Mikroskopická analýza změn translačního aparátu vyvolaných působením nanočástic nzvi v kvasince S.cerevisiae

Transkript

1 Seznam sekcí a složení komisí ústav 319 Komise: Předseda: Členové: Soutěžící: (přednášková) A12, 9:00 prof. Ing. Pavel Dostálek, CSc. doc. Ing. Martin Halecký, PhD Dr. Ing. Leona Paulová Bc. Dominik Eisner () Bc. Lucia Kořínková () Anna Kultová (B3) Bc. Romana Lokajová () Bc. Jana Novotná () Bc. Tomáš Potočár () Bc. Jan Prchal (M1) Bc. Kristýna Šinovská () Bc. Daniela Toulcová () Bc. Natallia Yeudakimenka () Mikroskopická analýza změn translačního aparátu vyvolaných působením nanočástic nzvi v kvasince S.cerevisiae Bc. Dominik Eisner prof. Ing. Alena Čejková, CSc. Nanotechnologie představují v současné době významné, rychle se rozvíjející odvětví. Nanočástice se díky relativně snadné přípravě, manipulaci a vysoké reaktivitě dají využít v různých oborech, například v medicíně, kosmetice nebo v remediačních technologiích, kde jsou zejména využívány nanočástice elementárního železa (nzvi). NZVI jsou charakterizovány unikátními vlastnostmi a mají schopnost různými, doposud ne zcela objasněnými mechanismy ovlivňovat biologické systémy. Vzhledem k jejich aplikacím přímo v životním prostředí je nutné se interakcemi s biologickými systémy zabývat. Cílem mé práce bylo studium vlivu a mechanismu účinku nanočástic Fe 0 na morfologii kvasinky Saccharomyces cerevisiae. Zabýval jsem se mikroskopickou analýzou, při které bylo využito geneticky modifikovaných kmenů kvasinky S. cerevisiae. Tyto kmeny produkují různé fluorescenčně značené fúzní proteiny přímo z chromozómu. Se znalostí chování těchto proteinů vlivem standardních stresových faktorů, lze hodnotit známky oxidativního stresu u živých, nefixovaných buněk vlivem nzvi. Zároveň byly pomocí rhodaminu označeny samy nanočástice Fe 0 a sledovala se jejich schopnost pronikat do cytoplazmy S. cerevisiae. Tato informace je zásadní k objasnění mechanismu účinku nzvi na buněčnou populaci.

2 Vysoká škola chemicko-technologická v Praze Příprava lidských buněčných linií s fluorescenčními reportéry aktivace vybraných transkripčních faktorů Bc. Lucia Kořínková Dr. Ing. Michaela Rumlová Celá řada velmi závažných onemocnění je spojena s poruchami v signálních drahách, regulujících aktivaci určitých transkripčních faktorů. Mezi takovéto transkripční faktory patří nukleární faktor kappa B (NFκB) a protein p53. NFkB je v buňkách imunitního systému hlavním transkripčním faktorem, regulující expresi genů spojených s odezvou organismu na zánět, infekci a jiné stresové stimuly. Protein p53, neboli tumor supresor je transkripční faktor zodpovědný za regulaci stovky genů podílejících se na zabránění karcinogeneze a s ní propojenou angiogenezi. Hlavním cílem této práce je připravit buněčný nástroj, pomocí kterého bychom mohli testovat látky, modulující aktivaci těchto dvou transkripčních faktorů. Pro tyto účely byly připraveny reportérové vektory nesoucí p53 a NFkB cílové úseky, řídící expresi reportérového zeleného fluorescenčního proteinu (GFP). Funkčnost připravených reportérových vektorů byla ověřena transientní transfekcí lidských embryonálních ledvinových buněk (HEK-293) příslušnými vektory s následnou kvantifikací aktivace NFkB a p53, vyvolanou vybranými indukčními činidly. V současné době jsou připravovány buněčné linie stabilně transfekované těmito reportérovými vektory, které bude možno využít pro testování různých látek s potenciální aktivitou inhibovat či aktivovat transkripční faktory. In vitro studium vlivu mutací bazické domény nukleokapsidového proteinu Mason-Pfizerova opičího viru na vazbu nukleových kyselin. Anna Kultová B3 ústav Biotechnologie Dr. Ing. Michaela Rumlová, Ing. Filip Kaufman Retroviry jsou obalené viry, jejichž genom je uložen ve formě jednovláknové RNA. Tyto viry jsou schopné pomocí reverzní transkriptázy přepsat svou vlastní genetickou informaci do DNA a tu následně inkorporovat do genomu hostitelské buňky. Životní cyklus retrovirů má dva kritické body, a to je tvorba nezralé a zralé infekční částice. Tyto částice vznikají díky vzájemným interakcím mezi kapsidovými proteiny a dále interakcemi mezi nukleokapsidovým proteinem a virovou genomovou RNA. Zablokování těchto interakcí vedoucích k vytvoření nezralých či zralých částic vede k potlačení virové infekce, a proto je proces skládání retrovirových částic jedním z cílů pro vývoj nových anti-retrovirových terapeutik. Cílem této práce je studium role bazické oblasti (KNKEK) nukleokapsidového proteinu (NC) Mason- Pfitzerova opičího viru (M-PMV) při interakci s nukleovou kyselinou. Bazická KNKEK oblast se nachází v N-koncové části NC v těsné blízkosti zinkových prstů, které jsou zodpovědné za interakci s virovou genomovou RNA. Byla navržena série mutací v KNKEK oblasti NC a tyto mutace byly naklonovány do bakteriálních expresních vektorů. Tyto konstrukty byly použity pro expresi příslušných NC proteinů v E. coli BL21(DE3) a mutantní proteiny byly purifikovány. Pomocí metody EMSA (electrophoretic mobility shift assay) bude analyzována a porovnávána schopnost vázat nukleovou kyselinu jak divokým typem, tak i mutantními formami NC.

3 Sekcia: Využitie poľnohospodárskych odpadov pre biotechnologickú produkciu biopalív Školiteľ: Bc. Romana Lokajová Ing. Barbora Branská, Ph.D Hlavným cieľom experimentu bolo využitie poľnohospodárskych odpadov ako náhrada komplexného média pre produkciu biobutanolu baktériami rodu Clostridium. Zdroj uhlíka a energie poskytovala odpadová slama a alkalický hydrolyzát kuracieho peria nahrádzal zdroj dusíka v podobe aminokyselín a peptidov. Najskôr sme optimalizovali prípravu hydrolyzátu kuracieho peria v teplotnom rozmedzí ( C) pri rôznych koncentráciách KOH. Na základe screeningových testov rastu E. Coli na vybraných hydrolyzátoch kuracieho peria sme stanovili vhodné podmienky: teplotu 70 C a koncentráciu 0,6% KOH. V ďalšom kroku bola testovaná spoločná hydrolýza slamy a peria, získaný hydrolyzát bol využitý k fermentačnej produkcii biobutanolu pri troch rôznych stratégiách kultivácie, konkrétne: oddelená sacharifikácia a fermentácia (SHF), simultánna sacharifikácia a fermentácia (SSF) a simultánna sacharifikácia s oneskorenou inokuláciou (dssf). Následne bol testovaný vplyv vstupného ph kultivačného média na produkčné parametre pre kmene Clostridium pasteurianum a Clostridium beijerinckii. Najnižšiu koncentráciu biobutanolu 0,4 g/l produkoval kmeň C. pasteurianum pri ph hodnolte 5,5 a najvyššiu koncentráciu 4,4 g/l preukázal kmeň C. beijerinckii pri ph 6 počas SHF. Antimikrobiální účinky nanočástic a jejich vliv na růstové a biochemické vlastnosti potenciálně patogenních mikroorganismů Bc. Jana Novotná Prof. Ing. Alena Čejková, CSc. Mikrobiální rezistence vůči běžně používaným antimikrobiálním látkám v současnosti představuje stále větší problém, především z medicínského a společenského hlediska. Stále zvětšující se počet rezistentních mikroorganismů dává podnět k vývoji stále nových preparátů. V této souvislosti je předmětem současného výzkumu studium aplikace nanočástic na bázi kovů, jako alternativy běžných antibiotik. Jejich jedinečnost spočívá především ve specifické velikosti a reaktivitě, díky čemuž jsou schopny ovlivnit životaschopnost exponované buňky na několika klíčových místech současně. Aplikace nanočástic na bázi kovů by tak díky komplexnímu mechanismu účinku mohla významně snížit vznik mikrobiální rezistence, která představuje proces vývoje a adaptace mikroorganismů v reakci na selektivní tlak určité látky. Cílem předkládané práce je studium antimikrobiálních účinků nanočástic stříbra, zlata a platiny vůči modelovým potenciálně patogenním mikroorganismům. Obsahem práce je nejen zaměření se na studium viability exponovaných buněk, ale také na některé aspekty přítomnosti oxidativního stresu, který je považován za jeden z klíčových mechanismů působení kovových nanočástic.

4 Kultivace mořských mikroorganismů produkujících biologicky aktivní látky Bc. Tomáš Potočár doc. Ing. Tomáš Brányik, Ph.D.; Mgr. Zuzana Ježková Mořský ekosystém je v současné době stále málo probádaný systém s predikcí mnoha biotechnologicky využitelných mikroorganismů. Tyto mikroorganismy by mohly být nositeli unikátních metabolických drah produkujících látky pro farmaceutický průmysl. Jedním z cílů realizovaných experimentů bylo zjistit vhodný zdroj uhlíku pro růst mořského mikroorganismu Salinispora tropica, spadající do řádu Actinomycetales. Experimenty byly hodnoceny vzhledem k maximální dosažené koncentraci biomasy s výpočtem konverze substrátu v biomasu. Vhodnost uhlíkového substrátu byla ověřena v laboratorních bioreaktorech po stanovení optimální frekvence míchání. Dalším cílem experimentů byla optimalizace metody stanovení celkových karotenoidních pigmentů přizpůsobením metody extrakce chlorofylu z mikroorganismu Chlorella vulgaris. Výsledný extrakt celkových karotenoidů byl posléze testován pro stanovení potlačení aktivity reaktivních kyslíkových částic. Užity byly tkáňové kultury buněk LnCap a HepG2. Obohacování chmelového materiálu biologicky aktivními prenylovanými flavonoidy Bc. Jan Prchal M1 Ing. Marcel Karabín, Ph.D. Pozitivní účinky prenylovaných flavonoidů na lidské zdraví byly v minulosti již mnohokrát potvrzeny. Do této skupiny se také řadí 8-prenylnaringenin, v současné době jeden z nejúčinnějších fytoestrogenů, zmírňující průběh klimakteria, který by se v budoucnu mohl stát doplňkem běžné hormonální léčby těchto problémů. V současné době jsou komerčně dostupné doplňky stravy, přičemž surovinou pro jejich výrobu je chmelový materiál - odpadní produkt výroby chmelových extraktů. Obsah prenylflavonoidů v tomto materiálu je však značně proměnlivý, a je tedy obtížné zajistit definovaný obsah účinné látky v produktu. Cílem této práce je vyvinutí jednoduché metody mechanické frakcionace chmelového materiálu, která by v kombinaci s izomerací prenylovaných flavonoidů suchou cestou vedla k produkci materiálu bohatého na 8-prenylnaringenin, jehož množství by bylo co nejméně závislé na obsahu prenylflavonoidů v původním materiálu.

5 Biologická produkce pigmentů houbou Monascus purpureus Bc. Kristýna Šinovská doc. Dr. Ing. Petra Patáková; Ing. Matěj Patrovský Plíseň Monascus purpureus je známá po staletí především v Asii díky jejímu využití při produkci červené fermentované rýže, zvané červené koji, anka, ankak nebo beni-koji. Současně je využívána jako producent červených pigmentů, které jsou používány v potravinářství jako přírodní barvivo. V poslední době je však zkoumána také díky svým pozitivním účinkům na lidské zdraví. Za tyto účinky jsou zodpovědné pigmenty (červené, oranžové, žluté) a řada dalších metabolitů. Cílem mé práce bylo kultivovat plíseň Monascus purpureus submerzně v třepaných baňkách a zjistit, jaké kultivační médium a jaké podmínky během kultivace přispívají k nejvyšší produkci pigmentů. V kultivačních médiích byl obměňován zdroj dusíku (NaNO 3, (NH 4) 2SO 4 a pepton), zdroj uhlíku (glukosa, škrob) a počáteční hodnota ph (2,5; 5,5; 6,5; 8,0). Současně byla vyzkoušena i kultivace v netřepaných baňkách. Při kultivaci bylo také zkoumáno, jak je množství produkovaných pigmentů ovlivněno délkou kultivace. Z pigmentů získaných extrakcí mycelia byly následně pomocí HPLC separovány čisté pigmenty pro přípravu standardů. U čistých pigmentů budou v dalších pracích zkoumány jejich mutagenní a antimikrobiální účinky. Altruistická metadynamika Bc. Daniela Toulcová Ústav biochemie a mikrobiologie doc. Ing. Vojtěch Spiwok Ph.D. Pomocí molekulového modelování můžeme zkoumat molekulární systém a jeho prostorové změny. Simulace molekulové dynamiky umožňuje výpočet plochy volné energie, která nám vytvoří představu o konformačních změnách molekulárního systému. Simulace složitějších molekulárních struktur však stále skýtají mnohá omezení. Za účelem snížením výpočetního času jsme vyvinuli novou metodu simulace, která umožňuje studovat více strukturně podobných systémů najednou. Metoda byla nazvána Altruistická metadynamika (AM) a je založena na využití metadynamiky, metody urychleného vzorkování, která pomocí přidávaného potenciálu rychleji prohledává plochu volné energie. AM spouští simulace paralelně, přičemž je přidávaný potenciál simulacemi vzájemně sdílen. Metoda byla aplikována na modelových systémech alanin-dipeptid a sada monosacharidů. Bylo prokázáno, že AM poskytuje dobré odhady ploch volných energií, které jsou srovnatelné s plochami získanými konvenční metodou. Metoda zkracuje výpočetní čas a zpřesňuje odhady ploch volných energií molekul. Využití AM je cíleno na farmaceutické predikce interakce protein-ligand, lze například simulovat interakci proteinu s více potencionálními léčivy najednou.

6 Vývoj chromatografické metody pro efektivní charakterizaci distribuce molekulové hmotnosti ligninu Bc. Natallia Yeudakimenka prof. Ing. Jan Páca, DrSc.; doc. Ing. Martin Halecký, Ph.D. Lignin je třetí nejvíce zastoupený biopolymer na planetě. Degradací ligninu je možné získat obrovské množství různých monomerů, dimerů a oligomerů, a proto můžeme považovat lignin za potenciálně velmi cenný biologicky obnovitelný zdroj. Abychom ho mohli výhodně používat, je zapotřebí rozsáhlá analytická metoda pro posouzení efektivity degradace ligninu, která zatím neexistuje. Hlavním cílem provedené práce byla optimizace podmínek chromatografické analýzy a optimizace hmotnostní spektrometrie jako hlavního způsobu stanovení. Je známo, že gelová chromatografie, která se používá pro stanovení molekulové hmotnosti, je silně ovlivněná specifickými sekundárními interakcemi. Vyhodnotili jsme separační účinnost ligninu gelovou filtrační a gelovou permeační chromatografii. Separace gelovou filtrační kolonou a některými gelovými permeačními kolonámi byla silně ovlivněna funkčními skupinami analytů. Nakonec byla nalezena separční kololona, která vykazovala nejpřesnější oddělení ligninu na základě molekulové hmotnosti s minimálím vlivem sekundárních interakcí. Čtyři sady komerčně dostupných standardů polymerů a 17 standardů monomerů a dimerů ligninu byly použity pro kalibraci chromatografických kolon.