PATOFYZIOLOGIE GLIOVÝCH BUNĚK A NÁDORY MOZKU

Transkript

1 PATOFYZIOLOGIE GLIOVÝCH BUNĚK A NÁDORY MOZKU Typy gliových buněk - funkce astrocytů, NG2 gliových buněk, oligodendrocytů a mikroglií v CNS, úloha gliových buněk v průběhu patologických stavů CNS: reaktivní glióza a změny morfologie a exprese genů u gliových buněk; typy gliomů a jejich původ, regulace genové exprese u gliomů, membránové vlastnosti nádorových buněk, úloha glutamátu.

2 PATOFYZIOLOGIE GLIOVÝCH BUNĚK A NÁDORY MOZKU Ing. Miroslava Anděrová, CSc

3 Gliové buňky (neuroglia) CNS PNS Ependymové buňky Astrocyty Oligodendrocyty Mikroglie = Hortegovy glie NG2-gliové buňky Schwannovy buňky Gangliové (satelitní) buňky = amficyty

4 Funkce gliových buněk Astrocyty fibrilární astrocyty v bílé hmotě 300 mm protoplazmatické astrocyty v šedé hmotě hvězdicovité buňky s dlouhými výběžky. výběžky naléhají na stěnu kapiláry a dotýkají se neuronů 100 mm

5 Alexandrova choroba jediná známá primární astrogliopatologie Heterozygotní mutace GFAP genu GFAP tvoří cytoplasmatické inkluze Asociace se stressovými proteiny (beta-krystalin, heat shock proteiny) Opožděný vývoj Zvětšení (progresivní) - ruce Záchvaty Křeče Zmatenost Kognitivní Poruchy Hsiao et al., Journal of Cell Science 118,

6 Astrocyty Základní funkce astrocytů v CNS 1. vývoj -regulace neurogeneze a gliogeneze (NSCs) 2. strukturní -tvoří mikroarchitekturu nervového systému -tvoří syncytium 3. kontrolní -regulace extracelulárních koncentrací iontů -odstraňování neurotransmiterů z ECS - homeostáza vody v CNS -regulace ph 4. metabolická -energetické substráty pro neurony -odstraňování neuronálních metabolitů 5. signální -modulace synaptického přenosu -uvolňování neurotransmiterů -signalizace uvnitř syncytia 6. vaskulární - součást BBB -regulace mikrocirkulace v mozku

7 Cerebrální ischemia Globalní cerebrální ischemie: dochází k redukci průtoku krve v celém mozku, většinou způsobena zástavou srdeční činnosti Fokální ischemie: dochází k okluzi cévy krevní sraženinou (trombóza) redukce průtoku krve v určité oblasti mozku

8 Globální cerebrální ischemie Fokální ischemie-jádro Penumbra Rossi et al., Nat Neurosci 10 (11): ,2007

9 Astrocyty funkce v poškozené nervové tkáni Positivní funkce: vychytávání glutamátu vychytávání K + iontů a jejich redistribuce (K + -uptake, K + spatial buffering) energetická zásobárna pro neurony glykogen anaerobní metabolismus za hypoxických podmínek produkce laktátu, alaninu a a-ketoglutarátu odstraňování volných radikálů kyslíku -vysoké hladiny antioxidantů (askorbát, glutation) reaktivní astroglióza-chrání okolní tkáň Proliferace/neurogeneze sub-populace astrocytů-neurosféry Negativní funkce: zvětšování objemu astrocytů -cytotoxický + vasogenní edém uvolňování neurotransmiterů-glutamátu, ATP, taurinu.. Změny v extrasynaptickém přenosu v důsledku zmenšeného/zvětšeného ECS, morfologie astrocytů Spreading depression - šířící se deprese (opakující se depolarizační vlna doprovázená vysokými koncentrace K +, která se šíří od rozhraní nekrotické oblasti přes penumbru) Ca 2+ vlny propagace poraněné nervové tkáně reaktivní astroglióza brání migraci buněk do místa poškození, limituje prorůstání a regeneraci axonů v poškozeném CNS

10 Astrocyty -udržování fyziologických koncentrací glutamátu v extracelulárním prostoru odstraňování glutamátu transportéry EAAT1 (GLAST) a EAAT2 (GLT1) Na/K pumpa Na/Ca antiport glutamatový transportér 2-5 mm Na + 5 mm mm 1-10 mm Verkhratsky a Butt, Glial Neurobiology, 2007 Benesova et al., J. Neurosci, 2008

11 Obrácené fungování glutamátového transportéru v ischemii: glutamát je uvolňován do extracelulárního prostoru Astrocyty přispívají k dalšímu poškození nervové tkáně -excitotoxicita -depolarizace buněčných membrán -aktivace Na + a Ca 2+ iontových kanálů -akumulace Ca 2+ v cytoplasmě a mitochondriích -inhibice ATP syntézy v mitochondriích buněčná smrt Verkhratsky a Butt, Glial Neurobiology, 2007

12 Astrocyty -udržování fyziologických koncentrací K + iontů v extracelulárním prostoru a K + redistribuce Kotransportéry- NKCC1, KCC1 Na + /K + pumpa Fyziologické podmínky 2.5mM K + Neuronální aktivita mm Epilepsie mm K + Ischemie/SD mm K + Astrocytární Na + /K + pumpa Saturace mm K + Na/K/Cl kotransport +H 2 O zvětšování objemu astrocytů

13 Astrocyty -udržování fyziologických koncentrací K + iontů v extracelulárním prostoru a K + redistribuce - K + iontové kanály Fyziologické podmínky 2-2,5mM K + Zvýšená neuronální aktivita ~4.5 mm K + Epilepsie max 20 mm K + Ischemie ~70 mm K + Verkhratsky a Butt, Glial Neurobiology, 2007

14 Astrocyty objemové změny astrocytů vyvolané patologický stavy CNS Cytotoxický edém Zvětšení objemu buněk Gliové a endotelové buňky, HEB neporušena zmenšení extracelulárního prostoru Vasogenní edém Porušení HEB -aktivita matrix metaloproteináz makromolekuly do ECP zvětšení ECP

15 Následky zvětšování objemu astrocytů -redukce extracelulárního prostoru -snížený extrasynaptický přenos -zvýšení extracelulárních koncentrací K + a glutamátu -depolarizace neuronů -buněčná smrt neuronů, oligodendrocytů -stlačení cév-redukce průtoku krve -aktivace iontových kanálů, které reagují na změnu objemu buňky -další uvolnění glutamátu, ATP Ischemie Trauma Selhání jater Hyponatremie

16 Hypotonický stres Extracelulární [K + ] Depolarizace, aktivace Cl-kanálů, K+ akumulace Glutamát Acidifikace Cl- 1. Aktivace antiportu Na + /H + Cl - /HCO 3 - kotransport Na + /HCO 3-2. Inhibice K + kanálů,akumulace K +, inhibice RVD Kimelberg, 2005, Glia

17 Astrocyty redistribuce vody a regulace ECP AQP4 a Kir4.1 kolokalizovány na membráně astrocytů Glu, K+, CO2 Verkhratsky a Butt, Glial Neurobiology, 2007

18 Astrocyty Transport relativně velkých molecul, až 1kDa uvolňování neurotransmiterů do extracelulárního prostoru - glutamát, aspartát, taurin, ATP -reverzně fungující transportéry (i u oligodendrocytů) v důsledku zvýšených intracelulárních koncentrací Na + a neurotransmiteru, + depolarizace (K + ) Verkhratsky a Butt, Glial Neurobiology, aniontové kanály aktivované změnami objemu - Cl - Regulatory Volume -konexony hemichannels decrease -ionotropní purinergní receptory -P2X 7 -exocytóza v důsledku zvýšené koncentrace Ca 2+ odlišná schopnost astrocytů regulovat objem závisí i na intracelulární obsahu taurinu

19 Astrocyty -anaerobní metabolismus za hypoxických podmínek Verkhratsky a Butt, Glial Neurobiology, 2007

20 Astrocyty Ca 2+ vlny = propagace poraněné nervové tkáně Parpura a Haydon, Astrocytes in Pathophysiology of CNS, 2009 Verkhratsky a Butt, Glial Neurobiology, 2007

21

22 Astrocyty anisomorfní astroglióza hypertrofované astrocyty proliferace permanentní gliální jizva produkce chondoitinu a keratinu inhibice regenerace axonů astroglióza isomorfní astroglióza růstové faktory (NGF, FGF, cytokiny, Shh) -proteiny extracelulární matrix -adhézní molekuly -podpora neuron-astrocyt interakcí -podpora růstu axonů, synaptogeneze Anderova et al., 2004, Glia

23 Astrocyty Morfologie astrocytů a exprese GFAP zvýšená exprese GFAP

24 Hipokampus potkana - GCI

25 Hipokampus potkana - GCI

26 Astrocyty Reaktivní astrocyty vykazují charakteristiky NSC -exprimují markery radiálních glií-vimentin -v přítomnosti NGF a bfgf neurosféry -diferenciace v neurony a oligodendrocyty Anderova et al., Glia, 2009 Buffo et al., PNAS, 2007

27 Apoptóza

28 Apoptóza

29 Časově závislé změny v počtu buněk CA1 oblasti hipokampu po GCI

30 Proliferace-mikroglie, NG2 glie a astrocyty

31 Alzheimerova choroba Astrocyty detekují beta-amyloid uvolňovaný neurony, odtažení astrocytárních výběžků od neuronů Degenerace nervových zakončení v blízkosti atrofovaných astrocytů Astrocyty akumulují beta-amyloid Odumírání neuronů a astrocytů, Aktivace mikroglií, reaktivní astrocyty- plaky Verkhratsky a Butt, Glial Neurobiology, 2007

32 Epilepsie Vápníková vlna může vyvolat synchronizované uvolňování glutamátu Synchronizovaná depolarizace neuronů = epileptický záchvat

33 Funkce gliových buněk Mikroglie tvoří imunitní systém mozku 10% z gliových buněk monocytomakrofágového původu schopnost fagocytovat klidový stav aktivovaná-reaktivní

34 Mikroglie Klidová mikroglie = buňka neustále kontrolující ECS nahodilý pohyb výběžků ( mm/min), jejich prodlužováním a zkracováním kontroluje oblast CNS v průběhu několika hodin aktivace: Signál-ATP uvolněné z astrocytů -purinergní receptory na mikrogliích Up-regulace K + kanálů-kir, vně usměrněné Aktivace GLT-1 synaptic stripping selektivní odstranění glutamergních synapsí Produkce cytokinů a chemokinů- NGF, BDNF, NT-3, NT-4 Produkce imunokompetentních molekul- ILs, TNFa, TGFb (kontrola imunitní odpovědi) Verkhratsky a Butt, Glial Neurobiology, 2007 TGFb astroglióza

35 Aktivace mikroglií Astrocyty, neurony ATP, cytokiny klidová mikroglie Aktivovaná-reaktivní mikroglie proliferace, migrace, transformace ve fagocyty, buněčná smrt

36 Aktivace mikroglií-gci

37 Mikroglie Rozsah poranění určuje rozsah morfologických změn a produkce cytokinů Charakter poranění, intenzita a trvání stimulu ovlivňují produkci cytokinů

38 Funkce gliových buněk Oligodendrocyty obklopují výběžky neuronů vytvářejí myelinové pochvy axonů v PNS jsou obdobou Schwanovy buňky NG2 MBP O4

39 Oligodendrocyty Mechanismy vedoucí k poškození oligodendrocytů Corpus callosum Karadottir et al., 2005 Nature Frühbeis et al., Frontiers in Cell Neurosci (7), 182, 2013

40 Oligodendrocyty Wallerova regenerace: tělo buňky reaguje na oddělení axonu produkcí stavebních proteinů, nový axon roste rychlostí cca 1 mm/den a snaží se spojit s původními efektory nebo receptory, poté dochází k tvorbě myelinových pochev a funkční regeneraci-pns Myelinizovaný axon Transekce a degenerace axonu Schwanovy buňky dediferencují Fragmentace myelinu Makrofágy odstraňují poškozené buňky Bazální lamina Schwanových buněk intaktní Regenerace axon prorůstá do trubice bazální laminy Schwanovy buňky produkce faktorů Reinervace axon regeneruje a inervuje svaly Schwanovy buňky myelinizují axon Verkhratsky a Butt, Glial Neurobiology, 2007

41 Oligodendrocyty Wallerova degenerace- po přerušení axonu dochází k odloučení od buněčného těla a k degeneraci jeho distálního pahýlu CNS x PNS Myelinizovaný axon Dezintegrace a fragmentace myelinu Aktivace mikroglií, astrocytů a NG2 glií Makrofágy-odstranění buněč. debris Permanentní gliální jizva Verkhratsky a Butt, Glial Neurobiology, 2007

42 Demyelinizační onemocnění Vanishing white matter disease ve věku 2-6 let, ztráta myelinu, degenerace bílé hmoty mozkové, cystická BH, kolem cyst ztráta oligodendrocytů, abnormální morfologie oligodendrocytů Roztroušená skleróza autoimunitní zánětlivé demyelinizační onemocnění CNS -primárně progresivní-smrt oligodendrocytů, neurodegenerace, zanět, bez relapsů, bez remyelinizace OPC,

43 Polydendrocyty a jejich funkce v CNS CNS PNS Ependymové buňky Astrocyty Oligodendrocyty Mikroglie = Hortegovy glie NG2-gliové buňky Schwannovy buňky Gangliové (satelitní) buňky = amficyty

44 Polydendrocyty 5-8 % gliových buněk NG2-gliové buňky Neuron-Glia Synantocyty-(kontakt) GluR gliové buňky Prekurzory oligodendrocytů Polydendrocyty NG2 = chondroitin sulfát proteoglykan 4 α receptor růstového faktoru produkt krevních destiček PDGF AA přežívání Proliferace migrace Komitova et al., 2009 J Comp Neurol

45 Polydendrocyty exprimují S100β, transcripční faktor Olig2 a APC Komitova et al., 2009 J Comp Neurol

46 Polydendrocyty-vývoj proliferující progenitorová buňka proliferující polydendrocyt Nishiyama et al., 2009, Nature Reviews/Neuroscience

47 Membránové vlastnosti polydendrocytů Vm ~ mv IR ~ Mohms +20mV -160mV oligodendrocyt -70mV astrocyt neuron NG2+ Olig2+ S100β- Exprese Na +, K +, Ca 2+ kanálů Glutamátové a GABA receptory Glutamátové transportéry GFAP 2 typy polydendrocytů NG2+ Olig2+ S100β+ Karadottir et al., Nature Neurosci, 2008

48 Polydendrocyty aktivně komunikují s neurony a gliovými buňkami Tvoří synapse s neuronypresynaptické zakončení, postsynaptické zakončení, NG2 glia a astrocyty Glutamát, ATP... Ranvierovy zářezy NG2 glie kontaktují Ranvierovy zářezy (propagace akčního potenciálu) -příma signalizace mezi neurony a NG2 gliovými buňkami -exocytóza- uvolnění glutamátu-aktivace AMPA R (depolarizace, Ca2+ increase) proliferace/diferenciace uvolnění růstových faktorů Nishiyama et al., 2009, Nature Reviews/Neuroscience

49 Polydendrocyty a jejich úloha v ischemickém poškození mozku 2 modely ischemického poškození mozku -globální cerebrální ischemie -fokální cerebrální ischemie Morfologické změny polydendrocytů Membránové vlastnosti polydendrocytů Proliferace polydendrocytů v ischemicky poškozené nervové tkáni Diferenciační potenciál polydendrocytů in vivo po ischemickém poškození mozku

50 Zvýšená proliferace gliových buněk po GCI Anderova et al., 2011, JCBFM

51 Proliferace-polydendrocyty a astrocyty Anderova et al., 2011, JCBFM

52 Proliferace a membránové vlastnosti polydendrocytů Vm, IR, proudova hustota KA current density (pa/pf) kontrola 6H 1D 3D

53 3D morfometrie - morfologické změny polydendrocytů A B C Alexa-Fluor-hydrazide 594- labeled astrocyte Confocal sectioning Confocal plane used for area calculation 0.12mm Benesova et al., J Neurosci Res, 2009

54 mm V (V, V ) 10 3 Změny morfologie NG2-glií po GCI processes soma ** 4 ** ** V V s V p ** 0 V processes /V (V soma /V) % (n=12) (n=14) (n=5) * V /V s V /V p control 3 days 1 month * Anderova et al., 2011, JCBFM

55 Globální cerebrální ischemie má za následek zvýšenou proliferaci polydendrocytů 3-7 den po GCI počet polydendrocytů ani oligodendrocytů v hipokampu po ischemickém poškození nestoupá počet astrocytů významně vzrůstá, i přestože proliferace astrocytů je nízká

56 Proliferace/diferenciace polydendrocytů in situ (P4) NG2 glie, oligodendrocyty Zhu et al., 2011, Development symetrické dělení -vznik 2 NG2 glií asymetrické dělení -vznik 1 NG2 gliea 1 oligodendrocytu symetrické dělení -vznik 2 oligodendrocytů

57 Zhu et al., 2011, Development Polydendrocyty dávají vznik subpopulaci astrocytů NG2creER :ZEG P14 Indukce Cre E16.5

58 Polydendrocyty heterogenní populace NG2 glia in GM NG2 glia in WM Astrocyty, Polydendrocyty, Neurony? Oligodendrocyty Polydendrocyty

59 Middle Cerebral Artery Occlusion triphenyltetrazolium chlorid

60 Vizualizace polydendrocytů: NG2CreBAC:ZEG Cre recombináza exprimovaná v polydendrocytech (NG2 gliích) indukuje permanentní expresi EGFP

61 EGFP pozitivní polydendrocyty Honsa et al., 2012, PlosOne

62 Fokální cerebrální ischemie

63 Zvýšená proliferace polydendrocytů 3 dny po FCI

64 Zvýšená proliferace polydendrocytů po FCI

65 Polydendrocyty dávají vznik i astrocytům a neuronům 7-14 dní po FCI

66 Polydendrocyty dávají vznik i astrocytům a neuronům 7-14 dní po FCI

67 Membránové vlastnosti EGFP+ buněk v nepoškozené nervové tkáni

68 Membránové vlastnosti EGFP+ buněk po FCI

69

70 Gliomy - původ gliální progenitorové buňky neurální kmenové buňky ependymové buňky astrocyty, polydendrocyty (zvýšená proliferace po poranění)

71 Heterogeneita gliomů -OPC -heterogenní populace -nedávno objevená populace buněk NSC NPC Neuroblasty Přechodové stavy Různé subpopulace reaktivních astrocytů -distální, proximální -vlastnosti NSC -heterogeneita astrocytů obecně Oblast mozku, aktivované signalizační dráhy EGF, PDGFalpha, Wnt Siebzehnrubl et al., GLIA 59: (2011)

72 Klasifikace gliomů World Health Organization Z klinického hlediska - dle malignity, 4 stupně (I-IV) stupeň I - benigní tumory (pilocystický astrocytom) stupeň II-IV maligní tumory, které se liší svou agresivitou Louis et al., Am J Pathol September; 159(3): Z histopatologického hlediska astrocytomy, oligoastrocytomy, oligodendrogliomy, glioblastomy

73 Limitace pro růst gliomů -nedostatečný prostor -extracelulární prostor ~20% z celkového objemu nervové tkáně -pevné hranice pro růst - CNS je ohraničen pevnou schránkou (lebka, míšní kanál) -nemetastázující Maligní gliomy si kolem sebe aktivně vytvářejí prostor Migrují podél axonů a cév

74 Gliomové buňky uvolňují glutamát do ECP NMDA a Ca 2+ Mikrodialýza - Grade IV GBM indukovaná neuronální smrt v blízkosti tumoru 2 cm od tumoru prostor pro další růst gliomu Electroneutrální transportér aminokyselin GSH-tripeptid složený z aminokyselin kyseliny glutamové, cysteinu a glycinu ochrana před oxydačním stresem DeGroot and Sontheimer 2011, Glia 59(8):1181-9

75 Glutamát uvolněný nádorovou buňkou ovlivňuje nejen neurony, ale i funkci okolních gliových buněk Glutamin produkovaný astrocyty transportován do tumorových buněk, konverze na glutamát Glutamátové receptory u astrocytů a oligodendrocytů Na +, Ca 2+ apoptóza Jeffrey D. Rothstein & Henry Brem, Nature Medicine 7, (2001)

76 Migrace gliomů Zvýšená exprese metaloproteináz MMP2, 9 štěpení molekul ECM, snazší migrace anti-mmp-2 sirna - apoptóza gliomových buněk inhibice MMP-2 - autofagocytóza gliomových buněk Zmenšení objemu gliomových buněk protáhlý tvar, snazší migrace v parenchymu McFerrin and Sontheimer, Neuron Glia Biol Feb;2(1): Blokátory ClC3 zamezují expanzi gliomu ukončena 2. fáze klinického výzkumu, zahájen Trial III Zvýšené oscilace intracelulárního Ca 2+ v důsledku aktivace AMPAR Inhibice AMPAR omezuje šíření a růst nádoru

77 Významné membránové proteiny z hlediska nádorových onemocnění Arcangeli and Becchetti, Pharmaceuticals 2010, 3, ; New Trends in Cancer Therapy: Targeting Ion Channels and Transporters

78 Nádorové buňky v mozku migrují podél cév a axonů odstraňují endfeet astrocytů RECA/GFAP/C6-GFP gliomové buňky C6 transplantované do striata neonatálních (2D) potkanů Farin et al., GLIA 53: (2006)

79 Mikroglie a glioblastomy nádorové buňky přetváří obranné systémy mozku expanze nádoru GBM GBM linie -až 30% nádoru tvoří mikroglie -produkce MT1-MMP nebo MMP14 -MT1-MMP max. aktivuje MMP2 gliomů usnadňují expanzi nádoru GMB produkuje CCL2 (Macrophage chemoattractant protein-2), CC Receptor na mikrogliích Tissue and Imaging Core Joanna Phillips, Tracy Richmond McKnight, Cynthia Cowdrey Zhang et al., Carcinogenesis vol.33 no.2 pp , 2012

80 Děkuji za pozornost