MS analyzátory - I. Příprava předmětu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253

Transkript

1 MS analyzátory - I Příprava předmětu byla podpořena projektem OPPA č. CZ..17/3.1.00/3353

2 Hmotnostní spektrometr Zařízení umožňující generovat ionty, separovat je podle jejich m/z a detekovat je, lze obvykle označit jako hmotnostní spektrometr Hmotnostní spektrometr sestává z: iontového zdroje hmotnostního analyzátoru detektoru

3 Schéma hmotnostního spektrometru

4 Analyzátory Společné charakteristiky: Látka musí být ionizována, pouze nabité látky jsou analyzovány Vždy je měřeno m/z Vlastní separace iontů probíhá v plynné fázi za velmi nízkého tlaku

5 Kvadrupolární analyzátory Jednoduché kvadrupóly (Single Quad) Iontové pasti - D (lineární past), 3D (IT) Průletové analyzátory, Time-of-Flight (TOF) Sektorové systémy Iontová cyklotronová rezonance s FT (FT-ICR) Orbitrap s FT Tandemové systémy - trojité kvadrupóly (Triple Quad) Hybridní systémy, např. kvadrupól + TOF (Q-TOF)

6 Kvadrupólový analyzátor typu jednoduchého kvadrupólu (Quadrupole Mass Analyzer, Single Quad) Velmi rozšířený typ analyzátoru Čtyři paralelní tyče kruhového nebo ideálně hyperbolického průřezu pevně fixované kolem centrální osy Energie vstupujících iontů jsou malé 5-10 ev Aplikací přesně definovaného DC a RF (oscilujícího elektrického pole) na protější páry tyčí je tvořen tzv. mass filter, jenom ionty určitého poměru m/z projdou analyzátorem do detektoru iontů Princip kvadrupólu popsal Paul a Steinwegen v roce 1953 (Bonn), navazovali na práci Christophilose studujícího fokusaci iontů (Atény), kvadrupól komercializovali Shoulders, Finnigan a Story

7

8 Pracovní režimy kvadrupólu a) Skenovací režim postupné skenování iontů různých hodnot m/z b) Výběr a propuštění jen iontů určité hodnoty m/z c) Fukusace všech iontů v širokém rozmezí hodnot m/z

9 a) Skenovací režim kvadrupólu

10

11 Při skenování kvadriupólu se zachovává poměr mezi U a V, U/V je tedy po celou dobu skenu konstantní

12

13 Ionty pohybující se v ose z jsou ovlivňovány celkovým na tyče vloženým elektrickým polem tvořeným dvěma složkami: a) kvadrupolárním proměnným polem superponovaným na b) konstantní elektrické pole Φ 0 = + ( U-V cosωt) a = ( U-V cosωt ) Φ 0 Φ 0 je potenciál aplikovaný na tyče, ω je angulární frekvence (v rad s -1 ), ω=πν, ν je radio frekvence (RF), U je stejnosměrná složka potenciálu, V je amplituda proměnné složky

14 Ionty pohybující se v ose z vstupují do prostředí, kde jim je uděleno zrychlení ve směru osy x a y, které je vyvoláno přítomným elektrickým polem: F F x y = = d x m dt d y m dt δφ = ze δx δφ = ze δy kde Φ je funkcí Φ 0 : Φ )/ ( x,y ) = Φ 0 + ( x - y ) / r0 = ( x - y )( U -V cos ωt r0 derivováním a úpravou lze odvodit následující vztahy: d x dt d y dt ze + ( U-V mr 0 ze ( U-V mr 0 cosωt) = 0 cosωt) = 0

15 trajektorie iontu bude stabilní jen tehdy, pokud x a y nikdy nedosáhne hodnoty r 0, tedy pokud iont nedopadne na tyč kvadrupólu pro zjištění souřadnic x a y v závislosti na čase t je třeba dvě posledně uvedené rovnice integrovat podobný matematický problém úspěšně vyřešil již v roce 1866 matematik Mathieu při popisu šíření vln v membránách: d u dξ + ( a u cosξ ) u q u = 0 následující substituce proměnných umožňuje popsat pohybové rovnice ve formě rovnice podle Mathieu: ωt 8zeU 4zeV ξ =, a = a = a =, q = q = q = u x y u x y mω r mω r 0 0

16 výsledkem řešení (integrace rovnic) je popis koordinát iontu v čase pro daný kvadrupól je r 0 konstaní, frekvence ω=πν je také konstantní, U a V jsou proměnné oblast stabilní trajektorie určitého iontu může být reprezentována ve formě a u -q u diagramu, v takto vymezené stabilní oblasti jsou hodnoty U a V takové, že x ani y nedosáhne hodnoty rovné nebo větší než r 0 Oblasti stability pro iont určité hodnoty m/z oblast užívaná u komerčních instrumentů Stabilitní diagram pro kvadrupól

17 detailed view

18 stabilní trajektorie iontů Změna sklonu operační linie umožňuje ovlivnit rozlišení a citlivost

19 r m zev q, r m zeu a u u ω ω = = e r z m q, e r z m a U u u ω ω = V = vztahy: lze přepasat do formy: stabilní oblast pro iont m 1 /z operační linie

20 Sken v rozsahu např amu trvá obvykle několik stovek milisekund, tato poměrně dlouhá doba je nutná pro dosažení rozumné citlivosti (good ion statistics) Rozlišení bývá standardně tzv. jednotkové, to znamená, že šířka píků v MS spektru je kolem 0,7 amu a to přes celý rozsah měřených hodnot m/z, tj. tzv. resolution power není konstatní v tomto rozsahu m/z; v případě kvadrupólových analyzátorů se většinou rozlišení definuje právě šířkou píku v polovině výšky (FWHM-full width half mass) a ne pomocí resolution power Nároky na hloubku vákua jsou u kvadrupólových analyzátorů podstatně menší než u analyzátorů magmetických, TOF a orbitrap; transmisní kvadrupól vyžaduje vakuum na úrovni ~ 10-4 Pa

21 b) Výběr a propuštění jen iontů určité hodnoty m/z aplikace přesně definované amplitudy RF spolu s určitým DC potenciálem SIM mod vysoce citlivý narozdíl od skenovacího, tzv. TIC modu SIM single ion monitoring TIC total ion current v SIM modu prochází kvadrupólem jen ionty vybrané hodnoty m/z, ostatní ionty mají nestabilní trajektorii

22 c) Fukusace všech iontů v širokém rozmezí hodnot m/z => provádí se aplikací pouze RF složky, DC složka je nulová výsledkem fokusace iontů v ose kvadruplou Mass Spetrometry, E. de Hoffnann, V. Stroobant

23 Shrnutí jednoduchý kvadrupól skenování podél operační linie, tedy zachování konstatního poměru mezi U a V, umožňuje postupnou detekci iontů s odlišnými hodnotami m/z strmost operační linie má vztah k rozlišení, zvýšení strmosti vede ke zvýšení rozlišení při U=0 je rozlišení nulové, v takovém případě rozhoduje o stabilitě trajektorie hodnota V, při daném V jen ionty s m/z větší než je určitá hranice vymezená stabilitním diagramem budou mít stabilní trajektorie aplikace samotného RF bez stejnosměrné složky se užívá pro fokusaci iontů praktický horní limit pro možnost skenování iontů v kvadrupólu je do m/z ~ 4000 m/z prakticky dosažitelné rozlišení bývá do ~ 3000, tzv. jednotkové rozlišení skenovací rychlost ~ 5000 amu/s

24

25 Spectral skewing projevuje se v případě spojení se separační technikou, např. GC-MS apod. u iontovýchn pastí a TOF analyzátorů k tomuto efektu nedochází

26 LC-MS, s jednoduchým kvadrupólem (Waters) MS Scan = 5000 amu / sec Total Ion Current (TIC) Single Ion Recording (SIR) nebo Single ion monitoring (SIM) MS/MS pouze fragmentace ve zdroji (CID) = pseudo MS/MS

27 Možná uspořádání kvadrupólů: a) jeden kvadrupól (single quad) b) tři kvadrupóly za sebou (triple quad) pro MS/MS (space-dependent tandem MS) Tandem QqQ kolizní cela, pouze RF, možnost fragmentace Q1 q Q3

28 fragmentation fragmentation

29 Typy skenů na trojitém kvadrupólu Product Ion Scan Precursor Scan Neutral Loss Scan Multiple Reaction Monitoring

30 Tandemové uspořádání LC-MS/MS s trojitým kvadrupólem (Waters)

31

32

33

34 Iontová past - 3D verze (Ion Trap Mass Analyzer, 3D Ion Trap) Iontovou past popsal Paul a Steinwedel v roce 1960, do prakticky použitelné formy byla modifiována Staffordem První komerční instrument v polovině 80. tých let, fy Finnigan Pracuje ve dvou krocích, zachycení a nahromadění iontů, pak následuje jejich detekce Elektrodynamická fokusace podobně jako u kvadruplového analyzátoru, ale v prostoru (na rozdíl od osy kvadrupólu) Detekce je založena na vypuzení iontů z pasti do detektoru Dvě koncové a jedna kruhová elektroda Možnost MS n, tzv. tandem v čase (time-dependent tandem MS) => fragmentace => strukturní informace Iontový zdroj může být interní nebo externí Iontové pasti jsou levnější než trojitý kvadrupól

35 V 3D pasti je poměrně vysoký tlak (10-1 Pa) tvořený heliem nebo argonem: buffer gas > collisionally cools the ions, zásadně zvyšuje rozlišení a omezuje vzájemné odpuzování iontů 3D pasti mají vždy na centrální elektrodu vloženu RF složku s konstantní frekvencí (~1 MHz), ale proměnnou amplitudou a dále (ale ne vždy i) složku DC; na dvě koncové elektrody, podle výrobce, bývá vkládána konstantní DC složka, dále často AC složka s nižší a proměnlivou frekvencí, než je použita na kruhové elektrodě, případně jsou koncové elektrody jen uzemněny K vypuzení iontů z pasti se používají různé metody, jednou z nich je metoda založená na postupné destabilizaci všech iontů od nejmenších po největší (mass ejection at the stability limit), jinou alternativou je specifické vypuzení jednotlivých iontů (resonant ejection), bude dále diskutováno podrobněji Rozlišení: nízké (0.1-1 amu), většinou je definováno skutečně takto, tedy ne formou res. power Rozsah: ~ 000 až amu Skenovací rychlost: ~ amu/sec Potřebné vakuum: 10-1 Pa (10-3 torr)

36 Obecné schéma 3D-IT Iontová past s interní ionizací dráha iontu v 3D pasti

37 3D iontovou past si je možno představit jako sám do sebe stočený kvadrupól, kde vnitřní elektroda je redukována do bodu, středu pasti, vnější elektroda tvoří kruhovou elektrodu a horní a dolní tyč horní a dolní koncovou elektrodu Elektrický potenciál působící na ionty je třírozměrný Matematická analýza s využitím Mathieu rovnic umožňuje zjištění příslušných hodnot U a V, kdy mají ionty stabilní dráhy, tzn. kdy jejich trajektorie nepřekročí rozměry pasti dané hodnotami z 0 a r 0 Poznámka: > v případě tyčového kvadrupólu pohyb iontů v ose x a y je vyvolán aplikací příslušných potenciálů na tyče, pohyb ve směru osy z byl dán jejich kinetickou energií před vstupem do kvadrupólu, pole je tedy dvoudimenzionání > v 3D pasti se ionty pohybují vlivem aplikovaného potenciálu ve třech osách, ale vzhledem válcové symetrii x +y =r, mohou být použity koordináty z, r; pole je ovšem třídimenzionální

38 Ionizace může být interní nebo externí Iontová past s externí ionizací RF-only octapoles

39

40

41

42 Pohybové rovnice popisující 3D iontovou past jsou podobné jako pro kvadrupólový analyzátor: = + + = + + r t z m r e dt r d z t z r m e dt z d ) cos - ( ) ( ) cos - ( ) ( ω ω V U z V U z následující substituce proměnných umožňuje popsat pohybové rovnice ve formě rovnice podle Mathieu: Mathieu rovnice: 0 = + u a u ) cos ( ξ ξ q u d u d ω ω ω ξ ) ( ) ( 0 0 z m ev z m eu t r z u r z u + = = = + = = = = r z q q q, r z a a a,

43 integrace metodou Floquet a Fourier vyžaduje použití funkce e (α+iβ), reálnářešení vedou jen k nestabilním trajektoriím, jen čistě imaginární řešení kdy současně platí: α=0 a 0<β u <1 poskytují stabilní dráhy parametr β u lze vypočítat na základě parametrů a u, q u v Mathieu rovnici, přesná hodnota vyžaduje složitější výpočet obsahující řadu členů, následující rovnice vede k přibližným hodnotám β u : / u u u u u u u u u u u u u u u q a q q q = ) )( ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( a u a a a a a a a a a β

44 Stability diagrams for ion trap β u =0, continuous lines β u =1, dotted lines stability area commonly used in commercial ion trap instruments

45 Stability diagram for ion trap a z =0,149998; q z =

46 Stability diagram for ion trap using U DC versus V RF representation Znázorněny jsou ionty s hodnotami m/z = 10, 50, 100; (iontová past má průměr 1 cm a frekvence je 1,1 MHz). Pokud bude hodnota U DC =0, povede zvyšování V RF k postupné destabilizaci trajektorií iontů ve směru rostoucích hodnot m/z.

47 Množství iontů vstupujících do pasti je regulováno (gating lens), příliš vysoká koncentrace by vedla k nežádoucí repulzi mezi ionty (space charge effect) a snížení rozlišení, naopak příliš nízká koncentrace by snižovala citlivost měření, proto automatic gain control (AGC)

48 po nástřiku iontů jsou v pasti shromážděny ionty různých hodnot m/z následuje jejich analýza podle m/z u většiny komerčních pastí je aplikováno tzv. fundamentální RF na kruhovou elektrodu, jeho frekvence je konstantní, ale jeho amplituda V je nastavitelná přídavné RF napětí o proměnně frekvenci a amplitudě může být vloženo na koncové elektrody některé iontové pasti používají jen kombinaci RF napětí bez aplikace DC

49 1. Mass analysis by ion ejection at the stability limit DC není aplikováno, proto je a u =0, pro q z platí: q z = m 8 z ev ( r 0 + z0 )ω q z se bude zvyšovat se zvyšováním V a bude klesat při zvětšovaní m/z pokud hodnota q z dosáhne 0,908, β bude rovno 1, a bude dosažen stabilitní limit, další nárůst V povede k vypuzení iontů z pasti ve směru osy z, 50% iontů dopadne na detektor takto je možno postupně analyzovat všechny ionty různých hodnot m/z v pasti je také patrno, že pro určité rozměry pasti, použitou fundamentální frekvenci a amplitudu V RF složky, bude existovat m MAX, což je maximální hmotnost iontu, který je za daných podmínek měřitelný (bude vypuzen při skenování z pasti) zmenšení pasti nebo snížení RF frekvence povede ke zvýšení m MAX

50

51 . Mass analysis by resonant ejection Při vložení fundamentální frekvence ν nebudou ionty oscilovat s touto frekvencí, ale s tzv. sekulární frekvencí f, která je obecně nižší a navíc závislá na hmotnosti iontů, vztah mezi ν a f pro osu z je roven: f z = β z ν / pokud je na koncové elektrody aplikováno AC (RF) napětí s vhodnou frekvencí f z (tj. ve směru osy z), může dojít k rezonanci s iontem určité hodnoty m/z, a tím ke zvýšení amplitudy jeho oscilací, což může vést až k vypuzení iontu z pasti uvedeným postupem tedy lze vypuzovat i ionty s vysokou hmotností, aniž by bylo nutné dosáhnout stabilitního limitu, tedy limitní hodnoty β z

52

53 Resonant ejection (for ion 100 amu) AC(RF)=0 khz AC(RF)=160 khz

54 Tandemová hmotnostní spektrometrie v IT Obecně se v případě iontové pasti jedná o tandemovou MS v čase, tedy time-dependent tandem MS existují různé možnosti provedení MS n experimentů, některé využívají aplikace DC napětí A) Pokud je využito DC složky je postup následující: 1. Vybraný iont je nejprve selektivně izolován. Fragmentace je následně uskutečněna pomocí excitace iontu vhodnou rezonanční sekulární frekvencí 3. Jednotlivé fragmenty jsou postupně analyzovány buď s využitím stabilitního limitu nebo rezonanční excitací

55 B) Pokud není využita DC složka a aplikuje se jen radiofrekvenční napětí, AC, na koncové elektrody může být postup následující: 1. Vybraný iont je nejprve selektivně izolován ze směsi tak, že jsou ostatní ionty z pasti vypuzeny selektivním excitačním pulzem (resonant ejection of ions by selected inverse Fourier transform, SWIFT). Napětí V je upraveno tak, aby prekurzor byl stabilizován (a byly tak vytvořeny vhodné podmínky pro zadržení následně generovaných fragmentů v pasti) 3. Fragmentace iontu je provedena vhodnou rezonanční sekulární frekvencí 4. Jednotlivé fragmenty jsou z pasti vypuzovány s užitím stabilitního limitu

56 C) Pokud není využita DC složka a aplikuje se jen radiofrekvenční napětí, AC, na koncové elektrody může být postup také následující: 1. Vybraný iont je nejprve selektivně izolován ze směsi kombinací využití stabilitního limitu a excitační ejekce. Následně je napětí V upraveno tak, aby prekurzor byl stabilizován (a byly tak vytvořeny vhodné podmínky pro zadržení generovaných fragmentů v pasti) 3. Fragmentace iontu je provedena vhodnou rezonanční sekulární frekvencí 4. Jednotlivé fragmenty jsou z pasti vypuzovány s užitím stabilitního limitu Animace

57 Důležité poznámky: a) Fragmenty s hodnotou m/z menší než ~0% hodnoty m/z prekurzoru jsou ztraceny (cut off), nelze je efektivně po fragmentaci v pasti zachytit b) Při fragmentaci v kolizní cele trojitého kvadrupólu jsou vznikající ionty vystaveny mnoha kolizím, a tak jsou reaktivovány a mohou dále fragmentovat, na druhou stranu pokud je v iontové pasti příslušný iont vystaven jen přesně odpovídající sekulární frekvenci, dochází k selektivní excitaci jen tohoto vybraného iontu a ten nemusí významně fragmentovat, proto bývají fragmentační spektra z pasti odlišná od spekter z trojitého kvadrupólu a bývají chudší, obsahují méně fragmentů Proto se často aplikuje tzv. broadband excitation, při kterém se použije velký rozsah frekvencí, kdy i vznikající fragmenty jsou reaktivovány a fragmentace je rozsáhlejší, ms spektra bohatší

58

59 Důležité poznámky (pokračování): c) Iontové pasti často pracují v tzv. segmentovém režimu (segmented scan function) d) Před vlastním skenováním je prováděn tzv. předsken (prescan, microscan, automatic gain control/ion-current control) jehož účelem je zajistit optimální průběh skenu ve smyslu ideálního naplnění pasti s cílem dosažení dostatečně intenzivního signálu, ale bez přeplnění pasti (space-charge effect) a ztráty rozlišení

60 Důležité poznámky (pokračování): e) Kapacita iontové pasti se dá zvětšit aplikací tzv. axiální modulace, tj. vložením RF s poloviční frekvencí než je RF aplikované na kruhové elektrodě, toto přídavné RF umožňuje také dosáhnout zvětšení rozsahu pasti d) Z podstaty principu skenování v iontové pasti ve srovnání se skenováním na kvadrupólu je jasné, že meze detekce ve skenovacím režimu jsou podstatně lepší v případě iontové pasti než trojitého kvadrupolu, cca 100x e) Iontová past může poskytovat spektra MS n (n = až 10), tím se odlišuje od single/triple quad instrumentů, kde jde o MS/MS, tedy MS f) Zejména v případě pastí s interní ionizací může docházet k nežádoucím reakcím mezi ionty a molekulami a mohou být pozorovány artefakty ve spektrech, souvisí to s poměrně dlouhou dobou setrvání iontů v pasti, řádově až stovky milisekund, při technice LC-MS je tento problém minimální, určitou roli má v GC-MS (kvůli reaktivitě příslušných iontů) g) Spektra z iontových pastí nevykazují zkreslení, no spectral skewing, protože pracují v pulzním uspořádání, oproti kvadrupólům

61 Lineární iontová past LIT, D verze iontové pasti Modifikovaná 3D IT Kapacita D pasti je zvýšena nejméně 0x ve srovnán s konvenční 3D pastí Existují dva koncepty lišící se ejekcí iontů, může být radiální nebo axiální První LIT byla komercializována v roce 00 a šlo o hybrid (QTrap 000) s axiální ejekcí V roce 003 byl představen jednak hybrid LIT s ICR (LTQ FTICR) s radiální ejekcí a současně i samostatná iontová past (LTQ)

62 Axiální LIT

63 Radiální LIT

64 Obecně u všech kvadrupólových analyzátorů je nutno učinit kompromis mezi rozlišením, skenovací rychlostí a citlivostí Jedná se o kofein, peptid MRFA a Ultramark161 Rozlišení 0,05 v celém rozsahu m/z, ale skenovací rychlost pouze 7 m/z za sekundu

65 Vliv skenovací rychlosti na rozlišení Jedná se o látku s molekulovou hmotností 3714 Da, pětkrát protonovanou

66 Vliv množství iontů v pasti na rozlišení a na mez detekce Targed values Jedná se o látku s molekulovou hmotností 6530, Da, devětkrát protonovanou