B5, 2007/2008, I. Literák

Transkript

1 B5, 2007/2008, I. Literák

2 NOBELOVY CENY V R LÉKAŘSTVÍ A FYZIOLOGIE R. AXEL (USA) a L. BUCK (USA): funkce čichového systému u myší cca 1000 genů (u člověka něco méně) pro vznik stejného počtu čichových receptorů tj. cca 3 % genů člověka je odpovědných za dekódování čichových vjemů čichové receptory patří do skup. RECEPTORŮ SPOJENÝCH S G-PROTEINY aktivace čichového receptoru čichová buňka vyšle el. signál do mozku CHEMIE A. CIECHNOVER (Izrael), A HERŠKO (Izrael) a I. ROSE (USA): odbourávání proteinů v buňce (objevy z 80. let) na nepotřebný protein se umístí UBIKVITIN molekulární značka (polibek smrti) označený protein je zlikvidován v PROTEASOMECH (molekulární jatka) proteasomy hrají klíčovou roli v regulaci buň. dějů nefungují-li správně nekontrolované dělení buňky rakovina v typické buňce až 30 tis. proteasomů

3 NOBELOVY CENY V R LÉKAŘSTVÍ A FYZIOLOGIE Barry MARSHALL a Robin WARREN (Austrálie) za výzkum bakterie Helicobacter pylori, která má vliv na onemocnění žaludku (gastritis) a vznik žaludečních vředů.

4 Craig MELLO a Andrew FIRE (USA) NOBELOVY CENY V R LÉKAŘSTVÍ A FYZIOLOGIE při pokusech s Caenorhabditis elegans objevili jev interference RNA sirna (RNAi) objev z r CHEMIE Roger D. KORNBERG (USA): objasnil trojrozměrnou strukturu RNA-polymerázy z kvasinek (Pol II) RNA polymeráza II (Pol II) je velký (550 kda) komplex z 12 podjednotek, který je klíčový pro transkripci

5 NOBELOVY CENY V R LÉKAŘSTVÍ A FYZIOLOGIE za vývoj postupů vyvolání genetických změn v myších za použití kmenových buněk z časných embryí Mario CAPECCHI - narodil se v Itálii, dnes občan USA Martin EVANS - UK Oliver SMITHIES - narodil se v Británii, dnes občan USA cílené modifikace genů (GENE TARGETING) - Vyjmou se kmenové (nediferencované) buňky z myších zárodků. - Do získaných buněk se vloží nový gen nebo se některý gen vyřadí z činnosti. - Pak buňky přenesou do dalšího myšího zárodku. Myš, která se narodí, má genetickou změnu v některých tkáních, včetně pohlavních buněk. Díky tomu ji pak může předat svým potomkům. Další generace myší - KNOCKAOUTOVANÉ MYŠI - mají genetickou změnu ve všech svých buňkách. - Vědci tak získávají linie laboratorních myší, na nichž mohou sledovat, co zásah do genů způsobil ve srovnání s běžnými hlodavci.

6 PAMĚŤOVÝ SYSTÉM BUŇKY BUNĚČNÁ PAMĚŤ Paměť - zaznamenání, uchování a předání informace (kniha, disketa, DNA, lidský mozek) Dědičnost = schopnost předávat soubor informací ve sledu po sobě jdoucích generací (buněk, mnohobuněčných organismů) Buněčná paměť (vnitřní paměť buňky) - zpracovává informaci pro - udržování buňky (struktura a funkce) - reprodukci - u jednobuněčných - u mnohobuněčných + informace o vývoji, funkci a chování celého jedince

7 NUTNÉ VLASTNOSTI BUNĚČNÉ PAMĚTI 1. velká kapacita 2. dlouhodobost 3. stabilita 4. snadná dostupnost a transformovatelnost do konkrétní vlastnosti buňky 5. zdvojitelnost (pro 2 dceřiné buňky) 6. schopnost doplňování (evoluce) TYPY - informace genová (genetická) nesená genofory hlavní médium... NK exprese genetické informace = kódování, vyzvedávání a vyjadřování (exprimace) do konkrétních vlastností - informace negenová (epigenetická) -část vnitřní informace buňky zprostředkovaná jinak ovlivňuje vyjádření genů (metylace DNA, modifikace histonů, sbalování chromatinu) UNIVERZÁLNOST GENETICKÉ INFORMACE každá genetická informace je zapsána v primární struktuře NK - DNA (většinou), RNA (RNA viry)

8 GEN MENDEL (1865) - diskrétní elementy odpovědné za vytvoření znaků JOHANSSEN (1909) - gen = jednotka dědičnosti MORGAN (1911) - geny jsou lokalizovány na lokusech chromozomů BEAGLE, TATUM (1941) - jeden gen - jeden enzym WATSON, CRICK (1953) - gen je část molekuly DNA kódující jeden enzym GEN = úsek polynukleotidového řetězce obsahující genetickou informaci pro strukturu polypeptidu jako translačního produktu (gen strukturní) nebo informaci pro strukturu RNA, která nepodléhá translaci (geny pro rrna a trna) GENY STRUKTURNÍ: informace o primární struktuře polypeptidu (bílkovině strukturní, enzymové, signální) - složené: z exonů (kódující sekvence genů) z intronů (nekódující sekvence genů) primární transkript podléhá posttranskripčnímu sestřihu mrna, která se na ribosomu překládá do molekuly polypeptidu (eukaryota) -jednoduché: přepisují se celé bez sestřihu (prokaryota) GENY PRO RNA: (rrna, trna)

9 NEGENOVÁ DNA: REGULAČNÍ OBLASTI (regulační sekvence) - úseky molekuly NK, které nesou informaci pro navázání specifických proteinů např. signalizace zahájení nebo ukončení transkripce (na DNA) TRANSPOZONY, RETROELEMENTY (endogenní retroviry, SINE, LINE, u člověka 42 % DNA), REPETITIVNÍ DNA (mikrosatelity, minisatelity) prokaryonta - jen malá část DNA je negenová eukaryonta - většíčást DNA je negenová (u savců 90 %) GENOM - soubor všech molekul DNA v buňce (genová i negenová DNA) - soubor všech genů strukturních a genů pro RNA GENOFORY: CHROMOZOMY PLAZMIDY

10 Některé známé kompletní GENOMY ORGANISMUS bakteriofág ΦX174 (1977) FPV (fowlpoxvirus) (2000) Haemophilus influenzae (1995) Mycoplasma genitalium Escherichia coli Saccharomyces cerevisiae Arabidopsis thaliana Caenorhabdis elegans Drosophila melanogaster Homo sapiens POČET BAZÍ (Mb) 5386 b ssdna dsdna POČET GENŮ 10 min Jaké další? Myš, potkan, kur, včela, pes, kráva (odhad NHGRI Washington)

11 EXPRESE GENETICKÉ INFORMACE F. CRICK: DNA RNA PROTEIN CENTRÁLNÍ DOGMA MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE 1. stupeň DNA RNA TRANSKRIPCE - na základě komplementarity bazí vznikají RNA kopie (transkripty) - postranskripční úprava 2. stupeň RNA PROTEIN TRANSLACE - nukleotidy AK - postranslační úprava přesná regulace (!): kvalitativní kvantitativní časová

12 Od DNA k proteinu Espero Publishing, s.r.o.

13 TRANSKRIPCE transkripční jednotka = definovaný úsek DNA pro transkripci složení: - promotor - sekvence DNA (40 bp) pro navázání RNA-polymerázy (prostřednictvím proteinu sigma faktor) - sekvence strukturního genu (strukturních genů) - terminátor 1. INICIACE - po navázání RNA-polymerázy na promotor se rozvinou oba řetězce DNA - od místa startu (1. přístupného nukleotidu) na matricovém vláknu se přiřazují RNA nukleotidy, začíná syntéza RNA - po dosažení délky 9 nukleotidů se odštěpuje sigma faktor prokaryota eukaryota RNA-polymeráza vazby RNA-polymerázy na promotor Bacteria - 1 typ Archea - mnoho typů prostá 3 typy (I, II, III) vyžaduje transkripční faktory (regulační proteiny)

14 2. ELONGACE - RNA-polymeráza se posunuje podél molekuly DNA - vzniká vlákno RNA v orientaci TERMINACE terminátor - sekvence DNA, po jejíž transkripci se RNA zdvojí (zdvojení je signál pro oddělení RNA polymerázy od DNA) jiná možnost terminace - vazba rho faktoru (specifický protein) na molekulu RNA REVERZNÍ TRANSKRIPCE... RNA DNA pomocí reverzní transkriptázy (RNA- závislé DNA-polymerázy) u retrovirů

15 DNA je transkribována enzymem RNA-polymerázou Espero Publishing, s.r.o.

16 Směry transkripce genů v krátkém úseku bakteriálního chromosomu Espero Publishing, s.r.o.

17 POSTTRANSKRIPČNÍ ÚPRAVA RNA (RNA processing) mrna prokaryonti - přímo translace eukaryonti pre-mrna (hnrna heterologní nukleární RNA) mrna 1. navázání 7-metylguanozinu na 5 konec (vznik tzv. čepičky) 2. polyadenylace (připojení adenosinnukleotidů) na 3 konec (vznik tzv. polya přívěsku) 3. splicing ponechání exonů (kódujících sekvencí k exprimování) průměrný gen má asi 1000 nukleotidů vystřižení intronů (často delších než exony) [ ribozym endonukleáza P] důvody 1. a 2.: - ochrana před účinkem nukleáz - nutné pro rozpoznání ribozomem - umožňuje přechod z jádra do cytoplazmy

18 rrna syntéza v jadérku % RNA pre-rrna rrna prokaryonta - 3 druhy rrna (pro ribosomální podjednotky) eukaryonta - 4 druhy rrna (pro ribosomální podjednotky) trna syntéza v jadérku pre-trna trna 1. odstranění zaváděcí sekvence 2. chemické modifikace (metylace) bazí 3. vystřižení intronů 4. přidání trojice nukleotidů CCA (u všech funkčních molekul trna)

19 TRANSLACE (proteosyntéza) = překlad z jazyka nukleotidů (4-písmenná abeceda) do jazyka AK (21-písmenná abeceda) - v cytoplazmě, - na ribosomech GENETICKÝ KÓD Nirenberg, Khoran, Ochoa ( Nobelova cena) kombinace tří nukleotidů kóduje 1 AK 64 variant (61 je využito pro AK) tripletový kód triplet nukleotidů v mrna... kodon (5 3 ) genetický kód je univerzální (stejný u všech organismů) je nepřekryvný (5 3 )

20

21 Degenerovaný genetický kód Genetický kód je degenerovaný, resp. redundantní, což znamená, že dva či více kodónů může kódovat jednu a tutéž aminokyselinu. Degenerované kodóny se obvykle liší ve své třetí pozici, viz kodóny GAA a GAG, které oba kódují glutamin. Tato degenerace genetického kódu umožňuje existenci tzv. tichých mutací. Degenerovanost genetického kódu a z ní plynoucí existence tichých mutací značně zvyšuje toleranci substitučních mutací v degenerovaných kodónech. Např. kodóny kódující alanin (GCG, GCA, GCU, GCC) mohou po libosti mutovat na své třetí pozici, aniž by došlo k záměně aminokyseliny, kterou kódují. Naproti tomu aminokyselina histidin je kódována pouze dvěma kodóny, takže bez změny aminokyseliny je pouze jedna z možných tří mutací na třetí pozici.

22 PROTEOSYNTETICKÝ APARÁT mrna ribosomy - místa syntézy proteinů trna -řadí AK podle tripletů volné AK ATP, GTP (zdroje energie) řada enzymů a tzv. pomocných faktorů mrna prokaryontní - nese informaci pro několik polypeptidů (polycistronická RNA) operon = skupina genů přepisovaných do 1 molekuly RNA eukaryontní - nese informaci 1 genu

23 RIBOSOMY tělíska z rrna a bílkoviny (1:1) v cytoplazmě prokaryontů i eukaryontů v matrix mitochondrií a stromatu chloroplastů - volné - vázané na membrány (ER, vnější membrána jaderného obalu) v buňce ribosomů velikost ribozomů v Svedbergových sedimentačních jednotkách Celý ribosom Větší podjednotka Menší podjednotka prokaryonta (+ mitochondrie a chloroplasty) eukaryonta specifická vazebná místa: - místo pro vazbu mrna - A (aminoacyl) místo vazba trna s AK (aminoacyl-trna) - P (peptidyl) místo (vazba peptidyl-trna) - E (exit) místo (místo, kde t-rna opouští ribosom) polysom - řetízek ribosomů, na nichž probíhá translace proteinů (prokaryonta i eukaryonta)

24 Komponenty eukaryontního ribosomu Espero Publishing, s.r.o.

25

26 RIBOZOMY VELIKOST V SVEDBERGOVÝCH SEDIMENTAČNÍCH JEDNOTKÁCH S celý ribozom LSU rdna SSU rdna EUKARYOTA PROKARYOTA CHLOROPLASTY MITOCHONDRIE

27 Vazebná místa pro RNA na ribosomu Espero Publishing, s.r.o.

28 Polyribosom Espero Publishing, s.r.o.

29 trna rameno antikodonové rameno aminokyselinové vazbu trna a AK zajištuje specifická aminoacyl-trna-syntetáza 20 syntetáz pro 20 AK (21. AK selenocystein vzniká kotranslační modifikací až po navázání AK na trna) energie uvolněná rozštěpením této vazby se použije k tvorbě peptidové vazby nového polypeptidu Izoakceptorové t-rna - stejná AK/jiný antikodon

30 PRŮBĚH TRANSLACE 1. INICIACE - připojení iniciačních faktorů na menší podjednotku ribosomu - vazba iniciační trna (trna f-met formylmethionin -eubakterie, trnamet methionin archea, eukaryota) na menší podjednotku ribosomu - vazba mrna na menší podjednotku ribosomu - připojení větší podjednotky ribosomu tj. vznik translačního komplexu energie z GTP (GTP GDP) 2. ELONGACE - na startovací kodon mrna se váže antikodon trna a další trna (A místo P místo E místo, tzv. translokace) nutné elongační faktory (EF-Tu, EF-Ts, EF-G) + energie z GTP spojování AK je katalyzováno peptidyltransferázovou aktivitou 23S rrna (RNA s enzymovou aktivitou, ribozym)

31 3. TERMINACE - elongace končí dosažením stop kodonu: UAA, UAG, UGA stop kodony - nejsou rozeznávány trna - jsou rozeznávány proteiny (uvolňovací faktory, terminační faktory), které se na tyto stop kodony váží - oddělení polypeptidu - rozpad translačního komplexu

32 POSTTRANSLAČNÍ MODIFIKACE PROTEINŮ k zajištění biologické funkčnosti polypeptidů postranslační modifikace kotranslační (začínající již během translace) modifikace - deformylace (odstranění formylové skupiny z methioninu) - odštěpení AK - vyštěpení peptidů - chemické modifikace AK (metylace, fosforylace) - tvorba disulfidových můstků - připojení cukerných zbytků (glykoproteiny) - odstranění signálních sekvencí řada postranslačních modifikací se uskutečňuje specifickými enzymy (peptidázy, deformylázy,...) tj. produkty jiných strukturních genů vznik SEK., TERC. a KVART. STRUKTURY - spontánně - asistovanou autoagregací pomocí chaperonových proteinů (chaperonů), které se vážou na některé funkční skupiny vznikajících proteinů a nedovolí vznik nežádoucích vazeb (např. Hsp heat shock protiens)

33 REGULACE GENOVÉ EXPRESE důvody pro regulaci genové exprese genové produkty - proteiny - jsou pro buňku potřebné: - v určité koncentraci - v určitém čase - na určitém místě A. PROKARYOTA GENY KONSTITUTIVNÍ - produkce konstitutivních (trvale potřebných) proteinů - bez regulace GENY ADAPTIVNÍ - produkce adaptivních proteinů regulace na úrovni transkripce (geny zapínány a vypínány) katabolické enzymy - indukce substrátem anabolické enzymy - represe konečným produktem operonové geny - skupina genů řízených promotorem a operátorem operátor je sekvence nukleotidů, na kterou se váže represor (protein kódovaný regulačním genem) tj. alosterický protein represor zastavuje transkripci genu, po jeho uvolnění transkripce probíhá

34 B. EUKARYOTA mnohem složitější regulační mechanismy na více úrovních 1. regulace na úrovni genomu - dekondenzace a kondenzace chromozomů - acetylace a deacetylace histonů - metylace a demetylace DNA (geny s metylovanými nukleotidy nejsou transkribovány) - přestavba genomu pomocí transpozonů (zkopírování určitých sekvencí a jejich včlenění do určitých lokusů, např. spuštění odlišných diferenciačních programů u kvasinek) - amplifikace určitých úseků genomu - genově specifické regulátory diferencující mezi transkripcí a replikací 2. regulace na úrovni transkripce - působení transkripčních faktorů: sekvence inr, TATA box, TFIID, TFIIB, zesilovače transkripce - enhancery tlumiče transkripce - silencery

35 RNA SILENCING 90. léta shutting down genes (= SILENCERs) = tlumicí postranskripční geny (PTGS) houby, rostliny, živočichové 2001 sirna - krátké interferující duplexy z nukleotidů RNAi krátký, interferující RNA duplex Princip: malé úseky RNA sirna mohou umlčovat expresi genů (platí odhadem pro 1/3 lidských genů) = RNA interference, tj. proces sekvenčně specifického umlčování genů pomocí homologní dsrna dsrna vzniká přirozeně, např. při replikaci RNA virů Funkce v buňce: evolučně starobylý obranný mechanismus proti virům a transpozonům

36 EFEKT: degradace mrna, tj. ukončení genové aktivity knockdown efekt obvykle: ds DNA ss mrna translace s sirna: ds DNA ss mrna + komplementární sirna s nukleázou (RISC komplex) degradace mrna blokace translace Výhledově velké terapeutické využití: ovlivnění genetických chorob, kontrola virových infekcí: Specifická dsrna se dá se vyrobit in vitro a použít in vivo poprvé využití v PRAXI: spinocerebelární ataxie myší je vyvolávaná toxinem produkovaným mutovanou alelou genu SCA1, nemocná myš byla vyléčena umlčením mutovaného genu po podání specifické sirna

37 RNA - SILENCING dsrna DICER = specifická RNA endonukleáza sirna RISC (RNA induced silencing complex) = sirna + endonukleáza RISC degraduje mrna

38 3. regulace na úrovni postranskripčních modifikací - alternativní sestřih RNA (např. produkce IgM) 4. regulace na úrovni translokace - přechod mrna z jádra do cytoplazmy 5. regulace na úrovni translace - působení iniciačních translačních faktorů 6. postranslační regulace - modulace chemické modifikace proteinů - modulace proteolýzy PROTEASOMY - komplexy proteáz, které degradují bílkoviny (s pomocí ATP jako zdroje energie) molekulární značka - rozeznávající komplex specifických enzymů připojí k bílkovině v místě lyzinu malý protein - ubikvitin (terč pro proteasomy)

39 UBIKVITINACE proces degradace nepotřebných, nadbytečných, poškozených bílkovin v buňce princip: na bílkovinu, která má být zničena, je navázáno několik (min. 4 ) molekul UBIKVITINU a tím je cílová bílkovina předurčena k likvidaci v PROTEASOMU - probíhá aktivně (za spotřeby ATP), rychle, účinně a regulovaně UBIKVITIN je aktivován enzymem E1(UBA, ubikvitin aktivující) AKTIVOVANÝ UBIKVITIN je připojen enzymem E2 (UBC, ubikvitin konjugující) na cílovou bílkovinu enzym E3 (ubikvitin-ligáza) připojí min. další 3 ubikvitiny E1 1 typ E2 10 typů Degradace bílkoviny v PROTEAZOMU: - proteázy odštěpí ubikvitiny pro další použití - proteázy štěpí bílkoviny na krátké úseky AK pro další použití E3 stovky typů zajišťují specifitu PROTEASOMY u všech organismů UBIKVITINACE jen u eukaryot Existují další malé proteiny (např. SUMO proteiny) ovlivňující aktivitu cílových bílkovin (nezpůsobují ale degradaci), někdy soutěží o vazebná místa pro ubikvitin.

40 TRANSKRIPTOSOM multienzymový komplex zajišťující transkripci SPLICEOSOM multienzymový komplex zajišťující posttranskripční sestřih snrnp small nuclear ribonucleoprotein particles umožňují vystřižení intronu = ribozym - ribonukleáza P PROCESOM komplex v jádře zajišťující vyzrávání rrna

41 Geny mohou být exprimovány s různou účinností Espero Publishing, s.r.o.

42 Bakteriální a eukaryontní gen Espero Publishing, s.r.o.

43 Struktura dvou lidských genů ukazující uspořádání exonů a intronů Espero Publishing, s.r.o.

44 Alternativní sestřih α-tropomyosinového genu u krys Espero Publishing, s.r.o.

45 Souhrn procesů vedoucích od genu k proteinu Espero Publishing, s.r.o.