Svět RNA a bílkovin. Sestřih pre-mrna. Sestřih pre-mrna. SESTŘIH pre-mrna. Trans-sestřih. Zrání pre-mrna. Posttranskripční modifikace

Transkript

1 Zrání pre-mrna Posttranskripční modifikace Vytvoření čepičky (capping) Polyadenylace Sestřih Editace Svět RNA a bílkovin SESTŘIH pre-mrna ální sestřih ální sestřih 1

2 Sestřih (splicing) Vystřižení intervenujících sekvencí (intronů) následované spojením odpovídajících částí kódující oblasti (exonů) Kvasinky Introny v 235 z 6000 genů Obratlovci a rostliny Introny v % všech genů Významný podíl na regulaci genové exprese Lidské buňky -40% genů Rostliny - zatím asi 5% genů M E C H A N I S M U S Typické geny a rekordy Savci Delší introny: Často několik kb 3-10 intronů / gen ozprostřených v oblasti nt Kratší exony: cca 300 nt Rostliny Kratší introny: nt, průměrně 150 nt Může být až 40 / gen Delší exony Lidský gen pro dystrofin 78 intronů: 99.4 % délky genu Pre-mRNA: nt / 79 exonů mrna: nt Drosophila; gen pro Down syndrome cell adhesion molecule: teoreticky až isoforem Rozpoznání místa sestřihu Sestřihové signály Rozpoznání místa sestřihu Sestřihové signály Nutné kroky při sestřihu: 1. Rozpoznání místa sestřihu 2. Excize intronu 3. Ligace exonů Pravidlo GT-AG Obratlovci Pravidlo GT-AG Konsensus 5 -místa sestřihu Dinukleotid GU 5 -CAG GUAAGUA-3 Rozpoznán U1 snrna Konsensus místa větvení Většinou nukleotid A 5 -UACUAAC-3 Nejprve rozpoznáno SF1 (BBP) Vazba U2 snrna Konsensus 3 -místa sestřihu Nejméně konzervovaný 5 -C/U/AAG G-3 Pyrimidinový trakt rozpoznán U2AF kooperativní rozpoznávání místa větvení (SF1) a 3 -SS (U2AF) Účast tří konsensus sekvencí místa větvení, pyrimidinového traktu a 3 -SS 2

3 Rozpoznání místa sestřihu - Sestřihové signály Nekonsensuální introny Odchylky od pravidla GT-AG: Introny AT-AC Konsensus sekvence 5 -SS: 5 - ATATCCTT-3 Místo větvení: 5 -CCTTRACCY-3 3 -SS: 5 -YAC -3 Rozpoznány minoritními snrnp snrnp U11 a U12 Rostliny nižší míra konsensu 5 SS, 3 SS a místa větvení polypyrimidonový trakt nahrazen sekvencemi bohatými UA U důležitější než A Rozdílné zastoupení bazí: Introny bohaté AU, exony bohaté GC Sestřih minoritními U12 spliceosomy Mechanismus analogický klasickému sestřihu Homology: U1 snrna U11 snrna U2 snrna U12 snrna U4 snrna U4atac snrna U6 snrna U6atac snrna U5 snrna v obou typech Existuje částečná funkční zastupitelnost obou typů spliceosomů Pomocné sestřihové signály mimo vlastní místa sestřihu Konsensus sekvence krátké a nedokonale komplementární Pomocné signály zesilovače, supresory, nukleotidové složení intronů a exonů Nutnost nalézt všechny introny a exony vystřihnout introny na správných místech Definice exonů a intronů Zesilovače (enhancers) Stimulují sestřih, nt od míst sestřihu Exonové i intronové Rozpoznávány SR proteiny (splicing factor-related proteins) Dvě RS domény Arg-Ser dipeptidové repetice Zeslabovače (suppressors) Váží hnrnp bílkoviny - PTB (polypyrimidine tract-binding proteins) či hnrnp A Nukleotidové složení intronů a exonů Dvouděložné rostliny Obsah AT: exony (50%) X introny (>70%) Oligo(U) řetězce v intronech Savci - Oligo(G) řetězce v intronech Chybné rozpoznání signálů: nevystřižení intronu intron skipping přeskočení exonu exon skipping použití kryptického 5 -SS Rozpoznávání intronů/exonů jako párů správně vzdálených vzájemně odpovídajících míst sestřihu Párování SS přes intron Párování SS přes exon 3

4 Definice exonů a intronů Definice exonů a intronů Čepička - analog 5 -SS prvního exonu CBP (20+80 kda) interaguje s U1 snrnp Poly(A) řetězec - analog 3 -SS posledního exonu PABP (33 kda) interaguje s U5 snrnp Predikce sestřihu in silico odhalí cca 80% míst sestřihu snrnp Bílkovinné faktory U1 snrnp U2AF (U2 association factor) U2 snrnp SR bílkoviny 70K hnrnp protein BBP/SF1 (Branching point-binding protein) UBP (Uridylate-specific RNA-binding hnrnp-like protein) ální sestřih Malé jaderné RNA a RNP Obecné funkce Interakce s pre-mrna a spolu navzájem prostřednictvím interakcí RNA-RNA Kostra pro přepravu a asociaci specifických spliceosomálních bílkovin Katalytické centrum spliceosomu 4

5 Primární a sekundární struktura snrna Obecně krátké: nt Primární sekvence vysoce konzervativní Primární a sekundární struktura snrna Dvě skupiny snrna 1) U1, U2, U4, U5, U11, U12 a U4atac snrna 2) U6 a U6atac snrna Sekundární strukturní elementy ještě konzervativnější Určité úseky primární sekvence téměř 100% konzervativní jednořetězcové úseky 1) RNA-RNA interakce (snrna:mrna a snrna:snrna) 2) vazebná místa bílkovin RNA-RNA interakce ve spliceosomu Klíčové pro správné zformování a funkci spliceosomu 4 typy interakcí 1. Intramolekulární interakce v rámci jedné U snrna 2. Intermolekulární interakce snrna / pre-mrna U1 snrna - 5 -SS U2 snrna - Místo větvení U6 snrna - 5 -SS U5 snrna - konce exonů 3. Intermolekulární interakce snrna / snrna U4/U6 snrna U6 snrna - U2 snrna Bílkovinné sestřihové faktory mimo snrnp CBP (cap-binding protein) 2 podjednotly, kda usnadnění navázání U1 snrnp k 5 -místu sestřihu definice prvního (5 -) exonu PABP (poly(a)-binding protein) 33 kda interakce s U5 snrna definice posledního (3 -) exonu DExD/H-box RNA helikasy řada bílkovin změna konformace RNA 4. Intramolekulární interakce v rámci pre-mrna 5

6 DExD/H-box ATP-dependentní RNA helikasy Bílkovinné sestřihové faktory mimo snrnp U2AF (U2 auxiliary factor) - esenciální sestřihový faktor; kda p65: N-terminální RS doména, 3 RRM domény, vazba k polypyrimidin. traktu p35: neváže se k RNA, nejasná úloha BBP (kvasinky) / SF1 (člověk) 75 kda, vazba k místu větvení a U2AF N-terminální KH doména (RNA-protein) C-konec bohatý prolinem (protein-protein) Součást U5 snrna 8 různých RNA helikas potřebných pro správný průběh jediného procesu - důkaz důležitosti strukturálních změn RNA během sestřihu pre-mrna SR bílkoviny jedna či více N-terminálních RRM domén C-terminální RS (Arg-Ser) doména regulace fosforylací serinu vazba k zesilovačům sestřihu UBP1 (Uridylate-specific RNA-binding hnrnp-like protein), rostliny vazba k AU-bohaté oblasti intronu 3 RBD domény definice intronu, zprostředkování vazby U snrnp k intronu Tri-snRNP model asociace/disociace spliceosomu ální sestřih Komplex E commitment complex fosforylace defosforylace 6

7 Modely formování spliceosomu ální cyklus Tri-snRNP model Původní a obecně přijímaný Tetra-snRNP model HeLa buňky isolován komplex U2/U4/U6 snrnp párování U2/U6 stabilizuje vazbu U4/U6 U2 součástí komplexu E savců isolovanéha za jemných podmínek Penta-snRNP (Holospliceosome) model (2002) holospliceosom isolován z kvasinkového extraktu při nízkých koncentracích solí Katalytické jádro spliceosomu Katalytické jádro spliceosomu velice pravděpodobně ribozym Přímé důkazy neexistují Nepřímé indicie: 1) Závislost první i druhé transesterifikační reakce na kovovém iontu (Mg ++ ) 2) Popsání slabé katalytické aktivity in vitro v trimolekulárním komplexu (2001) Jen RNA: U2 snrna, U6 snrna, fragment RNA hoologní k místu větvení Reakce analogická první transesterifikační reakci 0.15% za 24 hodin při plné saturaci U2 i U6 snrna Fosfát vážící Mg ++ Místo 2,3,5 -fosfotriesterové vazby s A v místě větvení Párování k 5 -SS U6 intramolecular stem-loop 3) Větvící A tvoří 2,3,5 -fosfotriesterovou vazbu s A a G u 5 -konce U6 ISL 4) Uracil U80 v U6 ISL (intramolecular stem-loop) váže hořečnatý ion Párování k místu větvení Formování terciálních interakcí mezi U6 a U2 snrna (pseudoknot) 7

8 ální sestřih Nezbytná součást genové exprese Významný regulační krok Člověk - 40 % genů ( podle EST / genů ) Arabidopsis - zatím asi 5 % genů ( podle EST / genů ) Variabilní užití potenciálních míst setřihu Komplexní transkripční jednotka Jedna pre-mrna může dát vzniknout mnoha zralým mrna Mnoho bílkovin může být kódovanáno jedním genem Základní typy alternativního sestřihu Zapomenutý intron Konkurující 3 místa sestřihu Konkurující 5 místa sestřihu Alternativní promotory Alternativní polyadenylační místa Kazetovité exony Vzájemně se vylučující exony Mechanismus alternativního sestřihu Neexistuje jednotný mechanismus Rozpoznání konstitutivních a alternativních míst sestřihu nízký stupeň konzervace regulační sekvence i sekvence míst sestřihu krátké a degenerované malý informační obsah snad čím blíže konsensu, tím silnější místa sestřihu Sestřihové zesilovače/supresory SR bílkoviny - definice exonů, vazba k zesilovačům sestřihu hnrnp bílkoviny (PTB, hnrnp A1) - většinou inhibitory sestřihu Sekundární struktura pre-mrna Poměr koncentrací a aktivit jednotlivých obecných a specifických sestřihových faktorů Komplexní proces - kombinace pozitivně a negativně působících faktorů 8

9 genu pro Dscam Nezbytná součást genové exprese Významný regulační krok Člověk - 40 % genů ( podle EST / genů ) Arabidopsis - zatím asi 5 % genů ( podle EST / genů ) Variabilní užití potenciálních míst setřihu Komplexní transkripční jednotka Jedna pre-mrna může dát vzniknout mnoha zralým mrna Mnoho bílkovin může být kódovanáno jedním genem Drosophila gen pro DS cell adhesion molecule (DSCAM): teoreticky až isoforem Funkční kategorizace alternativně stříhaných genů Funkční důležitost alternativního sestřihu Člověk (75 % genů) Signalizace Stres Regulace genové exprese Receptory Přenos signálů Transkripční faktory Produkce zcela rozdílných produktů jednoho genu Člověk: calcitonin (CT) X calcitonin gene-related peptide (CGRP) a polyadenylace CT/CGRP genu Štítná žláza - exon 4 -> 32 aa CT (hormon, hladina Ca v krvi) Neurony-Vystřižení exonu 4 -> 37 aa CGRP (vasodilatátor) Arabidopsis (většina genů) Regulace genové exprese Receptory Přenos signálů Transkripční faktory Stres Příklady rostlinných alternativně sestříhaných stresových genů Rýže: dvě mitochondriální bílkoviny Společný exon 1 - mitochondriální lokalizační signál Exon 2 - mt ribosomální protein S14 (RPS14) Exon 3 - podjednotka B mt sukcinát dehydrogenasy (SDHB) vznik: integrace původně mitochondriálního genu rps14 do intronu jaderného genu sdhb 9

10 Funkční důležitost alternativního sestřihu genu slo Vyjmutí či náhrada funkčních domén bílkovin Modulární struktura bílkovin, různé domény s různou funkcí Transkripční faktory - DNA vazebná a aktivační doména Lokalizace bílkovin Rozdílnábuněčná lokalizace stejné bílkoviny Změna nepřekládaných oblastí (UTR) ovlivnění translatability, stability a lokalizace mrna v cytoplasmě Drosophila: mrna pro ferritin - přítomnost / absence IRE Zpětnovazebná smyčka kvasinková ribosomální bílkovina L32 vazba k vlastní pre-mrna, inhibice sestřihu, narušení ORF, syntéza nefunkční bílkoviny genů pro neurexiny Další příklady komplexních transkripčních jednotek Fibroblast growth factor receptor 2 (savci) Vzájemně se vylučující exony mění vazebnou specificitu Neural cell adhesion molecule (mozek krys) Variable alternatively spliced exon (VASE) RUBISCO activase (rostliny) Obě aktivují RUBISCO, jen delší je regulována změnou redox potenciálu α-tropomyosin (krysy) 9 isoforem s rozdílnou buněčnou specificitou 2 alternativní promotory (A), 2 páry vzájemně se vylučujících exonů (B), řada alternativních míst polyadenylace (C) 10

11 ální sestřih Široce rozšířený zejména organely Protista (Kinetoplastida, Euglena) Hlísti, ploštěnci, obratlovci Každý exon kódován jinou RNA pre-mrna PTM (pre-transsplicing molecule) dříve SL RNA (spliceleader RNA) = Často spolu s alternativním sestřihem Časté u parazitů; vznik různých antigenních determinant ální sestřih Fylogeneticky značně rozšířené 1) rrna, trna, mrna Mitochondrie, plastidy Protista, houby, rostliny 2) mrna Eubacteria Dosud neobjeveny u Archebakterií - ribozymy Mobilní genetické elementy Mitochondriální genom: Arabidopsis 23 Marchantia 25 Chloroplastový genom Euglena 155 (40% genomu) Délka intronů: Variabilní; 389 nt kb bez ORF většinou kb (dle přítomnosti ORF) ORF cca nt stejný jako u spliceosomů snad jejich evoluční předchůdci teorie vzniku snrnarozpadem intronů II. typu 11

12 intronů II. typu Kofaktor Transesterifikace Hydrolýza Definice míst sestřihu Součást katalytickéha jádra ORF Nejkonzervovanější, Ribozym? Obsahuje nukleofil (A) Hydrolýza - alternativnízpůsob prvním nukleofilem voda, výsledkem lineární intron snad evoluční předchůdce transesterifikace Sekundární struktura intronů II. typu Bílkoviny účastnící se sestřihu intronů II. typu mobilní genetické elementy Kódované intronem (doména IV) maturasa stabilizace konformace intronu reversní transkriptasa endonukleasa twintrony Kódované jádrem RNA vazebné bílkoviny RNA helikasa RNA chaperony aa-trna synthetasy sestřihové faktory často společné se spliceosomálním sestřihem Retrohoming Bílkovina kódovaná intronovým ORF reversní transkriptasa endonukleasa Ribozym (intronová RNA) Retrotransposice 12

13 mobilní genetické elementy mobilní genetické elementy ální sestřih Fylogeneticky značně rozšířené Eukaryota,viry, Eubakterie, bakteriofágy Dosud neobjeveny u Archebakterií Abundantní zejména v mtdna hub - ribozymy zrychlení reakce krát 1) rrna, trna, mrna Mitochondrie, plastidy Protista, houby, rostliny 2) trna, mrna Eubacteria, bakteriofágy 3) rrna jádro Protista, houby 4) mrna Mitochondrie Živočichové (Žahavci) Jederná pre-23s rrna z Tetrahymena thermophila (413 nt) Mobilní genetické elementy 13

14 Primární a sekundární struktura intronů I. typu Sekundární struktura intronů I. typu Velice jednotná a komplexní sekundární a terciální struktura Délka nt Mohou obsahovat ORF Maturasa Stabilizace terciální struktury Endonukleasa Mobilita intronů Takřka žádná konzervace primární nukleotidové sekvence Upstreamexonkončí U Intronkončí G Čtyři téměř konzervované oblasti: P, Q, R a S Extrémní konzervace sekundární struktury Vlásenky (P) se smyčkami (L), pseudoknoty, jednořetězcové oblasti (J) Substrátová doména Vlásenky P1, P10 (začátek a konec intronu) a P2 IGS - internal guide sequence, párování s konci exonů Katalytické jádro Domény P4-P6 a P3-P7 Dvě téměř rovnoběžbé dvoušroubovice, mezi nimi substrátová doména Intron I. typu intronů I. typu Mechanismus podobný klasickému spliceosomu Dvě transesterifikační reakce Prvním nukleofilem volný guanosin Nevzniká laso, ale lineární intron První a druhý krok představují přímý a zpětný chod téže reakce (i intron končí G) Jen jedno katalytické jádro Jen jedna funkční konformace Statická struktura Cirkularizace intronu Mobilita - nejen vystřižení, ale i homing Závislost na přítomnosti dvojmocných kovových iontů Zaujetí správné funkční konformace (folding) Mg ++, Mn ++, Ca ++, Sr ++ Účast při vlastní sestřihové reakci (donor/akceptor protonů) Takřka výhradně Mg ++ 14

15 Další reakce katalyzované ribozymy I. typu Retrohoming Reverzní sestřih -> reverzní transkripce -> rekombinace (integrace do genomu) Cirkularizace intronu Transesterifikace či hydrolýza fosfoesterových vazeb Ligace RNA (ligasa) Analogie I. kroku: Endonukleolytické štěpení RNA a DNA (endonukleasa) Hydrolýza aminoacylesterů (aminoacylester hydrolasa) není hydrolýza fosfoesterové vazby! Analogie II. kroku: Polymerace RNA (polymerasa) Přenos nukleotidů (nukleotidyltransferasa) ální sestřih I. typu I. typu Didymium iridis (Myxomycetes) Naegleria gruberi (Amoeboflagellata) Podobnost: životní cyklus, buněčná morfologie, organizace rdna (extrachromozomální, Di 20 kb lineární, Ng 14 kb cirkulární) Intron I ( mt) Nejmenší známý ribozym I. typu Hydrolytickéštěpení dvou interních míst v RNA Ne sestřih, ale vyštěpení ORF z twintronu v rrna genech v konzervovaných částech rdna Intron II Klasický ribozym I. Typu Sestřih twintronu ORF - homing endonukleasa Mobilita twintronu Intron ribozym I. typu kb ORF (75O nt) homing endonukleasa Horizontální přenos: Přítomnost v tak evolučně vzdálených organismech jen v extrachromozomální DNA 15