse Vliv exogenní aplikace BRs na endogenní hladiny ABA je velmi různorodý. Na jedné straně po aplikaci 24-EPI dochází ke zvýšení hladiny ABA v rostlinách bavlníku (Gossypium hirsutum L.) a v hypokotylech okurky seté (Cucumis sativa L.) (KHRIPACH et al., 1999), na druhé straně bylo popsáno snížení hladiny ABA po aplikaci 24-EPI v etiolovaných (EUN et al., 1989) i neetiolovaných (KURAISHI et al., 1991) hypokotylech tykve velkoplodé (Cucurbita maxima Duch.). Především postřik roztokem BR 4 zvýšil obsah ABA v listech obou sledovaných rostlin (řepky i pšenice) ovšem do 24 hodin po aplikaci došlo k jeho snížení. ng ABA/ g sušiny BR 4 24-EPI 5 hod 24 hod 7.den 15.den doba od aplikace K Graf 16. Vliv BRs na obsah ABA v listech Brassica napus L. 46

47 ng ABA/g sušiny BR 4 24-EPI K 5 hod 24 hod 7.den 15.den doba od aplikace Graf 17. Vliv BRs na obsah ABA v listech Triticum aestivum L Vliv brassinosteroidů na změny obsahů cytokininů Výsledky Brassica napus L. odrůda Orkan Aplikace obou sledovaných brassinosteroidů (BR 4 i 24-EPI) snižovala hladinu 6-benzylaminopurinu (BA) (v obou termínech odběrů 1. odběr 5. den po aplikaci a 2. odběr 15. den po postřiku BRs) a dihydrozeatin-ribosidu DHZR (ve 2. odběru). Oba použité BRs také zvýšily hladinu meta topolinu (mt) (v 1. odběru). Po postřiku 24-EPI se zvýšila hladina trans-zeatinu (Z) (2. odběr), dihydrozeatinu (DHZ) (2. odběr), meta-topolin-ribosidu (mtr) (1. i 2. odběr) a ribosidu izopentenyl adeninu (ipr) (2. odběr). Naopak aplikace BR 4 snížila obsah DHZ (1. odběr), ipr (1. odběr) a mtr (2. odběr). Triticum aestivum L. odrůda Sulamit Na rostlinách pšenice oba zkoušené brassinosteroidy (BR 4 a 24-EPI) způsobily snížení BA (v obou odběrech),z (v obou odběrech), mt (2. odběr) a ZR (2. odběr). Naopak v 1. odběru pro sledování hladiny ZR bylo pozorováno zvýšení jeho obsahu. Ošetření látkou 24-EPI vyvolalo snížení DHZ (2. odběr), mtr (v obou odběrech) a ipr (v obou odběrech). 47

48 Exogenní aplikace BR 4 vyvolala zvýšení BAR (1. odběr), ip (2. odběr) a mírně také u DHZR (2. odběr). Diskuse Množství zeatinu bylo v rostlinách řepky i pšenice mírně snižováno po aplikaci syntetických brassinosteroidů, stejně tak jako v pracích KISLIN et SEMICHEVA (1991) a KOZICK et KISLIN (1991). Oproti tomu u rostlin řepky ošetřených 24-EPI po 15ti dnech od aplikace se obsah zeatinu mírně zvýšil, což se shoduje s pozorováním skupinami KARNACHUK et al. (22) na Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. a kalusové kultuře Nicotiana tabaccum L.zkoumané GAUDINOVÁ et al. (1995). U rostlin řepky neměla aplikace BRs vliv na množství zeatin ribosidu. Oproti tomu v rostlinách pšenice syntetický brassinosteroid s označením BR 4 i 24-epibrassinolid zvýšily obsah zeatin ribosidu 5. den od aplikace. Také u rostlin Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. 24-EPI zvýšil množství zeatin ribosidu (KARNACHUK et al., 22). Stejně tak i UPRETI et MURTI (24) pozorovali zvýšení endogenního ZR po aplikaci 24-epibrassinolidu na rostlinách fazolu (Phaseolus vulgaris L.). Autoři sledovali rozdíly dvou koncentrací 24-epibrassinolid a to M a M. V pokusech se jako účinnější koncentrace pro změnu obsahu ZR ukázala M. V této práci bylo experimentováno pouze s koncentrací, M, i přes to došlo ke zvýšení obsahu ZR v listech a to statisticky významně. KISLIN et SEMICHEVA (1991) a KOZICK et KISLIN (1991) ve svých pracích pozorovali zvýšení obsahu dihydrozeatinu a zeatin ribosidu v listech ječmene (Hordeum vulgare L.) po ošetření BRs. Při 2.odběru (15. den po aplikaci) na obsah DHZ u rostlin řepky ošetřených 24-EPI, byl jeho obsah významně zvýšen, tak jak uvádí KISLIN et SEMICHEVA (1991) a KOZICK et KISLIN (1991) ve svých pracích, kdy pozorovali zvýšení množství DHZ také 15. den po odběru. U rostlin řepky látka BR 4 snížila množství DHZ v jejích listech, také po aplikaci 24-EPI na rostlinách pšenice došlo k mírnému snížení DHZ. Aplikace BRs na rostliny řepky a pšenice měly naprosto odlišný účinek na obsah izopentenyl adeninu. U řepky pšenice došlo zejména 15. den po aplikaci ke snížení obsahu ip v porovnání s kontrolou. U pšenice se naopak 15. den zvýšilo množství ip v listech, především u BR 4, 24-EPI neovlivnil množství ip. GAUDINOVÁ et al. (1995) pozorovali, že aplikace 24-EPI zvýšila obsah izopentenyl adeninu v kalusové kultuře Nicotiana tabacum L.. 48

49 Použité brassinosteroidy po celou dobu sledování snižovaly množství BA v listech řepky i pšenice. PEREIRA-NETTO et al. (26) ve své studii nepozorovali ovlivnění obsahu BA u rostlin Malus prunifolia (Willd.) Borkh po aplikaci syntetického analoga brassinosteroidu. Vzájemné vztahy mezi exogenní aplikací BRs na rostlinu s následnou změnou endogenních hladin ribosidu 6-benzylaminopurinu, meta-topolinu a meta-topolin ribosidu nebyly doposud publikovány. ng/g čertvé hmotnosti 2 5.den 15.den ng/g čertvé hmotnosti 2 5.den 15.den 1 1 BR 4 24-EPI K BR 4 24-EPI K BR 4 24-EPI K BR 4 24-EPI K Z ZR Z ZR Graf 18. Vliv BRs na obsah Z a ZR u Brassica napus L. Graf 19. Vliv BRs na obsah Z a ZR u Triticum aestivum L. ng/g čertvé hmotnosti 2 5.den 15.den ng/g čertvé hmotnosti 2 5.den 15.den 1 1 BR 4 24-EPI K BR 4 24-EPI K BR 4 24-EPI K BR 4 24-EPI K DHZ DHZR DHZ DHZR Graf 2. Vliv BRs na obsah DHZ a DHRZ u Brassica napus L. eastivum L. Graf 21. Vliv BRs na obsah DHZ a DHRZ u Triticum 49

50 ng/g čertvé hmotnosti den 15.den ng/g čertvé hmotnosti den 15.den BR 4 24-EPI K BR 4 24-EPI K BA BAR BR 4 24-EPI K BR 4 24-EPI K BA BAR Graf 22. Vliv BRs na obsah BA a BAR u Brassica napus L. Graf 23. Vliv BRs na BA a BAR u Triticum aestivum L. ng/g čertvé hmotnosti den 15.den ng/g čertvé hmotnosti den 15.den BR 4 24-EPI K BR 4 24-EPI K BR 4 24-EPI K BR 4 24-EPI K mt mtr mt mtr Graf 24. Vliv BRs na obsah mt a mtr u Brassica napus L. Graf 25. Vliv BRs na obsah mt a mtr u Triticum aestivum L. ng/g čertvé hmotnosti den 15.den ng/g čertvé hmotnosti den 15.den BR 4 24-EPI K BR 4 24-EPI K BR 4 24-EPI K BR 4 24-EPI K ip ipr ip ipr Graf 26. Vliv BRs na obsah ip a ipr u Brassica napus L. Graf 27. Vliv BRs na obsa ip a ipr u Triticum aestivum L. 5

51 5.1.3 Vliv exogenní aplikace brassinosteroidů na endogenní hladiny ostatních fytohormonů při vystavení rostlin stresovým podmínkám Stres způsobený suchem (nedostatkem vody) Pro pokus byly použity rostliny řepky i pšenice. Při stresu suchem byly rostliny udržovány v trvale zavadlém stavu Ethylen Výsledky Brassica napus L. odrůda Orkan V prvotních pokusech ve skleníku byly zkoušeny dva termíny aplikace BRs - 7 dní před počátkem stresu a 5. den po počátku stresu. Při aplikaci látek 7 dní před stresem docházelo k velkým výkyvům v produkci ethylenu u jednotlivých vzorků. Lze však konstatovat, že BRs zvýšily množství produkovaného ethylenu oproti kontrole nestresované (K). Především rostliny ošetřené 24-EPI zvyšovaly produkci ethylenu, a to již 3 hodiny po počátku stresu až do 7. dne působení stresu suchem (14. den od aplikace). Rostliny stresované kontroly (KS) zvýšily produkci ethylenu 48 hodin po počátku stresu ve srovnání s kontrolou nestresovanou (K) téměř na dvojnásobek (graf 28.). Tento trend pokračoval i 7., 9. a 13. den po počátku stresu až do 15. dne, po kterém následoval útlum produkce ethylenu. Postřik BRs aplikovaný 5 dní po počátku stresu mírně snížil produkci ethylenu. Ve srovnání s kontrolou nebyly žádné významné rozdíly (graf 29.). V porovnání se stresovanou kontrolou (KS) 24-EPI snižoval množství uvolněného ethylenu po celou dobu trvání pokusu. Pro opakování pokusu v podmínkách klimaboxu byl zvolen pouze termín aplikace 5 dní po počátku stresu a zkoušené BRs byly BR 4 a 24-EPI. Bylo pozorováno, že látky BR 4 a 24-EPI měly vliv na snížení produkce ethylenu v prvních dvou dnech sledování. Oproti tomu stresované kontrolní rostliny (KS) produkovaly vyšší obsah ethylenu (graf 3.). 51

52 Triticum aestivum L. odrůda Sulamit Pokusy probíhaly pouze s postřikem BRs v termínu 5 dní po počátku stresu. Aplikace BRs na rostliny pšenice stresované suchem zvýšila produkci ethylenu u všech sledovaných vzorků ve srovnání s kontrolou, především 3 hodiny po ošetření. Během následujících měření po dobu 15-ti dnů došlo postupně ke snížení produkce ethylenu na úroveň kontrolních rostlin (graf 31.). Diskuse Vystavení rostlin řepky stresovým podmínkám nedostatku vody nevyvolalo zpočátku zvýšení produkce ethylenu, po 48 hodinách došlo pouze k mírnému nárůstu. Také EKLUND et al. (1992) a NARAYANA et al. (1991) pozorovali, že produkce ethylenu nebyla zvyšována působením vodního stresu. Ovšem u rostlin ošetřených BRs 7 dní před počátkem stresu se zvýšila produkce ethylenu 24 hodin po počátku stresu suchem, a to významně. Množství produkovaného ethylenu se zvýšilo u rostlin ošetřených 24-EPI a BR 1. Zvýšení produkce ethylenu patrně nepomohlo rostlinám řepky k vyrovnání se stresu suchem, rostliny měly menší nárůst biomasy (viz kap ) v porovnání s ostatními rostlinami ošetřenými BRs s nižší produkcí ethylenu. U rostlin pšenice došlo ke zvýšení produkce ethylenu především 5 hodin po aplikaci BRs. Následně se produkce ethylenu prudce snížila na úroveň kontroly i stresované kontroly. Také při pokusech s pšenici skupinou CHEN et al. (22), se při stresu suchem zvýšila produkce ethylenu pouze na 24 hodin po aplikaci a následně došlo ke snížení téměř k nule. Mnoho autorů pozorovalo zvýšení produkce ethylenu při vystavení vodnímu stresu (MORGAN et DREW, 1997; APELBAURN et YANG, 1983; MEKEON et al., 1982). Také tyto studie popisují prudké zvýšení produkce ethylenu zpočátku stresu s následným rychlým snížením. LI et VAN STADENT (1998) popsali, že BRs zvyšují toleranci ke stresu vyvolaným suchem u odrůd s vyšší odolností vůči suchu, kdežto na odrůdy citlivé k vodnímu stresu nemají brassinosteroidy vliv a jejich resistenci nezlepšují. 52

53 nl ethylenu/l/g sušiny BR 1 BR 2 BR 3 BR 4 24-EPI KS K 3 hod/ 24 hod/ 48 hod/ 4.den/ 7.den/3 hod-stres 8.den/24 hod 9.den/48 hod 12.den/5.den 14.den/7.den 16.den/9.den 18.den/11.den 2.den/13.den 22.den/15.den 24.den/17.den doba od aplikace/doba od počátku stresu Graf 28. Vliv BRs na produkci ethylenu u Brassica napus L. při aplikaci 7 dní před počátkem stresu suchem. nl ethylenu/l/g sušiny BR 1 BR 2 BR 3 BR 4 24-EPI KS K 3 hod/5.den 24 hod/6.den 48 hod/7.den 4.den/9.den 6.den/11.den 8.den/13.den 1.den/15.den 12.den/17.den doba od aplikace/doba od počátku stresu Graf 29. Vliv BRs na produkci ethylenu u Brassica napus L. při aplikaci 5 dní po počátku stresu suchem. nl ethylenu/l/g sušiny hod/5.den 48 hod/7.den 9.den/14.denkonec stresu 15.den/2.den BR 4 24-EPI KS K 5 3 hod/5.den 24 hod/6.den 48 hod/7.den 4.den/9.den 9.den/14.denkonec stresu 11.den/16.den 15.den/2.den doba od aplikace/doba od počátku stresu Graf 3. Vliv BRs na produkci ethylenu u Brassica napus L. při aplikaci 5 dní po počátku stresu suchem. 53

54 nl ethylenu/l/g sušiny hod/5.den 48 hod/7.den 9.den/14.denkonec stresu 15.den/2.den BR 4 24-EPI KS K 5 3 hod/5.den 24 hod/6.den 48 hod/7.den 4.den/9.den 9.den/14.denkonec stresu 11.de/16.den 15.den/2.den doba od aplikace/doba od počátku stresu Graf 31. Vliv BRs na produkci ethylenu u Triticum aestivum L. při aplikaci 5 dní po počátku stresu suchem Kyselina abscisová Výsledky Brassica napus L. odrůda Orkan Také u stanovení kyseliny abscisové u rostlin řepky stresovaných suchem byly zkoušeny dva termíny aplikace BRs (7 dní před stresem a 5 dní po počátku stresu). Aplikace brassinosteroidů 7 dní před počátkem stresu vyvolala u rostlin ošetřených 24-EPI 24 hodin po počátku stresu zvýšení produkce ABA ve srovnání se stresovanou kontrolou (KS). Všechny použité BRs podpořily zvýšenou hladinu ABA v porovnání s kontrolou (K) (graf 32.). Po 26. dnech stresu (33. den po aplikaci BRs) došlo k vyrovnání množství ABA v listech řepky na stejnou úroveň jako stresovaná kontrola (KS). Při aplikaci brassinosteroidů na rostliny vystavené 5-ti dennímu stresu, bylo po 24 hodinách až 7. den od aplikace pozorováno, že BRs snížily ve všech sledovaných variantách produkci ABA, a to velmi významně oproti stresované kontrole (KS, graf 33.). 21. den po ošetření 24-EPI (26.den po počátku stresu) byla hladina ABA v listech neustále na úrovni kontrolních rostlin. U ostatních sledovaných vzorků (BR 2 a BR 4) se zvýšila na stejné hodnoty jako stresovaná kontrola (KS). Pokus s aplikací BRs 5 dní po počátku stresu byl opakován v podmínkách klimaboxu (graf 34.). Všechny sledované varianty (včetně kontrol) obsahovaly vyšší množství ABA v listech než při předchozích pokusech ve skleníku. Množství ABA bylo až desetinásobné. Produkce ABA byla snižována u vzorků s postřikem BR 4 ve srovnání 54

55 se stresovanou kontrolou i ostatními použitými variantami BRs. U ostatních rostlin ošetřených brassinosteroidy došlo ke zvýšení množství ABA v listech a to především 24 hodin po aplikaci. Již 5 hodin po skončení stresu nedostatkem vody byla hladina ABA ve všech analyzovaných vzorcích s aplikací BRs vyrovnána na stejné množství jako v kontrolních rostlinách, tento trend pokračoval i v následujícím měření. Triticum aestivum L. odrůda Sulamit U rostlin pšenice byl zkoušen termín aplikace BRs pouze 5 dní po počátku stresu. V rostlinách pšenice snižovaly brassinosteroidy (BR 4 a 24-EPI) množství produkované ABA, ve srovnání se stresovanou kontrolou (KS). Konec stresu nevyvolal u kontrolních stresovaných rostlin žádnou odezvu snížením produkce ABA, a to ani 8. den po skončení stresu. Naopak ve všech rostlinách ošetřených brassinosteroidy se snížil 8. den po ukončení stresu obsah ABA v listech (graf 35.). Diskuse Rostliny řepky pěstované ve skleníku a vystavené stresu suchem produkovaly nižší množství kyseliny abscisové než rostliny pěstované v klimaboxu. Tento jev byl způsoben nestálými pěstebními podmínkami skleníku, kdy se rostliny adaptovaly na mírné stresy prostředí. Také MOHR et SCHOPFER (1995) pozorovali zvýšení hladiny ABA již při střední hladině stresu. Oproti tomu v řízených a stálých vlhkostních, teplotních i světelných podmínkách klimaboxu, reagovaly rostliny velice citlivě na vystavení stresu suchem. U kontrolních rostlin byl rozdíl hodnot více jak 3 ng ABA.g -1 sušiny. Při porovnání termínů aplikace látek u rostlin pěstovaných ve skleníku, měl postřik BRs 7 dní před počátkem vodního stresu vliv na vyšší obsah ABA v listech řepky a jeho hodnoty se blížily stresované kontrole. Ke stejným závěrům došli i autoři UPRETI et MURTI (24), kdy na rostliny Phaseolus vulgaris L. aplikovali BRs před počátkem stresu a zvýšení ABA pozorovali především u rostlin vystavených stresu po dobu 8 dní. Rostliny ošetřené až v průběhu stresu suchem pěstované ve skleníku, měly po celou dobu pozorování pouze mírně zvýšenou hladinu ABA v listech oproti kontrole. Oproti tomu při opakování pokusu v klimaboxu došlo po aplikaci 24-EPI k více jak 1-ti násobnému zvýšení v porovnání s kontrolou po dobu dvou dnů. Přípravek BR 4 udržel zvýšení ABA v mírnějších navýšeních, ovšem po dobu 7 dnů. IVANOVA et al. (1997) srovnávali akumulaci ABA u dvou genotypů vojtěšky (Medicago sativa L.), různě odolných vůči 55

56 stresu suchem, při vystavení vodnímu stresu. U genotypu tolerantnějšího k suchu došlo k navýšení hladiny ABA po delší dobu, než u odrůdy citlivější k působení sucha, kde bylo pozorováno pouze přechodné zvýšení množství ABA v listech. Vzhledem k těmto výsledkům, lze tedy říci, že brassinosteroid BR 4 zvýšil toleranci vůči stresu u rostlin řepky, odrůdy Orkan. Exogenní aplikace brassinosteroidů na rostliny pšenice pěstované v podmínkách stresu suchem, vyvolala snížení hladiny ABA v porovnání se stresovanou kontrolou (KS). ng ABA/g sušiny den/24 hod 14.den/7.den 33.den/26.den BR 2 BR 4 24-EPI KS K den/24 hod 14.den/7.den 33.den/26.den doba od aplikace/doba od počátku stresu Graf 32.Vliv BRs na obsah ABA v listech Brassica napus L. při aplikaci 7 dní před počátkem stresu suchem. ng ABA/g sušiny hod/6.den 7.den/12.den 21.den/26.den BR 2 BR 4 24-EPI KS K hod/6.den 7.den/12.den 21.den/26.den doba aplikace/doba od počátku stresu Graf 33. Vliv BRs na obsah ABA v listech Brassica napus L. při aplikaci 5 dní po počátku stresu suchem. 56

57 ng ABA / g sušiny hod/5.den 24 hod/6.den 7.den/12.den-konec stresu 15.den/2.den BR 4 24-EPI KS doba od aplikace/doba od počátku stresu K Graf 34. Vliv BRs na obsah ABA v listech Brassica napus L. při aplikaci 5 dní po počátku stresu suchem. ng ABA/g sušiny hod/5.den 24 hod/6.den 7.den/12.denkonec stresu 5 hod/5.den 24 hod/6.den 7.den/12.den-konec stresu 15.den/2.den 15.den/2.den BR 4 24-EPI KS doba od aplikace/doba od počátku stresu K Graf 35. Vliv BRs na obsah ABA v listech Triticum aestivum L. při aplikaci 5 dní po počátku stresu suchem. 57

58 Stres způsobený zaplavením substrátu Při stresu zamokření substrátu byly květníky rostlin ponořeny do vody cca 1 cm pod jejich okraj Ethylen Výsledky Brassica napus L. odrůda Orkan Také v experimentech, kdy byly rostliny vystaveny stresu zaplavením substrátu, byly rostliny řepky pěstovány ve skleníku i v klimaboxu. Produkce ethylenu u stresovaných i kontrolních rostlin pěstovaných ve skleníku byla vyšší než při opakování pokusu v řízených podmínkách klimaboxu (graf ). Při aplikaci BRs 7 dní před počátkem stresu, se v den počátku stresu prudce zvýšila produkce ethylenu u rostlin ošetřených BR 4 (graf 36.). V dalších dnech došlo ke snížení uvolňování ethylenu, množství produkovaného ethylenu se blížilo množství jako u kontrolních rostlin. Aplikace látek 5 dní po počátku stresu (při pokusech prováděných ve skleníku) snížila produkci ethylenu oproti stresované kontrole ve všech sledovaných variantách (graf 37.). Při opakování pokusu v klimaboxu došlo 48 hodin po aplikaci 24-EPI (7. den od počátku stresu) ke zvýšení produkce ethylenu ve srovnání se stresovanou kontrolou (graf 38.). Tento trend se udržel po celou dobu sledování (tzn. dalších 13 dní). Množství uvolňovaného ethylenu z rostlin řepky ošetřených BR 4 kopírovalo po celou dobu pokusu stresovanou kontrolu (KS). Triticum aestivum L. odrůda Sulamit Brassinosteroidy byly aplikovány na rostliny pšenice pouze v termínu 5 dní po počátku stresu. Použité BRs zvyšovaly množství uvolňovaného ethylenu z rostlin jen první dva dny po jejich aplikaci (graf 39.). Po 48 hodinách se produkce ethylenu u ošetřených rostlin snížila a naopak u stresované neošetřené kontroly (KS) zvýšila. 2. den působení stresu zamokření substrátu se produkce ethylenu u všech sledovaných variant sjednotila s nestresovanou kontrolou. 58

59 Diskuse Mnoho autorů popisuje zvýšenou produkci ethylenu 24 hodin po počátku stresu zaplavení substrátu, kdy nedostatek kyslíku v rostlinných kořenech způsobí zvýšenou produkci ethylenu. Pozorování byla prováděna např. u rostli rajčat (Lycoprersicon lycopersicum (L.) Karsten ex. Farw.), bobu (Vicia faba L.), a fazolu (Phaseolus vulgaris L.) (EL-BELTAGY et HALL, 1974; JACKSON et CAMPBELL, 1976; BRADFORD et YANG, 198; WADMAN-VAN SCHRAVENDIJK et VAN ANDEL, 1986, JACKSON, 22). Tyto výsledky se ovšem nepotvrdily u kontrolních stresovaných rostlin řepky. Ke zvýšení produkce ethylenu došlo až 7. den po počátku stresu, 9. den produkce ethylenu dosáhla maxima a následovalo prudké snížení na hodnoty kontrolních rostlin nestresovaných. Také k podobným výsledkům dospěli TANG et KOZLOWSKI ( 1984) při vystavení stresu zaplavení rostlin (Ulmus americana L., Melaleuca quinquenervia (Cav.) Blake, Fraxinus pensylvanica Marsh.), kdy produkce ethylenu prudce stoupla až 7-14 den po počátku vystavení rostlin stresu. Těmto výsledkům také odpovídá vývoj pokusu u stresovaných rostlin pšenice neošetřených BRs. U těchto rostlin pšenice došlo k významnějšímu zvýšení produkce ethylenu až 6 den po počátku působení stresu a trval po celou dobu sledování pokusu. Naproti tomu, pšenice ošetřená postřikem BRs na list, zvýšila produkci ethylenu především po dobu 24 hodin od aplikace stejně tak, jak uvádí JACKSON (22) i WADMAN- VAN SCHRAVENDIJK et VAN ANDEL (1986). nl ethylenu/l/g sušiny BR 1 BR 2 BR 3 BR 4 24-EPI KS K hod/ 24 hod/ 48 hod/ 4 dny/ 7 den/3 hod-stres 8.den/24 hod 9.den/48 hod 12.den/5.den 14.den/7.den 16.den/9.den 18.den/11.den 2.den/13.den 22.den/15.den doba od aplikace/doba od počátku stresu Graf 36. Vliv BRs na produkci ethylenu u Brassica napus L. při aplikaci 7 dní před počátkem stresu zaplavení substrátu. 59

60 nl ethylenu/l/g sušiny BR 1 BR 2 BR 3 BR 4 24-EPI KS K hod/5.den 24 hod/6.den 48 hod/7.den 4.den/9.den 6.den/11.den 8.den/13.den 1.den/15.den doba od aplikace/doba od počátku stresu Graf 37. Vliv BRs na produkci ethylenu u Brassica napus L. při aplikaci 5 dní po počátku stresu zaplavení substrátu. nl ethylenu/l/g sušiny hod/5.den 48 hod/7.den 9.den/14.denkonec stresu 15.den/2.den BR 4 24-EPI KS K 3 hod/5.den 24 hod/6.den 48 hod/7.den 4.den/9.den 9.den/14.denkonec stresu 11.den/16.den 15.den/2.den doba od aplikace/doba od počátku stresu Graf 38. Vliv BRs na produkci ethylenu u Brassica napus L. při aplikaci 5 dní po počátku stresu zaplavení substrátu. nl ethylenu/l/g sušiny hod/5.den 48 hod/7.den 9.den/14.denkonec stresu 3 hod/5.den 24 hod/6.den 48 hod/7.den 4.den/9.den 9.den/14.denkonec stresu 15.den/2.den 11.de/16.den BR 4 24-EPI KS 15.den/2.den doba od aplikace/doba od počátku stresu K Graf 39. Vliv BRs na produkci ethylen u Triticum aestivum L. při aplikaci 5 dní po počátku stresu zaplavení substrátu. 6

61 Kyselina abscisová Výsledky Brassica napus L. odrůda Orkan Analýzy sledující změny hladiny ABA v listech řepky při působení stresu zaplavení substrátu, probíhaly pouze z experimentů prováděných v klimaboxu s aplikací BRs 5 dní po počátku stresu zaplavení substrátu.. U všech sledovaných rostlin řepky ošetřených BRs, bylo sníženo množství ABA v listech oproti kontrole (K) po celou dobu vystavení stresu. 7.den po aplikaci BRs byl obsah ABA v listech mírně zvýšen u všech variant v porovnání se stresovanou kontrolou (KS). Po 12-ti dnech byl stres zaplavením substrátu ukončen a při následném měření po osmi dnech byla zvýšena kladina ABA u všech sledovaných vzorků nad hodnotu kontroly (K) (graf 4.). Triticum aestivum L. odrůda Sulamit Rostliny pšenice vystavené stresu zamokření substrátu se projevily zřetelně jinak než rostliny řepky. Stresovaná kontrola bez ošetření BRs po celou dobu sledování experimentu zvyšovala množství ABA v listech v porovnání s ostatními vzorky (graf 41.). 24 hodin od postřiku se zvýšila hladina ABA u vzorků BR 4 a 24-EPI, 7. den po aplikaci se množství ABA u všech ošetřených rostlin BRs snížilo pod hodnoty nestresované kontroly (K). Diskuse Stres zamokření substrátu vyvolal u rostlin řepky snížení hladiny ABA v listech v porovnání s nestresovanou kontrolou. Tyto výsledky se ovšem neslučují se závěry skupiny AHMED et al. (26), kdy zaplavení substrátu způsobilo zvýšení množství ABA v listech vigny (Vigna radiata L.). Také brassinosteroidy, kterými byly rostliny postříkány neměly vliv na zvýšení produkce ABA v porovnání s množství ABA v kontrolních rostlinách (K). Naopak postřik 24-EPI snížil množství ABA v listech pod hodnoty stresované kontroly (KS). Ke zvýšení množství ABA došlo u ošetřených rostlin až 8. den po ukončení stresu a to až 2,4x v porovnání s kontrolou. Stejným závěry jako AHMED et al. (26) bylo možno vyvodit u rostlin pšenice. Stres zaplavení substrátu vyvolal u kontrolních rostlin vystavených stresu navýšení hladiny 61

62 ABA a to 2,3x v porovnání s kontrolou nestresovanou. K podobným výsledkům také dospěli CASTONGUAY et al. (1993) při pokusech na vojtěšce (Medicago sativa L.), kde bylo zvýšení trojnásobné. Také u mnou sledovaných rostlin ošetřených brassinosteroidy se zvýšil obsah ABA v listech, ovšem nepřesáhl hodnoty stresované kontroly. ng ABA/ g sušiny BR 4 24-EPI KS K hod/5.den 24 hod/6.den 7.den/12.den-konec stresu 15.den/2.den doba od aplikace/doba od počátku stresu Graf 4. Vliv BRs na obsah ABA v listech Brassica napus L.při stresu zaplavení substrátu. ng ABA/g sušiny hod/5.den 24 hod/6.den 7.den/12.denkonec stresu 15.den/2.den BR 4 24-EPI KS K hod/5.den 24 hod/6.den 7.den/12.den-konec stresu 15.den/2.den doba od aplikace/doba od počátku stresu Graf 41. Vliv BRs na obsah ABA v listech Triticum aestivum L.při stresu zaplavení substrátu. 62

63 5.1.4 Vliv exogenní aplikace brassinosteroidů na množství sušiny Výsledky Brassica napus L. odrůda Orkan V předpokusech prováděných ve skleníku došlo u všech sledovaných vzorků ošetřených BRs bez vystavení stresu, k nárůstu sušiny minimálně o 5 % ve srovnání s kontrolními rostlinami (K) (graf 42.). Množství sušiny se nejvíce zvýšilo u rostlin ošetřených látkou BR 4, a to téměř o 82 % více než u kontroly, a BR 3 o 75 %. Při opakování pokusů v řízených klimaboxu byly rozdíly mezi kontrolními rostlinami a rostlinami ošetřenými BRs výrazně menší. K nárůstu sušiny došlo u všech použitých variant BRs, ale pouze o % ve srovnání s kontrolou (graf 45.). Ve skleníkových pokusech měly kontrolní rostliny stresované suchem (KS) o 42 % nižší množství sušiny než kontrola bez stresu (K). Rostliny vystavené stresu suchem měly většinou vyšší nárůst sušiny při aplikaci brassinosteroidů 5 dní po počátku stresu (graf 43.). Použití 24-EPI (aplikace 5 dní po počátku stresu) zvýšilo množství sušiny u stresovaných rostlin o 27 % ve srovnání se stresovanou neošetřenou kontrolou (KS). U ostatních BRs byl nárůst sušiny nižší BR 1 13 %, BR 3 15 % a BR 4 o 7 % ve srovnání s KS. U rostlin ošetřených 7 dní před počátkem stresu se obsah sušiny zvýšil ve srovnání se stresovanou kontrolou u vzorků BR 2 o 14 %, BR 3 o 8 % a BR 4 o 12 %. Rostliny s aplikací 24-EPI měly naopak množství sušiny menší než KS o 7 % (graf 43.). Při opakování experimentů v podmínkách klimaboxu bylo množství sušiny u stresované kontroly (KS) jen o 24 % nižší než u kontroly nestresované (K) (graf 45.). Obsah sušiny se zvýšil u vzorků BR 4 a 24-EPI o 8-11 %. Při stresu zamokření substrátu ve skleníkových pokusech byl nárůst sušiny u stresované kontroly (KS) vyšší o 12 % než u kontroly neošetřené BRs a nestresované (K). Také došlo k vyššímu nárůstu množství sušiny především u varianty aplikace BRs 5 dní po počátku stresu. Především u vzorku BR 4 (o 36 % ve srovnání s KS), u ostatních variant nebyly významné statistické rozdíly. Při aplikaci látek 7 dní před počátkem stresu se množství sušiny u všech sledovaných variant pohybovalo na úrovni stresované kontroly (graf 44.). Při opakování pokusu v podmínkách klimaboxu s variantou aplikace 5 dní po počátku stresu, bylo množství sušiny u všech sledovaných rostlin ošetřených BRs vyrovnané a nárůst byl statisticky nevýznamný v porovnání s KS (graf 45.). 63

64 Triticum aestivum L. odrůda Sulamit Experimenty na rostlinách pšenice probíhaly pouze v podmínkách klimaboxu a při aplikaci brassinosteroidů 5 dní po počátku stresu. U rostlin pšenice nevystavených stresovým podmínkám, byl nárůst sušiny zkoušených variant BRs ve srovnání s kontrolou neošetřenou BRs pouze nepatrný. K největšímu účinku došlo u rostlin ošetřených 24-EPI, a to pouze o 8 % více než u kontroly (graf 46.). U ostatních rostlin ošetřených BRs se zvýšení pohybovalo v rozmezí 2-6 %. Ani při stresu suchem neměly použité brassinosteroidy významný vliv na nárůst sušiny ve srovnání s kontrolním stresovaným vzorkem (KS). U vzorků BR 4 se množství sušiny navýšilo o 1 % ve srovnání s KS. Naopak postřik 24-EPI mírně snížil nárůst sušiny o 4 % ve srovnání s KS (graf 46.). Při pokusu stresu zamokření substrátu se množství sušiny stresované kontroly snížilo o 12 % v porovnání s kontrolou neošetřenou a nestresovanou (K). Mezi jednotlivými variantami použitých BRs a stresovanou kontrolou nebyly významné statistické rozdíly. K nejvyššímu nárůstu došlo u 24-EPI a to o 11 % ve srovnání s KS (graf 46.). Diskuse Všechny použité brassinosteroidy zvyšovaly množství sušiny jak u rostlin řepky tak i u pšenice. Také EUN et al. (1989) zaznamenal ve svých pokusech nárůst hmotnosti tykve (Cucurbita maxima Duch.) po aplikaci 24-EPI. I HAYAT et al. (2) pozorovali nárůst sušiny u hořčice (Brassica juncea L.) po aplikaci BRs a to statisticky významně v porovnání s kontrolou. V rozporu s těmi to výsledky jsou závěry pokusů autora HUNTER (21), kdy kořeny rostlinek sóji (Glycine max L.) ošetřené 24-epibrassinolidem v rozmezí koncentrací,1-1 µm inhibovaly nárůst sušiny celé rostliny. Inhibici nárůstu sušiny podporuje také použití vysoké koncentrace BRs (CHON et al., 2). I když byl brassinosteroid s označením BR 4 dodán později, v testech na změny obsahu sušiny se jevil jako nejúčinnější. Proto byl také vybrán pro další detailní zkoumání jednotlivých fytohormonů a jejich změn po působení stresorů v kombinaci s aplikací BRs. SCHILLING et al. (1991) vystavovali cukrovou řepu (Beta vulgaris L.) stresu suchem, což vedlo k redukci biomasy hlavního kořene. Při vystavení rostlin pouze mírnému stresu suchem a ošetření brassinosteroidy, došlo k navýšení množství biomasy 64

65 na úroveň nestresované a neošetřené kontroly. Tyto výsledky se shodují s pokusy prováděnými na řepce pěstované ve skleníku, kdy byly vlivem nestálých pěstebních podmínek rostliny mírnému stresu neustále vystaveny. Následně byl u rostlin cíleně navozen stresu suchem, rostliny však byly již mírně adaptovány a podmínky stresu suchem neměly na rostliny tak negativní vliv. U většiny sledovaných variant použitých brassinosteroidů, termínů aplikace i rostlinných druhů, byl nárůst sušiny větší než u stresované neošetřené kontroly. Také v práci SAIRAMI et al. (1994) byla u rostlin pšenice (Triticum aestivum L.), které byly ošetřeny BRs postřikem na list, stimulován růst při stresu suchem. V pokusech byla použita odrůda citlivá k suchu a odrůda k suchu tolerantní. U obou variant byl růst brassinosteroidy podpořen. Zaplavení substrátu vodou způsobilo u rostlin řepky převážně nárůst sušiny ve srovnání s kontrolou. Naopak rostliny pšenice po ukončení stresu zamokření substrátu měly nižší množství sušiny a to i po aplikaci brassinosteroidů. Také CHEN et al. (22) pozorovali u rostlin řeřichy širolisté (Lepidium latifolium L.) významné snížení množství sušiny po vystavení stresu zamokření substrátu v porovnání s kontrolou. Ke stejným závěrům dospěli i TANG et KOZLOWSKI (1982) po vystavení Quercus macrocarpa Michx. podmínkám zaplavení substrátu po dobu 3-ti dnů. Mírné zvýšení množství biomasy po vystavení stresu zaplavení bylo pozorováno především u Rumex ssp. (VOESENEK et al., 1992, BANGA et al., 1997). sušina (%) 1 BR 1 BR 2 BR 3 BR 4 24-EPI K varianta Graf 42. Vliv BRs na nárůst sušiny u Brassica napus L. pěstovaných ve skleníku, bez vystavení stresu. 65

66 sušina (%) 1 BR 1 BR 2 BR 3 BR 4 24-EPI 7 dní před stresem 5 dní po stresu KS K doba aplikace BRs kontrola Graf 43. Vliv BRs na nárůst sušiny u Brassica napus L. pěstovaných ve skleníku při stresu suchem. sušina (%) 1 BR 1 BR 2 BR 3 BR 4 24-EPI 7 dní před stresem 5 dní po stresu KS K doba aplikace BRs kontrola Graf 44. Vliv BRs na nárůst sušiny u Brassica napus L. pěstovaných ve skleníku při stresu zamokření substrátu. sušina (%) BR 4 24-EPI K 1 KS bez stresu sucho zamokření stresový faktor Graf 45. Vliv BRs na nárůst sušiny u Brassica napus L. pěstovaných v klimaboxu. 66

67 sušina (%) BR 4 24-EPI K 1 KS bez stresu sucho zamokření stresový faktor Graf 46. Vliv BRs na nárůst sušiny u Triticum aestivum L. pěstovaných v klimaboxu. 5.2 POLNÍ POKUSY Výsledky Brassica napus L. odrůda Orkan Tři týdny po druhé aplikaci brassinosteroidů (v prvním pokusném roce) bylo u rostlin sledováno: výška nadzemní části aplikace brassinosteroidů neměla statisticky významný vliv na prodlužovací růst nadzemní části rostlin řepky (graf 47.). množství šešulí na rostlině u všech sledovaných variant, postřik BRs snížil počet šešulí na rostlinách. Statistický významně u rostlin ošetřených BR 2 ve srovnání s kontrolou (K) (graf 48.). Pouze rostliny postříkané látkou 24-EPI měly srovnatelný počet šešulí jako neošetřené kontrolní rostliny. množství sušiny šešulí také hmotnost sušiny šešulí byla látkou BR 2 snížena a to statisticky významně ve srovnání s kontrolou (graf 49.). U rostlin s aplikací BR 1 a 24-EPI byla hmotnost sušiny vetší než kontrola, ale ne statisticky významně. rozvětvení rostlin i množství větví na rostlině bylo brassinosteroidem s označením BR 2 významně sníženo ve srovnání s kontrolou (graf 5.). Nižší počet větví byl zaznamenán také u BR 1. Ostatní látky rozvětvení rostlin neovlivnily. 67

68 Po sklizni bylo sledováno: výnos v prvním roce pokusů (22) byl výnos snižován všemi použitými BRs. Nejnižší výnos byl u rostlin ošetřených brassinosteroidem s označením BR 2 (o 24% méně než neošetřená kontrola, graf 51.). V následujícím roce 23 byly pokusy ovlivněny nepříznivými klimatickými podmínkami. V zimním období byly velmi nízké teploty i srážky, došlo k poškození porostu. Množství rostlin se ze standardního počtu 45 snížilo na 28 rostlin.m -2. Velmi nízké srážky a vysoké teploty (graf 75. a 76.), které následovaly v měsíci červnu, měly nepříznivý vliv na výnos. U všech sledovaných variant byl poloviční výnos než v předchozím roce. I přesto všechny použité BRs (kromě BR 1) zvýšily výnos ve srovnání s kontrolou, ale ne statisticky významně (graf 52.). obsah sušiny v semenech množství sušiny v semenech aplikace BRs mírně snížila ve srovnání s neošetřenou kontrolou. Nejvíce u vzorků BR 1 a BR 3, ale pouze o,15 % (graf 53). klíčivost semen vliv BRs na klíčivost byl pouze nepatrný. Vzorky BR 1 a BR 3 zvýšily klíčivost o 1-2 %, zatímco vzorky BR 2 a 24-EPI klíčivost o 1-2 % snížily (graf 54.). obsah desulfoglukosinolátů u rostlin ošetřených BR 1 se v sušině semen zvýšil obsah desulfoglukosinolátů o 2,3 µmol/g sušiny semene v porovnání s neošetřenou kontrolou. U 24-EPI bylo naopak pozorováno snížení o 1 µmol desulfoglukosinolátů.g -1 sušiny semene (tabulka 2.). obsah tuku v semenech ve srovnání s kontrolou zvyšovala aplikace brassinosteroidů BR 1, BR 2 a BR 3 množství tuku v semenech řepky (graf 55.). K největšímu zvýšení došlo u varianty BR 2, ale pouze o 1,3 %. obsah mastných kyselin v semenech analýzy byly prováděny na zjištění obsahu kyseliny palmitové, stearové, olejové, linolové, linolenové, eikosenové a erukové (tabulka 3.). U kyseliny olejové všechny aplikované látky zvýšily její obsah o 1% ve srovnání s kontrolou. Vzorek 24-EPI zvýšil obsah kyseliny linolové o 1 %. U ostatních kyselin nebyly mezi jednotlivými vzorky výrazné rozdíly. obsah sinapinu v semenech byl zvyšován variantou BR 1 a BR 2 ve srovnání s kontrolou (K) o 5-7 µmol sinapinu.g -1 sušiny semene (graf 56.). Vzorky ošetřené látkami BR 3 a 24-EPI neměly na obsah sinapinu v semenech vliv. 68

69 Diskuse Především rozdílné klimatické podmínky ve dvou po sobě následujících letech, kdy pokusy probíhaly, měly společně s brassinosteroidy vliv na růst a vývoj rostlin řepky. Polní pokusy na řepce probíhaly v letech 22 a 23. Jako kritický se jevil zejména rok 23 (grafy ), kdy měsíční srážky v jarních měsících klesaly hluboko pod dlouhodobě sledované průměrné hodnoty (o 19,8 mm, v červnu pak až o 52,5 mm) a naopak teploty byly významně nadprůměrné v měsících květnu a červnu a to až o 4,2 C. Přestože mnohé studie popisují stimulaci růstu po aplikaci brassinosteroidů (MANDAVA, 1988; SASSE, 199; SASSE, 1991; CLOUSE, 1996), u rostlin řepky pěstované v polních podmínkách nebyl pozorován významný vliv na vzrůst nadzemní části. Postřik většiny použitých BRs snížil počet šešulí na rostlinách. Pouze 24-EPI mírně zvýšil jejich množství (14,6 ks), ovšem ne statisticky významně v porovnání s kontrolou. Počet šešulí na rostlinu se pohybuje v množství 8-1 ks. Standardní technologie vyžaduje 15-2 ks, intenzívní technologie 25-3 ks šešulí na rostlinu (KUCHTOVÁ et VAŠÁK, 2). Rozvětvení rostlin řepky nebylo aplikací BRs podpořeno. Naopak došlo k mírnému snížení počtu větví. Optimálního počtu 6-12 větví (KUCHTOVÁ et VAŠÁK, 2) bylo dosaženo pouze u rostlin s aplikací 24-EPI. Při aplikaci brassinosteroidů o koncentraci 1,9.1-7 M dvakrát během vegetace byl zvýšen obsah tuků v semenech řepky jen nepatrně. A to o 1-2 % ve srovnání s kontrolou neošetřenou. Pouze 24-EPI snížil obsah tuku o 1 %. Ovšem autoři VARDHINI et RAO (1998) pozorovali na pokusech s podzemnici olejnou (Arachis hypogaea L.) zvýšení obsahu tuku v jejich semenech po aplikaci 24-EPI, a to velmi významně. Pracováno bylo se třemi koncentracemi 24-EPI M; M a M - tedy daleko vyššími než v této práci. Jednotlivé koncentrace byly na rostliny aplikovány třikrát během vegetace. U rostlin ošetřených M 24-EPI došlo k navýšení o 37 % v porovnání s kontrolou, M o 41 % a u koncentrace M o 46 %. Z těchto výsledků lze usuzovat, že v této práci použitá koncentrace 1,9.1-7 M byla příliš nízká pro ovlivnění obsahu tuku v semenech řepky. Rozbor semen na obsah mastných kyselin sledoval především změny obsahů kyseliny erukové, linolové a linolenové. Nežádoucí je především obsah kyseliny erukové pro špatnou resorpci při trávení, vliv na retardaci růstu a především projevy s kardiakální lipidózou. Nežádoucí je také vysoký obsah kyseliny linolenové jejíž oxidace způsobuje 69

70 žluknutí tuků. Naopak žádoucí je vysoký obsah kyseliny linolové pro příznivou úlohu v aterogenezi (ZUKALOVÁ, 2). Obsah kyseliny erukové byl mírně navýšen u semen z rostlin ošetřených BR 3 a 24-EPI, ovšem množství zůstalo v normě pro dvounulové řepky ( 5 %), kam odrůda Orkan patří. Dvounulové řepky mají také obsahovat kyselinu eikosenovou v rozmezí,5 2, %, všechny použité brassinosteroidy mírně snížily její množství v porovnání s kontrolou. Obsah kyseliny linolenové nebyl aplikací BRs ovlivněn. K nárůstu zdraví prospěšné kyseliny linolové došlo pouze po aplikaci 24-EPI, a to o 1%. Všechny použité BRs zvýšily obsah kyseliny olejové o,6-1 % v porovnání s kontrolou (69 %). Ovšem ZUKALOVÁ (2) uvádí, že obsah kyseliny olejové je u dvounulových odrůd řepky v rozmezí 23-4 %. Obsah glukosinolátů u dvounulových odrůd řepky nesmí přesáhnout množství 25 µmol.g -1 semene. Vysoký obsah glukosinolátů (GLS) ovlivňuje negativně činnost štítné žlázy a působí toxicky na činnost jater, jak u lidí tak u zvířat (ZUKALOVÁ, 2). Obsah glukosinolátů u všech sledovaných vzorků nepřesáhl maximální hranici (25 µmol.g -1 semene). Postřik 24-EPI snížil obsah GLS o 1,1 µmol.g -1 semen, za to rozbory vzorku s aplikací BR 1 ukázaly na zvýšení o 2,3 µmol.g -1 semen v porovnání s kontrolou. V prvním pokusném roce 22, klimaticky příznivějším pro růst a vývoj rostlin, postřik brassinosteroidy nezvýšil výnos. Naopak u všech použitých BRs došlo ke snížení výnosu ošetřených rostlin a to o 8-24 % v porovnání s neošetřenou kontrolou. Opakování pokusu v následném roce 23, kdy nízké srážky a vysoké teploty ovlivnily celý porost, byl po postřiku BRs (kromě jednoho) navýšen výnos o 2 32 % oproti kontrole. Aplikace BRs v polním pokusnictví na rostliny řepky byla zkoušena v Číně. Postřik BRs zvýšil výnos o 25 % (KHRIPACH et al., 1999). HAYAT et al (2) pozorovali zvýšení výnosu semen hořčice (Brassica juncea L.) po aplikaci BRs (28-homobrassinolidu) a to především při použití koncentrace 1-6 M. Obsah sušiny v semenech bylo mírně navýšeno pouze přípravky BR 1 a 24-EPI. Klíčivost semen odebraných z rostlin ošetřených BRs během vegetace byla ovlivněna pouze nepatrně. Obsah sinapinu byl zvýšen roztoky BR 1 a BR 2. Vzájemné vztahy mezi použitím exogenních brassinosteroidů na obsah sušiny v semenech, klíčivost ošetřených rostlin a obsah sinapinu nebyly doposud v literatuře popsány. Brassinosteroidy jsou často uváděny jako látky, které zvyšují toleranci k různým typům stresu, jako jsou vysoké a nízké teploty, stres zasolení a také suchem (SASSE et al., 7

71 1997). Postřiky BRs v sledovaných pokusech ovlivnily pozitivně výnos pouze v klimaticky nepříznivém roce, při vystavení rostlin podmínkám stresu. výška (cm) BR 1 BR 2 BR 3 24-EPI K varianta Graf 47. Vliv BRs na nárůst nadzemní části u Brassica napus L. počet šešulí (ks) BR 1 BR 2 BR 3 24-EPI K varianta Graf 48. Vliv BRs na množství šešulí na rostlinu Brassica napus L. 71

72 sušina (g) BR 1 BR 2 BR 3 24-EPI K varianta Graf 49. Vliv BRs na nárůst sušiny šešulí na rostlinu Brassica napus L. počet větví (ks) BR 1 BR 2 BR 3 24-EPI K varianta Graf 5. Vliv BRs na rozvětvení rostlin Brassica napus L. výnos (%) BR 1 BR 2 BR 3 24-EPI K varianta Graf 51. Vliv BRs na výnos semene Brassica napus L. v roce

73 výnos (%) BR 1 BR 2 BR 3 BR 4 24-EPI K varianta Graf 52. Vliv BRs na výnos semene Brassica napus L. v roce 23. sušina (%) BR 1 BR 2 BR 3 24-EPI K varianta Graf 53. Vliv BRs na obsah sušiny v semenech Brassica napus L. klíčivost (%) BR 1 BR 2 BR 3 24-EPI K varianta Graf 54. Vliv BRs na klíčivost semen Brassica napus L. 73

74 Tabulka 2. Vliv BRs na obsah desulfoglukosinolátů (µmol.g -1 sušiny) v semenech Brassica napus L Σ BR 1,12 9,89,17,8,27,51 2,95 4,17,42,87 3,2 st.,7 22,72 BR 2,9 8,84,17 -,23,34 3,65 3,23,45,75 2,34 st.,7 2,16 BR 3,16 8,95,18 -,2,32 2,81 3,42,35,97 3,9 st.,6 2,51 24-EPI,9 8,38,16,7,24,33 3,66 3,12,51,6 2,2,1,7 19,26 kontrola,1 9,15,17 -,23,32 3,61 3,24,43,76 2,28 st.,6 2,35 1. desulfoglucoiberin 5. desulfogluconapoleiferin 9. desulfoglucobrassicanapin 2. desulfoprogoitrin 6. desulfoglucoalyssin 1. desulfoglucobrassicin 3. desulfoepi-progoitrin 7. desulfogluconapin 11. desulfogluconasturtin 4. desulfoglucoraphanin 8. desulfo-4-hydroxyglucobrassicin 12. desulfo-4methoxyglucobrassicin 13. desulfoneoglucobrassicin obsah tuku (%) BR 1 BR 2 BR 3 24-EPI K varianta Graf 55. Vliv BRs na obsah tuku v semenech Brassica napus L. Tabulka 3. Vliv BRs na obsah mastných kyselin (%) v semenech Brassica napus L. kyselina palmitová stearová olejová linolová linolenová eikosenová eruková varianta BRs C 16: C 18: C 18:1 C 18:2 C 18:3 C 2:1 C 22:1 BR 1 2,75 1,27 7,8 16,75 6,73 1,31,5 BR 2 3,21 1,15 7,8 16,98 6,86,93,6 BR 3 3,6 1,65 69,72 16,95 6,26,71,1 24-EPI 3,2 1,9 69,62 17,66 6,49,84,15 kontrola 3,43 1,29 68,98 16,66 6,74 1,34,5 74

75 sinapin µmol/g sušiny semene BR 1 BR 2 BR 3 24-EPI K varianta Graf 56. Vliv BRs na obsah sinapinu v semenech Brassica napus L. Triticum aestivum L. - odrůda Sulamit a Nela Počet klasů Sulamit V prvním roce polních pokusů (rok 23, rostliny byly ošetřeny dvakrát během vegetace) došlo ke zvýšení počtu klasů u vzorku 24-EPI ve srovnání s neošetřenou kontrolou (graf 57.). Ostatní postřiky BRs převážně snížily množství klasů na řádku. Při opakování pokusů v následujícím roce (24), látka 24-EPI při aplikaci dvakrát během vegetace zvýšila počet klasů ve srovnání s kontrolou. K významnějšímu navýšení počtu klasů došlo při použití pouze jedenkrát během vegetace ve stádiu sloupkování u BR 4 (graf 59.). Mírné navýšení ovlivnila také 1. aplikace v době metání vzorkem BR 4. Nela U této odrůdy nebyl během prvního roku pozorován vliv BRs na zvýšení počtu klasů (graf 6.). I v roce 24 neovlivnily významně BRs nárůst počtu klasů. Pouze u vzorku BR 1 byl mírně zvýšen počet (cca o 11 klasů). Zato u vzorků BR 2, BR 3, BR 4 a 24-EPI při aplikaci 2x během vegetace, se počet klasů snížil (graf 62.). 75

76 Počet hlavních a vedlejších klasů Sulamit Počet hlavních a vedlejších klasů byl sledován pouze v roce 23. U odrůdy Sulamit se počet hlavních a vedlejších klasů pohybuje zhruba v poměru 75:25. Množství hlavních klasů bylo zvýšeno látkou 24-EPI, statisticky významně ve srovnání s kontrolou neošetřenou (K) (graf 58.). Počet vedlejších klasů se snížil po aplikaci BR 1, BR 2, BR 4. Nela Poměr hlavních a vedlejších klasů je cca 4:6. Látka BR 1 zvýšila nepatrně počet hlavních klasů ve srovnání s kontrolou (K) (graf 61.). Počet vedlejších klasů se zvýšil u vzorku BR 3. Naopak u BR 1 se počet vedlejších klasů snížil. Počet zrn v hlavním klasu Sulamit V prvním roce byl počet zrn zvýšen látkou BR 4 (graf 63.). U vzorků BR 2 a BR 3 došlo ke snížení množství zrn v klasu. V následujícím roce se počet zrn navýšil u variant BR 1, BR 3 a BR 4 při aplikaci 2x během vegetace, a také u vzorku BR 4 při aplikaci 1x během vegetace (sloupkování) (graf 64.). Nela Při prvních pokusech použité BRs neovlivnily počet zrn v hlavním klasu (graf 65.). Opakování pokusu v následujícím roce ukázalo vliv BRs na snížení počtu zrn v hlavním klasu téměř u všech sledovaných vzorků, kromě 24-EPI (graf 66.). Hmotnost tisíce zrn (HTZ) Sulamit V roce 23 byla HTZ zvýšena aplikací 24-EPI a snížena vzorky BR 1, BR 2 a BR 3 (graf 67.). V roce 24 byla HTZ, kromě zvýšení u vzorku BR 4 aplikovaném při metání, vyrovnaná ve všech sledovaných variantách (graf 68.). 76

77 Nela U odrůdy Nela neměla aplikace BRs v prvním roce statisticky významný vliv na HTZ (graf 69.). Opakování pokusu v následujícím roce ukázalo zvýšení HTZ u BR 3 po dvojí aplikaci během vegetace a u vzorku BR 4 aplikovaném ve stádiu sloupkování. Rozdíly ovšem také nebyly statisticky významné (graf 7.). Výnos Sulamit V prvním roce sledování došlo ke statisticky významnému navýšení výnosu u variant ošetřených látkou BR 3 (o 1,2 t.ha -1 ), BR 4, 24-EPI (o 1,1 t.ha -1 ) ve srovnání s kontrolou neošetřenou (K) (graf 71.). V následujícím roce 24 byl výnos vyšší u všech variant BRs ošetřených dvakrát během vegetace, ovšem ve srovnání s kontrolou již ne tak významně jak v předchozím roce. Naopak aplikace pouze jedenkrát, jak v době sloupkování nebo metání, snížila výnos (graf 72.). Nela V roce 23 se zvýšil výnos ve všech variantách ošetření BRs (graf 73.). U rostlin ošetřených BR 4 až o 1 t.ha -1 v porovnání s kontrolou (K). Při opakování pokusu v dalším roce aplikace BRs zvýšila výnos především u BR 1 a BR 2, ovšem ne tak významně jako v prvním roce pozorování. U ostatních vzorků nebyly pozorovány významné statistické rozdíly. Diskuse Také u rostlin pšenice byl růst a vývoj rostlin ovlivněn především klimatickými podmínkami. I zde se negativně projevil rok 23 nedostatkem srážek a vysokými teplotami. V roce 24 byl nedostatek srážek pouze v květnu, kdy množství srážek bylo nižší o 34 mm oproti dlouhodobému průměru. Rok 24 ovšem nebyl provázen vyššími teplotami. RAMRAJE et al. (1997) uvádějí, že aplikace BRs před kvetením sníží výnos pšenice, především poklesem počtu produktivních odnoží. U odrůdy Sulamit ovšem nedošlo v prvním roce sledování (23) k významnému snížení počtu odnoží v porovnání 77

78 s kontrolou. Naopak 24-EPI zvýšil počet produktivních odnoží v porovnání s neošetřenou kontrolou, a to statisticky významně. Opakování pokusu v následném roce ukázalo, že aplikace v době sloupkování zvýšila počet produktivních odnoží, v porovnání s kontrolou neošetřenou a rostlinami ošetřenými BRs ve fázi metání. U odrůdy Nela, která tvoří výnos především hustotou porostu, neměly brassinosteroidy v obou sledovaných obdobích významný vliv na zvýšení nebo snížení počtu produktivních odnoží. Výnos u odrůdy Sulamit je tvořen počtem zrn v klasu a hmotností tisíce zrn. Bylo tedy žádoucí, aby postřik brassinosteroidy tyto parametry zvýšil. V prvním roce pozorování pouze dvojí aplikace BR 4 mírně zvýšila množství zrn v hlavním klasu. Ostatní použité BRs neměly významný vliv. K mírnému navýšení počtu zrn v klasu došlo především v druhém roce pozorování, klimaticky příznivějším (24), u postřiku většiny látek BRs dvakrát během vegetace (odnožování a sloupkování) na odrůdě Sulamit. U odrůdy Nela aplikace BRs v prvním roce neměla vliv na počet zrn v klasu a v druhém roce převážně snížila jejich množství. Aplikace brassinosteroidů tedy neměla jednoznačný vliv na počet zrn v hlavním klasu a byla ovlivněna jak odrůdou tak klimatickými podmínkami. Většina autorů aplikovala BRs na rostliny pšenice v době kvetení. Autorky PRUSAKOVA et CHIZHOVA (1991) popisují zvýšení počtu semen v klasu o 3 % po aplikaci 24-EPI v době kvetení a zvýšení hmotnosti klasu o 2-3 %. Také IKEKAWA et ZHAO (1991) aplikovali 24-EPI postřikem na list pšenice ve stádiu kvetení, čímž významně zvýšili množství semen v klasu, a s tím tedy i související hmotnost klasu. Jak už bylo dříve zmiňováno, výnos u odrůdy Sulamit je tvořen také hmotností tisíce zrn. V klimaticky nepříznivém roce 23, pouze 24-EPI aplikovaný dvakrát během vegetace zvýšil HTZ téměř o 2 g. Opakování v následném roce účinek 24-EPI nepotvrdilo a HTZ bylo navýšeno pouze u rostlin s postřikem BR 4 v době metání a to o 1,1 g. U odrůdy Nela ovšem všechna ošetření BRs (dvakrát během vegetace) mírně zvýšila HTZ v klimaticky nepříznivém roce 23. Při opakování pokusu s aplikací BRs dvakrát během vegetace se zvýšilo HTZ pouze u látky BR 3, a při jedné aplikaci během sloupkování látkou BR 4. U variant s ošetřením BRs byl výnos zvýšen u BR 3 aplikovaném dvakrát během vegetace o 27 % a 24-EPI o 25 %. Naproti tomu YANG et al. (1992) uvádí, že aplikace 24- EPI neovlivnila výnos pšenice ozimé pěstované v polním pokusnictví. Také opakování pokusu na odrůdě Sulamit ukázalo, že aplikace BRs zvýší výnos, ovšem v klimaticky příznivém roce to bylo pouze o 1-8 %. Jednotlivé aplikace BRs v době sloupkování a 78

79 metání neměly na výnos vliv. U odrůdy Nela byl v klimaticky nepříznivém roce (23) zvýšen výnos u všech rostlin ošetřených BRs dvakrát během vegetace o 5-24 % (nejvíce látkou BR 4). V následném roce byly výnosy opět zvýšeny při aplikaci BRs dvakrát během vegetace ovšem pouze již v rozmezí 5-14 % v porovnání s kontrolou. Také u odrůdy Nela neměly jednotlivé aplikace látek BR 4 jak v době sloupkování tak v době metání na zvýšení výnosu vliv. Aplikace především 24-EPI na rostliny pšenice v polním pokusnictví, byla zkoumána v mnoha zemích (Japonsko, Kazachstan, Rusko, Čína), popisována jsou zvýšení výnosů o 6-37 % (KHRIPACH et al., 1999). Řada autorů ve svých pokusech aplikovala BRs v době kvetení, což následně zvýšilo výnos velice významně, a to i u rostlin pšenice (ZULLO et ADAM, 22; RAMRAJ et al., 1997; GOMES et al., 26 IKEKAWA et ZHAO; 1991). Stejně jako u pokusů s řepkou i u rostlin pšenice byl výnos zvýšen po aplikaci BRs především v klimaticky nepříznivém roce 23. Tyto výsledky potvrzují teorii, o zvýšení tolerance rostlin ke stresům po použití brassinosteroidů. počet klasů (ks) ,5 88,7 1,5 9,67 19,17 97, BR 1 BR 2 BR 3 BR 4 24-EPI K varianta Graf 57. Vliv BRs na počet klasů u odrůdy Sulamit v roce

80 počet klasů (ks) hlavní klasy 86,2 vedlejší klasy 74, 71,2 75,3 74,3 71,8 25,2 23, 25,5 14,5 17, 16,3 BR 1 BR 2 BR 3 BR 4 24-EPI K varianta Graf 58. Vliv BRs na poměr hlavních a vedlejších klasů u odrůdy Sulamit v roce 23. počet klasů (ks) ,9 7,8 77,8 78,3 85,8 7,1 72, BR 1 BR 2 BR 3 BR 4 24-EPI BR 4 BR 4 K odnožování+sloupkování sloupkovaní metání varianta/doba aplikace Graf 59. Vliv BRs na počet klasů u odrůdy Sulamit v roce 24. počet klasů (ks) ,5 91,3 96,3 94,8 88,5 93, BR 1 BR 2 BR 3 BR 4 24-EPI K varianta Graf 6. Vliv BRs na počet klasů u odrůdy Nela v roce 23. 8

81 počet klasů (ks) ,7 4,8 54,8 36,5 34,8 61,5 4,5 54,3 51,8 36,7 37,3 hlavní klasy vedlejší klasy BR 1 BR 2 BR 3 BR 4 24-EPI K varianta 55,7 Graf 61. Vliv BRs na poměr hlavních a vedlejších klasů u odrůdy Nela v roce 23. počet klasů (ks) ,6 94,1 99,1 97,9 116,4 115,8 15, BR 1 BR 2 BR 3 BR 4 24-EPI BR 4 BR 4 K odnožování+sloupkování sloupkovaní metaní varianta/doba aplikace Graf 62. Vliv BRs na počet klasů u odrůdy Nela v roce 24. počet zrn v klasu (ks) BR 1 BR 2 BR 3 BR 4 24-EPI K varianta Graf 63. Vliv BRs na počet zrn v hlavním klasu u odrůdy Sulamit v roce

82 počet zrn v klasu (ks) BR 1 BR 2 BR 3 BR 4 24-EPI BR 4 BR 4 K odnožování+sloupkování sloupkování metání Graf 64. Vliv BRs na počet zrn v hlavním klasu u odrůdy Sulamit v roce 24. varianta/doba aplikace počet zrn v klasu (ks) BR 1 BR 2 BR 3 BR 4 24-EPI K varianta Graf 65. Vliv BRs na počet zrn v hlavním klasu u odrůdy Nela v roce 23. počet zrn v klasu (ks) ,8 26,2 27,7 27,7 28,6 26,5 25,5 28,1 2 BR 1 BR 2 BR 3 BR 4 24-EPI BR 4 BR 4 K odnožování+sloupkování sloupkování metání Graf 66. Vliv BRs na počet zrn v hlavním klasu u odrůdy Nela v roce 24. varianta/doba aplikace 82

83 HTZ (g) ,4 37,7 39,1 39,8 41,7 39, BR 1 BR 2 BR 3 BR 4 24-EPI K varianta Graf 67. Vliv BRs na HTZ u odrůdy Sulamit v roce HTZ (g) 45 45,8 46, 46,2 45,4 46,2 45,7 45,2 46, BR 1 BR 2 BR 3 BR 4 24-EPI BR 4 BR 4 K odnožování+sloupkování sloupkování metání kontrola Graf 68. Vliv BRs na HTZ u odrůdy Sulamit v roce 24. varianta/doba aplikace HTZ (g) ,5 37,4 37,1 37,2 36,6 36, BR 1 BR 2 BR 3 BR 4 24-EPI K varianta Graf 69. Vliv BRs na HTZ u odrůdy Nela v roce

84 HTZ (g) ,6 45,4 48,5 46,9 46,4 47,4 46,3 46, BR 1 BR 2 BR 3 BR 4 24-EPI BR 4 BR 4 K odnožování+sloupkování sloupkování metání varianta/doba od aplikace Graf 7. Vliv BRs na HTZ u odrůdy Nela v roce 24. výnos (%) ,5 1,7 127,8 19, 124, 1, BR 1 BR 2 BR 3 BR 4 24-EPI K varianta Graf 71. Vliv BRs na výnos zrna u odrůdy Sulamit v roce 23. výnos (%) ,3 16,3 16,8 15, 11,3 97,2 9,9 1, BR 1 BR 2 BR 3 BR 4 24-EPI BR 4 BR 4 K odnožování+sloupkování sloupkovaní metaní varianta/doba aplikace Graf 72. Vliv BRs na výnos zrna u odrůdy Sulamit v roce

85 výnos (%) ,8 115,7 112,9 124,9 16,6 1, BR 1 BR 2 BR 3 BR 4 24-EPI K varianta Graf 73. Vliv BRs na výnos zrna u odrůdy Nela v roce 23. výnos (%) ,1 18,9 1, 17, 14,5 98,9 95,9 1, BR 1 BR 2 BR 3 BR 4 24-EPI BR 4 BR 4 K odnožování+sloupkování sloupkovaní metaní varianta/doba aplikace Graf 74. Vliv BRs na výnos zrna u odrůdy Nela v roce

86 6 ZÁVĚR Jak ukazují morfologické pokusy na modelových rostlinách hrachu (Pisum sativum L.) a lnu (Linum usitatissimu L.), jednotlivé rostlinné druhy reagují rozdílně na různé koncentrace různých brassinosteroidů. Zatím co u rostlin hrachu snižující se koncentrace brassinosteroidů podporovala růst kořenů i epikotylů (především 24-epibrassinolid), u rostlin lnu většina BRs ve všech sledovaných koncentracích růst inhibovala. Pokusy na pahýlech lnu ukázaly, že použité BRs nemají auxinový charakter. Jejich aplikace na pahýly zvyšovala počet adventivních pupenů (především u 24-EPI). K podobným závěrům vedlo také vyhodnocení pokusů s aplikací BRs na děložní list lnu, kdy brassinosteroidy BR 1 i 24-EPI vykazovaly inhibici růstu kotyláru u ošetřené dělohy. Pouze látka BR 2 stimulovala růst u ošetřené dělohy, což ukazuje na auxinový charakter BR 2 v tomto testu. Morfologické pokusy ukázaly, že nelze využívat jednotlivých brassinosteroidů a zvláště pak nově syntetizovaných látek, bez předchozího pečlivého zkoumání celé škály koncentrací na konkrétních rostlinných druzích. Sledování hladin některých dalších fytohormonů po aplikaci BRs na rostliny řepky (Brassica napus L.) a pšenice (Triticum aestivum L.) ukázalo, že množství IAA nebylo významně ovlivněno látkou BR 4 ani 24-EPI. Produkce ethylenu byla zvýšená (především 24-EPI) u obou rostlinných druhů. Množství ABA bylo zvýšené u obou sledovaných rostlinných druhů několik hodin po aplikaci látkou BR 4, postupně ovšem došlo ke snížení na hladinu kontroly neošetřené i 24-EPI. Při sledování obsahů cytokininů po aplikaci BRs byly jako nejpodstatnější změny pozorováno, že množství 6-benzylaminopurinu se snižovalo u obou rostlinných druhů oběma použitými BRs (24-EPI a BR 4), oba BRs také snižovaly endogenní hladiny trans-zeatinu u rostlin pšenice. Aplikace 24-EPI vyvolala u rostlin řepky zvýšení množství meta-topolin-ribosidu, ale u rostlin pšenice naopak jeho snížení. Z výsledků dosavadních experimentů vlivu 24-epibrassinolidu a nových syntetických brassinosteroidů na překonání stresu u rostlin řepky ozimé, způsobeného suchem nebo přemokřením substrátu je zřejmé, že všechny použité látky mají pozitivní vliv na akumulaci sušiny, snižují po určitou dobu po aplikaci produkci ethylenu a také endogenní hladinu abscisové kyseliny. Pozorované změny hladin ABA a ethylenu jsou v souladu s předpokladem, že méně stresované rostliny mají nižší endogenní obsah ABA 86

87 a uvolňují méně ethylenu. Ze dvou zkoumaných termínů aplikace (7. dní pře počátkem stresu a 5 dní po počátku stresu) se jako účinnější pro překonání stresu jevila aplikace 5 dní po počátku stresu. Rostliny ošetřené brassinosteroidy během vystavení stresu, vykazovaly vyšší akumulaci sušiny než při aplikaci látek 7 dní před stresem. Z výsledků testování BRs v polních podmínkách je zřejmé, že v klimaticky nepříznivém roce BRs pozitivně ovlivnily výnos u řepky olejné a také u pšenice ozimé. Především napomohly regeneraci porostu a překonání nepříznivého období sucha a vysokých teplot zároveň. Lze tedy předpokládat možné využití syntetických brassinosteroidů v praxi, kdy se látky mohou aplikovat cíleně pouze za nepříznivých podmínek pro růst a vývoj rostlin (při vystavení rostlin stresu). Především při morfologických pokusech bylo pozorován vyšší účinek 24-epibrassinolid v porovnání s ostatními novými syntetickými brassinosterody. V ostatních experimentech byly sledované parametry a jejich změny u různých brassinosteroidů odlišné. Nelze tedy jednoznačně označit, který ze zkoumaných brassinosteroidů by byl nejúčinnější. 87

88 7 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY ABE, H. & MARUMO, S.: Brassinosteroids in Leaves of Distylium racemosum Sieb. et Zucc.- In: CUTLER, H.G., YOKOTA, T. & ADAM, G.: Brassinosteroids: Chemistry, Bioaktivity, and Applications.- American Chemical Society, Washington DC, 1991, pp AHMED, S., NAWATA, E. & SAKURATANI, T.: Changes of endogenous ABA and ACC, and their correlations to photosynthesis and water relations in mungbean (Vigna radiata (L.) Wilczak cv. KPS1) during waterloggin.- Environmental and Experimental Botany 57: , 26. ANURADHA, S. & RAO, S.S.R.: Application of brassinosteroids to rice seeds (Oryza sativa L.) reduced the impact of salt stress on growth, prevented photosynthetic pigment loss and increased nitrate reductase activity.- Plant Growth Regulation 4: 29-32, 23. APELBAUM, A. & YANG, S.F.: Biosynthesis of Stress Ethylene Induced by Water Deficit.- Plant Physiology 68: , APELBAURN, A. & YANG, S.F.: Biosynthesis of stress ethyleneinduced by water dwficit.- Plant Physiology 68: , ARTECA, R.N., BACHMAN, J.M., YOPP, J.H. & MANDAVA, N.B.: Relationship of steroidal structure to ethylene production by etiolated mung bean segments.- Physiologia Plantarum 64: 13-16, ARTECA, R.N., TSAI, D.S., SCHLAGNHAUFER, C. & MANDAVA, N.B.: The effect of brassinosteroid on auxin-induced ethylene production by etiolated mung bean segments.- Physiologia Plantarum 59: , ARTECA, R.N.: Brassinosteroids. In: DAVIES P.J. (ed) Plant hormones: Physiology, biochemistry and molecular biology. Kluwer, Dordrecht, pp , BAJGUZ, A. & TRETYN, A.: The chemical characteristic and distribution of brassinosteroids in plants.- Phytochemistry 62: , 23. BANGA, M. BÖGEMANN, G.M., BLOM, C.W.P.M. & VOESENEK, L.A.C.J.: Flooding resistance of Rumex species strongly depends on their response to ethylene: Rapid shoot elongation or foliar senescence.- Physiologia Plantarum 99: , BAO, F., SHEN, J., BRADY, S.R., MUDAY, G.K., ASAMI, T. & YANG, Z.: Brassinosteroids Interact with Auxin to Promote Lateral Root Development in Arabidopsis.- Plant Physiology 134: , 24. BIELESKI, R.L.: The problem of halting enzyme action when extracting plant tissue.- Analytical Biochemistry, (9): , BOUQUIN, T., MEIER, C., FOSTER, R., NIELSEN, M.E. & MUNDY, J.:Control of specific gene expression by gibberellin and brassinosteroid, Plant Physiology 127 (2): , OCT 21. BRADFORD, K.J. & YANG, S.F.: Xylem transport of 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid, an ethylene precursor in waterlogged tomato plants.- Plant Physiology 65: ,

89 BRADFORD, K.J. & YANG, S.F.: Xylem transport of 1-aminocyclopropane-1-caroxylic acid, an ethylene precursor, in waterlogged tomato plants.- Plant Physiology 65: , 198. CAO, H. & CHEN, S.: Brassinosteroid-induced rice lamina joint inclination and its relation to indole-3-acetic acid and ethylene.- Plant Growth Regulation 16: , CASTONGUAY, P., NADEAU, P. & SIMARD, R.R.: Effect of flooding on carbohydrate and ABA levels in roots and sholte of alfalfa.- Plant Cell and Environment 16 (6): , AUG CLOUSE, S.D. & ZUREK, D.: Molecular analysis of brassinolide action in plant growth and development.- In: CUTLER, H.G., YOKOTA, T. & ADAM, G.: Brassinosteroids: Chemistry, Bioaktivity, and Applications.- American Chemical Society, Washington DC, pp , CLOUSE, SD : Molecular genetic studies confirm the role of brassinosteroid in plant growth and development.- Plant Journal 1: 1-8, COHEN, J.D. & MEUDT, W.J.: Investigations on the mechanism of the brassinosteroid response. Indole-3-acetic acid metabolism and transport.- Plant Physiology 72: , DONG, J.W., LOU, S.S., HAN, B.W., HE, Z.P. & LI, P.M.: Effects of brassinolide on rice seed germination and seedling growth.- Acta Agriculturae University Pekinensis 15: , In: CUTLER, H.G., YOKOTA, T. & ADAM, G.: Brassinosteroids: Chemistry, Bioaktivity, and Applications.- American Chemical Society, Wahington DC, pp , EDER, J., ROVENSKÁ, J., KUTÁČEK, M. & ČERMÁK, V.: HPLC analysis of indoles in Agrobacterium and transformed tabacco cells.- In: KUTÁČEK, M., BANDURSKI, R.S., KREKULE, J.: Physiology and Biochemistry of Auxins in Plants.- Academia Praha and SPB Acad., Hague, pp , EKLUND, L., CIENCIALA, E. & HLLGREN, J.R.: No relation between drought stress and ethylene production in Norway spurce.- Physiologia Plantarum 86: 297-3, EL-BELTAG, A.S. & HALL, M.A.: Effect of water stress upon endogenous ethylene levels in Vicia faba.- New Phytologist 73: 47-6, ELSE, M.A., TIEKSTRA, A.E., CROKER, S.J., DAVIES, W.J. & JACKSON, M.B.: Stomatal closure in flooded tomato plants involves abscisic acid and a chemically unidentified anti-transpirant in xylem sap.- Plant Physiology 112 (1): , SEP EUN, J.-S., KURAISHI, S. & SAKURAI, N.: Changes in Levels of Auxin and Abscisic Acid and the Evolution of Ethylene Squash Hypocotyls after Treatment with Brassinolide.- Plant Cell Physiology 3 (6): 87-81, FIŠEROVÁ, H. & HRADILÍK, J.: Produkce etylenu a etanu při tvorbě adventivních kořenů na stonkových segmentech révy vinné.- Rostlinná výroba 4, , FIŠEROVÁ, H., KULA, E., KLEMŠ, M. & REINÖHL, V.: Phytohormones as indicators of the degree of damage in birch (Betula pendula).- Biologia, 56 (4): 45-49,

90 FUJII, S. & SAKA, H.: Distribution of assimilates to each organ in rice plants exposed to low temperatureat the ripening stage, and the effect of brassinolide on the distribution.- Plant Production Science 4 (2): , 21b. GAUDINOVÁ, A., SÜSSENBEKOVÁ, H., VOJTĚCHOVÁ, M., KAMÍNEK, M., EDER, J. & KOHOUT, L.: Different effects of two brassinosteroids on growth, auxin and cytikonin content in tabacco callus tissue.- Plant Growth Regulation 17: , GOMES, M.M., CAMPOSTRINI, E., LEAL, N.R., VIANA, A.P., FERAZZ, T.M., SIQUUEIRA, L. DO N., ROSA, R.C.C., NETTO, A.T., NUÑEZ-VÁZQUEZ, M. & ZULLO, M.A.T.: Brassinosteroid analogue effects on the yield of yellow passion fruit plants (Passiflora edulis f. flavicarpa).- Scientia Horticulturae 11: , 26. GREGORY, L.E. & MANDAVA, N.B.: The activity and interaction of brassinolide and giberellic acid in mung bean epicotyls.- Physiologia Plantarum 54: , GROVE, M.D., SPENCER, G.F., PFEFFER, P.E., MANDAVA, N.B., WARTHEN, J.D. & WORLEY, J.F.: 6-Beta-glucopyranosyl fatty acid esters from Brassica napus pollen.- Phytochemistry 17: , GROVE, M.D., SPENCER, G.F., ROHWEDDER, W.K., MANDAVA, N., WORLEY, J.F., WARTHEN, J.D., STEFFENS, G.L., FILIPPEN-ANDERSON, J.L. & COOK, J.C.: Brassinolide, a plant growth-promoting steroid isolate from Brassica napus pollen. Nature 281: , HAUBRICK, L.L., TORSETHAUGEN, G. & ASSAMANN, S.M.: Effect of brassinolide, alone and in concert with abcisic acid, on control of stomatal aperture and potassium currents of Vicia faba guard cell protoplasts.- Physiologia Plantarum 128: , 26. HAYAT, S., AHMAD, A., MOBIN, M., HUSSAIN, A. & FARRIDUDDIN, Q.: Photosynthetic rate, growth, and yield of mustard plants sprayed with 28-homobrassinolide.- Photosynthetica 38 (3): , 2. HE, Y.-J., XU, R.-J. & ZHAO, Y.-J.: Enhancement of senescence by epibrassinolide in leaves of mung been seedling.- Acta Phytophysiologia Sin , HOAGLAND, D. R. & ARON, D. I.: The water culture-method of growing plants without soil. Calif. Agric. Exp. Stn. 195, 347 (Rev.). HUNTER, W.J.: Influence of root-applied epibrassinolide and corabenoxolone on the nodulation and growth og soybean (Glycine max L.) seedlings.- Journal of Agronomy and Crop Science 186: , 21. CHANG, J.W. & CAI, D.T.: The effects of brassinolide on seed germination and cotyledons tissue culture in Brassica napus L.- Oil Crops, China 4: 18-22, CHANG, S.CH., KIM Y.-S., LEE, J.Y., KAUFMAN, P.B., KIRAKOSYAN, A., YUN, H.S., KIM, T.- W., KIM, S.Y., CHO, M.H., LEE, J.S. & KIM, S.-K.: Brassinolide interacts with auxin and ethylene in the root gravitropic response of maize (Zea mays).- Physiologia Plantarum 121: , 24. CHEN, H., QUALLS, R.G. & MILLER, G.C.: Adaptive response of Lepidium latifolium to soil flooding: biomass allocation, adventitious rooting, aerenchyma formation and ethylene production.- Environmental and Experimental Botany 48: , 22. 9

91 CHEN, K.-M, GONG, H.-J., CHEN, G.-C. & ZHANG, CH.-L.: ACC and MACC Biosynthesis and Ethylene Production in Water-Stressed Spring Wheat.- Acta Botanica Sinica 44 (7): , 22. CHON, N.M., NISHOKAWA-KOSEKI, N., HIRATA, Y., SAKA, H. & ABE, H.: Effects of brassinolide an mesocotyl. coleoptile and leaf growth in rice seedlings.- Plant Product Science 3: , 2. IKEKAWA, N. & ZHAO, Y-J.: Application of 24-Epibrassinolide in Agriculture.- In: CUTLER, H.G., YOKOTA, T. & ADAM, G.: Brassinosteroids: Chemistry, Bioaktivity, and Applications.- American Chemical Society, Washington DC, 1991, pp IVANOVA, A., DJILIANOV, D., VAN ONCKELEN & ATANASSOV, A.: Abscisic acid changens in osmotic stressed leaves of alfalfa genotypes varying in drought tolerance.- Journal of Plant Physiology 15 (1-2): , IWASAKI, T. & SHIBAOKA, H.: Brassinosteroids act as regulators of tracheary-element differentiation in isolated Zinnia mesiphyll cells.- Plant and Cell Physiology 32 (7): , JACKSON, M.B. & CAMPBELL, D.J.: Waterloogging and petiole epinasty in tomato: the role of ethylene and low oxygen.- New Phytologist 76 (1): 21-29, JACKSON, M.B.: Long distance signalling from roots to shoots assessed: the flooding strory.- Journal of Experimental Botany 53: , 22. JONES-HELD, S., VAN DOREN, M. & LOOKWOOD, T.: Brassinolide application to Lepidium sativum seeds an the effects on seedling growth.- Journal of.plant Growth Regulation 15, 63-67, KAGELE, S., DIVI, U.K., KROCHKO, J.E., KELLNER, W.A. & KRISHNA, P.: Brassinosteroids confers tolerance in Arabidopsis thaliana and Brassica napus to a range of abioic stresses.- Planta 225: , 27. KARNACHUK, R.A., GOLOVATSKAYA, I.F., EFIMOVA, M.V. & KHRIPACH, V.A.: The Effect of Epibrassinolide on Arabidopsis Seedling Morphogenesis and Hormonal Balance under Green Light.- Russian Journal of Plant Physiology 49 (4), , 22. KATSUMI, M.: Physiological modes of brassinolide action in cucumber hypocotyl growth:- In: CUTLER, H.G., YOKOTA, T. & ADAM, G.: Brassinosteroids: Chemistry, Bioaktivity, and Applications.- American Chemical Society, Washington DC, pp , KAWASE, M.: Role of ethylene in induction of flooding damage in sunflower.- Physiologia Plantarum 31: 29-38, KHRIPACH, V.A., ZHABINSKII, V.N. & DE GROOT, A.E.: Brassinosteroids: A New Class of Plant Hormones.- Accademic Press, San Diego, pp , KHRIPACH, V.A., ZHABINSKII, V.N. & MALEVANNAYA, N.N.: Recent advances in brassinosteroid study and application.- Proc. Plant Growth Regul. Soc. Am., 24, 11-16, KIM, S.K., CHANG, S.C., LEE, E.J., CHUNG, W.S., KIM, Y.S., HWANG, S. & LEE, J.S.: Involvement of brassinosteroids in the gravitropic response of the primary root of maize.- Plant Physiology 123: , 2. 91

92 KISLIN, E.N. & SEMICHEVA, T.V.: Effect of brassinosteroids on endogenic level of cytokinins in barley leaves. In Workshop on Brassinosteroids, 2nd, pp , Minsk In: KHRIPACH, V.A., ZHABINSKII, V.N. & DE GROOT, A.E.(Eds): Brassinosteroids: A New Class of Plant Hormones.- Accademic Press, San Diego, pp , KORABLEVA, N.P., PLATONOVA T.A., DOGONADZE, M.Z. & EVSUNINA, A.S.: Bassinolide effect on growth of apical meristem, ethylene production and abscisic acid content in potato tubers.- Biologia Plantarum 45 (1):39-43, 22. KOZICK, T.A. & KISLIN, E.N.: Effect of brassinosteroids on cytokinin and ABA level in barley plants. In Workshop on Brassinosteroids 2nd, pp. 29-3, Minsk In: KHRIPACH, V.A., ZHABINSKII, V.N. & DE GROOT, A.E.(Eds): Brassinosteroids: A New Class of Plant Hormones.- Accademic Press, San Diego, pp , KUCHTOVÁ, P. & VAŠÁK, J.: Základy tvorby výnosu a přezimování.- In: VAŠÁK, J., BARANYK, P., BARTOŠKA, J., BEČKA, D., BECHYNĚ, M., FILÍPEK, I., KAMLER, F., KUCHTOVÁ, P, MATULA, J., MIKŠÍK, V., NERAD, D., NOVÁK., J., NOZDROVISKÝ, L., PAWLICA, R., PRÁŠIL, I., PROKINOVÁ, E., ŠUŠKEVIČ, M., ŠEDIVÝ, J., TUČEK, P., VINCENC, J., ZEHNÁLEK, P., ZUKALOVÁ, H.: Řepka.- Ing. František Savov- AGROSPOJ, Praha, pp , 2. KURAISHI, S., SAKURAI, N., EUN, J.-S. & SUGIYAMA, K.: Effect of brassinolide on levels of indoleacetic acid and abscisic acid in squash hypocotyls.- In: CUTLER, H.G., YOKOTA, T. & ADAM, G.: Brassinosteroids: Chemistry, Bioaktivity, and Applications.- American Chemical Society, Washington DC, 1991, pp KURAPOV, P.B., SKOROBOGATOVA, I.V., KOZIK, T.A., BUMAZHNYI, B.E. & KISLIN, E.N.: Effect of brassinosteroids on content of ABA, cytokinins and giberellins in spring barley.- In Plant growth regulators, Ukrainian Academy of Science, pp , Kiev In: KHRIPACH, V.A., ZHABINSKII, V.N. & DE GROOT, A.E.(Eds): Brassinosteroids: A New Class of Plant Hormones.- Accademic Press, San Diego, pp , KURAPOV, P.B.: Hormonal balancein plants, Doctor of Sciences Degree Thesis, Tymyryazev Agricultural Academy, Moscow, In: KHRIPACH, V.A., ZHABINSKII, V.N. & DE GROOT, A.E.(Eds): Brassinosteroids: A New Class of Plant Hormones.- Accademic Press, San Diego, pp , G.: Brassinosteroids and gibberellins promote tabacco seed germination by distinct pathways. Planta 213 (3): , 21. LEUBNER-METZGER, LI, J.N., NAGPAL, P., VITART, V., MCMORRIS, T.C. & CHORY, J.: A role for brassinosteroids in light-dependent development of Arabidopsis.- Science 272: , LI, L. & VAN STADEN, J.: Effect of plant growth regulators on drought resustance of two maize cultivars.- South African Journal of Botany 64 (2): , LIM, S.H., CHANG, S.C., LEE, J.S., KIM, S.K. & KIM, S.Y.: Brassinosteroids affect ethylene production in the primary roots of maize (Zea mays L.).- Journal of Plant Biology 45: , 22. LUO, J., XU, J.C. & ZHOU, D.: Effects of brassinolide on the changes in IAA, ABA levels in young cotton bools and bool shedding.- Plant. Physiol. Commun, pp , 92

93 In: KHRIPACH, V.A., ZHABINSKII, V.N. & DE GROOT, A.E.(Eds): Brassinosteroids: A New Class of Plant Hormones.- Accademic Press, San Diego, pp , MACHÁČKOVÁ, I., KREKULE, J., EDER, J., SEIDLOVÁ, F. & STRNAD, M.: Cytokinins in photoperiodic induction of flowering in Chenopodium species.- Physiologia Plantarum 87: , MANDAVA, N.B. & MITCHELL, J.W.: New plant hormones: chemical and biological investigations.- Indian Agriculture 15: 19-31, MANDAVA, N.B. & MITCHELL, J.W.: Structural elucidation of brassin.- Chemistry & Industry (23): , MANDAVA, N.B. SASSE, J.M. & YOPP, J.H.:Brassinolide, a growth-promoting steroidal lactone. II. Activity in selected giberellin and cytokinin bioassays.- Physiologia Plantarum 53, , MANDAVA, N.B., KOZEMPEL, M., WORLEY, J.F., MATTHEES, D., WARTHEN, J.D., JACOBSON, M., STEFFENS, G.L., KENNEY, H. & GROVE, M.D.- Isolation of brassins by extraction of rape (Brassica napus) pollen.- Industrial & Engineering Chemistry Product Research and Development 17 (4): , MANDAVA, N.B.: Plant Growth-Promoting Brassinosteroids.- Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 39: 23-52, MAZETS, ZH. E.: Peculiaties of kvartazin and brassinosteroid influence on physiologicalbiochemical processes of DT-lines of the Chinese spring wheat, Ph.D. Thesis, Institute of Experimental Botany, Academy of Sciences of Belarusk, Minsk In: KHRIPACH, V.A., ZHABINSKII, V.N. & DE GROOT, A.E.(Eds): Brassinosteroids: A New Class of Plant Hormones.- Accademic Press, San Diego, pp , MEKEON, T.A., HOFFMAN, N.E. & YANG, S.F.: The effects of plant-hormone pretreatments on ethylene production and synthesis of 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid in water-stressed wheat leaves.- Planta 155, , MILBORROW, B.W. & PRYCE, R.J.: The brassins.- Nature 243: 46, MITCHELL, J.W, MANDAVA, N.B., WORLEY, J.F., PLIMMER, J.R. & SMITH, M.V.: Brassin a new family of plant hormones from rape pollen.- Nature 225: 165, 197. MITCHELL, J.W. & GREGORY, L.E.: Enhancement of overall growth, a new response to brassins.- Nature 239: 254, MITCHELL, J.W., MANDAVA, N.B., WORLEY, J.F. & DROWNE, M.E.: Fatty hormones in pollen and immature seeds of bean.- Journal of Agricultural and Food Chemistry 19 (2): , MOHR, H. & SCHOPFER, P.: Plant physiology. Springer-Verlag, Berlin, MORGAN, P.W. & DREW, M.C.: Ethylene and plant responses to stress.- Physiologia Plantarum 1: 62-63, In: CUTLER, H.G., YOKOTA, T. & ADAM, G.: Brassinosteroids: Chemistry, Bioaktivity, and Applications.- American Chemical Society, Washington DC, pp , MÜSSIG, C., SHIN, G.-H. & ALTMANN, T.: Brassinosteroids Promote Root Growth in Arabidopsis.- Plant Physiology 133: ,

94 NARAYANA, I., LALONDE, S. & SAINI, H.S.: Water-stress-induced ethylene production in wheat, a fact or artific?- Plant Physiologia 96: 46-41, NISHIKAWA, N., TOYAMA, S., SHIDA, A. & FATATSUYA, F.: The uptake and transport of 14 C- labelled epibrassinolide in intact seedlings of cucumber and wheat.- Journal of Plant Research 17 (186): , JUN PEREIRA-NETTO, A.B., CRUZ-SILVA, C.T.A., SCHAEFER, S., RAMÍREZ, J.A. & GALAGOVSKY, L.R.: Brassinosteroid-stimulate branch elongation in the marubakaido apple rootstock.- Trees 2: , 26. PIPATTANAWONG, N., FUJISHIGE, N. & YAMANE, K.: Effect of brassinosteroids on vegetative and reproductive growth in two day-neutral strawberries.- Journal of the Japanese Society Horticultural Science 65 (3), , DEC PRUSAKOVA, L.D. & CHIZHOVA, S.I.: New type of regulators of plant growth and development.- In: Regulators of plant growth and development, 1st, p. 49, Moscow, In: KHRIPACH, V.A., ZHABINSKII, V.N. & DE GROOT, A.E.: Brassinosteroids: A New Class of Plant Hormones.- Accademic Press, San Diego, pp , QUARRIE, S.A., WHITFORD, P.N., APPLEFORD, N.E.J., WANG, T.L., COOK, S.K., HENSON, L.E. & LOVEYS, B.R.: A monoclonal antibody to (s)-abscisic acid: its characterization and use in a radioimmunoassay for measuring abscisic acid in crude extracts of cereal and lupin leaves.- Planta 173: , RADI, S.H. & MAEDA, E.: Effect of brassinosteroide on the cultured rice root-growth as modified by figaron and giberellic-acid.- Japanese Journal of Crop Science (1): , MAR RAMRAJ, V.M., VYAS, V.M., GODREJ, N.B., MISTRY, K.B., SWAMI, B.N. & SINGH, N.: Effevts of 28-homobrassinolide on yields of wheat, rice, groundnut mustard, potato and cotton.- Journal of Agricultural Science 128, , RAO, S.S.R., VARDHINI, B.V., SUJATHA, E. & ANURADHA, S.: Brassinosteroids A new class of phytohormones. Current Science, 82 (1), , 25 May, 22. RODDICK J.G. & GUAN M.-Brassinosteroids and root development.- In: CUTLER, H.G., YOKOTA, T. & ADAM, G.: Brassinosteroids: Chemistry, Bioaktivity, and Applications.- American Chemical Society, Washington DC, pp , RODDICK, J.G. & IKEKAWA, N.: Modification of root and shoot development in monocotyledon and dicotyledon seedlings by 24-epibrassinolide.- Journal of Plant Physiology 14 (1): 7-74, MAY SAIRAM, R.K., SHUKLA, D.S. & DESHMUK, P.S.: Effect of homobrassinolide seed treatment on germination, alpha-amylase aktivity and yield of wheat under moisture stress conditions. - Indian Journal Plant Physiology 1, , SAIRAM, R.K.: Effect of homobrassinolide application on plant metabolism and grain yield under irrigated and moisturestress conditions of two wheat varieties.- Plant Growth Regulation 14: , SAKA, H., KOGEN, A. & OKUMURA, N.: Fluctuation of Ethylene Production in Excised Panicles and Flag Leaf Blades During Grain Ripening in Rice (Oryza satival.).- Japanese Journal of Crop Science 61 (2): , JUN

95 SAKURAI, A. & FUJIOKA, S.: The current status of physiology and biochemistry of brassinosteroids.- Plant Growth Regulation 13: SASSE, J.M., SMITH, R. & HUDSON, I.: Effect of 24-epibrassinolide on germination of seeds of Eucalyptus camaldulensis in saline conditions.- Proc. Plant Growth Regul. Soc. Am. 22, , SASSE, J.M.: Brassinolede-induced elongation and auxin.- Physiologia Plantarum 8: 41-48, 199. SASSE, J.M.: Effects of brassinolide and other natural plant growth regulators on the morphology of pea stem tissue.- Proc Plant Growth Regul Soc Amer 14: 3-39, SASSE, J.M.: Recent progress in brassinosteroid research.- Physiologia Plantarum 1: , 1997 SASSE, J.M.: The case for brassinosteroids as endogenous plant hormones. In: CUTLER, H.G., YOKOTA, T. & ADAM, G.: Brassinosteroids: Chemistry, Bioaktivity, and Applications.- American Chemical Society, Washington DC, 1991, pp SASSE, J.M.: The place of brassinolide in the sequential response to plant growth regulators in elongating tissue.- Physiologia Plantarum 63: 33-38, SCHILLING, G., SCHILLER, C. & OTTO, S.: Influence of brassinosteroids on organ relations and enzyme activities of sugar beet plants.- ACC Symposium series 474, pp , SCHLAGNHAUFER, C., ARTECA, R.N. & YOPP, J.H.: Evidence that brassinosteroid stimulates auxin-induced ethylene synthesis in mung bean hypocotyls between S-adenosylmethionine and 1-aminocyclopropane-1-carbocylic acid.- Physiologia Plantarum 61: , SCHMID, J., YOKOTA, T., ADAM, G. & TAKAHASHI, N.: Castasterone and brassinolide in Raphanus sativus seeds. -Phytochemistry 3: , STEFFENS, G.L.: U.S. Department of agriculture brassins project: In: CUTLER, H.G., YOKOTA, T. & ADAM, G.: Brassinosteroids: Chemistry, Bioaktivity, and Applications.- American Chemical Society, Washington DC, pp. 3-17, STRNAD, M. & KOHOUT, L.: A simple brassinolide analogue 2α, 3α-dihydroxy-17β-(3- methyl-butyryloxy)-7oxa-b-homo-5α-androstan-6-one which induce beane second internode splitting.- Plant Growth Regulation 4: 39-47, 23. STRNAD, M., VANĚK, T, BINAROVÁ, P, KAMÍNEK, M. & HANUŠ, J.: Enzyme immunoassays for cytokinins in alfalfa cell culture, In: KUTÁČEK, M., ELLIOTT, M. C., MACHÁČKOVÁ, J. (Eds.), Molecular aspects of hormonal regulation of plant development.- SPB Academic Publ., The Hague, pp , 199. STRNAD, M.: Enzyme Immunoassays of N 6 -Benzyladenine and N 6 -(meta- Hydroxybenzyl)adenine Cytokinins.- Journal of Plant Growth Regulation 15: , SUGE, H.: Reproductive development og higer plants as influence by brassinolide.- Plant Cell Physiology 27: ,

96 SZEKERES, M., NÉMETH, K., KONCZ-KÁLMÁN, Z., MATHUR, J., KAUSCHMANN,A., ALTMENN, T., RÉDEI, G.P., NAGY, F., SCHELL, J. & KONCZ, C.: Brassinosteroids rescue the deficiency of CYP9, a cytochrome P45, controlling cell elongation and de-etiolation in Arabidopsis.- Cell 85: , ŠEBÁNEK, J., SLADKÝ, Z. & PROCHÁZKA, S.:Experimentální morfologie rostlin.- Academia, Praha, pp , TAIZ, L.: Plant cell expansion: regulation of cell wall mechanical propriets.- Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 35: , TAKATSUTO, S., YAZAWA, N., IKEKAWA, N., TAKEMATSU, T., TAKEUCHI, Y. & KOGUCHI, M.: Structure-activity relationship of brassinosteroids.- Phytochemistry 22 (11): , TAKENO, K. & PHARIS, R.P.: Brassinosteroid-induced bending of the leaf lamina of dwarf rice seedlings: an auxin mediated phenomenom. Plant and Cell Physiology 23 (7): , TANG, Z.C. & KOZLOWSKI, T.T.: Ethylene production and morphological adaptation of woody plants to flooding.- Canadian Journal of Botany 62: , TANG, Z.C. & KOZLOWSKI, T.T.: Some physiological and morphological response of Quercus macrocarpa seedlings to flooding.- Canadian Journal Res. 12: , TARDIEU, F., LAFARGE, T. & SIMONNEAU, T.: Stomatal control by fed or endogenous xylemaba in suflower: Interpretaton of correlations between leaf water potential and stomatal conductance in anisohydric species.- Plant Cell and Environment 19 (1): 75-8, JAN UPRETI, K.K. & MURTI, G.S.R.: Effects of brassinosteroids on growth, nodulation, phytohormone content and nitrogenase activity in French bean under water stress.- Biologia Plantarum 48 (3): , 24. UPRETI, K.K., MURTI, G.S.R. & BHATT, R.M.: Response of French bean cultivars to water deficits: changes in endogenous hormones, proline and chlorophyll.- Biologia Plantarum 4: , VARDHINI, B.V. & RAO, S.S.R.: Acceleration of ripening of tomato pericarp discs by brassinosteroids.-phytochemistry 61: , 22. VARDHINI, B.V. & RAO, S.S.R.: Effect of brassinosteroids on growth, metabolic content and yield of Arachis hypogaea.- Phytochemistry 48: , VARDHINI, B.V. & RAO, S.S.R.: Effect of brassinosteroids on the activities of certain oxidizing and hydrolyzing enzymes of groundnut. Indiana Journal of Plant Physiology 5: 89-92, 2. VOESENEK, L.A.C.J., VAN DER SMAN, A.J.M., HARREN, F.J.M. & BLOM, C.W.P.M.: An amalgamation between hormone physiological and plant ecology: A rewiew on flooring resistance and Ethylene, Journal of Plant Growth Regulation 11: , WADMAN-VAN SCHRAVENDIJK, H. & VAN ANDEL, O.M.: The role of ethylene during flooding of Phaseolus vulgaris.- Physiologia Plantarum 66: ,

97 WORLEY, J.F. & MITCHELL, J.W.: Growth responses induced by brassins (fatty plant hormones) in bean plants.- Journal of the American Society of Horticultural Science 96: , WRIGHT, S.T.C. & HIRON R.W.P.: (+)-abscisic acid, growth inhibitor induced in detached wheat leaves by a period of wilting.- Nature 224 (522): 719, XU, R.J., GUO, Y.S. & ZHAO, Y.J.: Epibrassinolide induced changes in the elongation, endogenous GA 3, ABA and starch content of cucumber hypokotyls.- Acta Phytophysiologica Sin 16 (2): , In: KHRIPACH, V.A., ZHABINSKII, V.N. & DE GROOT, A.E.: Brassinosteroids: A New Class of Plant Hormones.- Accademic Press, San Diego, pp , YAMAMOTO, R., DEMURA, T. & FUKUDA, H.: Brasinosteroids induce entry into the final stage of trachear element differentiation in cultured Zinnia cells.- Plant and Cell Physiology 38 (8): , AUG YANG, Z.S., SHI, G.A. & JIN, J.H.:Effects of epibrassinolide and triadimefon on winter wheat yield and its physiological response.- Acta Univ. Agric. Boreali Occidentalis: 2, 47-5, In: KHRIPACH, V.A., ZHABINSKII, V.N. & DE GROOT, A.E.: Brassinosteroids: A New Class of Plant Hormones.- Accademic Press, San Diego, pp , YI, H.C., JOO. S., NAM, K.H., LEE, J.S., KANG, B.G. & KIM, W.T.: Auxin and brassinosteroid differentially regulate the expresion of three members of the 1- amonocyclopropane-1-carboxylate synthase gene family in mung bean (Vigna radiata L.).- Plant Molecular Biology 41 (4): , YOKOTA, T., ARIMA, M. & TAKAHASHI, N.: Castasterone, a new phytosterol with planthormone potency, from chestnut insect gall.- Tetrahedron Letters 23 (12): , YOKOTA, T.: The History of Brassinosteroids: Discovery to Isolation of Biosynthesis and Signal Transduction Mutants.- In: SAKURAI, A., YOKOTA, T. & CLOUSE, S.D.: Brassinosteroids: Steroidal Plant Hormones.- Springer, Tokyo, 1999, pp YOPP, J.H., MANDAV, N.B. & SASSE, J.M.: Brassinolide, a growth-promoting steroidal lactone I. Activity in selected auxin bioassay.- Plant Physiology 53: , YOSHIOK, T., NESUMI, H. & ITO, Y.: Selection of plant growth regulators affecting citrus precocious flowering.- Journal of the Japanese Society Horticultural Science 59: 44-45, 199. ZHANG, J.H. & ZHANG X.P.: Can early wilting of old leaves account for much of the ABA accumulation in flooded pea-plants.- Journal of Experimental Botany 45 (278): , SEP ZHAO, Y-J., XU, R.-J. & LUO, W.-H.: Inhibitory effects of abscisic acid on epibrassinolideinduced senescence of detached cotyledons in cucumber seedlings.- China. Scienci, Bull, 35, , 199. ZUKALOVÁ, H.: Kvalita ozimé řepky a šlechtění.- In: VAŠÁK, J., BARANYK, P., BARTOŠKA, J., BEČKA, D., BECHYNĚ, M., FILÍPEK, I., KAMLER, F., KUCHTOVÁ, P, MATULA, J., MIKŠÍK, V., NERAD, D., NOVÁK., J., NOZDROVISKÝ, L., PAWLICA, R., PRÁŠIL, I., 97

98 PROKINOVÁ, E., ŠUŠKEVIČ, M., ŠEDIVÝ, J., TUČEK, P., VINCENC, J., ZEHNÁLEK, P., ZUKALOVÁ, H.: Řepka.- Ing. František Savov-AGROSPOJ, Praha, pp. 6-73, 2. ZULLO, M.T.A. & ADAM, G.: Brassinosteroid phytohormones structure, bioactivity and aplications.- Brazilian Journal of Plant Physiology 14: , 22. ZUREK, D.M., RAYLE, D.L., MCMORRIS, T.C. & CLOUSE, S.D.: Investigation of gene expression, growth kinetics, and wall extensibility during brassinosteroid-regulated stem elongation.- Plant Physiolology 14: ,

99 8 PŘÍLOHY 8.1 SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK 24-EPI 24-epibrassinolid ABA kyselina abscisová ACC 1-aminocyklopropan-1-karboxylová kyselina BA 6-benzylaminopurin BAR ribosid 6-benzylaminopurinu BL brassinolid BR 1; BR 2; BR 3; BR 4 označení zkoušených nových syntetických brassinosteroidů BRs brassinosteroidy BSA hovězí sérový albumin DHZ dihydrozeatin DHZR ribosid dihydrozeatinu ELISA enzymově vázané imunochemické stanovení GLC gelová kapalinová chromatografie GLS glukosinoláty HBL homobrassinolid HPLC vysokotúčinná kapalinová chromatografie HTZ hmotnost tisíce zrn IAA indolyl-3-octová kyselina ip izopentenyl adenin ipr ribosid izopentenyl adeninu K kontrola KS kontrola stresovaná bez aplikace BRs mt meta topolin mtr meta topolin ribosid TBS tris (trizma ) 2-amino-2-hydroxymethylpropan-1,3-diol TFA kyselina trifluoroctová TIBA 2,3,5-trijodbenzoová kyselina Z trans-zeatin ZR ribosid trans-zeatinu 99

100 Grafy klimatických podmínek polních pokusů (zdroj ČHMU, stanice Troubsko) srážky (mm) I. II. III. IV. V. VI. VII. VIII. IX. X. XI. XII. průměr měsíc Graf 75. Průměrné měsíční srážky ve sledovaném období. teplota ( C) průměr I. II. III. IV. V. VI. VII. VIII. IX. X. XI. XII. měsíce Graf 76. Průměrná měsíční teplota ve sledovaném období. délka slunečního svitu (hod) průměr I. II. III. IV. V. VI. VII. VIII. IX. X. XI. XII. měsíce Graf 77. Délka slunečního svitu ve sledovaném období. 1

101 Fotodokumentace experimentů Foto 5. a 6. Brassica napus L. a Triticum aestivum L. před aplikací BRs v laboratorních pokusech. Foto 7. a 8. Brassica napus L. pěstovaná v lahvích pro odběr ethylenu. Foto 9. a 1. Brassica napus L. vystavená stresu zaplavení substrátu (9.) a suchu (1.). 11

102 BR 4 24-EPI kontrola Foto 11. Brassica napus L. ošetřená BRs, konec pokusu. Foto 12. Brassica napus L. ošetřená BRs a vystavená stresu suchem, konec pokusu. Foto 13. Brassica napus L. ošetřená BRs a vystavená stresu zamokření substrátu, konec pokusu. 12

103 BR 4 24-EPI kontrola Foto 14. Triticum aestivum L. ošetřeno BRs, konec pokusu Foto 15. Triticum aestivum L. ošetřeno BRs a vystaveno stresu suchem, konec pokusu. Foto 16. Triticum aestivum L. ošetřeno BRs a vystaveno stresu zamokření substrátu, konec pokusu. 13

104 Foto 17. a 18. Poškození porostu Brassica napus L. po zimě 22/23 (foto duben 23). Foto 19. a 2. Aplikace BRs na Brassica napus L. ve stadiu 5. internodium viditelné (19.) a 3% květů na stonku otevřeno (2.). Foto 21. Brassica napus L. ve stádiu sklizňové zralosti. 14

105 Foto 22. a 23. Porost Triticum aestivum L. po špatném přezimování 23 (22.) a v následném roce 24 (23.). Sulamit Nela Foto 24. a 25. Triticum aestivum L. ve fázi začátek sloupkování. Sulamit Nela Foto 26., 27. a 28. Triticum aestivum L. ve fázi praporcový list. 15