CELOSTÁTNÍ PŘEHLÍDKY SÝRŮ 2006

Transkript

1

2 CELOSTÁTNÍ PŘEHLÍDKY SÝRŮ 2006 Výsledky přehlídek a sborník přednášek semináře Mléko a sýry Praha leden 2006

3 Editor: Štětina J., Čurda L. Vydavatel: Vysoká škola chemicko-technologická v Praze Technická Praha 6 ISBN

4 OBSAH Výsledky 10. ročníku Celostátních přehlídek sýrů Čurda Ladislav, Štětina Jiří...13 Cheese in the World Today Hopkin Edvard...22 Vývoj ve výrobě a prodeji sýrů v České republice a naše perspektivy do budoucna Kopáček Jiří...28 Vliv složení sýrů ementálského typu na výskyt máselného kvašení. Erban Vladimír, Černý Vladimír, Havlíková Šárka, Kvasničková Eva, Pufrová Eva, Komárková Eliška...35 Antimikrobiální aktivita Lactobacillus paracasei izolovaných z polotvrdých sýrů Tůma Štěpán, Vogensen K. Finn, Ardö Ylva, Plocková Milada, Chumchalová Jana...41 Vplyv koncentrácie NaCl na produkciu tyramínu mliekarensky významnými enterokokmi Greif Gabriel, Greifová Mária, Karovičová Jolana, Kohajdová Zlatica...47 Zhodnocení rozdílů v sýrařských vlastnostech mléka mezi dojnicemi holštýnského a montbeliardského plemene Čejna Vladimír, Chládek Gustav...53 Mikrobiologická kvalita kozího mléka Cupáková Šárka, Pospíšilová Markéta, Lipertová Monika, Koláčková Ivana, Karpíšková Renata, Janštová Bohumíra...59 Exopolysacharidy bakterií mléčného kvašení Kánský Jiří, Štětina Jiří...64 Vplyv ochrannej kultúry na rast Candida maltosa YP1 v jogurtových krémoch Liptáková Denisa, Valík Ľubomír, Šindelková Lucia...70 Funkční potraviny poznatky z IDF World Dairy Summit 2005 Plocková Milada...75 Růst bifidobakterií v kravském a mateřském mléce Rada Vojtěch, Nevoral Jiří, Vlková Eva, Trojanová Iva, Killer Jiří...78 Charakteristika vybraných laktobacilov z pohľadu probiotických baktérií Greifová Mária, Kontová Marcela, Šovčíková Andrea, Greif Gabriel, Peterková Zuzana...82 Mikrobiologická charakteristika a obsah prebiotik ve vybraných zahraničních a tuzemských probiotických a synbiotických preparátech Killer Jiří, Trojanová Iva, Vlková Eva, Rada Vojtěch...88 Aplikace stanovení sacharidů v mlékárenských výrobcích Přibyla Lubomír, Černý Vladimír...96 Aplikace jednoduché metody měření viskozity v mlékárenské praxi Černý Vladimír, Švandrlík Zdeněk Hodnocení texturních vlastností eidamských sýrů NIR spektrometrem Mlček Jiří, Šustová Květoslava

5 Plakátová sdělení: Rastové parametre kmeňov Staphylococcus aureus izolovaných z ovčieho mlieka a hrudkového syra Bajúsová Barbora, Valík Ľubomír, Liptáková Denisa, Medveďová Alžbeta Změny základních ukazatelů kvality ovčího mléka v průběhu laktace Dragounová Hedvika, Hejtmánková Alena Využití FT-NIR v analýze pasterovaného kozího mléka Hadra Luboš, Dračková Michaela, Janštová Bohumíra, Navrátilová Pavlína, Vorlová Lenka Senzorická analýza kozích sýrů Lužová Táňa, Šustová Květoslava, Kuchtík Jan Spotrebiteľský test kozieho syra Staruch Ladislav, Schmidt Štefan, Sekretár Stanislav, Greif Gabriel, Mastihuba Vladimír, Greifová Mária Vliv vybraných ukazatelů kvality mléka na jakost sýřeniny u ovcí kříženek plemen Lacaune a Východofríská ovce Novotná Lenka, Kuchtík Jan, Růžičková Jana Proteolytické psychrotrofné mikroorganizmy ako faktor ovplyvňujúci kvalitu mlieka Ducková Viera, Čanigová Margita, Krupová Zuzana Vliv časné a pozdní laktace na technologické vlastnosti mléka holštýnských dojnic Chládek Gustav, Čejna Vladimír Význam ukazovateľa bodu mrznutia mlieka pre zistenie jeho technologickej kvality Kirchnerová Katarína, Foltys Vladimír Vliv přídavku proteinu obohaceného esenciálními aminokyselinami do bachoru dojnic na množství a obsahové složky mléka Hadrová Sylvie, Křížová Ludmila, Bjelka Marek, Černý Vladimír, Třináctý Jiří Využití FT-NIR v analýze pasterovaného mléka Dračková Michaela, Hadra Luboš, Tatranová Iva, Vozková Lenka, Vorlová Lenka Posouzení vlivu rozdílných teplot kravského mléka na přesnost měření metodou NIR spektroskopie Růžičková Jana, Šustová Květoslava Využití různých způsobů extrakce pro analýzu aroma látek sýra Niva Štoudková Hana, Vítová Eva, Loupancová Blanka, Fišera Miroslav Identifikace hořkých peptidů v sýru Niva hmotnostní spektrometrií MALDI-TOF Zemanová Jana, Štoudková Hana, Laštovičková Markéta, Vítová Eva, Loupancová Blanka Efekt solí na ph a aktivitu lipáz Salis Andrea, Pinna M. Cristina, Bilaničová Dagmar, Monduzzi Maura, Ninham Barry W., Schmidt Štefan Kontinuálna príprava galaktooligosacharidov v membránovom enzýmovom reaktore Mišún Daniel, Čurda Ladislav, Šípalová Olga Vliv přídavku 1-monoacylglycerolů na konzistenci plnotučných tavených sýrů Buňka František, Pavlínek Vladimír, Hrabě Jan, Rop Otakar, Galářová Blanka, Janiš Rahula, Krejčí Jiří

6 Změny barvy sterilovaných tavených sýrů během dvouletého skladování Buňka František, Štětina Jiří, Hrabě Jan Vliv exopolysacharidů jogurtových kultur a koncentrace bílkovin na reologické vlastnosti jogurtu Kánský Jiří, Štětina Jiří, Zábranská Dana Reologické vlastnosti gelů karagenanu s galaktomannany v mléce Loužecký Tomáš, Štětina Jiří Senzorické hodnocení sýru Hermadur Jarošová Alžbeta, Šustová Květoslava, Jurčíková Radka Organoleptické vlastnosti uzených sýrů v závislosti na době od otevření originálního balení Kouřimská Lenka, Panovská Zdeňka, Babička Luboš, Šedivá Alena Senzorické posouzení bílých jogurtů Panovská Zdenka, Šedivá Alena, Lukešová Dobromila, Pokorný Jan Animované objekty v odborných potravinářských databázích Uvíra Roman, Pudil František Bakterie mléčného kvašení v sójových výrobcích Dvořák Milan, Šůchová Eva, Chumchalová Jana Sledování produkce organických kyselin kmeny Lactobacillus v různých médiích Hudáček Jaroslav, Zalán Zsolt, Štětina Jiří, Chumchalová Jana, Halász Anna Aplikace metody FISH pro identifikaci laktobacilů z majonézových výrobků a surovin Chumchalová Jana, Fialová Jana, Míková Kamila, Navrátilová Jiřina Antimikrobiálne pôsobenie Lactobacillus rhamnosus VT1 v mlieku a v potravinách s mliečnou zložkou Koreňová Janka, Valík Ľubomír, Liptáková Denisa, Petríková Jana Antimikrobiálne účinky rozmarinových a šalviových extraktov na rast potravinársky nežiadúcich mikroorganizmov Krajčová Eva, Adamová Adriana, Sekretár Stanislav, Schmidt Štefan, Greifová Mária Antibakteriální aktivita izolátů z majonézových výrobků Kučerová Kateřina, Chumchalová Jana, Míková Kamila, Navrátilová Jiřina Využití Petrifilmu k izolaci Staphylococcus aureus ze syrového kozího a kravského mléka Pospíšilová Markéta, Karpíšková Renata Subletální poškození a detekce Candida utilis DMF 1021 a Kluyveromyces marxianus var. Marxianus DMF 1005 Šviráková Eva, Linda Horníková, Jaromír Fiala, Plocková Milada

7 CONTENS Results of 9th National Cheese Show Čurda Ladislav, Štětina Jiří...13 Cheese in the World Today Hopkin Edvard...22 Trends of cheeses production and sales in Czech Republic and our future prospects Kopáček Jiří...28 Effect of hard cheese composition on type and incidence butiric fermentatoon Erban Vladimír, Černý Vladimír, Havlíková Šárka, Kvasničková Eva, Pufrová Eva, Komárková Eliška...35 Antimicrobial activity of Lactobacillus paracasei isolated from semi-hard cheese Tůma Štěpán, Vogensen K. Finn, Ardö Ylva, Plocková Milada, Chumchalová Jana...41 The effect of NaCl concentration on the production of tyramine by dairy relevant enterococci Greif Gabriel, Greifová Mária, Karovičová Jolana, Kohajdová Zlatica...47 The analysis of differences in cheese-making characteristics of milk of Holstein and Montbeliarde cows Čejna Vladimír, Chládek Gustav...53 Microbiological quality of Goat s milk Cupáková Šárka, Pospíšilová Markéta, Lipertová Monika, Koláčková Ivana, Karpíšková Renata, Janštová Bohumíra...59 Exopolysaccharides of lactic acid bacteria Kánský Jiří, Štětina Jiří...64 Effect of protective culture on the growth dynamics of Candida Maltosa YP1 in yogurts Liptáková Denisa, Valík Ľubomír, Šindelková Lucia...70 Functional foods Trends presented in the IDF World Dairy Summit 2005 Plocková Milada...75 Growth of Bifidobacteria in Cow and Human milk Rada Vojtěch, Nevoral Jiří, Vlková Eva, Trojanová Iva, Killer Jiří...78 Characterisation of selected lactobacilli from the point of view of probiotic bacteria. Greifová Mária, Kontová Marcela, Šovčíková Andrea, Greif Gabriel, Peterková Zuzana...82 Microbiological analysis and contents of prebiotics in some foreign and Czech probiotic and synbiotic preparations. Killer Jiří, Trojanová Iva, Vlková Eva, Rada Vojtěch...88 Saccharide determination in milk products Přibyla Lubomír, Černý Vladimír...96 Application of a simple method for measurement of viscosity in dairy praxis Černý Vladimír, Švandrlík Zdeněk Evaluation of structure properties of Edam cheese by NIR spectrometer Mlček Jiří, Šustová Květoslava

8 Posters: Growth parameters of Staphylococcus aureus strains isolated from ewe`s milk and cheese Bajúsová Barbora, Valík Ľubomír, Liptáková Denisa, Medveďová Alžbeta The changes of basic quality indicators of Sheep milk during the lactation period Dragounová Hedvika, Hejtmánková Alena Use of FT-NIR to analysis of pasteurized goat milk Hadra Luboš, Dračková Michaela, Janštová Bohumíra, Navrátilová Pavlína, Vorlová Lenka Organoleptic quality of goat s cheeses Lužová Táňa, Šustová Květoslava, Kuchtík Jan Consumer Test on Goat Cheese Staruch Ladislav, Schmidt Štefan, Sekretár Stanislav, Greif Gabriel, Mastihuba Vladimír, Greifová Mária Influence of chosen parameters of milk quality on quality of rennet curdling from sheep (Lacaune x East Friesian) Novotná Lenka, Kuchtík Jan, Růžičková Jana Proteolytic psychrotrophic microorganisms as a factor influencing milk quality Ducková Viera, Čanigová Margita, Krupová Zuzana The effect of early and late lactation on processing characteristics of milk of Holstein cows Chládek Gustav, Čejna Vladimír The use of Freezing point parameter for the technological quality of milk estimating Kirchnerová Katarína, Foltys Vladimír The effect of supplementation of protein enriched with essential amino acids into the rumen of lactating dairy cows on milk yield and composition Hadrová Sylvie, Křížová Ludmila, Bjelka Marek, Černý Vladimír, Třináctý Jiří Application of FT-NIR to the analysis of pasteurized milk Dračková Michaela, Hadra Luboš, Tatranová Iva, Vozková Lenka, Vorlová Lenka Impact of different temperatures in NIR spectroscopy measuring of cow s milk composition Růžičková Jana, Šustová Květoslava Analyse aroma substances of cheese Niva using various ways of extraction Štoudková Hana, Vítová Eva, Loupancová Blanka, Fišera Miroslav Identification of Bitter Peptides in Niva Cheese by Mass Spectrometry MALDI-TOF Zemanová Jana, Štoudková Hana, Laštovičková Markéta, Vítová Eva, Loupancová Blanka Effect of salts on ph and lipase activity Salis Andrea, Pinna M. Cristina, Bilaničová Dagmar, Monduzzi Maura, Ninham Barry W., Schmidt Štefan Continuous Preparation of Galactooligosaccharides in Membrane Enzymatic Reactor Mišún Daniel, Čurda Ladislav, Šípalová Olga The effect of addition of 1-monoacylglycerols on consistency of full-fat processed cheeses Buňka František, Pavlínek Vladimír, Hrabě Jan, Rop Otakar, Galářová Blanka, Janiš Rahula, Krejčí Jiří The colour changes of the sterilized processed cheeses during 2-years storage Buňka František, Štětina Jiří, Hrabě Jan

9 The influence of yogurt culture exopolysaccharides and of protein concentration on the rheological properties of yogurt Kánský Jiří, Štětina Jiří, Zábranská Dana Rheological properties of carrageenan gels with galactomannans in milk Loužecký Tomáš, Štětina Jiří Sensory analysis Hermadur cheese Jarošová Alžbeta, Šustová Květoslava, Jurčíková Radka Organoleptic properties of smoked cheese in relation to the time from opening the original packaging Kouřimská Lenka, Panovská Zdeňka, Babička Luboš, Šedivá Alena Sensory evaluation of natural yoghurts Panovská Zdenka, Šedivá Alena, Lukešová Dobromila, Pokorný Jan Animated objects in scientific food-stuff databases Uvíra Roman, Pudil František Lactic acid bacteria in soya products Dvořák Milan, Šůchová Eva, Chumchalová Jana Determination of the production of organic acids in three different media by Lactobacillus strains Hudáček Jaroslav, Zalán Zsolt, Štětina Jiří, Chumchalová Jana, Halász Anna Application of FISH method for identificatin of lactobacilli from mayonnaise-based products and raw materials Chumchalová Jana, Fialová Jana, Míková Kamila, Navrátilová Jiřina Antimicrobial influence of Lactobacillus rhamnosus VT1 in milk and in foodstuff with milky component Koreňová Janka, Valík Ľubomír, Liptáková Denisa, Petríková Jana Antimicrobial effects of rosemary and sage extracts on growth of food contaminants Krajčová Eva, Adamová Adriana, Sekretár Stanislav, Schmidt Štefan, Greifová Mária Antibacterial activity of bacteria isolated from delicacy products Kučerová Kateřina, Chumchalová Jana, Míková Kamila, Navrátilová Jiřina Using petrifilm for isolation of Staphylococcus aureus strains from raw goat s and cow s milk Pospíšilová Markéta, Karpíšková Renata Sublethal injury and detection of Candida utilis DMF 1021 and Kluyveromyces marxuanus var. marianus DMF 1005 Šviráková Eva, Linda Horníková, Jaromír Fiala, Plocková Milada

10 Přednášky

11 VÝSLEDKY 10. ROČNÍKU CELOSTÁTNÍCH PŘEHLÍDEK SÝRŮ Čurda Ladislav, Štětina Jiří Ústav technologie mléka a tuků, Vysoká škola chemicko-technologicklá v Praze RESULTS OF 10 TH NATIONAL QUALITY COMPETITION FOR CHEESE Summary: The 10th National Quality Competition for Cheese was organized traditionally by Department of Dairy and Fat Technology (ICT Prague), Czech-Moravian Dairy Association and Czech Chemical Society on the 19 and 25 of January 2006 in Prague. 65 hard, semi-hard, mould, white, fresh and processed cheeses of 18 producers competed in this year s show. Competitive samples of cheeses were divided into 10 categories and evaluated by a commission of experts and also by a public commission. Two commissions of experts formed from three members assessed each cheese. Altogether 180 evaluators worked in public commissions. The cheeses were evaluated according to their taste and aroma and their consistence and appearance. Cheeses from abroad (10 samples) were evaluated separately. The results are summarized in tables. Extraordinary cheeses were presented on an exhibition within the show. The National Quality Competition for Cheese was accompanied by a seminar called Milk and Cheeses with a scientific programme involving 17 lectures and 35 poster presentations. Ve dnech 19. a 25. ledna 2006 se uskutečnily Celostátní přehlídky sýrů, 26. ledna seminář Mléko a sýry. Podobně jako předchozí ročníky i ten letošní byl organizován Ústavem technologie mléka a tuků Vysoké školy chemicko-technologické v Praze ve spolupráci s Českomoravským svazem mlékárenským a Odbornou skupinou pro potravinářskou a agrikulturní chemii České společnosti chemické. Přejímka vzorků a odborné hodnocení se konalo 19. ledna. Do hodnocení bylo zařazeno 65 vzorků od 18 tuzemských výrobců a 10 vzorků zahraničních, které poskytli 4 dovozci sýrů. Sýry byly rozděleny do 10 kategorií. Původně bylo vyhlášeno 12 kategorií, bohužel se však nepodařilo obsadit dostatečným počtem vzorků kategorii sýrů typu Moravský blok a kategorii bílých sýrů. Kategorie sýrů typu Moravský blok byla spojena se kategorií sýrů s dobou zrání minimálně 3 měsíce, bílé sýry byly přesunuty do specialit. Jinak byly kategorie poměrně rovnoměrně obsazeny 5 až 7 vzorky. Nově byla v letošním ročníku vyhlášena kategorie tavených sýrů. Těmto sýrům byl věnován druhý ročník přehlídek a od té doby nebyly hodnoceny. Vzhledem k tomu, že ve výrobě a spotřebě tavených sýrů na obyvatele patříme ke světové špičce, i vzhledem k zájmu výrobců tavených sýrů je jejich zařazení do hodnocení opodstatněné. Tato kategorie i přes omezení pouze na neochucené sýry nejpočetněji zastoupenou kategorií letošních přehlídek (9 vzorků). Rozdělení vzorků do kategorií je uvedeno v tab. I, v tab. II je pak přehled zúčastněných výrobců. I když organizační výbor zvažoval určité úpravy systému hodnocení sýrů, byl pro letošní ročník dosavadní systém zachován a případné změny budou po konzultacích s účastníky přehlídek uplatněny až v dalším ročníku. Při odborném hodnocení byl proto každý sýr posouzen dvěma paralelními komisemi, každá z komisí měla nezávislého předsedu a dva zástupce výrobců. V případě kategorií čerstvých a termizovaných neochucených sýrů a tavených neochucených sýrů, které se hodnotily neanonymně, byla posílena část komise z nezávislých odborníků na tři, komise byla tedy celkem pětičlenná. Komise posoudily sýry ve dvou znacích: vzhledu a konzistenci (ve výsledném hodnocení tvoří 40 %) a chuti a vůni (60 %). Veřejné hodnocení osobně zahájil 25. ledna rektor VŠCHT Prof. Ing. Vlastimil Růžička, CSc., pod jehož záštitou se přehlídky konají. O účast na veřejném hodnocení byl enormní zájem, sál v menze Studentský dům byl zcela zaplněn. Sýry posuzovalo celkem 180 hodnotitelů. Shoda mezi odborným a veřejným hodnocením je poměrně dobrá, v některých kategoriích (Sýry s tvorbou ok a Čerstvé a termizované sýry neochucené) však byly zaznamenány výraznější rozdíly. 13

12 Tabulka I Rozdělení hodnocených sýrů do kategorií. Kategorie 1 Eidamské sýry % t.v s. 2 Eidamské sýry % t.v s. 3 Polotvrdé a tvrdé sýry zrající min. 3 měsíce 4 Sýry s tvorbou ok 6 Uzené sýry 7 Sýry s plísní na povrchu 8 Sýry s plísní v těstě 10 Čerstvé a termizované sýry neochucené 11 Tavené sýry neochucené 12 Speciality Celkem Počet vzorků ČR Zahraniční Tabulka II Přehled přihlašovatelů sýrů a jejich zastoupení v jednotlivých kategoriích. Přihlašovatel Počet sýrů Kategorie Česká republika BEL Sýry Česko, a.s., Želetava 2 2 Jaroměřická mlékárna, a.s Krkonošské sýrárny, a.s KROMILK, s.r.o., Kroměříž MADETA, a.s MILTRA B, s.r.o., Městečko Trnávka Mlékárna Klatovy, a.s Mlékárna Kyjov, a.s 2 2 Mlékárna Otínoves, s.r.o. 1 1 Mlékárna Polná, s.r.o Mlékárna Varnsdorf, s.r.o Niva, s.r.o., Dolní Přím 1 1 PLASTCOM, a.s., mlékárna Příšovice Povltavské mlékárny, a.s., Sedlčany Pribina, s.r.o., Přibyslav 2 2 Provital milk, a.s., provoz Plzeň 2 2 TANY, s.r.o., Nymburk 3 3 TPK s r.o., Hodonín 2 2 Vzorky z ČR celkem Dovozce zahraničních sýrů IMCO s.r.o Lactalis Europe Centrale Et Orientale s.r.o MILKPOL s.r.o SEAFOOD s.r.o Sýry z dovozu celkem

13 V odborném a veřejném hodnocení bylo 52, resp. 55,5 % vzorků hodnoceno jako výborné nebo velmi dobré (tab. III). Pro účely zařazení do kategorií při veřejném hodnocení je v tab. III použito bodové hodnocení, i když pořadí bylo sestaveno neparametrickým způsobem. Pořadí z bodového hodnocení je však shodné s pořadím z neparametrického vyhodnocení. Porovnání četností hodnocení je uvedeno na obr. 1, v obou komisích se nejčastěji objevilo hodnocení body, ve veřejném se však téměř se stejnou četností objevovalo i hodnocení mezi 85 a 90 body. Průměrné hodnocení se lišilo nepatrně (76,0 a 75,7 bodu), bylo tak o více než 1,5 bodu vyšší než loni. Medián je pro odborné hodnocení shodný s průměrem, pro veřejné se rozdíl v distribuci odpovědí projevil zvýšením mediánu na 78 bodů. Celkové výsledky přehlídek jsou shrnuty v tab. IV, hodnocení vzorků z dovozu je uvedeno v tab. V. Tučně jsou vyznačené vzorky, které obdržely diplom. Celkem bylo tuzemským sýrům uděleno 19 diplomů. K nejúspěšnějším sýrárnám na letošních přehlídkách patří MILTRA B s. r. o., Městečko Trnávka. Ze čtyř přihlášených sýrů tři sýry získaly první místo ve svých kategoriích. Tři diplomy byly uděleny také společnosti MADETA a. s. Celkem 5 sýrů bylo hodnoceno jako výborných, t. j. v rozmezí 90 až 100 bodů. Kromě eidamských salámových polotvrdých sýrů s 30 % a 40 % t. v s. (MILTRA B s. r. o.) to byly smetanové tavené sýry Matador a Apetitto (BEL Sýry Česko, a. s., Želetava) a Čerstvý sýr - přírodní chuť z Hané (KROMILK, s. r. o., Kroměříž). Kromě soutěžních vzorků bylo na přehlídkách presentováno 103 vzorků našich výrobců na doprovodné výstavě (tab. VI). Program přehlídek byl doplněn zajímavými přednáškami pana E. Hopkina (bývalý čelní představitel Mezinárodní mlékařské federace), Ing. J. Kopáčka, CSc. (Českomoravský svaz mlékárenský) a prof. P. Jelena (Univesity of Alberta, Kanada). Na navazujícím semináři Mléko a sýry bylo prezentováno 17 přednášek a rekordních 35 posterů. I letos se pro seminář podařilo získat zahraničního hosta, kterým byl prof. P. Dejmek (Lund University, Švédsko), který vystoupil s inspirativní přednáškou Mléčné výrobky jako nosiče bioaktivních látek. Přehlídek i semináře se dále účastnilo 12 firem, jejichž činnost se dotýká laboratorního vybavení a potřeb pro zpracování mléka. Také v letošním ročníku bylo hodnocení tuzemských sýrů zásluhou pana L. Liklera doplněno zajímavými sýry z dovozu. Tyto sýry jsou posuzovány odděleně, hodnotí je všichni členové odborných komisí i departážní komise. Každý hodnotitel sýr zařazuje do kvalitativních kategorií a navíc má právo 3 vzorky, které považuje za nejlepší, navrhnout na diplom. Jednoznačně nejlépe byl hodnocen kozí čerstvý sýr Petits Chévres Doux společnosti Lactalis Europe Centrale Et Orientale s. r. o., který získal 36 návrhů na diplom ze 44 možných. Diplomem byl dále oceněn sýr Langres (SEAFOOD s. r. o.) a Lazur Aksamit (MILKPOL s. r. o.). Sýry z dovozu dodala rovněž firma IMCO s. r. o. za zmínku stojí např. ovčí Pecorino Romano. Úplné výsledky jsou v tab. V. Tabulka III Rozdělení hodnocených sýrů do kvalitativních kategorií Kvalitativní kategorie Bodové hodnocení Odborné hodnocení počet % vz. Veřejné hodnocení počet % vz. Výborný (ideální typ) ,5 Velmi dobrý Průměrný (standardní kvalita) Podprům ěrný ,5 Nevyhovující <

14 Obr. 1 Porovnání relativních četností hodnocení expertů a při veřejném hodnocení. 25 Relativní četnost [%] Hodnocení expertů Veřejné hodnocení Bodové hodnocení Tabulka IV Výsledky Celostátních přehlídek sýrů Kategorie Pořadí odborného hodnocení Pořadí veřejného hodnocení Sýr Výrobce (přihlašovatel) Odborné hodnocení Průměrné hodnocení Interval spolehlivosti Neparametrické hodnocení Veřejné hodnocení Průměrné hodnocení Interval spolehlivosti Eidamský salámový polotvrdý sýr 30% MILTRA B, s.r.o., Městečko Trnávka 97,33 3,46 23,54 79,94 4, Eidam 30% t. v s. Mlékárna Klatovy, a.s. 85,33 3,15 22,73 79,77 3, Eidamská cihla MADETA, a.s. 77,00 5,04 20,60 76,80 4, Eidamský sýr 30% t. v s. Jaroměřická mlékárna, a.s., střed. M. Budějovice 73,33 6,53 18,68 73,43 4, Eidamská cihla - polotvrdý sýr Mlékárna Varnsdorf, s.r.o. 59,00 7,89 11,47 63,77 3, Eidamská cihla PLASTCOM, a.s., mlékárna Příšovice 53,33 7,41 8,49 56,86 4, Eidamský salámový polotvrdý sýr 40% MILTRA B, s.r.o., Městečko Trnávka 94,67 1,94 27,95 85,14 2, Eidamský sýr 45% t. v s. Jaroměřická mlékárna, a.s., střed. M. Budějovice 78,00 7,44 20,04 75,54 3, Eidamská cihla MADETA, a.s. 77,67 3,84 15,00 70,74 3, Eidamský blok 45 % Jaroměřická mlékárna, a.s., středisko Jaroměřice 74,33 1,57 17,02 73,03 2, MANDAVA, Bio sýr - polotvrdý sýr Mlékárna Varnsdorf, s.r.o. 66,33 8,91 13,29 68,57 3, Eidamská cihla FONDEL PLASTCOM, a.s., mlékárna Příšovice 64,67 4,71 10,83 64,57 4, Eidamský sýr 45% Mlékárna Polná, s.r.o. 55,67 7,40 18,86 74,63 4, Moravský blok 45% t. v s. Mlékárna Klatovy, a.s. 84,67 3,31 28,54 87,23 2, Krásná Haná KROMILK, s.r.o., Kroměříž 84,33 2,36 23,99 81,74 4, GASTON bazalka PLASTCOM, a.s., mlékárna Příšovice 76,00 6,48 15,88 74,10 3, Archivní sýr Jaroměřická mlékárna, a.s., střed. M. Budějovice 74,33 5,94 12,53 70,15 3, Zlatá Praha Mlékárna Polná, s.r.o. 64,00 2,48 17,07 74,77 3, Zámecký sýr Jaroměřická mlékárna, a.s., středisko Želetava 88,00 2,48 17,62 76,82 3, Goldenburg Krkonošské sýrárny, a.s. 88,00 3,20 21,67 80,05 2, Goldenburg lux Krkonošské sýrárny, a.s. 82,67 2,98 22,34 81,18 3, Madeland light MADETA, a.s. 79,33 4,25 18,40 76,31 3, Madeland MADETA, a.s. 75,00 3,16 14,04 73,18 2, Primátor II MADETA, a.s. 73,33 2,19 18,52 77,33 3, Primátor I MADETA, a.s. 72,33 5,67 24,41 82,67 3,36 Eidamský salámový polotvrdý sýr uzený MILTRA B, s.r.o., Městečko Trnávka % 85,50 2,94 21,15 78,63 3, Jihočeský uzený sýr MADETA, a.s. 78,50 2,94 21,05 77,71 3, Eidamský sýr uzený 45% Mlékárna Polná, s.r.o. 77,00 3,39 21,77 79,09 3, Eidamský uzený blok PLASTCOM, a.s., mlékárna Příšovice 75,50 2,94 13,63 68,06 4, Eidam uzený 45 % Krkonošské sýrárny, a.s. 73,00 1,96 18,71 75,20 3, Uzený eidam 40% t. v s. Mlékárna Klatovy, a.s. 66,50 2,94 20,69 77,49 4, Eidamský uzený blok PLASTCOM, a.s., mlékárna Příšovice 57,00 5,88 6,01 56,51 3,77 16

15 Tabulka IV pokračování Výsledky Celostátních přehlídek sýrů Kategorie Pořadí odborného hodnocení Pořadí veřejného hodnocení Sýr Výrobce (přihlašovatel) Odborné hodnocení Průměrné hodnocení Interval spolehlivosti Neparametrické hodnocení Veřejné hodnocení Průměrné hodnocení Interval spolehlivosti Sedlčanský Vltavín Povltavské mlékárny, a.s., Sedlčany 83,58 4,31 28,14 83,85 3, Sedlčanský Hermelín původní Povltavské mlékárny, a.s., Sedlčany 80,92 6,23 23,86 78,77 4, Kamadet Královský sýr MADETA, a.s. 73,67 2,10 31,14 87,95 2, Sedlčanský Hermelín smetanový Povltavské mlékárny, a.s., Sedlčany 73,58 5,72 19,89 74,41 3, Harlekýn 100 g Provital milk, a.s., provoz Plzeň 68,00 4,08 7,89 51,59 4, Sedlčanský Hermelín pikantní Povltavské mlékárny, a.s., Sedlčany 52,67 2,89 20,18 75,08 2, Camembert Karel IV 90g Provital milk, a.s., provoz Plzeň 52,00 2,17 5,91 45,54 4, Caesar Bleu MADETA, a.s. 88,75 5,77 23,12 78,77 4, Niva Premium MADETA, a.s. 75,33 3,67 31,06 87,95 2, Sýr Niva Mlékárna Otínoves, s.r.o. 73,67 3,36 18,74 74,41 3, Niva MADETA, a.s. 73,50 4,80 6,00 51,59 4, NIVA - sýr s plísní uvnitř hmoty Niva, s.r.o., Dolní Přím 59,92 6,56 19,09 75,08 2, Čerstvý sýr - přírodní chuť z Hané KROMILK, s.r.o., Kroměříž 90,20 4,27 11,44 73,00 5,09 Zálesák lahůdkový - termizovaný KROMILK, s.r.o., Kroměříž 2 3 smetanový sýr 84,60 4,30 18,41 83,38 4, FÉNIX termizovaný smetanový Jaroměřická mlékárna, a.s., středisko Jaroměřice 81,80 4,54 20,12 85,44 3, Lučina 100g Povltavské mlékárny, a.s., Sedlčany 75,80 3,22 19,45 85,13 2, Cottage MADETA, a.s. 67,00 3,57 11,70 73,44 5, Lučina do salátu Povltavské mlékárny, a.s., Sedlčany 60,00 4,37 15,39 79,88 4, MATADOR smetanový - tavený sýr BEL Sýry Česko, a.s., Želetava 94,20 1,48 21,04 84,94 4, Apetitto - tavený smetanový sýr BEL Sýry Česko, a.s., Želetava 93,60 4,00 22,22 86,31 3, NOVÝ SMETANOVÝ - tavený sýr TANY, s.r.o., Nýrsko 88,20 2,71 15,80 77,69 4, Nové Lipno, tavený nízkotučný sýr MADETA, a.s. 85,80 5,59 17,62 79,88 3, Nové Lipno, tavený lahůdkový sýr MADETA, a.s. 84,40 7,65 18,32 80,56 4, DELICATO - tavený sýr TANY, s.r.o., Nýrsko 82,80 2,12 18,04 80,38 4, NÍZKOTUČNÝ - tavený sýr TANY, s.r.o., Nýrsko 74,40 3,14 8,87 64,06 5, Apetito Super Cremo TPK s r.o., Hodonín 72,40 5,12 10,93 69,50 4, Maratonec TPK s r.o., Hodonín 62,20 4,03 11,66 70,00 5,14 Hermadur PRIBINA, s.r.o., Přibyslav 80,33 2,94 27,36 89,60 2,48 Blaťácké Zlato s pepřem MADETA, a.s. 78,67 3,15 15,78 76,57 3,87 Istambuli Mlékárna Kyjov, a.s. 74,67 2,61 18,10 79,43 3,06 Kyjovský sýr Božin - kořeněný Mlékárna Kyjov, a.s. 73,33 5,13 17,08 78,74 3,57 Eidamský salámový polotvrdý sýr MILTRA B, s.r.o., Městečko Trnávka ochucený 40%-mexické koření 72,00 2,48 15,47 77,43 3,02 Nakládaný sýr s feferony PRIBINA, s.r.o., Přibyslav 71,33 4,25 11,71 72,06 4,10 Tabulka V Výsledky Celostátních přehlídek sýrů zahraniční vzorky Sýr Dovozce Kategorie t. v s. [%] suš. [%] Modus Medián Návrhy na diplom Gorgonzola IMCO s.r.o Pecorino Romano IMCO s.r.o Brie President Lactalis Europe Centrale Et Orientale s.r.o Coulommiers President Lactalis Europe Centrale Et Orientale s.r.o Le Crémiot Bridel Lactalis Europe Centrale Et Orientale s.r.o Petits Chévres Doux Lactalis Europe Centrale Et Orientale s.r.o Krolewski MILKPOL s.r.o Lazur Aksamit MILKPOL s.r.o 'Chaurce Fermier SEAFOOD s.r.o Langres SEAFOOD s.r.o Kategorie sýrů: Kvalitativní kategorie: 4. Sýry s tvorbou ok 1. Vynikající 7. Sýry s plísní na povrchu 2. Výborný 8. Sýry s plísní v těstě 3. Velmi dobrý 12. Speciality 4. Průměrný 5. Podprůměrný 17

16 Tabulka VI Seznam sýrů vystavených v průběhu Celostátních přehlídek sýrů a semináře Mléko a sýry Výrobce Sýr Suš. (%) t. v s. (%) A.W. s r. o., Loštice Pravé olomoucké tvarůžky 34 3 Pozdrav z Loštic - kousky s kořením BEL Sýry Česko a. s. Apetitto - tavený lahůdkový sýr Řada ochucených tavených sýrů - Apetitto Řada ochucených tavených sýrů - Želetava Řada tavených sýrů Matador Jemný tavený sýr - Želetava Matador smetanový Krkonošské sýrárny a. s. Krkonošský eidam uzený - plátky Krkonošský sýr ementálského typu Goldenburg - plátky Goldenburg LUX - plátky Krkonošský eidam uzený - blok Krkonošský sýr ementálského typu Goldenburg - blok KROMILK s. r. o., Kroměříž Čerstvý sýr přírodní Čerstvý sýr příchuť česnek Čerstvý sýr příchuť Mexiko Čerstvý sýr příchuť křen Čerstvý sýr příchuť provensálské koření Hanácká koule, přírodní polotvrdý sýr Kromík - minigouda, přírodní polotvrdý sýr Krajanka - termizovaný smetanový sýr přírodní Krajanka - termizovaný smetanový sýr s bylinkami Krajanka - termizovaný smetanový sýr se salámem Herkules Zálesák lahůdkový, termizovaný smetanový sýr Zálesák se zeleninou, termizovaná smetanová pomazánka Lučanka se šunkou, termizovaná smetanová pomazánka Žervé smetanový Žervé s bylinkami Žervé se žampiony Žervé rajče a oliva Krásná Haná MADETA a. s. Madeland - jemný lahodný sýr holandského typu - plátky Madeland light - jemný lahodný sýr holandského typu - plátky Primátor - plátky Nové lipno nízkotučné Nové lipno lahůdkové Bláťácké zlato se zeleným pepřem Niva Premium Caesar Bleu Cottage - čerstvý sýr ve smetaně Tavený labužník se šunkou Tavený labužník se šunkou a zeleninou Jihočeský eidam plátkový Jihočeský eidam plátkový Eidam uzený plátkový Moravský bochník - plátky MILTRA B s.r.o., Městečko Trnávka Eidamský salámový polotvrdý sýr - ochucený

17 Tabulka VI - pokračování Seznam sýrů vystavených v průběhu Celostátních přehlídek sýrů a semináře Mléko a sýry Výrobce Sýr Suš. (%) t. v s. (%) Mlékárna Klatovy a.s., Klatovy Šumava - eidam 30% Šumava - eidam 30% - plátkový sýr Šumava -eidam 30% - bloček Šumava - eidam 40% Šumava -eidam 45% Šumava - eidam uzený 40% Šumava - eidam uzený 40% - plátkový sýr Šumava - polotvrdý sýr 50% Šumava - polotvrdý sýr 50% - plátkový sýr Šumava - polotvrdý sýr 50% - bloček Šumava - moravský blok 45% Šumava - moravský blok 45% - plátkový sýr Šumava - moravský blok 45% - bloček Jasan Mlékárna Kyjov a. s. Istambuli - bílý sýr dle balkánské receptury Kyjovský sýr Božin - přírodní bílý sýr kořeněný Mlékárna Otínoves s. r. o. Sýr Niva Niva extra Mlékárna Polná s. r. o. Balkánský sýr Koliba - pařený uzený sýr Eidamský sýr - bloček Eidamský sýr - blok výkroj Eidamský sýr uzený MP sýr eidam uzený s bazalkou 45 Niva s. r. o., Dolní Přím Niva -sýr s plísní uvnitř hmoty 50 PLASTCOM a. s., mlékárna Příšovice Gaston s bazalkou Eidamský uzený sýr Eidamský uzený sýr Eidamská cihla Eidamská cihla Eidamský uzený sýr - bločky Eidamský uzený sýr - bločky Eidamská cihla - bločky Eidamská cihla - bločky Polabské mlékárny a.s. Poděbrady a Mlékárna Varnsdorf Biosýr MANDAVA - polotvrdý sýr Povltavské mlékárny a. s., Sedlčany Lučina delikátní smetanová 29,5 58 Lučina do salátu 39,5 70 Lučina sladké ráno - s příchutí vanilky Lučina (v hliníkové fólii) 40 67,5 Figura - sedlčanský hermelín s jogurtovou kulturou Sedlčanský hermelín smetanový Sedlčanský hermelín původní Sedlčanský hermelín pikantní Sedlčanský vltavín Tartare gourmet s česnekem a bylinkami Provital milk a. s., mlékárna Plzeň Camembert - Karel IV Harlekýn TANY s. r. o. tavírna sýrů, Nýrsko Smetanový Tany - tavený lahůdkový sýr Delicato Tany - tavený lahůdkový sýr Šunkový Tany - tavený pomazánkový sýr Hajánek - tavený sýr Nový smetanový Tany - tavený lahůdkový sýr Nízkotučný Tany - tavený lahůdkový sýr Plísňový Tany - tavený pomazánkový sýr TPK s. r. o., mlékárna Hodonín Apetito SuperCremo - tavený sýr neochucený Maratonec - tavený sýr neochucený

18 Protože letošní ročník přehlídek byl jubilejní desátý, byly uděleny dvě zvláštní ceny. Cenu nejúspěšnějšího výrobce sýrů na celostátních přehlídkách získala MADETA a. s. za nejvyšší počet diplomů (celkem 27) obdržený v uplynulých deseti letech. Na předních místech v tomto žebříčku se dále umístily Mlékárna Klatovy a. s. a Krkonošské sýrárny a. s., které získaly 20 a více diplomů. Další mlékárny, které získaly více než 5 diplomů a patří tak k výrobcům s kvalitní produkcí, jsou uvedeny v tab. VII. Je zřejmé, že mlékárny s širokým sortimentem, které jsou schopné obsadit několik kategorií, mají v tomto hodnocení výhodu, přesto uvedené srovnání nesporně má určitou vypovídací hodnotu. Další cena byla udělena nejúspěšnějšímu sýru, kterým se stal Moravský blok Mlékárny Klatovy a. s. Vzhledem k tomu, že ve 2. ročníku přehlídek byly hodnoceny pouze tavené sýry, získal tento sýr až na jednu výjimku vždy diplom. Nejlépe hodnocené sýry v jednotlivých kategoriích jsou uvedeny v tab. VIII, nejsou zařazeny kategorie, které jsou hodnoceny jen krátce, sýry v těchto kategoriích tak neměly možnost opakovaně získat ocenění. Uplynulých deset ročníků přehlídek sýrů je nejen příležitostí k bilancování, ale také k zamyšlení, jakým způsobem v započaté tradici pokračovat. Snahou organizátorů je, aby Celostátní přehlídky sýrů i seminář Mléko a sýry přinesly účastníkům užitečné informace a aby byly také příjemným zážitkem. 20

19 Tabulka VII Nejúspěšnější mlékárny uplynulých deseti ročníků Celostátních přehlídek sýrů. Mlékárny s 20 a více udělenými diplomy: MADETA a.s., Č. Budějovice Mlékárna Klatovy a. s. Krkonošské sýrárny, a.s. Mlékárny s více než 5 udělenými diplomy: Jaroměřická mlékárna, a. s. Pribina s. r. o., Přibyslav Želetavská sýrárna a. s. - BEL sýry Česko MILTRA B s. r. o., Městečko Trnávka Mlékárna Polná, s. r. o. Moravia Lacto a. s., Jihlava Povltavské mlékárny, a. s. Sedlčany PROM s. r. o., mlékárna Dvorec u Nepomuku Kromilk s. r.o., Kroměříž Plastcom a. s., mlékárna Příšovice Tabulka VIII Nejúspěšnější sýry uplynulých deseti ročníků Celostátních přehlídek sýrů v jednotlivých kategoriích. Kategorie / sýr Výrobce Počet diplomů Eidamské sýry 20-30% t.v.s. Eidamský salámový polotvrdý sýr MILTRA B, s.r.o., Městečko Trnávka 5 Eidam 30% t.v.s., polotvrdý sýr Mlékárna Klatovy, a.s. 5 Eidamské sýry 40-50% t.v.s. Eidamský blok Krkonošské sýrárny, a. s. 6 Tvrdé a polotvrdé sýry s dobou zrání min. 3 měsíce Gaston - hnětený sýr s bazalkou PLASTCOM, a.s. a Mlékárna Polná 4 Sýry s tvorbou ok Primátor PROM s. r. o., mlékárna Dvorec u Nepomuku 4 Sýr ementálského typu Krkonošské sýrárny, a. s. 4 Sýry typu Moravský blok Moravský blok (Vladan) Mlékárna Klatovy a. s. 8 Uzené sýry Eidamský uzený blok Krkonošské sýrárny a. s. 5 Sýry s plísní na povrchu Niva Niva, s.r.o. Dolní Přím 4 Sýry s plísní v těstě Geramont Pribina s. r. o., Přibyslav 4 Speciality Blaťácké zlato s pepřem MADETA a. s. 5 21

20 CHEESE IN THE WORLD TODAY Edward Hopkin Former Director General of the International Dairy Federation The information in this paper is an introduction to the report by IDF published as Bulletin of IDF No 402/2005 which appeared in December 2005, summarizing the world market for cheese over the previous ten years. WORLD PRODUCTION As milk is the raw material cheese is made from it is logical to start a consideration of cheese production with that of milk. Milk World production of milk has increased 14% between 1995 and 2004 to reach t. Cows milk has grown only 11%, buffalo milk 41% and is now t. India is the world s largest milk producer at t. USA is largest producer of cows milk t. EU milk quotas have kept European production stable. Increased yield per cow and increased consumption in less-wealthy countries are responsible for the rise. New Zealand s production (cows milk) has grown by 59%. China s has tripled in ten years, growing 13.4% in one year alone! The Chinese government has promoted production and stressed the importance of milk. EU has made a serious effort to introduce school milk in China. Consumption is still mostly confined to the cities. Pakistan is also growing spectacularly if not at the same rate as China. Since 1995 buffalo milk has grown 36% but cows milk has doubled. Figures for 2004 are t for buffaloes and t for cows. Prediction for by OECD (Organization for Economic Co-operation and Development) gives an increase of 1.9% annually to reach t in Cheese Production peaked in 2004 at t, accounting for approximately 40% of world milk production. Annual growth rate over past decade was 2.3%. Cows milk = 95-96% of cheese production, the rest is buffalo, sheep, goat (also camel in Mauretania and yak in Outer Mongolia and some regions of China). In 2004 EU-15 led world production with t or 42% of the total. (It was 43.5% in 1995.) The EU-25 = 47.4% of world cheese. USA is the largest single country with t which is just under 25% of the total for the whole world. Then come: Germany t France t Italy t Netherlands t Egypt t (doubled since 1994) Poland t. Growth over the decade was as follows: EU 1.9% /year, US 2.5% /year, Africa grew by 54% over the ten years. Australia and New Zealand grew 50%. The new EU-10 have grown spectacularly since 1995 to t in 2004 (51% increase). Poland is half of this. 22

21 South America reached high point in 2000 at t and then dropped as consequence of economic crisis in Argentina. Argentina s production has perhaps only now recovered to the level in 2000 but data for 2005 are not yet available. The Balkans represents the only area showing a decrease over the decade. Not only the economic crisis and war in ex-yugoslavia resulted in a slump in production, but also production fell significantly in Bulgaria (by almost 50%) and Rumania (by 40%). European CIS (former Soviet Union) showed 24% increase in cheese over the decade despite a drop in milk production of 18%. In Russia, Ukraine and Belarus the trend is positive China, of course, has grown quickly, at 2.4% /year over the decade, but milk production has tripled in the same period. It is clear that cheese has not yet found its way into Chinese dietary habits, but it is expected to grow dramatically in the next decade. Prices and forecast for next 10 years Figure 1 show how prices fell in 2002 only to rise to a record level in OECD predicts cheese prices in 2014 will be 15% less than at the peak, but prices of other dairy products, not having peaked so strongly, will be rather closer to today s levels in World Prices (USD/100kg) Butter Cheese Skim Milk Powder Whole Milk Powder Figure 1 Development and Outlook for world marked prices for dairy products (Source: OECD-FAO Agricultural Outlook ) For the next decade OECD predicts steady annual growth rate of 1.8% in cheese world-wide as shown in Figure 2. This is almost exactly equivalent to the predicted growth in milk production in the same period. EU will grow slowly less than 1.4%, Russia even less 0.7%. USA will grow at 2.4% by t to reach t in For Africa growth is forecasted at 3.9% /year. 23

22 China should grow by 6.5% /year over the decade and even 7.6% annually for the next five years. New Zealand should grow by 4.2% annually and catch up with production in Australia by Cheese will remain the most important dairy commodity world-wide, accounting for about 40 % of world milk production, the same as it does today. Of course the OECD is not the only body to forecast the evolution of the world cheese market. As these forecasts do not all use the same methods to analyse the data they reach different figures. But, even if the others may consider the OECD forecast optimistic, they do agree that the world market will grow in the next ten years - and that cannot be bad for the dairy sector. 25,000 20,000 '000 tones 15,000 10,000 5,000 0,000 Average est Figure 2 Outlook for World cheese production (Source: OECD-FAO Agricultural Outlook ) OECD Non-OECD World CHEESE TYPES The IDF survey distinguishes and provides detailed data concerning: hard and semi-hard cheese e g Cheddar, Edam, Emmental, Feta, Gouda, Parmiggiano soft cheese, e g Camembert, Herve blue cheese, e g Danablu, Gorgonzola, Stilton, Roquefort fresh cheese, e g cottage cheese, Mozzarella, Ricotta, Quark, Tvaroh, Turo other (non-specified) processed cheese. Fresh cheese has grown remarkably at 2.9% /year over the decade, in particular, Mozzarella, Ricotta and Cottage cheese which are used as ingredients and in food service. The major producers are USA, EU-15 and Poland. Australia s production doubled in 10 years. Hard and semi-hard cheese remains the predominant type with 50.9% of total production. Growth over the decade has been more modest at 1.9% /year. Soft cheese has also grown at 1.8% /year. France remains the leading country. Blue cheese passed a peak in 1999 but has lost 3.5% over the whole 10 year period. Processed cheese has been nearly stable, with a fall in 2004 after a peak of t in

23 CHEESE CONSUMPTION Consumption has grown in most countries (except Israel, and Australia/New Zealand where it has stagnated). Countries of the EU-15 increased 1.6% /year, reaching 19.1 kg per head in New EU members have grown considerably in recent years. USA consumption grew 1.6% /year reaching 15.7 kg per head. For China and India we have no exact figures but forecasts suggest important development. Greece has overtaken France as the country with the greatest consumption at 28.7 kg per person per year. France is now at 24.5 kg per head. Iceland comes third with 24.0 kg per head. Iceland, incidentally, is N 1 in per caput consumption of liquid milk Consumption of cheese, along with that of other dairy products, is driven by population growth (not surprisingly) and income growth. Introduction of new cheese varieties, expansion of cold storage facilities and improved marketing and packaging all stimulate consumption. The expansion of the ingredients and food service sectors is also very significant. Cheese prices are expected to be 15% below current levels in 2014 and this is certain to have a positive influence. In OECD countries future growth is forecast at 1.7% per year although, as Figure 3 shows, there are differences. EU-10 will grow at 4% /year and USA at 2.3%. In non-oecd countries growth will be 3% Index 2005 = World EU 15 EU 10 Australia USA Argentina China Russia Africa Figure 3 Outlook for consumption of cheese, 2005 to 2014 (Source: OECD-FAO Agricultural Outlook ) 25

24 INGREDIENTS AND FOOD SERVICE Distinction between them As different definitions are used in different countries published figures cannot be compared directly. The IDF survey defines the ingredients market as cheese used in catering (pizzas, burgers, sandwiches, salads) and all food processing uses and food service as commercial outlets from fast food establishments to cafés and restaurants and institutional (hospitals and schools and government canteens). One difficulty for this report is that publicly available data on this sector are relatively scarce. Potential for growth The main cheeses involved are Mozzarella, Ricotta, Cheddar, Gouda, Feta and processed cheese. Eating away from home and take-away food have grown to form a major sector in USA and are growing to different extents in many other countries. In US today 70-75% of cheese is consumed as an ingredient. Italian style food (pizza, pasta, lasagne), together with use of Feta in salads is increasingly popular in many countries. Growth is expected to continue in this food service sector as consumers go for convenience, flexibility and speed of preparation. In Asia, former eastern Europe, Latin America and Africa cheese is either expensive or less common and market shares are less than 10%. Westernized lifestyle is gaining ground, however, and cheese use can be expected to grow despite the relatively high price. INTERNATIONAL TRADE Impact of WTO agreements Implementation of the GATT Uruguay Round agreements started at the beginning of the 10-year period that has been surveyed. Now we have to evaluate the impact on world cheese markets of the conclusions of the difficult negotiations in the Doha round (which were reached after the publication of Bulletin of IDF N 402/2005). World trade in cheese has increased by 34% in the past 10 years. Compare this with the increase in cheese production of 20%. Liberalization of world trade seems to be having an effect. Many countries have increased their trade. See Figure 4. Australia and New Zealand have enjoyed the greatest growth, virtually doubling their trade and increasing their share of the world market from 24% to 37%. For the EU it is the opposite story. EU-15 exports dropped 25% to 1999 though they have recovered since. EU-25 now has 43% of world trade. The new EU-10 countries almost doubled their exports in the 10 years. USA has also almost achieved 100% growth. Canada, Norway, Switzerland, Argentina all saw sales peak in mid-term only to decline again by Implementation of GATT agreement is partly the cause of all of theses developments. But there were also economic crises in a number of important markets Russia, Asia, Argentina that were a setback to world trade in cheese. Enlargement of the EU also had an effect, stimulating growth in the new members (but also affecting the statistics with the 10 countries joining the single market and their trade with EU-15 no longer counting as international trade). World cheese market suppliers are (1) Australia t, (2) New Zealand t, (3) Germany t. Largest export destinations are Japan ( t) and USA ( t). Future potential Implementation of the WTO negotiations remains exceedingly difficult to predict time-wise, but the principle is quite clear: elimination of export subsidies. World trade should increase when this is accomplished. Russia is an important export destination but is vulnerable to sudden fluctuations. China has enormous potential, but first cheese has to become more popular! 26

25 '000 tonnes EU New Zealand Australia Others USA Figure 4 World marked for cheese export by shares in volume, 1994 to 2004 Source: ZMP (EU12 in 1994, EU15 in , and EU25 from the 1 st of May 2004) ANECDOTE Innovation in marketing Ploughman s Lunch Innovation is important in the cheese, as it is for most dairy products. Innovation in marketing is probably more important than technical innovation. In the UK at the end of the 1950s the production of cheese grew again after the disruption created by W W II and a problem arose with selling the increased production. In an English pub one evening the Chairman of the Milk Marketing Board, Sir Richard Trehane, who was also President of IDF at the time, was discussing the problem with the publican. Out of the conversation came the idea of selling cheese in pubs with a large piece of bread, some butter, some pickle and a glass of beer and they called it a Ploughman s Lunch. The idea took off, as they say, and this simple meal has become a popular favourite. The new edition of the Oxford English Dictionary cites an internal memorandum of the Milk Marketing Board as the source of the term which is now widely known in English! If you wish to know more about cheese in the world, acquire a copy of Bulletin of IDF N 402/2005 World Market for Cheese info@fil-idf.org website: Search in Publications 27

26 VÝVOJ VE VÝROBĚ A PRODEJI SÝRŮ V ČESKÉ REPUBLICE A NAŠE PERSPEKTIVY DO BUDOUCNA Kopáček Jiří Českomoravský svaz mlékárenský TRENDS OF CHEESES PRODUCTION AND SALES IN CZECH REPUBLIC AND OUR FUTURE PROSPECTS Výroba sýrů se za několik posledních let stala celosvětově velmi perspektivním oborem, neboť se jedná o nejefektivnější způsob zhodnocení mléčné suroviny. Sýr je výrobek s vysokou přidanou hodnotou, tedy produkt, na kterém by měly jeho výrobci vždy profitovat. Sýr je mléčný výrobek, který podstatně přispívá ke zdravé výživě. Velká rozmanitost druhů sýrů dává každé věkové skupině možnost zařadit tuto cennou základní potravinu do jídelníčku. Sýr poskytuje především bílkoviny s významnou nutriční hodnotou, ale také mléčný tuk. Různé druhy sýrů se pak vyznačují i vysokým obsahem minerálních látek, z nichž přední místo zaujímá vápník, důležitý a nezbytný pro růst a zdraví kostí. Neméně důležité jsou ale i další minerálie jako fosfor, hořčík, sodík, draslík, aj., ale rovněž významné vitaminy a stopové prvky. Sýr je tedy potravinou, která zůstane trvalou součástí stravy dnešní populace a to vytváří pro zpracovatele mléka skvělé šance a příležitosti do budoucna. Jak je to v současnosti s výrobou sýrů v ČR a jaké šance se před naším průmyslem v tomto směru otevírají? 1. Výroba sýrů Světová výroba sýrů dlouhodobě roste. V roce 2004 bylo dle statistiky Mezinárodní mlékařské federace průmyslově vyprodukováno 16,1 mil.tun sýrů, přičemž v posledních deseti letech je dosahována průměrná meziroční míra růstu 1,5 2,0 %. Podle údajů OECD/FAO bylo v uvedeném roce vyprodukováno dokonce 17,778 mil.tun sýra. V tomto údaji jsou však zahrnuty výrobky ze všech druhů hospodářských zvířat, tedy nejenom z mléka kravského, ovčího či kozího, ale rovněž sýry z mlék buvolů, velbloudů, příp. dalších zvířat; tento údaj zahrnuje vedle průmyslové výroby sýrů rovněž odborný odhad výroby sýrů přímo na zemědělských farmách a malých hospodářských usedlostech. Nejvýznamnější oblastí výroby sýrů je jednoznačně Evropská unie, ve které se vyrábí okolo 8,5 mil.tun sýrů, následována severní Amerikou s více jak 4,5 mil.tun. Významnými výrobci jsou také Oceánie, Argentina, Egypt, a další. Převážná část sýrů se vyrábí z kravského mléka, kterého se celosvětově v sýrařství využívá okolo 40 %. V České republice je sýrařství dnes skutečně nejdynamičtěji se rozvíjejícím se mlékárenským odvětvím. V roce 2004 bylo vyrobeno 148,6 tis. tun sýrů a tvarohů; v roce 2005 výroba především z důvodů významného dovozu ze zemí Unie poklesla o téměř 5% na pouhých 141, 2 tis. tun. Na celosvětové průmyslové výrobě sýrů se tedy podílíme asi 0,9 %, na průmyslové výrobě EU-25 dosahuje náš podíl okolo 1,75 % a řadíme se z hlediska objemu výroby v současnosti na 9.místo v EU-25. V Evropské unii patří k nejvýznamnějším výrobcům Německo (24,2 %), Francie (22,0 %), Itálie (12,7 %), Nizozemí (8,8 %) a Polsko (6,5%). K výrobě sýrů a tvarohů se z českých dodávek mléka využilo ke zpracování na sýry v roce 2004 přibližně 41,5 % mléčné plasmy a přibližně 23 % mléčného tuku. Z celkové české výroby připadl v roce 2005 na přírodní sýry objem tun (= 65 %), na sýry tavené objem tun (14 %) a na konzumní tvarohy pak objem tun (21 %). Na obrázku 1 je znázorněna výroba sýrů a tvarohů v ČR za posledních 10 let. Sýry se v České republice vyrábějí průmyslovým způsobem ve 36 podnicích a celkem ve 43 provozech. Největší sýrárnou je závod akciové společnosti Madeta v Plané nad Lužnicí, ve kterém se nyní produkuje přibližně 9 % celkové české výroby sýrů, a dokonce přibližně 13,5 % produkce polotvrdých a tvrdých sýrů, jež u nás tvoří nejvýznamnější segment. Dalšími skutečně velkými provozy pak jsou TPK s.r.o. Hodonín jako závod specializovaný na výrobu tavených sýrů; společnost Moravia Lacto, a.s. v Jihlavě s nedávno instalovanou moderní sýrařskou halou; společnosti Pribina s.r.o. v Přibyslavi se špičkovou technologickou linkou na výrobu sýrů s plísní 28

27 na povrchu či závod vybudovaný na zelené louce a uvedený do provozu v listopadu 2005 společnosti Miltra B, s.r.o. v Městečku Trnávka. Samozřejmě v Čechách a na Moravě operují další výrobci sýrů a tvarohů se zajímavými moderními technologiemi, které již jsou srovnatelné s evropskými parametry ,9 126,0 133,4 137,1 145,3 143,3 146, ,7 141, , tuny přírodní tavené tvaroh Obr. 1 Vývoj výroby sýrů v ČR v letech Současný sortiment sýrů v ČR Čerstvé a termizované sýry Tato výrobková skupina tvoří 8,4 % z celkové výroby přírodních sýrů. Poptávka po čerstvých nezrajících a termizovaných sýrech zaznamenala v posledních letech výrazné oživení především díky zavedení výrobku Lučina a v roce 2004 překročila dokonce 8 tis.tun. V roce 2005 vyrobilo celkem 7 podniků tun těchto výrobků (index 96,2%). K nejvýznamnějším výrobcům patří Povltavské mlékárny, a.s. Sedlčany, velmi rozmanitý sortiment dále nabízí Kromilk spol. s r.o. Kroměříž. Bílé sýry (uchovávané v solném nálevu) Jedná se o svéráznou skupinu sýrů, jejichž konzumace je rozšířena především na Balkánském poloostrově, ale také na Středním a Dálném východě. Zatímco se v těchto regionech vyrábějí tyto sýry výlučně z ovčího nebo kozího mléka, u nás se jednalo vždy o výrobu z mléka kravského. Segment bílých sýrů byl dlouhodobě stěžejním vývozním artiklem českého mlékárenství, který směřoval právě do uvedených oblastí. Dnes se bílé sýry stále ještě podílejí téměř 9 % na celkové výrobě našich sýrů, výroba však má již spíše klesající tendenci. Zatímco ještě v polovině devadesátých let jsme vyráběli pro země arabského světa okolo tis.tun této výrobkové skupiny ročně (např. druhy Akawi, Jadel, Istanbuli, Balkánský sýr), v roce 2005 to bylo již pouhých tun s indexem 88,2 %. Snížení výroby bylo způsobeno především změnou pravidel obchodní politiky EU do třetích zemí (snižování vývozních dotací), ale částečně také problémy společensko-politickými (komunikace s muslimským, resp. arabským světem). I když je snaha přiblížit i tuto výrobkovou kategorii českému, resp. evropskému spotřebiteli (především novým způsobem balení, snížením obsahu soli ve výrobku, ale také účinnou marketingovou komunikací), původní výrobní objemy docilované v ČR se již asi nevrátí, spíše bude potřeba počítat ještě s dalším mírným poklesem. 29

28 Plísňové sýry Plísňové sýry, a to ať už s ušlechtilou plísní uvnitř hmoty (tzv. modré sýry), či s plísní na povrchu, zaznamenávají u nás skutečný výrobní a spotřebitelský boom. Zatímco v roce 1995 představovala jejich výroba něco přes 5 tis. tun ročně, dnes je to již téměř 15 tis.tun. Plísňové sýry tvoří 16,3 % celkové české výroby přírodních sýrů. V roce 2005 bylo vyprodukováno tun (index 106,2 %). Modré sýry jsou vyráběny především v závodě Madeta, a.s. v Českém Krumlově, kde se vedle tradiční Nivy vyrábějí i její vylepšené varianty (např. Zlatá Niva, Niva Premium a vysokotučný plísňový značkový produkt Caesar Bleu). Dalšími výrobci jsou společnost Niva s.r.o. Dolní Přím; Mlékárna Otínoves, s.r.o. Lídrem trhu v kategorii sýrů s plísní na povrchu jsou pak závody skupiny Bongrain, a to Pribina, s.r.o. Přibylav (značky Král sýrů, Hermelín, Geramont a nově např. Hermadur) a Povltavské mlékárny, a.s. Sedlčany (spotřebitelsky oblíbená značka Sedlčanský Hermelín). Měkký sýr Kamadet s bílou plísní na povrchu vyrábí Madeta, a.s. závod Řípec. Povltavské mlékárny, a.s. Sedlčany vyrábí rovněž dvouplísňový sýr Vltavín. Polotvrdé sýry Polotvrdé sýry tvoří nejrozšířenější skupinu sýrů v Česku (asi 53% z výroby přírodních sýrů) a jsou vyráběny v 18 provozech. Výroba se v posledních letech pohybovala okolo 50 tis.tun, nicméně v uplynulém roce došlo k jejímu značnému poklesu na pouhých tun (index 91,7 %), což bylo způsobeno zvýšeným dovozem těchto sýrů ze zemí EU, především z Německa a z Polska. Dovezené sýry nešly vždy do konzumu přímo, ale často prostřednictvím našich sýráren, které si často přikupovaly ze zahraničí levnější surovinu na další zpracování a zušlechtění, např. pro výrobu plátkových a porcovaných sýrů. K dovezené surovině tak byla u nás přidána pouze přidaná hodnota. Nejvíce zastoupeným výrobkem této skupiny jsou sýry eidamského typu, a to jak v různých formách balení (hranoly, cihly, bloky či tradiční koule), o různých tučnostech (od 20 do 50 % t.v suš.), či v různém finálním provedení (výrobky určené pro krájení v sýrových pultech či spotřebitelská balení pro samoobslužný regál, sýry mladé či archivní, sýry v provedení konvenientní potraviny (předsmažené výrobky), sýry uzené, apod. Velmi oblíbenou kategorií se stávají polotvrdé sýry s tvorbou ok, tedy sýry holandského typu maasdam. Mezi nimi jednoznačně dominuje Madeland, který má své místo na trhu úspěšně zajištěno již od poloviny devadesátých let, jeho novými konkurenty se stávají Zámecký sýr z Jaroměřické mlékárny, Montana z Jihlavy či Kralevic ze sýrárny v Kralovicích. Tvrdé a extratvrdé sýry Skupina tvrdých sýrů je technologicky velmi blízká předchozí kategorii a je třeba poznamenat, že spotřebitelé příliš mezi těmito dvěma skupinami nerozlišují. Tvrdé sýry jsou v našich podmínkách také velmi oblíbenými, a to především díky sýrům ementálského typu značek Primátor (výrobce Madeta a.s.) či Goldenburg (Krkonošské sýrárny), ale také díky tradičnímu českému zástupci sýru Moravský blok (nejvýznamnější výrobci jsou Mlékárna Klatovy a.s. a Moravia Lacto, a.s. Jihlava). Mezi extratvrdé sýry se pak řadí parmezánské druhy, které jsou u nás zastoupeny skvělou značkou Gran Moravia ze společnosti Orrero v Litoveli. Tato specialita se nejenom úspěšně etablovala na českém trhu, pro výrobce je však především skvělým exportním artiklem. Tvrdé sýry zaznamenaly v uplynulém roce markantní navýšení výroby a dosáhly tak podílu 9,5 % z celkové české výroby přírodních sýrů. Bylo vyrobeno tun, což představuje meziroční index dokonce 153,5 % a který částečně eliminuje propad u skupiny polotvrdých sýrů. 30

29 Speciality Kategorie specialit není blíže statisticky sledována a je uváděna většinou v položce ostatní. Je tedy vhodné vyjmenovat alespoň některé zástupce výrobců a jejich tradiční produkty. Madeta a.s. Řípec vyrábí sortiment měkkých sýrů Blaťácké zlato ; v závodě Madeta a.s., v Jindřichově Hradci vzniká měkký zrající sýr s mazem na povrchu Romadur; Madeta a.s., závod Prachatice vedle výroby bílých a tvrdých sýrů vyrábí pro gastronomii také Mozzarellu; měkký zrající sýr Baladur produkuje závod Provital milk s.r.o. v Plzni; Pribina s.r.o. Přibyslav je jediným provozem na úpravu konvenientních sýrových výrobků; pařené sýry pocházejí v Česku z Mlékárny Polná s.r.o. Není se možné nezmínit také o jediném zcela původním českém výrobku a to o Pravých olomouckých tvarůžcích ty jsou dnes již vyráběny v jediné společnosti, a to v A.W., s.r.o. Loštice. Sýry italského typu jako je Mozzarella, Ricotta či Mascarpone patří do sortimentu společnosti Italat CZ, s.r.o. z Blatnice pod sv.antoníčkem a výrobce Italsýr s.r.o. vyrábí v Jihlavě rovněž italskou Mozzarellu. Tavené sýry Mluvíme-li o českém sýrařství, nelze nezmínit sýry tavené. Ty jsou u nás totiž naprosto výjimečnou výrobkovou skupinou z hlediska spotřebitelské oblíbenosti, která se odráží v naprosto nejvyšší spotřebě sýra na obyvatele na světě. U nás se totiž ročně zkonzumuje až 2,7 kg tavených sýrů na hlavu (Irsko 2,2 kg, USA asi 1,7 kg, jinak se spotřeby pohybují většinou okolo 1 kg). V Čechách se v současnosti ročně vyrábí okolo 20 tis. tun, ale dalších více jak 7 tis. tun se k nám dováží. V uplynulém roce se výrobou tavených sýrů zabývalo 14 společností, nicméně podstatná část produkce se odehrává pouze v pěti z nich. Společnost TPK s.r.o. Hodonín produkuje 40 % všech v Česku vyráběných tavených sýrů, Bel Sýry Česko, a.s Želetava se podílí na výrobě 20 % a třetím hráčem pak je Madeta, a.s. závod Řípec (asi 19% produkce). Tvarohy Rovněž výrobková skupina konzumních tvarohů se technologicky řadí do kategorie sýrů. Tvarohy jsou tradiční a neoddělitelnou součástí českého jídelníčku. Spotřeba se pohybuje okolo 3,4 kg na hlavu a byla v minulých letech kryta především domácí výrobou. Po otevření evropského komunitárního trhu se však na náš trh dostávají levnější výrobky ze sousedních zemí, což má za následek výrazný pokles domácí výroby. V roce 2005 bylo vyprodukováno tis. tun, což představovalo index pouhých 85,7 % a což bylo také největší příčinou propadu celkové výroby sýrové kategorie. Konzumní tvarohy vyrábí v Česku řada producentů. K nejvýznamnějším se však řadí Polabské mlékárny, a.s. Poděbrady (asi 1/4 české produkce), dále pak Madeta, a.s. závod Jindřichův Hradec a Mlékárna RMD Olešnice, kde je instalována velmi zajímavá kontinuální výrobní linka. 2. Zahraniční obchod se sýry Zahraniční obchod se sýry zaznamenává významný vývoj. V posledních deseti letech rostl nejenom export našich výrobků, významný nárůst je však dosahován hlavně u dovozu, který zintensivnil především po otevření hranic s Evropskou unií. Na obrázku 2 je uveden vývoj exportu a importu v ČR v tunách za rok. Dovoz sýrů Dovoz sýrů do ČR přispíval donedávna přibližně 15 % k celkové české spotřebě sýrů a zvyšoval se z průměrných 12 tis. tun v polovině devadesátých let na úroveň vyšší než 20 tis. tun před vstupem ČR do EU. Po přistoupení se však vyšplhal na úroveň 44,1 tis.tun, která byla dosažena za rok Hlavními dovozními zeměmi pro nás jsou Polsko, Německo a Slovensko a hlavní dovážené komody tvoří polotvrdé a tvrdé sýry a tvaroh, jejichž import má přímou vazbu na snižování výroby v Čechách a dále pak tavené sýry. Dva z významných francouzských operujících tavírenských společností na českém trhu totiž vyrábějí významnou část produkce určené pro ČR na Slovensku a v Polsku. Dovoz ze zemí EU-25 dnes představuje 99 % celkového importu 31

30 tuny Export Import Obr. 2 Vývoj zahraničního obchodu ČR se sýry v letech Vývoz sýrů Export sýrů z Česka se stabilizoval na úrovni okolo 19 tis. tun a jakkoliv je trend spíše slabě rostoucí, má celková bilance zahraničního obchodu naopak snižující tendenci z důvodů masivních dovozů. Nejvýznamnějšími exportními teritorii byly pro nás země arabského světa, kam směřovaly až 2/3 dovozu (především skupina bílých sýrů). Tento podíl je však dnes již na pouhé třetině a pravděpodobně se dále sníží. Zvyšující se množství sýrů se však dnes prodává hlavně do zemí EU-25 (již 2/3 vývozu). Na zahraničních trzích se obchodují především blokové sýry určené k dalšímu zpracování a zušlechtění v průmyslu, do Unie se však již od minulého roku dostávají také spotřebitelské produkty s vysokou přidanou hodnotou (hlavně na Slovensko, do Polska a do Německa). 3. Spotřeba sýrů v Česku Jak již bylo dříve uvedeno, jde spotřeba sýrů v České republice, stejně tak jako výroba, ruku v ruce s celosvětovými vývojovými trendy. V roce 2005 byla u nás dosažena zatím historicky nejvyšší spotřeba sýrů a tvarohů, a to ve výši 16,2 kg/osobu. Spotřeba u nás sice nedosahuje úrovně největších světových konzumentů sýrů (Řecko 29kg, Francie 25kg, Německo 22kg, EU-15 19kg), je ale jednoznačně nejvyšší ze zemí střední a východní Evropy a předčí i řadu významných mlékařských zemí (V.Británie, Španělsko, Austrálie, Nový Zéland). Na celkové spotřebě 16,2 kg se přírodní sýry podílejí hodnotou 10,1 kg (62 %), tavené sýry 2,7 kg (17 %) a konzumní tvarohy 3,4 % (21 %). 4. Očekávané vývojové trendy Aby bylo možné seriózně odhadnout další vývoj v sýrařském odvětví u nás, je dobré si nejprve provést analýzu silných a slabých stránek a šancí a rizik, které před průmyslem stojí (tzv. SWOT analýza). Silné stránky Sýry jsou v ČR tradiční a neopominutelnou součástí jídelníčku Máme zmodernizované výrobní provozy (většinou v souvislosti se vstupem do EU) Provozujeme řadu špičkových sýráren a tavíren plně srovnatelných s nejmodernějšími kapacitami v Evropě (Planá n.l., Přibyslav, Hodonín, Jihlava,) Je zde dobré know-how odborného personálu především v segmentu tradičních sýrařských produktů 32

31 kg na obyvatele a rok ,3 11,3 11,5 12,0 13,0 13,9 13,8 14,2 14,7 15,6 16, sýry tvarohy Průměrná míra růstu: 6,8 % meziročně Obr. 3 Spotřeba sýrů a tvarohů vývoj Slabé stránky V ČR je vysoký počet sýrařských provozů, což vede k relativně nízkému stupni koncentrace výrobců, malým kapacitám a zhoršení jejich konkurenceschopnosti Některé výrobní kapacity jsou velmi malé, což z ekonomických důvodů snižuje jejich konkurenceschopnost V porovnání s evropskými/světovými výrobními lídry jsou relativně malé i největší české zpracovatelské kapacity, které vyrábějí asi tis.tun sýra ročně; největší výrobní kapacity v Evropě produkují tis.tun sýra ročně Ve vývozu výrobků je zatím stále málo produktů s vysokou přidanou hodnotou Český průmysl se potýká s omezeným množstvím finančních prostředků pro investice a další modernizace Nemáme vždy dostatečné marketingové zkušenosti a často chybí našim výrobcům dostatek finančních prostředků pro podporu prodeje Je zde stále ještě nízký stupeň zbožíznaleckých vědomostí u obchodních partnerů a u spotřebitelů a někdy i u samotných výrobců. Jaké máme příležitosti a šance? Významně rostoucí spotřeba sýrů, která jde ruku v ruce se současnými celosvětovými trendy v sýrařství Dobrá a stále se ještě rozvíjející distribuční a maloobchodní síť Možnost vytváření kooperací se zahraničními investory (vytváření joint-venture, nákup licencí, vznik kapitálových propojení, získávání osvědčených know-how) Zlepšování marketingového přístupu výrobců; vytváření silných obchodních značek (např. Král sýrů, Madeland, Apetito, Želetava,..); využívání mediální podpory; osvěta a P.R.-komunikace zdravé výživy umožní posilování spotřebitelského uvědomění. A jaké před námi stojí rizika? Relativně vysoká cena za mléko a přetrvávající tlak zemědělců na její udržení, což má vliv na vysoké výrobní náklady a tím na konkurenceschopnost 33

32 Výroba analogů, tedy náhražek s využitím např. rostlinných tuků (např. tzv. Eidam- Alternative ) Rostoucí dovoz levných výrobků ze zemí EU-25 nejen pro přímý prodej, ale také jako polotovar pro další zpracování, což vede nejen ke ztrátě vlastní identity, ale často to mívá dopad do kvality produkce Vstup některých zahraničních investorů na český trh včetně přebírání suroviny může ovlivnit sýrařský sektor Nízký stupeň zbožíznaleckých vědomostí u obchodních partnerů a u spotřebitelů, někdy i u samotných výrobců Liberalizace světového obchodu a tím dopad opatření WTO a CAP na zahraniční obchod by mohly rovněž negativně zasáhnout sektor, např.ztrátou odbytišť ve třetích zemích Co nás tedy pravděpodobně čeká a je nevyhnutelné? Z pohledu konkurenceschopnosti je nutná další koncentrace a specializace. Příležitostí pro malé firmy bude výroba okrajových specialit. Udržení konkurenceschopnosti si také vyžaduje snižování ceny nakupovaného mléka v duchu reformy společné zemědělské politiky EU. Z pohledu marketingu se bude zvyšovat diskontní prodej, bude se omezovat pultový prodej ve prospěch samoobslužných regálů, na našem trhu se objeví další výrobky ze zemí EU, a to jak levné výrobky, tak sýrové speciality. Bude třeba posílit výrobu značkových produktů, a to jak výrobců, tak privátních značek obchodních řetězců. Zvýší se nabídka výrobků konvenietních (předpřipravených). Otázkou zůstává vybudování speciální sítě obchodů se sýry typu sýroték. V zahraničním obchodu by cílem mělo být obnovit nebo zlepšit vztahy s Ruskou federací, zemí s vysokým spotřebitelským potenciálem. Pokud mlékárny nabídnou výrobky s vyšší přidanou hodnotou, mají šanci se uplatnit i na trhu EU., naopak z důvodů liberalizace světového obchodu poklesne odbyt do zemí 3. světa, zejména se to týká bílých sýrů. Další možnosti je otevírání výrobních filiálek českých podnikatelů ve 3. zemích 5. Závěr Jak z předchozího vyplývá, je sýr takovým mléčným výrobkem, který bude mít díky své vysoké přidané hodnotě svoji neoddiskutovatelnou budoucnost a perspektivu. Organizace OECD na základě expertních propočtů předpovídá pro období příštích 10 let ( ) velmi pozitivní vývoj s průměrnou mírou růstu ve výši 19,9%. Podle těchto prognóz byl měl vývoj jít nejrychleji v rozvojových zemích jako jsou Čína (+87,7%), země afrického kontinentu (+46,8%), a také v oblasti jižní Ameriky (Brazílie +28,9%; Argentina +39,3%). Pro Rusko se předpovídá nárůst pouhých 6,9% a pro Japonsko +17,1 %. Vysoký nárůst je očekáván také v USA (+27,2%), na Novém Zélandu (+50,7%) a v Austrálii (+19,3%). V nových členských zemích Evropské unie (EU-10) je počítáno s navýšením o 22,1 %, zatímco ve starých členských zemích by měl být vývoj výroby sotva poloviční (+10,8%). V České republice je současný stav spíše obrazem západoevropského prostředí nežli např. situace v pobaltských zemích a rozvoj sýrařství v posledních letech již zaznamenal významnou progresi, domnívám se, že další vývoj bude kopírovat spíše západoevropský scénář, tedy asi 1% meziroční míru růstu. To by tedy znamenalo nárůst výroby oproti roku 2005 asi o 9 % na úroveň okolo tisíc tun. Roční spotřeba se by se mohla v tomto období ustálit na úrovni okolo kg na osobu a dostat se tak na průměrnou spotřebu evropské pětadvacítky. Kontaktní adresa: Ing. Jiří Kopáček, CSc., Českomoravský svaz mlékárenský, V Olšinách 75, Praha 10 jkopacek@cheesespectrum.cz 34

33 VLIV SLOŽENÍ SÝRŮ EMENTÁLSKÉHO TYPU NA VÝSKYT MÁSELNÉHO KVAŠENÍ Erban Vladimír 1, Černý Vladimír 2, Havlíková Šárka 2, Kvasničková Eva 2, Pufrová Eva 2, Komárková Eliška 1 1 Výzkumný ústav potravinářský Praha, 2 Výzkumný ústav mlékárenský, MILCOM, a.s. EFFECT OF HARD CHEESE COMPOSITION ON TYPE AND INCIDENCE BUTYRIC FERMENTATION Summary: The final sensory quality of cheeses depends on butyric fermentation caused, by Clostridium tyrobutyricum. In the text is presented analyse of 60 blocks of cheeses from all four seasons through manufactory production - before and after fermentation cellar and rape chesses. The effect was studied on determination produced lactic, acetic and butyric acid and growth of propionic bacteria and Clostridium tyrobutyricum and determination physical parameters water activity (Aw) and ph. It follows these results: the production of butyric acid depend not only on Aw but also on ph higher then 5.5, presence minimally 10 3 cells of Clostridium tyrobutyricum in gram of cheese and propionic acid with acetic acid should be on minimal level. Vedle požadavku na zdravotní nezávadnost sýra jsou základními znaky kvality zralého ementálského sýra odpovídající fyzikálně-chemické složení a senzorické vlastnosti. Při zrání a vývoji výsledné chuti a vůně zralých sýrů hrají významnou úlohu změny bílkovinné matrice sýrů spolupůsobením proteáz z mléka, použitého syřidla, použitými čistými mlékařskými kulturami i kontaminující mikroflórou (např. termorezistentní nebo sporulující), přežívající pasteraci mléka určeného pro výrobu sýrů. Významný vliv na výslednou kvalitu ementálského sýra mají sezónní vlivy, zejména vliv krmení siláží, ve kterých může být vysoký obsah sporulující mikroflóry. Proto byly sledovány sezónní vlivy jak na mikrobiologické tak na chemické a fyzikální vlastnosti sýrů v průběhu výroby. V každém ročním období bylo provedeno 5 rozborů ze dvou výrob v odstupu 14-ti dnů vždy před a po kvasném sklepu a u finálního ementálského sýra. Celkově bylo analyzováno 60 bloků sýra. Je prezentován vztah mezi mléčným, propionovým a máselným kvašením. V relaci s fyzikálními charakteristikami vodní aktivity (Aw) a aktivní kyselosti (ph). Obsah kyseliny mléčné je ve všech sezónách stejný a po kvasné fázi významně klesá. U jarních a letních na minimum u podzimních na polovinu a u zimních pouze na ¾ původního obsahu (obr.1). kyselina mléčná 1400,0 1200,0 1000,0 800,0 600,0 400,0 200,0 obsah (mg/100g) zralý po KV před KV proces výroby jaro léto podzim sezona zima 0,0 Obr. 1 Průměrný obsah kyseliny mléčné v 5-ti blocích sýra ve 4 ročních obdobích během výroby před kvasným sklepem po kvasném sklepu a u zralého sýra. 35

34 Dále byl sledován obsah Clostridium tyrobutyricum, jehož počty narůstají již v počáteční fázi zrání v chladném sklepě nejvyšší obsahy byly zjištěny u zimních a jarních sýrů (obr. 2) a obsah kyseliny máselné (obr.3). Vztah mezi počty klostridií a kyselinou máselnou popisuje obrázek 4. Clostridium tyrobutyricum 4,50 4,00 3,50 3,00 2,50 2,00 1,50 log (bb/g) 1,00 0,50 0,00 zima střed zralý jaro střed léto střed podzim střed po KV před KV ChS proces výroby jaro kraj léto kraj podzim kraj zima kraj sezona, blok sýra Obr. 2 Průměrný obsah Clostridium tyrobutyricum v okrajové a středové oblasti bloku sýra v 5-ti blocích sýra ve 4 ročních obdobích během výroby před kvasným sklepem po kvasném sklepu a u zralého sýra kyselina máselná zralý 100,0 90,0 80,0 70,0 60,0 50,0 40,0 30,0 20,0 10,0 0,0 obsah (mg/100g) proces výroby po KV před KV jaro léto podzim sezona Obr. 3 Průměrný obsah kyseliny máselné v 5-ti blocích sýra ve 4 ročních obdobích během výroby před kvasným sklepem po kvasném sklepu a u zralého sýra. zima 36

35 k. máselná (mg/100g) ,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 předkv log(bb/g) po KV zralý Obr.4 Závislost mezi obsahem kyseliny máselné na počtu Clostridium tyrobutyricum Počty Clostridium tyrobutyricum významně narůstají již v počáteční fázi zrání v chladném sklepě. Nejvyšší obsahy byly zjištěny u zimních a jarních sýrů. Velmi nízký obsah kyseliny máselné ve skupině sýrů vyrobených v září, odpovídá i velmi nízkému obsahu Clostridium tyrobutyricum. Obsah kyseliny máselné je před kvasným sklepem minimální a narůstá v průběhu zrání sýra. Nejméně přibývá v letních měsících nejvíce v zimních měsících až na desetinásobek původního množství. V zimní fázi obsah kyseliny máselné narůstá v korelaci se zvýšenými obsahy Clostridium tyrobutyricum a poklesem laktobacilů i celkových počtů obsažené mikroflóry. V jarních měsících však nízký obsah kyseliny máselné neodpovídá relativně vysokému obsahu Clostridium tyrobutyricum. Celkově jsou však jak počty Clostridium tyrobutyricum tak i obsah kyseliny máselné minimální a z hlediska senzorických charakteristik nevýznamné. Vysoká kvalita sýrů neumožnila prokazatelnější průkaz charakteristik. Průběh obsahu propionových bakterií a kyseliny propionové je zachycen na obrázku 5 a 6. Závislost obsahu kyseliny propionové na počtu propionových bakterií ukazuje obr. 7. Obsah propionových baktérií je významně vyšší v jarním a letním období. Významný je jejich nízký obsah před kvasným sklepem v podzimním a zimním období. V zimním období je jejich obsah významně nízký i po kvasném sklepu a u zralého sýra. Obsah kyseliny propionové se významně zvyšuje až při obsahu propionových bakterií přesahující 10 8 CFU/g sýra. propionové bakterie kyselina propionová 700,0 600,0 zralý proces výroby po KV před KV jaro sezona léto podzim zima 10,00 Obr.5 Průměrný obsah propionových bakterií v okrajové a středové oblasti bloku sýra v 5-ti blocích sýra ve 4 ročních obdobích během výroby před kvasným sklepem po kvasném sklepu a u zralého sýra 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00 log (bb/g) zralý po KV před KV proces výroby jaro léto sezona podzim zima 400,0 300,0 200,0 100,0 0,0 500,0 Obr. 6 Průměrný obsah kyseliny propionové v 5-ti blocích sýra ve 4 ročních obdobích během výroby před kvasným sklepem po kvasném sklepu a u zralého sýra obsah (mg/100g) 37

36 Závislost obsahu kyseliny propionové na počtu propionových bakterií ukazuje obr. 7. Obsah propionových baktérií je významně vyšší v jarním a letním období. Významný je jejich nízký obsah před kvasným sklepem v podzimním a zimním období. V zimním období je jejich obsah významně nízký i po kvasném sklepu a u zralého sýra. Obsah kyseliny propionové se významně zvyšuje až při obsahu propionových bakterií přesahující 10 8 CFU/g sýra Závislost obsahu kyseliny propionové a množství propionových bakt. kys prop. (mg/100g) ,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00 10,00 log(poč. prop.bakt.) Obr. 7 Závislost kyseliny propionové na počtu propionových bakterií. Z fyzikálních charakteristik byly sledovány Aw a ph. Vzhledem k tomu, že dříve zjištěná kritická hodnota Aw < 0,95 pro inhibici růstu Clostridium tyrobutyricum nebyla dosažena v době přesunu do kvasného sklepa, byla sledována relace ph a růstu Clostridium tyrobutyricum s produkcí kyseliny máselné obr.8. Z obrázku je patrné, že růst klostridií je nezávislý na ph produkce kyseliny máselné je závislá na ph jehož mezní ph je mezi 5,4 5,5 v závislosti na aktuální hodnotě Aw. MASEL Clos Obr. 8 Relace mezi ph a obsahem Clostridium tyrobutyricum a produkcí kyseliny máselné phvt 38

37 MASEL PROP Obr.9 Relace mezi obsahem kyseliny mléčné, propionové a máselné v mg/100g MLEC Relace mezi obsahem zdrojové kyseliny mléčné a produktů z ní kyseliny propionové a máselné je demonstrována na obrázku 9. Z obrázku je patrné, že významné množství kyseliny máselné se vytváří pouze v případě vysoké koncentrace kyseliny mléčné a nízké koncentrace kyseliny propionové. To znamená v případě, kdy kyselina mléčná není metabolizovaná na kyselinu propionovou a octovou. Proto byla sledována závislost produkce kyseliny mléčné, octové a máselné v souvislosti s fází výroby a ročním obdobím obrázek 10 a 11. korelace mezi k. mléčnou a k. prop., oct. a másel. korelace mezi k. mléčnou a k. prop., oct. a másel. SUMA P = -0,5567x + 695,63 Před KV sklepem P = -0,0734x + 95, R 2 = 0, R 2 = 0, O = -0,2339x + 323,54 R 2 = 0, O = -0,0662x + 124,36 R 2 = 0, M = -0,0064x + 36, M = -0,0121x + 26, R 2 = 0,0116 R 2 = 0, PROP 10 PROP 0 OCTOVÁ 0 OCTOVÁ MÁSEL MÁSEL k.mléč(mg/100g) k.mléč(mg/100g) korelace mezi k. mléčnou a k. prop., oct. a másel. korelace mezi k. mléčnou a k. prop., oct. a másel. Po KV sklepě P = -0,5368x + 659,22 ZRALÝ sýr 700 R 2 = 0, k. prop. oct. más. (mg/100g) k. prop. oct. más. (mg/100g) k.mléč(mg/100g) O = -0,2462x + 327,12 R 2 = 0,9744 M = 0,0243x + 18,797 R 2 = 0,2946 PROP OCTOVÁ MÁSEL Obr. 10 Korelace mezi obsahem kyseliny propionové, octové a máselné v závislosti na obsahu kyseliny mléčné - suma dat a jednotlivé fáze výroby. k. prop. oct. más. (mg/100g) k. prop. oct. más. (mg/100g) k.mléč(mg/100g) P = -0,6168x + 742,9 R 2 = 0,9612 O = -0,2943x + 349,63 R 2 = 0,9416 M = 0,0661x + 11,904 R 2 = 0,5432 PROP OCTOVÁ MÁSEL 39

38 Z obrázku vyplývá, že obsah kyseliny propionové a octové u sýrů po KV a u zralého sýra odpovídá stechiometrickému poměru fermentace kyseliny mléčné na kyselinu propionovou a octovou, které jsou hlavní produkty kyseliny mléčné. Z grafu před kvasným sklepem, kdy je minimální obsah kyseliny propionové vzhledem ke kyselině octové vyplývá, že zdrojem kyseliny octové nejsou propionové bakterie a kyselina mléčná, jak vyplývá z nízkého korelačního koeficientu ke kyselině mléčné. Fáze výroby sýra před kvasným sklepem a zralý sýr byly analyzovány i podle ročních období (obr. 11). Z grafů je zřejmé, že kromě fáze před kvasným sklepem, je možné produkci kyseliny propionové a octové rozdělit do jednotlivých klastrů podle ročních období. Největší množství kyseliny máselné v pozdních fázích zrání sýra se vyskytuje pouze u těch výrob, ve kterých je produkce kyseliny propionové nejmenší. korelace mezi k. mléčnou a k. prop., oct. a másel. Před KV zima + jaro k.mléč(mg/100g) korelace mezi k. mléčnou a k. prop., oct. a másel. ZRALÝ JARO + ZIMA k. prop. oct. más. (mg/100g) k. prop. oct. más. (mg/100g) JARO ZIMA k.mléč(mg/100g) P = 0 R 2 = #N/A O = -0,1416x + 217,06 R 2 = 0,1623 M = 0,0218x - 17,598 R 2 = 0,0739 PROP OCTOVÁ MÁSEL P = -0,6664x + 792,34 R 2 = 0,9816 O = -0,2844x + 349,17 R 2 = 0,9421 M = 0,0747x + 13,431 R 2 = 0,5398 PROP OCTOVÁ MÁSEL korelace mezi k. mléčnou a k. prop., oct. a másel. Před KV léto + podzim P = -0,0734x + 96, R 2 = 0, O = -0,0303x + 84, R 2 = 0,1697 k. prop. oct. más. (mg/100g) korelace mezi k. mléčnou a k. prop., oct. a másel. ZRALÝ léto + podzim k. prop. oct. más. (mg/100g) k.mléč(mg/100g) P = -0,589x + 714,31 R 2 = 0,9458 O = -0,3285x + 357,94 R 2 = 0,9502 M = 0,0306x + 19,642 R 2 = 0,6287 Obr.11 Korelace mezi obsahem kyseliny propionové, octové a máselné v závislosti na obsahu kyseliny mléčné fáze před kvasným sklepem a zralý sýr vzhledem k ročním obdobím k.mléč(mg/100g) LÉTO PODZIM M = -0,0126x + 27,433 R 2 = 0,1359 PROP OCTOVÁ MÁSEL PROP OCTOVÁ MÁSEL Z prezentovaných výsledků vyplývá, že tvorbu kyseliny máselné kromě nízké vodní aktivity ovlivňuje také ph, které je vyšší než 5,4 až 5,5 v závislosti na Aw minimální množství klostridií 10 3 /g sýra a minimální množství propionových bakterií 10 8 /g sýra a tomu odpovídající minimální množství kyseliny propionové a octové. Práce vznikla za finanční podpory NAZV Mze ČR projekt QF 3284 Kontaktní adresa: v.erban@vupp.cz 40

39 ANTIMIKROBIÁLNÍ AKTIVITA LACTOBACILLUS PARACASEI IZOLOVANÝCH Z POLOTVRDÝCH SÝRŮ Tůma Štěpán 1, Vogensen K. Finn 2, Ardö Ylva 2, Plocková Milada 1, Chumchalová Jana 1 1 Ústav technologie mléka a tuků, Vysoká škola chemicko-technologická v Praze 2 Department of Food Science, The Royal Veterinary and Agricultural University, Denmark ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF LACTOBACILLUS PARACASEI ISOLATED FROM SEMI-HARD CHEESE Summary: In this study, the antifungal, anticlostridial activity and bacteriocin production, of selected (11) Lactobacillus paracasei strains, were tested. All lactobacilli were isolated from Czech or Danish semi-hard cheeses during ripening. Four strains with the strongest antifungal activity were examinated by milk agar plate method, with three different mould strains Fusarium proliferatum M 5689, Penicillium sp. DMF 0006, Aspergillus niger DMF 0801, isolated from spoiled dairy products as a target microorganisms and compared with the antifungal effectiveness of standard antifungal strains Lactobacillus rhamnosus VT1 and Lactobacillus plantarum DC All four lactobacilli exhibited the strongest inhibition against Fusarium proliferatum M 5689, followed by Penicillium sp. DMF 0006 and Aspergillus niger DMF The level of mould growth inhibition of newly isolated Lb. paracasei strains was slightly higher compared with standard ones. The anticlostridial activity and bacteriocin production of all (11) Lb. paracasei strains was confirmed by well-agar diffusion method against 15 Clostridium sp. All isolates showed a certain inhibition against all 15 Clostridium sp., but for only four of them, the inhibitory effect could be dedicated to bacteriocin-like substance. The inhibitory compounds were produced during late-log phase, were heat resistant (at 25, 30, 37 or 55 C, 30 min) and remained active after 30 min incubation at ph in the range of 2-8. All lactobacilli were identified as Lactobacillus paracasei by Rep-PCR method. Úvod Kontaminace polotvrdých sýrů nežádoucími mikroorganismy může způsobit technologické, ekonomické problémy a zdravotní rizika. Nežádoucí mikroorganismy způsobují nevratné změny chuti, vůně a textury za vzniku rozkladných produktů, které znehodnocují sýr pro další konzumaci. Během celého procesu výroby (fermentace, srážení, lisování, solení a zrání) může být sýr kontaminován mnoha druhy plísní (Penicillium, Aspergillus, Fusarium, Mucor, Geotrichum a Cladosporium) a bakterií (koliformní, NSLAB, Clostridium sp.) [2,8]. Nejčastěji se vyskytujícím rodem, který byl detekován při kontaminaci polotvrdých sýrů v celé řadě evropských států, byl rod Penicillium [8], zejména pak Penicillium commune [11]. Ze zdravotního hlediska je výskyt plísní v polotvrdých sýrech nebezpečný vzhledem k potenciální produkci mykotoxinů [6]. Neméně významná je kontaminace sýrů bakteriemi Clostridium sp., které způsobují tzv. pozdní duření sýrů. V sýru se tvoří trhliny, oka, nepříjemná chuť a vůně, které jsou způsobeny především tvorbou plynu a produkcí kys. máselné [2]. V sýrařské technologii se k potlačení nežádoucích bakterií a plísní používá celá řada způsobů. Účinnou ochranou proti plísním je pravidelné mytí a dokonalé vysušení všech ploch zařízení přicházející do styku se sýrem, mikrobiální kontrola vzduchu v zracích sklepech, ochrana sýrů plastovými obaly a fóliemi obsahujícími fungicidní látky natamycin nebo sorbáty [22]. K potlačení výskytu Clostridium sp. se nejčastěji používá baktofugace a přídavek dusičnanu do mléka. Nicméně, vzhledem k chemické povaze dusičnanu, je snahou jeho používání nahradit jinou účinnou a více šetrnou metodou [2]. 41

40 Další možností, kterou se zabývají vědci na různých pracovištích, je využití antimikrobiální aktivity bakterií mléčného kvašení, zejména laktobacilů ze skupiny NSLAB přirozeně se vyskytujících v sýru [4] k potlačení nežádoucí mikroflóry [2,5,8,12]. Při zrání sýrů dochází k dramatickému nárůstu NSLAB populace z počátečních nedetekovatelných hodnot (< 10 KTJ.g -1 sýra) až k hodnotám, které přesahují 10 8 KTJ.g -1 a stávají se dominantní mikroflórou. Lze předpokládat, že růst NSLAB je doprovázen produkcí řady metabolitů a antimikrobiálních látek, které jim umožní růst v sýru za přítomnosti LD-startovacích kultur běžně používaných pro výrobu polotvrdých sýrů. NSLAB zahrnují zejména kmeny mezofilních laktobacilů, v menší míře se občas vyskytuji i pediokoky, streptokoky, mikrokoky, enterokoky a leukonostoky [1,18]. Zdrojem těchto mikroorganismů je syrové mléko, voda, ingredience k výrobě sýra, personál, strojní zařízení a vzduch nebo nedostačující hygienickosanitační režim výroby. NSLAB mohou dokonce přežívat pasteraci [7,9]. U polotvrdých sýrů převažují ze skupiny NSLAB fakultativně heterofermentativní laktobacily, zejména Lactobacillus casei a Lactobacillus paracasei. Zastoupení jednotlivých NSLAB závisí na typu sýra, umístění mlékárny i zemi původu [1,18]. Některé laktobacily včetně laktobacilů ze skupiny NSLAB jsou schopny inhibovat růst nežádoucích mikroorganismů včetně patogenů a mikroorganismů způsobujících kažení potravin produkcí různých druhů antimikrobiálních látek. Kromě produkce kys. mléčné jsou některé laktobacily schopny produkovat i další antimikrobiální látky (bakteriociny, diacetyl, oxid uhličitý, peroxid vodíku, ethanol, organické kyseliny) [17,23], z antifungálních látek především pak kyseliny octovou, propionovou, benzoovou, phenylmléčnou), nízkomolekulární sloučeniny (reuterin, methylhydantoin, mevalonolacton, cyclo( L -Phe- L -Pro), cyclo(phe-pro)) [12,14]. Antimikrobiální aktivita byla již v minulosti prokázána [9] u druhů Lactobacillus plantarum [5,12,14], Lactobacillus casei, Lactobacillus rhamnosus [15,19], Lactobacillus paracasei subsp. paracasei, Lactobacillus fermentum a Lactobacillus coryniformis subsp. coryniformis [4,12]. V této práci se sledovala antifungální a antiklostridiální aktivita u kmenů Lactobacillus paracasei izolovaných z polotvrdých českých a dánských sýrů v průběhu zrání. U aktivních kmenů bylo zjišťováno, zda se jedná o inhibiční efekt způsobený produkcí bakteriocinů. Materiál a metody Média Laktobacily byly kultivovány na De Man, Rogosa and Sharpe (MRS) agaru a v (MRS) bujónu (Merck, Německo), při 30 C anaerobně (AnaeroGen TM, Oxoid, Velká Británie). Klostridia byly kultivovány v Reinforced Clostridium Medium (RCM) nebo na (RCM) agar (15 g.l -1 )(Difco, USA), při 37 C anaerobně (AnaeroGen TM, Oxoid, Velká Británie). Plísně se kultivovaly na PDA (Difco, USA), agaru, 25 C, 5 dnů. Antifungální aktivita Antifungální aktivita vybraných 4 kmenů Lb. paracasei byla porovnána s antifungální aktivitou standardních kmenů Lactobacillus rhamnosus VT1 (Ústav technologie mléka a tuků, VŠCHT Praha) a Lactobacillus plantarum DC 1246 (Danisco, Germany) proti Fusarium proliferatum M 5689, Aspergillus niger DMF 0801 a Penicillium sp. DMF 0006 (Ústav technologie mléka a tuků, VŠCHT Praha) kmeny plísní byly izolovány ze zkažených mlékárenských výrobků. Pro stanovení antifungální aktivity laktobacilů byla použita částečně upravená metoda mléčných agarových misek [19]. Do 5 ml koncentrovaného odstředěného mléka 180 g.l -1 (Promyl, Nový Bydžov, Czech Republic) se naočkovalo 10 ml.l -1 testované kultury Lactobacillus sp.. Naočkované mléko se zalilo (10 ml) bakteriologickým agarem (15 g.l -1, obsahující 100 mg.ml -1 bromkresolpurpur-bcp). Po zatuhnutí se misky přelily 10 ml soft agarem (7,5 g.l -1 obsahující 100 mg.ml -1 BCP). Na zatuhlý soft-agar se napipetovaly (3 μl) suspenze spor testovaného kmene 42

41 plísně. Suspenze spor se připravila vytřepáním čerstvě nakultivované plísně 5 ml sterilního fyziologického roztoku obsahujícího 1 ml.l -1 Tween 80 [15,19]. Kultivace proběhla při 30 C, inhibiční účinek se sledoval v denních intervalech. Inhibiční účinek (I) byl vyjádřen podle rovnice: I (%) = (MCD/MCD 0 ) x 100, kde (I) je vyjádřen jako % nárůst plísně v přítomnosti testovaného laktobacilu vzhledem k samostatnému nárůstu dané plísně, MCD 0 průměr kolonie kontrolního vzorku (pouze plíseň) a MCD průměr kolonie plísně na plotně obsahující Lb. paracasei. Výsledky jsou vyjádřeny jako průměr ze tří měření. Antiklostridiální aktivita Antiklostridiální aktivita laktobacilů a bakteriocinů se testovala agarovou difúzní metodou. Do petriho misek (průměr 9 cm) se nadávkovala suspenze (10 ml.l -1 ) aktivní klostridiální kultury (Abs. 610 nm = 0,7-0,8) s 30 ml RCM agaru (55 C). Do předsušených misek se připravily sterilním korkovrtem o průměru (7 mm) otvory, do kterých se nadávkovala kultura testovaného laktobacilu nebo bezbuněčného supernatantu (50 µl). Poté se nechaly misky v lednici při 4 C, 2 h, aby došlo k dokonalé difúzi do agaru. Kultivace proběhla anaerobně při 37 C. Inhibiční učinek se sledoval po 24, 48 a 72 h. Pozitivní inhibice byla identifikována jako vyjasněná zóna kolem otvoru [3]. Produkce a charakterizace bakteriocinů Bezbuněčný supernatant byl připraven z Lactobacillus sp. po kultivaci v MRS bujónu a po odstředění (4 C, 4000 g, 15 min.). Supernatant se neutralizoval (1 mol.l -1 ) NaOH na ph 6, aby se vyloučil inhibiční účinek kys. mléčné. Do supernatantu se napipetovaly enzymy proteinasa K nebo katalasa (0,1 mg.ml -1, kultivace při 37 C, 30 min), aby se vyloučil inhibiční efekt peroxidu vodíku a potvrdila přítomnost inhibiční látky bílkovinného charakteru (bakteriocinu). Supernatanty se uchovávaly při -20 o C [10,17]. Citlivost bakteriocinu vůči teplotě se testovala ohřátím supernatantu na 25, 30, 37, 55 a 100 C po dobu 30 min. Poté se supernatant ochladil na 25 C, zneutralizoval na ph 6 a přidaly se enzymy proteinasa K nebo katalasa (popis viz výše) [10,13]. Vliv ph na aktivitu bakteriocinu se testoval obdobně jako vliv teploty. Supernatanty se ohřály na 25 C, upravilo se ph v rozmezí 2-8. Supernatanty se ohřály na 37 C po dobu 30 min, ochladily na 25 C, zneutralizovaly na ph 6 a testovala se inhibiční aktivita [10,13,20]. Výsledky a diskuse Antifungální aktivita Antifungální aktivita Lb. paracasei se testovala proti Penicillium sp. DMF 0006, Aspergillus niger DMF 0801 a Fusarium proliferatum M 5689 a porovnala s aktivitou Lactobacillus rhamnosus VT1 [15,16] a Lactobacillus plantarum DC1246 (popsáno Danisco, Germany)(Obr.1). Nejlépe inhibovaly laktobacily růst Fusarium proliferatum M 5689, následně Penicillium sp. DMF Inhibiční účinek proti Aspergillus niger DMF 0801 byl detekovatelný, nicméně byl mnohem slabší ve srovnání s účinkem proti Fusarium a Penicillium. Největší inhibiční účinek vykázaly Lb. paracasei ST 490 a Lb. paracasei ST 491 proti kmenům Fusarium a Penicillium. Oba kmeny inhibovaly růst mycelia více jak z 85%. Lb. paracasei ST 68 a Lb. rhamnosus VT1 inhibovaly ze všech zkoušených laktobacilových kmenů plíseň Aspergillus niger nejlépe. Antifungální aktivita Lb. plantarum DC1246 byla ze všech testovaných laktobacilů nejnižší. Lb. rhamnosus VT1 inhiboval Penicillium sp., stejně jako Lb. paracasei ST490 a ST

42 nárůst plísně v přítomnosti testovaného laktobacilu I [%] ST68 ST307 ST490 ST491 VT1 DC laktobacily Obr.1 Inhibiční účinek I [%] kmenů Lb. paracasei ST68, ST307, ST490, ST491, Lb. rhamnosus VT1 a Lb. plantarum DC1246 proti ( ) Aspergillus niger, ( )Fusarium proliferatum a ( ) Penicillium sp. Antiklostridiální aktivita U všech 11 kmenů Lb. paracasei izolovaných z dánských a českých polotvrdých sýrů, které byly vybrány na základě předchozích prací [2,21], byla potvrzena určitá antiklostridiální aktivita živých buněk agarovou difúzní metodou, proti 15 kmenům Clostridium sp. (Clostridium tyrobutyricum, Clostridium butyricum, Clostridium sporogenes, Clostridium beijerinckii). Všechny laktobacily inhibovaly Cl. butyricum, Cl. sporogenes, Cl. beijerinckii a některý z 11 kmenů Cl. tyrobutyricum. Nejlepší inhibiční účinek prokázaly kmeny 61H4, 7R1 a 8R2 proti Cl. tyrobutyricum. Tyto kmeny inhibovaly 8 z celkových 11 kmenů (Tab.1). Kmeny Lb. paracasei ST68, ST307, ST490, ST491 s antifungální aktivitou inhibovaly menší počet Cl. tyrobutyricum. Nejlépe inhiboval Lb. paracasei ST68, 5 z celkových 11 kmenů Cl. tyrobutyricum. Tab I. Inhibiční účinek živých buněk kmenů Lactobacillus paracasei proti (11) Clostridium tyrobutyricum, (2) Clostridium beijerinckii, (1) Clostridium sporogenes a (1) Clostridium butyricum kmenům. počet ST68 ST307 ST485 ST486 ST490 ST491 61H4 8R2 7R1 171M7 171R2 Cl. tyrobutyricum Cl. beijerinckii Cl. sporogenes Cl. butyricum Ze všech kmenů Lb. paracasei byly připraveny bezbuněčné supernatanty (zneutralizované na ph 6, ošetřené proteinasou K a katalasou) a otestovány na antiklostridiální aktivitu vůči vybraným kmenům Clostridium sp.. Z 11 kmenů pouze u 4 kmenů byl inhibiční efekt způsoben látkou bílkovinného charakteru. Tyto látky inhibovaly pouze Clostridium tyrobutyricum a jejich inhibiční spektrum bylo užší než inhibiční spektra u živých buněk laktobacilů. Inhibiční látky bílkovinné povahy u všech 4 kmenů Lb. paracasei vykazovaly inhibiční účinek i po tepelném ošetření (30 min při 25, 30, 37 nebo 55 C), avšak již ne po záhřevu nad 100 C. Inhibiční aktivita zůstala zachována i po kultivaci při 37 C, 30 min, při ph v rozmezí 2-8. Podle těchto vlastností lze předpokládat, že se jedná s největší pravděpodobností o bakteriociny (Tab. II). 44

43 Tab II. Vliv ph a teploty na inhibiční účinek látky bílkovinné povahy (bakteriocinu) proti Clostridium tyrobutyricum. No:Cl. celkový počet inhibovaných klostridií. Lb. paracasei No:Cl. ph C R R M H Pozn: Výsledky jsou vyjádřeny jako počet klostridií inhibovaných bakteriocinem z celkového počtu testovaných klostridií inhibovaných supernatanty jednotlivých kmenů Lb. paracasei. Závěr V této práci byly otestovány kmeny Lactobacillus paracasei na antimikrobiální aktivitu. Laktobacily byly izolované z polotvrdých sýrů v průběhu zrání. Některé z kmenů vykázaly antifungální aktivitu (především proti Fusarium proliferatum a Penicillium sp.). Řada kmenů měla i antiklostridiální aktivitu, především proti kmenům Clostridium tyrobutyricum. Pouze u 4 kmenů byl inhibiční účinek proti klostridiím způsoben látkou bílkovinné povahy (bakteriocinem). U kmenů ST68, ST307, ST490 a ST491 byla současně nalezena antifungální i antiklostridiální aktivita. Antifungální a antiklostridiální aktivita kmenů Lb. paracasei, vyskytujících se v sýru, by mohla být využita k potlačení nežádoucích plísní a Clostridium sp. v průběhu zrání. Použití Lb. paracasei s antimikrobiální aktivitou, jako doplňkové kultury nebo jako součást multi-kmenových kultur, by mohlo být přínosem při výrobě polotvrdých sýrů. Poděkování Tato práce byla financována Danish Dairy Research Foundation a z grantu MŠMT No: CEZ: MSM Poděkování patří Aideh B.Y. z Royal Veterinary and Agricultural University, Copenhagen, Denmark za identifikaci Lactobacillus paracasei. Literatura 1. ANTONSSON M., ARDÖ Y., MOLIN G. A comparison between the microflora of Herregård cheese from the different dairies. Int. Dairy J., 2001, 11, pp CHRISTIANSEN P., PETERSEN M.H., KASK S., MØLLER P.L., PETERSEN M., NIELSEN E.W., VOGENSEN F.K., ARDÖ Y. Anticlostridial activity of Lactobacillus isolated from semi-hard cheeses. Int. Dairy J., 2005, 15, pp DAVE R.I., SHAH N.P. Characteristics of bacteriocin produced by Lactobacillus acidophilus LA-1. Int. Dairy J., 1997, 7, pp DE MUYNCK C., LEROY A.I.J., DE MAESENEIRE S., ARNAUT F., SOETAERT W., VANDAMME E.J. Potential of selected lactic acid bacteria to produce food compatible antifungal metabolites. Microbiol. Research, 2004, 159, pp DEVLIEGHERE F., VERMEIREN L., DEBEVERE J. New preservation technologies: Possibilities and limitations. Int. Dairy J., 2004, 14, pp FILTENBORG O, FRISVALD JC, TRANE U. Moulds in food spoilage. Int J Food Microbiol., 1996, 33, pp

44 7. FITZSIMONS N.A., COGAN T.M., CONDON S., BERESFORD T. Spatial and temporal distribution of non-starter lactic acid bacteria in Cheddar cheese. J.Appl. Microbiol., 2001, 90, pp KURE C.F., SKAAR I., BRENDEHAUG J. Mould contamination in production of semi hard cheese. Int. J. Food Microbiol., 2004, 93, pp LANE C.N., FOX P.F., WALSH E.M., FOLKERTSMA B., MC SWEENEY P.L.H. Effect of compositional and environmental factors on the growth of indigenous non-starter lactic acid bacteria in Cheddar cheese. Lait, 1997, 77, pp LASH B. W., MYSLIWIEC T.H., GOURAMA H. Detection and partial characterization of a broadrange bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum ATCC Food Microbiol., 2005, 22, pp LUND F, FILTENBORG O, FRISVALD J.C. Associated mycoflora of cheese. Food Microbiol., 1995, 12, pp MAGNUSSON J., STRÖM K., ROSS S., SJÖRGEN J., SCHNÜRER J. Broad and complex antifungal activity among environmental isolates of lactic acid bacteria. FEMS Microbiol. Letters, 2003, 219, pp MESSI P., BONDI M., SABIA C., BATTINI R., MANICARDI G. Detection and preliminary characterization of a bacteriocin (plantaricin 35d) produced by a Lactobacillus plantarum strain. Int. J. Food Microbiol., 2001, 64, pp NIKU-PAAVOLA M.L., LAITILA A., MATTILA-SANDHOLM T., HAIKARA A. New types of antimicrobial compounds produced by Lactobacillus plantarum. J. Appl. Microbiol., 1999, 86, pp PLOCKOVÁ M., STILES J., CHUMCHALOVÁ J., HALFAROVÁ R. Control of mould growth by Lactobacillus rhamnosus VT1 and Lactobacillus reuteri CCM 3625 on milk agar plates. Czech J.Food Sci., 2001, Vol 19, No 2, pp PLOCKOVÁ M., CHUMCHALOVA J., GIESOVÁ M., BOUŠKOVÁ O. Antifungal effectiveness of Lactobacillus rhamnosus VT1 at different temperatures. Advances in Food Sci., 2004, Vol 26, No.2, RODRIGUEZ E., GONZALES B., GAYA P., NUNEZ M., MADINA M. Diversity of bacteriocins produced by lactic acid bacteria isolated from raw milk. Int. Dairy J., 2000, 10, pp SOUSA M.J., ARDÖ Y., MCSWEENEY P.L.H. Advances in the study of proteolysis during cheese ripening. Int. Dairy J., 2001, 11, pp SUZUKI I., NOMURA M., MORICHI T. Isolation of lactic acid bacteria which suppress mould growth and show antifungal action. Milchwissenschaft, 1991, 46 (10), pp TŮMA Š., GIESOVÁ M., CHUMCHALOVÁ J, PLOCKOVÁ M.: The antimicrobial activity of Lactobacillus strains isolated from Dutch-type cheese. (poster) The 19 th International ICFMH Symposium Food micro 2004, Portorož, Slovenia 21. YANG.R., RAY B. Factors inluencing production of bacteriocins by lactic acid bacteria. Food Microbiol., 1994, 11, pp WALSTRA P., NOONEN A., GEURTS T.J. Dutch-type varieties. In: Fox, P.F. (Ed.), Cheese: Chemistry, Physics and Microbiology, 1993, vol.2. Chapman & Hall, London, pp ZHU W.M., LIU W., WU D.Q. Isolation and characterization of a new bacteriocin from Lactobacillus gasseri KT7. J. Appl. Microbiol., 2000, 88, pp Kontaktní adresa: Štěpán Tůma, VŠCHT Praha, Ústav Technologie mléka a tuků, Technická 3, Praha 6, , stepan.tuma@vscht.cz, tel:

45 VPLYV KONCENTRÁCIE NaCl NA PRODUKCIU TYRAMÍNU MLIEKARENSKY VÝZNAMNÝMI ENTEROKOKMI Greif Gabriel, Greifová Mária, Karovičová Jolana, Kohajdová Zlatica Ústav biotechnológie a potravinárstva, FCHPT - STU v Bratislave, Slovenská republika THE EFFECT OF NaCl CONCENTRATION ON THE PRODUCTION OF TYRAMINE BY DAIRY RELEVANT ENTEROCOCCI Summary: The influence of NaCl concentration on tyramine formation in Nutrient Broth No. 2 by enterococci containing Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium were investigated. Sterilised Nutrient Broth No. 2 possessing various NaCl concentrations was inoculated with 10 3 CFU.cm -3 Enterococcus faecalis or Enterococcus faecium and incubated at 37 C. From among all monitored biogenic amines, only tyramine was produced in these model experiments. The biogenic amines were determined as Dansyl derivatives by HPLC - UV method. The values of ν TYR (specific rate of production of tyramine), l TYR (theoretically calculated time at which tyramine is produced in measurable concentration) and M TYR (time, at which ν TYR is maximal) were calculated from parameters obtained by fitting the funcion c TYR = f(τ). Enterokoky sú ubikvitárne baktérie, ktoré sa frekventovane vyskytujú v značnom počte v mliekarenských výrobkoch, ale aj v iných fermentovaných potravinách. V roku 1937 Sherman navrhol schému, kde rozčlenil streptokoky do štyroch skupín: pyogénnu, viridanovú, laktis a enterokokovú. Posledná skupina zahŕňa rody katalázo negatívnych, grampozitívnych, fakultatívne anaeróbnych kokov, ktoré sú schopné rásť pri 10 a 45 C, v prítomnosti 6,5 % NaCl, 40% žlče, pri ph 9,6, prežívajú 30 minútový záhrev pri 60 C, hydrolyzujú eskulín a koagulujú mlieko (GIRAFFA 2002). Je pravdepodobné, že fylogenetický systém rodu Enterococcus ešte stále nebol kompletne objasnený a niektoré zmeny v klasifikácii budú pravdepodobne v blízkej budúcnosti nutné (GIRAFFA 2002, 2003). Hoci E. faecalis, E. faecium a E. durans sú často izolované z ľudských výkalov, sú menej bežné vo výkaloch dobytka (hovädzieho dobytku, oviec) (LECLERS, DEVRIESE a MOSSEL 1996). Enterokoky nie sú spájané iba s teplokrvnými zvieratami, ale často sa vyskytujú v pôde, povrchových vodách, na rastlinách a zelenine (GIRAFFA 2002). Prítomnosť enterokokov v mliečnych produktoch (pokiaľ nie sú používané vo forme štartovacích kultúr) je označovaná ako indikácia nedostatočných sanitačných podmienok počas získavania a spracovania mlieka. Enterokoky sa môžu rozmnožovať aj mimo zažívacieho traktu a zaujať tak aj iný rezervoár (GIRAFFA 2002). Na produkciu tyramínu enterokokmi v mliečnych výrobkoch poukázali (GARDINI, MARTUSCELLI, CARUSO a kol., 2001; GIRAFFA, PEPE, LOCCI a kol., 1995; GIRAFFA, CARMINATI a NEVIANI 1997) a laktokokmi (MADERA, GARCÍA, JANZEN a kol., 2003). Migrény, zvýšenie krvného tlaku, srdcovú a mozgovú príhodu pripisujú autori JARISCH a WANKE (1996) tyramínu. Prvýkrát bolo zvýšenie krvného tlaku vyvolané tyramínom zistené po konzumácii syrov u pacientov liečených inhibítormi monoaminooxidáz (MAO) v 60. rokoch minulého storočia. Preto sa intoxikácia tyramínom často označuje ako reakcia na syry (angl. cheese reaction) (ten BRINK, DAMINK, JOOSTEN a kol. 1990;). Medzi faktory znižujúce výkonnosť detoxikačného systému MAO-áz patria okrem putrescínu a kadaverínu aj alkohol, káva, čaj, cigarety a niektoré lieky (ambroxol hydrochlorid, dihydralazín, isoniazid, klavulanová kyselina, prometazín, verapamil) (JARISCH a WANKE 1996). 47

46 Materiál a metódy Použité mikroorganizmy Enterococcus faecalis 816, Enterococcus faecium 106/2 (VUM, Praha, Česká republika), Analýza tyramínu Tyramín bol stanovený vo forme Dansyl derivátu metódou HPLC-UV za nasledujúcich podmienok: kolóna: NUCLEOSIL C 18 (125 x 4 mm), 5 μm (Watrex), temperovaná na 40 C; mobilná fáza: acetonitril-voda (4:1 v/v), prietok 1 cm 3.min -1 ; dávkovač: LCI 30, 20μl slučka; detektor: UV-VIS (254 nm). Obsah tyramínu bol vyhodnocovaný metódou kalibračnej krivky. Tabuľka l Experimentálne podmienky pre hodnotenie vplyvu koncentrácie NaCl na produkciu biogénnych amínov Enterococcus faecalis a Enterococcus faecium Živný bujón No ,5% glukóza + 0,1% lyzín, + 0,1% histidín + 0,1% tyrozín teplota kultivácie 37 C Enterococcus faecalis 816 NaCl (%) 0,6 1,0 2,1 3,2 4,6 6,0 ph = 7,0 ± 0,2 Enterococcus faecium 106/2 NaCl (%) 1,3 1,9 2,9 3,9 4,9 5,9 7,9 ph = 7,0 ± 0,2 Výsledky a diskusia Vplyv koncentrácie NaCl v MPB na produkciu amínov Enterococcus faecalis 816 Enterococcus faecalis 816 produkoval pri všetkých nami použitých koncentráciách NaCl (Tab. l) v MPB a teplote 37 C tyramín (obr. 1). Najvyššia koncentrácia tyramínu bola stanovená v MPB s obsahom NaCl 1,1% v 25. h kultivácie (1345 μg.cm -3 ). Do 12. h kultivácie bol pozorovaný významný nárast koncentrácií tyramínu v MPB s obsahom NaCl (0,6 3,2%). Pri vyšších obsahoch NaCl v MPB (4,6 a 6,0%) bol významný nárast koncentrácií tyramínu pozorovaný v 20. resp. 24 h kultivácie. c TYR [μg.cm -3 ] Čas [h] Obr. 1 Vplyv koncentrácie NaCl v MPB na produkciu tyramínu Enterococcus faecalis 816 pri 37 C 48 0,6% 1,1% 2,1% 3,2% 4,6% 6,0%

47 Z kriviek produkcie tyramínu Enterococcus faecalis v MPB v závislosti od obsahu NaCl (obr. 2) boli vypočítané parametre: špecifická rýchlosť produkcie tyramínu (ν TYR ), teoretický určený čas, v ktorom nastane merateľná koncentrácia tyramínu (l TYR ) a čas, v ktorom dosiahne špecifická rýchlosť produkcie tyramínu maximum (M TYR ) (obr. 2). Z obr. 2 je vidieť, že najvyššia špecifická rýchlosť produkcie tyramínu Enterococcus faecalis bola v MPB s obsahom NaCl 1,2%. So zvyšujúcou sa koncentráciou NaCl postupne klesala. So zvyšujúcou koncentráciou NaCl v MPB sa teoretický určený čas, v ktorom nastane merateľná koncentrácia tyramínu (l TYR ) lineárne predlžoval, pričom čas, v ktorom dosiahne špecifická rýchlosť produkcie tyramínu maximum (M TYR ) sa predlžoval exponenciálne podľa rovníc: l = 6, , x TYR M TYR ( NaCl ) = 6, , 24exp 0, 31x ( NaCl ) 30 l TYR M TYR 500 l TYR ; M TYR [h] ν TYR ν TYR [μg.cm -3.h -1 ] NaCl [%] Obr. 2 Vplyv koncentrácie NaCl v MPB na parametre charakterizujúce produkciu tyramínu Enterococcus faecalis 816 pri 37 C Vzhľadom na možný výskyt Enterococcus faecalis v surovinách a produktoch rastlinného, ale predovšetkým živočíšneho pôvodu s obsahom NaCl do 3%, kde sa vyskytuje buď ako nežiaduci kontaminant alebo ako štartovacia kultúra, je potrebné brať do úvahy jeho pomnoženie a tvorbu významných koncentrácií tyramínu. Taktiež autori GARDINI, MARTUSCELLI, CARUSO, a kol. (2001) uvádzajú, že nízke koncentrácie NaCl v substráte môžu viesť k maximálnej produkcii biogénnych amínov, pričom už 5%-ný prídavok NaCl môže výrazne znížiť koncentráciu amínov. Vplyv koncentrácie NaCl v MPB na produkciu amínov Enterococcus faecium 106 Enterococcus faecium 106 produkoval tyramín v MPB s rôznym obsahom NaCl (Tab. l) a denzitou buniek 5x10 3 KTJ.cm -3 (obr. 3). Pri koncentrácii 1,3% NaCl v MPB bola pozorovaná produkcia tyramínu kmeňom Enterococcus faecium 106 v 9. h kultivácie (10,6 μg.cm -3 ) a denzite buniek 10 6 KTJ.cm -3. Maximálna koncentrácia tyramínu pri 1,3% NaCl v MPB bola zaznamenaná v 24. a 30. h kultivácie (560,63 μg.cm -3 ). Obsah NaCl 1,9 a 2,9% nielenže priaznivo ovplyvnil rast Enterococcus faecium 106 v MPB ale aj produkciu tyramínu. Pri 1,9% NaCl bola merateľná koncentrácia tyramínu zaznamenaná v 6. h kultivácie (6,5 μg.cm -3 ) a najvyšší nárast koncentrácie tyramínu bol medzi 8. a 10. h kultivácie (21,4 na 144,3 μg.cm -3 ). Pri 2,9% NaCl bol najvyšší nárast koncentrácie tyramínu medzi 11. a 12. h kultivácie (47,6 na 177,3 μg.cm -3 ). 49

48 Najvyššia koncentrácia tyramínu produkovaného Enterococcus faecium 106 v MPB bola stanovená v substráte s obsahom 5,9% NaCl (660,4 μg.cm -3 ) a najnižšia v substráte s 7,9% NaCl (365,9 μg.cm -3 ), čo úzko súvisí s rastom a rozmnožovaním sa kmeňa Enterococcus faecium 106 v danom substráte ako aj s činnosťou L-tyrozín dekarboxylázy ním tvorenej (obr. 3). Súčasne bol sledovaný vplyv koncentrácie NaCl v MPB (Tab. l) na produkciu tyramínu Enterococcus faecium 106 so vstupnou denzitou buniek 10 6 KTJ.cm -3, čo už je denzita buniek schopná produkovať merateľné koncentrácie tyramínu. Vplyv obsahu NaCl v MPB na produkciu tyramínu kmeňom Enterococcus faecium 106 (denzita buniek 10 6 KTJ.cm -3 ) sa významne prejavil do 24. h kultivácie. Najvyšší nárast tyramínu bol pozorovaný pri koncentráciách 1,3 až 4,9% NaCl v MPB. V 36. a 49. h koncentrácie tyramínu produkovaného Enterococcus faecium 106 sa významne nelíšili a boli na hladine 735 až 750 μg.cm -3. c TYR [μg.cm -3 ] ,3% NaCl 1,9% NaCl 2,9% NaCl 3,9% NaCl 4,9% NaCl 5,9% NaCl 7,9% NaCl Čas [h] Obr. 3. Vplyv koncentrácie NaCl v MPB na produkciu tyramínu Enterococcus faecium 106 pri 37 C a vstupnej denzite 10 3 KTJ.cm -3 Na obr. 4 je vyjadrená závislosť koncentrácie tyramínu produkovaného Enterococcus faecium 106 (vstupná denzita buniek 10 6 KTJ.cm -3 ) od obsahu NaCl v MPB a času kultivácie pri 37 C. Pri obsahu 1,3% NaCl v MPB bola nameraná koncentrácia tyramínu produkovaného Enterococcus faecium 106 (vstupná denzita buniek 10 6 KTJ.cm -3 ) pri 37 C v 4. h kultivácie 118,07 μg.cm -3 a so zvyšujúcim sa obsahom NaCl exponenciálne klesala. V a 24. h kultivácie sa výraznejšie prejavil priaznivý vplyv obsahu NaCl v intervale 1,9 až 4,9% na vytvorené množstvo tyramínu Enterococcus faecium 106 a priebeh je možné popísať kvadratickými funkciami. c TYR [μg.cm -3 ] h; 8. h; 12. h; 24. h NaCl [%] Obr. 4. Koncentrácie tyramínu v závislosti od obsahu NaCl v MPB a času kultivácie Enterococcus faecium 106 (vstupná denzita buniek 10 6 KTJ.cm -3 ) pri 37 C. 50

49 Koncentrácie tyramínu produkovaného Enterococcus faecium 106 v MPB s obsahom (1,3 až 7,9% NaCl) sa v 38. a 49. h navzájom významne nelíšili a boli na hladine 735 až 750 μg.cm -3. Čas M TYR, v ktorom dosiahla špecifická rýchlosť produkcie tyramínu v nami použitých podmienkach sa so stúpajúcou koncentráciou NaCl exponenciálne predlžoval podľa rovnice: ( NaCl ) M TYR = 6, , 019exp a najvýraznejšie sa to prejavilo pri obsahu NaCl nad 5,9%. Vplyv obsahu NaCl v MPB a vstupnej denzity buniek Enterococcus faecium 106 na špecifickú rýchlosť produkcie tyramínu je na obr. 59 a bol popísaný kvadratickými rovnicami ν TYR = 27, , 34x NaCl 5, 77x 0, 72x 2 NaCl 10 3 KTJ.cm νtyr = 4, , 56xNaCl 6, 48xNaCl 10 KTJ.cm Vyššia špecifická rýchlosť produkcie tyramínu Enterococcus faecium 106 bola pozorovaná pri vstupnej denzite buniek 10 3 KTJ.cm -3 a obsahu NaCl v intervale 1,3 3,9% (obr. 5), čo súvisí s rýchlejším rastom a rozmnožovaním sa sledovaného kmeňa v danom substráte. Naopak, najvyššia špecifická rýchlosť produkcie tyramínu Enterococcus faecium 106 bola pozorovaná pri vstupnej denzite buniek 10 6 KTJ.cm -3 a obsahu 4,9 5,9% NaCl, z čoho je možné usúdiť priaznivý vplyv uvedeného obsahu NaCl na činnosť L-tyrozín dekarboxylázy. Preto je dôležité uvádzať vstupnú denzitu mikroorganizmov pri hodnotení vplyvu obsahu NaCl na rast a produkciu amínov. Aj napriek významným pozitívam, ktoré enterokoky majú, predovšetkým Enterococcus faecium ako producent bakteriocínov voči rodu Listeria spp., na ktoré poukazujú autori (CASAUS, NILSEN, CINTAS et all., 1997; CALLEWAERT, HUGAS a DEVUYST 2000; CINTAS, CASAUS, HERRANZ a kol., 2000), ako probiotická kultúra (AGERHOLM-LARSEN, BELL, GRUNWALD et all., 2000; LUND, ADAMSSON a EDLUND 2002), objavujú sa aj ich negatíva vyplývajúce z ich termorezistencie a rezistencie voči antibiotikám ν TYR [μg.cm -3.h -1 ] KTJ.cm KTJ.cm NaCl [%] Obr. 5 Vplyv obsahu NaCl v MPB a vstupnej denzity buniek Enterococcus faecium 106 na špecifickú rýchlosť produkcie tyramínu V neposlednom rade sú enterokoky významným a nezanedbateľným producentom tyramínu vo výrobkoch predovšetkým živočíšneho pôvodu na čo poukazuje aj táto práca. Preto pri získavaní, spracovaní a skladovaní takýchto typov výrobkov je potrebné dodržiavať prísne hygienické pravidlá, aby nedochádzalo k ich nadmernému pomnoženiu a súčasne k produkcii zdravie ohrozujúcich koncentrácií vazoaktívneho amínu tyramínu. U výrobkov, kde je ich prítomnosť nevyhnutná (bryndza, tvrdé, dlho zrejúce syry) z technologického a senzorického hľadiska odporúčame aplikovať kmene s nízkou produkciou amínov a zároveň viesť proces zrenia pri nižších teplotách zabraňujúcich nadmernú produkciu amínov. 51

50 Literatúra: AGERHOLM-LARSEN L., BELL M.L., GRUNWALD G.K., et all.: The effect a probiotic milk product on plasma cholesterol: a meta-analysis of short-term intervention studies. Eur. J. Clin. Nutr., 49, 2000, s BEUTLING D.: Biogene Amine in der Ernährung. Arch. Lebensmittelhyg., 47, 1996, s Callewaert R., Hugas M., Devuyst L.: Competitiveness and bacteriocin production of Enterococci in the production of Spanish-style dry fermented sausages. Int. J. Food Microbiol., 57, 2000, s CASAUS P., NILSEN T., CINTAS, L.M., et all.: Enterocin B, a new bacteriocin from Enterococcus faecium T136 which can act synergistically with enterocin A. Microbiology, 143, 1997, s CINTAS L.M., CASAUS P., HERRANZ, C., et all.: Biochemical and genetic evidence that Enterococcus faecium L50 produces enterocins L50A and L50B, the sec-dependent enterocin P, and a novel bacteriocin secreted without an N-terminal extension termed enterocin Q. J. Bacteriol., 182, 2000, s GARDINI F., MARTUSCELLI M., CARUSO M.C., et all.: Effects of ph, temperature and NaCl concentration on the growth kinetics, proteolytic activity and biogenic amine production of Enterococcus faecalis. Int. J. Food Microbiol., 64(1-2), 2001, s GIRAFFA F.: Enterococci from foods. FEMS Microbiol. Rev., 26, 2002, GIRAFFA G. Functionality of enterococci in dairy products. Int. J. Food Microbiol., 64, 2003, s JARISCH R., WANKE F.: Wine and headache. Int. Arch. Allergy Immunol., 110, 1996, s LECLERS H., DEVRIESE L.A., MOSSEL D.A.A.: Taxonomical changes in intestinal (faecal) enterococci and streptococci: consequences on their use as indicators faecal contamination in drink water. J. Appl. Bacteriol., 81, 1996, s LUND B., ADAMSSON I., EDLUND C.: Gastrointestinal transit survival of an Enterococcus faecium probiotic strain administered with or without vancomycin. Int. J. Food Microbiol., 77, 2002, s MADERA C., GARCÍA P., JANZEN T., RODRÍGUEZ A. AND SUÁREZ E.J.: Characterisation of technologically proficient wild Lactococcus lactis strains resistant to phage infection. Int. J. Food Microbiol., 86(3), 2003, s Ten BRINK B., DAMINK C., JOOSTEN H. M. L. J., et al Occurence and formation of biologically active amines in foods. Int. J. Food Microbiol., 11, 1990, s

51 ZHODNOCENÍ ROZDÍLŮ V SÝRAŘSKÝCH VLASTNOSTECH MLÉKA MEZI DOJNICEMI HOLŠTÝNSKÉHO A MONTBELIARDSKÉHO PLEMENE Čejna Vladimír, Chládek Gustav Ústav chovu a šlechtění zvířat, Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně THE ANALYSIS OF DIFFERENCES IN CHEESE-MAKING CHARACTERISTICS OF MILK OF HOLSTEIN AND MONTBELIARDE COWS Summary: Cattle breed significantly affects composition and characteristics of processed milk. We analysed individual milk samples of Holstein (H) and Montbeliarde (CI) cows kept in identical conditions during their lactation with the aim to determine the differences in cheese-making characteristics between the breeds. We found a significant effect (P<0.001) of breed on milk protein content (3.43 % in H and 3.65 % in CI), rennet coagulation time (288 s. in H and 222 s. in CI), rennet gel quality (class; 1.89 in H and 1.32 in CI), volume of expelled whey (7.3 ml in H and 10.2 ml in CI) and active acidity (6.71 ph in H and 6.78 ph in CI). No significant effect was found in titratable acidity (6.59 SH in H and 6.47 SH in CI). With respect to the major milk processing characteristics (milk protein content and rennet coagulation time) the milk of Montbeliarde cows was more favourable. Our experiment proved the effect of cattle breed on cheese-making quality. This information may be useful for milk processing plants with regards to the milk producers cattle herds. Úvod Výběr plemenné skladby dojnic je pro producenty mléka jedním z klíčových a strategických rozhodnutí. Chovatel se může rozhodnout pro mléčný typ skotu (obecně vyšší produkce mléka, ale nižší obsah složek) nebo pro kombinovaný typ (obecně nižší produkce mléka, ale vyšší obsah složek). Musí také brát zřetel na své chovatelské podmínky a zejména kvalitu výživy, kterou je schopen dojnicím zajistit (Čejna a Chládek, 2006). Populace dojeného skotu je v České republice rovnoměrně rozdělena mezi dva užitkové typy skotu. Mléčný typ skotu je zastoupen plemenem holštýnským a kombinovaný typ skotu plemenem českým strakatým. Kombinovaný typ skotu představuje také plemeno montbeliarde, které je fylogeneticky příbuzné s plemenem české strakaté. Významnými poradci ohledně výběru plemenné skladby dojnic by vedle šlechtitelských odborníků měli být také pracovníci mlékáren, kteří vyprodukované mléko zpracovávají (Čejna a Chládek, 2005a). Sýrařské vlastnosti mléka významně participují na celém procesu výroby a výsledné kvalitě produkovaných sýrů. Souhrnně ovlivňují množství vyrobených sýrů (obsah bílkovin, syřitelnost) a dosažení požadovaných hodnot sýřeniny (kvalita sýřeniny, množství vyloučené syrovátky). Kyselost syrového mléka se podílí na predikci neporušenosti a vhodnosti mléka k výrobě sýrů. Pro hodnocení sýrařských vlastností je důležitá znalost jejich změn a vztahů v průběhu laktace (Ostersen et al., 1997). Mléko s příznivými sýrařskými vlastnostmi dává předpoklad vyšší výtěžnosti sýrů s jejich požadovaným složením, než mléko s nevhodnými sýrařskými vlastnostmi (Bynum a Olson, 1982). Na výše jmenované sýrařské vlastnosti jsme se zaměřili v našem experimentu z hlediska vlivu plemenné příslušnosti dojnic a stádia laktace. Materiál a metodika Analyzovali jsme vzorky mléka získané z večerního nádoje čistokrevných dojnic holštýnského (n=12) a montbeliardského skotu (n=12) chovaných na farmě, kde byla tato plemena ustájena ve společné stáji a krmnena shodnou krmnou dávkou. Skupiny dojnic se nacházely ve stejném stádiu laktace. Průměrné pořadí laktace u plemene holštýnské (H) bylo 1,62 a u plemene montbeliarde (CI) 1,55. Odběr individuálních vzorků mléka probíhal v pravidelných měsíčních intervalech v rámci KU od 3. do 10. měsíce laktace. Obsah bílkovin byl stanoven v laboratoři LRM Brno-Chrlice infračerveným absorpčním analyzátorem (Bentley 2000). Ostatní ukazatele byly zjištěny v laboratoři Ústavu chovu a šlechtění zvířat MZLU v Brně. Syřitelnost mléka byla stanovena pomocí Nefelo-turbidimetrického snímače koagulace mléka měřící principem vysvětleným v Čejna a Chládek (2005b). Bylo použito syřidlo Laktochym 1:5000 (Milcom Tábor) 53

52 v množství 1 ml na 50 ml mléka po zředění syřidla 1:4. Kvalita sýřeniny byla hodnocena po 60 minutové inkubaci 50 ml zasýřeného mléka při 35 C a posouzena dle známé tabulky (Gajdůšek, 1999) hodnotící vzhled sýřeniny a syrovátky (třída 1 = nejlepší, třída 5 = nejhorší). Podíl syrovátky byl zjištěn paralelně s hodnocením kvality sýřeniny jako množství samovolně vyloučené syrovátky. Aktivní kyselost byla měřena ph-metrem CyberScan PC 510 (Eutech Instruments). Titrační kyselost byla prováděna dle ČSN čl. 58. Výsledky a diskuze Průměrné hodnoty sledovaných parametrů u plemene holštýnské (H) a montbeliarde (CI) v jednotlivých měsících laktace ukazuje tab. I, ve které je také uvedena statistická průkaznost mezi plemeny u jednotlivých parametrů. Jednou ze základních složek mléka jsou bílkoviny. Významné jsou pro zpracovatelskou technologii, pro výživnou hodnotu mléka a také pro možnost kontroly výživy dojnic a tím též jejich zdravotního stavu (Hanuš, 2001). Kvalita a kvantita bílkovin patří mezi nejvýznamnější ukazatele výtěžnosti sýrů (Gajdůšek, 1999). Nejvýznamnějším fyziologickým faktorem ovlivňující obsah bílkovin je stádium laktace. V průběhu laktace bývá pozorována negativní korelace mezi produkcí mléka a obsahem bílkovin (Gajdůšek, 2003). Zjištěný obsah bílkovin vykazoval s postupujícím stádiem laktace u obou plemen vytrvalý vzestup (graf 1). Tento výsledek je ve shodě s pracemi Auldist et al. (1998) a Ikonen et al. (2004). Průměrná hodnota obsahu bílkovin plemene H byla 3,43 % a 3,65 % u plemene CI. Plemeno CI mělo při všech odběrech vyšší obsah bílkovin a celkově byl zjištěn velmi vysoce statisticky průkazný vliv (P<0,001) plemene na obsah bílkovin. Také Macheboeuf et al. (1993) zjistili statisticky průkazný rozdíl (P<0,05) v obsahu bílkovin mezi těmito plemeny. Zásadní technologická vlastnost mléka je jeho syřitelnost. Jedná se o schopnost mléka srážet se syřidlem a vytvořit sýřeninu požadovaných vlastností (Gajdůšek, 2003). Syřitelnost mléka je kombinací iniciační enzymatické hydrolýzy a následné enzymově nezávislé agregační reakce proteinů (van Hooydonk a Walstra, 1987). Dobrá syřitelnost mléka závisí na jeho neporušeném složení, na obsahu kaseinových bílkovin, jejich složení a genetickém typu, na obsahu minerálních látek a jejich rovnováze s bílkovinami, na formě minerálních látek, tj. rozpustné, ionizované a koloidní formě a na přirozeném ph mléka, které s těmito faktory přímo souvisí (Forman, 1994). V našem měření byla syřitelnost nejhorší ve 4. a 5. měsíci laktace a následně v 9. a 10. měsíci laktace (graf 2). Kromě 9. měsíce laktace byla vždy výrazně lepší syřitelnost mléka u plemene CI. V tomto měsíci bylo u plemene CI zaznamenáno prudké zvýšení PSB (437 tis/ml), a tento negativní stav se zřejmě projevil nejen v tomto, ale i v dalších parametrech (kvalita sýřeniny, aktivní a titrační kyselost). Prodlužování doby syřitelnosti s postupující laktací zjistili i Žižlavský et al. (1989). Také Davoli et al. (1990) uvádí zhoršení sýrařských vlastností s postupující fází laktace, ačkoliv vyšší obsah tuku a kaseinu v mléce v poslední fázi laktace může tento negativní projev eliminovat (Sapru et al., 1997). Ostersen et al. (1997) a Ikonen (2000) zjistili nejlepší syřitelnost na začátku a na konci laktace, přičemž nejhorší syřitelnost zjistili v 6. měsíci laktace. Průměrná hodnota syřitelnosti plemene H byla 288 s. a 222 s. u plemene CI. Zjistili jsme vysoce statisticky průkazný vliv (P<0,001) plemene na syřitelnost mléka. Také Auldist et al. (2002) uvádějí, že mléko od plemene montbeliardského mělo rychlejší syřitelnost (P<0,01) než mléko od plemene holštýnského, a to především z důvodů, že monbeliardské plemeno vykázalo vyšší četnost varianty B κ-kaseinu, vyšší obsah proteinu a menší velikost kaseinových micel. Podobně Macheboeuf et al. (1993) zjistili, že mléko od plemene H má menší obsah kaseinu a vápníku ve srovnání s plemenem CI. Při hodnocení kvality sýřeniny vyplynulo, že u plemene H docházelo v průběhu laktace k zlepšování tohoto parametru, zatímco u plemene CI se udržovala kvalita sýřeniny přibližně na stejné úrovni po celou dobu laktace (graf 3). Naopak Coulon et al. (1991) zjistil nejlepší kvalitu sýřeniny na začátku a konci laktace. Průměrná hodnota třídy sýřeniny plemene H byla 1,89 a 1,32 u plemene CI. Zjistili jsme vysoce statisticky průkazný vliv (P<0,001) plemene na kvalitu sýřeniny. Podobně Machebouf et al. (1993) a Auldist et al. (2002) zjistili u tohoto parametru mezi plemeny H a CI statisticky průkazný rozdíl (P<0,05). Na grafu 4 lze vidět procentuální zastoupení 54

53 nejkvalitnější třídy sýřeniny. Mimo 9. měsíce mělo plemeno CI vždy vyšší zastoupení nejkvalitnější sýřeniny. Schopnost vylučovat syrovátku (syneréze) během tvorby sýřeniny je dalším ukazatelem, který determinuje vhodnost mléka k výrobě sýrů. Kvalitní sýřenina vykazuje vyšší množství vyloučené syrovátky. Vylučování syrovátky ze sýřeniny je výsledkem kontrakce sýřeniny způsobenou přeskupením vazeb mezi proteinovými agregáty (Fox, 1987). Důležitost syneréze spočívá v množství vyloučené syrovátky, která se projeví ve výsledné hodnotě sušiny sýrů (Calvo a Balcones, 2000). Pevnost a propustnost sýřeniny je především určena jejím celkovým složením, teplotou, ph a koncentrací syřidla (Grundelius et al., 2000). V našem experimentu se projevil silný vliv stádia laktace výrazným poklesem vyloučené syrovátky s postupující fází laktace (graf 5). Pokles množství vyloučené syrovátky v průběhu laktace byl shodný pro obě plemena kromě 8. a 9. měsíce bylo větší množství vyloučené syrovátky u plemene CI. Pravděpodobně je to způsobeno lepší syřitelností a kvalitou sýřeniny zjištěné u tohoto plemene. Z toho vyplývá, že i tento ukazatel má vypovídací schopnost o sýrařských vlastnostech mléka. Snížení množství vyloučené syrovátky v pozdní laktaci lze vysvětlit vyšší tučností mléka produkovaného dojnicemi v tomto období, neboť Green et al. (1983) a Pearse a Mackinlay (1989) uvádějí, že s vyšší koncentrací tuku v mléce se rychlost syneréze snižuje. Se zvyšujícím se obsahem tuku, tukové kuličky ve větší míře zaplňují skuliny v sýřenině a zvyšují odpor odtoku syrovátky (Storry et al., 1983). Rychlost syneréze se též snižuje se zvyšujícím se ph (Daviau et al. 2000). V našem případě se však hodnota ph v pozdní laktaci dramaticky nezvyšovala (graf 6). Renault et al. (1997) uvádí, že změny v synerézy mohou být způsobeny také změnami v konformaci proteinu, což se projeví v přeměně hydrofobních vazeb. Průměrné množství vyloučené syrovátky u plemene H bylo 7,3 ml a 10,2 ml u plemene CI. Zjistili jsme vysoce statisticky průkazný vliv (P<0,001) plemene na množství vyloučené syrovátky. Syřitelnost mléka také ovlivňuje jeho kyselost. Proto jsme též zkoumali změny v aktivní a titrační kyselosti mléka v průběhu laktace. Nejnižší aktivní kyselost mléka (ph) byla zaznamenána shodně u obou plemen ve 3., 6. a 8. měsíci laktace (graf 6). Při všech odběrech vykázalo plemeno CI vyšší aktivní kyselost. I přes tvrzení Olffose et al. (1992) a Ikonena (2000), že vyšší ph je v negativní korelaci k sýrařským vlastnostem, v našem experimentu se tento fakt v mléce od plemene CI nepotvrdil. Minimální změny ph v průběhu laktace uvádí také Sapru et al. (1997). Průměrná hodnota aktivní kyselosti plemene H byla 6,71 ph a 6,78 ph u plemene CI. Zjistili jsme vysoce statistický průkazný vliv (P<0,001) plemene na aktivní kyselost mléka. Titrační kyselost mléka hraje důležitou roli při všech fázích srážení mléka: reaktivitě mezi syřidlem a kaseinem, agregační rychlosti micel a synerézy sýřeniny (Mariani, 1989). Titrační kyselost mléka obou plemen se nejčastěji pohybovala v intervalu 6,2 6,8 SH, s výjimkou v 9. měsíci, kdy u obou plemen došlo k poklesu pod hodnotu 6,2. Průměrná titrační kyselost u plemene H byla 6,59 SH a 6,47 SH u plemene CI. Nezjistili jsme statisticky průkazný vliv plemene na titrační kyselost. Tabulka I Průměrné hodnoty sledovaných parametrů u plemene holštýnské (H) a montbeliarde (CI) v jednotlivých měsících laktace a statistická průkaznost mezi plemeny u jednotlivých parametrů parametr bílkovina (%) syřitelnost (s) kvalita sýřeniny (třída) 55 podíl syrovátky (ml) aktivní kyselost (ph) titrační kyselost (SH) měsíc plemeno laktace H CI H CI H CI H CI H CI H CI 3 3,08 3, ,33 1,42 11,3 14,3 6,66 6,75 6,75 6,30 4 3,23 3, ,08 1,09 10,4 12,2 6,74 6,82 6,37 6,25 5 3,16 3, ,70 1,33 10,7 16,0 6,75 6,81 6,67 6,56 6 3,45 3, ,00 1,18 8,1 13,8 6,70 6,74 6,48 6,65 7 3,54 3, ,73 1,25 7,2 10,7 6,71 6,77 6,80 6,77 8 3,65 3, ,81 1,36 3,8 3,4 6,67 6,75 6,84 6,65 9 3,69 4, ,64 1,64 5,1 2,9 6,74 6,85 6,16 5, ,80 4, ,67 1,17 0,5 4,1 6,74 6,76 6,74 6,86 x 3,43 A 3,65 B 288 A 222 B 1,89 A 1,32 B 7,3 A 10,2 B 6,71 A 6,78 B 6,59 6,47 s x 0,338 0,427 83,6 77,8 0,868 0,559 5,17 6,15 0,076 0,090 0,610 0,669 v % 9,824 11,691 29,0 34,2 46,066 42,513 70,60 60,82 1,132 1,334 9,250 10,340 Průměrné hodnoty jednoho faktoru označené ve stejném řádku různými písmeny (A,B) se liší velmi vysoce stat. průk. (P<0,001)

54 350 4,3 (s) (%) 4,1 3,9 3,7 3,5 3,3 3,1 2, , , měsíc laktace měsíc laktace H CI H CI Graf 1: Změny obsahu bílkovin v průběhu laktace u plemene H a CI Graf 2: Změny v syřitelnosti mléka v průběhu laktace u plemene H a CI (třída sýřeniny) 2,40 2,20 2,00 1,80 1,60 1,40 y = 0,0138x + 1,2429 R 2 = 0,0377 y = -0,0805x + 2,2321 R 2 = 0,6514 1,20 1, měsíc laktace H CI Lineární (CI) Lineární (H) Graf 3: Změny kvality sýřeniny v průběhu laktace u plemene H a CI (%) (ml) H CI měsíc laktace měsíc laktace H CI H CI Graf 4: Procentuální podíl nejkvalitnější třídy sýřeniny u plemene H a CI Graf 5: Množství vyloučené syrovátky v průběhu laktace u plemene H a CI 56

55 6,90 7,00 6,85 6,80 6,80 6,60 (ph) 6,75 6,70 (SH) 6,40 6,20 6,65 6,00 6,60 5,80 6, měsíc laktace 5, měsíc laktace H CI H CI Graf 6: Změny aktivní kyselosti v průběhu laktace u plemene H a CI Graf 7: Změny titrační kyselosti v průběhu laktace u plemene H a CI Závěr Plemeno skotu zásadním způsobem ovlivňuje složení a vlastnosti zpracovávaného mléka. Také naše sledování zjistilo velmi významný vliv plemene na sledované sýrařské vlastnosti. Zjistili jsme velmi vysoce statisticky průkazný vliv (P<0,001) sledovaných plemen na obsah bílkovin (3,43 % u H a 3,65 % u CI), syřitelnost mléka (288 s. u H a 222 s. u CI), kvalitu (třídu) sýřeniny (1,89 u H a 1,32 u CI), množství vyloučené syrovátky (7,3 ml u H a 10,2 ml u CI) a aktivní kyselost (6,71 ph u H a 6,78 ph u CI). Statisticky neprůkazný vliv byl zjištěn u titrační kyselosti (6,59 SH u H a 6,47 SH u CI). Z pohledu nejvýznamnějších sýrařských vlastností (obsah bílkovin a syřitelnost mléka) vykázalo lepší hodnoty mléko od plemene montbeliarde. Náš experiment podává důkaz zpracovatelům mléka, jak může plemenná skladba dojnic jejich dodavatelů ovlivnit jakost nakupované suroviny. Příspěvek byl vypracován s podporou projeku QF Použitá literatura: AULDIST, M. J., WALSH, B. J., THOMSON, N. A.: Seasonal and lactational influences on bovine milk composition in New Zealand. Journal of Dairy Res.,1998, (65): AULDIST, M., MULLINS, C., O BRIEN, B., O KENNEDY, B. T., GUINEE, T.: Effect of cow breed on milk coagulation properties. Milchwissenschaft, 2002, 57 (3): BYNUM, D. G., OLSON, N. F.: Influence of curd firmness at cutting on cheddar cheese yield and recovery of milk constituent. J. Dairy sci., 1982, 65: CALVO, M. M., BALCONES, E.: Some factors influencing the syneresis of bovine, ovine and caprine milks. J. Dairy Sci., 2000, 83: COULON, J. B., CHILLIARD, Y., REMOND, B.: Effect of physiological stage and season on dairy milk chemical composition and its technological characteristic. INRA Production animales, 1991, (4): ČEJNA, V., CHLÁDEK, G.: Differences in the main milk characteristics between hosltein and montbeliarde cows. [in Czech] Sborník Mendelnet05Agro, 2005a, multimediální CD-rom ČEJNA, V., CHLÁDEK, G.: A coagulation time of individual milk samples and its relationship with a numer and phase of lactation in holstein cows. [in Czech] Sborník: Mléko a sýry. 1. vyd. Praha: Česká společnost chemická, 2005b, s ČEJNA, V., CHLÁDEK, G.: Porovnání dojnic holštýnského a montbeliardského plemene. Náš chov č. 1, 2006, s

56 DAVIAU, C., FAMELART, M.-H., PIERRE, A., GOUDÉRANCHE, MAUBOIS, J.-L.: Rennet coagulation of skim milk and curd drainage: Effect of ph, casein concentration, ionic strength and heat treatment. Lait, 2000, 80: DAVOLI, R., DALĽOLIO, S., RUSSO, V.: Effect of κ-kasein genotype on the coagulation properties of milk. J. Anim. Breed. Genet. 1990, 107: FORMAN, L.: Mlékárenská technologie II. Praha: VŠCHT, 1994, 217 s. FOX, P.H.: Cheese: Chemistry, physics and microbiology. London: Elsevier Applied Science, 1987, 1056 GAJDŮŠEK, S.: Mlékařství II (cvičení). Brno: MZLU. 1999, 92 s. GAJDŮŠEK, S.: Laktologie. Brno: MZLU. 2003, 84 s. GREEN, M. L., MARSHALL, R. J., GLOVER, F. A.: Influence of homogenisation of concentrated milk on the structure and properties of rennet curds. J. Dairy Res., 1983, 50: GRUNDELIUS, A. U., LODAITE, K., ÖSTERGREN, K., PAULSSON, M., DEJMEK, P.: Syneresis of submerged single curd grains and curd rheology. International Dairy Journal, 2002, 10(7): HANUŠ, O.: Variabilita a vlivy působící na kompozici a relace dusíkatých složek kravského mléka. Sborník: Den mléka 2001, s IKONEN, T.: Possibilities of genetic improvement of milk coagulation properties of dairy cows. Academic dissertation, University of Helsinky, 2000, 34 s. IKONEN, T., MORRI, S., TYRISEVÄ, A.-M., ROUTTINEN, O., OJALA, M.: Genetic and phenotypic correlations between milk coagulation properties, milk production traits, somatic cell count, casein kontent and ph of milk. J. Dairy Sci., 2004, 87: MACHEBOEUF, D., COULON, J. B., DHOUR, P.: Effect of breed, protein genetic-variants and feeding on cows milk coagulation properties. Journal of Dairy Res., 1993, 60(1): MARIANI, P.: Attitudine del latte alla coagulazione presamica: ruolo delľacidità nella produzione di formaggi a lunga maturazione. Obiettivi e Documenti Veterinari, 1989, 10(2):13-22 OLFFOS, K., SCHULTE-COERNE, H., PABST, K., GRAVERT, H. O.: Die Bedeutung der Proteinvarianten für genetische Unterschiede in der Käsereitauglichkeit der Milch. Züchtungskunde, 1992, 64:20-26 OSTERSEN, S., FOLDAGER, J., HERMANSEN, J. E.: Effects of stage of lactation, milk protein genotype and body condition at calving on protein composition and renneting propertiesof bovine milk. Journal of Dairy Res., 1997, (64)2: PEARCE, M. J., MACKINLAY, A. G.: Biochemical aspects of syneresis. J. Dairy Sci., 1989, 72: RENAULT, C., GASTALDI, E., LAGAUDE, A. CUQ, L. J., TARODO DE LA FUENTE, B.: Mechanisms of syneresis in rennet curd without mechanical treatment. J. Food Sci. 1997, 62: SAPRU, A., BARBARO, D. M., YUN, J. J., KLEI, L. R., OLTENACU, P. A., BANDLER, D. K.: Cheddar cheese: Influence of milking frequency and stage of lactation on composition and yield. J. Dairy Sci., 1997, 80: STORRY, J. E., GRANDISON, A. S., MILLARD, D., OWEN, A. J., FORD, G. D.: Chemical composition and coagulating properties of renneted milk from different breeds and species of ruminants. J. Dairy Res., 1983, 50: VAN HOOYDONK, A. C. M., WALSTRA, P.: Interpretation of the kinetice of the renneting reaction in milk. Netherlands Milk Dairy Journal, 41, 1987: WALSTRA, P., et al.: Dairy technology. Marcel Dekker, Inc., 1999, 726 s. ŽIŽLAVSKÝ, J., MIKŠÍK, J., GAJDŮŠEK, S., Pospíšil, Z.: Průběh a variabilita složek a vlastností mléka krav v prvních 100 dnech laktace. Živočišná výroba, 34 (LXII), 1989, (8): Kontaktní adresa: Ing. Vladimír Čejna, ÚCHŠZ AF MZLU BRNO, Zemědělská 1, , xcejnav@seznam.cz 58

57 MIKROBIOLOGICKÁ KVALITA KOZÍHO MLÉKA Cupáková Šárka 1, Pospíšilová Markéta 1, Lipertová Monika 1, Koláčková Ivana 2, Karpíšková Renata 2, Janštová Bohumíra 1 1 Ústav hygieny a technologie mléka, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno 2 Centrum hygieny potravinových řetězců Brno, Státní zdravotní ústav Praha MICROBIOLOGICAL QUALITY OF GOAT S MILK Summary: The aim of the study was to evaluate microbiological quality of raw and pasteurised goat s milk during lactation period. Samples were obtained from a goat farm in the South Moravia district. Sampling was carried out periodially from April to November 2005 on a farm baring 75 goats of White Short-haired stock. Quantitative analysis was performed on total plate count, psychrotrophic viable count, coliform bacteria, Escherichia coli, enterococci, Staphylococcus aureus, qualitative analysis on the presence of Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Salmonella spp., Campylobacter spp. and β-d-glucuronidase-negative E. coli. Evaluated raw goat s milk matches the selected limits in goat s eg. cow s milk. Selected pathogenic microorganisms were not detected in raw or in pasteurised milk. Occurrence of enterotoxigenic S. aureus need not be a health risk in case of proper manipulation with raw milk. Celosvětová produkce kozího mléka představuje pouze 2 % celkového množství vyprodukovaného mléka, přesto u některých států, jako Bangladéš (55 % celkové produkce mléka), Somálsko (51 %), Indonésie (29 %), Řecko (26 %), má významný ekonomický dopad (Haenlein, 2002). V Evropě se ročně vyprodukuje více než 2 miliony tun kozího mléka, což představuje asi 17 % celosvětové produkce. Nejvýznamnější producenti kozího mléka jsou situováni do blízkosti Středozemního moře - Řecko, Francie, Portugalsko, Španělsko a Itálie (Morgan et al., 2003). Kozí mléko se od kravského liší lepší stravitelností (Park, 2000), alkalitou (Aganga et al., 2002), vyšší pufrační kapacitou a obsahem základních složek mléka (Park, 2000). Odlišné jsou také senzorické vlastnosti syrového kozího mléka bílá barva způsobená absencí karotenu a specifická vůně a chuť, která je dána obsahem volných mastných kyselin. Výskyt alergických onemocnění je při konzumaci kozího mléka výrazně nižší než u mléka kravského (Martín-Diana et al., 2003). Ve studii jsme se zaměřili na hodnocení mikrobiologické jakosti syrového a tepelně ošetřeného kozího mléka, porovnání výsledků s dostupnými limitními hodnotami a zhodnocení možného zdravotního rizika. Materiál a metody: Vzorky mléka byly získány z kozí farmy v Jihomoravském kraji. Farma čítá 75 koz plemene bílá krátkosrstá koza na 1. až 8. laktaci, s průměrnou dojivostí 2-3 l denně, tj l za rok. V období od poloviny května do poloviny listopadu byly kozy krmeny letní krmnou dávkou zahrnující: pastvu, 0,5 kg sena a do 1 kg jádra (ječmen, triticale, oves, atd.) + vitamínová a minerální směs a sůl, ve zbylém období zimní krmnou dávkou: 3 kg travní senáž, 1 kg cukrovková siláž, 1 kg seno a do 1 kg jádra + vitamínová a minerální směs a sůl. Dojení je prováděno strojně 1x denně. Po nadojení je mléko zchlazeno na teplotu 4-6 C. Při této teplotě je uchováváno po dobu hodin do dalšího zpracování, které představuje stacionární pasteraci při teplotě 72 C po dobu 20 minut. Pasterované mléko slouží jako surovina pro výrobu čerstvých sýrů různých příchutí, které jsou distribuovány do vybraných prodejen zdravé výživy. Současně je v omezené míře realizován i prodej syrového kozího mléka vybraným zákazníkům. Odběr vzorků byl prováděn po odstavu kůzlat v období duben listopad 2005 v pravidelných intervalech, celkem bylo odebráno 48 vzorků syrového a 40 vzorků pasterovaného kozího mléka. Vzorky, zchlazené na teplotu 4-6 C, byly transportovány tak, aby nedošlo ke zvýšení jejich teploty na více než 8 C. Po příjmu v laboratoři byly ihned zpracovány. 59

58 Základní zpracování vzorků bylo provedeno dle ČSN ISO U vyšetřovaných vzorků byly hodnoceny následující mikrobiologické ukazatele: celkový počet mikroorganismů - CPM (ČSN ISO 4833), počet psychrotrofních mikroorganismů - PPM (zalití 1 ml vzorku půdou GTK s následnou aerobní kultivací při teplotě 6 C po dobu 10 dnů), počet koliformních bakterií - KB a Escherichia coli (ČSN ISO 4832 a ČSN ISO ), počet enterokoků (roztěr 0,2 ml vzorku na povrch S-B agaru s následnou aerobní kultivací 48 hodin při teplotě 44 C), počet Staphylococcus aureus (ČSN EN ISO ), průkaz Bacillus cereus (vyočkování vzorku po pomnožení v pufrované peptonové vodě na MYP agar a aerobní kultivace 24 hodin při 30 C), průkaz Listeria monocytogenes (ČSN EN ISO ) a Salmonella spp. (ČSN EN 12824). Konfirmace charakteristických kolonií enterokoků a S. aureus byla doplněna o genotypovou konfirmaci metodou PCR, zaměřenou v případě enterokoků na detekci rodově specifického tuf-genu (Cupáková et al., 2005) a u S. aureus na detekci nuc-genu (Pospíšilová et al., 2004). Izoláty S. aureus byly dále testovány na výskyt genů kódujících stafylokokové enterotoxiny typu A J metodou PCR (Pospíšilová a Karpíšková, 2005), současně byla metodou RPLA (SET- RPLA, Denka Seiken, Japonsko) prověřována schopnost izolátů produkovat enterotoxiny A D. U vzorků syrového mléka byl sledován také výskyt termotolerantních Campylobacter spp. (ČSN ISO 10272) a β-d-glukuronidáza-negativních E. coli (SMAC s BCIG agar, aerobní kultivace při 37 C po dobu 24 hodin). Vzorek mléka byl za stálého chlazení asepticky zkoncentrován odstředěním při rpm po dobu 5 minut, vzniklý sediment byl sterilním tamponem rozetřen na povrch kultivačního média. U korespondujících vzorků syrového a pasterovaného mléka bylo na základě dosažených hodnot celkového počtu mikroorganismů provedeno zhodnocení účinku používaného pasteračního záhřevu pasterační efek. Při výpočtu průměrných měsíčních hodnot kvantitativních ukazatelů byl na jednotlivé soubory dat použit Grubbsův test extrémních odchylek pro vyloučení odlehlých hodnot (STATPlus, VÚVeL software, 1992). Výsledky a diskuse: Průměrné měsíční hodnoty celkového počtu mikroorganismů a počtu psychrotrofních mikroorganismů v syrovém i pasterovaném kozím mléce uvádí Obr počet mikroorganismů [KTJ.ml -1 ] duben květen červen červenec srpen září říjen listopad měsíc CPM syrové mléko CPM pasterované mléko CPM limitní hodnota PPM syrové mléko 60 PPM pasterované mléko Obr. 1 Průměrné měsíční hodnoty CPM a PPM syrového a pasterovaného kozího mléka.

59 Pro syrové kozí mléko je podle Nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 853/2004 a vyhlášky Mze ČR 203/2003 Sb. stanovena limitní hodnota klouzavého geometrického průměru CPM za dobu 2 měsíců při alespoň dvou vzorcích za měsíc na 1, KTJ.ml -1. Jak vyplývá z Obr. 1, po celé sledované období nebyla tato hodnota překročena, maximální stanovená průměrná hodnota CPM syrového kozího mléka 2, KTJ.ml -1 byla zaznamenána v měsíci srpnu. Na základě stanovených hodnot CPM u korespondujících vzorků syrového a pasterovaného kozího mléka byl stanoven průměrný pasterační efekt použité stacionární pasterace, a to 99,94 %. Pro PPM v syrovém kozím mléce není legislativou limitní hodnota stanovena. Při porovnání s doporučenou hodnotou 5, KTJ.ml -1 psychrotrofních mikroorganismů pro syrové kravské mléko (viz. ČSN ), nevyhovují zjištěné průměrné hodnoty PPM syrového kozího mléka v letních měsících červen, červenec. Za povšimnutí stojí výrazný pokles CPM pasterovaného mléka v měsících září a říjen. Po konzultaci s chovatelem vyšlo najevo, že počátkem září bylo provedeno seřízení řídící jednotky pasteračního zařízení, což se projevilo právě snížením CPM a PPM pasterovaného mléka a zvýšením pasteračního efektu, který v uvedených měsících dosáhl průměrné hodnoty 99,96 %, resp. 99,99 %. Obr. 2 uvádí průměrné měsíční hodnoty počtu koliformních bakterií, enterokoků a Staphylococcus aureus v syrovém kozím mléce. Počet bakterií E. coli se u všech vzorků syrového mléka pohyboval pod mezí detekce použité kultivační metody, tj. < 5 KTJ.ml -1, ojedinělý výskyt E. coli byl zaznamenán po pomnožení vzorku počet mikroorganismů [KTJ.ml-1] duben květen červen červenec srpen září říjen listopad 61 měsíc Koliformní bakterie Enterokoky S. aureus KB doporučená hodnota Obr. 2 Průměrné měsíční hodnoty KB, enterokoků a S. aureus syrového kozího mléka. V Obr. 2 je vyznačena doporučená limitní hodnota počtu koliformních bakterií v syrovém kravském mléce 1, KTJ.ml -1, jak ji uvádí ČSN Po většinu sledovaného období počet koliformních bakterií v syrové kozím mléce tento limit mírně převyšuje, maximální hodnota 2, KTJ.ml -1 byla stanovena v měsíci září. Výskyt koliformních bakterií, E. coli, enterokoků a Staphylococcus aureus v pasterovaném kozím mléce byl ojedinělý. Maximální hodnota počtu enterokoků v měsíci listopadu se může podílet na výrazném zvýšení CPM u pasterovaného mléka. Zdá se, že termostabilní enterokoky, přežívající záhřev 60 C po dobu 30 minut (Franz et al., 1999), mohou v omezené míře při stacionárním způsobu pasterace přežívat. Tuto hypotézu podporuje zvýšený výskyt enterokoků v pasterovaném kozím mléce

60 ve vzorcích odebraných koncem října a v průběhu listopadu, a to před i po 24hodinovém pomnožení v pufrované peptonové vodě 28,6 %, resp. 57,1 %. Další příčinou vzestupu CPM může být zvýšená tučnost syrového kozího mléka zaznamenaná v měsících říjnu a listopadu, která mohla negativně ovlivnit prostup tepla mlékem v průběhu stacionární pasterace (nepublikovaná data). Tyto změny korespondují se snížením produkce mléka v důsledku zaprahování koz. S. aureus byl prokázán u 69 % vzorků syrového kozího mléka. Téměř všechny izoláty nesly gen sec kódující tvorbu stafylokokového enterotoxinu typu C (SEC), schopnost produkovat tento enterotoxin byla potvrzena metodou RPLA. U jednoho izolátu S. aureus nebyl metodou PCR prokázán žádný ze sledovaných enterotoxigenních genů, u dvou izolátů byly detekovány geny seb, seg, sei a u jednoho pouze geny seg a sei. Schopnost produkovat enterotoxin B (SEB) byla opět potvrzena metodou RPLA. Jediný izolát S. aureus z pasterovaného kozího mléka měl schopnost produkovat SEC. Tento toxinový typ byl nejčastěji se vyskytujícím u izolátů S. aureus z mastitidního mléka a zároveň je to také nejčastěji produkovaný enterotoxin u kmenů získaných z kozího mléka (Scherrer et al., 2004). Zjištěné počty S. aureus v syrovém mléce (viz. Obr. 2) nedosahují hodnot KTJ.ml -1 potřebných k vyprodukování množství enterotoxinů schopných vyvolat alimentární intoxikaci (Ercolini et al., 2004). Avšak při nevhodném skladování syrového mléka může dojít k pomnožení S. aureus a k produkci vysoce termostabilních toxinů, v tomto případě by pasterace nebyla dostatečným opatřením pro zajištění zdravotní nezávadnosti mléka či čerstvých sýrů. Bakterie rodu Salmonella, termotolerantní Campylobacter spp. ani Listeria monocytogenes nebyly ve sledovaných vzorcích prokázány. Výskyt Bacillus cereus byl po pomnožení prokázán ve dvou vzorcích pasterovaného kozího mléka, v obou případech se jednalo o vzorky odebrané v měsíci říjnu. U více než 85 % vzorků syrového kozího mléka byly izolovány z půdy SMAC s BCIG suspektní kolonie β-d-glukuronidáza-negativních E. coli. Následnou fenotypovou konfirmací však byly ve většině případů izoláty identifikovány jako Hafnia alvei. Závěr: Hodnocené syrové kozí mléko odpovídá ve vybraných ukazatelích, s výjimkou počtu koliformních bakterií, limitním hodnotám pro kozí, resp. kravské mléko. Sledované patogenní mikroorganismy, mimo S. aureus, nebyly v syrovém ani pasterovaném mléce prokázány. Výskyt enterotoxinogenních S. aureus nemusí být v případě správné manipulace se syrovým mlékem rizikem z pohledu jeho zdravotní nezávadnosti. Poděkování: Práce vznikla za podpory výzkumného záměru Ministerstva školství, mládeže a tělovýchovy ČR MSM Veterinární aspekty bezpečnosti a kvality potravin. Použitá literatura: 1. AGANGA, AA., AMARTEIFIO, JO., NKILE, N. Effect of stage of lactation on nutrient composition of Tswana sheep and goat s milk. Journal of Food Composition and Analysis, 2002, vol. 15, no. 5, p CUPÁKOVÁ, Š., POSPÍŠILOVÁ, M., KOLÁČKOVÁ, I., KARPÍŠKOVÁ, R. Genus-specific identification of enterococci by PCR method. Acta Veterinaria Brno, 2005, vol. 74, no. 4, p ERCOLINI, D., BLALOTTA, G., FUSCO, V., COPPOLA, S. PCR-based detection of enterotoxigenic Staphylococcus aureus in the early stages of raw milk cheese making. Journal of Applied Microbiolgy, 2004, vol. 96, no. 1, p FRANZ, CHMAP., HOLZAPFEL, WH., STILES, ME. Enterococci at the crossroads of food safety? International Journal of Food Microbiology, 1999, vol. 47, no. 1-2, p HAENLEIN, GFW. Relationship of somatic cell counts in goat milk to mastitis and productivity. Small Ruminant Research, 2002, vol. 45, no. 2, p

61 6. MARTÍN-DIANA, AB., JANER, C., PELÁEZ, C., REQUENA, T. Development of a fermented goat s milk containing probiotic bacteria. International Dairy Journal, 2003, vol 13, no. 10, p MORGAN, F., MASSOURAS, T., BARBOSA, M., ROSEIRO, L., RAVASCO, F., KANDARAKIS, I., BONNIN, V., FISTAKORIS, M., ANIFANTAKIS, E., JAUBERT, G., RAYNAL-LJUTOVAC, K. Characteristics of goat milk collected from small and medium enterprises in Greece, Portugal and France. Small Ruminant Research, 2003, vol. 47, no. 1, p PARK, YW. Comparison of mineral and cholesterol composition of different commercial goat milk products manufactured in USA. Small Ruminant Research, 2000, vol 37, no. 1-2, p POSPÍŠILOVÁ, M., KARPÍŠKOVÁ, R. Detekce genů stafylokokových enterotoxinů metodou PCR. In VII. Konference mladých vědeckých pracovníků s mezinárodní účastí. Sborník. VFU Brno, 2005, s POSPÍŠILOVÁ, M., KARPÍŠKOVÁ, S., KARPÍŠKOVÁ, R. Identifikace druhu Staphylococcus aureus metodou polymerázové řetězové reakce. In VI. Konference mladých vědeckých pracovníků s mezinárodní účastí. Sborník. VFU Brno, 2004, s SCHERRER, D., CORTI, S., MUEHLHERR, J.E., ZWEIFEL, C., STEPHAN, R. Phenotypic and genotypic characteristics of Staphylococcus aureus isolates from raw bulk-tank milk samples of goats and sheep. Veterinary Microbiology, 2004, vol. 101, no. 2, p ČSN Syrové kravské mléko pro mlékárenské ošetření a zpracování ČSN EN Mikrobiologie potravin a krmiv - Horizontální metoda průkazu bakterií rodu Salmonella ČSN EN ISO Mikrobiologie potravin a krmiv - Horizontální metoda stanovení počtu koagulázopozitivních stafylokoků (Staphylococcus aureus a další druhy) Část 1: Technika s použitím agarové půdy podle Baird-Parkera ČSN EN ISO Mikrobiologie potravin a krmiv - Horizontální metoda průkazu a stanovení počtu Listeria monocytogenes Část 1: Metoda průkazu ČSN ISO Mikrobiologie. Všeobecné pokyny pro stanovení počtu koliformních bakterií. Technika počítání kolonií ČSN ISO Mikrobiologie. Všeobecné pokyny pro stanovení celkového počtu mikroorganismů. Technika počítání kolonií vykultivovaných při 30 C ČSN ISO Mikrobiologie potravin a krmiv Všeobecné pokyny pro mikrobiologické zkoušení ČSN ISO Mikrobiologie poživatin a krmiv - Horizontální metoda průkazu termotolerantních druhů rodu Campylobacter ČSN ISO Mikrobiologie potravin a krmiv - Horizontální metoda stanovení počtu betaglukuronidázopozitivních Escherichia coli - Část 2: Technika počítání kolonií vykultivovaných při 44 C s použitím 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-d-glukuronidu Nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 853/2004 ze dne 29. dubna 2004 stanovující zvláštní hygienické předpisy po potraviny živočišného původu. 22. Vyhláška Mze 203/2003 Sb., o veterinárních požadavcích na mléko a mléčné výrobky. Sbírka zákonů ČR, 2003, částka 73, s Kontaktní adresa: MVDr. Šárka Cupáková, Ph.D. Ústav hygieny a technologie mléka Veterinární a farmaceutická univerzita Brno Palackého Brno cupakovas@vfu.cz 63

62 EXOPOLYSACHARIDY BAKTERIÍ MLÉČNÉHO KVAŠENÍ Kánský Jiří, Štětina Jiří Ústav technologie mléka a tuků, Vysoká škola chemicko-technologicklá v Praze EXOPOLYSACCHARIDES OF LACTIC ACID BACTERIA Summary In this lecture are concluded informations about formation and properties of lactic acid bacteria (LAB) exopolysaccharides (EPS) and their significance in fermented milk products. EPS are very heterogenous. They can exist both in the form of homo- or heteropolysaccharides, they can be loose or capsular and their structure can vary a lot. They serve as a protection against dessication, phagocytosis, antibiotics, they can help to colonize ecosystems, mentioned is also their anticancerogenic influence. Their are main cause of ropiness of fermented milk products which is affected mainly by their molecular weight and structure. Their use can solve problems as a low viscosity or an excessive whey syneresis of a product. Except of fermented yogurt-type products they can be utilized elsewhere, e.g. for low-fat cheese production. The influence of EPS will be shown on different illustrative cases of our measurements. For fermentations were used different yogurt cultures (MY 092, J2) or isolates of bacteria, as a substrate were used milk, whey or milk permeate. For MY 092 yogurt culture were measured monosaccharidic composition and molecular weight of a polymer. For EPS concentration ultrafitration was used. Yogurts were also assessed for their rheological properties (e.g. flow curves). At the end were discussed possibilities of an EPS isolate obtained from a culture medium. Úvod Bakteriální polysacharidy se mohou vyskytovat ve formě lipopolysacharidů (LPS, taktéž O-antigeny), kapsulárních sacharidů (CPS), nebo jako exopolysacharidů (EPS), vylučovaných do prostředí (Boels, 2001). EPS produkující bakterie mléčného kvašení rodů Streptococcus, Lactobacillus, Leuconostoc a Lactococcus, některé propionibakterie a bifidobakterie produkují široké spektrum strukturně odlišných polysacharidů. Mohou být rozděleny do tříd podle mechanismů biosyntézy a podle potřebných prekurzorů (De Vuyst, 2001). Do první strukturní třídy patří extracelulárně produkované homopolysacharidy jako dextran, levan, mutan. K jejich produkci je třeba specifický substrát, např sacharosa. K polymeraci dochází prostřednictvím extracelulárních glykosyltransferas, které přenášejí monosacharid z disacharidu na rostoucí polysacharidový řetězec. Jejich produkce je poměrně jednoduchá, nezávislá na centrálním uhlíkovém metabolismu a různorodost ve struktuře je limitována. Další dvě třídy zahrnují homo a heteropolysacharidy syntetizované z intracelulárních cukerných nukleotidických prekursorů. Ty slouží k tvorbě EPS, ovšem jsou zahrnuty také v biosyntéze několika komponentů buněčné stěny a mohou tedy být esenciální pro růst buňky (Laws, 2001). Heteropolysacharidy (dále jen EPS), jež jsou nejrozšířenější z produkovaných polysacharidů bakterií mléčného kvašení, vznikají polymerací opakujících se jednotek vzniklých v cytoplazmě. Poté jsou sestaveny na membráně postupným přidáváním aktivovaných cukrů (nukleotid či nukleosid difosfátů) do rostoucí jednotky, připojené k undekaprenoylfosfátovému lipidickému nosiči. Hotové jednotky jsou transportovány ven z buňky, kde se tvoří EPS (van Kranenburg, 1999). Je prokázáno, že u mezofilních kmenů (např. Lactobacillus casei a Lactococcus lactis) produkce EPS spojena s přítomnými plazmidy. To bylo prokázáno transportem EPS plazmidů do recipientního kmene, jež poté vykazoval EPS produkující fenotyp (Boels, 2001). V případě termofilních bakterií (např. jogurtová kultura) je tvorba EPS kódována na chromosomech. Zdá se, že toto uspořádání souvisí i s produkcí EPS, neboť mezofilní LAB jich produkují nejvíce při suboptimálních podmínkách, zatímco u termofilních je to při podmínkách optimálních (De Vuyst, 1998). 64

63 Obecně je schopnost produkce EPS poměrně nestabilní. K ztrátě tvorby může dojít při opakované kultivaci, obzvláště při delší inkubaci při vyšších teplotách. Projevit se mohou i spontánní mutace. Nakonec mohou působit i glykohydrolásy, schopné polysacharid štěpit (De Vuyst, 2001). Je tedy obtížné uchovat v průmyslovém měřítku stálost této vlastnosti. U mezofilních bakterií souvisí ztráta produkce zřejmě se ztrátou plazmidů. U termofilních nebyla přítomnost plazmidů kódujících tvorbu EPS zjištěna (Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Streptococcus thermophilus), ztracený táhlovitý fenotyp může být obnoven, např. opakovaným přeočkováním v mléce. Tato genetická nestabilita může být způsobena pohyblivými (mobile) genetickými elementy a jevy, jako je např. inserční sekvence, či všeobecnou genovou nestabilitou, jako DNA delece a přeskupení (rearrangement) (De Vuyst, 2001). Za syntézu EPS jsou v LAB zodpovědné geny organizované ve shlucích (clusterech), jež vykazují významnou podobnost organizace a sekvence. Tyto clustery kódují enzymy zodpovědné za tvorbu oligosacharidů, jejich transport i polymerizaci (Welman, 2003). Jak už bylo řečeno výše, dělí se polysacharidy na homo- a hetero-polymery. Homopolysacharidy se skládají z opakující se monosacharidové jednotky, jako je glukosa, fruktosa či galaktosa. Tyto se mohou různě větvit a dosahovat různých molekulových hmotností. U heteropolysacharidů je ovšem situace jiná. Molekula zahrnuje více různých sacharidů, které se mnohonásobně opakují v oligosacharidických jednotkách Studium těchto struktur bylo umožněno až z rozvojem NMR technologie počátkem devadesátých let. (Laws, 2001). Nejčastější sacharidy heteropolysacharidů LAB jsou D-glukosa, D-galaktosa, L-rhamnosa a další, někdy se vyskytuje též N-acetylglukosamin, N-acetylgalaktosamin a glukurunová kyselina (Ruas-Madiedo, 2002). Možná je i přítomnost sn-glycerol-3-fosfátu a fosfátových a acetylových skupin. Monosacharidy mohou být přítomny jako α- či β-anomery v pyranosové či furanosové formě, kdy oligosacharidické části se skládají se ze tří až osmi jednotek, kdy na C2, C3, C4 a C6 uhlíku může dojít k větvení (De Vuyst, 2001). Molekulová hmotnost heteropolysacharidů se může lišit od po Velice často je vyšší než Pravděpodobně jsou na ní závislé též i texturní vlastnosti, s rostoucí molekulovou hmotností roste totiž i viskozita roztoku (Laws, 2001). Vyšší viskozita ovšem nemusí souviset pouze s molekulovou hmotností. Dalším důležitým faktorem je i tuhost řetězce. Platí, že β(1-4) vazby tvoří tužší řetězec než β(1-3) a β(1-2) a tím viskozitu zvyšují, a že α-vazby jsou zodpovědné za větší ohebnost řetězce, čímž působí opačně. Jako další možné vlivy jsou uváděny přítomnost náboje či větvení řetězce (Ruas-Madiedo, 2002). Ovšem až na těchto několik poznatků ještě nebyla nalezena určující korelace mezi strukturou EPS a viskozitou. Důvodem je ohromná variabilita ve složení, nábojích, prostorovém uspořádání, či schopnosti interagovat s proteiny. Tato souvislost je přitom velice důležitá, protože umožní zaměřit výzkum na tvorbu funkčně hodnotných polymerů, s předvídatelnými vlastnostmi (Welman, 2003). Pro využití EPS jako potravinářského aditiva byla stanovena jako ekonomicky výhodná minimální produkce v množství g.l -1. Ovšem nejvyšší naměřená koncentrace byla pouhých 2,7 g.l -1 pro Lactobacillus rhamnosus RW-9595M (Macedo, 2002). Zdá se tedy, že coby individuum, izolované po kultivaci, nenajdou EPS ještě nějaký čas využití. Uplatnění však nacházejí ve fermentovaných výrobcích (např. jogurtech), kde jsou bakterie produkující EPS již jejich součástí a kde pomáhají ovlivnit texturu výrobku i v nižších koncentracích, přičemž nevedou k dalšímu zvyšování výrobních nákladů. Mnohem vyšší výtěžky jsou zaznamenány v případě LAB produkujících homopolysacharidy, např. pro Lactobacillus reuteri LB 121 je to asi 10 g.l -1. Příkladem jiných než LAB bakterií může být průmyslový producent xanthanu, Xanthomonas campestris, u kterého je dosahováno výtěžků g.l -1. Jenže v prvním případě vzniká polymer vně buňky, v druhém se jedná o G - aerobní bakterii, pročež je nelze přímo s LAB produkujícími heteroexopolysacharidy srovnávat (Ruas-Madiedo, 2002). Existuje mnoho výrobků, kde se mohou exopolysacharidy LAB uplatnit. Nejčastější je použití táhlovitých kultur při výrobě jogurtů a jogurtových nápojů. Obě přítomné bakterie Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus a Streptococcus thermophilus jsou schopny v jisté míře 65

64 EPS tvořit. Tyto táhlovité kultury jsou schopny zadržet větší množství vody, čímž dokáží zabránit nechtěné synerezi. Jogurt s EPS také vykazuje vyšší viskozitu, i když nižší tuhost (ta souvisí s proteinovými interakcemi, které jsou přítomností EPS narušeny), a po případném narušení struktury (míchání) si udržuje stále dostatečně viskózní strukturu v porovnání s jogurtem bez EPS. Z mikroskopického pozorování vyplynulo, že EPS a bílkoviny byly v jogurtu odděleny, a že jogurt s EPS obsahoval větší póry (Hassan, 2003). Wacher-Rodarte (1993) přitom uvádí, že při senzorickém hodnocení byl lépe hodnocen táhlovitý jogurt se sušinou 12% nežli netáhlovitý se sušinou 17%, což není jistě zanedbatelné. Velmi důležitý faktor přitom hraje struktura EPS, mající na konzistenci větší vliv než množství. Další oblastí, kde se využívají EPS produkující kultury je výroba fermentovaných mléčných nápojů. Ty jsou obzvláště populární v severských zemích, Rusku či Mongolsku. Příkladem může být finský nápoj viili, při jehož přípravě se používá směs kultur Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis, Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris a plíseň Geotrichum candidum, která se rozvíjí na povrchu (Duboc, 2001). Jiným příkladem je kefír, mléčný nápoj vzniklý činností rozsáhlého symbiotického společenstva bakterií a kvasinek. Přítomné bakterie mléčného kvašení jsou Lactobacillus sp., Streptococcus sp., Lactococcus sp., kvasinky Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida a další, mohou se vyskytovat i bakterie rodu Acetobacter. Buňky jsou zakotveny v polysacharidu kefiranu, který se skládá z glukosy a galaktosy v poměru 1:1, a který je pravděpodobně vytvářen některým z přítomných laktobacilů. Přítomnost kvasinek působí na tvorbu EPS synergicky (Frengova, 2002). Jinou oblastí aplikace kultur kultur LAB produkujících EPS je výroba nízkotučných měkkých sýrů, kde mají za úkol zvýšit vazbu vody. Broadbent a spol. (2001) referovali o výrobě sýru Mozarella pomocí kmenů Lactobacillus helveticus produkujících EPS, které umožňují zachování nízkého obsahu tukuprosté sušiny a tím i měkké konzistence výrobku. Zjistili, že nejvhodnější pro tuto aplikaci jsou kultury s kapsulárními polysacharidy, poněvadž volné EPS způsobují problémy při koncentraci a sušení syrovátky, tím že zvyšují její viskozitu. Kromě výše zmíněných vykazují exopolysacharidy i jisté fyziologické funkce. Mohou mít protirakovinné a antimutagenní účinky, aktivovat makrofágy a indukovat cytokiny (výsledky pro Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus) (Boels, 2001). Vzhledem k jejich polysacharidické struktuře se nabízí taktéž jejich využití jakožto prebiotik. Degradovatelnost gastrointestinálními mikroorganismy však závisí silně na struktuře EPS, a tak je nutné nejdříve uvážit, který mikroorganismus pro jejich produkci použít (Ruas- Madiedo, 2002). Využití exopolysacharidů bakterií mléčného kvašení je tedy pro použití v mlékárenském průmyslu perspektivní a lze proto očekávat, že v budoucnosti dojde k jejich aplikaci v daleko širším měřítku. Na ústavu technologie mléka a tuků je problematice využití EPS bakterií mléčného kvašení pro modifikaci textury mléčných výrobků již několik let věnována pozornost, jak z hlediska možností izolace a charakterizace jejich složení, tak i z hlediska jejich vlivu na konzistenci fermentovaných výrobků. Pro tyto studie jsou používány jogurtové kultury MY092 (Texel, Francie), resp. J2 a RX (Laktoflora Vokovice, ČR). Kultury J2 a MY vykazují táhlovitost, přižemž v kultuře J2 jsou za táhlovitost zodpovědné laktobacily, zatímco v kultuře MY 092 streptokoky. Kultura RX je používána jako srovnávací, přičemž pro posouzení vlivu na kyselé srážení mléka a reologické vlastnosti koagulátu bylo použito i srážení pomocí glukono-δ-laktonu. Pro účely izolace exopolysacharidů (EPS) byla provedeny kultivace táhlovitých jogurtových kultur) v syrovátce, resp. v permeátu po ultrafiltraci mléka, při teplotě 45 C po dobu 16, resp. 32 hodin. Zakoncentrování EPS ve fermentovaném permeátu bylo provedeno ultrafiltrací na zařízení ARNO 700 (Mikropur, Hradec Králové). Použity byly tubulární keramické membrány (Tami, Německo) s cut-off 8 a 50 kda. Maximální dosažená teplota byla 45 C, pracovní tlak okolo 2-3 bar. Bylo zjištěno, že dostatečné retence EPS bylo dosaženo již na membráně s cut-off 50 kda. Problémem se stala ztráta táhlovitosti takto získaného koncentrátu namísto předpokládaného 66

65 zesílení. K tomu došlo patrně působením vysoké smykové rychlosti v přístroji. Na obr. 1 lze vidět rozdíl v tokových křivkách pro původní syrovátku a poté co byla po dobu jedné minuty cirkulovala v ultrafiltračním zařízení (pracovní tlak 2 bar). před po Obr 1 Srovnání tokových křivek syrovátky fermentované táhlovitou jogurtovou kulturou před a po cirkulaci v ultrafiltrační jednotce (τ smykového napětí; γ& smyková rychlost) Vzhledem k relativně nízké produkci EPS v permeátu byla charakterizace EPS produkovaných jogurtovou kulturou MY provedena po fermentaci v obnovené syrovátce, kde bylo dosaženo více než dvojnásobné výtěžnosti (řádově 100 mg/l, Kánský et al., 2004) a přitom ve srovnání s mlékem byla vzhledem k podstatně nižšímu obsahu bílkovin jednoduší izolace. Zakysaná syrovátka byla nejprve zakoncentrována ultrafiltrací (TIA, Francie) a poté dále zahuštěna na rotační vakuové odparce (Bűchi, Německo). Koncentrát byl poté odstředěn při 9000 rpm (Universal 32R, Hettich, Německo). V supernatantu byly vysráženy bílkoviny působením kyseliny trichloroctové (konečná koncentrace 12%) a po dalším odstředění a neutralizaci (ph 5) byl vzorek dialyzován (sáčky Sigma-Aldrich, cut-off Da) oproti demineralizované vodě a poté opět zahuštěn odpařením. Obsah EPS byl stanoven fenol-sulfonovou metodou při 490 nm (Dubois et al., 1956). Výsledky byly přepočítány na množství glukosy. Výsledná koncentrace roztoku EPS byla 2,5 g/kg. Izolované EPS byly charakterizovány z hlediska molekulové hmotnosti a zastoupení monosacharidů. Stanovení molekulové hmotnosti bylo provedeno pomocí gelové chromatografie v systému dvou analytických kolon Plaquagel-OH MIXED (velikostí částic 8 μm) (Polymer Laboratories Ltd, UK) zapojených za sebou s refraktometrickou detekcí (RIDK Laboratorní přístroje Praha). Mobilní fáze - vodný roztok solí : 0,2 mol.l -1 NaNO 3, 0,01 mol.l -1 NaH 2 PO 4 a 0,02% NaN 3, průtok 0,5 ml. min -1. V preparátu EPS byly nalezeny dvě frakce o různých molekulových hmotnostech ( a Da). Protože se však jednalo o směsnou kulturu, není jisté, zda byly oba polymery produkovány jednou kulturou, či každý jednou z nich. Pro tyto účely je nutno provést izolaci z média fermentovaného jednotlivými bakteriemi. Stanovení monosacharidů proběhlo po kyselé hydrolýze (trifluoroctovou kys.) pomocí chromatografie na anexech s pulsní amperometrickou detekcí (HPAEC-PAD) na koloně CarboPac PA1 (částice o průměru 10 μm) (Dionex, USA). Mobilní fáze - 16 mm NaOH. Izolované EPS se skládaly převážně z glukosy (42%) a galaktosy (46%). Mezi dalšími minoritními složkami byly zjištěny rhamnosa, arabinosa, mannosa a glukosamin, což odpovídá i zjištěním jiných pracovišť (De Vuyst et al., 2001; Ruas-Madiedo et al., 2002, Welman, Maddox, 2003;). Pro zjišťování vlivu EPS na reologické vlastnosti fermentovaných výrobků bylo použito široké spektrum metod. Např. dynamická oscilační reometrie byla využita buď pro sledování průběhu tvorby gelu při fermentaci jogurtovou kulturou nebo jako frequency sweep test, resp. stress 67

66 sweep test pro charakterizaci viskoelastických vlastností vzniklého gelu. Charakterizace reologických vlastností rozmíchaného koagulátu byla provedena pomocí rotační reometrie. Reologické měření bylo provedeno na rotačním reometru Rheostress RS 80 v systému koaxiálních válců Z40 (Haake) při teplotě 10 C. Vzorek (obnovené sušené mléko fermentrované jogurtovou kulturou 45, příp. 35 C po dobu 6, resp. 16 hodin) byl před měřením definovaně rozmíchán lžičkou (10 krát ve směru a 10 krát proti směru hodinových ručiček). Měření probíhalo v pěti krocích. Nejprve se sledovala časová závislost zdánlivé viskozity při konstantní smykové rychlosti 10 s -1 po dobu 5 minut. Poté byly hodnoceny viskoelastické vlastnosti rozmíchaného jogurtového gelu dynamickou oscilační reometrií. Byla sledována závislost na frekvenci oscilací v rozmezí 0,1 až 50 Hz v controlled deformation modu (CD) s amplitudou deformace 0,01. Následovalo měření vzestupné tokové křivky (změna smykové rychlosti z 10 s -1 na 100 s -1 za dobu 90 s ), poté časové závislosti zdánlivé viskozity při konstantní smykové rychlosti 100 s -1 po dobu 5 minut a nakonec měření sestupné tokové křivky (100 s -1 0,1 s -1 ) po dobu 5 minut. Pro názornost je uvedena pouze toková křivka táhlovitého a netáhlovitého jogurtu (obr. 2). táhlovitý netáhlovitý Obr. 2 Srovnání tokových křivek rozmíchaného koagulátu mléka fermentovaného táhlovitým a netáhlovitým kmenem Lactobacillus bulgaricus. Táhlovitý kmen byl izolován z jogutové kultury J2, netáhlovitý z kultury MY. vzestupná část, sestupná část, τ smykové napětí; γ& smyková rychlost Ze srovnání je viditelné, jak přítomnost exopolysacharidů dokáže ovlivnit chování jogurtu. Hodnoty smykového napětí tau se pohybují až v dvojnásobných hodnotách, současně je patrná větší míra poklesu napětí a tedy i zdánlivé viskozity v průběhu působení smykové rychlosti 100 s -1. Z uvedených dat vyplývá několik závěrů. Exopolysacharidy jsou schopny výrazně ovlivnit konzistenci fermentovaných mléčných výrobků, čehož se již běžně využívá. V současné době je věnována pozornost charakterizaci jejich interakcí s mléčnými bílkovinami, které jsou důležitým faktorem při tvorbě textury těchto výrobků. V budoucnu jistě najdou mnohé další zajímavé aplikace. Využití samotných exopolysacharidů (jako čistého preparátu) však stále čeká na vyřešení problému, jako je např. jejich nízká výtěžnost. Poděkování: Tato práce byla podpořena grantem MSM Použitá literatura Boels, I. C., van Kranenburg, R., Hugenholtz, J., Kleerebezem, M., de Vos, W. M. (2001): Sugar catabolism and its impact on the biosynthesis and engineering of exopolysaccharide production in lactic acid bacteria. International Dairy Journal, 11,

67 Broadbent, J. R., McMahon, D. J., Oberg, C. J., Welker, D. L. (2001): Use of exopolysaccharide-producing cultures to improve the functionality of low fat cheese. International Dairy Journal, 11, De Vuyst, L., De Vin, F., Vaningelgem, F., Degeest, B. (2001): Recent developments in the biosynthesis and applications of heteropolysaccharides from lactic acid bacteria. International Dairy Journal, 11, De Vuyst, L., Vanderveken, F., Van de Ven, S., Degeest, B. (1998): Production by and isolation of exopolysaccharides from Streptococcus thermophilus grown in a milk medium and evidence for their growth-associated biosynthesis. Journal of Applied Microbiology, 84, Duboc, P., Mollet, B. (2001): Application of exopolysaccharides in the dairy industry. International Dairy Journal, 11, Dubois M., Gilles K.A., Hamilton J.K., Rebers P.A., Smith F. (1956): Colorimetric method for determination od sugars and related substances., Analytical Chemistry 28, Frengova, G. I., Simova, E. D., Beshkova, D. M., Simov, Z. I. (2002): Exopolysaccharides produced by lactic acid bacteria of kefir grains. Zeitschrift fűr Naturforschung, 57, Hassan, A. N., Frank, J. F., Elsoda, M. (2003): Observation of bacterial exopolysaccharide in dairy products using cryo-scanning electron microscopy. International Dairy Journal, 13, Kánský J., Trčková J., Štětina J., Čopíková J., Blafková P., Nitková L. (2004): Izolace a charakterizace exopolysacharidů jogurtové kultury při fermentaci syrovátky a permeátu. Sborník Celostátní přehlídky sýrů 2004, str , Odborná skupina pro potravinářskou a agrikulturní chemii ČSCH, Praha Laws, A. P., Marshall, V. M. (2001): The relevance of exopolysaccharides to the rheological properties in milk fermented with ropy strains of lactic acid bacteria. International Dairy Journal, 11, Macedo, M. G., Lacroix, C., Gardner, N. J., Champagne, C. P. (2002): Effect of medium supplementation on exopolysaccharide production by Lactobacillus rhamnosus RW-9595M in whey permeate. International Dairy Journal, 12, Ruas-Madiedo, P., Hugenholtz, J., Zoon, P. (2002): An overview of the functionality of exopolysaccharides produced by lactic acid bacteria. International Dairy Journal, 12, van Kranenburg, R., Boels, I. C., Kleerebezem, M., de Vos, W. M. (1999): Genetics and engineering of microbial exopolysaccharides for food: approaches for the production of existing and novel polysaccharides. Current Opinion in Biotechnology, 10, Wacher-Rodarte, C., Galvan, M. V., Farres, A., Gallardo, F., Marshall, V. M. E., García-Garibay, M. (1993): Yogurt production from reconstituted skim milk powders using different polymer and non-polymer forming starter cultures. Journal of DairyResearch, 60, Welman, A. D., Maddox, I. S. (2003): Exopolysaccharides from lactic acid bacteria: perspectives and challenges. Trends in Biotechnology, 21, Kontaktní adresa: Ing. Jiří Štětina, CSc. Ústav technologie mléka a tuků, VŠCHT v Praze, Technická 5, , Praha 6 jiri.stetina@vscht.cz 69

68 VPLYV OCHRANNEJ KULTÚRY NA RAST CANDIDA MALTOSA YP1 V JOGURTOVÝCH KRÉMOCH Liptáková Denisa, Valík Ľubomír, Šindelková Lucia Katedra výživy a hodnotenia potravín, STU Bratislava, Slovensko EFFECT OF PROTECTIVE CULTURE ON THE GROWTH DYNAMICS OF CANDIDA MALTOSA YP1 IN YOGHURTS Summary: The addition of the protective cultures caused the partial inhibition of C. maltosa YP1 growth. This was represented with slow growth rate decreasing and lag-phase prolongation. Lagphase duration and growth rates of C. maltosa YP1 were dependent mostly on the incubation temperature. Dependance of the yeast growth rate on temperature in yoghurts with protective culture was described using linear Ratkowsky model: μ = T (R 2 = ). Lagphase duration was shortened with temperature according to the equation: λ = T (R 2 = ). Results obtained from the secondary mathematical modelling were used for calculation of time prediction to reach CFU.ml -1 C. maltosa in yoghurts at different storage temperature. This time was about 8 days longer in yoghurt contained protective culture at 6 C. At 8 C which is the maximal storage temperature allowed, the time for C. maltosa to reach CFU.ml -1 in protected yoghurts was only about 4 days longer in comparison with classic yoghurts. On the base of our results, the shelf-life of yoghurt with or without added protective culture could be considerably limited at 8 C in relation to growth of C. maltosa YP1. This fact confirms the maximal importance of preventive precautions in yoghurt production. Application of protective culture into fermented products is adequate tool enhancing microbiological stability but not substituting good hygiene or manufacturing practice. Kyslomliečne produkty patria medzi spotrebiteľsky obľúbené výrobky a to nielen vďaka príjemným senzorickým vlastnostiam, ale aj zdravotným benefitom, ktorý so sebou prináša ich konzumácia.v súčasnosti sa do popredia dostáva snaha zvýšiť priaznivé dietetické vlastnosti jogurtov prídavkom probiotických kultúr. Avšak spotrebiteľ očakáva od produktu aj vysokú hygienickú kvalitu a bezpečnosť. Kyselina mliečna vznikajúca pri fermentácii jogurtov znižuje ph výrobku až na hodnoty 4,2 až 4,6, čím sa do veľkej miery zamedzuje rastu nežiadúch baktérií. Vďaka veľkej schopnosť kvasiniek rásť za podmienok nevyhovujúcich mnohým bakteriálnym druhom, zohrávajú tieto významnú úlohu v znehodnotení fermentovaných mliek a kyslomliečnych produktov a syrov (Jakobsen and Narvhus, 1996; Viljoen and Greyling, 1995; Gadaga a kol., 2000; Cosentino et al., 2001). Mnohé z nich sú schopné rásť pri chladničkových teplotách, fermentovať alebo asimilovať kyselinu mliečnu. Vďaka týmto vlastnostiam ako aj ich lipolytickej a proteolytickej aktivite sa mnoho kvasiniek a kvasinkových organizmov podieľa na kazení mliečnych produktov (Richter et al., 1992; Betts et al. 1999; Jakobsen and Narvhus, 1996) sprevádzanom zmenami textúry, konzistencie, kvasničnou, ovocnou alebo horkou chuťou a nepríjemným zápachom (Viljoen and Greyling, 1995; Corbo et al., 2001). Jedným z novších postupov, ako zabrániť, resp. spomaliť rozmnožovanie nežiadúcich mikroorganizmov v mliečnych produktoch je aplikácia tzv. ochranných kultúr. Ide o čisté kultúry baktérií mliečneho kysnutia, ktoré sú schopné produkovať široké spektrum metabolitov účinných voči iným mikroorganizmom a meniť podmienky prostredia tak, aby sa pre ich konkurentov stali neprijateľnými. 70

69 Cieľom našej štúdie bolo sledovať dynamiku rastu nami izolovanej, psychrotrófnej, acidoa termo- rezistentnej kvasinky C. maltosa YP1 zámerne inokulovanej do jogurtových zmesí obsahujúcich komerčnú ochrannú kultúru, ktoré boli asepticky odobraté z tzv. prechladzovacieho tanku. Jogurtové krémy boli na začiatku každej série experimentov vyšetrené na obsah kvasiniek a plesní podľa normy STN ISO 7954, titračnú (SH) a aktívnu kyslosť (ph). Zámerne boli inokulované suspenziou buniek C. maltosa YP1 a neskôr uchovávané v termostate pri teplotách 6, 8, 12, 18 a 21 ± 0,5 C. Dynamika rastu kvasinky Candida maltosa YP1 zámerne inokulovanej do jogurtových zmesí Dynamika rastu kultúry C. maltosa YP1 zámerne inokulovanej do vzoriek jogurtových krémov s komerčnou ochrannou kultúrou v závislosti od teploty uchovávania je graficky znázornená na obr. 1. Rastové parametre C. maltosa YP1 sú v závislosti od teploty a druhu substrátu zosumarizované v tab.1. Grafické znázornenia rastových čiar C. maltosa (obr. 1) v oboch rastových substrátoch (jogurtový krém klasik a nízkotučný) a rovnako aj výsledky rastových parametrov zosumarizované v tab. 1 poukazujú na skutočnosť, že rastová rýchlosť kvasinky sa so zvyšujúcou sa teplotou uchovávania zvyšovala a trvanie lag- fázy sa analogicky skracovalo. Tabulka I Priemerné hodnoty rastovej rýchlosti, resp. generačného času (GT) C. maltosa YP1 pri inokulácii vzoriek jogurtových zmesí v závislosti od teploty ich uchovávania Rastová rýchlosť (μ) [h -1 ] Generačný čas (GT) [h] v jogurte Klasik v jogurte Nízkotučný v jogurte Klasik 6 0,0096 0, ,5 18,6 8 0,0197 0, ,3 18,6 12 0,0319 0,0252 9,4 11,9 18 0,054 0,0583 4,3 5,1 21 0,0746 0,0767 4,0 3,9 Teplota inkubácie [ C] v jogurte Nízkotučný 8 log KTJ.ml _NT 6_KL 8_KL 8_NT 12_KL 12_NT 18_KL 18_NT 21_KL 21_NT Čas [h] Obr. 1: Dynamika rastu Candida maltosa YP1 v jogurtových krémoch klasik a nízkotučný s komerčnou ochrannou kultúrou v závislosti od teploty uchovávania 71

70 Ako je vidieť z obr. 1, dynamika rastu C. maltosa YP1 bola vo všetkých vzorkách jogurtových krémov uchovávaných pri jednotlivých teplotách veľmi podobná. Najdlhšia lag-fáza a generačný čas boli zistené prirodzene pri nízkych teplotách uchovávania, 6 až 8 C. So zvyšujúcou sa teplotou nad 12 C došlo k výraznejšiemu skráteniu lag-fázy aj generačného času kvasinky. Pri teplote 21 C bol čas potrebný na prispôsobenie sa C. maltosa novým podmienkam v prostredí v priemere len 7,6 h. Logicky, so zvyšujúcou sa teplotou sa zvyšovala aj rastová rýchlosť. Napríklad pri teplote 12 C bola rastová rýchlosť kvasinky (μ = 0,0286 h -1 ) v priemere 2-násobne vyššia ako pri teplote 6 C (μ = 0,0129 h -1 ). Najvýraznejšia dynamika rastu C. maltosa bola pozorovaná pri teplote 21 C, kedy sa rastová rýchlosť zvýšila takmer 6- násobne (μ = 0,0757 h -1 ) v porovnaní s teplotou 6 C, čomu zodpovedal aj generačný čas trvajúci 4h. Z pokusov jednoznačne vyplynulo, že určujúcim faktorom dynamiky rastu vyšetrovaného kmeňa kvasinky C. maltosa YP1 v jogurtoch obsahujúcich komerčnú ochrannú kultúru bola teplota uchovávania (obr. 2 a 3). Pre analýzu závislosti rastovej rýchlosti C. maltosa YP1 od teploty inkubácie sa využil osvedčený Ratkowského model, ktorý linearizuje závislosť rastovej rýchlosti od teploty a je aplikovateľný v širšom rozmedzí teplôt (obr. 2). Vplyv teploty na rastovú rýchlosť kvasinky v jogurte určený pomocou Ratkowského modelu opisuje rovnica s vysokým korelačným koeficientom: μ 1/2 = 0,0112T+0,0373 (R 2 μ = 0,9569) Zvyšovanie teploty skracovalo lag-fázu C. maltosa YP1 (obr. 3) v jogurtových krémoch s protektívnou kultúrou podľa vzťahu: λ= 984,46T -1,6331 (R λ 2 = 0,7518) druhá odmocnina rastovej rýchlosti 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 y = 0,0112x + 0,0373 R 2 = 0, druhá odmocnina Teplota [ C] rýchlosti Obr.2 Grafické znázornenie závislosti lag-fázy C. maltosa YP1 od teploty uchovávania lag-fáza [h] y = 984,46x -1,6331 R 2 = 0, lag-fáza Teplota [ C] Obr.3 Grafické znázornenie závislosti rastovej rýchlosti C. maltosa YP1 od teploty uchovávania Obidve matematické rovnice založené na výsledkoch našich experimentov bolo možné využiť pre výpočet času, po ktorom by kontaminant C. maltosa YP1, ak by sa v príslušných kyslomliečnych produktoch s ochrannou kultúrou nachádzal, dosiahol počty, napríklad KTJ.ml -1. Následne sme predpovede časov porovnali s časom, ktorý by bol potrebný na dosiahnutie uvedeného limitu v jogurtových krémoch bez protektívnej kultúry. Z týchto predpovedí napríklad vyplynulo, že ak by sa C. maltosa YP1, ako kontaminant nachádzal v počiatočnej koncentrácii N 0 = 1 KTJ.ml -1, potom by dosiahnutie jej koncentrácie KTJ.ml -1 vyžadovalo 25 dní pri teplote 72

71 6 C a 17 d pri teplote 8 C, čo predstavuje predĺženie času na znehodnotenie produktov kvasinkami o 4 až 8 dní v porovnaní s predikciami vypočítanými pre produkty neobsahujúce komerčnú ochrannú kultúru. Ak však berieme do úvahy súčasnú dobu spotreby jogurtov 30 dní, zovšeobecnením by mohlo vyplynúť, že jogurty s takouto počiatočnou kvasinkovou kontamináciou by už v druhej polovici doby spotreby mohli vykazovať kvasničnú príchuť alebo kvasničný zápach. Z výsledkov ďalej vyplynulo, že ochranná kultúra bola účinnejšia skôr pri nižších teplotách Tento fakt poukazuje na dôležitosť dodržiavania zásad správnej výrobnej praxe, podľa ktorých by teplota pri spracovaní a skladovaní jogurtov nemala prekročiť 8 C. Z vypočítaných predikcií tiež vyplynulo, že reálne predísť týmto problémom znehodnotenia jogurtov kvasinkami, je zabrániť ich kontaminácii, zvlášť termorezistentnými a acidotolerantnými kvasinkami, akou je C. maltosa YP1, nakoľko je zrejmé, že ani ochranná kultúra nevyváži nedokonalú hygienu a sanitáciu. Tabulka II Predpovede časov [d], kedy by C. maltosa YP1 dosiahla počet KTJ.ml -1 v jogurtových krémoch s ochrannou kultúrou pri jej počiatočnej koncentrácii N 0 = 1 KTJ.ml -1 pri teplote uchovávania 6, 8, 12, 18 a 21 C Teplota Čas [d] potrebný na dosiahnutie KTJ.ml -1 v jogurte inkubácie s ochrannou kultúrou bez ochrannej kultúry [ C] Záver Cieľom našej štúdie bolo sledovať dynamiku rastu psychrotrófnej, acido- a termorezistentnej kvasinky C. maltosa YP1 zámerne inokulovanej do jogurtových zmesí Klasik a Nízkotučný (Rajo a.s.) obsahujúcich komerčnú ochrannú kultúru a uchovávaných pri teplote 6, 8, 12, 18 a 21 ± 0,5 C. V oboch kyslomliečnych produktoch sme pozorovali rast testovaného kmeňa kvasinky pri teplote 6 ± 0,5 C. Na základe experimentálnych výsledkov je možné konštatovať, že prídavok ochrannej kultúry spôsobil parciálnu inhibíciu rastu C. maltosa YP1, ktorá sa prejavila miernym poklesom rastovej rýchlosti ako aj predĺžením doby zdvojenia v porovnaní s rastovými parametrami kvasinky pozorovanými v jogurtoch bez ochrannej kultúry. Dĺžka lag-fázy a hodnoty rastových rýchlostí C. maltosa YP1 boli však významne ovplyvnené predovšetkým teplotou uchovávania. Na základe matematických predpovedí možno konštatovať, že prídavok ochranných kultúr by mal byť popri účinnej hygiene a sanitácii doplnkovým nástrojom na zabezpečenie hygienicky bezchybných kyslomliečnych produktov. Výsledky získané v prezentovanej štúdii sú príkladom využitia princípov prediktívnej mikrobiológie v mliekarskej praxi s cieľom upozorniť na dynamiku rozmnožovania sa kvasiniek v kyslomliečnych produktoch v prítomnosti antagonistických baktérií mliečneho kysnutia a probiotických baktérií. 73

72 Literatúra: 1. Betts, G.D., Linton, P., Betteridge, R.J.: Food spoilage yeasts: Effects of ph, NaCl and temperature on growth. Food Control, 10, 1999, s Corbo, M.R., Lanciotti, R., Albenzio, M., Sinigaglia, M.: Occurence and characterization of yeasts isolated from milks and dairy products of Apulia region. International Journal of Food Microbiology, 69, 2001, s Consentino, S., Fadda, M.E., Deplano, M., Mulargia, A.F., Palmas, F.: Yeasts associated with Sardinian ewe s dairy products. International Journal of Food Microbiology, 69, 2001, s Gadaga, T.H., Mutukumira, A.N., Narvhus, J.A.: Enumeration and identification of yeasts isolated from Zimbabwean traditional fermented milk. International Dairy Journal, 10, 2000, s Jakobsen, M., Narvhus, J.: Yeasts and their possible beneficial and negative effects on the quality of dairy products. International Dairy Journal, 6, 1996, s Richter, R.L., Ledford, R.A., Murphy, S.C.: Milk and milk products. In.: Vanderzant, C., Splittstoesser, D.F.: Compendium of methods for the microbiological examination of foods. American Public Health Association, Washington, 1992, s Viljoen, B.C., Greyling, T.: Yeasts associated with Cheddar and Gouda making. International Journal of Food Microbiology, 1995, 28, s Kontaktná adresa: Ing. Liptáková Denisa PhD., Doc. Ing. Valík Ľubomír PhD., Fakulta chemickej a potravinárskej technológie, Radlinského 9, Bratislava, Slovenská republika 74

73 FUNKČNÍ POTRAVINY POZNATKY Z IDF WORLD DAIRY SUMMIT 2005 Plocková Milada Ústav technologie mléka a tuků, Vysoká škola chemicko-technologická v Praze FUNCTIONAL FOODS TRENDS PRESENTED IN THE IDF WORLD DAIRY SUMMIT 2005 Summary: The list of eight sessions of IDF World Dairy Summit 2005 is outlined. Special attention is given to the session Dairy Science and Technology and Nutrition & Health, where the actual trends in functional food production were mentioned. The samples of food bioactive components, especially milk originating ones, non-dairy functional ingredients added to dairy products, sample of industrially produced functional dairy product and a special procedure used in its production are presented. Ve dnech se v kanadském Vancouveru konal IDF World Dairy Summit 2005, kterého se zúčastnilo 670 delegátů ze 41 zemí světa. Pořádajícími zeměmi byly USA a Kanada. Odborný program byl rozdělen do 8 sekcí: 1. Mlékařská politika a ekonomie. 2. Věda, technologie, výživa a zdraví-technologie funkčních potravin. 3. Mlékařská věda a technologie. 4. Výživa a zdraví. 5. Marketing. 6. Management farem, problematika hospodářských zvířat. 7. Výživa a marketing. 8. Životní prostředí. V rámci sekcí zaznělo 92 přednášek a bylo prezentováno 66 posterů. Vybrané přednášky v Power-Pointu jsou uvedeny v angličtině nebo francouzštině na adrese: User name: guest Password:Vancouver Problematika funkčních potravin byla detailně diskutována v sekci Věda, technologie, výživa a zdraví-technologie funkčních potravin, zaznívala však i v ostatních sekcích např. Mlékařská věda a technologie a Výživa a zdraví. Vývoj a výroba funkčních potravin je rychle se vyvíjející oblastí, která vyžaduje multidisciplinární přístup k řešení. Potravina může být považována za funkční, jestliže je uspokojivě prokázáno, že kromě odpovídají nutriční hodnoty pozitivně ovlivňuje jednu nebo více cílových funkcí v organismu ve smyslu zlepšení zdravotního stavu nebo kvality života a/nebo redukce vzniku onemocnění (pro uvažovanou část populace). V souvislosti s prodlužující se délkou lidského života vyvstává potřeba řešit specifické potřeby rozrůstající se skupiny starší populace a funkční potraviny jsou vnímány jako velmi pozitivní složka stravy této skupiny obyvatelstva. V následujícím přehledu jsou uvedeny příklady bioaktivních složek potravin a jejich možné vlivy na fyziologické funkce nebo onemocnění: Bioaktivní složka Vliv na funkci/onemocnění - fytochemikálie kardiovaskulární choroby, rakovina, prevence poškození buněk oxidací -bioaktivní lipidy kardiovaskulární choroby, arthritis, rakovina -rostlinné steroly snížení hladiny cholesterolu -bioaktivní peptidy hypertenze, imunitní systém, rakovina, osteoporóza 75

74 -probiotické bakterie -prebiotika -minerální látky -vitaminy zažívací trakt, imunitní systém, alergie, rakovina, redukce hladiny cholesterolu zažívací trakt, diabetes, obesita, zubní kaz osteoporóza, hypertenze osteoporóza, kardiovaskulární choroby Samotné mléko je bohatým zdrojem bioaktivních složek, vznik dalších bioaktivních složek je spojen s činností probiotických bakterií, které nalézají v mléce vhodné podmínky pro svůj růst a biochemickou činnost. V následujícím přehledu jsou uvedeny dosud nejvíce prozkoumané bioaktivních složky mléka a probiotické bakterie a jejich možné vlivy na fungování lidského organismu: Bioaktivní složka Pozitivní vliv na orgán/funkci - bílkoviny syrovátky tělesná hmotnost glykomakropeptid (GMP) CLA - bioaktivní peptidy činnost srdce vápník CLA - vápník stav kostí bioaktivní peptidy laktoferrin - bioaktivní peptidy duševní rozpoložení, zvládání stresu - bílkoviny syrovátky stav imunitního systému imunomodulační peptidy laktoferrin GMP CLA probiotické bakterie - antimikrobiální peptidy stav zažívacího traktu imunoglobuliny deriváty laktosy laktoferrin sfingolipidy probiotické bakterie - bioaktivní peptidy stav chrupu imunoglobuliny laktoperoxidasa GMP probiotické bakterie Různé mlékárenské výrobky jsou rovněž vhodnými nosiči nemléčných funkčních složek, což vede ke vzniku specifických výrobků, někdy určených cíleně pro specifickou skupinu konzumentů. Příklady jsou uvedeny dále: Funkční složka Aplikace do výrobků - Rostlinné steroly mléko, fermentované mléko, jogurt, sýr - Prebiotika/vláknina mléko, fermentované mléko, jogurt (inulin, ß-glukan) ice-cream, sýr - Probiotika mléko, fermentované mléko, jogurt sýr, ice-cream, syrovátkové nápoje 76

75 - Polyfenoly mléko, jogurt, ice-cream, (flavonoidy, isoflavonoidy) syrovátkové nápoje - Mastné kyseliny mléko, máslo, sýr, jogurt, (omega-3, CLA) ice-cream - Minerály a stopové prvky mléko, fermentované mléko (Ca, Se) - Vitaminy mléko, fermentované mléko (D, kyselina listová) Mlékárenský průmysl hrál v posledních 10 letech vedoucí roli ve vývoji funkčních potravin. Mlékárenské výrobky jednoznačně převládají na globálním trhu s funkčními potravinami. Příklady úspěšných funkčních mlékárenských výrobků jsou výrobky s probiotiky, prebiotiky, bioaktivními peptidy a rostlinnými steroly. S výrobou funkčních potravin souvisí nové obchodní příležitosti, nové technologie potřebné pro koncentraci, isolaci a aplikaci funkčních bioaktivních složek mléka, syrovátky nebo kolostra. Velmi úspěšná je průmyslová výroba funkčních potravin v severských státech Evropy, zvláště ve Finsku. Příkladem je průmyslově vyráběný (firma Valio) finský funkční výrobek Evolus, (patent EP ) - ochucený mléčný nápoj snižující hypertenzi obsahující bioaktivními peptidy vzniklé fermentací a vhodný poměr minerálních látek Na: (Ca, K, Mg). Mléko je fermentováno proteolyticky aktivním kmenem Lactobacillus helveticus LBK -16H, který hydrolyzuje ß-kasein za tvorby tripeptidů: Ile-Pro-Pro (IPP) a Val-Pro-Pro (VPP), které mají schopnost inhibovat ACE enzym (angiotensin-1 converting enzyme peptidyldipeptid hydrolasa, EC ), který katalyzuje reakce související s regulací krevního tlaku. Vzhledem k silně kyselé chuti spojené s intensivní produkcí kyseliny mléčné a intensivní proteolýze vedoucí ke vzniku hořkých peptidů působením Lactobacillus helveticus LBK -16H a dále hořkosti spojené se solubilizací Ca při nízkém ph bylo třeba zavést novou technologii k zajištění požadovaných senzorických parametrů finálního výrobku. Využití nanofiltrace při ošetření fermentovaného mléka umožní odstranění kyseliny mléčné, hořkých peptidů a monovalentních iontů, koncentraci bivalentních iontů a zachycení bioaktivních peptidů. Závěrem možno zmínit budoucí trendy spojené s vývojem a výrobou funkčních potravin. Očekává se využití nových potenciálně bioaktivních složek z netradičních zdrojů (rostliny), zavádění nových biotechnologií (genové inženýrství, GMO) pro zvýšení produkce biologicky aktivních komponent v rostlinách a živočiších, vývoj technologií pro isolaci bioaktivních komponent a jejich aplikace do nových potravinářských matricí, vyvíjení nových technologií pro dosažení maximálních biologických aktivit při výrobě, skladování a trávení potravin. Důležité bude rovněž určit pozitivních zdravotních efekty na základě seriózního vědeckého výzkumu, zavést vhodná regulační opatřeními pro schvalování nových výrobků a seriózně informovat širokou veřejnost o prospěšnosti funkčních potravin. Ve vědeckém světě se očekává rozvoj nových disciplin (nutrigenomika) souvisejících s personalizovanou výživou. Aktivní účast na IDF World Dairy Summit 2005 byla umožněna díky grantu MSM Použitá literatura: 1. Prezentace na IDF World Dairy Summit 2005 ( Kontaktní adresa: Milada Plocková, Ústav technologie mléka a tuků, VŠCHT Praha Technická 5, Praha 6-Dejvice. 77

76 RŮST BIFIDOBAKTERIÍ V KRAVSKÉM A MATEŘSKÉM MLÉCE Rada Vojtěch 1, Nevoral Jiří 2, Vlková Eva 1, Trojanová Iva 1, Killer Jiří 1 1 Katedra mikrobiologie, výživy a dietetiky, ČZU Praha; 2 První pediatrická klinika UK Praha GROWTH OF BIFIDOBACTERIA IN COW AND HUMAN MILK Summary: The growth of five strains of bifidobacteria in five different samples of human milk was tested. Two strains of B.bifidum and one strains B. longum were isolated from infant faeces. Two strains of B. animalis were isolated from fermented milk products. All strains were identified using biochemical tests followed by species-specific PCR. The faecal flora of infants of milk donors was also analysed using cultivation methods and FISH. Three infants had high numbers of bifidobacteria (>10 log CFU/g) in their faeces. Remaining two infants did not contain detectable amounts of bifidobacteria in their faecal samples. Luxuriant growth of B. bifidum (both strains) in human milk was accompanied with decreasing of ph (up to 4.4) and production of lactic acid (up to 2 g/l). On the other hand, numbers of viable cells of B. animalis (both strains) and B. longum decreased by the factor 10 to 1000 after incubation in human milk. There were significant differences (P < 0.05) in bifidobacterial counts among B. bifidum, B. animalis and B. longum in all human milk samples tested. Our results suggest that B. bifidum is suitable species for probiotic treatment of fully breastfed infants, which are free of bifidobacteria. On the other hand, B. animalis seems not to be effective probiotic bacterium for infants. Úvod Bifidobakterie jsou přirozeně dominantní složkou mikroflóry trávicího traktu kojených novorozenců, přičemž působí jako ochranný faktor proti střevním patogenům (Chierici et al., 2003). Avšak osídlování střev bifidobakteriemi je u některých kojenců významně opožděné (Mitsuoka, 1992). Důvody mohou být rozličné: kojení vs. umělá výživa, hygiena při porodu, způsob porodu (záporně působí hlavně císařský řez), doba porodu (předčasně porozené děti jsou v tomto směru často deficientní) a konečně prostředí porodnice (Edwards a Parrett, 2002; Fanaro et al., 2003). Stimulačně na růst a množení bifidobakterií působí zejména mateřské mléko, které je z tohoto hlediska vlastně prvním prebiotikem, které člověk za normálních okolností konzumuje (Boehm et al., 2005). Bifidobakterie však mohou chybět i u normálně porozených a plně kojených dětí. Vlková et al. (2005) sledovali soubor 51 normálně porozených a plně kojených dětí, přičemž 29 z nich mělo vysoké počty bifidobakterií ve stolici (obvykle více než 9 log CFU/g), 3 děti měly nízké počty (3-5 log CFU/g) a u 17 z nich (35%) se nepodařilo bifidobakterie detekovat a to ani pomocí kultivačních metod ani pomocí fluorescence in situ hybridizace. Absence bifidobakterií trvala někdy jen několik dnů, nejčastěji však několik týdnů a výjimkou nebyly ani kojenci ve věku 3-5 měsíců, které měly stále v tomto směru negativní nálezy ve stolici. Pokud bifidobakterie ve střevě kojence chybí, dominantními bakteriemi se zpravidla stávají potenciálně nebezpečné klostridie (Vlková et al., 2005). Řešením této situace by mohlo být podání probiotických preparátů s obsahem bifidobakterií, jejichž důležitou vlastností musí být schopnost růstu v mateřském mléce. O nalezení takovýchto kmenů jsme se pokusili právě v této předběžné studii. Cílem této práce bylo izolovat bifidobakterie ze stolice kojenců a jejich identifikace. Dále byly izolovány i kmeny používané při výrobě mléčných kysaných výrobků. Byla testována schopnost růst v kravském a mateřském mléce. Dále byl změřen pokles hodnot ph po kultivaci a konečně byla měřena produkce kyseliny mléčné. 78

77 Materiál a metody: Seznam a původ použitých kultur uvádí tabulka č. 1. Jako kravské mléko byl použit Sunar v koncentraci 10% (W/V). Bylo použito celkem 5 vzorků mateřského mléka pocházejících od 5 různých dárkyň. Vzorky byly ihned po odebrání zmrazeny při -20 o C a zpracovány v průběhu jednoho měsíce. Přehled použitých vzorků uvádí tabulka č. 2, která také uvádí údaje o mikroflóře stolice dětí dárkyň. Izolace, identifikace bifidobakterií a analýzy stolic byly provedeny podle Vlková et al. (2005). Mateřské mléko bylo před testováním pasterováno při 75 o C/2 min, kravské mléko bylo sterilováno při 110 o C/1 h. Mléka byla rozplněná po 100 µl do sterilních mikrotitračních destiček s 96ti jamkami (Gama Group, Trhové Sviny, ČR). Kultury bifidobakterií (2 ml) narostlé ve Wilkins-Chalger bujónu (Oxoid, UK) byly odstředěny při rpm/5min, propláchnuty fosfátovým pufrem (ph = 6,5) a resuspendovány ve stejném objemu fosfátového pufru. Z takto připravené suspenze bylo očkováno 10 µl do jamek mikrotitrační destičky. Počáteční koncentrace živých buněk bifidobakterií byla cca 6 log CFU/ml. Každý kmen byl očkován ve čtyřech opakováních. Po kultivaci v anaerostatech (Anaerobic Plus System, Oxoid, UK) při 37 o C/24 h, bylo kultivačně stanoveno množství bifidobakterií podle Vlková et al. (2005) a bylo změřeno ph a koncentrace kyseliny mléčné pomocí přístroje Reflektoquant (Merck, Germany). Výsledky a diskuse Jak vyplývá z tabulky č. 2, děti tří dárkyň měly velmi vysoké počty bifidobakterií ve stolici, zatímco zbývající dvě tyto bakterie neměly a v jejich fekální flóře dominovaly klostridie. Údaje o růstu bifidobakterií v mateřském a kravské mléce jsou shrnuty v tabulce č. 3. V kravské mléce rostly do určité míry všechny kultury. Nejslaběji B. longum, nejlépe oba kmeny B. animalis a B. bifidum kmen B. Zcela jiná situace byla v mateřském mléce, kde rostly pouze oba kmeny B. bifidum. Naopak B. longum a oba kmeny B. animalis byly evidentně mateřským mlékem inhibovány. U těchto kmenů byly počty živých buněk po kultivaci ve všech případech nižší než počáteční koncentrace (cca 6 log CFU/ml). Růst bifidobakterií byl doprovázen i poklesem ph (až na hodnotu 4,4) a produkcí kyseliny mléčné (tabulka č. 4 a obrázek č. 1). Kyselinu mléčnou v mateřském mléce produkovaly pouze kmeny B. bifidum, přičemž evidentně aktivnější byl kmen B. Druhy B. longum a hlavně B. animalis jsou často přidávány jako probiotické mikroorganismy do mléčných kysaných výrobků a dalších potravin. Tyto druhy se začínají objevovat i v mléčných náhražkách pro kojence a na trhu jsou i probiotika ve formě lyofilizovaných prášků s jejich obsahem (Salminen et al., 2005). Jak vyplývá z našich výsledků, není velká pravděpodobnost, že by B. animalis bylo účinné probiotikum přinejmenším pro kojence, kteří přijímají mateřské mléko. Počet kmenů B. animalis, který se používá v potravinářském průmyslu je totiž velmi omezený a kromě kmenů použitých v této studii, se s velkou pravděpodobností žádné další nepoužívají. Oba kmeny byly mateřským mlékem výrazně inhibovány. U druhu B. longum je situace jiná, v potravinářském průmyslu se používají kmeny jiné, než které byly testovány zde, a proto je třeba účinek mateřského mléka na tento druh ještě ověřit. Není jasné, co bylo konkrétní příčinou inhibice některých bifidobakterií v našem pokusu. Mateřské mléko totiž obsahuje řadu antibakteriálních látek jako je laktoperoxidázový komplex, laktoferin, leukocyty, imunoglobuliny a snad i některé oligosacharidy (Coppa et al., 2004). Růst B. bifidum v mateřském mléce se naopak zdá být jednoznačný, protože oba kmeny rostly ve všech pěti vzorcích. I zde je však třeba výsledky potvrdit na dalších izolátech, neboť mohou být rozdíly mezi jednotlivými kmeny. I v naší studii byly určité (malé) rozdíly mezi oběma kmeny, přičemž aktivnější byl kmen B. bifidum B. U tohoto kmene bylo také zajímavé, že velmi dobře rostl i v kravském mléce a jeho použití jako probiotika by se tak mohlo rozšířit i na kojence krmené náhradní výživou. 79

78 Tabulka I: Původ použitých kmenů Kmen zdroj B. bifidum A stolice kojenců B. bifidum B stolice kojenců B. longum stolice kojenců B. animalis A mléčný kysaný výrobek B. animalis B mléčný kysaný výrobek Tabulka II: Přítomnost bifidobakterií a klostridií (v log CFU/g) ve stolici dětí dárkyň mateřského mléka bifidobakterie klostridie počty počty přítomnost přítomnost kultivačně FISH FISH vzorek A + 10,41 10,33 - ND vzorek B + 10,34 10,65 - ND vzorek C - 0 ND + 8,78 vzorek D - 0 ND + 8,78 vzorek E + 10,43 10,50 - ND Tabulka III: Růst bifidobakterií v mateřském a kravském mléce mateřské mléko kravské Kmen vzorek A vzorek B vzorek C vzorek D vzorek E mléko B.bifidumA 6,90±0,32 b 7,33±0,11 d 8,12±0,05 c 8,32±0,14 c 7,56±0,15 c 7,30±0,04 b B.bifidumB 6,25±0,05 b 7,28±0,13 d 7,77±0,05 c 8,58±0,07 c 8,16±0,08 d 8,54±0,02 d B.longum 3,00±0,00 a 6,08±0,65 c 4,08±0,95 a 3,94±0,15 ab 3,46±0,15 a 6,98±0,07 a B.animalisA 3,98±0,97 a 3,20±0,20 a 3,00±0,00 a 3,39±0,39 a 3,00±0,00 a 8,56±0,09 d B.animalisB 5,79±0,10 b 4,74±0,14 b 5,41±0,10 b 4,54±0,33 b 5,42±0,40 b 8,13±0,03 c Všechny hodnoty jsou průměry (v log CFU/g) ze tří měření ± SD Počáteční koncentrace bifidobakterií byla cca 6 log CFU/g Hodnoty ve sloupcích s různými indexy se statisticky významně liší (P < 0,05) Tabulka IV: Hodnoty ph mléka po kultivaci mateřské mléko kravské ph vzorek A vzorek B vzorek C vzorek D vzorek E mléko B.bifidumA 5,5 5,7 4,9 4,5 5,0 5,5 B.bifidumB 5,4 5,6 4,5 4,5 4,4 4,9 B.longum 6,2 6,2 6,2 6,1 6,0 5,2 B.animalisA 6,2 6,2 6,2 6,0 5,9 5,2 B.animalisB 6,3 6,3 6,3 6,0 6,1 5,3 Kontrola 6,3 6,2 6,3 6,3 6,5 6,1 80

79 Obrázek I: Koncentrace laktátu laktát (mg/l) vzorek D vzorek E B.bifidumA B.bifidumB B.longum B.animalisA B.animalisB kontrola Závěr Naše výsledky prokázaly výrazný rozdíl v účincích mateřského mléka na různé druhy bifidobakterií. Mateřské mléko výrazně stimuluje růst B. bifidum, zatímco B. animalis je inhibován. Jako probiotikum pro kojence je proto vhodný druh B. bifidum, nikoliv B. animalis. (Práce byla sponzorována granty IGA NR/ a MSM ) Použitá literatura: Boehm, G., Stahl, B., Jelinek, J., Knol., J., Miniello, V., Moro, GE., Prebiotic carbohydrates in human milk and formulas. Acta Paediatric. Suppl. 94, Coppa, G.V., Bruni, S., Morelli, L., Soldi, S., Gabrielli, O., The first prebiotics in humans. J. Clin. Gastroenterol. 38, S80-S83. Chierici, R., Fanaro, S., Saccomandi, D., Vigi, V., Advances in the modulation of the microbial ecology of the gut in early infancy. Acta. Paediatr. Suppl. 91, Edwards, C.A., Parrett, A.M., Intestinal flora during the first months of life: new perspectives. Brit. J. Nutr. 88, S11-S18. Fanaro, S., Chierici, R., Guerrini P., Vigi, V., Intestinal microflora in early infancy: composition and development. Acta. Paediatr. Suppl. 441, Mitsuoka, T., The human gastrointestinal tract. In: Wood, B.J.B. (Ed.), The Lactic Acid Bacteria in Health and Disease. Elsevier Applied Science, London, pp Salminen, S.J.,Gueimonde, M., Isolauri, E., Probiotics that modify disease risk. J. Nutr. 135, Vlkova, E., Nevoral., J., Jencikova., B., Kopecny J., Godefrooij, J., Trojanova I., Rada, V., Detection of infant faecal bifidobacteria by enzymatic methods. 60,

80 CHARAKTERISTIKA VYBRANÝCH LAKTOBACILOV Z POHĽADU PROBIOTICKÝCH BAKTÉRIÍ Greifová Mária 1, Kontová Marcela 2, Šovčíková Andrea 1, Greif Gabriel 1, Peterková Zuzana 1 1 Fakulta chemickej a potravinárskej technológie STU v Bratislave, 2 Výskumný ústav mliekarenský, Žilina, Slovenská republika CHARACTERISATION OF SELECTED LACTOBACILLI FROM THE POINT OF VIEW OF PROBIOTIC BACTERIA. Summary: This contribution describes basic in vitro tests to evaluate probiotic properties of Lactobacillus plantarum ALC 01 and Lactobacillus rhamnosus LC 705. Lactobacilli are able to grow in acid environment (in sterile saline solution, in PBS and MRS broth ) at ph = 4 to 3. They are not able to keep their initial cell concentration at ph 2 and their number falls down by five orders of magnitude within the first hour of incubation. In the presence of 0,3 % bile salt in MRS broth (ph not adjusted), lactobacilli keep their entry concentration also after 4 hours. Increase of bile salt concentration in MRS broth results in decrease of concentration of viable cells by five orders of magnitude in case of L. rhamnosus LC705 and to zero in case of L.plantarum ALC01. The concentration of pancreatic fluid 1 g/l and ph = 8 does not influence significantly the growth of tested lactobacilli and their growth curve remains constant within 4 hours. Both strains of lactobacilli are resistant to vancomycin, gentamicin, netilmicin and nalidixinsaure and the most sensitive to piperacillin, ampicillin and cefazolin. The tested microorganisms are able to adhere to Caco-2 cells after 2 hours of incubation. Percentages of fixed cells fall between 0,2 5,2 % of entry number of cells. They are able to protect Caco-2 cells against entering Listeria monocytogenes. Úvod Probiotiká sú živé mikrobiálne potravinové prídavky, ktoré sú prospešné pre zdravie konzumentov [1]. V súčasnosti sa probiotiká definujú ako látky alebo produkty obsahujúce v dostatočnom počte životaschopné mikroorganizmy, ktoré po implantácii alebo kolonizácii zmenia mikroflóru v určitom anatomickom mieste hostiteľa, čo im umožní prejaviť svoje zdravotne prospešné účinky [2, 3]. Probiotické pôsobenie takýchto mikroorganizmov nie je obmedzené len na gastrointestinálny trakt, ale môže sa uplatniť, napr. aj v urogenitálnom alebo dýchacom trakte [2]. Najnovšie výskumy však ukazujú, že nielen živé mikroorganizmy, ale aj ich neživé formy a určité zložky bunkových stien mikroorganizmov pravdepodobne môžu ovplyvňovať hostiteľa [4, 5]. Nie každý mikroorganizmus môže mať funkciu probiotika. Teoretický základ pre výber probiotických mikroorganizmov zahŕňa bezpečnosť (nie sú patogénne), funkčnosť (prežitie, osídľovanie, antimikrobiálnu produkciu, imunitnú stimuláciu, antigénotoxickú aktivitu a prevenciu pred patogénmi) a technologické aspekty (rast v potravine, senzorické vlastnosti, stabilita, životaschopnosť - realizovateľnosť v procese výroby) [6, 7]. Je potrebné poznať správanie sa a účinok probiotík v GIT, nielen pozitívne vlastnosti, ale aj vedľajšie efekty na organizmus [8]. Práca nadväzuje na predchádzajúce experimenty [9,10], zamerané na technologické využitie uvedených kultúr pri výrobe syrov eidamského typu ako aj sledovanie ich antimikrobiálnej aktivity voči nežiadúcim mikroorganizmom. Cieľom práce bolo vykonať základné in vitro testy na posúdenie probiotických vlastností vybraných mikroorganizmov, konkrétne: schopnosť laktobacilov prežiť v kyslom žalúdočnom prostredí; odolnosť vybraných laktobacilov voči žlčovým soliam; schopnosť laktobacilov prežiť v alkalickom prostredí v prítomnosti pankreatického enzýmu; schopnosť vybraných laktobacilov utilizovať rôzne sacharidy; odolnosť vybraných laktobacilov voči rôznym antibiotikám (penicillin, ampicillin, piperacillin, cefazolin, cefuroxim, cefotaxim, ceftriaxon, vancomycin, gentamicin, netilmicin, tetracyclin, erythromycin, clindamycin, nalidixinsaure); schopnosť laktobacilov adherovať na epitelové Caco-2 bunky ako aj zabránenie vstupu L. monocytogenes do Caco-2 buniek. 82

81 Materiál a metódy Testované mikroorganizmy Lactobacillus rhamnosus LC 705 ( Danisco-Cultor Niebüll, Nemecko), Lactobacillus plantarum ALC01 (Danisco-Cultor Niebüll, Nemecko), Indikátorové mikroorganizmy Listeria monocytogenes NCTC 4886 (National Collection of Type Cultures, UK). Test odolnosti resp. vnímavosti kmeňov na žlčové soli Kultúra mikroorganizmov sa testovala v prostredí žlčových solí (Fluka, Bratislava, Slovenská republika) podľa nami upraveného postupu autorov Cebecci & Gürakan [7]. Scentrifugovaná kultúra mikroorganizmov (9000 otáčok, 5 min.) sa doplnila fyziologickým roztokom na objem 5 ml a rozdávkovala do MRS bujónu obsahujúceho testovanú koncentráciu žlčových solí (0,3 %; 0,5 % a 1 %) (vstupná koncentrácia mikroorganizmov bola cca 10 8 KTJ.cm -3 ) a inkubovala v termostate 4 h pri 37 C. Každú hodinu sa z testovaného prostredia (vždy nová skúmavka) zisťoval počet viabilných buniek. Test acidorezistencie laktobacilov na zmenu ph kultivačného média Čerstvá kultúra mikroorganizmov sa po scentrifugovaní doplnila na objem 5 cm 3 fyziologickým roztokom (vstupná koncentrácia mikroorganizmov bola cca 10 8 KTJ.cm -3 ) a rozdelila do 5 sterilných skúmaviek s testovaným médiom (MRS, PBS - Phosphate Buffered Saline, fyziologický roztok) pri ph = 2; 3; 4. ph bolo upravené HCl. Inkubácia prebiehala 4 hodiny pri teplote 37 C. Každú hodinu sa zisťoval počet viabilných buniek. Postup testu acidorezistencie bol obdobou postupu podľa literatúry [7, 11,12]. Test utilizácie sacharidov mikroorganizmami Test skvasovania sacharidov sledovanými mikroorganizmami sa vykonal pomocou API 50 CH (BIOMÉRIEUX, Marcy - l Etoile, Francúzsko ) podľa autorov Rada & Petr [13]. Test citlivosti na vybrané antibiotiká Oživené 16 hodinové kultúry mikroorganizmov sa testovali podľa nami upraveného postupu autorov Cebecci & Gürakan [7] na citlivosť resp. vnímavosť na vybrané antibiotiká (MAST DISKY, Mast Group Ltd., Merseyside, UK): netilmycín (30 μg) NET30, gentamycín (10 μg) GM10, vankomycín (30 μg) VA30, ceftriaxon (30 μg) CRO30, cefotaxím (30 μg) CTX30, cefuroxím (30 μg) CXM 30, cefazolín (30 μg) CZ30, piperacilín (100 μg) PRL100, ampicilín (10 μg) AP10, penicilín G (10 U) PG10, kyselina nalidixová (30 μg) NA30, klindamycín (2 μg) CD2, erytromycín (15 μg) E15, tetracyklín (30 μg) T30. Metóda je modifikáciou agarovej difúznej metódy [7]. Bunkové kultúry Karcinómová línia Caco-2 sa izolovala z primárneho adenokarcinómu hrubého čreva 72-ročného muža. Z morfologického hľadiska ide o adherentné epitelové bunky s časom zdvojenia asi 80 hodín. Bunky sa kultivovali v Eaglovom minimálnom esenciálnom médiu (E-MEM), ktoré sa obohatilo o bovinné fetálne sérum (10 % objemu), penicilín (0,1 mg/ml) a streptomycín (0,1 mg/ml). Bunkovú líniu poskytol RNDr. Ján Sedlák, CSc. z Ústavu experimentálnej onkológie SAV. Adhézia testovaných mikroorganizmov na Caco-2 bunky Bunky Caco-2 s počiatočnou koncentráciou /ml média boli založené do Petriho misiek (PM) (priemer 6 cm). Zároveň bol pripravený rovnaký počet PM s rovnakou koncentráciou buniek obsahujúcich ešte sterilné krycie skielko (pre možnosť zafarbenia a mikroskopického pozorovania preparátu). Pred vlastným pokusom boli Caco-2 bunky v PM 2-krát premyté s roztokom PBS. 5 ml inokula testovaného mikroorganizmu o koncentrácií cca 10 8 KTJ/ml bolo pridané do každej PM 83

82 s bunkami (ich vstupná koncentrácia bola určená vyočkovaním na MRS agar). Misky boli inkubované po dobu 2 hodín pri 37 C v termostate vo zvlhčenej atmosfére s 5% CO 2. Po inkubácii boli všetky PM s bunkami 3-krát premyté s PBS roztokom. Následne boli bunky lyzované 30 min. s 0,1% roztokom Tritonu-X100 pri 37 C a vyočkované na PM s MRS agarom, pre zistenie počtu baktérií, ktoré boli naviazané na Caco-2 bunky (KTJ/ml). PM obsahujúce skielka boli premyté s roztokom PBS a skielka fixované 10 min. za použitia 100% metanolu a farbené 40 min. činidlom Giemsa-Romanowski. Po zafarbení boli skielka opláchnuté destilovanou vodou a adherované bunky pozorované svetelným mikroskopom pri 100-násobnom zväčšení za použitia olejovej imerzie [14]. Vplyv testovaných mikroorganizmov na vstup Listeria monocytogenes do Caco-2 buniek Postup bol rovnaký ako v predchádzajúcom prípade. V tomto prípade bolo sledované ako testované mikroorganizmy ovplyvnia vstup L. monocytogenes do CaCo 2 buniek. PM s Caco-2 bunkami boli po prepláchnutí s roztokom PBS infikované L. monocytogenes (10 8 KTJ/ml) samotným a zároveň spolu so zvolenými mikroorganizmami. Misky boli inkubované 2 hodiny v termostate vo zvlhčenej atmosfére s 5% CO 2. Pre určenie koncentrácie buniek L. monocytogenes bola vždy vstupná vzorka vyočkovaná na Oxford agar. Po inkubácii boli bunky 3-krát premyté s roztokom PBS. Následne bol pridaný roztok aminoglykozidového antibiotika gentamycínu v médiu (10 μg/ml), aby boli zabité extracelulárne baktérie. Misky boli inkubované ďalšie 2 hod. v termostate vo zvlhčenej atmosfére s 5% CO 2. Po inkubácií boli znovu premyté ako v predchádzajúcom prípade a bunky boli lyzované 30 min. s 0,1% roztokom Tritonu-X100 pri 37 C. Následne boli vyočkované na PM s Oxford agarom, pre zistenie počtu L. monocytogenes, ktoré vstúpili do Caco-2 buniek, keď boli kultivované samotné a spolu s testovanými mikroorganizmami [15]. Výsledky a diskusia Probiotické mliečne produkty zaznamenali v posledných rokoch značný rozmach. Tento trend i naďalej pokračuje spolu s tým, ako sa hromadia ďalšie dôkazy o zdravotných účinkoch probiotík, ako lepšie chápeme mechanizmy ich účinku a ako sa kladie stále väčší dôraz na zdravie a kvalitu života obyvateľov. Dôležité pre probiotické kmene je ich prežívanie v kyslom žalúdočnom prostredí. Hodnota ph žalúdočných štiav je približne 1,0 2,0 a stúpa na hodnotu 5,0 alebo viac po konzumácií jedla. Výsledky (obr.1) poukazujú na dobrú životaschopnosť obidvoch druhov pri ph = 4 a 3 vo všetkých troch testovaných médiách po dobu 4 hodín. Znížením ph na hodnotu 2 došlo k redukcii množstva životaschopných baktérií už po prvej hodine o tri až päť poriadkov, potom sa počet viabilnych buniek ustálil. Tento pokles sa vyskytol vo všetkých médiách u obidvoch druhov log (KTJ/ml) ph=2 ph=3 ph=4 bez úpravy ph v MRS bujóne log (KTJ/ml) ph=2 ph=3 ph=4 bez úpravy ph v MRS bujóne čas (h) čas (h) Obr. 1 Závislosť koncentrácie Lactobacillus plantarum ALC 01 a Lactobacillus rhamnosus LC 705 od času vo fyziologickom roztoku pri rôznom ph 84

83 Všeobecne sa prežívanie mikroorganizmov po 3h pri ph3 považuje za dostatočné, pretože probiotické kultúry sú často chránené potravinou, a nie sú priamo vystavené takému nízkemu ph [16]. Minelli, E. B. a kol. [17] tiež dokázali citlivosť laktobacilov na hodnotu ph = 2. Ďalším kritériom pre výber probiotík je odolnosť voči žlčovým soliam. Koncentrácia žlčových solí 0,3 % nemala výrazný vplyv na rast laktobacilov (obr.2). Obidva druhy pri tejto koncentrácií si zachovali vstupné koncentrácie a následné 4 hodiny boli takmer konštantné, s miernym poklesom. V prípade koncentrácie 0,5 % a 1 % žlčových solí pokles nastal u oboch laktobacilov už v nultej hodine pri príprave riedení vzorky. Vzorka MRS bujónu s koncentráciou žlčových solí 0,5 % si zachovala konštantné množstvo po celú dobu pokusu. Naproti tomu vzorka s koncentráciou žlčových solí 1 % poklesla v nultej hodine a ďalší pokles nastal znovu v 3 hodine log (KTJ/ml) ŽS=1 % ŽS=0,5 % ŽS=0,3 % bez prídavku ŽS čas (h) log (KTJ/ml) čas (h) ŽS=1 % ŽS=0,5 % ŽS=0,3 % bez prídavku ŽS Obr.2 Závislosť koncentrácie Lactobacillus plantarum ALC 01 a Lactobacillus rhamnosus LC 705 od času v MRS bujóne s prídavkom žlčových solí bez úpravy ph Odolnosť laktobacilov voči prechodu tenkým črevom sa sledovala v roztoku s prídavkom pankreatického enzýmu o koncentrácií 1 g/l a s úpravou ph na hodnotu 8. Rovnako ako Minelli, E. B. a kol. [17] aj my sme pozorovali počas celého 4 hodinového pokusu, že zvolené laktobacily si udržali vstupnú koncentráciu buniek. Dôležitou vlastnosťou baktérií je ich schopnosť utilizovať jednotlivé sacharidy. Pre zistenie schopnosti laktobacilov utilizovať rôzne sacharidy sa využili testy API 50 CH. Obidva druhy laktobacilov boli schopné utilizovať rovnaké druhy sacharidov. Jednoznačná farebná zmena nastala u 24 cukrov (D-ribóza, D-galaktóza, D-glukóza, D-fruktóza, D-manóza, L-sorbóza, L-ramnóza, D-manitol, D-sorbitol, Metyl-αD-glukopyranozid, N-acetylgluozamín, Amygdalín, Arbutín, Askulín železnatý citrát, Salicín, D-celobióza, D-maltóza, D-laktóza (kravský pôvod), D-sacharóza, D-trehalóza, D-melezitóza, Gentiobióza, D-turanóza, D-tagatóza) z celkového počtu 49 po 48 hodinách. Významnou vlastnosťou laktobacilov je ich odolnosť a naopak citlivosť na rôzne antibiotiká. Celkovo zo 14 použitých antibiotík obidva testované laktobacily boli odolné na 4 z nich, a to vancomycin, gentamicin, netilmicin a nalidixovú kyselinu. V ich prípade nevznikla žiadna inhibičná zóna. Naopak najväčšia inhibičná zóna a teda najväčšia citlivosť u oboch laktobacilov nastala u 3 antibiotík v tomto poradí: piperacillin, ampicillin a cefazolin. Z viacerých štúdií vyplýva, že odolnosť na antibiotiká je u každého mikroorganizmu, aj v rámci kmeňov mikroorganizmov, jedinečná [7]. Sledovala sa tiež adhézia testovaných mikroorganizmov na povrch Caco-2 buniek. Adhézia probiotických kmeňov na črevný povrch a následná kolonizácia ľudského gastrointestinálneho traktu je považovaná za jednu z najvýznamnejších podmienok pre posúdenie probiotického účinku toho ktorého mikroorganizmu. Adherentné kmene probiotických baktérií 85

84 dlhšie zotrvávajú v črevnom trakte a preto majú lepšie možnosti na preukázanie metabolických a imunomodulačných účinkov než neadherujúce kmene. Preto len o adherentných probiotikách sa myslelo, že efektívne vzbudzujú imunitné účinky a stabilizujú sliznično-črevnú bariéru. Adhézia môže tiež poskytovať spôsob súťažného vylúčenia patogénu z črevného epitelu [18]. Schopnosť laktobacilov a bifidobaktera adherovať na Caco-2 bunky sa zistila vyočkovaním po 2 hodinovej kultivácií s Caco-2 bunkami pri 37 C v termostate vo zvlhčenej atmosfére s 5 % CO 2. Vstupná koncentrácia baktérií bola okolo 10 8 KTJ.ml -1, po 2-hodinovej inkubácií s Caco-2 bunkami bola od 0, do 11, KTJ.ml -1. Množstvo naviazaných buniek testovaných mikroorganizmov po dvoch hodinách inkubácie sa pohybovalo okolo od 0,2 5,2 % oproti vstupnej koncentrácií. To znamená, že testované mikroorganizmy sú schopné adherovať na Caco-2 bunky pri zvolených podmienkach. In vitro adhézne experimenty poukazujú na rozdiely v adhéznom potenciály rôznych probiotických kmeňov [19] a tiež adherujúce kmene na CaCo-2 bunky nemusia nutne adherovať na sliznicu rovnako účinne. Tabuľka I Porovnanie vstupnej koncentrácie buniek a koncentrácie adherovaných buniek po dvojhodinovej inkubácií na Caco-2 bunky (KTJ/ml) Vstupná koncentrácia ( KTJ/ml) 1,6 2,1 1,0 2,8 3,9 L.plantarum ALC 01 L.rhamnosus LC 705 L.rhamnosus VTl L.plantarum 7039 B.longum 4990 Koncentrácia mikroorganizmov adherovaných na Caco-2 bunky po 2 hodinách ( KTJ/ml) 6,0 0,5 5,2 7,6 11,1 Množstvo adherovaných buniek v % 3,8 0,2 5,2 2,7 2,8 V ďalšom nás zaujímalo aký vplyv bude mať spoločná kultivácia laktobacilov a L. monocytogenes na vstup listérie do Caco-2 buniek. Ak L. monocytogenes rástla spolu s laktobacilmi bol pozorovaný jej menší vstup do bunky ako keď rástla v médiu s Caco-2 bunkami samotná. Pozitívnou vlastnosťou testovaných laktobacilov je ich schopnosť redukovať vstup nežiaducich mikroorganizmov do Caco-2 buniek. Bibiloni, R. a kol. [14] vo svojej práci dokázali zníženie vstupu Salmonella arizonae do Caco-2 buniek pri súčasnej inkubácií s B. bifidum. Záver Obidva testované laktobacily sú schopné rastu v kyslom prostredí pri hodnote ph = 4 a 3 vo fyziologickom roztoku, vo fosfátovom pufre a MRS bujóne. Pri ph hodnote 2 ich množstvo kleslo o päť poriadkov už v prvej hodine. V prítomnosti žlčových solí o koncentrácií 0,3 % v MRS bujóne si laktobacily udržiavajú vstupnú koncentráciu buniek aj po 4 hodinách kultivácie. So zvyšujúcou sa koncentráciou žlčových soli v MRS bujóne, klesala koncentrácia viabilných buniek; o 5 poriadkov pre L. rhamnosus LC705, resp. na nulu u L. plantarum ALC01 pri koncentrácií žlčových solí 1%. Koncentrácia pankreatického enzýmu 1 g/l a ph = 8 nemá výrazný vplyv na rast testovaných laktobacilov. Rastová krivka zostáva po dobu 4 hodín konštantná. Testované laktobacily sú schopné utilizovať 24 sacharidov z celkového počtu 49 rôznych cukrov. 86

85 Obidva laktobacily sú odolné voči 4 testovaným antibiotikám: vancomycin, gentamicin, netilmicin a nalidixinová kyselina. Najväčšia citlivosť u oboch laktobacilov je na piperacillin, ampicillin a cefazolin. Lactobacillus plantarum ALC01, Lactobacillus rhamnosus LC 705, Lactobacillus rhamnosus VTl, Lactobacillus plantarum 7039 a Bifidobacterium bifidum majú schopnosť adherovať sa na Caco-2 bunky po dvojhodinovej inkubácií, percentá naviazaných buniek sa pohybujú medzi 0,2 5,2 % oproti vstupnej koncentrácií buniek. Lactobacillus plantarum ALC01, Lactobacillus rhamnosus LC 705, Lactobacillus rhamnosus VTl, Lactobacillus plantarum 7039 a Bifidobacterium bifidum sú schopné zredukovať vstup Listeria monocytogenes do Caco-2 buniek. Použitá literatúra: 1. Fooks, L. J., Fuller, R., Gibson, G. R.: Prebiotics, probiotics and human gut microbiology. International Dairy Journal, 9, 1999, s Ferenčík, M., Ebringer, L.: Možnosti využitia probiotík v prevencii a terapii alergických chorôb. Alergie, 10, 2002, s Schrezenmeir, J., De Vresse, M.: Probiotics, prebiotics, and synbiotics approaching and definition. American Journal of Clinical Nutrition, 2001, 73, s Salminen, S., Ouwehand, A. C., Isolauri, E.: Clinical applications of probiotic bacteria. International Dairy Journal, 8, 1998, s Ziemer, Ch. J., Gibson, G. R.: An overview of probiotics, prebiotics and synbiotics in the functional food concept: perspectives and future strategies. International Dairy Journal, 8, 1998, s Vinderola, C. G., Reinheimer, J. A.: Lactic acid starter and probiotic bacteria: a comparative in vitro study of probiotic characteristics and biological barrier resistance, Food Research International, 36, 2003, s Cebecci, A., Gürakan, C.: Properties of potential probiotic Lactobacillus plantarum strains, Food Microbiology, 20, 2003, s Mattila-Sandholm, T., Mättö, J., Saarela, M.: Lactic acid bacteria with health claims - interactions and interference with gastrointestinal flora. International Dairy Journal, 9, 1999, s Kontová, M., Greifová, M., Greif, G.: Funkcia kyslomliečnych kultúr produkujúcoch bakteriocíny pri ochrane syrov počas ich zrenia. In: Výsledky přehlídek a sborník přednášek seminář Mléko a sýry Praha, január, 2004, s Kontová, M., Greifová, M., Hudáček, J., Drončovský Maroš.: Vplyv doplnkových kultúr laktobacilov na dynamiku prekysávania a zrenia polotvrdých syrov. In: Výsledky přehlídek a sborník přednášek seminář Mléko a sýry Praha, január, 2005, s Prasad, J., Gill, H., Smart, J. A Gopal, P. K.: Selection and characterization of Lactobacillus and Bifidobacterium strains for use as probiotics, International Dairy Journal, 8, 1998, s Rőnkä, E., Malinen, E., Saarela, M., Rinta-Koski, M., Aarnikunnas, J. A Palva, A.: Probiotic and milk technological properties of Lactobacillus brevis, International Journal of Food Micrbiology, 83, 2003, s Rada, V., Petr, J.: A new selective medium for the isolation of glucose non-fermenting bifidobacteria from hen caeca. Journal of Microbiological Methods, 43, 2000, s Bibiloni, R., Pérez, P. F., De Antoni, G. L.: Factors involved in adhesion of bifidobacterial strains to epithelial cells in culture, Anaerobe, 5, 1999, s Bibiloni, R., Pérez, P. F., De Antoni, G. L.: Will a high adhering capacity in a probiotic strain guarantee exclusion of pathogens from intestinal epithelia, Anaerobe, 5, 1999, s Matijašič, B.G.,Rogelj,I.: Lactobacillus K7-a new candidate for a probiotic strains. Food Technology and Biotechnology, 38, 2000, s Minelli, E. B., Benini, A., Marzotto, M., Sbarbati, A., Ruzzenente, O., Ferrario, R., Dellaglio,F.: Assesment of novel probiotic Lactobacillus casei strains for the production of functional dairy foods. International Dairy Journal, 14, 2004, s Saarela, M., Mogensen G., Fondén, R., Mättö, J., Mattila-Sandholm, T.: Probiotic bacteria: safety, functional and technological properties. Journal of Biotechnology, 84, 2000, s Toumola,E.M., Salminen,S.J.: Adhesion of some probiotic and dairy Lactobacillus strains to Caco-2 cell cultures. International Journal of Food Microbiology, 41, 1998, s Kontaktná adresa: Ing.Mária Greifová, PhD., maria.greifova@stuba.sk FCHPT-STU Bratislava, Ústav biotechnológie a potravinárstva, Oddelenie potravinárskej technológie, Radlinského 9, Bratislava, SR. Práca bola podporená VEGA 1/0102/03, VEGA 1/2392/05. 87

86 MIKROBIOLOGICKÁ CHARAKTERISTIKA A OBSAH PREBIOTIK VE VYBRANÝCH ZAHRANIČNÍCH A TUZEMSKÝCH PROBIOTICKÝCH A SYNBIOTICKÝCH PREPARÁTECH Killer Jiří, Trojanová Iva, Vlková Eva, Rada Vojtěch Katedra mikrobiologie, výživy a dietetiky, Česká zemědělská univerzita v Praze MICROBIOLOGICAL ANALYSIS AND CONTENTS OF PREBIOTICS IN SOME FOREIGN AND CZECH PROBIOTIC AND SYNBIOTIC PREPARATIONS. Summary: The purpose of our study was to investigate both qualitatively and quantitatively the microbial and prebiotic contents of probiotic and synbiotic freeze-dried products. Microbiological analysis was performed on twelve different samples (ten foreign and two czech) of probiotic and synbiotic products that claimed to contain lactobacilli and/or bifidobacteria. The species were identified according to phenoyipic characters, using API 50CH, API 50CHL and RAPID ID32A kits. Some bacterial strains belonging to the Bifidobacterium genus were identified using genotypic methods (amplification of specific DNA fragments by PCR and analysis of their nucleotide sequences). The number of microorganisms contained in the preparations was determined using the plate-count method. The contents of prebiotics were measured by method Fructan assay procedure for the measurement of oligofructan and fructan polysaccharide separate from sucrose and reducing sugars. Microbiological and genetic analysis showed that, in terms of quality, none of the twelve preparations contained the bacterial strains claimed on the label. Quantitative analysis demonstrated that 5 of 12 preparations contained the bacterial counts at the cell densities claimed on the label. The largest contents of fructans (prebiotic contents) had the synbiotic product Auxor. Our study demonstrates unsatisfactory qualitative microbiological specification in the tested products. However, there was relatively good quantitative agreement with the labeling. Our findings indicate that regulations govering the labeling of probiotic products are urgently reguired. Úvod V současné době jsou v popředí zájmu výživových doporučení tzv. funkční potraviny (vlastní termín byl zaveden v Japonsku v polovině 80. let minulého století), což je podle definice: jakákoli potravina mající kromě výživové hodnoty příznivý účinek na zdraví konzumenta, jeho fyzický i duševní stav. Jde o potravinu (nikoli tablety, kapsle, prášek apod.) vyrobenou z přirozeně se vyskytujících složek, která by se měla konzumovat jako součást denní stravy. Její konzumace mimo jiné posiluje přirozené obranné mechanismy proti škodlivým vlivům prostředí či působí preventivně proti nemocem (Goldberg, 1994). Podle této definice lze mezi funkční potraviny zahrnout tzv. prebiotika, dále pak probiotika a synbiotika v podobě nejrůznějších fermentovaných mléčných výrobků. Jinou formou prebiotik, probiotik a synbiotik jsou v lékárnách dostupné komerční lyofilizované (v podobě nejrůznějších tablet, kapslí apod.) a sušené práškové preparáty, které jsou ovšem běžně řazeny mezi tzv. doplňky stravy. Termín probiotikum představuje preparát aplikovaný ve výživě lidí (ale také živočichů) obsahující přesně definované živé mikroorganismy, který je používán k cílevědomému pozitivnímu ovlivnění gastrointestinální mikroflóry s cílem zlepšit zdravotní stav včetně posílení obranných mechanismů, a prostřednictvím něhož je také zlepšováno využívání živin (Dimer a Gibson, 1998; Zubillaga et al., 2001). Prebiotika jsou definována jako nestravitelné či nízkostravitelné potravinové složky (nejčastěji jsou využívány FOSfruktooligosacharidy, dále potom GOS-galaktooligosacharidy), které pozitivně ovlivňují zdraví hostitele selektivní stimulací růstu a/nebo aktivity jednoho nebo více probiotických mikroorganismů v tlustém střevě (Zimmer a Gibson, 1998; Manning a Gibson, 2004). Pod označením synbiotikum se rozumí současný přídavek probiotik a prebiotik do jednoho 88

87 produktu. Tato kombinace zprostředkovává lepší přežívání probiotických kultur při průchodu horní částí trávicího traktu nebo podporuje přežívání, růst a metabolickou aktivitu těchto zdraví prospěšných bakterií (kombinací lze tedy zajistit aditivní či synergický účinek) v gastrointestinálním traktu (Kaur a kol., 2002). Samotný název vznikl z pozorovaného jevu synergismu, což znamená, že zdravotní přínos kombinace obou účinných složek je větší než součet přínosů každé z nich aplikované samostatně. Nejrůznější formy probiotik a synbiotik obsahují nejčastěji zástupce bakteriálního rodu Bifidobacterium (grampozitivní, sacharolytické, pleomorfní, striktně anaerobní nesporulující tyčinky přirozeně se vyskytující v trávicím traktu lidí a zvířat; Scardovi, 1986) a Lactobacillus (obecně se jedná o velmi heterogenní skupinu fakultativně anaerobních druhů s velkou variabilitou fenotypických, biochemických a fyziologických vlastností), přičemž ojediněle se lze také setkat s některými zástupci rodu Streptococcus a Enterococcus. V rámci rodu Bifidobacterium jsou zmiňovány druhy B. bifidum, B. breve, B. longum, B. infantis, B. adolescentis, B. animalis subsp. lactis (Klaenhammer a Kullen, 1999; Kaur a kol., 2002). V případě laktobacilů se lze nejčastěji setkat s druhy Lactobacillus acidophilus, L. rhamnosus a L. casei. Zatímco laktobacily jsou klasickými představiteli bakterií mléčného kvašení (grampozitivní bakterie s podobnými metabolickými a fyziologickými charakteristikami produkující kyselinu mléčnou jako hlavní konečný produkt fermentace sacharidů), bifidobakterie jako samostatný rod lze charakterizovat jako heterofermentativní mléčné bakterie mající v porovnání s ostatními odlišný mechanismus zkvašování glukózy. Prostřednictvím specifického enzymu pro tento rod, fruktózo-6-fosfoketolázy (důležitý identifikační znak), fermentují glukózu v konečném důsledku až na kyselinu mléčnou a octovou v teoretickém molárním poměru 2:3 (Scardovi a Trovatelli, 1965). V odborné literatuře se setkáváme s četnými příklady (ovšem často spornými) pozitivního vlivu probiotik na lidské zdraví. Jde především o antimikrobiální aktivitu, resp. potlačování patogenů v trávicím traktu (Lee a kol., 2003; Dock a kol., 2004), antikancerogenní aktivitu (Kaur a kol., 2002; Lo a kol., 2002), imunomodulační efekt (Gill, 2003) či produkci vitamínů, především skupiny B (Crittenden a kol., 2003). V souvislosti s pozitivními účinky prebiotik, kromě již citovaných (stimulace růstu a/nebo aktivity probiotických bakterií), je zmiňován efekt zvýšené absorpce kationtů Ca 2+ a Mg 2+ v tlustém střevě (Coudray a kol., 1997), efekt snižování celkového a LDL (light density lipoproteins) sérového cholesterolu (Davidson a kol., 1998). Proto, aby mohly být určité mikroorganismy využívané jako probiotika, musí splňovat daná kritéria spojená s bezpečností, funkčními a technologickými vlastnostmi (FAO/WHO, 2001). Z bezpečnostního hlediska musí být probiotické mikroorganismy nepatogenní, nesmí být jakýmkoli způsobem spojovány s bakteriemi způsobujícími průjmová onemocnění a přenosem genů zodpovědných za rezistenci na antibiotika, stejně tak musí mít schopnost udržení genetické stability. Kromě funkčních vlastností (např. rezistence vůči kyselému prostředí trávicího traktu, vůči žlučovým kyselinám, trávicím enzymům, schopnost adheze na střevní stěně atd.), je nutné uvést velmi důležité technologické vlastnosti bakterií, které hrají zásadní roli při výrobě probiotik (Saarela et al., 2000). Patří sem dobrá fermentační aktivita, dobré přežívání v průběhu procesu lyofilizace a sprejového sušení, dostatečná životaschopnost v daných produktech, fágová rezistence a vysoká stabilita v průběhu dlouhodobého skladování. Cíl Cílem naší studie bylo kvalitativní (srovnání deklarovaných a identifikovaných druhů) a kvantitativní (srovnání deklarovaného a skutečného počtu probiotických bakterií, even. deklarovaného a skutečného obsahu prebiotik, resp. oligofruktanů a fruktanového polysacharidu) zhodnocení vybraných zahraničních a tuzemských probiotických či synbiotických preparátů. 89

88 Materiál a metody Pro výše zmíněné zhodnocení byly vybrány 2 holandské probiotické a 10 synbiotických preparátů (2 holandské, 2 české a 1 německý, britský, italský, španělský, japonský a slovenský). Seznam spolu s vlastními názvy preparátů a označeními zemí původu uvádějí tabulky č. 1 a 2. Počty bifidobakterií (KTJ/g) byly u příslušných preparátů stanoveny kultivační metodou prostřednictvím modifikovaného TPY agaru (SCHARLAU CHEMIE S.A., Španělsko) s přídavkem mupirocinu (100mg/L; Rada a Petr, 2000) po 48 hodinách kultivace za anaerobních podmínek, počty laktobacilů prostřednictvím ROGOSA agaru (OXOID, Anglie) po hodinách kultivace za mikroaerofilních podmínek. Počty enterokoků byly stanoveny na SLANETZ&BARTLEY agaru (OXOID, Anglie) po 48 hodinách kultivace za aerobních podmínek. Podobně byly určeny počty laktokoků a streptokoků, ovšem při použití M17 agaru (OXOID, Anglie). Bylo izolováno několik kmenů bifidobakterií a laktobacilů z TPY, resp. ROGOSA agaru, které byly v případě bifidobakterií dále identifikovány na rodovou úroveň prostřednictvím fruktózo- 6-fosfoketolázového testu (důkaz specifického enzymu bifidobakterií; Orban a Patterson, 2000), resp. prostřednictvím morfologie a Grammova barvení (v případě laktobacilů). Následně byly identifikovány na druhovou úroveň pomocí biochemických testů API 50CH a RAPID ID32 (BioMèrieux -Francie) v případě izolátů bifidobakterií a API 50CHL (BioMèrieux -Francie) v případě izolátů laktobacilů, přičemž pro rozlišení animálních druhů bifidobakterií od lidských byl testován růst čistých kultur při 46 o C (za těchto podmínek rostou pouze animální druhy, Gavini a kol., 1991). Vyhodnocení testů pro identifikaci bifidobakterií bylo provedeno prostřednictvím počítačového programu Bacter (Lille, Francie), zatímco test pro identifikaci laktobacilů byl vyhodnocen prostřednictvím programu apiweb (BioMèrieux, Francie). Výsledky izolátů bifidobakterií některých preparátů (viz. Tabulka č. 2 s vysvětlivkami) byly potvrzeny rodovou a druhově specifickou PCR (polymerázová řetězová reakce; Vlková, 2004). Hypotéza obsahu animálních kmenů byla potvrzena použitím primerů pro B. animalis a B. lactis. Obsah prebiotik, resp. fruktanů byl zjišťován podle příslušné metodiky (Fructan assay procedure for the measurement of oligofructan and fructan polysaccharide separate from sucrose and reducing sugars, MEGAZYME-Irsko). Výsledky a diskuse Deklarované a skutečné počty probiotických bakterií uvádí tabulka č. 1. U 8 ze 12 studovaných preparátů jsme se na etiketách setkali s deklarovanými počty životaschopných buněk v expirační době, ovšem ve všech případech nebyly specifikovány počty u jednotlivých deklarovaných rodů. V případě obou probiotických preparátů řady ECOLOGIC holandské provenience byl zjištěn deklarovaný počet životaschopných buněk, což platí také pro zbylé synbiotické preparáty této řady. Deklarovaný počet životaschopných buněk splnily také zbylé 2 zahraniční preparáty (AUXOR/It. a SYMBIOLACT/Něm.) a jeden český (BIOPRON). U 10 z 12 studovaných produktů byl deklarován obsah zástupců rodu Bifidobacterium (byly ovšem zjištěny u 11 preparátů), přičemž u 8 (7 zahraničních a 1 tuzemského) z těchto produktů jsme se setkali s jejich relativně vysokými počty (od 8,26 do 9,2 log KTJ/g). U 6 z 8 preparátů, kde byly deklarovány zástupci rodu Lactobacillus, jsme potvrdili taktéž relativně vysoké počty (od 8,06 do 9,69 log KTJ/g). U zbylých dvou preparátů jsme přítomnost laktobacilů nepotvrdili. Hamilton a kol. (1996) zjistili u 11 ze 13 studovaných anglických preparátů méně než 1/10 deklarovaného množství životaschopných buněk probiotických bakterií. V porovnání 30 sušených probiotických doplňků stravy s 25 kysanými mléčnými výrobky zjistili Temmerman a kol. (2003) podstatně nižší počty probiotických bakterií u sušených preparátů. Ve studii prováděné v Polsku (Szajewska et al., 2004) zjistili u 57 vzorků z 64 (ovšem šlo pouze o více vzorků 5 probiotických preparátů) deklarovaný počet probiotických preparátů. Deklarované a identifikované druhy probiotických bakterií u jednotlivých probiotických a synbiotických preparátů uvádí tabulka č

89 Tabulka 1 Porovnání deklarovaného a skutečného počtu probiotických bakterií u jednotlivých preparátů PRODUKT/země DEKLAROVANÉ RODY DEKLAROVAVÝ POČET (log KTJ/g) SKUTEČNÝ POČET (log KTj/g) ECOLOGIC 328/Hol. ECOLOGIC 700/Hol. ECOLOGIC 600/Hol. Bifidobacterium 8,78 Lactobacillus > 9 všech 8,21 Lactoc. / Enteroc. 9,17 / 8,5 Bifidobacterium 8,26 Lactobacillus > 9 všech 8,33 Lactoc. / Enteroc. 9,17 / 8,71 Bifidobacterium 8,97 Lactobacillus > 9 všech 8,06 Lactoc. / Enteroc. 8,34 ECOLOGIC 500/Hol. Bifidobacterium > 9 všech 8,78 LEPICOL/VB Lactobacillus NEDEKLAROVANÉ 0 AUXOR/It. Bifidobacterium 8,44 9,4 všech Lactobacillus 8,18 SYMBIOLACT B/Něm. Bifidobacterium 9 9,18 BABYLACTUM/Šp. Bifidobacterium NEDEKLAROVANÉ 6,89 PROBIOKID/Jap. Bifidobacterium 9,03 NEDEKLAROVANÉ Lactobacillus 9,58 UNIMILK/Slov. NEDEKLAROVANÉ NEDEKLAROVANÉ 1,78 / Bifidob. 2 / Enteroc. Bifidobacterium 9,2 BIOPRON/ČR PROBIOFLORA/ČR -probiotické preparáty Lactobacillus 9 9,69 Lactoc. / Enteroc. NEZJIŠŤOVANÉ Bifidobacterium 3 Lactobacillus 9,05 všech 0 Streptococcus 6,72 V 9-ti (2 probiotických a 7 synbiotických) z 12-ti studovaných preparátech byl deklarován druh B. bifidum, ovšem ani v jediném případě nebyl námi identifikován. V těchto produktech byl pomocí biochemických testů nejčastěji identifikován druh B. animalis. Ten byl dále pomocí druhově specifických primerů (metoda PCR) identifikován jako B. animalis subsp. lactis. Podobného výsledku bylo dosaženo u druhu B. infantis, který byl deklarován u 2 zahraničních synbiotických preparátů, ovšem identifikován nebyl. Na druhou stranu u preparátů (2 zahraniční a oba tuzemské preparáty), kde byl deklarován druh B. longum, byl ve většině případů také identifikován pomocí biochemických testů. Jestliže byly identifikovány zástupci druhů rodu Lactobacillus, nejfrekventovaněji se vyskytovaly L. plantarum a L. pentosus, u nichž ovšem nebyl splněn požadavek minimálního identifikačního skóre. Tyto druhy nebyly ve většině případů výrobci deklarovány (nejčastěji byly deklarovány druhy L. acidophilus, L. casei a L. salivarius). 91

90 Tabulka 2 Porovnání deklarovaných a identifikovaných druhů probiotických bakterií NÁZEV PRODUKTU/země ECOLOGIC 328/ Hol. DEKLAROVANÉ DRUHY IDENTIFIKOVANÉ B. animalis B. pseudolongum(n), animalis ssp.lactis (PC) L. acidophilus, casei, salivarius L. plantarum (N), paracasei (N) Entc. faecium; Lc. lactis Lc. lactis (N), brevis (N) ECOLOGIC 700/ Hol. ECOLOGIC 600/ Hol. B. bifidum B. dentium, pseudolongum ( o.n), animalis ssp.lactis(pc) L. acidophilus,casei,salivarius,plantarum L. pentosus(n) Entc. faecium; Lc. lactis Lc. lactis(n), brevis(n) B. bifidum, lactis, longum B. animalis, adolescentis(n),animalis ssp. lactis (PC) L. acidophilus, paracasei, plantarum, rhamnosus, salivarius Entc. faecium L. plantarum, pentosus (o.n) NEIDENTIFIKOVANÉ ECOLOGIC 500/ Hol. B. infantis, lactis, longum B. pseudolongum (N), animalis ssp. lactis (PC) LEPICOL/ Vel.Brit. L. acidophilus, bifidus B. animalis, animalis ssp. lactis (PC) AUXOR/ Itálie B. breve, bifidum B. animalis L. acidophilus L. paracasei subsp. paracasei SYMBIOLACT B/ Něm. B. bifidum B. animalis; animalis ssp. lactis (PC) BABYLACTUM/ Špaň. B. bifidum, infantis B. longum PROBIOKID/ Jap. B. bifidum, infantis B.longum, pseudocatenulatum (o.n) L. acidophilus L. delbruecki subsp. lactis UNIMILK/ Slov. NEDEKLAROVANÉ BIOPRON/ ČR PROBIOFLORA/ ČR B. bifidum, breve, longum L.acidophilus,casei,plantarum,rhamnosus Strc. thermophilus;lc. lactis B. longum, breve (N), adolescentis (N) B. bifidum, longum, lactis B. longum L. acidophilus, bulgaricus, casei NEIDENTIFIKOVANÉ Strc. thermophilus NEIDENTIFIKOVANÉ probiotické preparáty N nesplnily požadované identifikační kritérium, které bylo stanoveno zhotovitelem programu Bacter PC v těchto případech byla provedena u izolátů také rodově a druhově specifická PCR, přičemž byly použity druhově specifické primery jak pro B. animalis, tak pro B. lactis 92

91 Hamilton-Miller a kol. (1996) studovali u 13 britských preparátů kvalitativní i kvantitativní mikrobiologické charakteristiky. Pouze u 2 preparátů bylo zjištěno na etiketách deklarovaná množství životaschopných buněk a deklarovaných druhů. Zbylé preparáty neobsahovaly deklarované druhy (např. L. acidophilus, stejně jako v našem případě) či obsahovaly nedeklarované druhy. U mnohých z těchto preparátů chyběla etiketa s názvy obsažených druhů. V jiné podobné studii byly z 55 probiotických produktů (30 sušených doplňků stravy a 25 kysaných mléčných výrobků) identifikovány pouze u 6 z nich veškeré deklarované druhy. U 18 z těchto produktů byly zjištěny nedeklarované druhy a pouze ve 3 z 13 preparátů, u nichž byl deklarován obsah bifidobakterií, byly tyto probiotické bakterie nalezeny (Temmerman a kol., 2003). Szajewska a kol. (2004) identifikovali prostřednictvím týchž biochemických testů u 2 polských probiotických produktů místo deklarovaného B. bifidum, B. animalis a B. ruminantium podobně jako v naší studii. V jednom produktu, kde byl deklarován B. bifidum, také identifikovali pomocí druhově specifické PCR dnes již samostatně řazený B. animalis subs. lactis. Laktobacily identifikovali v rozporu s našimi výsledky ve studovaných 5 preparátech bez problémů. Obsah fruktanů, resp. prebiotik u synbiotických preparátů udává tabulka č. 3. Nejvyšší obsah fruktanů ve vybraných synbiotických preparátech byl námi zaznamenán u italského AUXORu (30,7%), slovenského UNIMILKu (24,2%) a holandského produktu ECOLOGIC 500 (23,3%). U ostatních měřených preparátů jsme zaznamenali obsah fruktanů od 1,2% (BIOPRON, ČR) do 14,2% (LEPICOL, VB). Stejně jako v případě preparátu UNIMILK, nelze zahrnout do definice synbiotik také britský LEPICOL, u něhož rovněž nebyly nalezeny dostatečné počty bakterií. Tabulka 3 Obsah fruktanů ve vybraných synbiotických preparátech PRODUKT/ZEMĚ Auxor/ It. Unimilk/Slov. Ecologic 500/ Hol. Lepicol/ VB Ecologic 600/ Hol. Probiokid/ Jap. Probioflor-a/ ČR Biopron/ ČR fruktany (mg/g) 307,1 242,4 232,8 141,9 84,7 68,3 41,3 11,8 Naše výsledky kvalitativního hodnocení vybraných probiotických a synbiotických lyofilizovaných preparátů korespondují s výsledky prací, které byly v Evropě na toto téma doposud prováděny (Hamilton-Miller a kol., 1996; Temmerman a kol., 2003; Szajewska a kol., 2004). Ovšem na rozdíl od prvních dvou prací jsme ve většině případů (u 9 z 12 preparátů) zaznamenali uspokojivé výsledky kvantitativního hodnocení. V preparátech se tedy vyskytují nedeklarované druhy, resp. kmeny bakterií (ve většině případů animální), které pravděpodobně lépe snáší stresující podmínky technologie výroby (mechanický stres v bioreaktorech, rychlé vyčerpání živin při růstu a akumulace škodlivých metabolitů, mechanický stres při separaci buněk, extrémní teplotní podmínky v průběhu sprejového sušení a lyofilizace; Desmond a kol., 2001; Mattila- Sandholm a kol., 2002). Závěr U všech studovaných preparátů jsme zjistili v různé míře nesrovnalosti pochybení ve smyslu obsahu deklarovaných druhů, kdy ve většině případů byly místo druhů běžně se vyskytujících v trávicím traktu lidí (např. B. bifidum, B. infantis, L. acidophilus) identifikován animální druh B. animalis (biochemické testy) a potvrzen pomocí druhově specifické PCR jako B. animalis subsp. lactis. Výjimkou byl druh B. longum, který byl hojně deklarován i identifikován. U 8 z 12 preparátů byla deklarována určitá množství životaschopných buněk, přičemž námi zjištěné hodnoty tomu ve většině případů odpovídaly. Pouze u jediného synbiotického preparátu jsme zjistili nulový obsah 93

92 živých buněk (LEPICOL/VB), ovšem u jiných dvou preparátů (UNIMILK/Slov.; PROBIOFLORA/ČR) jsme zaznamenali velmi nízké počty. Kvalitativní srovnání s preparáty ze Západní Evropy (především holandské) snese jeden ze dvou námi studovaných tuzemských preparátů, a to BIOPRON. Z obsahu prebiotik, resp. fruktanů v synbiotických preparátech nelze vyvozovat zásadní závěry. Nikde není např. uvedena jejich minimální denní potřeba z hlediska splnění funkčních vlastností pro konzumenty. Ovšem u obou tuzemských synbiotických preparátů byl zjištěn nižší podíl fruktanů v porovnání se zahraničními. Do budoucna je z hlediska splnění vlastní definice probiotik (obsah přesně definovaných živých mikroorganismů mající pozitivní vliv na lidské zdraví) třeba zaměřit se, a to nejen u lyofilizovaných probiotických a synbiotických preparátů, na výzkum skutečných pozitivních účinků daných druhů na zdraví. Je také třeba se zaměřit na výzkum v souvislosti s hledáním kmenů probiotických bakterií izolovaných právě z lidského trávicího traktu, které budou odolávat podmínkám technologie výroby nejen v případě lyofilizovaných preparátů. Rovněž je třeba vyvinout standardní mezinárodně respektované postupy pro kontrolu kvantitativního a kvalitativního složení probiotických, probiotických a synbiotických preparátů. (Práce byla sponzorována grantem GAČR523/03/H076 a MSM ) Použitá literatura: 1. Coudray C., Bellanger J., Catiglia-Delavaud C.: Effect of soluble and partly soluble dietary fibres supplementation on absorption and balance of calcium, magnesium, iron, and zinc in healthy young men. Eur. J. Clin. Nutr. 51, 1997, s Crittenden R.G., Martinez N.R., Playne M.J.: Synthesis and utilization of folate by yoghurt starter cultures and probiotic bacteria. Int. J. Food Microbiol. 80, 2003, s Davidson M.H., Maki K.C., Synecki C.: Evaluation of the influence of dietary inulin on serum lipids in adults with hypercholesterolemia. Nutrition, 18, 1998, s Dimer C., Gibson G.R.: An overview of probiotics, prebiotics and synbiotics in the functional food concept: perspectives and future strategies. Int. Dairy J. 8, 1998, s Dock D.B., Latorraca M.Q., Aguilar-Nascimento J.E., Gomes da Silva M.H.G.: Probiotics enhance recovery from malnutrition and lessen colonic mucosal atrophy after short-term fasting in rats. Basic Nutr. Investigat. 20, 2004, s FAO/WHO: Health and nutritional properties of probiotics in food including powder milk with live lactic acid bacteria. Cordoba, Argentina, ftp://ftp.fao.org/es/esn/food/probio_report_en.pdf 7. Gavini F., Pourcher A.M., Neut C., Monget D., Romound C., Oger C., Izard D.: Phenotypic differentiation of bifidobacteria of human and animal origins. Int. J. Syst. Bacteriol. 41, 1991, s Gill H.S.: Probiotics to enhance anti-infective defences in the gastrointestinal tract. Best Pract. Res. Clin. Gastroenterol. 17, 2003, s Grajek W., Olejnik A., Sip A.: Probiotics, prebiotics and antioxidants as functional foods. Acta Biochimica Polonica 52, 2005, s Hamilton-Miller J.M., Shah S., Smith C.T.: Probiotic remedies are not what they seem. B.M.J. 312, 1996, s Kalač F.: Funkční potraviny, kroky ke zdraví, České Budějovice: DONA, 2003, s. 8-10, Kaur I.P., Chopra K., Saini A.: Probiotics: potencial pharmaceutical applications. Eur. J. Pharm. Sci. 15, 2002, s Klaenhammer T.R., Kullen M.J.: Selection and design of probiotics. Int. J. Food Microbiol. 50, 1999, s Lee Y.J., Yu W-K., Heo T-R.: Identification and screening for antimicrobial activity against Clostridium difficile of Bifidobacterium and Lactobacillus species isolated from healthy infant faeces. Int. J. Antimicrob. Agents. 21, 2003, s

93 15. Lo P.-R., Yu R.-Ch., Chou Ch-Ch., Tsai Y-H.: Antimutagenic activity of several probiotic bifidobacteria against benzopyrene. J. Biosci. Bioeng. 94, 2002, s Manning T.S., Gibson G.R.: Prebiotics. Best Pract. Res. Clin. Gastroenterol. 18, 2004, s Orban J.I., Patterson J.A.: Modification of the phosphoketolase assay for rapid identification of bifidobacteria. J. Microbiol. Meth. 40, 2000, s Rada V., Petr J.: A new selective medium for the isolation of glucose non-fermenting bifidobacteria from hen caeca. J. Microbiol. Methods 43, 2000, s Roberfroid M.B.: Prebiotics and probiotics: are they functional foods?. American Journal of Clinical Nutrition 71, 2000, s Saarela M., Mogensen G., Fonden R., Mattila-Sandholm T.: Probiotic bacteria: safety, functional and technological properties. J. Biotechnol. 84, s Scardovi V.: Genus Bifidobacterium. In: Bergey s Manual of Systematic Bacteriology. Wiliams and Wilkins, Baltimore, 1986, s Szajewska H., Fordymacka A., Bardowski J., Gorecki R.K., Mrukowicz J.Z., Banaszkiewicz: Microbiological and genetic analysis of probiotic products licensed for medicinal purposes. Med. Sci. Monit. 10, 2004, s Temmerman R., Huys G., Pot B., Swings J.: Identification and antibiotic resistance of isolates from probiotic products. Int. J. Food Microbiol. 81, 2003, s Vlková E.: Identifikace bifidobakterií-disertační práce. Česká zemědělská univerzita v Praze-Katedra mikrobiologie, výživy a dietetiky, Praha 2004, s Weese J.S.: Evaluation of deficiencies in labeling of commercial probiotics. Can. Vet. J. 44, 2003, s Zubillaga M., Weil R., Postaire E., Goldman C., Caro R., Boccio J.: Effect of probiotics and functional foods and their use in different diseases. Nutr. Res. 21, 2001, s Kontaktní adresa: Jiří Killer, killer@af.czu.cz Česká zemědělská univerzita v Praze Katedra mikrobiologie, výživy a dietetiky Kamýcká 129, Praha 6 Suchdol 95

94 APLIKACE STANOVENÍ SACHARIDŮ V MLÉKÁRENSKÝCH VÝROBCÍCH Přibyla Lubomír 1, Černý Vladimír 2 1 Ústav analytické chemie AVČR Brno, 2 Výzkumný ústav mlékárenský, MILCOM a.s., Oddělení sýrařských technologií, Tábor SACCHARIDE DETERMINATION IN MILK PRODUCTS Summary: There are two main importance fermentation processes in production swiss-type cheese. The first one fermentation lactose by starter proceeds during production of cheese curd, the second one catabolism of lactate by Propionobacterium ssp. - during cellar ripening. The quality of cheese would worst when there are residual saccharide for ripening of cheese. The important indicator there is quantity of lactose, galactose, glucose during key stage of production. There are important knowledges of amount saccharides named above for right cheese know-how production. Method of determination fructose, galactose, glucose, lactose, sacharose by indirect capillary electrophoresis at technical easy gatget CE MILK 1 is presented. There was determine callibration graph for lactose and fructose. Metodology prepare of samples is either presented. Results the lactose volume in milk samples at range to 5.54% are presented. Influence of starter and decrease volume content of lactose during 24 hour fermentation is presented. Apparatus CE MILK 1 is also suitable for measurement Na +, K +, Ca 2+ and Cl -, NO 3 -, SO Je známo mnoho analytických metod pro stanovení různých sacharidů, avšak jen některé se hodí pro naši běžnou praxi. Pokud se rozhodneme pro kapilární elektroforézu, může to přinést některé výhody a zjednodušení, jak uvidíte dále. Aby bylo možno použít kapilární elektroforézu, musíme zajistit dvě hlavní podmínky : a) aby sacharidy v roztocích pro elektroforézu nesly náboj a bylo je možno separovat; toho můžeme dosáhnout například disociací v silně alkalickém elektrolytu, b) aby odezva detektoru na daný sacharid byla dostatečná. Když zvolíme metodu nepřímé detekce, můžeme využít jednoduchou absorpční detekční celu s vysílací LED diodou a přijímací fotodiodou na vhodné vlnové délce (např. 605nm) Optimalizovaná volba nosného elektrolytu s amidočerní o složení 0,28 g NaOH + 1,136 g Na 2 HPO 4 + 0,12 g amidočerni ve 100 ml dest. vody poskytuje výhodu detekce laktózy v mléce bez dalších rušivých píků. Postup přípravy vzorků mléka pro stanovení obsahu laktózy : Jako vnitřní marker rozpustíme ve vzorku mléka definované množství fruktózy (např. 10 g/l). Volba fruktózy vyplynula z předchozích experimentů, které potvrdily, že v mléce není fruktóza přítomna a dále, že ve zvoleném prostředí roztoků pro analýzy ji lze v kapiláře separovat od laktózy. Vzorek mléka vysrážíme Carrezovým činidlem (Carrez I: ZnSO 4, Carrez II: K 4 [Fe(CN) 6 ), odstraníme bílkoviny, centrifugou odstředíme a odebereme definované množství, to protřepeme v chloroformu, abychom odstranili zbytky tuků. Pak odebereme vodnou část. Takto máme připraven vzorek k dávkování do analyzátoru, případně jej zamrazíme pro uskladnění. Před vlastním dávkováním do analyzátoru jej smícháme s nosným elektrolytem v poměru 1 : 1. Aplikace metody kapilární elektroforézy Metoda kapilární elektroforézy s nepřímou detekcí byla aplikována na technicky jednoduchém přístroji CE MILK 1. Kapilára použitá v přístroji je křemenná, nepokrytá, s vnitřním průměrem 75 μm, celková délka 23 cm, délka po detektor 20 cm (dodavatel CACO Bratislava). Kapilára je termostatována na 15 C. Stabilita teploty je zajištěna měděným blokem, Peltiérovým článkem a 96

95 vnějším chladičem. Zvláštností je použití kapiláry bez vytvoření optického okénka pro optický detektor (neodstraňuje se vnější pokrytí kapiláry vrstvou polyimidu, který ji chrání před zlomením). Kapilára je v přístroji umístěna horizontálně, konce zasahují do nádobek se zásobním pracovním elektrolytem. Použití běžných injekčních stříkaček pro tyto nádobky umožňuje jednak uzavření roztoku a minimalizaci interakcí se vzdušným oxidem uhličitým, jednak snadnou obsluhu a manipulaci se vzorky při dávkování. Současně s koncem kapiláry zasahuje do špičky injekční stříkačky i platinový drát, který tvoří vysokonapěťovou elektrodu elektroforézy v kapiláře. Přístroj používá zabudovaný vysokonapěťový zdroj s předvolitelným pracovním napětím do 8 kv a maximálním proudem do 100 μa. Snadné přepínání polarity umožňuje použitý vysokonapěťový konektor. Bezpečnost obsluhy je zajištěna jednak omezením výkonu (celý přístroj je napájen z devítivoltového síťového adaptéru, o výkonu 9VA), jednak plovoucím zapojením vysokého napětí a nesnadným přístupem k elektrodám. Detektor využívá optické vlákno pro zavedení světelného paprsku zdroje realizovaného výkonnou LED diodou do místa detekce na kapiláře. Optické uspořádání detekční cely je dvoupaprskové se zpětnovazebním snižováním šumu snímáním referenčního paprsku. Detekční cela tvaru kostky o velikosti 2,5 x 2,5 x 0,6 cm je sestavena na keramické podložce a uzavřena v elektromagnetickém stínicím pouzdru. Kapilára prochází nejkratší osou. Kostka je mechanicky spojena s chladicím blokem kapiláry čímž je také temperována. Signály jsou zpracovány šestnáctibitovou aritmetikou procesoru a komunikace s počítačem probíhá přes standartní sériový port (sběrnice RS232, např. port COM1 PC). Vnitřní uspořádání bloku detektoru a temperace kapiláry je schematicky znázorněno na následujícím obrázku č.1. Celkový vzhled přístroje je zřejmý z následujícího obrázku č.2 Obr. 1 Obr. 2 97

96 Vysokonapěťový zdroj je propojen s elektrodami na koncích kapiláry kablíky přes konektor pod nápisem ELEKTROFORÉZA. Na kyvném raménku je připevněn chladič Peltiérových článků, které stabilizují teplotu měděného bloku uvnitř raménka. Nasouvání injekčních stříkaček v mechanickém vedení chrání konce kapiláry před poškozením. Hydrodynamické dávkování vzorku provádíme nakloněním kyvného raménka. Kalibrace přístroje S ohledem na rozdílnost délek optické dráhy světelného paprsku v komerčních spektrofotometrech a přístroji CE MILK 1 uvádíme dva možné přístupy ke kalibraci. První, bližší podmínkám v kapiláře, bere za základ signálovou hladinu při vysoké (nominální) koncentraci amidočerni., kdy dochází k maximálnímu útlumu světelného paprsku. Postupným ředěním velikost útlumu klesá až k nekonečnému ředění, kdy obdržíme signálovou úroveň čisté vody. Tento postup je znázorněn na obrázku 3. V konečném stadiu analýz se koncentrace analytu stanoví s plochy píku, takže vlastně nezáleží, jaké jednotky jsme na ose Y zvolili. (V našem případě jsme zpracovávali signálové úrovně v mv). Kalibrace přístroje je graficky znázorněna na obr. 4. mv Obr. 3 (Poznámka za koncentraci rovnou jedné jsme zvolili optimalizovaný roztok nosného elektrolytu s amidočerní o složení uvedeném výše) Druhý přístup ke kalibraci vychází z měření absorbance na komerčním přístroji. V našem případě jsme použili komerční spektrofotometr Beckman DU520, který měří absorbanci na kyvetě o optické dráze 1cm. Pro amidočerň lze najít maximum absorbance v oblasti 605 nm. Při této vlnové délce je na obr. 5 znázorněna koncentrační závislost. (poznámka pro absorbanci rovnou jedné poklesne intenzita světla při průchodu kyvetou na jednu desetinu Lambert Beerův zákon) Metoda přímé detekce využívá oblastí nízkých koncentrací roztoků a ke srovnání signálových úrovní lze využít komerční přístroje viz obr. 5, kdežto pro metody nepřímé detekce bývají koncentrace optimalizovaných nosných elektrolytů vysoké, jak je zřejmé z předchozích grafů. 98

97 5000 Závislost intenzity na koncentraci elektrolytu CE MILK 1 2,5 Závislost intenzity na koncentraci elektrolytu DU [mv] y = 4560x R 2 = 0,995 2,0 1,5 1,0 absorbance y = 68,692x R 2 = 0, ,5 koncentrace 0 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Obr. 4 Obr. 5 koncentrace 0,0 0,00 0,01 0,02 0,03 0, Obr. 6 Plocha (mv.s) y = 355,9x R 2 = 0,9925 Fruktoza Laktoza y = 211,41x R 2 = 0, Koncentrace (mg/ml) Tabulka I Laktoza Fruktoza Laktoza Fruktoza Prů m ě r L a ktoz a mv*s mv*s mg/ml mg/ml mg/ml % slepý pokus (1) ,923 slepý pokus (2) ,103 slepý pokus (3) ,550 slepý pokus (4) ,240 I (1) ,471 19,969 I (2) ,703 14,875 24,327 4,864 II (1) ,253 18,663 II (2) ,729 19,410 23,280 4,652 II (3) ,720 20,464 III (1) ,251 18,789 III (2) ,392 18,050 III (3) ,693 24,321 14,324 4,063 III (4) ,020 20,809 IV (1) ,984 26,609 IV (2) ,862 18,421 IV (3) ,439 11,604 23,584 4,712 IV (4) ,452 11,655 99

98 Kalibrační charakteristika pro laktosu a fruktosu je znázorněna na obr.6. Výsledky stanovení obsahu laktosy ve vzorcích čtyřech různých druhů mlék jsou shrnuty v tabulce I. Neméně laktosy obsahoval vzorek č.iii, nejvíce pak vzorek I. Přístroj CE MILK 1 lze využít i k jiným analýzám, lze tedy aplikovat i jiné metody. Následující obrázky demonstrují aplikace pro modelové separace aniontů a kationtů. Na obrázku 7 je znázorněna separace 1 bromidy, 2 chloridy, 3 nitráty, 4 sulfáty, 5 a 6 fumaráty, 7 malonáty, 8 citráty, 9 glutamáty, I nečistoty citrátů podle [1]. Na obrázku 8 je znázorněna separace 1 Cs +, 2 K +, 3 Ca ++, 4 Mg ++, 5 Na +, 6 Li +, rovněž podle [1]. Obr. 7 Obr.8 Autoři děkují za podporu MZe, NAZV (grant QF4082) Použitá literatura: [1] Capillary zone electrophoresis with indirect photometric detection in the visible range. Electrophoresis 1994, 15, Art [2] Master Book on Sensors ISBN (sborník konference Eurosensors XVI September 15 18, 2002) [3] Determination of saccharides in fruit juices by capillary electrophoresis. Journal of Mass Spectrometry 2001; 36 : Kontaktní adresa: L. Přibyla ÚACH AVČR Veveří BRNO, pribyla@iach.cz, V.Černý VÚM, MILCOM a.s. Soběslavská TÁBOR, v.cerny@vum-tabor.cz 100

99 APLIKACE JEDNODUCHÉ METODY MĚŘENÍ VISKOZITY V MLÉKÁRENSKÉ PRAXI. Černý Vladimír, Švandrlík Zdeněk Výzkumný ústav mlékárenský s.r.o., MILCOM a.s., Oddělení sýrařských technologií, Tábor APPLICATION OF A SIMPLE METHOD FOR MEASUREMENT OF VISCOSITY IN DAIRY PRAXIS Summary: The possibility of the vibratory viscosimeter SV-10 (producer A&D Company, Japan) use in dairy praxis was investigated. The tests were aimed at two areas. 1. Viscosity measurements of fermented milk products, deserts and quarks including the temperature effect on the viscosity changes. Sensitivity and measurement range was sufficient for viscosity measurement of tested products. Operation of instrument is not demanding; the data are transported into PC. For possible errors elimination (errors could occur during samples manipulation or during the actual measurements) evaluation of three repeated measurements is recommended. 2. Rennet milk coagulation measurement. The results of repeated measurements of milk coagulation on models confirmed sufficient repeatability of rennet ability determination (time 588,8 s ą 3,5 s, so ą 0,59 %), and rate of hardening of rennet curd (maximum of viscosity change 0,09427 mpa, i.e. ą 1,9 % ). Effect of rennet portion changes and effect of calcium chloride addition was checked and observed. The results of measurements confirm that the instrument SV-10 is suitable for application in both in milk industry and research purposes. Measurement of viscosity and its dependence on temperature makes it possible to control employed technological procedures and the effect of product composition changes. Byla zkoumána možnost aplikace vibračního viskozimetru SV- 10 výrobce A&D Company, Japonsko v mlékárenském průmyslu. Viskozimetry SV se skládají z řídící jednotky a detekční jednotky. Detekční jednotka je složená ze dvou tenkých kotoučových čidel, které vibrují po stále stejné sinusové křivce v reverzní fázi jako ladička a slouží pro měření viskozity vzorku. Kotoučová čidla jsou poháněna elektromagnetickou silou stejné frekvence jako vlastní frekvence (rezonance). Toto využití rezonance je charakteristickým rysem viskozimetrů tohoto typu. Elektromagnetická hnací jednotka řídí vibraci kotoučových čidel ve vzorku při stále stejné amplitudě. K tomu je využívána rezonance detekční jednotky. Řídící elektrický proud jako excitační síla je pak ve vztahu k viskozitě vzorku a viskozitní koeficient je dán korelací mezi řídícím elektrickým proudem a viskozitou. Přístroje se podle výrobce vyznačují těmito výhodami : - rezonance detekční jednotky dovolí detekci viskozity s vysokou citlivostí i ve spodním viskozitním spektru, - setrvačné síly a vratné síly kotoučových čidel se vzájemně eliminují a budicí síla (řídící elektrický proud ) je ovlivněný jen velikostí vazkosti (viskozity). - vibrační systém kotoučových čidel není ovlivněný setrvačnými a vratnými silami, a tak je možné změřit i rychlé změny ve viskozitě vzoru během měření, - souběžně měří viskozitu a teplotu vzorku v reálném čase, - přesnost s opakovatelnost dosahuje 1 % měřené hodnoty viskozity, - měří v širokém rozsahu viskozity od jen 0.3 mpa.s do mpa.s - umožňují změřit viskozitu pohybujícího se nebo proudícího vzorku, - je proveditelné měření viskozity na výrobní lince při instalovaném obtoku nebo přetoku do nádrže. Laboratoř a výrobní linka může v tomto případě sdílet správu stejných dat. 101

100 Jako možné aplikace měření viskozity přístrojem SV-10 byly vybrány dvě oblasti : Měření viskozity mlékárenských výrobků a její změny v závislosti na teplotě. Pro ověřovací série měření byly použity mlékárenské výrobky běžné kvality zakoupené v tržní síti. Byla měřena závislost jejich viskozity na teplotě vzorku. Každé měření bylo 3x opakováno a výsledky byly po vypočtení průměrných hodnot graficky zpracovány v programu Microsoft Excel. Do souboru testovaných vzorků byly zařazeny jogurty, tvarohy a tvarohové dezerty. Výsledky měření jsou presentovány v následujících grafech. Obr. Č. 1 viskozita (Pa.s) teplota ( C) Obr. 1 : Tvarohový dezert kakao ( ) a vanilka ( ) výrobce 1 Obr. Č viskozita (Pa.s) teplota ( C) Obr. 2 : Tvarohový dezert kakao ( ) a vanilka ( ) výrobce 2 102

101 Obr. Č viskozita (Pa.s) teplota ( C) Obr. 3 : Tvaroh odtučněný ( ) a polotučný ( ) téhož výrobce. Obr. Č. 4 viskozita (Pa.s) teplota ( C) Obr. 4 : Porovnání viskozity jogurtů od 3 výrobců. Výsledky testovacích měření jogurtů, desertů a tvarohů ukazují mimo jiné toto : - měřící rozsah přístroje pro měření viskozity těchto výrobků dostatečný, - porovnávání křivek měření změny viskozity v závislosti na teplotě má vyšší vypovídací hodnotu než měření viskozity jen při jedné (např. pokojové) teplotě. Umožňují vyhodnocovat rozdíly v mechanických vlastnostech i u vzorků jejichž viskozita je při pokojové teplotě přibližně stejná (rozdíly ve viskozitě jogurtu od tří výrobců ), - z výsledků měření změn viskozity v závislosti na teplotě lze usuzovat opakovatelnost či naopak na změny v používaných technologických postupech výroby či na změny ve složení výrobku (Obr. č.1-2 ), 103

102 Měření koagulace mléka působením syřidel nebo změnou ph. Měření času koagulace mléka a znalost rychlosti formování sýřeniny hrají významnou roli při výrobě sýrů a tedy i ve výzkumu zaměřeném na tuto oblast mlékárenského průmyslu. Tato měření umožňují studovat vztahy mezi složením mléka nebo vlivem dalších parametrů (např. teplota, kyselost mléka) při použití konstantní dávky syřidel na průběh koagulace mléka nebo naopak výzkum vlivu použitého syřidla na rychlost srážení mléka a formování sýřeniny. Testování použitelnosti přístroje SV-10 v této oblasti výzkumu zahrnovalo : Opakovatelnost měření koagulace mléka za konstantních podmínek. Pro měření bylo použito syřidlo s obsahem 75 % chymosinu a 25 % bovinního pepsinu jehož síla byla upravena na 1 : 750 SU, použitá teplota byla 31,5 C. Měření bylo opakováno 5x a výsledky jsou uvedeny v Obr. č. 5. Z průběhu grafických záznamů jednotlivých měření je zřejmá opakovatelnost stanovení. Čas koagulace byl 588,8 +- 3,5 s, tedy +- 0,59 % a průměrná hodnota maximální rychlosti změny viskozity byla 0,0427 mpa se směrodatnou odchylkou 0,00068 mpa, tj. +- 1,9 %. Výsledky potvrzují vysokou míru opakovatelnosti stanovení času koagulace mléka za použití přístroje SV Obr. Č 5 viskoztita (mpa.s) voda test1 test2 test3 test4 test čas (s) Obr. č. 5 : Test opakovatelnosti Vliv dávky syřidla. Pro testování bylo použito syrové směsné mléko odebrané z cisterny svozné linky. Síla syřidla byla 1 : 847 a jeho přídavek byl 2,25ml, 2,5ml, 2,75 ml, 3 ml resp. 3,5 ml na 200 ml mléka. Záznamy průměru opakovaných měření viskozity ukázaly dobrou citlivost přístroje při této aplikaci, naměřené rozdíly způsobené změnou dávky syřidla byly signifikantní. Vliv přídavku chloridu vápenatého (Obr. č.6). Uvedený příklad souboru měření vychází z průměru tří opakovaných měření viskozity za použití stejného mléka a s konstantním přídavkem syřidla. Sledovaným parametrem byl přídavek roztoku chloridu vápenatého voleným tak, že přídavek odpovídal po přepočtu přídavku 2, 3, 5, 7 a 10 ml nasyceného roztoku chloridu vápenatého na 100 l mléka. 104

103 30 Obr. Č. 6 viskozita (mpa.s) čas (min) 0 ml 2 ml 3 ml 5 ml 7 ml 10 ml Obr. č. 6 : Vliv přídavku chloridu vápenatého. Závěr : 1. Přístroj SV-10 je použitelný pro vhodné aplikace v mlékárenském průmyslu i pro výzkumné účely. 2. Směrný operační postup měření viskozity mlékárenských výrobků s tímto přístrojem bude při použití k výzkumným účelům ve VÚM zahrnovat mj. tyto zásady : a. opakovat měření minimálně na třech baleních výrobku, b. měřit změnu viskozitu výrobku v závislosti na teplotě a z této křivky odečíst hodnotu viskozity minimálně při dvou předem zvolených teplotách, Použitá literatura: 1. Černý,V., Klepetář, J., Přibyla, L. : Měření dynamiky koagulace mléka působením syřidla. Celostátní přehlídky sýrů a seminář Mléko a sýry 2003, VŚCHT Praha, ledna 2003, přednáška 2. Černý, Klepetář, Přibyla : Aplikace optických metod v procesu řízení výroby sýrů a jogurtů. Poster, XXX. Seminář Jakost potravin, Brno, MLZU, Poděkování : Práce byly provedeny s finanční podporou MŠMT, grant MSM Kontaktní adresa: ing. Vladimír Černý, Výzkumný ústav mlékárenský s.r.o., Soběslavská 841, Tábor 105

104 HODNOCENÍ TEXTURNÍCH VLASTNOSTÍ EIDAMSKÝCH SÝRŮ NIR SPEKTROMETREM Mlček Jiří, Šustová Květoslava Ústav Technologie potravin, Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně EVALUATION OF STRUCTURE PROPERTIES OF EDAM CHEESE BY NIR SPECTROMETER Summary: There were evaluated structure properties of Edam (hardness in mouth and between fingers, elasticity by thumb and elasticity in mouth, chewing, consistency and tenacity) by NIR spectrometry in this work. Samples of Edam with contains of 45 % TVS and 30 % TVS were used to analysis s. Analyses were done always after month until 6 month old cheese. Reference sensorial validations of Edams were done by board of experts with 10 members. Sensorial validated samples were parallel scaled by NIR spectrometry on the field of integration (technique of reflectance). After that, calibration models were created by PLS algorithm for each indicators of structures of properties. Their dependability was validating by cross validation. All results were evaluated using the correlation between reference values and calculated values from calibration equation and based on size of standard deviation (SEC, SEP). By method of NIR reflectance were obtained high correlation coefficients (R): 0,757 0,961. All validated attributes, beside tenacity and hardness in mouth showed availability for using measuring by NIR spectroscopy. ÚVOD Stanovení hlavních složek potravin klasickými analytickými metodami je pomalé a drahé. Tyto metody často vyžadují použití chemikálií a testovacích vzorků, dříve než analýzu provedeme. Důsledkem těchto tradičních metod je akumulace chemických odpadů a kontaminace životního prostředí. Rychlé a nedestruktivní anylýzy NIR spektroskopie překonávají nevýhody klasických metod (Rodrigues Otero et al., 1995; Osborne et al., 1993). Již bylo dokázáno, že NIR analýza je jednoduchá a přesná. Po NIR analýze vzorky nejsou zničeny, ale mohou se dále použít. Spektroskopie v NIR oblasti se v potravinářství a zemědělství jako jediných oborech uplatňuje již od 60. let (stanovení vody, proteinů, olejů, tuků a sacharidů). Další uplatnění našla ve farmacii, petrochemii, medicíně a při sledování životního prostředí (Centner, 1999). Spektroskopie v NIR oblasti se uplatňuje v kontrole jakosti surovin, meziproduktů i finálních výrobků. Jsou získávány údaje o obsahových látkách, ale i o některých funkčních, senzorických vlastnostech a fyzikálně chemických parametrech (Rodrigez Otero et at., 1997). Praktické použití NIR spektroskopie v mlékárnách je hlavně zaměřeno na měření vlhkosti, tuku, proteinů a laktózy v mléce a mléčných produktech. Byla publikována řada výsledků v analýze sýrů pomocí NIR spektroskopie, např. stanovení vlhkosti, sušiny, tuku, proteinů a laktózy. V úvahu však také přichází schopnost této techniky stanovit kvalitativní vlastnosti potravin. Možnosti techniky ukazují na výzkumy v senzorické kvalitě masových klobás (Ellekjaer et al., 1994), falšování pomerančových džusů (Twomey et al., 1995), senzorika a detekce znehodnocených sýrů díky Clostridium tyrobutyricum (Sørensen a Jepsen, 1997,1998), senzorika espresa z pražené kávy (Esteban-Díez et al., 2004), senzorické hodnocení textury brambor (Van Dijk et al., 2002), stanovení barvy, textury a senzorické vlastnosti hovězích steaků (Liu et al., 2003), stanovení kvality čokolády měřením kakaových bobů (Davies et al., 1991), senzorické vlastnosti ovoce (Kim et al., 2000). Výsledky uvedené v této práci hodnotí texturní vlastnosti eidamů metodou NIR reflektanční spektroskopií, zároveň porovnávají tuto metodu s metodou klasického senzorického hodnocení. 106

105 MATERIÁL A METODY Materiál K analýze byly použity vzorky eidamů s různou tučností a odlišnou startovací kulturou. Byly sledovány eidamy skupiny č.1 s obsahem 30% TVS (kultura FD Lactobac. casei) a eidamy skupiny č. 2 s obsahem 30% TVS (kultura CHN 11 Lactobac. casei. Dále se jednalo o vzorky skupiny č.3 s obsahem 45% TVS (kultura WIESBY PROBAT 505 L. casei a L. lactis). Vzorky sýrů byly odebírány v měsíčních intervalech až do stáří sýrů 6 měsíců. U vzorků sýrů skupiny č. 1 a 2 byl plátek rozdělen na střed a kraj a u každé části byly referenčně určeny texturní vlastnosti. U sýrů skupiny č. 3 nešlo posuzovat kraj a střed, neboť se jednalo o 13 kg blok, který byl rozřezán na 6 menších dílů. Texturní vlastnosti byly tedy posuzovány v celé ploše sýra. Výsledné referenční hodnoty pro jednotlivé složky sýrů všech skupin byly sloučeny (celkem 30 hodnot pro každou složku) a následně použity pro vytvoření kalibračních modelů. Došlo tak k rozšíření kalibračního rozpětí hodnot. Referenční hodnoty pro jednotlivé texturní vlastnosti jsou uvedeny v tab. II. Referenční metody Senzorické hodnocení všech skupin eidamských sýrů prováděla 10ti členná odborná komise. Hodnocení texturních vlastností probíhalo pomocí 100 mm grafické stupnice. NIR metody Vzorky sýrů byly analyzovány na FT-NIR spektrometru Nicolet Antaris. Přístroj byl vybaven InGaAs detektorem a CaF 2 beamsplitterem. Spektra byla snímána v rozsahu cm -1 cca 1 min. Vzorky eidamských sýrů byly na přístroji měřeny v režimu reflektance na integrační sféře s nástavcem Sample Cup Spinner pro rotaci vzorků. Pro měření na integrační sféře byly vzorky nastrouhány (cca 5g) a vloženy do kompresní kyvety se skleněným dnem o poloměru 1 cm. U vzorků sýrů skupiny č. 1 a č. 2 se strrouhal zvlášť střed a zvlášť kraj. Sýry byly na integrační sféře měřeny vždy 3 krát. Počet snímání jednoho spektra byl 80 scanů se spektrálním rozlišením 4 cm -1 Pro vyhodnocení bylo použito průměrné spektrum. Statistické metody Kalibrační modely byly vytvořeny pomocí PLS algoritmu (metoda minimálních čtverců) (Haaland and Thomas, 1988a,b) a ověřeny křížovou validací. PLS faktory použité v kalibračních modelech zahrnují spektrální a současně koncentrační informaci. Křížová validace je užívána proto, abychom se vyhnuli tzv. přefitování kalibračních modelů (Sanderson et al., 1997). Při tomto postupu je vždy vypuštěn jeden ze standardů a ze zbylých kalibračních dat je vytvořen nový model, který je použit pro výpočet vektoru koncentrací vypuštěného standardu. Vypočtené odchylky od deklarovaného obsahu složek vypuštěného standardu jsou pak statisticky vyhodnoceny. Zhodnocení výsledků bylo provedeno na základě korelace mezi referenčními hodnotami a hodnotami vypočtenými ze získaných kalibračních rovnic a na základě velikosti směrodatných odchylek kalibrace (SEC) a validace (SEP). Je kladen důraz na minimální SEP, protože se jedná o odchylku, která je očekávána v budoucích předpovědích. SEP spolehlivé kalibrace není obvykle o mnoho větší než SEC. Nejžádanější hodnotou obou odchylek je hodnota blížící se k nule. Vhodnost výsledného modelu se posuzuje rovněž dle korelačních koeficientů (R). Korelační koeficient je mírou lineární závislosti mezi naměřenými spektry a referenčními laboratorními hodnotami. Čím více se hodnota R blíží 1, tím lze považovat model za použitelnější. Dalším ukazatelem spolehlivosti modelu je hodnota kalibračního variačního koeficientu CCV a hodnota predikčního variačního koeficientu PCV. Velmi spolehlivá kalibrace znamená, že hodnota CCV je pod 5 % a hodnota PCV pod 10 %. 107

106 VÝSLEDKY A DISKUZE Referenční data a tvorba kalibračního modelu Pro vytvoření kalibračních modelů byly použity vzorky sýrů s 30 % TVS a 45 % TVS a různými kulturami. Základní složení sýrů uvádí tabulka I. Přesné referenční analýzy vzorků jsou limitujícím faktorem pro získání funkčních kalibračních modelů. (Murray, 1986). Cílem naší práce byla možnost stanovení texturních vlastností eidamů. Zaměřili jsme se na stanovení texturních vlastností (tvrdost v ústech a tvrdost mezi prsty, elasticita palcem a elasticita v ústech, žvýkatelnost, soudržnost a mazlavost). Pro vytvoření kalibračního modelu bylo použito 30 vzorků (24 vzorků sýrů skupiny č. 1,2 a 6 vzorků sýrů skupiny č.3). Pomocí diagnostického nástroje (spectrum outlier) byly některé odlehlé výsledky ignorovány, a to ty, u kterých byla nepřesně stanovena referenční hodnota nebo se objevila odchylka ve změřeném spektru. Přesný počet vzorků použitých pro kalibraci pak uvádí tabulka II. Nebyla provedena první ani druhá derivace spektra. Tab. I Základní složení hodnocených eidamských sýrů Vzorek Kultura Sušina Tuk TVS Skupina č. 1 FD 51,50 15,75 30,58 Skupina č. 2 CHN 11 50,81 16,50 32,47 Skupina č. 3 PROBAT ,34 26,50 45,34 Tab. II Parametr n max min x p s x PLS soudržnost ,89 7,96 1 tvrdost prsty ,44 9,97 8 tvrdost ústy ,37 9,48 4 žvýkatelnost ,00 8,09 1 mazlavost ,44 12,17 4 elasticita-palec ,69 7,9 3 elasticita-žvýkání ,73 7,48 3 Referenční analytické hodnoty v bodech (1 až 100 mm) n počet vzorků; max maximální hodnota; min minimální hodnota; x p průměr; s x směrodatná odchylka; PLS počet faktorů Predikce texturních vlastností NIR technikou V tabulce III a IV jsou uvedeny směrodatné odchylky kalibrace (SEC), směrodatné odchylky validace (SEP), hodnoty kalibračních variačních koeficientů (CCV), hodnoty predikčních variačních koeficientů (PCV) a korelačních koeficientů kalibrace i validace (R). Z tabulky IV vyplývá, že u vzorků byla překročena hodnota PCV (10 %) ve dvou případech, a to u mazlavosti a tvrdosti v ústech. Znamená to, že tyto dvě vlastnosti nesplňují podmínku spolehlivého modelu. Vlastnost tvrdost mezi prsty se pohybuje na hranici 10 % a tudíž ji můžeme zahrnout mezi všechny ostatní vlastnosti, které tuto splňují podmínku spolehlivých modelů. U všech sledovaných vlastností byla překročena hodnota CCV, kromě vlastnosti tvrdost mezi prsty. Je zvláštností, že právě tato vlastnost pohybující se na hranici obou koeficientů jak CCV tak i PCV splňuje jako jediná podmínku velmi spolehlivého modelu, tedy CCV do 5 % a PCV do 10 %. U hodnot CCV byly velmi překročeny hodnoty u mazlavosti a tvrdosti v ústech, podobně jako 108

107 u PCV. Bylo dosaženo relativně velmi vysokých korelačních koeficientů u všech vlastností jak u kalibrace tak i validace. Velmi vyrovnané hodnoty směrodatných odchylek kalibrace a validace (SEC a SEP), pohybující se v rozmezí mezi 2,74 a 7,19 samozřejmě značí bodovou odchylku od senzorického hodnotitele, který provádí hodnocení na 100 mm grafické stupnici a 1 bod znamená 1 mm. Z tohoto můžeme usoudit, že přístroj je schopen provést max. 7,19 mm odchylku od hodnocení senzorickým hodnotitelem. Tab. III Výsledky kalibrace IS KALIBRACE bx+a R SEC CCV [%] soudržnost 0,727x + 16,330 0,853 4,16 6,95 tvrdost prsty 0,942x + 4,200 0,961 2,74 4,94 tvrdost ústy 0,711x + 13,690 0,843 5,10 10,77 žvýkatelnost 0,572x + 28,231 0,757 5,29 8,02 mazlavost 0,836x + 6,647 0,914 4,93 12,19 elasticita-palec 0,680x + 20,051 0,825 4,47 7,13 elasticita-žvýkání 0,819x + 8,107 0,905 3,18 7,91 y = bx ± a rovnice regresní přímky; SEC směrodatná odchylka kalibrace; CCV kalibrační variační koeficient; R korelační koeficient Tab. IV Výsledky validace IS VALIDACE bx+a R SEP PCV [%] soudržnost 0,692x + 18,500 0,825 4,50 7,51 tvrdost prsty 0,789x + 12,122 0,837 5,58 10,06 tvrdost ústy 0,511x + 22,724 0,633 7,19 15,18 žvýkatelnost 0,542x + 30,206 0,697 5,84 8,85 mazlavost 0,806x + 7,908 0,859 6,32 15,63 elasticita-palec 0,613x + 24,233 0,723 5,54 8,84 elasticita-žvýkání 0,787x + 9,543 0,869 3,71 8,29 y = bx ± a rovnice regresní přímky; SEP směrodatná odchylka predikce; PCV predikční variační koeficient; R korelační koeficient V tabulce V jsou zaznamenány výsledky statistického vyhodnocení predikovaných NIR hodnot a referenčních hodnot jež byly testovány párovým T-testem. Nebyl zaznamenán statisticky průkazný rozdíl mezi referenčními a predikovanými hodnotami. 109

108 Tab. V Statistické vyhodnocení T-testem Parametr n xnir xref d s x P soudržnost 27 59,89 59,89 0,000 4,16 - tvrdost prsty 27 55,4 55,4 0,000 2,74 - tvrdost ústy 27 47,37 47,37 0,000 5,09 - žvýkatelnost 27 65,99 66,00 0,000 5,29 - mazlavost 27 40,44 40,44-0,000 4,93 - elasticita-palec 26 62,69 62,69 0,000 4,47 - elasticita-žvýkání 26 44,73 44,73 0,000 3,18 - * = P<0.05 n počet vzorků, xnir hodnoty predikované; xref hodnoty referenční; d diferenční rozdíl predikovaných a referenčních hodnot; s x směrodatná odchylka diference; z z test. ZÁVĚR Senzorické hodnocení hodnotiteli je vždy ovlivňováno řadou vlivů, které mohou zkreslovat výsledky. Výkonnost metody NIRS predikovat senzorické vlastnosti, v našem případě texturní vlastnosti, může být právě ovlivněna přesností referenční metody, vůči níž se provádí kalibrace. Použití metody NIRS může dále omezovat to, že ke všem účelům vyžaduje pracnou a náročnou kalibraci. Jakmile je však spolehlivá kalibrace provedena, je již vlastní stanovení velmi jednoduché. Na rozdíl od tradičního senzorického hodnocení metoda NIRS umožňuje rychlé, jednoduché a současné vyhodnocení více složek a vlastností to vše bez organizačně náročného senzorického hodnocení a zkušeností hodnotitele. NIR spektroskopie může tyto nepříznivé vlivy alespoň částečně odstranit a tím zpřesnit výsledky.všechny hodnocené znaky, kromě mazlavosti a tvrdosti ústy vykazovaly vhodnost použití pro měření technikou NIR spektroskopie. Použitá literatura: Centner, V. (1999): Blízká infračervená spektroskopie (NIR) a její průmyslová aplikace. CHEMagazín,1, Davies A.M.C., Franklin J.G., Grant A., Griffiths N.M., Shepherd R., Fenwick G.R. (1991): Prediction of chocolate quality from near-infrared spectroscopis measurements of the raw cocoa beans, Vibrational spectroscopy 2, Ellekjaer, M. R., Isaksson, T. and Solheim, R. (1994): Assessment of sensory quality of meat sausages using near infrared spectroscopy. Journal of Food Science 59, Esteban-Díez, I., González-Sáiz, J.M., Pizarro, C. (2004): Prediction of sensory properties of espresso from roasted coffee samples by near-infrared spectroscopy. Analytica Chimica Acta 525, Haaland M.D., Thomas V.E. (1988a): Partial least squares methods for spectral analyses. 1. Relation to other quantitative calibration methods and the extraction of qualitative information. Analytical Chemistry, 60, Haaland M.D., Thomas V.E. (1988b): Partial least squares methods for spectral analyses. 2. Application to simulated and glass spectral data. Analytical Chemistry, 60,

109 Kim J., Mowat A., Poole P., Kasabov N. (2000): Linear and non-linear pattern recognition models for classification of fruit from visible-near infrared spectra. Chemometrics and intelligent laboratory system systems 51, Liu Y.L., Lyon B.G., Windham W.R., Realini C.E., Pringle T.D.D., Duckett S. (2003): Prediction of color, texture, and sensory characteristics of beef steaks by visible and near infrared reflectance spectroscopy. A feasibility study. Meat Science 65, Murray, I. (1986): Near infrared reflectance analysis of forages. In W. Heresign, & D. J. A. Cole (Eds.), Recent advances in animal nutrition, London: Butterworths pp. Osborne, B. G., Fearn, T., & Hindle, P. H. (1993): Practical NIR spectroscopy with applications in food and beverage analysis. Essex: Longman Scientific & Technical. Rodriguez-Otero, J. L., Hermida, M. and Cepeda, A. (1995): Determination of fat, protein, and total solids in cheese by near-infrared reßectance spectroscopy. Journal of AOAC International 78, Rodriguez-Otero, J.L., Hermida, M., Centeno, J. (1997): Analysis of Dairy Products by Near-Infrared Spectroscopy. A Rewiew. J. of Agric. Food Chem., 45, Sanderson, R., Lister, S. J., Dhanoa, M. S., Barnes, R. J. and Thomas, C. (1997): Use of near infrared reflectance spectroscopy to predict and compare the composition of carcass samples from young steers. Animal Science, 65, S rensen, L. K. and Jepsen, R. (1997): Detection of cheese batches exposed to Clostridium tyrobutyricum spoilage by near infrared spectroscopy. Journal of Near Infrared Spectroscopy 5, S rensen, L. K. and Jepsen, R. (1998): Assessment of Sensory Properties of Cheese by Near-infrared Spectroscopy Int. Dairy Journal 8, Twomey, M., Downey, G. and McNulty, P. B. (1995): The potential of NIR spectroscopy for the detection of the adulteration of orange juice. Journal of the Science of Food and Agriculture 67, Van Dijk C., Fischer M., Holm J., Beekhuizen J.G., Stolle-Smits T., Boeriu C. (2002): Texture of cooked potatoes (Solanum tuberosum). 1. Relationships between dry matter content, sensory-perceived texture, and near-infrared spectroscopy. Journal of agricultural and food chemistry 50, Kontaktní adresa: Ing. Jiří Mlček, Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, Ústav technologie potravin, Zemědělská 1, Brno, Česká republika Tel.: , xmlcek@node.mendelu.cz 111

110 Plakátová sdělení

111 RASTOVÉ PARAMETRE KMEŇOV STAPHYLOCOCCUS AUREUS IZOLOVANÝCH Z OVČIEHO MLIEKA A HRUDKOVÉHO SYRA Bajúsová Barbora, Valík Ľubomír, Liptáková Denisa, Medveďová Alžbeta Fakulta chemickej a potravinárskej technológie STU v Bratislave GROWTH PARAMETERS OF STAPHYLOCOCCUS AUREUS STRAINS ISOLATED FROM EWE`S MILK AND CHEESE Summary: Staphylococcus aureus is one of the ubiquitous contaminants of raw ewe s milk. Presence of the toxin producing strains and their enterotoxins in ewe s lump cheese produced from raw milk are dependent on various factors connected with animal health status and environmental, hygienical and technological conditions during production. On the other hand, fermentation and ripening resulting in specific intrinsic factors play key role in fate of this organism. In this work, an experimental survey and statistical evaluation of Staphylococcus aureus growth parameters is presented. Replicated growth curves of 15 strains were determined in milk at 15 C. The results demonstrate that despite some inherent errors of the microbiological cultivation method, the growth curves and calculated growth rates can be determined with high repeatability represented with as low coefficient of variation (CV) as 7.1 % (for all the strains of S. aureus under study). The most accurate growth rate of the same strain was calculated from 6 growth curves resulted from two independent trials (CV = 1.2 %). The results confirmed the fact that the higher repeatability of growth curves and subsequent growth parameters is determined the best predictions can be postulated. Prediktívna mikrobiológia, ako zložka kvantitatívnej potravinárskej mikrobiológie, je užitočným nástrojom pre zistenie vzťahov na jednej strane medzi vlastnosťami potravín, históriou manipulácie s nimi a vonkajším prostredím a mikroorganizmami, ktoré sa môžu v potravinách rozmnožovať alebo prežívať, na strane druhej (McMeekin a kol., 1997; Adams a Moss, 1995). Prediktívna mikrobiológia využíva tzv. primárne a sekundárne matematické modely. K primárnym modelom najčastejšie zaraďujeme rastovú čiaru v prípade rastu mikroorganizmov alebo tzv. letalitnú čiaru v prípade ich devitalizácie. Rast a rozmnožovanie mikrobiálnej populácie je zákonitý proces. Vo vhodnom prostredí vznikajú z jednej bakteriálnej bunky dve a ich počet sa ďalej s časom zdvojnásobuje. V semilogaritmickom znázornení tento dej znázorňuje rastová čiara, ktorá má obyčajne sigmoidný tvar zahrňujúci jednotlivé fázy rastu. Z nich pre predikcie sú najdôležitejšie lag-fága a tzv. fáza exponenciálneho alebo logaritmického rastu. Medzi najznámejšie primárne modely patria Gompertzova funkcia a Baranyiho dynamický model (Baranyi a kol., 1993; McKellar a Lu, 2004). Druhý v poradí v zjednodušenom tvare reprezentuje nasledovná rovnica dn dt () t ( N ) N = α μ, v ktorej μ = špecifická rastová rýchlosť, N = počet mikroorganizmov a funkcia α(t) charakterizuje prispôsobenie sa mikrobiálne bunky novému prostrediu počas lag-fázy. Rast mikroorganizmov závisí od faktorov súvisiacich so samotným mikrobiálnym druhom, jeho vlastnosťami, fyziologickým stavom a v neposlednom rade od faktorov vnútorného a vonkajšieho prostredia potravín (Valík a Görner, 1995; Görner a Valík, 2004). Nakoľko podľa viacerých autorov, ako napríklad, podľa Monoda (1949) a Rossa a McMeekina (1994), sú odozvy populácií mikroorganizmov na tieto faktory reprodukovateľné, je možné matematicky určiť vzťah medzi parametrami vypočítanými z rastových alebo letalitných čiar a týmito faktormi prostredia. Tieto vzťahy sú definované skupinou tzv. sekundárnych modelov (Ross a Dalgaard, 2004). 115

112 Všeobecným cieľom prediktívneho prístupu v potravinárskej mikrobiológii je na základe známych faktorov prostredia predpovedať rast mikroorganizmov a zhodnotiť jeho dôsledky pre bezpečnosť a trvanlivosť potravín (Roberts, 1995). Staphylococcus aureus tvorí grampozitívne kokovité bunky, ktoré sa v kultúre vyskytujú vo forme strapcovitých zhlukov. Je fakultatívne anaeróbny, mezofilný, tvorí katalázu, ale oxidázu nie. Rastie v oblasti teplôt 7 až 48 C a ph 4,2 až 9,3. Charakteristická je jeho halotolerantnosť ekvivalentná maximálne minimálnej hodnote a v = 0,83 (21 % NaCl; Chen, 1989). Jeho kmene sa vyznačujú tvorbou termostabilných enterotoxínov, ktoré môže za aeróbnych podmienok tvoriť už pri a v = 0,86. Staphylococcus aureus sa principiálne nachádza na pokožke a mukóznych membránach teplokrvných zvierat. Bežne sa nachádza v surovom mlieku a v syroch vyrobených zo surového mlieka. Jeho počty môžu byť v mlieku zvýšené, ak sa v stáde vyskytuje mastitídne ochorenie. V mliekarenskej praxi môže S. aureus kolonizovať technologické zariadenia na miestach, ktoré sa obtiažne čistia (Adams a Moss, 1995). V dobre nadojenom ovčom mlieku sa vyskytuje v počtoch medzi 100 až 200 KTJ.ml -1 (Valík a kol., 2004). Podľa Aspergera a Zangerla (2002) sa za normálnych podmienok počas prvých 24 h dá očakávať jeho zvýšenie počtov o 1,5 až 3 logaritmické poriadky. Preto aj súčasná legislatíva EÚ pripúšťa jeho maximálne limity v syroch vyrobených zo surového mlieka m = 10 4 a M = 10 5 KTJ.g -1 (Regulation (ES) 2073/2005). Cieľom našej práce bolo popísať rast kmeňov Staphylococcus aureus izolovaných z ovčieho mlieka a ovčieho syra pri teplote 15 C a zistiť opakovateľnosť vypočítaných rastových parametrov z rastových čiar zistených u toho istého kmeňa opakovane ako aj zo skupiny 15 kmeňov ako celku. Materiál a metódy Kmene Staphylococcus aureus boli izolované z ovčieho mlieka a ovčieho syra na Štátnom veterinárnom a potravinovom ústave v Prešove (poskytnuté MVDr. Hanzélyovou). Jeden kmeň bol izolovaný z materského mlieka (Úrad verejného zdravotníctva SR; Ing. Sirotná). Identifikácia kmeňov bola dodatočne potvrdená systémom API (BioMérieux, Marcy l'etoile, Francúzsko). Štandardné 24h kultúry čistých kmeňov sa inokulovali do sterilného UHT mlieka tak, aby sa získal čo najmenší rozptyl počiatočných počtov S. aureus v mlieku. Paralelne naočkované mlieko sa inkubovalo pri 15 C, pričom v príslušne stanovených intervaloch sa vyšetroval aktuálny počet KTJ.ml -1 S. aureus, kultivačne na Agare podľa Baird-Parkera (Imuna, Šarišské Michaľany, SR) a neskôr na GTK agare (Imuna, Šarišské Michaľany, SR). Zo zistených počtov sa zostrojili rastové čiary, ktoré sa podrobili primárnemu modelovaniu podľa Baranyiho (Baranyi a kol., 1993), výsledkom ktorého boli vypočítané rastové parametre (rastová rýchlosť, lag-fáza a i.). Rastové parametre boli podrobené základnému matematicko-štatistickému hodnoteniu s využitím štatistického balíka Microsoft a Statistica Cz. Výsledky a diskusia Na obr. 1 sú znázornené rastové čiary 6 kmeňov S. aureus. Pre prehľadnosť ďalšie rastové čiary už nebolo vhodné znázorniť. Aj z týchto prezentovaných čiar je vidieť, že sa líšili navzájom len minimálne, čo potvrdzujú aj rozmedzia v akom sa pohybovali príslušné lag-fázy a smernice exponenciálnej fázy. Pozoruhodné pritom je, že rastové čiary vychádzali z výsledkov získaných klasickou zrieďovacou kultivačnou metódou, ktorá sa všeobecne vyznačuje 16 až 52% opakovateľnosťou stanovenia (STN ISO 6888). V tab. 1 sú zhrnuté výsledky štatistického zhodnotenia rastových parametrov, ktoré potvrdzujú minimálne odchýlky od ich priemerných hodnôt očakávané z grafického znázornenia rastových čiar. Priemerná rastová rýchlosť kmeňov S. aureus v mlieku pri 15 C činila 0,067 ± 0,005 h -1 (n = 60; v k = 7,1 %), čo zodpovedalo priemerne generačnému času 4,5 ± 0,3 h. Generačný čas sa pritom pohyboval v intervale 3,9 až 5,5 h. Podobne priemerná dĺžka lag-fázy S. aureus bola 14,3 ± 2,4 h (n = 60; v k = 16,8 %) pri rozpätí minimálnej a maximálnej hodnoty 9,4 až 18,4 h. Pre minimalizáciu chýb počas rastových experimentov bolo potrebné precízne 116

113 postupovať pri príprave inokula, samotnej inokulácii, kultivačnom stanovení počtov S. aureus ako aj dôsledne dodržiavať podmienky inkubácie. O týchto skutočnostiach počas našej práce svedčia aj ďalšie ukazovatele uvedené v tab. 1. Ako príklad uvádzame priemerný počiatočný počet S. aureus v mlieku po inokulácii (logn 0 = 3,73 ± 0,21 KTJ.ml -1 ; v k = 2,1 %) a tiež aj priemerný maximálny počet S. aureus dosiahnutý v stacionárnej fáze (logn max = 8,30 ± 0,18 KTJ.ml -1 ; v k = 2,1 %). (Príslušné distribučné diagramy týchto ukazovateľov sú/boli prezentované na seminári.) 9 8 N [log KTJ.ml -1 ] SA1744_A SA1759 SA2006 SA2296 SA_MMD SA2610_B Obr. 1 Grafické porovnanie priebehu rastových čiar 6 kmeňov Staphylococcus aureus v mlieku pri 15 C. Tabuľka I Priemerné hodnoty rastových parametrov S. aureus v mlieku inkubovanom pri 15 C a ich základné matematicko-štatistické hodnotenie Lag-fáza [h] 117 t [h] Rastová rýchlosť [h -1 ] Čas zdvojenia [h] N 0 [logktj.ml -1 ] N max [logktj.ml -1 ] Stredná hodnota 14,3 0,067 4,5 3,73 8,30 Smerodajná odchýlka výberu 2,4 0,005 0,3 0,18 0,18 Medián 14,8 0,068 4,4 0,21 8,32 Minimum 9,4 0,054 3,9 3,16 7,83 Maximum 18,4 0,077 5,5 4,14 8,71 Počet v k [%] 16,8 7,1 7,4 5,6 2,1 Validácia výsledkov Naše hodnoty rastových rýchlostí sú veľmi blízke hodnotám vygenerovaným softvérom PMP ver. 7.0 (Pathogen Modeling Program) a Combase Predictor (LeMarc, 2005; Tab II). Priemerná hodnota rastovej rýchlosti našich kmeňov S. aureus je nepatrne nižšia, čo sa prejavilo v dlhšom v čase zdvojenia o 0,5 h. Túto skutočnosť je možné vysvetliť tým, že rastové experimenty, z ktorých vychádzali obidva programy, boli vykonané v bujóne a nie v mlieku.

114 Tabuľka II Hodnoty rastových parametrov S. aureus pri 15 C vygenerované softvérom PMP vz. 7.0 a Combase Predictor (LeMarc, 2005) Lag-fáza [h] Rastová rýchlosť [h -1 ] Čas zdvojenia [h] PMP 7.0 8,9 0,077 3,9 Combase Predictor 14,3 0,074 4,1 Záverom konštatujeme, že hlavným výsledkom tejto práce bola zistená opakovateľnosť stanovenia rastových parametrov vyplývajúcich z rastových čiar, ktoré patrili jednému kmeňu alebo druhu S. aureus všeobecne (15 kmeňov). Získané výsledky sú v zhode s údajmi publikovanými vo vedeckej literatúre. V budúcnosti sa využijú pre predpovede správania sa tohoto toxinogénneho organizmu v surovom mlieku alebo v produktoch z neho vyrobených. Na základe získaných štatistických parametrov sa dá predpokladať, že vyslovené predpovede podložené príslušnými experimentmi budú v maximálnej zhode so skutočnosťou. Použitá literatúra: 1. ADAMS, M.R. MOSS, M.O. Food Microbiology. 1. ed. Cambridge: The Royal Society of Chemistry, s. ISBN ANONYMUS. Microbial pathogen data sheets: Staphylococcus aureus. New Zealand Food Safety Authority, Wellington, NEW ZEALAND. Plný text tiež na adrese: 3. ASPERGER, H. - ZANGERL, P. Staphylococcus aureus. In: Encyclopedia of Dairy Science. Academic Press, 2002, s BARANYI, J. ROBERTS, T.A. - MCCLURE, P. A non- autonomous differential equation to model bacterial growth. Food Microbiology. Roč.10, (1993), s BUCHANAN, R.L. Predictive food microbiology. In: Trends in Food Science & Technology. Roč. 4, č. 1 (1993), s GÖRNER, F. VALÍK, Ľ. Aplikovaná mikrobiológia požívatín. 1. vyd. Bratislava: Malé Centrum, s. ISBN CHEN, C.S. Water Activity Concentration Models for Solutions of Sugar, Salts and Acids. In: Journal of Food Science. Roč. 54, č. 5 (1989), s LEMARC, Y. Osobné zdelenie. Norwich MCKELLAR, R.C. - LU, X. Primary Models. In: Modeling Microbial Responses in Food. London: CRC Press, 2004, s MCMEEKIN, T.A. - BROWN, J. - KRIST, K. - MILES, D., NEUMEYER, K. - NICHOLS, D.S. - OPLET, J. - PRESSER, K. - RATKOWSKY, D.A. - ROSS, T. Quantitative Microbiology: A Basis for Food Safety. In: Emmerging Infectious Diseases. Roč. 3, č. 4 (1997), s MONOD, J. The growth of bacterial cultures. Annual Review of Microbiology. Roč. 3, (1949), s COMMISSION REGULATION (EC) 2073/2005 of 15 November 2005 on microbiological criteria for foodstuffs. Official Journal of the European Union (2005). Plný text tiež na adrese: ROBERTS, T.A. Microbial Growth and Surfoval: Developments in Predictive Modelling. In International Biodeteriation & Biodegradation. (1995), s ROSS, T. - DALGAARD, P. Secondary Models. In: Modeling Microbial Responses in Food. London: CRC Press, 2004, s

115 15. ROSS, T. - MCMEEKIN, T.A. Predictive microbiology. International Journaof Food Microbiology. Roč. 23, (1994), s StatSoft, Inc. (2004). STATISTICA Cz [Softwarový systém na analýzu dat], verze STN ISO Mikrobiológia. Všeobecné pokyny na stanoveni počtu baktérií Staphylococcus aureus. Metóda počítania kolónií. Slovenský ústav technickém normalizácie, 1997, 16 s. 18. VALÍK, Ľ. - GÖRNER, F. Predpovedná mikrobiológia. Bulletin potravinárskeho výskumu. Roč. 34, č.3-4 (1995), s VALÍK, Ľ. GÖRNER, F. SONNEVELD, K. POLKA, P. Faktory ovplyvňujúce fermentáciu ovčieho hrudkového syra na salaši. In: Celostátní přehlídky sýrů, 2004: Výsledky přehlídek a sborník přednášek semináře Mléko a sýry Ed.: J. ŠTĚTINA, L. ČURDA L. Praha: Česká společnost chemická, 2004, s ISBN Kontaktná adresa: Doc. Ing. Valík Ľubomír PhD., Ing. Bajúsová Barbora, FCHPT STU, Radlinského 9, Bratislava, SR 119

116 ZMĚNY ZÁKLADNÍCH UKAZATELŮ KVALITY OVČÍHO MLÉKA V PRŮBĚHU LAKTACE Dragounová Hedvika 1, Hejtmánková Alena 2 1 Katedra kvality zemědělských produktů, 2 Katedra chemie, Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů, ČZU v Praze THE CHANGES OF BASIC QUALITY INDICATORS OF SHEEP MILK DURING THE LACTATION PERIOD Summary: The analysis of the sheep milk has confirmed that the sheep milk contains more fat, proteins, casein and solid (including solid without fat) than the cow milk. The quantity of milk sugar in cow and sheep milk is almost the same. The milk yield during the lactation period fluently decreases, but the quantity of fat, proteins, casein, solid and fatless solid increases, although the participation of casein in proteins in sheep milk during the lactation period decreases. The participation of amino acids in proteins in sheep milk is a little different than the participation of amino acids in proteins in cow milk. The participation of amino acids, which are including sulphur (that means cysteine and methionine), is higher. The participation of glutamic acid and glutamine is lower.. Úvod V současnosti dochází v České republice k rozvoji chovu ovcí. I když nadále chov ovcí v porovnání s ostatními komoditami živočišné produkce představuje poměrně malý objem, jsou výrobky z ovčího mléka velmi vhodné zejména pro obohacení sortimentu potravin a je žádoucí jejich zařazování do běžného jídelníčku pro jejich nutriční hodnotu a podpůrné léčebné účinky. Ovčí mléko se skládá ze základních částí tekutiny (plazmy) a malých rozptýlených koloidních částí. Jedná se o biologickou tekutinu, která obsahuje přibližně 200 účinných látek: 20 aminokyselin, 60 masných kyselin, 45 minerálií, 25 vitamínů (největší zastoupení mají vitamíny skupiny A, B 1, B 2, B 12 a C), 5 sacharidů (4 6 % laktózy), enzymy a hormony (Horák et al., 2004) Ovčí mléko obsahuje v porovnání s kravským mlékem více tuku (6 9 %), minerálií (0,93 %), bílkovin (6 6,8 %) a přirozeně s touto skutečností stoupá i obsah sušiny (17 21 %). Vyšší nutriční hodnota z pohledu celkového obsahu bílkovin je umocněna dvoj- až trojnásobným obsahem syrovátkových bílkovin s početným zastoupením aminokyselin obsahujících síru. Kasein z celkového obsahu bílkovin tvoří % (Podhorský, 1993). Analýzy ovčího mléka potvrdily i vysoký obsah vápníku, zinku a jodu, který je uváděn v literatuře (Polychroniadou et al., 1985; Rincon et al., 1994; Hampel et al., 2004; Španik a Margetín, 2004). V porovnání s kravským mlékem je obsah vápníku asi o 70 % vyšší. Vyšší je i obsah hořčíku a fosforu. Ovčí mléko má rovněž příznivé spektrum mastných kyselin. Jedná se především o n-3 mastné kyseliny s krátkým a středním řetězcem a konjugovanou kyselinu linolovou (CLA), jejíž obsah se mění podle výživy ovce. Mastné kyseliny se středním řetězcem jsou obsažené v ovčím mléce jsou pro lidský organismus snadno stravitelné a mohou se uplatnit při léčení nemocí trávicího traktu. Zvýšené podíly n-3 kyselin se projevují vytvářením eikosanoidů řady n-3 s příznivými protizánětlivými, antitrombotickými a tuky snižujícími účinky. Předpokládá se, že odlišné složení mastných kyselin vede k lepší absorpci laktózy, což má velký význam pro lidi s mírnou laktózovou intolerancí. Ovčí mléko má rovněž vysoký podíl kyseliny máselné (Hampel et al., 2004). Ovčí mléko má typickou vůni a příjemnou nasládlou chuť, je určeno především pro výrobu mnoha druhů sýrů. Základním je sýr hrudkový. Na 1 kg hrudkového sýra je třeba přibližně 5 kg mléka. Z hrudkového sýra se dále vyrábí brynza, parenica, oštěpky, rokfór a camembert. Vedlejším produktem při výrobě sýrů je syrovátka žinčica, z které se vyrábí nápoj. Světová produkce ovčího mléka je odhadována na 8 miliard kilogramů ročně. Délka laktačního období je různá, pohybuje se v rozsahu dní. Na produkci mléka má vliv plemenná příslušnost, pořadí a délka laktace, četnost vrhu, výživa, zdravotní stav a způsob dojení. Množství mléka za laktaci u dojených ovcí dosahuje v průměru 120 kg. Specializovaným dojným plemenem je plemeno východofríské, které má dojivost kg (Štolc a Nohejlová, 2003). 120

117 Metody V letech 2004 a 2005 byly v průběhu laktačního období sledovány základní ukazatele kvality ovčího mléka, tj. tuk, bílkoviny a laktóza, a množství nadojeného mléka (nádoj). V roce 2005 byly sledované ukazatele doplněny o stanovení obsahu sušiny, tukuprosté sušiny a kaseinu. Současně bylo opakovaně sledováno procentuální zastoupení jednotlivých aminokyselin v proteinech ovčího mléka po kyselé hydrolýze bílkovin. Základní ukazatele kvality ovčího mléka byly stanovovány na přístroji Milko-Scan 133B, kasein byl stanovován na přístroji Milko-Scan FT 120. Obsah jednotlivých aminokyselin v ovčím mléce byl stanoven metodou HPLC na reverzní fázi C 18 s fluorescenční detekcí po kyselé hydrolýze bílkovin a prekolonové derivatizaci vzorku podle standardního operačního postupu firmy Waters. K analýzám bylo odebíráno mléko ovcí východofríského plemene chovaného na farmě, která se nachází v chráněné krajinné oblasti východních Čech. Krmná dávka byla složena z pastevního porostu s přídavkem sena a jádra (ječmen). Ovce byly na pastvě společně s jehňaty. Výsledky a diskuse Hodnoty základních ukazatelů kvality ovčího mléka sledované v průběhu laktačního období v roce 2004 (květen září) a v roce 2005 (červen říjen ) jsou uvedeny v tabulkách I a II. Tabulka I Hodnoty základních ukazatelů kvality ovčího mléka rok 2004 Ukazatel Květen Červen Červenec Srpen Září Tuk Rozmezí 3,08 4,54 4,16 5,59 4,42 6,15 5,62 7,02 5,2 8,28 [%] Průměr 4,22 4,97 5,22 6,30 6,92 Bílkoviny Rozmezí 3,32 5,02 4,58 5,44 3,97 5,07 4,45 5,34 4,41 5,82 [%] Průměr 4,45 5,05 4,83 4,97 5,22 Laktóza Rozmezí 4,58 6,28 4,73 5,24 4,72 5,50 4,77 5,01 4,08 4,71 [%] Průměr 5,26 5,06 5,06 4,90 4,42 Nádoj Rozmezí 2,2 3,1 2,0 3,0 1,5 2,6 0,9 2,0 0,4 1,2 [litry] Průměr 2,8 2,5 2,0 1,4 0,7 Analýzy ovčího mléka potvrdily vyšší obsah tuku, bílkovin, kaseinu a sušiny, včetně tukuprosté sušiny ve srovnání s mlékem kravským. Obsah laktózy je srovnatelný s obsahem laktózy v mléce kravském. Množství nadojeného mléka a obsah laktózy v průběhu laktačního období plynule klesá. Na začátku laktačního období je množství nadojeného mléka zhruba čtyřnásobné ve srovnání s koncem laktačního období. Průměrný obsah laktózy v obou letech v průběhu laktačního období shodně klesl o 19 %. Obsah tuku, bílkovin, kaseinu, sušiny a tukuprosté sušiny i přes drobné výkyvy naopak stoupá. I když obsah kaseinu v průběhu laktačního období stoupá, jeho procentuální zastoupení v proteinech ovčího mléka v průběhu laktačního období klesá z cca 89 % na 65 %. Průměrné procentuální zastoupení kaseinu v proteinech ovčího mléka za celé sledované období bylo 76,55 %. Průměrné zastoupení kaseinu v proteinech kravského mléka je podle Velíška (2002) 80 %, průměrné procentuální zastoupení kaseinu v proteinech mléka kravského a ovčího je tedy přibližně stejné. 121

118 Tabulka II Hodnoty základních ukazatelů kvality ovčího mléka rok 2005 Ukazatel Červen Červenec Srpen Září Říjen Tuk Rozmezí 5,07 7,48 5,02 6,66 4,28 5,96 7,54 9,36 6,95 10,9 [%] Průměr 6,95 5,95 5,05 8,43 9,25 Bílkoviny Rozmezí 3,98 5,40 4,37 5,20 4,59 5,88 7,11 8,62 7,30 9,56 [%] Průměr 4,78 4,81 5,60 7,98 8,61 Kasein Rozmezí 3,54 4,59 3,86 4,68 3,64 4,41 4,52 5,77 4,95 6,21 [%] Průměr 4,15 4,29 4,08 5,29 5,64 Laktóza Rozmezí 4,22 5,78 4,48 5,08 4,27 4,88 3,85 4,28 3,97 4,22 [%] Průměr 4,86 4,79 4,48 4,00 4,09 Sušina Rozmezí 14,2 19,4 13,6 18,0 13,3 18,6 17,6 23,7 19,2 27,4 [%] Průměr 17,13 16,09 15,67 21,00 22,80 TPS Rozmezí 8,63 12,1 8,32 12,3 9,08 13,1 10,7 14,7 11,5 15,6 [%] Průměr 10,18 10,15 10,62 12,91 13,55 Nádoj Rozmezí 2,2 3,0 2,1 2,8 1,6 2,3 0,7 2,0 0,2 1,0 [litry] Průměr 2,7 2,4 2,0 1,5 0,6 Nejvyšší procentuální nárůst během laktačního období byl zaznamenán v případě bílkovin v roce 2005 (o 80 %) a tuku v roce 2004 (o 63 %). V roce 2005 procentuální nárůst tuku, sušiny, tukuprosté sušiny a kaseinu činil shodně 33 %. V roce 2005 bylo procentuální zastoupení tuku a bílkovin v ovčím mléce výrazně vyšší než v roce 2004, naopak množství laktózy v roce 2005 bylo ve srovnání s předchozím rokem cca o 8 % méně. V průběhu laktačního období bylo opakovaně metodou HPLC po kyselé hydrolýze bílkovin sledováno zastoupení jednotlivých aminokyselin. Celkový obsah stanovených aminokyselin byl v dobré shodě s procentuálním obsahem bílkovin stanoveným na přístroji Milko- Scan 133B a měnil se v závislosti na době odběru, procentuální zastoupení jednotlivých aminokyselin zůstávalo v rámci experimentální chyby stanovení stejné. V tabulkách III a IV je uvedeno průměrné zastoupení jednotlivých esenciálních a neesenciálních aminokyselin v proteinech ovčího mléka (s výjimkou tryptofanu, který se po kyselé hydrolýze rozkládá a je tímto postupem nestanovitelný). Tabulka III Zastoupení esenciálních aminokyselin v ovčím mléce Aminokyselina [%] Thr Val Met Lys Ileu Leu Phe 3,45 7,08 3,19 8,07 5,54 9,93 4,84 42,10 Tabulka IV Zastoupení ostatních aminokyselin v ovčím mléce Aminokyselina [%] Asx Ser Glx Gly His Arg Ala Pro Cys Tyr 7,02 2,68 17,4 2,06 2,86 3,76 3,65 10,2 4,31 3,91 Stanovené procentuální zastoupení aminokyselin v proteinech ovčího mléka se mírně liší od procentuálního zastoupení aminokyselin v proteinech ovčího i kravského mléka uváděného Velíškem (2002) i od procentuálního zastoupení aminokyselin v proteinech kravského i kozího mléka, které bylo sledováno v rámci výzkumného záměru MSM (Hejtmánková et al., 2004), a to především v zastoupení serinu, glutaminu, argininu, cysteinu, tyrosinu a methioninu. 122

119 Zatímco procentuální zastoupení serinu, glutaminu, a tyrosinu je nižší, zastoupení argininu a především aminokyselin cysteinu, ale i methioninu, tedy aminokyselin obsahujících síru je vyšší, což je v dobré shodě s tvrzením Podhorského (1993). Celkové procentuální zastoupení esenciálních aminokyselin v ovčím mléce ve srovnání s hodnotou uváděnou Velíškem je rovněž nižší a odpovídá celkovému procentuálnímu zastoupení esenciálních aminokyselin v mléce kozím. Závěr Analýzy ovčího mléka potvrdily vyšší obsah tuku, bílkovin, kaseinu a sušiny, včetně tukuprosté sušiny ve srovnání s mlékem kravským. Obsah laktózy je srovnatelný s obsahem laktózy v mléce kravském. Množství nadojeného mléka a obsah laktózy v průběhu laktačního období plynule klesá, obsah tuku, bílkovin, kaseinu, sušiny a tukuprosté sušiny i přes drobné výkyvy naopak stoupá, přestože procentuální zastoupení kaseinu v proteinech ovčího mléka v průběhu laktačního období klesá. Zastoupení jednotlivých aminokyselin v proteinech ovčího mléka se mírně liší od zastoupení jednotlivých aminokyselin v proteinech mléka kravského, vyšší je především zastoupení aminokyselin obsahujících síru, tj. cysteinu a methioninu, nižší je naopak zastoupení kyseliny glutamové společně s glutaminem. Použitá literatura:. 1. Hampel K., Schöne F., Böhm M., Leiterer M., Jahreis G. (2004): Zusammensetzung und ernährung physiologische Bedeutung von Schafmilch und Schafmilchproduktion. Dtsch. Lebensm. Rdsch. 100(11): Hejtmánková A., Trnková E., Dragounová H. (2004): Obsah aminokyselin v proteinech kravského a kozího mléka. In: Den mléka 2004 Sborník referátů ze semináře s mezinárodní účastí. ČZU v Praze, Praha 2004, Horák F. a kol. (2004): Ovce a jejich chov. Nakladatelství Brázda, s.r.o. Praha. 4. Podhorský M. (1993): Zdravotní přednosti ovčího a kozího mléka. Průmysl potravin. 44(4): Polychroniadou A., Vafopoulou A. (1985): Variation of major mineral constituents of ewe milk during lactation. J. Dairy Sci. 68: Rincon F., Moreno R., Zurera G., Amaro M. (1994): Mineral composition as a characteristic for identification of animal origin of raw milk. J. Dairy Res. 61: Španik J., Margetín M. (2004): Niekoľko faktov o ovčiem mlieku. In: Farmářská výroba sýrů a kysaných mléčných výrobků. Sborník referátů ze semináře s mezinárodní účastí. MZLU v Brně, Brno, Štolc L., Nohejlová L. (2003): Mléčná užitkovost ovcí. In: Den mléka 2003 Sborník referátů ze semináře s mezinárodní účastí. ČZU v Praze, Praha 2003, Velíšek J. (2002): Chemie potravin 1. OSSIS Tábor. Práce vznikla za finanční podpory výzkumného záměru MSM Kontaktní adresa: HEDVIKA DRAGOUNOVÁ, Česká zemědělská univerzita v Praze, Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů, Praha 6-Suchdol, Česká republika, tel.: , fax: , e mail: dragounova@af.czu.cz 123

120 VYUŽITÍ FT-NIR V ANALÝZE PASTEROVANÉHO KOZÍHO MLÉKA Hadra Luboš, Dračková Michaela, Janštová Bohumíra, Navrátilová Pavlína, Vorlová Lenka Ústav hygieny a technologie mléka, Fakulta veterinární hygieny a ekologie VFU Brno USE OF FT-NIR TO ANALYSIS OF PASTEURIZED GOAT MILK Summary: Determination of major components of foodstuff by classical analytical methods is slow and expensive. The main advantages of near-infrared spectroscopy for food analysis lie in its speed, the absence of the use of chemicals. The aim of our study was to determine the major components of pasteurized goat milk by NIR spectroscopy. For monitored components was created calibration models, which was evaluated statistically on the basis of correlation coefficients (R) and standard errors of calibrations (SEC). Following statistical values were obtained: R = 0,968 and SEC = 0,087 for fat content, R = 0,984 and SEC = 0,008 for lactose, R = 0,985 and SEC = 0,025 for proteins, R = 0,966 and SEC = 0,113 for total solids, R = 0,897 and SEC = 0,073 for non-fat solids and R = 0,989 and SEC = 0,102 for titratable acidity. The developed calibration models were verified by cross-validation. Study showed, that FT-NIR is a potentially useful technique for evaluating of pasteurized goat milk composition. ÚVOD Oblíbenost kozího mléka neustále vzrůstá, ať už pro jeho chuť, stravitelnost nebo jako alternativu kravského mléka pro osoby s alergiemi na kravské mléko. Sledování fyzikálněchemických parametrů mléka je důležité, pro posouzení jeho kvality a vhodnosti k výrobě různých mléčných výrobků 1. NIR spektroskopie nabízí řadu výhod oproti tradičním chemickým metodám. Jedná se o fyzikální, nedestruktivní metodu, kde příprava vzorků je minimalizována nebo zcela eliminována. Další výhody představují úspora práce, času a materiálu, snadná obsluha a možnost měření vzorků i přes transparentní obaly. Jedno spektrum je použitelné ke kvantitativnímu stanovení více složek i kvalitativní analýze 2,3. Cílem naší práce je sestavení kalibračních modelů pro stanovení obsahu tuku, laktózy, bílkovin, sušiny tukuprosté sušiny a titrační kyselosti pomocí FT-NIR v pasterovaném kozím mléce. METODIKA Byl sledován obsah tuku, laktosy, bílkovin, sušiny, tukuprosté sušiny a titrační kyselosti v pasterovaném kozím mléce. Hodnoty pro kalibraci FT-NIR byly stanoveny pro obsah tuku, laktózy a bílkovin podle normy ČSN stanovení složení mléka infračerveným absorpčním analyzátorem na přístroji Bentley 2500 (Bentley Instruments, Minnesota, USA), sušinu podle normy ČSN ISO , titrační kyselost podle ČSN a tukuprostá sušina odečtením obsahu tuku od sušiny. Vzorky mléka byly proměřeny na spektrometru NIR Nicolet Antaris (Thermo electron Corporation, Madison, USA) ve spektrálním rozsahu cm -1 se 100 scany. Čas snímání jednoho spektra se pohyboval okolo 1,5 min. Spektra byla měřena na integrační sféře v režimu reflektance s použitím transflektanční kyvety o tloušťce vrstvy 0,1 mm. Vzorky byly temperovány na 40 C, promíchány a po ochlazení na 20 C byly přeneseny na Petriho misky. Naměřená data byla zpracována pomocí programu TQ Analyst verze Ke statistickému vyhodnocení dat byl použit statistický a grafický software STAT Plus

121 VÝSLEDKY A DISKUZE Kalibrační modely byly vytvořeny pomocí PLS algoritmu. Spolehlivost jednotlivých kalibračních modelů byla následně ověřena cross-validací. Základní údaje o souboru vzorků jsou uvedeny v tabulce I. Tabulka I Základní statistické údaje n Průměr Sm. odchylka Min Max Tuk (%) 44 3,05 0,41 2,38 4,70 Laktóza (%) 46 4,54 0,07 4,16 4,65 Bílkoviny (%) 44 2,80 0,15 2,42 3,20 Sušina (%) 36 11,24 1,00 10,30 16,62 TPS (%) 35 7,95 0,31 7,32 8,96 TK ( SH) 36 5,6 0,7 4,4 7,2 TPS tukuprostá sušina; TK titrační kyselost; n počet vzorků Vzorky, u kterých byla nepřesně stanovena referenční hodnota nebo se objevila odchylka ve změřeném spektru, byly vyřazeny pomocí diagnostického nástroje spektrum outlier a leverage. V kalibračním modelu bylo vyřazeno 7 vzorků pro tuk, sušinu a tukuprostou sušinu, 9 vzorků pro laktózu, 2 vzorky pro bílkoviny a 5 vzorků pro titrační kyselost. Kalibační modely pro laktózu a tukuprostou sušinu byly vytvořeny z 2. derivací spekter, v případě bílkovin byly použity 1. derivace spekter. Byly zjištěny korelační koeficienty (R) a směrodatné odchylky kalibrace (SEC) pro následující parametry pasterovaného kozího mléka: pro tuk R = 0,968 a SEC = 0,087 (Obr. 1), počet PLS faktorů 7, pro laktózu R = 0,984 a SEC = 0,008, počet PLS faktorů 2, pro bílkoviny R = 0,985 a SEC = 0,025, počet PLS faktorů 6, pro sušinu R = 0,966 a SEC = 0,113, počet PLS faktorů 7, pro tukuprostou sušinu R = 0,897 a SEC = 0,073, počet PLS faktorů 3 a pro titrační kyselost R = 0,989 a SEC = 0,102, počet PLS faktorů 4. Pro vytvoření validačního modelu metodou křížové validace byla použita stejná sada vzorků jako pro kalibraci. Validace ověřuje spolehlivost kalibračního modelu a je charakterizována směrodatnou odchylkou validace (SECV). V křížové validaci byly zjištěny následující hodnoty: pro tuk R = 0,942 a SECV = 0,115, pro laktózu R = 0,902 a SEC = 0,020, pro bílkoviny R = 0,900 a SEC = 0,064, pro sušinu R = 0,933 a SEC = 0,158, pro tukuprostou sušinu R = 0,643 a SEC = 0,128 a pro titrační kyselost R = 0,951 a SEC = 0,220. Dalším kritériem pro posouzení použitelnosti kalibrace v NIR spektroskopii je kalibrační variační koeficient (CCV) a hodnota predikčního koeficientu (PCV) a neměly by přesáhnout hodnoty CCV 5 % a PCV 10 % 8. Limitní hodnoty nebyly překročeny pro žádný stanovovaný parametr (tabulka II). Tabulka II Hodnoty CCV a PCV pro jednotlivé parametry pasterovaného kozího mléka Stanovovaný parametr CCV (%) PCV (%) Tuk 2,87 3,87 Laktóza 0,18 0,45 Bílkoviny 0,90 2,32 Sušina 1,01 1,42 TPS 0,93 1,61 TK 1,80 3,88 125

122 y = x R 2 = Predikované hodnoty [%] y = x R 2 = Laboratorní hodnoty [%] Kalibrace Cross-validace Lineární (Kalibrace) Lineární (Cross-validace) Obr. 1 Kalibrační a validační modely pro bílkovinu. Výsledky referenčních hodnot vzorků a vypočítaných hodnot pomocí NIR, byly statisticky vyhodnoceny pomocí párového T-testu v programu STAT plus 7. Nebyly nalezeny statisticky významné rozdíly (p < 0,05) mezi referenčními hodnotami a vypočítanými hodnotami pomocí NIR. ZÁVĚR Z dosažených výsledků je zřejmé, že NIR spektroskopie je adekvátní technika k analýze pasterovaného kozího mléka. Úspěšnost při využití NIR spektroskopie závisí nejen na kvalitě přístroje, ale také na referenční metodě, standardní přípravě vzorku, jeho homogenitě a v neposlední řadě na kalibrační metodě. Byla zavedena kalibrační metoda pro stanovení obsahu tuku, laktózy, bílkovin, sušiny, tukuprosté sušiny a titrační kyselosti v pasterovaném kozím mléce. Použitá literatura: 1. DÍAZ-CARRILLO, E., MUÑOZ-SERRANO, A., ALONSO-MORAGA, A., SERRADILLA- MANRIQUE J.M. Near infrared calibrations for goat's milk components: protein, total casein, α s -, β- and κ-caseins, fat and lactose. J. Near Infrared Spectrosc., 1993, vol. 1, no. 3, p BÜNING-PFAUE, H. Analysis of water in food by near infrared spectroscopy. Food Chem., 2003, vol. 82, no. 1, p ŠUSTOVÁ, K., JANKOVSKÁ, R. Sledování obsahu kaseinu v mléce použitím FT NIR spektroskopie. Mlékařské listy, 2002, vol. 73, s ČSN Stanovení složení mléka infračerveným absorpčním analyzátorem. Vydal Český normalizační institut, Praha,

123 5. ČSN ISO 6731 Mléko, smetana a zahuštěné neslazené mléko Stanovení obsahu celkové sušiny (referenční metoda). Vydal Český normalizační institut, 1997, s ČSN Metody zkoušení mléka a tekutých mléčných výrobků. Vydal Úřad pro normalizaci a měření, Praha, 1995, s MATOUŠKOVÁ, O., CHALUPA, J., CÍGLER, M., HRUŠKA, K. STAT-Plus uživatelská příručka, verse 1.01., Veterinary Research institute, Brno, CR, s ALBANELL, E., CÁCERES, P., CAJA, G., MOLINA, E., GARGOURI, A. Determination of fat, protein and total solids in ovine milk by near-infrared spectroscopy. J AOAC Int, 1999, vol. 82, p Práce vznikla za podpory výzkumného záměru MSM Kontaktní adresa: Ing. Luboš Hadra, Ústav hygieny a technologie mléka Veterinární a farmaceutická univerzita Brno Palackého 1/3, Brno lhadra@vfu.cz 127

124 SENZORICKÁ ANALÝZA KOZÍCH SÝRŮ. Lužová Táňa 1, Šustová Květoslava 1, Kuchtík Jan 2 1 Ústav technologie potravin, 2 Ústav chovu hospodářských zvířat Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně ORGANOLEPTIC QUALITY OF GOAT S CHEESES Summary: The aim of work was to value sensory quality of fresh cheeses made from goat s milk. 14 cheeses were evaluated by specialized commission of 10 members. By the patterns were appraised the smell, the textural and overall taste. Accordance with expectation commission preferred relish cheeses. The relish component restricted the goat s smell and taste which o lot of people doesn t like. The best cheese in taste was for commission spicy cheese from Látal s farm. This cheese had very pleasant smell. With low smell from goat s milk and low strange smell. From textural characteristics commission preferred harder cheeses which were less adhesive. Ovčí a kozí mléko mléko představuje 4,25 % ze světové produkce mléka. Největší množství tohoto mléka se produkuje v Asii (KALANTZOPOULOS, 2003). Z čehož představuje asi 7 miliónů tun kozího mléka v Indii, Bangladéši, Iránu, Pákistánu, Turecku, Indonésii a Číně. Evropa je druhým největším producentem. Chov koz a ovcí je rozvinutý nejvíce v oblasti středozemního moře, hlavně v Řecku, Španělsku, Francii a Itálii. Tendence posledních let je taková, že se sice stavy mléčných koz a ovcí snížily, ale celková produkce mléka se zvýšila. Stavy koz a jejich produktivivou se zabývali někteří autoři ( DUBEUF a kol., 2004; BOYAZOGLU a kol., 2001). Mléko ovcí a koz se využívá zejména na výrobu sýrů. V České republice došlo ke zvýšenému zájmu o chov koz, za účelem produkce mléka, počatkem devesátých let minulého století. Chovatelé byli nuceni naučit se zpracovávat mléko na farmě, vzhledem k nezájmu mlékáren o tento druh mléka. Rovněž výrobky z kozího mléka nepatřily k tradičnímu sortimentu zboží, pro konzumenta tedy byly velkou neznámou. S rostoucím zájmem o racionální výživu se zvýšil i zájem o produkty z kozího mléka. V otázce sortimentu není Česká republika na takové úroni jako Francie nebo Itálie, nutno však říci, že čeští výrobci nemají obavy z pokusů vytvářet nové produkty. Při výrobě kozích čerstvých sýrů je nezbytné dodržovat důkladnou čistotu a zamezit tak vzniku vad. Jako jsou vady vnějšku (tvar, vady pokožky a kůry), dále vady vnitřku (barva těsta, dírkování, struktura, konzistence) a v neposlední řadě vady vůně a chuti. Vlastní senzorické hodnocení a sledování technologií výroby nám pak pomáhá předejít vadám výrobků. Senzorická analýza nám také pomáhá zjistit preference zákazníků. Ve světě se senzorickou analýzou kozích sýrů zabývali z hlediska vztahu krmení a laktace SORYAL a kol., 2004, z hlediska uchovávání kozích sýrů v modifikované atmosféře OLARTE a kol., Dále byl zkoumán vliv zrání kozích sýrů na jejich typickou chuť (GABORIT a kol., 2001), a vliv zrání na texturu a barvu (BUFFA a kol., 2001). Cílem naší práce bylo sledovat vybrané senzorické vlastnosti u kozích sýrů vyráběných na farmách. MATERIÁLY A METODY 2.1 Materiál Pro senzorickou analýzu byly použity sýry z různých farem, které byly hodnoceny v rámci semináře o farmářské výrobě sýrů a kysaných mléčných výrobků. Hodnoceno bylo celkem 14 vzorků převážně čerstvých sýrů s různými příchutěmi i bez ní. 128

125 2.2 Metody Metody senzorické Analýza byla provedena odbornou 10-ti člennou komisí v senzorické laboratoři na Ústavu technologie potravin. Dvě hodiny před hodnocením byly vzorky rozkrájeny na kousky velikosti 1x1x5 cm a až do doby hodnocení byly ponechány při pokojové teplotě, aby došlo k žádoucímu rozvoji chuti a aromatu. Analýza byla provedena za pomoci kategorové nestrukturované stupnice 10 cm dlouhé s popisem krajních bodů. Hodnoceny byly deskriptory vůně, textury, chuti, jako jsou celková příjemnost vůně, vůně po kozím mléku, vůně po ovčím mléku, cizí vůně, tvrdost mezi prsty, soudržnost, mazlavost a celková chuť Statistické metody Výsledky měření byly zpracovány v programu MS Excel a rovněž pomocí programu Unistat 5.5. U všech vlastností byly provedena analýza variance a mnohonásobné porovnávání Tukeyovým testem na hladinách pravděpodobnosti 95 a 99 %. Vzorky byly rovněž porovnávány korelační Pearsonovou analýzou. VÝSLEDKY A DISKUSE V této práci se sledovaly senzorické vlastnosti 14ti převážně čerstvých kozích sýrů, které byly dovezeny z různých farem na seminář o farmářské výrobě sýrů a kysaných mléčných výrobků. Hodnoceny byly deskriptory vůně, textury, chuti, a to konkrétně celková příjemnost vůně, vůně po kozím mléku, vůně po ovčím mléku, cizí vůně, tvrdost mezi prsty, soudržnost, mazlavost a celková chuť. Při vyhodnocování deskriptorů vůně byla zaznamenána vyšší variabilita, zejména u vůně po ovčím mléku a cizí vůně u všech vzorků, a také u kozí vůně u přírodního sýru ze Šošůvky a sýru s gyrosem, rovněž dovezený ze Šošůvky. Při hodnocení textury byla zaznamenána vyšší variabilita jen u mazlavosti v ústech u uzeného sýru z kozí farmy Štrbových. Zhoršení chutnosti sýrů způsobila vyšší intenzita cizích vůní. Existuje rovněž nepřímá závislost mezi příjemností vůně a vůní po kozím mléce.výjimkou jsou pouze dva vzory, sýr slaný zralejší (Hrbkovi) a sýr s koprem (Štrbovi), u nichž závislost prokázána nebyla. Byla zjištěna přímá závislost u texturních vlastností sýrů, a to tvrdost mezi prsty a soudržnost u lužického sýru (farma Žofín). U dvou sýrů sýr s nivou (Zelenská) a kmínový sýr (Štrbovi) naopak větší tvrdost mezi prsty znamenala menší soudržnost, která je patrná z nepřímé závislosti mezi těmito vlastnostmi. Sýry, které měly texturu více mazlavou, byly současně hodnoceny jako méně chutné (např. sýr přírodní ze Šošůvky, slaný zralejší sýr od Hrbkových, slaný sýr pana Koňaříka byly hodnoceny jako chutnější při nižší mazlavosti). Nejvyšší korelace byla dosažena mezi chutí a soudržností mezi prsty u vzorku sýru s nivou od paní Zelenské (0,67). Jako nejchutnějším byl ohodnocen sýr čerstvý kořeněný od Látalových. Svou vůní byl hodnocen jako velmi příjemný, vůně po kozím, ovčím mléce i cizí vůně byly hodnoceny minimálně. V tvrdosti mezi prsty se jevil vzorek tvrdším při nižší mazlavosti. Další vzorky, které byly hodnoceny jako chutné byly sýr kmínový (Štrbovi), sýr s gyrosem (Šošůvka) a sýr s koprem (Štrbovi). U těchto sýrů nebyl již příjemnost vůně tak výrazná, zapříčiněná silnějším pachem po kozím mléce. V texturních vlastnostech byly sýry od předchozího méně tvrdé a více mazlavé. Negativně byl hodnocen, co se chutnosti týče, sýr s nivou (Zelenská). Převažovala velmi silná vůně po kozím mléce a rovněž byla zaznamenána přítomnost cizích pachů. U tohoto sýru nebyly hodnoceny příliš pozitivně ani texturní vlastnosti. Slaný sýr zralejší (Amalthea) byl také hodnocen jako nepříliš chutný. Při hodnocení jeho vůně byl zaznamenán zvýšený pach po kozině a silná cizí vůně. U texturních vlastností byla zjištěna nízká tvrdost a vysoká mazlavost. Při porovnání výsledků hodnocení neochucených a ochucených sýrů, hodnotitelé upřednostňovali ochucené sýry. U těchto vzorků použitá ochucující složka omezila vůni a chuť po kozině, které jsou při vyšší intenzitě často brány jako nepříjemné. 129

126 ZÁVĚR Podle očekávání byly hodnoceny dobře především sýry ochucené. Nejméně voněl po kozině sýr s gyrosem (Šošůvka) a sýr s koprem (Štrbovi). Tyto dva vzorky byly rovněž hodnoceny jako příjemně vonící, jako i většina ostatních vzorků. Nejslabším vzorkem v příjemnosti vůně se stal sýr s nivou (Zelenská). Tento sýr byl i nejméně chutným, byl více cítit po mléce kozím a zaznamenal vyšší intenzitu cizích vůní. Zřetelně se na tomto vzorku projevila technologie výroby, kdy byla do sýru přidána plísňová kultura. Tím se zvýšila intenzita pachu i chuti po kozině, které tak přispěly ke zhoršení celkové chuti. Nejchutnějším vzorkem se stal sýr kořeněný (Látalovi). Vzorek sýru velmi příjemně voněl. Kozina i cizí vůně byly hodnoceny s nejnižší intenzitou. Při hodnocení texturních vlastností komise preferovala sýry, které byly více tvrdé. Sýry tvrdší byly méně mazlavé a komise je hodnotila i jako chutnější. Tuto skutečnost dokazuje i nejchutnější sýr sýr kořeněný (Látalovi) i druhý nejchutnější sýr kmínový (Štrbovi), u nichž se projevila větší tvrdost a menší mazlavost. Na základě výsledků senzorického hodnocení je patrné, že v oblasti hodnocení kozích sýrů není u nás tolik zkušeností jako se sýry z mléka kravského. Je jisté, že výroba kozích sýrů půjde do popředí zájmu. Každá senzorická analýza je nezbytným krokem vedoucím k zlepšování kvality výrobků. Je nutné se oblastí senzorického hodnocení výrobků z kozího mléka zabývat častěji. REFERENCE DUBEUF, J.-P., MORAND-FEHR, P., RUBINO, R. Situation, changes and future of goat industry around the world, Small ruminant research, 2004, 51, s BOYAZOGLU, J., MORAND-FEHR, P. Mediterian dairy sheep and goat products and their quality, Small ruminant research, 2001, 40, 1, s.1-11 KALANTZOPOULOS, G. Kvalita ovčieho a kozieho mlieka z pohl adu IDF, Mliekarstvo, 2003, 34, 4, s SORYAL, K.A., ZENG, S.S., MIN, B.R., HART, S.P. Effect of feeding treatments and lactation composition and organoleptic quality of goat milk Domiati cheese, Small ruminant research, 2004, 52, 1-2, s OLARTE, C., GONZALES-FANDOS, E., SANZ, S. A proposed methodology to determine the senzory quality of a fresh goat s cheese (Cameros cheese): application to cheese packaged under modified atmospheres, Food quality and preference, 2001, 12, s GABORIT, P., MENARD, A., MORGAN, F. Impact of ripening strains on the typical flavour of goat cheese, International dairy journal, 2001, 11, 4-7, s BUFFA, M.N., TRUJILLO, A.J., PAVIA, M., GUAMIS, B. Changes in textural, microstructural, and colourr characteristic during ripening of cheese made from raw, pasteurized or high-pressuretreated goat s milk, Iternational dairy journal, 2001, 11, 11-12, s Kontaktní adresa: Ing. Táňa Lužová, Ing. Květoslava Šustová, PhD., Department of Food Technology, Doc. Dr. Ing. Jan Kuchtík, Department of Animal Breeding, Mendel University of Agriculture and Forestry Brno, Zemědělská 1, Brno, Czech Republic, Tana.Luzova@centrum.cz 130

127 SPOTREBITEĽSKÝ TEST KOZIEHO SYRA Staruch Ladislav, Schmidt Štefan, Sekretár Stanislav, Greif Gabriel, Mastihuba Vladimír, Greifová Mária Katedra potravinárskej technológie, FCHPT STU Bratislava, Slovenská republika CONSUMER TEST ON GOAT CHEESE Summary: Portugal goat cheese produced either by traditional method or by procedures employing ohmic heating were evaluated according to their after one month of maturation. Following sensoric properties were chosen for evaluation: appearance, odour, flavour, texture, aftertaste and overall quality. Key words: Conventional and Ohmic manufactured goat cheese Senzoricky boli porovnávané kozie syry portugalskej proveniencie vyrábané tradičným postupom a postupmi využívajúcimi odporový ohrev po jednom mesiaci zrenia pričom ako senzorické ukazovatele bol hodnotený vzhľad, vôňa, chuť, textúra, doznievanie chuti a celkový dojem. Hedonická stupnica zahrňovala 9 hodnotiacich bodov od Dislike extremely (1. stupeň) po Like extremely (9. stupeň). Na základe výsledkov 100 hodnotiteľov zo štyroch štátov (Írsko, Portugalsko, Slovensko, Švédsko) boli oba typy syrov vyhodnotené ako senzoricky podobné alebo prijateľnejšie oproti konvenčným syrom, s ktorými sa hodnotitelia doteraz stretli, predovšetkým vďaka menej výraznej aróme typickej pre fermentované výrobky z kozieho mlieka. Väčšina hodnotiteľov ohodnotila tieto syry atribútmi like alebo like very much (7. a 8. stupeň) pričom neboli signifikantné rozdiely medzi konvenčným syrom a syrom vyrobeným pomocou odporového ohrevu. Írski konzumenti hodnotili tieto syry výrazne nižšie ako slovenskí a portugalskí konzumenti. Švédski konzumenti hodnotili tiež konvenčne vyrobené syry zrejúce dva mesiace a syry so zníženým obsahom tuku zrejúce jeden mesiac, pričom neboli hedonické rozdiely medzi syrom zrejúcim jeden a dva mesiace. Na hodnotenie v každej zo štyroch hodnotiteľskych krajín boli použité rovnaké hodnotiteľské hárky s príslušnými hedonickými stupnicami a rovnakým servírovaním. ( 100 g syra z každého typu, pohár pitnej vody, pečivo) 131

128 Kozí syr Hodnotiteľ číslo: C. muž žena D. Vek: < Mimoriadne sa mi nepáči 2. Veľmi sa mi nepáči 3. Nepáči sa mi 4. Trochu sa mi nepáči 5. Ani páči ani nepáči 6. Trochu sa mi páči 7. Páči 8. Veľmi sa mi páči 9. Mimoriadne sa mi páči VZORKA Č. : E. Vzhľad F. Aróma G. Chutnosť H. Textúra I. Dochuť J. Celková kvalita Sem môžete pridať vlastné poznámky o kvalite vzorky: 132

129 Kozí syr Odpovedajte na otázky, označte možnosť/možnosti, s ktorými súhlasíte. L. Ako časte jete kozí syr? Denne 1-2 razy za týždeň 1-2 rezy za mesiac 2-5 krát za rok M. Ktorý parameter kvality je pre vás najdôležitejší? Vzhľad Aróma Chutnosť Textúra Dochuť N. Čo si myslíte o kvalite tohto produktu v porovnaní s kozím syrom, ktorý zvyčajne kupujete? Oveľa lepšia Lepšia Rovnaká Horšia Oveľa horšia O. Kúpili by ste si produkt, ako je tento? Určite áno Myslím si, že áno Možno Asi nie Určite nie P. Čo ovplyvňuje vašu voľbu pri nákupe kozieho syra? Kvalita Značka Cena Iné; čo Q. Prosím označte jeden alebo viacero z dôvodov, o ktorých si myslíte, že sú hodné zaplatenia vyššej ceny: Neprítomnosť aditív Nová metóda úpravy, ktorá zlepší chuť výrobku Pôvod z miestnej výroby Postup výroby, ktorý je šetrný k prostrediu Pôvod z manuálnej malovýroby R. Akú cenu by ste boli ochotný/ochotná zaplatiť za kg takéhoto výrobku? S. Koľko stojí kg kozieho syra (syra), ktorý zvyčajne kupujete? 133

130 Skladba jednotlivých hodnotiteľov Frequency Gender Male 80 Female Ireland Portugal Slovakia Sweden Country Frequency Age < Ireland Portugal Slovakia Sw eden Country Čo si myslíte o kvalite daného produktu v porovnaní s bežne kupovaným kozím syrom? Frequency IE conv P conv SLK conv Much better Better The same Poorer Much poorer Frequency IE ohm P ohm SLK ohm Much better Better The same Poorer Much poorer Kúpili by ste si produkt, ako je tento? 60 Conventional goat cheese 60 Ohmic goat cheese Frequency IE conv P conv SLK conv Yes, I surely would Yes, I think so Perhaps Probably not Absolutely not Frequency IE ohm P ohm SLK ohm Yes, I surely would Yes, I think so Perhaps Probably not Absolutely not 134

131 Väčšina hodnotiteľov pozitívne hodnotila testované syry a je ochotná v predkladanej kvalite si ich aj kúpiť za primeranú cenu. Respondenti nepostrehli signifikantné rozdiely medzi ohmicky vyrábaným kozím syrom a konvenčnou výrobou. Írski konzumenti hodnotili tieto syry výrazne nižšie ako slovenskí a portugalskí konzumenti. Čo ovplyvňuje vašu voľbu pri nákupe kozieho syra? Frequency Ireland Portugal Slovakia Sweden Quality Trademark Price Other; what Vo všetkých štyroch krajinách kvalita bola ten parameter, ktorý respondenti (60-70%) určili ako dominantný pre kúpu tovaru. Záverom môžme konštatovať, že ohmický spôsob výroby kozieho syra, ktorý je doposiaľ výrobným tajomstvom, prispieva k rovnomernému, regulovanému a definovanému tepelnému opracovaniu suroviny s požadovanými senzorickými vlastnosťami. Literatúra na vyžiadanie u autora. Kontaktná adresa : Staruch Ladislav KPT FCHPT STU Radlinského Bratislava 135

132 VLIV VYBRANÝCH UKAZATELŮ KVALITY MLÉKA NA JAKOST SÝŘENINY U OVCÍ KŘÍŽENEK PLEMEN LACAUNE A VÝCHODOFRÍSKÁ OVCE Novotná Lenka 1, Kuchtík Jan 1, Růžičková Jana 2 1 Ústav chovu a šlechtění hospodářských zvířat, 2 Ústav technologie potravin, Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně INFLUENCE OF CHOSEN PARAMETERS OF MILK QUALITY ON QUALITY OF RENNET CURDLING FROM SHEEP (LACAUNE X EAST FRIESIAN) Summary: The aim of research was determine the influence of chosen parameters of milk quality on quality of rennet curdling from sheep. Ovine milk was collected from 10 ewes (L x EF) on 1 st lactation, five times during all lactation Sheep milk contained on average % total solids (TS), 7.94 % fat (F), 6.49 % protein (P), 5.09 % casein (C), 4.64 % lactose (L).Average value somatic cell count (SCC) was cells/ml. Average titratable acidity (TA) of milk amounted to 9.61 SH and average ph value was Average rennetability was 225s. Quality of rennet curdling varied between 1 3,5 and average value was 2,15. Data was statistically processed with SAS 8.2. Between all chosen parameters and quality of rennet curding there weren t registered any significant correlations. Positive nonsignificant correlations were between quality of rennet curdling and TS, F, P, C, TA. On the other hand negative nonsignificant correlations were between quality of rennet curdling and L, SCC, ph, rennetability. Úvod Ovčí mléko je narozdíl od kravského a kozího mléka využíváno téměř výhradně k výrobě sýrů. Při výrobě sýrů hraje důležitou roli, kromě jiných faktorů, výsledná jakost sýřeniny (PUGLIESE et al., 2000). Sýřenina by měla mít při rozlomení na své spodní části lasturovitou konzistenci a hrany na místě lomu ostré. Vznik lasturovitého lomu je znakem, že jsou kohézní síly v sýřenině dostatečné a že se sýřenina nebude při krájení tříštit a nebude vznikat sýrařský prach (ZAJÍCOVÁ et al., 2004). Jakost sýřeniny může být ovlivňována řadou faktorů, jakými například mohou být obsahy jednotlivých složek ovčího mléka dále také počet somatických buněk (PSB), ph, titrační kyselost (TK) a sýřitelnost. Cílem našeho sledování se tedy stalo posouzení korelačních závislostí mezi vybranými ukazateli kvality ovčího mléka a jakostí vzniklé sýřeniny za celou laktaci. Materiál a metodika Pro hodnocení korelačních závislostí mezi vybranými ukazateli kvality ovčího mléka (sušina (S), tuk (T), čisté bílkoviny (ČB), kasein (K), laktóza (L), počet somatických buněk (PSB), ph, titrační kyselost (TK) a sýřitelnost) a jakostí sýřeniny bylo využito výsledků analýz mléka od 10 kusů bahnic (kříženek plemen Lacaune x Východofríská ovce), přičemž všechny tyto bahnice byly na 1. laktaci. Odběry vzorků ovčího mléka byly získávány strojním dojením, když v průběhu celé laktace bylo realizováno 5 po sobě jdoucích odběrů v průběhu roku Jednotlivé analýzy mléka byly prováděny standardními metodami v rozborové laboratoři mléka na MZLU v Brně. Hodnocení jakosti sýřeniny bylo prováděno dle následujícího klíče (GAJDŮŠEK, 1999): tř. 1: velmi dobrá sýřenina, tř. 2: dobrá sýřenina, tř. 3: špatná sýřenina, tř. 4: velmi špatná sýřenina, tř. 5: nezřetelné nebo žádné vyvločkování kaseinu. Korelační závislosti za celou laktaci byly vyhodnoceny pomocí statistického programu SAS 8.2, byla aplikovaná metoda dle Pearsona. Všechny sledované bahnice byly v průběhu celého sledovaného období chovány v identických podmínkách a po celou dobu byly všechny zdravé a v dobrém výživném stavu. Krmná dávka bahnic byla založena na ad libitní celodenní pastvě s minimálním přídavkem jádra (5 dkg/kus/den). 136

133 Výsledky a diskuse Průměrné obsahy základních složek ovčího mléka (S, T, ČB, K, L, ) za celou laktaci byly: %, 7.94 %, 6.49 %, 5.09 % a 4.64 %. Průměrný počet somatických buněk byl / 1 ml mléka. Průměrné ph mléka, titrační kyselost a doba sýření činily 6.69, 9.61 SH a 225 sekund. PAVIĆ et al. (2002), uvádí nížší obsahy sušiny (19.11 %), tuku (7.52 %), čistých bílkovin (5.9 %), laktózy (4.55 %) i nižší titrační kyselost (9.3 SH) a vyšší ph (6.78). Naproti tomu HORÁK et al. (2004) udává vyšší obsah S (21,3 % ), T (8,9 %), L (5,0 %) a nižší obsah ČB (6,3 %). Podle JAEGGI et al. (2003), PSB do v 1 ml mléka můžeme považovat za dobrý. Jakost sýřeniny za celé sledované období se pohybovala v závislosti na konkrétním vzorku mléka v rozpětí 1 až 3.5, když průměrná jakost sýřeniny za celou laktaci byla Co se týká průměrné jakosti sýřeniny zde lze obecně konstatovat, že sýřenina byla dobrá, ale poněkud méně pevná a méně dobře zachovávala tvar. Vylučování syrovátky nebylo dokonalé a syrovátka byla bělavé, respektive nazelenalé barvy. Z hodnocení vzájemných korelačních závislostí mezi jakostí sýřeniny a vybranými ukazateli kvality ovčího mléka za celou laktaci (tab.1) především vyplývá, že mezi všemi sledovanými ukazateli a jakostí sýřeniny nebyla zjištěna ani v jednom případě žádná průkazná závislost. Nicméně v případě závislostí mezi jakostí sýřeniny a obsahy S, T, ČB, K a TK se jednalo o pozitivní závislosti, naproti tomu v případě závislostí mezi jakostí sýřeniny a ostatními sledovanými ukazateli (L, PSB, ph, sýřitelnost) byly ve všech případech zjištěny negativní závislosti. Vzhledem ke stupnici hodnocení jakosti sýřeniny se zvyšujícím se obsahem S, T, ČB, K, a zvyšující se TK docházelo ke zlepšení jakosti sýřeniny. Naproti tomu zvyšováním ostatních ukazatelů (L, PSB, ph, sýřitelnost) docházelo ke zhoršení jakosti sýřeniny. Toto částečně koresponduje s údaji GAJDŮŠKA (2002), který uvádí, že vyšší koncentrace kaseinu zvyšuje pevnost sýřeniny i výtěžnost a že vyšší titrační kyselost ( nižší ph) zlepšuje tvorbu a pevnost sýřeniny. Také podle NÁJERA et al. (2003), snížením ph dochází ke snížení doby sýření a ke zlepšení pevnosti sýřeniny. JAEGGI et al. (2003) a GAJDŮŠEK (2003), uvádějí, že pokud se zvýší PSB dojde ke zvýšení doby sýřitelnosti a ke zhoršení jakosti sýřeniny. Tab.1: Přehled korelačních závislostí (Pearsonovy korelace) mezi vybranými ukazateli kvality ovčího mléka a jakostí sýřeniny za celou laktaci Jakost sýřeniny Sušina (%) Tuk (%) Čisté bílkoviny (%) Kasein (%) Laktóza (%) Somatické buňky(tis./ml) ph Titrační kyselost ( SH) Sýřitelnost (s) Závěr Závěrem je možno konstatovat, že ani v jednom případě nebyla zjištěna v případě vzájemných závislostí mezi námi sledovanými ukazateli a jakostí sýřeniny průkazná závislost. Poděkování Sledování probíhalo s podporou MSM

134 Použitá literatura: 1. GAJDŮŠEK, S. Laktologie. Brno : MZLU, s 2. GAJDŮŠEK, S. Mlékařství II. Brno : MZLU, s 3. GAJDŮŠEK, S. Mlékařství II. cvičení. Brno : MZLU, s 4. HORÁK, F., et al. Ovce a jejich chov. Praha : Brázda, s. 5. PAVIĆ, V., ANTUNAC, N., MIOĆ, B., IVANKOVIĆ, A., HAVRANEK, J.L. Influence of stage of lactation on the chemical composition and physical properties of sheep milk.. Czech Journal of Animal Science. Czech Journal of Animal Science. 2002, 47, s JAEGGI, J. J., GOVINDASAMY-LUCEY, S., BERGER, Y.M., JOHNSON, M. E., McKUSICK, B. C., THOMAS, D. L., WENDORFF, W. L. Hard Ewe s Milk Cheese Manufactured from Milk of Three Different Groups of Somatic Cells Counts. J. Dairy Sci. 2003, 86, s NÁJERA, A. I., DE RENOBALES, M., BARRON, L. J. R. Effects of ph, temperature, CaCl2 and enzyme concentrations on therennet-clotting properties of milk: a multifactorial study. Food Chemistry. 2003, no. 80, s PUGLIESE, C., ACCIAIOLI, A., RAPACCINI, S.,PARISI, G., FRANCI, O. Evolution of chemical composition, somatic cell count and renneting properties of the milk of Massese ewes. Small Ruminant Research. 2000, 35, s ZAJÍCOVÁ, P, KUCHTÍK, J, PUKAČOVÁ, J. Posouzení korelačních závislostí mezi vybranými ukazateli ovčího mléka a jakostí sýřeniny v průběhu laktace. In Farmářská výroba sýrů a kysaných mléčných výrobků. [s.l.] : [s.n.], s Kontaktní adresa: Ing. Lenka Novotná, MZLU v Brně, ÚCHŠZ, Zemědělská 1, Brno, xnovot22@node.mendelu.cz tel.:

135 PROTEOLYTICKÉ PSYCHROTROFNÉ MIKROORGANIZMY AKO FAKTOR OVPLYVŇUJÚCI KVALITU MLIEKA Ducková Viera, Čanigová Margita, Krupová Zuzana Fakulta biotechnológie a potravinárstva, SPU v Nitre, Slovensko PROTEOLYTIC PSYCHROTROPHIC MICROORGANISMS AS A FACTOR INFLUENCING MILK QUALITY Summary: The aim of this work was to characterize the microbiological quality of cow milk delivered to dairy plant from the point of psychrotrophic microorganisms and proteolytic psychrotrophic microorganisms. The portion of psychrotrophic microorganisms in bulk tank samples (n=41) constitutes 58.7% of total milk microflora. Proteolytic psychrotrophic microorganisms stated by the spreading method constituted 4.4 % of total bacterial microflora. About 68 strains from the grown colonies of proteolytic psychrotrophic microorganisms were isolated and identified. Gram-negative, oxidase-positive rods from the family of Pseudomonadaceae reached the dominant position. Pseudomonas fluorescens became the most frequently isolated bacteria in milk (29.41 %). Proteolytic activity of isolated strains was found out semiquantitatively and quantitatively. The values of specific proteolytic activity of the tested strains ranged from 2.97 U.mg -1 (Ps. fluorescens) to U.mg -1 (Ps. aeruginosa). The differences in proteolytic activity not only among various bacterial species but also within the strains of the same species were determined by both tested methods. Drawing out the raw material for cheesemaking there is necessary to judge the risk of milk devaluation by affecting of the psychrotrophic microorganisms' proteases and besides the counts of psychrotrophic microorganisms to take into consideration their representation and the proteolytic activity of individual strains. Psychrotrofné mikroorganizmy sú významnou mikroflórou kontaminujúcou mlieko. Počet týchto mikroorganizmov sa v mlieku zvyšuje pri nedodržaní základných hygienických podmienok získavania mlieka a predlžovaním doby skladovania mlieka v chlade pred samotným spracovaním mlieka. Samotný rast psychrotrofných mikroorganizmov v mlieku nespôsobuje vážne problémy, pretože väčšinou sú tieto mikroorganizmy pasterizáciou mlieka devitalizované. Psychrotrofné mikroorganizmy sa dostali do popredia záujmu pre svoju schopnosť produkovať termostabilné enzýmy, predovšetkým proteázy a lipázy. Produkciou proteolytických termorezistentných enzýmov spôsobujú psychrotrofné mikroorganizmy ireverzibilné zmeny v kvalite mlieka a mliečnych výrobkov. Väčšina bežných chýb chuti v mlieku a v mliečnych výrobkoch sú: ovocná a stuchnutá chuť, avšak pozorovali sa tiež hnilobná, syrová, horká, nečistá, mydlová, kvasinková alebo chuť po rybách (1). S aktivitou extracelulárnych proteáz v pasterizovanom a UHT mlieku sú spájané chyby ako napr. sladké zrážanie, gélovatenie, tiahla viskózna konzistencia, stekutenie, chyby farby šedá (2, 3). Pri výrobe syrov bakteriálne proteázy vplývajú na skrátenie doby sýrenia mlieka, kvalitu syreniny, zníženie výťažnosti výroby syrov a chuť syrov. Mäkšia syrenina, slabá tvorba syreniny, slabá textúra vyrábaného syra sa objasňuje zvýšenou väznosťou vody na meniaci sa kazeín. V dôsledku činnosti proteáz sa môže v niektorých prípadoch objaviť u syrov horká chuť ako dôsledok prítomnosti tzv. horkých peptidov. Avšak chyby chuti syrov vyvolané proteázami psychrotrofných baktérií sú zriedkavejšie. Súvisí to s tým, že proteázy majú tendenciu prechádzať do srvátky (4,5). V súvislosti so zrením syrov sa však objavujú štúdie, ktoré poukazujú na možné využitie proteáz psychrotrofných mikroorganizmov. Plazmín, hlavná natívna proteáza mlieka je dôležitá pre zrenie syrov. Plazmínový proenzým - plazminogén je aktivovaný počas zrenia syrov. Dokázalo sa, že mikrobiálne proteázy psychrotrofných mikroorganizmov, konkrétne napr. aj proteázy produkované Pseudomonas fluorescens M 3/6 pri teplote 4 C zvyšujú aktivitu aktivátorov plazminogénu, čím dochádza k zmene plazminogénu na plazmín. Na základe týchto zistení sa uvažuje, že izolované proteázy by sa mohli využívať ako prostriedok kontroly hladiny plazmínu a urýchlenia zrenia syrov (6). 139

136 Cieľom práce bolo zistiť kvantitatívne a kvalitatívne zastúpenie proteolytických psychrotrofných mikroorganizmov v cisternových vzorkách kravského mlieka a určiť ich proteolytickú aktivitu. Materiál a metódy V cisternových vzorkách kravského mlieka (n = 41) odobratých v mliekarenskom závode v priebehu roka sa stanovili: celkový počet mikroorganizmov (CPM) (7) počet psychrotrofných mikroorganizmov (PPM) - (8) počet proteolytických psychrotrofných mikroorganizmov (PPPM) rozterom (9). Z vyrastených kolónií proteolytických psychrotrofných mikroorganizmov sa náhodne izolovalo 68. Základné rozdelenie izolovaných baktérií sa vykonala podľa Betinu et al. (10). Rodová a druhová identifikácia sa robila pomocou komerčných NEFERMtestov 24 - firmy Lachema, a. s., Brno. Semikvantitatívne sa proteolytická aktivita určila platňovou difúznou metódou. Do Petriho misiek sa sterilne prenieslo 20 ml mliečneho agaru (ph 7,2 + 0,2). Po jeho stuhnutí sa do platničiek sterilným korkovrtom urobili otvory s priemerom 0,7 cm. Z 24 hodinovej kultúry mikroorganizmov vyrastenej na šikmom agare sa urobila vo fyziologickom roztoku (ph 7,0 + 0,2) suspenzia mikroorganizmov (2. stupeň zákalu podľa McFarlanda, s približnou hustotou buniek 10 6 cfu.ml -1 ). Mikropipetou sa po okraj otvoru v Petriho miske napipetovala suspenzia mikroorganizmov. Kultivácia prebiehala 48 hod pri teplote 22 C. Po ukončení kultivácie sa odčítal priemer lytických zón. Proteolytická aktivita sa u každého kmeňa stanovovala paralelne v dvoch vzorkách. Kvantitatívne stanovenie proteolytickej aktivity identifikovaných izolátov sa vykonalo modifikovanou skúškou podľa Asha et al. (11). Koncentrácia bielkovín sa určila metódou podľa Bradforda (12). Výsledky a diskusia Mikrobiologická kvalita surového mlieka vyjadrená prostredníctvom celkových počtov mikroorganizmov, počtov psychrotrofných mikroorganizmov a počtov psychrotrofných mikroorganizmov s proteolytickou aktivitou je uvedená v tabuľke 1. Tabuľka I Počty sledovaných skupín mikroorganizmov v surovom mlieku (n=41) Rozpätie CPM (cfu.ml -1 ) 3, , Rozpätie PPM (cfu.ml -1 ) 1, , Rozpätie PPPM (cfu.ml -1 ) 2, , Geometrický priemer CPM (cfu.ml -1 ) 4, Geometrický priemer PPM (cfu.ml -1 ) 2, Geometrický priemer PPPM (cfu.ml -1 ) 1, Na základe výsledkov v tabuľke 1 možno konštatovať, že mikrobiologická kvalita mlieka privážaného do mliekarenského závodu je nízka. Hodnoty psychrotrofných mikroorganizmov rádovo na úrovni 10 5 cfu.ml -1, ktoré odpovedajú geometrickému priemeru proteolytických psychrotrofných mikroorganizmov 4, cfu.ml -1 sú už totiž spájané s produkciou extracelulárnych enzýmov a predstavujú pre mliekarenský závod počiatok možného vzniku technologických problémov ako aj zníženie kvality vyrobených výrobkov (13). Podiel psychrotrofných mikroorganizmov v analyzovaných vzorkách predstavoval 58,7 % z celkovej mikroflóry mlieka. Proteolytické psychrotrofné mikroorganizmy tvorili 4,4 % z psychrotrofnej mikroflóry. 140

137 Čeľaď Pseudomonadaceae má v skupine psychrotrofných mikroorganizmov významné postavenie. Potvrdilo sa to pri identifikácii proteolytických psychrotrofných baktérií, keď zo 68 náhodne izolovaných a identifikovaných baktérií, 52 izolátov, t.j. 76,46 % patrilo do rodu Pseudomonas (tabuľka II). Najčastejšie izolovaným druhom bol Pseudomonas fluorescens, ktorý predstavoval 38,46 % z rodu Pseudomonas. Dominantné postavenie tohto psychrotrofného rodu a druhu v surovom, ale i pasterizovanom mlieku skladovanom v chlade sa potvrdilo aj v prácach iných autorov (5, 14). Tabuľka II Výsledky identifikácie proteolytických psychrotrofných mikroorganizmov izolovaných z mlieka (n=68) Počet zaradených Mikroorganizmus izolátov Pseudomonas fluorescens 20 29,41 Pseudomonas stutzeri 10 14,70 Pseudomonas putida 9 13,24 Pseudomonas aeruginosa 7 10,29 Pseudomonas alcaligenes 2 2,94 Iné Pseudomonas sp. 4 5,88 Moraxella sp. 6 8,82 G - bližšie neidentifikované 2 2,94 G + bližšie neidentifikované 8 11,76 Spolu 68 99,98 % z celkového počtu izolátov U identifikovaných kmeňov psychrotrofných mikroorganizmov sa zisťovala proteolytická aktivita. Nenáročným spôsobom určenia proteolytickej aktivity je platňová difúzna metóda, ktorá má semikvantitatívny charakter. Z výsledkov vyplýva, že proteolytická aktivita testovaných kmeňov psychrotrofných baktérií vyjadrená veľkosťou zón je veľmi variabilná a kolíše od 0,80 cm (G + bližšie neidentifikované baktérie) do 2,60 cm (Pseudomonas aeruginosa 18 ). Percentuálne rozdelenie psychrotrofných mikroorganizmov v závislosti od ich proteolytickej aktivity uvádza tabuľka III. Tabuľka III Percentuálne rozdelenie psychrotrofných mikroorganizmov v závislosti od ich proteolytickej aktivity zisťovanej platňovou difúznou metódou (n = 68) Proteolytická aktivita Ø zóny [cm] Percentuálny podiel izolovaných psychrotrofných baktérií do 1,00 11,76 % 1,01 1,50 14,71 % 1,51 2,00 45,59 % 2,01 2,50 25,00 % nad 2,51 2,94 % Pre kvantitatívne stanovenie proteolytickej aktivity sa kultivovali vybrané kmene psychrotrofných baktérií 48 hod pri teplote 25 C submerznou kultiváciou (280 otáčok za min). Zistené hodnoty proteolytickej aktivity obomi metódami sú uvedené v tabuľke IV. 141

138 Tabuľka IV Porovnanie proteolytickej aktivity vybraných kmeňov psychrotrofných mikroorganizmov stanovenej dvomi metódami Platňová difúzna metóda Proteolytick á aktivita [U.ml -1 ] Obsah proteínov [mg.ml -1 ] Špecifická aktivita [U.mg -1 ] Mikroorganizmus Ø zóny[cm] (A) (B) (A:B) Pseudomonas fluorescens 57 1, ,45 756,50 2,97 Pseudomonas fluorescens 67 1, ,20 706,70 3,59 Pseudomonas fluorescens 59 1, ,20 704,80 3,65 Pseudomonas fluorescens 62 1, ,20 538,70 5,02 Moraxella sp. 63 1, ,33 436,03 6,75 Pseudomonas pseudoalcaligenes* 1, ,93 375,71 6,75 Pseudomonas stutzeri 51 1, ,25 392,55 6,90 Pseudomonas sp. 61 1, ,30 341,65 8,87 Pseudomonas aeruginosa 39 2, ,10 286,20 12,53 Pseudomonas stutzeri 46 2, ,55 284,50 12,85 Pseudomonas aeruginosa 4 2, ,65 246,50 15,05 Pseudomonas fluorescens 54 2, ,45 245,05 20,07 Pseudomonas aeruginosa 13 2, ,55 214,65 20,91 Pseudomonas aeruginosa 18 2, ,20 23,34 Horný index = číslo identifikovaného kmeňa * kultúra pochádzajúca zo zbierky psychrotrofných mikroorganizmov KHSŽP FBP SPU Rovnako ako pri platňovej difúznej metóde i kvantitatívnou metódou sa zistili rozdiely v proteolytickej aktivite nielen medzi rozličnými bakteriálnymi druhmi, ale aj v rámci kmeňov toho istého druhu. Príkladom je druh Pseudomonas fluorescens, ktorého jednotlivé kmene vykazovali špecifickú proteolytickú aktivitu v rozsahu od 2,97 do 20,07 U.mg -1. Možno teda predpokladať, že proteolytická aktivita nie je podmienená len bakteriálnym rodom a druhom, ale závisí aj od vlastností daného kmeňa. Porovnávať navzájom hodnoty proteolytickej aktivity psychrotrofných mikroorganizmov zistené inými autormi je veľmi komplikované. Súvisí to s rozdielnymi metódami stanovenia proteolytickej aktivity. Značné rozdiely v špecifickej proteolytickej aktivite medzi psychrotrofnými mikroorganizmami sa však zistili i medzi: Bacillus coagulans 9,5 U.mg -1, Bacillus sp. 41,2 U.mg -1, Bacillus subtilis 9,9 U.mg -1 a Pseudomonas fluorescens 163,5 U.mg -1 (15). Záver Z výsledkov vyplýva, že vzhľadom na zistené rozdiely v proteolytickej aktivite psychrotrofných baktérií, stupeň nežiadúcich zmien surovín a z nich vyrobených produktov spôsobený účinkom extracelulárnych proteáz je okrem množstva podmienený aj zastúpením kontaminujúcej psychrotrofnej mikroflóry a jej proteolytickým potenciálom. Práca sa riešila v rámci projektu VEGA 1/9076/02 Č.Ú. 96/

139 Použitá literatúra: 1. COUSIN, M. A Presence and activity of psychrotrophic microorganisms in milk and dairy products: A Review. In: J. Food Protection, vol. 45, 1982, no. 2, p VYLETĚLOVÁ, M. HANUŠ, O. 2000b. Vliv kontaminace Pseudomonas fluorescens na hlavní složky a technologické vlastnosti pasterizovaného mléka během skladovaní. In: Czech J. Food Sci., vol. 18, 2000, no. 6, p DRAČKOVÁ, M. VORLOVÁ, L Stanovení vlivu enzymatické činnosti Bacillus spp. na frakce kaseinu. In: I. vedecká konferencia študentov a doktorandov (Zborník abstraktov), Nitra, 2003, str , ISBN ČANIGOVÁ, M Vplyv psychrotrofnej mikroflóry na výrobu syrov. In: Mliekarstvo, roč. 29, 1998, č. 1, s ČANIGOVÁ,M Zmeny v mlieku spôsobené činnosťou psychrotrofných mikroorganizmov. In: Mliekarstvo, roč. 31, 2000, č. 2, s NIELSEN, S. S Plasmin system and microbial proteases in milk: characteristics, roles, and relationship. In: J. Agric. Food Chem., vol. 50, 2002, no. 22, p STN ISO Mikrobiológia potravín a krmív. Horizontálna metóda na stanovenie počtu mikroorganizmov. Metóda počítania kolónií kultivovaných pri 30 C. ÚNM: Bratislava s. 8. STN ISO Mlieko. Stanovenie počtu jednotiek tvoriacich kolónie psychrotrofných mikroorganizmov. Technika počítania kolónií vykultivovaných pri 6,5 C. Bratislava : SÚTN, 14s. 9. HAVLOVÁ, J. JIČÍNSKÁ, E. HRABOVÁ, H Mikrobiologické metody v kontrole jakosti mléka a mlékarenských výrobků. Praha: ÚZPI, s., ISBN BETINA, V. et al Mikrobiologické laboratórne metódy. Bratislava: Alfa. 1988, 536 s. 11. ASHA, A. K. ANURADHA, K. ADITI, P Salt tolerant and thermostable alkaline protease from Bacillus subtilis NCIMN64. In: Appl. Microbiol. Biotechnol, vol. 38, 1993, p BRADFORD, M. M Anal. Biochem., vol. 72, 1976, p VYLETĚLOVÁ, M. HANUŠ, O. URBANOVÁ, E. et al Výskyt a identifikace psychrotrofních bakterií s proteolytickou a lipolytickou aktivitou v bazénových vzorcích mléka v podmínkách technologií prvovýrobního uskladnění. In: Czech J. Anim. Sci., vol. 45, 2000, p VYLETĚLOVÁ, M. HANUŠ, O. URBANOVÁ, E Výskyt proteolytických a lipolytických psychrotrofních baktérií v bazénových vzorcích kravského mléka. In: Veterinářství, roč. 49, 1999, č. 11, s YAN, L. LANGLOIS, B. E. O LEARY, J. et al Purification and Characterization of our Extracellular Proteases Isolated from Raw Milk Psychrotrophs. In: Journal of Dairy Science, vol. 68, 1985, no. 6, p Kontaktná adresa: Viera Ducková, KHSŽP, FBP, SPU v Nitre, Tr. A. Hlinku 2, Nitra, SR viera.duckova@uniag.sk 143

140 VLIV ČASNÉ A POZDNÍ LAKTACE NA TECHNOLOGICKÉ VLASTNOSTI MLÉKA HOLŠTÝNSKÝCH DOJNIC Chládek Gustav, Čejna Vladimír Ústav chovu a šlechtění zvířat, Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně THE EFFECT OF EARLY AND LATE LACTATION ON PROCESSING CHARACTERISTICS OF MILK OF HOLSTEIN COWS Summary: Phase of lactation affects milk production, milk composition and characteristics. A growing milk yield of Holstein cows is associated with changes in milk composition and processing characteristics which considerably affect the processes employed in dairy production. We analysed milk of Holstein cows (with average milk yield of l per lactation) at the beginning and at the end of lactation in order to asses the effect of early and late lactation on processing characteristics of milk. We found a highly significant effect of early and late lactation on milk protein content (P<0.001), freezing point (P<0.01), rennet coagulation time and rennet gel quality (P<0.05). Active acidity was not significantly affected. Our study indicates that lactation affects, besides milk composition, also processing characteristics of milk. Úvod Dynamicky se zvyšující užitkovost holštýnských dojnic v posledních letech vyžaduje opakované analýzy základních parametrů jejich mléka. Kromě klasických obsahových složek (bílkovina, tuk, laktóza a tukuprostá sušina) či dalších parametrů (počet somatických buněk, koncentrace močoviny) se dostávají do popředí také ukazatele související s technologickými vlastností mléka (Chládek a Čejna, 2004). V mnoha zemích bylo zjištěno, že výsledkem šlechtění dojnic došlo k zvýšení produkce mléka, ale zhoršila se jeho syřitelnost a zvýšil se počet krav produkujících nesráženlivé mléko (Malossiny et al., 1996; Tyrisevä et al., 2003). Z hlediska zpracovatelnosti na jednotlivé druhy mlékárenských výrobků musí mít mléko kromě vhodného složení i požadované vlastnosti (Gajdůšek, 2003). Mezi nejvýznamnější technologické vlastnosti zařazuje Kadlec et al. (2002) a Gajdůšek (2003) kysací schopnost, syřitelnost a tepelnou stabilitu. Hanuš (2004) rozšiřuje tento výčet o další technologické parametry (obsah kaseinu; bod mrznutí; inhibiční látky; tukuprostá sušina; psychrotrofní, termorezistentní a sporulující baktérie; aktivní a titrační kyselost). V našem experimentu jsme se zaměřili na rozdíly v obsahu bílkovin, bodu mrznutí, syřitelnosti, kvalitě sýřeniny a aktivní kyselosti mezi skupinami dojnic nacházejícími se na začátku a konci laktace. Materiál a metodika S cílem zjistit změny v technologických vlastnostech mléka mezi časnou a pozdní laktací jsme analyzovali vzorky večerního nádoje mléka holštýnských dojnic v chovu s průměrnou užitkovostí litrů. Srovnávali jsme skupinu dojnic nacházejících se na začátku laktace (skupina ČL, n = 20, průměrný laktační den = 46, průměrné pořadí laktace = 1,0) se skupinou dojnic na konci laktace (skupina PL, n = 17, průměrný laktační den = 308, průměrné pořadí laktace = 1,4). Všechny vzorky byly odebrány v rámci jednoho večera. Obsah bílkovin a bod mrznutí byly stanoveny v laboratoři LRM Brno-Chrlice (BENTLEY, 2000; CRYOSTAR). Ostatní ukazatele byly zjištěny v laboratoři Ústavu chovu a šlechtění zvířat MZLU v Brně. Syřitelnost mléka byla stanovena pomocí Nefelo-turbidimetrického snímače koagulace mléka měřící principem vysvětleným v Čejna a Chládek (2005). Bylo použito syřidlo Laktochym 1:5000 (Milcom Tábor) v množství 1 ml na 50 ml mléka po zředění syřidla 1:4. Kvalita sýřeniny byla hodnocena po 60 minutové inkubaci 50 ml zasýřeného mléka při 35 C a posouzena dle známé tabulky (Gajdůšek, 1999) hodnotící vzhled sýřeniny a syrovátky (třída 1 = nejlepší, třída 5 = nejhorší). Aktivní kyselost byla měřena ph-metrem CyberScan PC 510 (Eutech Instruments). 144

141 Výsledky a diskuze Průměrné hodnoty sledovaných parametrů mezi skupinami dojnic v časné (skupina ČL) a pozdní laktaci (skupina PL) jsou uvedeny v tab. I, ve které je také uvedena statistická průkaznost mezi skupinami u jednotlivých parametrů. Na grafu 1 je uvedeno rozložení skupin v rámci laktačních dnů. Význam bílkovin jako technologické vlastnosti spočívá zejména v jejím přímém vlivu na výtěžnost výsledných produktů, zejména sýrů, kdy vysoká výtěžnost sýrů bývá asociována s vyšším obsahem bílkovin (kaseinu) a tuku, krátkým časem syřitelnosti, vyšším kaseinovým číslem a pevnější sýřeninou (Buchberger a Dovč, 2000). Obsah bílkovin v mléce je ovlivňován řadou faktorů: výživa, plemeno, dojivost, sezóna, stadium laktace, pořadí laktace, atd. (Doležal et al., 2000). Obsah proteinu během laktace vykazuje značné změny. V mlezivu je obsah bílkovin velmi vysoký (až 230 g/l) především z důvodů velkého zastoupení imunoglobulinů. Kolem osmého týdne laktace bývá nejnižší obsah bílkovin, což koreluje s maximem negativní energetické bilance dojnic (rozdíl mezi příjmem krmiva a produkcí mléka je největší). S postupující laktací a přechodem zvířat do pozitivní energetické bilance dochází k vzestupu obsahu bílkovin. Na konci laktace dochází k zvýšení syrovátkových bílkovin, především z důvodů zvýšení propustnosti epiteliálních buněk (Stelwagen, 2002). Obsah bílkovin ve skupině ČL byl 2,96 % a ve skupině PL 3,93 % (graf 2). Uvedený rozdíl je podobný tomu, který zjistil Čejna a Chládek (2004) u holštýnských dojnic během laktace (2,90 % až 3,74 %). Zjištěný rozdíl mezi skupinami (P<0,001) činil 0,97 %, a je poněkud vyšší, než uvádí Čejna et al. (2005) u obsahu kaseinu (0,59 %) mezi 25. a 208. dnem laktace u holštýnských dojnic. Zvýšení obsahu bílkovin na konci laktace je ve shodě s tvrzením Doležala et al. (2000). Bod mrznutí mléka (BMM) slouží k rychlému posouzení technologické neporušenosti syrového mléka, zejména zvodněním. Příčinou kolísání BMM však může být také řada dalších vlivů souvisejících se změnami složení a vlastnostmi mléka. Vedle vlivu sezony, stadia laktace, plemene, užitkovosti, subklinických mastitid apod., je nejzávažnější a nejčastější vliv výživy a dietetických, případně metabolických poruch (Gajdůšek, 2003). V individuálních vzorcích kravského mléka se BMM většinou pohybuje v rozmezí 0,512 až 0,550 C se středními hodnotami 0,520 C až 0,532 C (McCarthy, 2002). Deprese BMM je podle Walstry a Jennesse (1984) určována složkami mléka, přičemž 54 % připadá na laktózu, 30,5 % na obsah minerálních solí, 3,3 % na obsah organických solí, 2 % na obsah močoviny a zbylých 10,2 % na ostatní složky mléka. Skupina dojnic ČL vykázala vyšší (horší) hodnotu BMM oproti skupině PL ( 0,532 C resp. 0,537 C) s vysoce statisticky průkazným rozdílem P<0,01 (graf 3). Nižší hodnota BMM u skupiny PL může být poněkud ovlivněna vyšším obsahem bílkovin v této skupině, neboť Chládek a Čejna (2005) uvádějí u holštýnských dojnic mírně zlepšující korelační koeficient bílkovin na BMM (r = 0,184). Svoji roli mohla také sehrát logicky vyšší produkce mléka ve skupině ČL. Syřitelnost mléka představuje jednu z nejvýznamnějších technologických vlastností mléka. Dobrá syřitelnost podmiňuje efektivní výrobu sýrů jak po stránce kvantitativní (výtěžnost), tak kvalitativní (jakost). Syřitelnost mléka je důležitá fáze výroby sýrů a je výsledkem dvou procesů: proteolýzy κ-kaseinu syřidlem vedoucí k destabilizaci kaseinových micel a agregací těchto micel, jejichž výsledkem je formování sýřeniny (López et al., 1998). Syřitelnost mléka (měřena jako čas vytvoření prvních vloček parakaseinu po přídavku syřidla) byla lepší (P<0,05) u skupiny ČL (203 s.) oproti skupině PL (246 s.). Zjistili jsme tedy poněkud lepší syřitelnost u dojnic na začátku laktace (graf 4). Podobně Ostersen et al. (1997) uvádí u dánských holštýnských dojnic lepší syřitelnost u skupiny ve 13. dni laktace oproti skupině ve 323. dni laktace (12,2 min resp. 14,8 min). Také při hodnocení kvality sýřeniny byl zjištěn statisticky průkazný rozdíl (P<0,05) mezi skupinami (graf 5), ovšem s tím rozdílem, že zatímco u syřitelnosti bylo u skupiny PL zaznamenáno její zhoršení, tak u kvality sýřeniny bylo dosaženo zlepšení (ČL: tř. 1,35 a PL: tř. 1,06). Toto zjištění naznačuje, že syřitelnost mléka a kvalita sýřeniny bude ovlivňována nestejnými faktory. Ostersen et al. (1997) udává lepší kvalitu sýřeniny na začátku laktace než na konci. 145

142 Aktivní kyselost ovlivňuje vlastnosti mléka a pochopení jejího působení je základním předpokladem úspěšné výroby sýrů (Pastorino et al., 2003). Ovlivňuje enzymatickou i agregační reakci tvorby sýřeniny (Esteves et al., 2003). U skupiny ČL byla zjištěna hodnota 6,75 ph a u skupiny PL 6,72 ph (graf 6). U tohoto parametru jsme nezjistili statisticky průkazný rozdíl mezi skupinami. Námi zjištěný interval je daleko užší, než zjistili Čejna a Chládek (2004), v jejichž sledování se v průběhu laktace pohyboval interval ph od 6,61 do 6,82. Minimální změny aktivní kyselosti v průběhu laktace uvádí Sapru et al. (1997). Ostersen et al. (1997) udává interval ph v průběhu laktace 6,61 až 6,67. Tabulka I Průměrné hodnoty sledovaných parametrů mezi skupinami dojnic v časné (skupina ČL) a pozdní laktaci (skupina PL) a statistická průkaznost mezi skupinami u jednotlivých parametrů parametr skupina x min max sx v % laktační den bílkovina (%) bod mrznutí ( C) syřitelnost (s) kvalita sýřeniny (třída) aktivní kyselost (ph) ČL 46 A ,3 33,6 PL 308 B ,4 8,3 ČL 2,96 A 2,07 3,66 0,382 12,925 PL 3,93 B 3,29 4,52 0,292 7,424 ČL -0,532 A -0,528-0,539 3,43 0,64 PL -0,537 B -0,527-0,554 6,89 1,28 ČL 203 a ,2 29,6 PL 246 b ,4 16,4 ČL 1,35 a 1,00 2,00 0,477 35,331 PL 1,06 b 1,00 2,00 0,235 22,222 ČL 6,75 6,63 6,81 0,047 0,701 PL 6,72 6,62 6,81 0,054 0,808 Průměrné hodnoty jednoho faktoru označené ve stejném sloupci různými písmeny (A,B; A,B; a,b) se liší velmi vysoce statisticky průkazně (P<0,001), vysoce statisticky průkazně (P<0,01) nebo statisticky průkazně (P<0,5) , ,2 (laktační den) (%) 4,0 3,8 3,6 3,4 3,2 3,0 50 2,8 0 ČL skupina Graf 1: Rozdíl v laktačních dnech mezi sledovanými skupinami PL 2,6 ČL skupina Graf 2: Rozdíl v obsahu bílkovin mezi časnou (ČL) a pozdní laktací (PL) PL 146

143 0,542 0, , , (- C) 0,534 0,532 0,530 (s) , ,526 ČL skupina Graf 3: Rozdíl v bodu mrznutí mezi časnou (ČL) a pozdní laktací (PL) PL 160 ČL skupina Graf 4: Rozdíl v syřitelnosti mléka mezi časnou (ČS) a pozdní laktací (PL) PL 1,6 6,78 (třída sýřeniny) 1,5 1,4 1,3 1,2 1,1 1,0 0,9 0,8 0,7 ČL skupina Graf 5: Rozdíl v kvalitě sýřeniny mezi časnou (ČL) a pozdní laktací (PL) PL (ph) 6,77 6,76 6,75 6,74 6,73 6,72 6,71 6,70 6,69 6,68 ČL skupina Graf 6: Rozdíl v aktivní kyselosti mezi časnou (ČL) a pozdní laktací (PL) PL Závěr Laktační cyklus ovlivňuje nejen obsahové složky mléka, ale i jeho vlastnosti. Zjistili jsme velmi vysoce statisticky průkazný vliv (P<0,001) časné a pozdní laktace na obsah bílkovin, vysoce statisticky průkazný vliv (P<0,01) na hodnotu bodu mrznutí, statisticky průkazný vliv (P<0,05) na syřitelnost mléka a třídu sýřeniny a statisticky neprůkazný vliv na aktivní kyselost. Z našeho experimentu vyplývá, že mezi časnou a pozdní laktací jsou největší rozdíly v obsahu bílkovin. U některých technologických vlastností mléka měla pozdní laktace vliv jak negativní (syřitelnost), tak pozitivní (obsah bílkovin, bod mrznutí, kvalita sýřeniny). 147

144 Použitá literatuta BUCHBERGER, J., DOVČ, P.: Lactoprotein genetic variant in cattle and cheese making ability. Food technol. biotechnol., 2000, 38(2):91-98 ČEJNA, V., CHLÁDEK, G.: The effect of phase of lactation on some milk production parameters in Holstein cows (first calvers). [in Czech] Sborník Mendelnet04Agro (MZLU Brno), 2004, multimediální CD-rom ČEJNA,V., RŮŽIČKOVÁ, J., CHLÁDEK, G.: Changes in casein content induced by phase of lactation and its relationship with some milk parameters in Holstein cattle. [in Czech] Sborník Den mléka 2005 (ČZU Praha), 2005, s ČEJNA, V., CHLÁDEK, G.: A coagulation time of individual milk samples and its relationship with a numer and phase of lactation in holstein cows. [in Czech] Sborník: Mléko a sýry. 1. vyd. Praha: Česká společnost chemická, 2005, s DOLEŽAL, O., et al.: Mléko, dojení, dojírny. Agrospoj. 2000, 242 s. ESTEVES, C. L. C., LUCEY, J. A., WANG, T., PIRES, E. M. V.: Effect of ph on the gelation properties of skim milk gels made from plant coagulants and chymosin. Journal of Dairy Sci., 2003, 86: GAJDŮŠEK, S.: Mlékařství II (cvičení). Brno: MZLU. 1999, 92 s. GAJDŮŠEK, S.: LAKTOLOGIE. BRNO: MZLU. 2003, 84 S. HANUŠ, O: Význam laboratorního testování syrového kravského mléka pro chovatele dojnic. Mliekarstvo, 2004, 35, 2: CHLÁDEK, G., ČEJNA, V.: The effect of lactation phase on coagulation time and titratable acidity of holstein cows milk. [in Czech] Sborník Den mléka 2004 (ČZU Praha), 2004, s CHLÁDEK, G., ČEJNA, V.: The relationship between freezing point of milk and milk components and its changes during lactation in Czech Pied and Holstein cows. [in Czech] Acta univ. agric. et silvic. Mendel. Brun., 2005, LIII (5), s KADLEC, P., et al..: Technologie potravin II. Praha: VŠCHT. 2002, 236 s. LÓPEZ, M. B., LOMHOLT, S. B., QVIST, K. B.: Rheological properties and cutting time of rennet gels. Effect of ph and enzyme concentration. International Dairy Journal, 1998, 8: MALOSSINI, F., BOVOLENTA, S., PIRAS, C., ROSA, M. D., VENTURA, W.: Effect of diet and breed on milk composition and rennet coagulation properties. Ann. Zootech., 1996, 45:29-40 McCARTHY, O. J.: Physical and physicochemical properties. In Encyclopedia of dairy science. (Roginski, H., Faquay, J. W., Fox, P. F., ed.), Academic Press, 2002, s OSTERSEN, S., FOLDAGER, J., HERMANSEN, J. E.: Effects of stage of lactation, milk protein genotype and body condition at calving on protein composition and renneting properties. Journal of Dairy Res. (65), 1997, s PASTORINO, A. J., HANSEN, C. L., McMAHON, D. J.: Effect of ph on the chemical composition and structurefunction relationships of cheddar cheese. Journal of Dairy Sci., 2003, 86: SAPRU, A., BARBARO, D. M., YUN, J. J., KLEI, L. R., OLTENACU, P. A., BANDLER, D. K.: Cheddar cheese: Influence of milking frequency and stage of lactation on composition and yield. J. Dairy Sci., 1997, 80: STELWAGEN, K.: Milk protein. In Encyclopedia of dairy sciences. (Roginski, H., Faquay, J. W., Fox, P. F., ed.), Academic Press, 2002, s TYRISEVÄ, A-M., IKONEN, T., OJALA, M.: Repeatibility estimates for milk coaulation trakte and non-coagulation of milk in Finnish Ayrshire cows. Journal of Dairy Res., 2003, 70:91-98 WALSTRA, P., JENNESS, R.: Dairy chemistry and physics. John Wiley and Sons. New York, 1984, 467 s. Příspěvek byl vypracován s podporou projeku QF Kontaktní adresa: Doc. Ing. Gustav Chládek, CSc., ÚCHŠZ AF MZLU BRNO, Zemědělská 1, Brno chladek@mendelu.cz 148

145 VÝZNAM UKAZOVATEĽA BODU MRZNUTIA MLIEKA PRE ZISTENIE JEHO TECHNOLOGICKEJ KVALITY Kirchnerová Katarína, Foltys Vladimír Slovenské centrum poľnohospodárskeho výskumu, Nitra THE USE OF FREEZING POINT PARAMETER FOR THE TECHNOLOGICAL QUALITY OF MILK ESTIMATING Summary: During 11 month of a year we observed 132 bulk milk samples from 12 agricultural enterprises that produce milk corresponding at least to 1 st quality class according to Slovak standard STN Average content of dry matter was 12.92g/100g, proteins 3.23g/100g, lactose 4.78g/100g, ash 0.72g/100g, SNF 8,84g/100g, fat 3.88g/100g, total count of microorganisms 31 ths/ml milk, somatic cells count 175 ths/ml, ph value 6.52, titratable acidity 6.57 SH. Urea content was in the range mg/100g, mg/100g in average, chloride ions mg/100g, mg/100g in average. The average freezing point was -513±7 m C, in the range from -496 to -533m C. The highest count of samples (39%) was in the range from -511 to -515m C. At 37% of samples was the freezing point value higher than -510m C. In the detected narrow span of values of milk quality parameters was not observed their significant effect on freezing point tin studied samples. There occurred only one medium significant correlation coefficient R= for the dependence between the freezing point and urea content in milk. Quite high values of freezing point found in milk in Slovakia are not an unambiguous evidence of the presence of additional water in milk. Nariadenie vlády Slovenskej republiky z 9. júla 2003 č. 312/2003 o zdravotných požiadavkách na výrobu a uvádzanie na trh surového mlieka, tepelne ošetreného mlieka a mliečnych výrobkov predpisuje, že bod tuhnutia konzumného mlieka tepelne ošetreného ( 5 písm. i)) i surového (príl.č.6) nesmie byť vyšší ako -0,520 C. Vychádza zo smernice Európskeho spoločenstva č. 92/46, ktorá určuje hygienické predpisy pre výrobu a predaj mlieka a mliečnych výrobkov, zo , podľa ktorej musí mať konzumné mlieko pre ľudskú výživu bodu mrznutia taktiež nižšiu, alebo rovnú -0,520 C. Z toho vyplýva i hranica pre surové kravské mlieko určené na spracovanie pre ľudskú výživu. Štúdiom vzťahu zloženia mlieka k teplote tuhnutia ako indikátoru zvodnenia v mlieku na Slovensku sme sa zaoberali v predošlých prácach. V 295 individuálnych vzorkách mlieka sa BM pohybovala v rozpätí -0,555 až -0,498 C, pričom obsah základných zložiek v g/100g bol v rozpätí: tuk 2,46-5,79, bielkoviny 2,66-3,86, laktóza 3,32-5,32 a beztuková sušina 7,02-9,57. Tieto výsledky sú typické pre individuálne vzorky mlieka odzrkadľujúce najrozličnejšie metabolické a fyziologické vplyvy u dojníc. Avšak 11 vzoriek z tohto súboru vykázalo protichodné hodnoty, keď napriek vyhovujúcemu zloženiu mali nedostatočnú BM, alebo naopak, pri nevyhovujúcom zložení mali žiadúcu hodnotu BM (Popelka a kol., 1992). Pri vyhodnotení 210 bazénových vzoriek mlieka (Kirchnerová, Foltys, 1999), ktoré vo všetkých základných ukazovateľoch stanovených klasickými referenčnými metódami spĺňali požiadavky kvalitatívnej normy, sme zistili priemernú hodnotu BM -514±11m C, pričom početnosť vzoriek bola najvyššia v intervale -515 až -520m C, a to 48% z celkového počtu vzoriek. Vzhľadom k vyhovujúcemu zloženiu týchto vzoriek sme konštatovali, že pomerne vysoké hodnoty bodu mrznutia mlieka zisťované na Slovensku nie sú jednoznačným dôkazom zvodnenia mlieka dodávaného do mliekární, a že detailnejším skúšaním mlieka je potrebné zistiť, konkrétne ktoré vlastnosti mlieka spôsobujú tento jav. V nadväznosti na tieto práce sme ďalej hľadali vzťahy a príčiny nedostatočných hodnôt tohto ukazovateľa pri inak kvalitnom mlieku slovenských dodávateľov. Stálosť bodu mrznutia neporušeného mlieka súvisí so stálosťou osmotického tlaku mlieka, a ten je v rovnováhe s osmotickým tlakom krvi dojnice, ktorý môže kolísať iba vo veľmi úzkom rozpätí (Harding, 1990). Buchberger a Graml (1988) vo svojich pozorovaniach dospeli k záveru, 149

146 že i značné kolísanie obsahu močoviny v mlieku môže spôsobiť nie nevýznamné zmeny bodu mrznutia mlieka. Signifikantnú koreláciu medzi bodom mrznutia a obsahom kyseliny citrónovej pozoroval Mitchel (1989). Práce domácich autorov prezentujú podobné výsledky. I keď prvoradou príčinou prekročenia predpísanej BM môže byť tzv. technologické zvodnenie mlieka pri nedostatočnom odstraňovaní preplachovej vody z potrubného systému, čerpadiel a nádrží, nesmieme zabúdať, že bod mrznutia mlieka je závislý od mnohých zootechnických faktorov, ktoré majú dôsledok v obsahu nižších organických molekúl a solí v mlieku, ako napr. plemeno, štádium laktácie, úroveň výživy, príjem vody a faktory ustajnenia a prostredia (Hejlová a Polák, 1994; Hanuš, 1998). Materiál a metódy V priebehu všetkých ročných období jeného roku sme sledovali bazénové vzorky mlieka 12 poľnohospodárskych podnikov, ktoré sú vytypované mliekarňou ako podniky so stabilnou výberovou kvalitou suroviny, ktoré produkujú mlieko zodpovedajúce najmenej 1. triede kvality určenej podľa počtu somatických buniek, celkového počtu mikroorganizmov a s negatívnym výskytom inhibičných látok, čo sú záväzné požiadavky STN Prevládajúce chované plemeno v týchto podnikoch je holsteinské a slovenské strakaté. Vo vzorkách sme stanovili obsah základných zložiek tuku, bielkovín a laktózy - infračerveným absorpčným analyzátorom podľa STN Obsah sušiny sme stanovili vážkovou metódou, obsah popolovín mineralizáciou v muflovej peci, titračnú kyslosť sme stanovili podľa Soxhlet Henkela a aktívnu kyslosť ph metrom - všetko podľa STN Metódy skúšania mlieka a tekutých mliečnych výrobkov. Počet somatických buniek na prístroji Fossomatic 90 podľa STN , celkový počet mikroorganizmov platňovou metódou podľa STN Obsah močoviny sme stanovili fotokolorimetricky pri 420 nm s použitím Ehrlichovho činidla a obsah chloridov argentometrickou titráciou. bod mrznutia mlieka sme stanovili pomocou digitálneho termistorového Kryoskopu 4D2 Advanced Instruments podľa STN , vo výsledkoch je vyjadrená v mili C (m C). Výsledky a diskusia Keď porovnáme priemerné hodnoty sledovaných zložiek mlieka s predpísanými hodnotami (tab.i) vidíme, že v mlieku ktoré sme v práci sledovali, boli podmienky normy splnené a odobraté vzorky nie sú porušené zvodnením. Z hygienického hľadiska môžeme hodnotiť sledovaný súbor ako výberovej kvality, keď priemerný celkový počet mikroorganizmov bol 31tis./ml mlieka a počet somatických buniek 175tis./ml mlieka. Nízke korelačné koeficienty tuku a bielkovín s bodom mrznutia potvrdzujú, že látky v emulzii, suspenzii alebo vo forme koloidu nemajú vplyv na bod mrznutia roztoku. Vzťah obsahu laktózy s hodnotou BM je problematický. Koeficient korelácie medzi obsahom laktózy a BM vyšiel R = Laktóza býva pri zníženom obsahu kompenzovaná chloridmi, takže osmotický tlak, a tým i hodnota BM sa nemení, iba ak je zníženie obsahu laktózy zapríčinené zriedením mlieka vodou, hodnota BM stúpa. Obsah minerálnych látok v mlieku vyjadrený ako obsah popolovín, pri ktorom sa predpokladá najväčší vplyv na osmotický tlak mlieka, v skúšaných vzorkách taktiež nevykázal významnú koreláciu k BM, keď R = 0,225. Minerálne látky sa v mlieku nachádzajú v rozličných formách viazané na organické molekuly a iba časť z nich je disociovaná v iónovej forme. V autentickom, vodou neporušenom, mlieku je zrejme tento podiel veľmi stabilný. Metóda priameho stanovenia obsahu minerálnych látok v mlieku je veľmi zdĺhavá a pracná, zatiaľ čo použitie kryoskopickej metódy pomocou digitálneho mliečneho kryoskopu je jednoduchá, časovo nenáročná metóda umožňujúca vykonávať rozbory veľkých sérií vzoriek. To je dôvodom, že sa v širokej miere používa na indikáciu zníženého obsahu minerálnych látok v mliečnom sére, ale podľa týchto výsledkov nemôže slúžiť ako priamy dôkaz zriedenia mlieka vodou. 150

147 Tabuľka I Základné štatistické údaje výsledkov sledovaných vzoriek mlieka Limit Koef. korel. x min. max. Sx v% n=132 STN k BM tuk bielkoviny laktóza g/100g sušina mlieka BTS popol ph * SH BM m C chloridy mg/100g * močovina mlieka * CPM *10 3 /ml PSB mlieka * optimálne hodnoty BTS vykazuje koreláciu s hodnotou BM R = Túto hodnotu ovplyvňuje hlavne obsah laktózy, bielkovín a minerálnych látok, avšak ani v súčte nevykazujú významný vplyv na BM. Obsah sušiny má v sledovanom rozsahu pri R = 0,166 taktiež mizivý vplyv na hodnotu BM. Ako vidno z uvedených výsledkov, v hodnote BM autentického mlieka zrejme nie je zohľadnený obsah jednotlivých zložiek mlieka, ale osmotický tlak mlieka. A ten u nezvodného mlieka môže kolísať len v rozmedzí kolísania osmotického tlaku krvi v tele dojnice. Výsledok stanovenia hodnoty BM mlieka v prípade, že zistená hodnota je nižšia ako požadovaná hranica znamená, že mlieko obsahuje dostatočný obsah osmoticky účinných látok a nie je zriedené. Tento výsledok však nemusí znamenať, že má dostatočný obsah BTS, alebo bielkovín a laktózy. A naopak, ak je hodnota BM vzorky vyššia ako požadovaná hranica, je v takomto mlieku nedostatok rozpustných látok, ale nie je zákonitý nízky obsah základných zložiek, v súčte BTS. Bod mrznutia mlieka teda nemá dostatočnú vypovedaciu schopnosť o jeho zložení a technologickej kvalite. Priemerná hodnota bodu mrznutia vzoriek mlieka ktoré v jednotlivých ukazovateľoch v priemere vyhovovali požiadavkám normy, bola -513 ± 7m C. Početnosť vzoriek s rovnakou teplotou tuhnutia podľa obr. 2 bola najvyššia v kategóriách -512 a -515m C, a to 39% z celkového počtu vzoriek. Vidíme, že takáto hladina hodnôt BM je v našej oblasti pre neporušené mlieko typická. 37% vzoriek malo BM dokonca vyšší ako -510m C, pričom tieto hodnoty nesúviseli s nedostatočným obsahom jednotlivých základných zložiek mlieka a teda nemáme nijaký ukazovateľ, ktorý by mohol potvrdiť prípadné zvodnenie, z ktorého by mohli tieto vzorky byť na základe ich hodnôt BM podozrivé. V snahe nájsť vysvetlenie pre vzájomný súvis kvality mlieka a pomerne vysoké u nás zisťované hodnoty BM, sme sledovali i ďalšie faktory ktoré podľa literárnych údajov vplývajú na bod mrznutia. Kyslosť vzoriek vyjadrená ako hodnota ph, bola v rozmedzí , v priemere 6.52 a v regresnej analýze k BM vyšiel koeficient spoľahlivosti R = Titračná kyslosť, vyjadrená ako hodnota SH, bola v rozmedzí , v priemere 6.57 a koeficient spoľahlivosti = V tomto rozsahu hodnôt kyslosti mlieka sme teda nepozorovali významný vplyv na teplotu tuhnutia sledovaných vzoriek. 151

148 Podiel z celkového počtu v % Počet vzoriek Podiel z celkového počtu v % Bod mrznutia mlieka m C Obr. 1 Absolútna a relatívna početnosť výskytu vzoriek mlieka v rôznych kategóriách bodu mrznutia Počet vzoriek Ďalšou významnou zložkou mlieka poukazujúcou na vyrovnanosť metabolizmu a homeostázu dojníc je obsah močoviny v mlieku, ktorý sa v nami sledovaných vzorkách vyskytoval v rozmedzí mg/100g mlieka, v priemere mg/100g mlieka. Tu sa vyskytol i jediný stredne významný korelačný koeficient R = , a to je stredne silná negatívna závislosť medzi teplotou tuhnutia a obsahom močoviny v mlieku. Ako však vidíme na obr. 4, vyskytli sa i vzorky ktoré mali i popri nízkom obsahu močoviny nízku teplotu tuhnutia. Vzhľadom k tomu, že obsah močoviny v mlieku je indikátorom využiteľnosti dusíkatých látok kŕmnej dávky, nie je reálne predpokladať, že jeho ovplyvňovaním by bolo možné zlepšovať výsledky mlieka na BM. y = -0,0363x + 84,846 R 2 = 0,0009 y = -0,7047x - 334,64 R 2 = 0, močovina chloridy lin. (močovina) lin. (chloridy) mg/100g mlieka Bod mrznutia mlieka (m C) Obr. 2 Obsah chloridov a močoviny v mlieku vo vzťahu k bodu mrznutia mlieka

149 Zdravotný stav mliečnej žľazy odzrkadľuje okrem počtu somatických buniek v mlieku i obsah chloridových iónov Cl -. V uvádzanom súbore vzoriek sa vyskytoval v rozmedzí mg/100mlieka, v priemere mg/100gmlieka. Korelácia s BM sa nezistila, keď R = Pomerne vysoké hodnoty teploty tuhnutia mlieka zisťované v bazénových vzorkách na Slovensku teda nie sú jednoznačným dôkazom zvodnenia mlieka, pretože sa vyskytujú i u vzoriek s dostatočným obsahom všetkých základných zložiek. V odborných kruhoch v európskej únii sa vedú diskusie o význame tohto parametra pri hodnotení mlieka pre speňažovanie a uvažuje sa o jeho zrušení. Použitá literatura: 1. BUCHBERGER, J: Untersuchungen zum Gefrierpunkt der Milch. In: Archiv für Lebensmittelhygiene, 41, 1990, s HANUŠ, O. - JÍLEK, M. - SKYVA, J.: Krátce k bodu mrznutí mléka. In: Náš chov, 58, 1998, 8, s HARDING, F.: Milk adulteration-freezing point depression. In: J. of the Soc. of Dairy Technol., 43, 1990, s HEJLOVÁ, Š. POLÁK, P.: Několik poznámek o bodu mrznutí mléka. In: Technická kontrola jakosti v mlékárenském průmyslu: Zbor. z medzin. ved. konf., Kroměříž: SOUP, 1994, s KIRCHNEROVÁ, K. FOLTYS, V.: Teplota tuhnutia surového kravského mlieka ako najnovšie kritérium kvality v STN In: J. of Farm Anim. Sci. (Ved. pr. VÚŽV Nitra), 32, 1999, s MICHALCOVÁ, A.: Vplyv niektorých faktorov na teplotu tuhnutia mlieka. Doktorská dizertačná práca, Nitra: SPU, Agronomická fakulta, 1997, 122 s. 7. PALO, V., - FÁBRY, I. - HOSTÍN, S.: Kryoskopické štúdium akosti mlieka. I. Mlieko nakupované Bratislavským mliekárenským závodom. In: Poľnohospodárstvo, 38, 1992, 3, s POPELKA, P. KIRCHNEROVÁ, K. SOKOL, J. RIGO, F. VIRGALOVÁ, G.: Nové metodické postupy pri vyšetrovaní surového kravského mlieka. Nitra: ŠVÚ, 1992, 25 s. Kontaktní adresa: Ing. Katarína Kirchnerová, PhD., Ing. Vladimír Foltys, PhD. Ústav kvality živočíšnych produktov, Slovenské centrum poľnohospodárskeho výskumu, Hlohovská 2, SK Nitra tel: , kirchnerova@vuzv.sk 153

150 VLIV PŘÍDAVKU PROTEINU OBOHACENÉHO ESENCIÁLNÍMI AMINOKYSELINAMI DO BACHORU DOJNIC NA MNOŽSTVÍ A OBSAHOVÉ SLOŽKY MLÉKA Hadrová Sylvie 1, Křížová Ludmila 1, Bjelka Marek 1, Černý Vladimír 2, Třináctý Jiří 1 1 Výzkumný ústav pro chov skotu, s. r. o., pracoviště Pohořelice a Rapotín 2 MILCOM a.s., Výzkumný ústav mlékárenský THE EFFECT OF SUPPLEMENTATION OF PROTEIN ENRICHED WITH ESSENTIAL AMINO ACIDS INTO THE RUMEN OF LACTATING DAIRY COWS ON MILK YIELD AND COMPOSITION Summary: The aim of this study was to determine the effect of rumen-protected soya-protein HP 300, enriched with lysine (Lys), methionine (Met) and histidine (His), added in form of rumen-protected tablets to rumen of dairy cows on the yield and composition of milk. The experiment was carried out on three lactating Holstein cows of average weight of 523 kg fitted with ruminal and duodenal cannulas. The experiment was divided into 4 periods of 13 d (10 d preliminary period and a 3 d experimental period). In the first period one cow received the tablets (T group) and the other two received the non-tableted mixture (K group, control) with the same composition. In the subsequent period the rate of animals was antipodal. Cows were fed on a diet based on a corn silage, alfalfa hay and a supplemental mixture. Average milk yield recorded in group T was 17.8 kg and was significantly higher than that recorded in group K (16,6 kg, P<0,05). Protein content was affected by the treatment (3.1 vs. 3.2 %, P<0.05), protein yield was higher (572.4 g/d) in the T group than in the K (515.8 g/d, P<0.05). Casein content and yield in T group was higher than in K group (2.70% and g vs. 2.46% and g, P<0.05). Contents of individual casein fractions were unaffected by the treatment. Yields of individual casein fractions (α-casein, β-casein and κ-casein) were significantly higher in the T group than in the K (P<0.05). Podporováno výzkumným záměrem MSM č Úvod Obsah základních složek mléka můžeme ovlivnit nejen za pomoci genetických přístupů, ale i krmnými zásahy. Nedostatečné zásobování dojnic proteinem a nedostatečná saturace potřeb dojnic esenciálními aminokyselinami vedou v praktických podmínkách ke snížení produkce a ovlivnění složení mléka. Dosažení maximální produkce proteinu (mléko, maso) je ovlivněno množstvím a vzájemným poměrem jednotlivých stravitelných aminokyselin. Syntéza mléčného proteinu může být limitována množstvím prekurzorů, které se dostanou do mléčné žlázy dojnic, zvláště pak hladinami jednotlivých esenciálních aminokyselin. Pro syntézu proteinu je využita většina aminokyselin, které jsou v mléčné žláze absorbovány. Hlavními proteiny, syntetizovanými v mléčné žláze skotu, jsou kaseiny (α S1 -kasein, α S2 -kasein, β-kasein, κ-kasein) a syrovátkové bílkoviny (především β-laktoglobulin a α-laktalbumin), představují asi 92% bovinních mléčných proteinů. Zbývající proteiny, které se v mléce skotu nacházejí (např. imunoglobuliny), jsou absorbovány přímo z krve a nejsou syntetizovány v mléčné žláze (Bequette et al., 1998). Kaseiny tvoří přibližně 76-86% z celkového množství proteinu (DePeters a Cant, 1992). Zpracovatelské vlastnosti mléka, výtěžek a kvalita sýrů, jsou primárně určeny obsahem tuku a proteinu v mléce, obsah kaseinu je pak zvláště důležitý pro výrobu sýrů (Christensen et al., 1994). Podle Gregy et al. (1999) ovlivňuje celkový obsah mléčného proteinu a jeho frakce, κ-kasein a β-laktoglobulin (zvláště pak některé z jejich genetických variant), výtěžnost sýrů a jeho rheologické vlastnosti. Většina studií prokázala pozitivní vliv postruminálního doplňku esenciálních aminokyselin na syntézu mléčného proteinu a kaseinu, zvláště v rané laktaci (DePeters a Cant, 1992). Dále bylo zjištěno, že se podíl kaseinu po doplňku ruminálně chráněných aminokyselin zvyšuje, zatímco podíl syrovátkových bílkovin a neproteinové frakce zůstává nezměněn (Schwab, 1993). Nejednoznačné výsledky v publikovaných studiích se objevují u vlivu chráněných 154

151 aminokyselin na jednotlivé kaseinové frakce. Zatímco po duodenálních infuzích methioninu se snižoval podíl α-kaseinu a κ-kasein nebyl pokusným zásahem ovlivněn (Pisulewski et al., 1996), infuze lysinu obsah kaseinových frakcí téměř neovlivnila (Guinard et al., 1994). Po podání ruminálně chráněného methioninu a lysinu naopak došlo ke zvýšení obsahu α- a β-kaseinu a snížení obsahu κ-kaseinu (Donkin et al., 1989). Cílem pokusu bylo stanovit vliv přídavku ruminálně chráněného sojového proteinu obohaceného esenciálními aminokyselinami lysinem (Lys), methioninem (Met) a histidinem (His) ve formě tablet na množství a obsahové složky mléka. Materiál a metody Pokus byl proveden na 3 laktujících holštýnských dojnicích (1.-3. laktace), o průměrné hmotnosti 523 kg, s ruminálními a duodenálními kanylami. Pokus proběhl ve 4 periodách, každá perioda zahrnovala 10 dnů přípravného a 3 dny pokusného období. V 1. periodě byl jedné dojnici podán doplněk ve formě ruminálně chráněných tablet (T) a zbývajícím dvěma dojnicím v práškové, neztabletované formě (K, kontrola). V následující periodě byl poměr zvířat opačný. Dojnice byly krmeny dvakrát denně krmnou dávkou, složenou z kukuřičné siláže (54,7 %), vojtěškového sena (15,0 %) a doplňkové směsi (30,3 %). Tablety obsahovaly čištěný sojový protein HP 300, Lys, Met a His. Krávy byly dojeny dvakrát denně v 7.15 a hod. Po každém dojení byla zaznamenána mléčná užitkovost a byly odebrány vzorky mléka. Pro základní rozbor mléka (obsah sušiny, proteinu, tuku a laktózy) bylo ranní a večerní mléko konzervováno Bronopolem, ochlazeno na 6 C a analyzováno infračerveným absorpčním analyzátorem (Bentley Instruments 2000, Bentley Instruments Inc., USA). Obsah kaseinu v mléce byl stanoven po vysrážení 10% kyselinou octovou při ph 4,6. Kjeldahlova metoda byla provedena na poloautomatickém zařízení Kjeltec auto Po odstranění zbytkového tuku byly vzorky kaseinu lyofilizovány na přístroji Lyovac GT 2, STERIS, Germany (López-Fandiño et al., 1993) a obsah kaseinových frakcí byl stanoven elektroforézou v polyakrylamidovém gelu (SDS-PAGE) s použitím Mini-Protean III Cell Electrophoresis apparatus (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA). Obsah nekaseinového proteinu byl stanoven výpočtem. Výsledky byly vyhodnoceny pomocí třífaktorové analýzy variance (faktory- pokusný zásah, dojnice a perioda) s využitím programu Statgraphics v Výsledky a diskuse Příjem sušiny krmiva (tabulka I), a následně i ostatních živin, byl průkazně vyšší ve skupině T než ve skupině K (P<0,05). Podobné odezvy na podání ruminálně chráněných aminokyselin byly publikovány i v jiných pracech (Schwab et al., 1992; Vanhatalo et al., 1999). Naproti tomu v jiných studiích, sledujících vliv ruminálně chráněného methioninu nebo duodenálně infundovaného lysinu, nebyl pozitivní vliv na příjem krmiva prokázán (Guinard a Rulquin, 1994; Rulquin a Delaby, 1997). V tabulce II jsou uvedeny průměrné hodnoty užitkovosti dojnic, relativní obsah a produkce sledovaných parametrů mléka. Průměrná denní užitkovost u dojnic ze skupiny T byla vyšší než u dojnic z kontrolní skupiny (P<0,05). Podobné výsledky publikoval i Vanhatalo et al. (1999), který pozoroval vyšší mléčnou užitkovost u dojnic po infuzi směsi aminokyselin, složené z 6,5 g histidinu, 6 g methioninu a 19 g lysinu, ve srovnání s kontrolní skupinou (bez dotace aminokyselin). Fraser et al. (1991) usuzuje, že obsah histidinu v mikrobiálním proteinu je limitujícím pro produkci mléka. Obsah proteinu v mléce byl pokusným zásahem ovlivněn, signifikantně vyšší byl ve skupině T v porovnání se skupinou K (3,2 vs. 3,1 %, P<0,05), a rovněž produkce proteinu byla signifikantně vyšší ve skupině T oproti skupině K (572,4 vs. 515,8 g/d, P<0,05). Vanhatalo et al. (1999) nezjistil žádný vliv infuze methioninu, lysinu a histidinu na obsah proteinu v mléce, zatímco jeho produkce byla po podání aminokyselin průkazně zvýšena. Choung a Chamberlain (1995) popsali, že po intravenozním podání směsi aminokyselin (histidin, lysin, methionin a tryptophan) dojnicím, krmených travní siláží, došlo ke zvýšení denní produkce proteinu o 26%. 155

152 Tabulka I Spotřeba živin K (n=18) T (n=18) Živina Průměr SEM Průměr SEM Sušina kg 15,7 b 0,33 16,3 a 0,27 Organická hmota kg 14,6 b 0,30 15,1 a 0,25 Protein kg 1,9 b 0,05 2,0 a 0,04 Tuk kg 0,5 0,01 0,6 0,01 Vláknina kg 2,3 b 0,06 2,4 a 0,05 NDF kg 5,2 b 0,12 5,4 a 0,10 ADF kg 3,1 0,07 3,2 0,06 Popel kg 1,1 b 0,02 1,2 a 0,02 BNLV kg 9,6 b 0,21 9,9 a 0,17 PDIN kg 1,3 b 0,02 1,3 a 0,02 PDIE kg 1,3 b 0,02 1,4 a 0,02 NEL MJ 98,9 b 2,06 102,0 a 1,68 a,b hodnoty s indexy jsou průkazně odlišné (P<0,05) Tabulka II Užitkovost dojnic a obsah (%) a produkce (g/d) sledovaných složek mléka K (n=18) T (n=18) Obsah složek mléka Průměr SEM Průměr SEM Užitkovost kg/d 16,6 b 0,47 17,8 a 0,36 Sušina % 11,7 0,19 11,8 0,16 Protein % 3,1 b 0,10 3,2 a 0,07 Kasein % 2,5 b 0,10 2,7 a 0,06 α-kasein % 56,3 0,78 54,8 0,88 β-kasein % 31,3 0,78 32,7 0,89 κ-kasein % 12,5 0,24 12,5 0,29 Produkce složek mléka Protein g/d 515,8 b 20,44 572,4 a 7,55 Kasein g/d 407,8 b 18,95 477,9 a 11,08 α-kasein g/d 229,7 b 11,51 261,2 a 5,85 β-kasein g/d 127,6 b 6,47 156,9 a 6,69 κ-kasein g/d 50,7 b 2,37 59,9 a 2,22 Nekaseinový protein g/d 108,0 10,55 94,5 10,06 a,b hodnoty s indexy jsou průkazně odlišné (P<0,05) Obsah a produkce kaseinu byla průkazně vyšší ve skupině T ve srovnání s kontrolní skupinou (2,7 vs. 2,5 % respektive 477,9 vs. 407,8 g/d, P<0,05). Obsah jednotlivých kaseinových frakcí nebyl pokusným zásahem ovlivněn, produkce jednotlivých kaseinových frakcí však byla průkazně vyšší ve skupině T ve srovnání s kontrolní skupinou (261,2 vs. 229,7 g/d pro α-kasein, 156,9 vs. 127,6 g/d pro β-kasein a 59,9 vs. 50,7 g/d pro κ-kasein, P<0,05). Produkce nekaseinového proteinu byla stanovena výpočtem a průkazně se nelišila mezi oběma pokusnými skupinami. 156

153 Závěr Po přídavku ruminálně chráněného sojového proteinu, obohaceného esenciálními aminokyselinami Lys, Met a His, podávaného ve formě tablet do bachoru dojnic, došlo ke zvýšení obsahu proteinu a kaseinu a k navýšení produkce proteinu, kaseinu a kaseinových frakcí v mléce ve skupině pokusné ve srovnání s kontrolní. Použitá literatura: Bequette, B. J., Backwell, F. R. C., Cromptom, L. A. (1998): Current concepts of amino acid and protein metabolism in the mammary gland of the lactating ruminant. J. Dairy Sci., 81: DePeters, E. J., Cant, J. P. (1992): Nutritional factors influencing the nitrogen composition of bovine milk: a review. J. Dairy Sci., 75: Donkin, S. S., Varga, G. A., Sweeney, T. F., Muller, L. D. (1989): Rumen-protected methionine and lysine: Effects on animal performance, milk protein yield and physiologival measures. J. Dairy Sci., 72: Fraser D. L., Orskov E. R., Withelaw F. G., Franklin M. F. (1991): Limiting amino acids in dairy cows given casein as the sole source of protein. Livest. Prod. Sci., 28: Grega, T., Pisulewski, P., Kowalski, Z. M., Sady, M., 1999: Effect of rumen-protected amino acids (L-lysine and DL-methionine) on processing quality of milk. Pol. J. Food Nutr. Sci., 8/49 (3): Guinard J., Rulquin H. (1994): Effects of graded amounts of duodenal infusions of lysine an the mammary uptake of major milk precursors in dairy cows. J. Dairy Sci., 77: Choung J. J., Chamberlain D. G. (1995): The effects of intravenous supplements of amino acids on milk production of dairy cows consuming grass silage and supplement containing feather meal. J. Sci. Food Agric., 68: Christensen, R. A., Cameron, M. R., Clark, J. H., Drackley, J. K., Lynch, J. M., Barbano, D. M. (1994): Effects of amount of protein and ruminally protected amino acids in the diet of dairy cows fed supplemental fat. J. Dairy Sci., 77: López Fandiño, R., Olano, A., Corzo, N., Ramos, M. (1993): Proteolysis during storage of UHT milk: differences between whole and skim milk. J. Dairy Res., 60 (3): Pisulewski, P. M., Rulquin, H., Peyraud, J. L., Vérité, R. (1996): Lactational and systemic responses of dairy cows to postruminal infusions of increasing amounts of methionine. J. Dairy Sci., 79: Rulquin H., Delaby L. (1997): Effects of the energy balance of dairy cows on lactational responses to rumenprotected methionine. J. Dairy Sci., 80: Schwab, C. G. (1993): Rumen-protected amino acids for dairy cattle: progress towards determining lysine and methionine requirements. Proc. 28 th Annual Pacific Northwest Animal Nutr. Conf., Oct , Boise, ID. Schwab, C. G., Bozak, C. K., Whitehouse, N. L., Olson, V. M. (1992): Amino acid limitation and flow to the duodenum at four stages of lactation. 2. Extent of lysine limitation. J. Dairy Sci., 75: Vanhatalo A, Huhtanen P., Toivonen V., Varvikko T. (1999): Response of dairy cows fed grass silage diets to abomasal infusions of histidine alone or in combinations with methionine and lysine. J. Dairy Sci., 82: Kontaktní adresa: Ing. Sylvie Hadrová Výzkumný ústav pro chov skotu, s. r. o. pracoviště Pohořelice Vídeňská Pohořelice tel.: vuvz@vuvz.cz 157

154 VYUŽITÍ FT-NIR V ANALÝZE PASTEROVANÉHO MLÉKA Dračková Michaela, Hadra Luboš, Tatranová Iva, Vozková Lenka, Vorlová Lenka Ústav hygieny a technologie mléka, Fakulta veterinární hygieny a ekologie VFU Brno APPLICATION OF FT-NIR TO THE ANALYSIS OF PASTEURIZED MILK Summary: The aim of this study was to determine fat, lactose, total solid and non-fatty solids content by FT-NIR spectroscopy. Sixty five samples of pasteurized (whole, skimmed, semi-skimmed) milk were used to calibrate the instrument by partial least squares (PLS) method. Spectra were measured in the reflectance mode with a transflectance cuvette between and 4000 cm -1, averaging 100 scans. The following statistical values were obtained: correlation coefficient (R) = and standard error of calibration (SEC) = for fat, R = and SEC = for lactose, R = and SEC = for total solids and R = and SEC = for nonfatty solids. The calibration models developed were verified by cross validation. The study showed that FT-NIR is a potentially useful technique for evaluating the composition of pasteurized milk. Úvod Tradiční metody jsou pro hodnocení kvality potravin příliš zdlouhavé a nákladné. Řada autorů se proto zabývala sledováním základních složek potravin pomocí optických metod. V analýze zpracovávaného mléka a tekutých mléčných výrobků je dominantní střední infračervená oblast s přístroji typu MilkoScan. Pro mléko a mléčné výrobky zatím není NIR spektroskopie u nás příliš rozšířená, nicméně on-line NIR měření se začíná stále více objevovat (Čurda et al., 2002; Laporte et al., 1998). NIR spektroskopie se používá zejména pro stanovení hlavních složek, tzn. sušiny, bílkovin, tuku a sacharidů. Její uplatnění je však mnohem širší a zahrnuje i stanovení senzorických a fyzikálně chemických parametrů (hustota, bod tuhnutí, ph, velikost částic). NIR spektra jsou obvykle snímána v transmitanci a zpracována metodou PLS (Čurda et al., 2002; Tsenkova et al., 1998; Sorensen et al., 1998) Cílem naší práce bylo sestavení kalibračních modelů pro stanovení obsahu tuku, laktózy, sušiny a tukuprosté sušiny pomocí FT-NIR v pasterovaném mléce. Metodika Pro vytvoření kalibračních modelů byly použity vzorky pasterovaného mléka z tržní sítě. Pasterovaná mléka o různé tučnosti (plnotučné, odstředěné a polotučné) byla vzájemně smíchána v různém poměru (celkem 65), aby bylo zajištěno dostatečné rozpětí kalibračních hodnot. Ve vzorcích byly pomocí referenčních metod stanoveny následující parametry: obsah tuku (ČSN , 1995), sušiny (ČSN ISO 6731, 1997), laktózy a tukuprosté sušiny (ČSN , 1999). Vzorky mléka byly proměřeny na spektrometru Nicolet Antaris Near-IR Analyzer (Thermo Electron Corporation, Madison, USA) ve spektrálním rozsahu cm -1 se 100 scany. Čas snímání jednoho spektra se pohyboval okolo 1,5 min. Spektra byla měřena na integrační sféře v režimu reflektance s použitím transflektanční kyvety o tloušťce vrstvy 0,1 mm. Vzorky byly temperovány na 40 C, promíchány a po ochlazení na 20 C byly přeneseny na Petriho misky. Naměřená data byla zpracována pomocí programu TQ Analyst verze metodou PLS (částečných nejmenších čtverců). Stejné vzorky byly použity pro křížovou validaci. Ke statistickému vyhodnocení dat byl použit párový T test STAT Plus (Matoušková et al., 1992). Výsledky a diskuse Pro vytvoření kalibračních modelů bylo použito celkem 65 vzorků pasterovaného mléka. Rozpětí referenčních hodnot pro jednotlivé složky jsou vyjádřena jako směrodatná odchylka průměru (Tab. I). Pomocí diagnostických nástrojů (Spectrum Outlier a Leverage) byly 158

155 pro vytvoření kalibračních modelů odstraněny odlehlé standardy, u kterých byla nepřesně stanovena referenční hodnota nebo se objevila spektrální odchylka ve změřeném spektru. Pro vytvoření vlastních modelů bylo proto použito 56 vzorků pro laktózu, 53 vzorků pro tukuprostou sušinu, 50 vzorků pro tuk a 49 vzorků pro sušinu (Tab. II). Kalibrační modely byly vytvořeny pomocí PLS algoritmu (partial least squares). Důležitým diagnostickým nástrojem je závislost PRESS (predicted resiudual error sum of squares) na počtu PLS faktorů použitých ke kalibraci, který umožňuje odhadnout optimální počet faktorů (Čurda et al. 2002; Jankovská a Šustová 2003). Hodnota PRESS je indikátorem chyby kalibrace PLS metody. Kalibrační a validační výsledky pro sledované parametry jsou uvedeny v tabulce II. Tabulka I Referenční hodnoty pro pasterované mléko parametr (%) n x min max SD tuk 63 1,67 0,13 3,84 0,84 laktóza 65 4,88 4,42 5,12 0,12 sušina 54 10,51 9,01 14,21 0,96 tukuprostá sušina 65 8,80 7,91 9,44 0,28 n počet vzorků, x - průměr, min a max minimální a maximální hodnota, SD směrodatná odchylka Tabulka II Kalibrační a validační výsledky kalibrované parametry (%) n PLS faktory derivace vlnové délky (cm -1 ) rozpětí konc. tuk , ,29 0,42 3,84 laktóza , ,80 4,73 5,08 sušina , ,30 9,01 12,43 tukuprostá sušina , , , , , ,53 8,23 9,25 kalibrované kalibrace validace parametry (%) R SEC CCV (%) R SECV PCV (%) tuk 0,995 0,078 4,60 0,982 0,150 8,80 laktóza 0,851 0,050 1,02 0,726 0,066 1,35 sušina 0,933 0,234 2,26 0,887 0,299 2,89 tukuprostá sušina 0,856 0,133 1,51 0,765 0,166 1,89 R korelační koeficient, SEC směrodatná odchylka kalibrace, SECV směrodatná odchylka validace, CCV kalibrační variační koeficient, PCV predikční variační koeficient, n počet vzorků po odstranění odlehlých standardů Nejvyšší korelační koeficient kalibrace byl zaznamenán u parametru tuku R = 0,955, kdy SEC byla 0,078. Velmi dobrý korelační koeficient byl nalezen také u parametru sušiny R = 0,933. U dalších sledovaných parametrů laktózy a tukuprosté sušiny byly hodnoty R menší než 0,900. Obdobné výsledky zaznamenali také Tsenkova et al. (1999). Uvedení autoři zjistili u nehomogenizovaného mléka, na základě použití různých spektrálních regionů, korelační koeficienty pro tuk v rozmezí 0,996 0,999 a pro laktózu 0,813 0,857. Jankovská a Šustová (2003) ve své práci, zaměřené na syrové mléko, dosáhli téměř stejné hodnoty korelačního koeficientu pro tuk (R = 0,961). Pro laktózu (R = 0,931) a sušinu (R = 0,928) však zaznamenali, ve srovnání s touto prací, vyšší korelační koeficienty. 159

156 Pro vytvoření validačních modelů metodou křížové validace byla použita stejná sada vzorků jako při kalibraci. U všech modelů se jedná o pevnou závislost mezi hodnotami referenčními a hodnotami predikovanými. Průběh těchto závislostí pro tuk a sušinu je patrný z obr. 1 a 2. Křížová validace je charakterizována korelačním koeficientem validace (R) a směrodatnou odchylkou validace (SECV). Pomocí těchto ukazatelů jsme ověřili spolehlivost kalibračního modelu. Nejvyšší korelační koeficient validace byl zjištěn opět pro tuk (R = 0,982). Pro laktózu a tukuprostou sušinu se hodnoty R pohybovaly pod 0,800. Dalším kritériem pro posouzení použitelnosti kalibrace v NIR spektroskopii je kalibrační variační koeficient (CCV) a predikční variační koeficient (PCV). Za velmi spolehlivou kalibraci je předpokládána hodnota CCV pod 5 % a PCV pod 10 % (Jankovská a Šustová, 2003). Pro všechny sledované parametry pasterovaného mléka jsou hodnoty CCV i PCV v mezích velmi spolehlivé kalibrace (Tab. II). Pomocí párového T testu nebyly nalezeny statisticky významné rozdíly (p < 0,05) mezi referenčními hodnotami a vypočítanými hodnotami pomocí FT-NIR. tuk NIR (%) 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 y = 0,9898x + 0,0173 R 2 = 0,9903 y = 0,9815x + 0,0348 R 2 = 0,9652 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 tuk REF (%) kalibrace Lineární (kalibrace) cross validace Lineární (cross validace) Obr. 1 Kalibrační a validační modely pro tuk sušina NIR (%) 12,5 12,0 11,5 11,0 10,5 10,0 9,5 y = 0,8698x + 1,3477 R 2 = 0,8707 y = 0,801x + 2,0581 R 2 = 0,7874 9,0 9,0 9,5 10,0 10,5 11,0 11,5 12,0 12,5 sušina REF (%) kalibrace Lineární (kalibrace) Obr. 2 Kalibrační a validační modely pro sušinu cross validace Lineární (cross validace) 160

157 Závěr Byly vytvořeny kalibrační modely pro stanovení obsahu tuku, laktózy, sušiny a tukuprosté sušiny. Výsledky byly posouzeny na základě korelace mezi referenčními a vypočtenými hodnotami z kalibračních rovnic a na základě směrodatných odchylek kalibrace a validace (SEC, SECV). Korelační koeficient pro tuk a sušinu se přibližují hodnotě 1, což je pro použitelnost modelu nejvhodnější. FT-NIR představuje proto vhodnou techniku pro rychlou a jednoduchou analýzu vybraných parametrů pasterovaného mléka. Použitá literatura: 1. ČSN Metody zkoušení mléka a tekutých mléčných výrobků. Vydal Úřad pro normalizaci a měření, Praha, 1995, s ČSN Stanovení složení mléka infračerveným absorpčním analyzátorem. Vydal Český normalizační institut, Praha, ČSN ISO 6731 Mléko, smetana a zahuštěné neslazené mléko Stanovení obsahu celkové sušiny (referenční metoda). Vydal Český normalizační institut, 1997, s ČURDA, L., KUKAČKOVÁ, O., NOVOTNÁ, M. NIR spektroskopie a její využití při analýze mléka a mléčných výrobků. Chem. Listy, 2002, vol. 96, no. 5, p JANKOVSKÁ, R., ŠUSTOVÁ, K. Analysis of cow milk by near-infrared spectroscopy. Czech J. Food Sci., 2003, vol. 21, no. 4, p MATOUŠKOVÁ, O., CHALUPA, J., CÍGLER, M., HRUŠKA, K. STAT-Plus uživatelská příručka, verse 1.01., Veterinary Research institute, Brno, CR. 7. LAPORTE, MF., MARTEL, R., PAQUIN, P. The near-infrared optic probe for monitoring rennet coagulation in cow s milk. Int. Dairy J., 1998, vol. 8, no. 7, p SORENSEN, LK., JEPSEN, R. Assessment of sensory properties of cheese by near-infrared spectroscopy. Int. Dairy J., 1998, vol. 8, no , p TSENKOVA, R., ATANASSOVA, S., TOYODA, K., OZAKI, Y., ITOH, K., FEARN, T. Nearinfrared spectroscopy for dairy management: measurement of unhomogenized milk composition. J. Dairy Sci., 1999, vol. 82, no. 11, p Práce vznikla za podpory výzkumného záměru MSM Veterinární aspekty bezpečnosti a kvality potravin. Kontaktní adresa: MVDr. Michaela Dračková, Ph.D., Ústav hygieny a technologie mléka, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno, Palackého 1/3, Brno, drackovam@vfu.cz 161

158 POSOUZENÍ VLIVU ROZDÍLNÝCH TEPLOT KRAVSKÉHO MLÉKA NA PŘESNOST MĚŘENÍ METODOU NIR SPEKTROSKOPIE Růžičková Jana, Šustová Květoslava Ústav Technologie potravin, Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně IMPACT OF DIFFERENT TEMPERATURES IN NIR SPECTROSCOPY MEASURING OF COW S MILK COMPOSITION Summary: NIR spectroscopy making use of a near infrared spectrum offers wide using in a food quality control. This quick method allows the measuring of numerous samples with minimal usage of chemicals. Due this fact it is also used in quantitative analyses of milk composition. In this study we observed an impact of different temperatures of cow s milk samples on measuring exactness. The milk samples were taken from separate dairy cows and immediately refrigerated to 6-8 C. Until the analysis the samples were deposited in the refrigerator. Just before the analysis on FT NIR spectrometer they were warmed to 40 C and then cooled down in water bath to the temperatures 20 C, 21 C, 23 C and 25 C. Afterwards the samples were measured on Petri dish in reflectance mode with resolution 8 and number of scans 100. The spectres of samples were evaluated using calibration models for determination of solids and contents of proteins, fat and lactose. Observed measures were statistically compared within separate temperatures in relation to standard temperature 20 C. ÚVOD Spektroskopie NIR oblasti (blízká infračervená oblast) poskytuje širokou paletu aplikací v kontrole jakostních ukazatelů potravinářských surovin, meziproduktů i finálních výrobků. Avšak použití NIR spektroskopie je mnohem širší a zahrnuje i stanovení senzorických a fyzikálně chemických parametrů (hustota, bod tuhnutí, ph, velikost částic) (RODRIQUEZ-OTERO J. et al., 1997). Této metody se využívá zejména pro stanovení hlavních složek (sušina, bílkoviny, tuk a sacharidy) při analýzách kvantitativního složení mléka (ČURDA et al. 2002; SASIC et al. 2001). NIR spektroskopie využívá oblast měření mezi cm -1. Jedná se o metodu rychlou, nedestruktivní, s minimální spotřebou chemikálií. Cílem naší práce bylo posouzení vlivu rozdílných teplot vzorků kravského mléka při měření NIR spektroskopem v závislosti na odečítání vybraných jakostních ukazatelů z kalibračních modelů vyhotovených pro analýzu mléka při 20 C. METODIKA K analýze byly použity vzorky syrového kravského mléka odebírané od jednotlivých dojnic pomocí Tru-testu při večerním dojení. Po odběru byly ihned vychlazeny na teplotu 6-8 C a do doby analýzy (druhý den ráno) uchovávány v chladu. Před samotným měřením se vzorky vytemperovaly ve vodní lázni na teplotu 40 C a následně ochladily na teplotu měření 20 C dle normy ČSN Za účelem naší práce byly tytéž vzorky vytemperovány rovněž na teplotu odlišnou a to 21 C, 23 C a 25 C. Vzorky mléka byly měřeny na přístroji FT NIR Antaris firmy ThermoNicolet ve spektrálním rozsahu cm -1 v režimu reflektance na integrační sféře pomocí zrcátka určujícího konstantní množství vzorku na Petriho misce. Spektra se proměřovala při 100 scanech a rozlišení 8 s dobou snímání cca 50 vteřin. Každý vzorek byl změřen třikrát a ke stanovení složení bylo použito průměrné spektrum. Spektra byla porovnána s kalibračními modely pro obsah sušiny, bílkovin, tuku a laktózy pro syrové kravské mléko vyhotovené pro teplotu 20 C. Získané hodnoty pro jednotlivé teploty a složky byly statisticky vyhodnoceny pomocí statistického programu S plus 2000 (S plus, 1999) ANOVA testem průkaznosti rozdílu mezi porovnávanými teplotami. 162

159 VÝSLEDKY Ke zjištění možného rozdílu mezi porovnávanými teplotami bylo použito 90 vzorků syrového kravského mléka měřené při teplotách 20 C, 21 C, 23 C a 25 C na vodní lázni. U každého vzorku bylo odečteno složení základních jakostních ukazatelů (sušina, obsah bílkovin, tuku a laktózy) dle kalibračních modelů NIR spektroskopu a následně porovnáno mezi sebou v rámci daných teplot měření. K porovnání byla použita ANOVA test průkaznosti rozdílu mezi jednotlivými teplotami a došli jsme k výsledku, že mezi vybranými teplotami existuje signifikantní rozdíl při hladině významnosti α = 0,05. U modelu pro sušinu je mezi teplotami zjištěn statisticky vysoce průkazný rozdíl (p < 0,001), pro kalibrační modely pro stanovení bílkovin a tuku jsme dospěli k velmi vysokému statisticky průkaznému rozdílu (p < 0,0001). Výjimku tvoří pouze model pro stanovení laktózy, i zde byl ovšem zjištěn statisticky průkazný rozdíl mezi porovnávanými teplotami. Výsledky ANOVA testu jsou shrnuty v tabulce I. Tabulka I Výsledky statistického vyhodnocení pomocí ANOVA Ukazatel DF F P Sušina 3 7,73918 ** Bílkoviny 3 48,23577 *** Tuk 3 13,17333 *** Laktóza 3 2, * DF stupně volnosti; F faktor průkaznosti; P pravděpodobnost; * p < 0,01; ** p < 0,001; *** p < 0,0001 Na jednotlivých obrázcích (1 4) jsou graficky zaznamenány rozdíly mezi porovnávanými teplotami pro jednotlivé složky mléka. Obrázek 1 vyjadřuje rozdílnost zjištěných vážených průměrů u modelu sušiny, je zde patrný zvyšující se rozdíl v obsahu sušiny se stoupající teplotou (kolísání mezi 21 C a 23 C). U kalibračního modelu pro obsah bílkovin syrového kravského mléka je zřejmý lineárně se zvyšující se rozdíl mezi váženými průměry viz obrázek 2. U obsahu tuku (obr. 3) je zaznamenán jistý skok mezi 21 C a 23 C, nejedná se o čistě lineární průběh změny. Nejmenší rozdíl byl zaznamenám u kalibračního modelu pro laktózu mezi teplotou 20 C a 21 C, avšak opět se objevil větší rozdíl mezi teplotou 21 C a 23 C. Obr.1 Grafické znázornění rozdílu mezi teplotami měření u obsahu sušiny kravského mléka 163

160 Obr.2 Grafické znázornění rozdílu mezi teplotami měření u obsahu bílkovin kravského mléka Obr.3 Grafické znázornění rozdílu mezi teplotami měření u obsahu tuku kravského mléka Obr.4 Grafické znázornění rozdílu mezi teplotami měření u obsahu laktózy kravského mléka 164

161 Všechna získaná spektra při každé teplotě mléka byla podrobena rovněž dikriminační analýze (obr.5). Výsledkem je rozvržení do klastrů, které by měly odpovídat vybraným teplotám měření. Z důvodu velkého počtu spekter (pro každou teplotu 90 vzorků) dochází k patrnému překrývání jednotlivých klastrů. Obr.5 Diskriminační analýza spekter kravského mléka pro teploty 20 C, 21 C, 23 C a 25 C ZÁVĚR Podle dosažených výsledků lze usuzovat, že teplota vzorků při měření NIR spektroskopem je důležitá. Po statistickém vyhodnocení byl prokázán statistický rozdíl mezi porovnávanými teplotami, přičemž by zaznamenán největší rozdíl mezi teplotou 20 C a 25 C. Menších variací rozdílu bylo mezi sousedními teplotami 20 C a 21 C a taktéž 23 C a 25 C. Proto je třeba dodržovat teplotu vzorku shodnou s teplotou, na níž je kalibrován model NIR spektroskopu pro danou složku. Použitá literatura: 1. ČURDA L., KUKAČKOVÁ O., NOVOTNÁ M., Near-infrared spektroskopy and its application to milk and dairy products analysis. Chemické listy 96: ČSN : Metody zkoušení mléka a tekutých mléčných výrobků. Methods for testing of milk and milk products. Článek IV. Fyzikální a chemické zkoušky, část A. Mléko, účinnost od RODRÍGUEZ-OTERO J. L., HERMIDA M., CENTERO J., Analysis of dairy products by near-infrared spectroscopy. J. Agric. Fd. Chem. 45: SASIC S., OZAKI Y., Short-wave hear-infrared spectroscopy of biological fluids. 1. Quantitative analysis of fat, protein, and lactose in raw milk by partial least squares regression and band assignment. Analytical Chemistry 73: S plus Guide to statistic, Volume 1. Data analysis Products Division, MathSoft, Seatle, WA, 637 s. Kontaktní adresa: Jana Růžičková, Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, Ústav Technologie potravin, Zemědělská 1, Brno , Česká republika Tel: , xruzic10@node.mendelu.cz 165

162 VYUŽITÍ RŮZNÝCH ZPŮSOBŮ EXTRAKCE PRO ANALÝZU AROMA LÁTEK SÝRA NIVA Štoudková Hana, Vítová Eva, Loupancová Blanka, Fišera Miroslav Fakulta chemická, Vysoké učení technické v Brně ANALYSE AROMA SUBSTANCES OF CHEESE NIVA USING VARIOUS WAYS OF EXTRACTION Summary: Blue mould-ripened cheeses are favourite for their specific flavour. The aim was to isolate aroma substances of cheese using various ways of extraction. Method with molecular sieves and SPME method (solid phase microextraction) were used for isolation of these aromatic substances. Extraction was followed by a gas chromatography analysis. The aromatic compounds were identified and quantified based on available standards. Blue mould-ripened cheese Niva in the various stages of ripening was tested. Two types of molecular sieves were applied: Molecular Sieve 5A and Carboxen 569. First of all optimal extraction conditions were determined for both of used adsorbents. 6 aromatic substances consisting of 3 alcohols, 2 ketones and 1 aldehyde were identified using Molecular Sieve 5A. In the case of Carboxen 569 total 11 aromatic compounds consisting of 3 alcohols, 2 ketones, 2 aldehydes, 2 acids and 2 sulphides were identified. A total of 27 aromatic compounds were identified using SPME: 10 alcohols, 6 ketones, 4 aldehydes, 3 acids, 2 sulphides, 1 ester and 1 nitrogen compound. Most of these volatile compounds were present in all stages of cheese ripening, however their amount changed significantly. Ethanol, acetaldehyde, butyric acid and acetic acid were the most significant. By comparing of extraction effectiveness of HS-SPME method and method using both types of molecular sieves is more effective solid phase microextraction. SPME is fast, simple and sensitive extractive method which has wide-ranging application. Úvod Sýry s modrou plísní v těstě jsou oblíbené zejména díky svým specifickým organoleptickým vlastnostem. Charakteristické aroma je způsobeno především lipolytickou a proteolytickou činností použité plísně Penicillium roqueforti [1]. Ta tvoří v nákroji typický mramorový porost modré nebo modrozelené barvy a zajišťuje hlavní biochemické pochody v průběhu zrání, kdy sýry získávají typickou chuť, vůni, vzhled, konzistenci a složení. Cílem bylo různými způsoby extrakce izolovat látky podílející se na aroma a chuti sýra. Byly použity vzorky sýra s modrou plísní v těstě Niva v různých stupních zralosti. Extrakce nízkomolekulárních organických látek z headspace (HS) sýra byla provedena dvěma způsoby. Jednak byla aplikována metoda SPME (mikroextrakce tuhou fází), která je dnes hojně uplatňována na široké spektrum různých biologických vzorků včetně chuťových a vonných složek potravin [2]. Dále bylo využito adsorpčních vlastností dvou typů vybraných molekulových sít polární Molecular Sieve 5A a nepolární Carboxen 569 [3,4]. Nasorbované aromatické látky byly identifikovány a kvantifikovány na základě dostupných standardů plynovou chromatografií. Experimentální část Vzorky Byly použity vzorky sýrů s modrou plísní v těstě Niva s obsahem sušiny 55 % a tuku v sušině 50 %. Vzorky byly různého stáří 8, 15, 23, 30, 35, 42, 49 a 56 dní. Ze sýra byla odkrojena výseč, ze které se odstranily povrchové vrstvy. Vzorek byl nastrouhán, promíchán a s příslušnou navážkou byla provedena vlastní extrakce. 166

163 Podmínky extrakce aromatických látek pomocí molekulových sít Molecular Sieve 5A, 30/40 mesh (molekulové síto 5A, síťování 30/40) Carboxen TM 569, 20/45 mesh (Carboxen TM 569, síťování 20/45) Aktivace: 4 hodiny; Molecular Sieve 5A při 300 C; Carboxen TM 569 při 200 C Extrakční (laboratorní) teplota: 25 C Doba extrakce: 60 minut Množství molekulového síta: 0,5 g Použité rozpouštědlo: heptan Navážka sýra: 10 g Množství použitého rozpouštědla: 2 ml Obr. 1 Schéma uspořádání aparatury pro extrakci těkavých látek ze sýra využitím molekulových sít Pro umístění vzorku sýra byla použita skleněná trubice se zábrusem (2). Při analýze bylo důležité, aby se na molekulové síto naadsorbovalo co nejméně vlhkosti. Proto byla na zúženou část skleněné trubice nasazena injekční stříkačka (1), která byla naplněna sušidlem - vyžíhaným síranem sodným. Také na druhém konci trubice byla umístěna buničina s tímto sušidlem. Pro umístění molekulového síta byla použita SPE kolonka (3). Celý systém byl přes plynovou promývací láhev (4) napojen na vakuovou tlakovou pumpu (5). Těkavé látky byly z molekulového síta získány s využitím vakuového Manifoldu promytím rozpouštědlem. Podmínky extrakce aromatických látek SPME technikou SPME vlákno s polární stacionární fází CAR TM /PDMS o tloušťce filmu 85 μm Způsob extrakce: headspace prostor nad vzorkem Navážka vzorku: 1 g Rovnovážná doba: 30 min Prodleva mezi extrakcí a desorpcí: 0 min Doba extrakce: 20 min Teplota desorpce: 280 C Teplota extrakce: 35 C Doba desorpce: 5 min Podmínky GC analýzy Plynový chromatograf TRACE GC (ThermoQuest Italia S. p. A., Itálie) Nosný plyn: dusík; optimální průtok 0,9 ml.min -1 Dávkování: splitless injection ventil je uzavřen po dobu 5 minut Teplota injektoru: 250 C Teplotní program: 40 C, 1 minuta; vzestupný gradient 5 C za minutu do 200 C s výdrží 7 minut Kolona: kapilární DB WAX o rozměrech 30 m 0,32 mm 0,5 μm Detektor: plamenově ionizační (FID), 220 C; průtok vodíku 35 ml.min -1, vzduchu 350 ml.min -1, make up dusíku 30 ml.min -1 Celková doba analýzy: 40 minut 167 4

164 Výsledky Stanovení aromatických látek s využitím molekulových sít Na základě retenčních časů použitých standardů bylo identifikováno v případě Molecular Sieve 5A celkem 6 aromatických látek, z toho 3 alkoholy, 2 ketony a 1 aldehyd. V nejvyšším množství byl detekován acetoin. V případě Carboxen 569 se podařilo identifikovat 11 aromatických sloučenin, z toho 3 alkoholy, 2 ketony, 2 kyseliny, 2 aldehydy a 2 sirné sloučeniny. V nejvyšším množství se vyskytoval nonan-2-on. Porovnání Molecular Sieve 5A a Carboxen 569 Molecular Sieve 5A adsorbuje polární sloučeniny a Carboxen 569 je sorbent především nepolárních látek. Pokud porovnáme účinnost sorpce obou molekulových sít během zrání, bylo zjištěno, že celkové množství aromatických látek, které se nasorbovaly v jednotlivých stupních zralosti, se v průběhu zrání u Carboxen 569 a také u Molecular Sieve 5A příliš nemění. Je však zřejmé, že na Molecular Sieve 5A se nasorbovalo několikrát větší množství látek než na Carboxen 569. Porovnání obou sorbentů je uvedeno na Obr Molecular Sieve 5A Carboxen 569 Množství nasorb. látek (mg) Doba zrání (dny) Obr. 2 Porovnání množství nasorbovaných látek na Molecular Sieve 5A a Carboxen 569 (různá doba zrání) V případě adsorpce Carboxen 569 bylo identifikováno 11 aromatických látek. Při využití Molecular Sieve 5A bylo identifikováno méně a to pouze 6 aromatických sloučenin. Z porovnání zjištěných koncentrací identifikovaných aromatických sloučenin vyplynulo, že při použití Molecular Sieve 5A se koncentrace látek pohybovala v desetinách, setinách a menších jednotkách μg.g -1 sýra. V případě Carboxen 569 byla koncentrace v nižších jednotkách a to v setinách, tisícinách a menších μg.g -1 sýra. Manipulace s Molecular Sieve 5A byla mnohem jednodušší než práce s Carboxen 569. Carboxen je tvořen malinkými kuličkami. Po aktivaci také docházelo k tomu, že se kuličky Carboxenu na každý materiál nepříjemně zachycovaly. Pracovat s tímto adsorbentem je poněkud obtížné. I přesto, že při extrakci Carboxen 569 bylo identifikováno více sloučenin než v případě Molecular Sieve 5A, jeví se použití Molecular Sieve 5A jako účinnější. Molecular Sieve 5A je adsorbentem polárním a většina těkavých aromatických látek, které jsou obsaženy v sýru s modrou plísní v těstě, jsou polární sloučeniny. 168

165 Stanovení aromatických látek metodou HS-SPME Aromatické látky byly stanovovány u série vzorku v různých fázích zrání. Extrakce probíhala metodou HS-SPME, tedy z headspace prostoru nad vzorkem. Na základě retenčních časů použitých standardů bylo identifikováno a kvantifikováno celkem 27 aromatických sloučenin, z toho 3 kyseliny, 6 ketonů, 2 sulfidy, 4 aldehydy, 10 alkoholů, 1 ester a 1 dusíkatá sloučenina. V použitém vzorku sýru Niva byly v nejvyšší množství zastoupeny ethanol, acetaldehyd, kyselina octová, methanol a kyselina máselná. Většina zjištěných aromatických látek byla přítomna ve všech stupních zrání, nicméně během zrání se jejich množství výrazně měnilo. Srovnání metody využívající molekulová síta a metody SPME Metodu využívající molekulová síta a metodu SPME lze porovnávat z několika hledisek. V našem případě byla srovnána délka analýzy, složitost aparatury, nároky na množství použitého vzorku sýra, použití rozpouštědel v analýze a výsledky analýzy. Molekulová síta na rozdíl od SPME vlákna na sebe velice rychle navazují vlhkost a další plynné látky ze vzduchu a to práci s nimi poměrně znesnadňuje. Před začátkem extrakce muselo být molekulové síto podrobeno aktivaci při vysoké teplotě (Molecular Sieve 5A 300 C, Carboxen C) po delší dobu (v našem případě 4 hodiny). Pro každou analýzu byla navážena nová dávka molekulového síta. Zatímco SPME vlákno lze používat opakovaně a aktivace byla provedena po několika analýzách. U extrakce využívající molekulových sít byla optimální extrakční doba delší doba než při využití HS-SPME. V případě molekulových sít extrakce probíhala po dobu 60 minut, zatímco optimální doba u SPME byla stanovena pouze na 30 minut. Nároky na množství vzorku byly v případě extrakcí molekulovými síty vyšší, při optimálních podmínkách bylo použito 10 g sýra, zatímco u SPME pouze 1 g sýra. U extrakce SPME technikou je adsorpční materiál umístěn na povrchu křemenného vlákna. Při analýze byla použita vialka s teflon-kaučukovým septem, do které byl vkládán vzorek sýra. Další součástí byla vodní lázeň, do níž se umístila vialka a která zajišťovala konstantní teplotu po celou dobu extrakce a napomáhala přestupu těkavých aromatických látek ze vzorku na povrch vlákna. SPME vlákno bylo umístěno přímo v prostoru nad sýrem. V případě molekulových sít byla sestavena speciální aparatura. Ta byla složena z několika součástí, jejichž spoje bylo nutné utěsnit, aby nedocházelo k úniku vzduchu, který napomáhal vynášení aromatických látek ze vzorku sýra. Molekulové síto bylo umístěno v SPE kolonce spojené se skleněnou trubicí, v níž byl vzorek sýra, gumovou hadicí. Na získání aromatických látek z molekulových sít byla používána organická rozpouštědla. V našem případě se jako optimální rozpouštědlo ukázal hexan. U mikroextrakce tuhou fází není rozpouštědlo třeba. K desorpci dochází vlivem teploty v injektoru plynového chromatografu. Na SPME vlákno se ze vzorku sýra nasorbovalo o mnoho více látek než při použití molekulových sít. V případě molekulových sít se na chromatogramech objevil velký pík rozpouštědla, který zakrýval píky nízkomolekulárních látek, které se na molekulová síta případně mohly sorbovat. Na Obr. 3 je uvedena celková plochy píků těkavých aromatických látek izolovaných použitými metodami a analyzovaných plynovou chromatografií. Při izolaci molekulovými síty byla od celkové plochy píků odečtena plocha píku rozpouštědla. Z tohoto grafu (Obr. 3) vyplývá, že v případě využití izolace Molecular Sieve 5A a Carboxen 569 se celkové množství těkavých aromatických látek v průběhu zrání příliš nemění. Zatímco v případě extrakce metodou HS-SPME jsou množství aromatických sloučenin v různých stupních zrání poměrně dost rozdílná. Metodou SPME se nasorbovalo několikrát více aromatických sloučenin než při využití adsorpce Molecular Sieve 5A a Carboxen 569. V tabulce I jsou uvedeny průměrné koncentrace identifikovaných aromatických látek pro použité extrakční metody. Při všech použitých extrakčních metodách byly zjištěny sloučeniny: hexanal, isobutanol, pentan-2-ol, butan-2-ol, acetoin a nonan-2-on. 169

166 SPME Molecular Sieve 5A Carboxen Celková plocha píků (kv. s) Doba zrání (dny) Obr. 3 Celkové plochy píků těkavých aromatických látek analyzovaných plynovou chromatografií Tabulka I Průměrné koncentrace zjištěných aromatických látek Retenční Průměrné zjištěné koncentrace (μg. g -1 sýra) čas Sloučenina Molecular HS-SPME (min) Carboxen 569 sieve 5A CAR /PDMS 3,47 Amoniak - - 0,011 ± 0,003 3,88 Acetaldehyd ,165 ± 4,474 4,64 Propionaldehyd - - 0,506 ± 0,310 4,93 Aceton - - 2,083 ± 0,463 6,19 Methanol ,143 ± 1,778 6,78 Isopropanol - - 0,900 ± 0,168 6,95 Ethanol ,886 ± 7,347 7,75 Butan-2,3-dion - - 1,456 ± 0,273 7,86 Pentan-2-on - - 1,302 ± 0,343 10,09 Dimethyltrisulfid - 0,0116 ± 0,0054 0,051 ± 0,012 10,14 Dimethyldisulfid - 0,0010 ± 0,0003 0,156 ± 0,014 10,28 Hexanal 0,0025 ± 0,0006 0,0009 ± 0,0003 0,200 ± 0,039 10,75 Isobutanol 0,0141 ± 0,0028 0,0039 ± 0,0010 0,642 ± 0,045 11,57 Pentan-2-ol 0,0043 ± 0,0013 0,0020 ± 0,0003 0,320 ± 0,081 12,25 Butan-1-ol 0,0198 ± 0,0064 0,0011 ± 0,0002 6,967 ± 1,944 16,14 Acetoin 0,0754 ± 0,0185 0,0002 ± 0,0000 0,045 ± 0,006 16,69 Heptan-2-ol - - 0,046 ± 0,009 18,54 Nonan-2-on 0,0269 ± 0,0066 0,0149 ± 0,0010 0,115 ± 0,036 19,99 Okt-1-en-3-ol - - 0,106 ± 0,013 20,08 Octová kyselina ,883 ± 9,848 22,68 Oktan-1-ol - - 0,010 ± 0,001 22,90 Isomáselná kyselina - 0,0043 ± 0, ,80 Undekan-2-on - - 0,008 ± 0,002 24,33 Máselná kyselina - 0,0033 ± 0, ,457 ± 2,759 24,92 Fenylacetaldehyd - 0,0019 ± 0,0005 0,142 ± 0,007 25,26 Isopentanová kyselina - - 4,158 ± 0,561 28,63 Fenylethanol - - 0,396 ± 0,059 28,76 Fenylethylacetát - - 0,062 ± 0,

167 Závěr Aromatické látky jsou zastoupeny velkým množstvím sloučenin s různými funkčními skupinami. Vyskytují se pouze ve stopových množstvích. Látky se musí z matrice vhodně extrahovat a koncentrovat. Tato práce se zabývá problematikou extrakce těkavých aroma látek ze vzorku sýra Niva. Byla použita metoda využívající molekulová síta a metoda HS-SPME. Při extrakci bylo využito Molecular Sieve 5A a Carboxen 569. Nejprve bylo nutné pro dosažení maximálního výtěžku optimalizovat extrakční podmínky. Na základě retenčních časů dostupných standardů bylo plynovou chromatografií s FID detektorem identifikováno při použití Molecular Sieve 5A celkem 6 aromatických látek. V případě Carboxen 569 se podařilo identifikovat 11 aromatických sloučenin. Byla porovnána účinnosti sorpce obou molekulových sít. Celkový obsah aromatických látek se během zrání příliš nemění. Většina těkavých aromatických látek, které jsou obsaženy v sýru s modrou plísní v těstě, jsou polární sloučeniny, a proto se lépe adsorbují na polární Molecular Sieve 5A. I přesto, že při extrakci Carboxen 569 bylo identifikováno více sloučenin než u Molecular Sieve 5A, jeví se, vzhledem k sorpci většího množství aroma látek, vyšší koncentraci identifikovaných sloučenin a lepší manipulaci, použití Molecular Sieve 5A jako účinnější. Těkavé aromatické látky byly dále extrahovány metodou HS-SPME a následně analyzovány plynovou chromatografií. Na základě retenčních časů použitých standardů bylo identifikováno a kvantifikováno celkem 27 aromatických sloučenin. Většina identifikovaných látek byla přítomna ve všech stupních zrání. Nicméně v průběhu zrání se jejich množství výrazně měnilo. Metoda využívající molekulová síta a mikroextrakce tuhou fází byly porovnány z několika hledisek. Byla sledována příprava, délka analýzy, složitost aparatury, nároky na množství použitého vzorku sýra, použití rozpouštědel v analýze a výsledky analýzy. U extrakce využívající molekulových sít byla optimální extrakční doba delší, nároky na množství vzorku byly vyšší a příprava byla složitější než při využití SPME. Na získání aromatických látek z molekulových sít bylo používáno organické rozpouštědlo - hexan. U metody SPME se rozpouštědlo nepoužívá. Na SPME vlákno se ze vzorku sýra nasorbovalo o mnoho více aromatických sloučenin než při extrakci využívající molekulová síta. Mikroextrakce tuhou fází je pro extrakci tedy jednoznačně výhodnější. Je to jednoduchá, rychlá, cenově dostupná metoda, která neklade velké nároky na množství použitého vzorku a nepoužívá se při ní organických rozpouštědel. Tato metoda má široké spektrum využití. Použitá literatura: 1. ROGINSKI, H., FUGNAY, J., FOX, P. Encyklopedia of Dairy Science. London: Academia press, 2003, ISBN CHIN, H. W., BERNHARD, R. A., ROSENBERG, M. Solid phase microextraction for cheese volatile compound analysis. J. Food Sci. 1996, Vol. 61, No. 6, pp ČEJKA, J., ŽILKOVÁ, N. Syntéza zeolytů, Chem. Listy, 2000, vol 94, pp WARTELLE, L. H., MARSHALL, W. E., TOLES, C. A., JOHNS, M. M. Comparison of nutshell granular activated carbons to commercial adsorbents for the purge-and-trap gas chromatographic analysis of volatile organic compounds. J. Chromatogr. A. 2000, 879, pp Kontaktní adresa: Ing. Hana Štoudková Ústav chemie potravin a biotechnologií, fakulta chemická VUT v Brně Purkyňova 118, Brno stoudkova@fch.vutbr.cz 171

168 IDENTIFIKACE HOŘKÝCH PEPTIDŮ V SÝRU NIVA HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIÍ MALDI-TOF Zemanová Jana 1, Štoudková Hana 1, Laštovičková Markéta 2, Vítová Eva 1, Loupancová Blanka 1 1 Ústav chemie potravin a biotechnologií, Fakulta chemická VUT v Brně 2 Ústav analytické chemie AV ČR IDENTIFICATION OF BITTER PEPTIDES IN NIVA CHEESE BY MASS SPECTROMETRY MALDI-TOF Summary: This project is focused on the study of proteinaceous substances, especially on possibilities for determination of bitter peptides formed in Niva cheese during its ripening. All samples were sensory assessed. The least ripened cheeses were evaluated as the worse. The 28 days ripened sample already has some good organoleptic properties. The most ripened cheeses were assessed only as substandard. An evaluation of water-soluble extracts was a part of sensory analysis too. The sample assessed as the most bitter was analyzed by mass spectrometry MALDI-TOF for identification of bitter peptides. 4-hydroxy-α-cyanocinnamic acid was used as matrix. There were 13 bitter peptides with 8-23 amino acid residues by using Ney s Q-rule (average hydrophobicity of peptides) identified. The most frequent amino acids in identified bitter peptides were proline (25 %), valine (12%), lysine (10 %) and glutamic acid (10 %). Tryptophane and aspartic acid have not occurred. 1. Úvod Sýry patří ke skupině mléčných výrobků, která je velmi ceněna z hlediska výživové i senzorické hodnoty. Mezi zvláště vysoko hodnocené patří sýry s plísní v těstě, jejichž zástupcem je u nás již řadu let populární sýr Niva. Jedná se o přírodní sýr, vyráběný z kravského pasterovaného mléka. Průměrný obsah sušiny je 55 hm.%, tuku v sušině 50 hm.% a soli 4-4,5 hm.% [1, 2]. Charakteristickým znakem Nivy je mramorovitý modrozelený porost v těstě, tvořený plísní Penicillium roqueforti. Hořká chuť patří mezi základní chutě. Zatímco v některých potravinách je nahořklá chuť přijímána pozitivně (pivo, káva), u jiných potravin znamená nežádoucí změnu jakosti. To je právě případ sýrů. Jejich hořkou chuť způsobují především látky organického původu, k nimž patří i některé peptidy. 2. Hořké peptidy Hořká chuť v sýrech může být způsobena akumulací krátkých hořkých peptidů, vznikajících enzymovou hydrolýzou kaseinu, kdy je jejich vznik ovlivněn celou řadou faktorů - kvalitou výchozí suroviny a syřidla, použitou mikroflórou, solením atd. [3, 4]. V literatuře [5] se uvádí, že výskyt hořkých peptidů je častým problémem zejména při urychlování procesu zrání sýra Čedar účinkem endoproteas. Tyto peptidy ale každopádně přispívají k chutnosti sýra, což je potvrzeno skutečností, že byly izolovány jak z hořkých, tak nehořkých sýrů [3, 4]. Celková hladina hořkosti sýra závisí na relativní rychlosti, jakou jsou hořké peptidy formovány a jakou štěpeny na nehořké produkty [6]. Vyšší množství syřidla, zachyceného v sýřenině, také způsobuje vjem hořkosti sýra. Účinkem syřidla vznikají hořké peptidy jak z α s1 -kaseinu, tak z β-kaseinu, zatímco vlivem proteas mléčných bakterií se hořké peptidy tvoří většinou z β-kaseinu [6]. Hořké peptidy obsahují různý počet vázaných aminokyselin, obvykle 2-23 [7]. Více hořkých peptidů bylo izolováno z enzymatických hydrolyzátů kaseinu než ze samotných sýrů [3]. V literatuře se uvádí, že hořké peptidy pocházejí přednostně z hydrofobních oblastí kaseinu. U α s1 -kaseinu to jsou frakce 14-34, a , zatímco u β-kaseinu se většinou jedná o sekvenci nebo potom hydrofobní C-konec řetězce (tj. fragmenty , , 172

169 ) [4, 8, 9]. Nejčastěji zmiňovaným hořkým peptidem v sýrech (většinou Čedaru) je frakce (Val-Pro-Tyr-Pro-Gln-Agr-Asp-Met-Pro-Ile-Gln-Ala-Phe-Leu-Leu-Tyr-Gln) z β-kaseinu [3, 4, 10, 11, 12]. Hořkost peptidů obvykle klesá spolu se snižující se hodnotou hydrofobicity na C-konci řetězce, zejména, je-li na N-konci peptidu umístěna bazická aminokyselina (např. arginin). Naopak intenzita hořkosti je u peptidů posilována přítomností leucinu, fenylalaninu a tyrosinu ve struktuře [5], obzvláště jsou-li napojeny na C-konci peptidu [13]. Peptidy obsahující ve své struktuře prolin jsou často označovány jako hořké [13, 14]. Ishibashi et al. [14] zkoumal právě vliv přítomnosti prolinových reziduí a dalších aminokyselin v hořkých peptidech. Zjistil, že pro hořkou chuť je důležité, aby postranní řetězec aminokyseliny obsahoval nejméně 3 atomy uhlíku [13]. Z publikovaných výzkumů dále vyplývá, že v hořkých peptidech bývají nejvíce obsaženy hydrofobní L-aminokyseliny leucin, isoleucin, prolin, valin, fenylalanin, tyrosin a tryptofan, často je přítomna i kyselina glutamová, zatímco sirné aminokyseliny cystein a methionin většinou chybí [7, 15]. Podle Neye [17] na hořkou chuť nemá vliv specifická sekvence aminokyselin nebo délka řetězce. Hořké peptidy jsou odštěpovány z určitých oblastí kaseinových řetězců, které se vyznačují zvýšenou hodnotou hydrofobicity, takže hořkost peptidů často souvisí právě s přítomností vysokého obsahu aminokyselin s hydrofobním postranním řetězcem, popř. aromatických aminokyselin [14, 16, 17]. Ney [9, 17, 18, 19] pro určení, zda je daný peptid hořký či ne, navrhl tzv. Q-pravidlo, které je definováno následující rovnicí: ΣΔft Q = [J mol -1 ] (2.1) n kde Q...průměrná hodnota hydrofobicity peptidů Δf t...volná energie přenosu postranního řetězce aminokyseliny z vody do organického rozpouštědla (tabelováno) n...počet aminokyselinových zbytků v peptidu 3. Metody 3.1 Senzorické hodnocení Dotazník pro senzorické hodnocení sýra Niva byl rozdělen na několik částí. Hodnotil se vzhled a konzistence Nivy, její chuť a vůně, intenzitní profil vybraných chutí, dále pak vliv hořké chuti na celkovou chutnost sýra a také chuť vodného extraktu. Při zpracování sýra Niva bylo využito metody stanovení senzorického profilu a hodnocení s použitím stupnic, konkrétně kategorové ordinální stupnice hédonické i intenzitní. Výsledky byly statisticky vyhodnoceny a prezentovány formou sloupcových a hvězdicových grafů, které znázorňovaly změny jednotlivých charakteristik sýra během jeho procesu zrání. 3.2 Identifikace peptidů metodou hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF Metoda hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF byla použita jako účinný způsob detekce a identifikace peptidů přítomných ve vzorku. Následnou aplikací Neyova pravidla pak bylo možné zařadit identifikované peptidy z hlediska jejich hořkosti. Touto metodou byl analyzován jednak vodný extrakt nejzralejšího sýra, u něhož byla při senzorickém hodnocení jak samotného sýra, tak i jeho příslušného vodného extraktu zaznamenána zvýšená intenzita hořké chuti (doba zralosti byla 54 dní), a jednak byla tímto způsobem analyzována sada upravených extraktů, které pokrývají sledovanou dobu zrání a které byly vysráženy 3% kyselinou sulfosalicylovou. Vodný extrakt sýra byl přečištěn extrakcí pevnou fází (SPE - C 18 ). 173

170 Pro nanášení vzorků na speciální destičku s terčíky bylo využito techniky dried-droplet (DD). Matrice byla tvořena kyselinou 4-hydroxy-α-kyanoskořicovou. Měření byla prováděna na přístroji firmy Applied Biosystems 4700 Proteomics Analyzer, který je vybaven Nd:YAG laserem emitujícím záření o vlnové délce 355 nm. Laserové pulsy jsou vysílány v časových periodách 3-7 ns. Všechna měření byla uskutečněna v pozitivním iontovém módu při reflektronovém uspořádání (RP - Reflectron Positive) a jejich výsledkem byla hmotnostní spektra protonovaných peptidů (MH + ), která vznikla z 2500 odstřelů. Hodnoty intenzity laseru byly relativní a byly voleny ze stupnice Výsledky a diskuse 4.1 Senzorické hodnocení Senzorické analýze byly podrobeny všechny vzorky, které byly k dispozici v různých fázích zrání. Bylo využito metody stanovení senzorického profilu a hodnocení s použitím stupnic, konkrétně kategorové ordinální stupnice hédonické i intenzitní. Mladé sýry vykazovaly nejhorší hodnocení jak v kategorii vzhled a konzistence, tak v kategorii chuť a vůně. Nejlépe hodnoceny byly většinou sýry prozrálejší. Již po 28 dnech zrání, kdy byl porost plísně zřejmý, ne však příliš prorostlý hmotou, dosahovaly sýry poměrně dobrých organoleptických vlastností. Z toho lze usuzovat, že naši spotřebitelé jsou pravděpodobně zvyklí spíše na nedozrálý sýr, což potvrzuje i ta skutečnost, že v obou sadách vzorků byly nejzralejší sýry hodnoceny pouze jako podprůměrné. Intenzita chuti slané a plesnivé se během zrání zvyšovala. U zralých sýrů byly tyto deskriptory většinou hodnoceny stupněm 3, tedy jako silnější. Naopak mléčně-smetanová a kyselá chuť během zrání sýra na intenzitě postupně ztrácí. U zralých sýrů byla zaznamenána zvýšená intenzita hořké chuti (hodnocena stupněm 3 a 4 z pětibodové stupnice), což mohlo být důsledkem výkyvu některého z parametrů technologického procesu. mléčně-smetanová 5 hořká slaná 6 dní 13 dní 21 dní 28 dní 0 33 dní 40 dní 47 dní 54 dní plesnivá kyselá Obr. 1 Intenzitní profil všech vybraných chutí Proces tvorby chuťově aktivních látek obecně závisí na řadě faktorů, mj. na technologickém postupu, stáří sýra a podmínkách skladování. Právě v nejzralejším vzorku (doba zrání 54 dny, intenzita hořkosti hodnocena stupněm 4) bylo identifikováno 13 dále zmíněných hořkých peptidů (Tab. I). 174

171 5 4 vodný extrakt sýr bodové hodnocení doba zrání [dny] Obr. 2 Intenzita hořké chuti sýra a odpovídajících vodných extraktů Do dotazníku bylo také zařazeno určení prahové citlivosti, kdy byly pro hořkou chuť použity dva standardy, a to roztoky kofeinu a chinin-sulfátu. Jako odlišná chuť byla pro toto posouzení zvolena sladká, reprezentovaná roztoky sacharosy. Všichni hodnotitelé dokázali hořkou chuť identifikovat alespoň v jednom z předložených standardů, ačkoliv rozpoznat hořkou chuť ze standardu kofeinu bylo pro mnohé z nich obtížné. Průběh hodnocení intenzity hořké chuti u vodného extraktu odpovídal předpokladu, vyplývajícímu ze závěrů hodnocení intenzity hořké chuti u vzorků sýrů. Byla zjištěna významná hodnota korelace (0,7105), která svědčí o tom, že při přípravě vodného extraktu přešly do rozpouštědla látky způsobující hořkou chuť sýra. 4.2 Identifikace peptidů metodou MALDI-TOF Metodou hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF bylo ve vodném extraktu 54 dní zralého sýra identifikováno 13 hořkých peptidů s 8-23 aminokyselinovými rezidui v řetězci (Tab. I): Nejvíce zastoupenou aminokyselinou v identifikovaných hořkých peptidech byl jednoznačně prolin (25 %). Mimo to byl ještě zaznamenán častější výskyt valinu (12 %), lysinu (10 %) a kyseliny glutamové (10 %). Naopak zcela chyběl tryptofan a kyselina asparagová. Otázku vztahu mezi stupněm proteolýzy a hořkostí není jednoduché plně vyřešit a zobecnit. Závisí to na nejen na typu substrátu a enzymu, ale také na technologických parametrech výroby. Spektrometrie MALDI-TOF však může být vzhledem ke své citlivosti a rychlosti velice užitečnou metodou pro včasnou detekci vzniku hořké chuti v sýrech. Nespornou výhodou metody MALDI-TOF je to, že umožňuje provádět analýzy i relativně málo přečištěných (předseparovaných) vzorků, čímž předchází potenciálním ztrátám některých složek analytu tak, jak bylo např. patrné v této práci z porovnání výsledků analýz vodného extraktu sýra (identifikováno celkem 76 peptidů), a pak po jeho vysrážení 3% kyselinou sulfosalicylovou (5 peptidů). 175

172 Tabulka I Peptidy identifikované ve vodném extraktu sýra Niva, 54 dní zralého, vyhodnocené jako hořké m/z peptid n Q [J mol -1 ] 866,5 Glu-Pro-Val-Leu-Gly-Pro-Val-Arg ,5 Gly-Pro-Val-Arg-Glu-Pro-Phe-Pro-Ile ,6 Glu-Pro-Val-Leu-Gly-Pro-Val-Arg-Gly-Pro ,6 Val-Leu-Gly-Pro-Val-Arg-Gly-Pro-Phe-Pro ,6 Pro-Val-Leu-Gly-Pro-Val-Arg-Gly-Pro-Phe-Pro ,7 Gly-Pro-Val-Arg-Gly-Pro-Phe-Pro-Ile-Ile-Val ,7 Glu-Pro-Val-Leu-Gly-Pro-Val-Arg-Gly-Pro-Phe-Pro ,8 Glu-Pro-Val-Leu-Gly-Pro-Val-Arg-Gly-Pro-Phe-Pro-Ile ,0 Lys-His-Lys-Glu-Met-Pro-Phe-Pro-Lys-Tyr-Pro-Val-Glu-Pro-Phe-Thr- Glu-Ser ,3 Met-Gly-Val-Ser-Lys-Val-Lys-Glu-Ala-Met-Ala-Pro-Lys-His-Lys-Glu- Met-Pro-Phe-Pro-Lys-Tyr ,3 Val-Lys-Glu-Ala-Met-Ala-Pro-Lys-His-Lys-Glu-Met-Pro-Phe-Pro-Lys- Tyr-Pro-Val-Glu-Pro-Phe ,3 Glu-Ala-Met-Ala-Pro-Lys-His-Lys-Glu-Met-Pro-Phe-Pro-Lys-Tyr-Pro- Val-Glu-Pro-Phe-Thr-Glu-Ser ,4 Lys-His-Lys-Glu-Ala-Met-Ala-Pro-Lys-His-Lys-Glu-Met-Pro-Phe-Pro- Lys-Tyr-Pro-Val-Glu-Pro-Phe Závěr Problematika hořké chuti sýrů je poměrně složitá a hlavně komplexní záležitost, a tak je také třeba na ni pohlížet. Tato práce se sice zaměřila na analýzu a identifikaci tzv. hořkých peptidů, ve skutečnosti však hořká chuť sýra může být způsobena a ovlivňována i řadou jiných složek, zejména rozkladnými produkty lipidů [20, 21]. Z toho tedy plyne, že vždy je třeba pro dosažení objektivních závěrů postihnout více aspektů. Předkládaná práce popisuje určitou možnost, jak pomocí instrumentálních metod zhodnotit chutnost potraviny. Vzhledem k tomu, že využití hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF pro analýzu hořkých peptidů v sýru Niva nebylo dosud publikováno a stejně tak i co se týče možností metody kapilární elektroforézy v dané souvislosti, stává se tato práce novým východiskem při hledání účinné metody analýzy hořkých peptidů v jednom z našich nejoblíbenějších sýrů. Stanovit chutnost potraviny instrumentálními metodami není tedy jednoduché a zřejmě ani v budoucnosti nebude možné nahradit zcela senzorické hodnocení přístrojovou technikou. Použitá literatura: 1. Forman, L.: Mlékárenská technologie II. 2. vyd. Praha: VŠCHT, s. ISBN Doležálek, J., Kopáček, J.: Vliv kmene Penicilium rogueforti na průběh zrání a jakost sýra Niva. Mlékařské Listy, 1989, sv. 15, č.1, s ISSN Habibi-Najafi, M.B., Lee, B.J.: Bitterness in cheese: A Review. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 1996, vol. 36, no. 5, pp ISSN Mayer, H. K.: Bitterness in processed cheese caused by an overdose of a specific emulsifying agent? International Dairy Journal, 2001, vol. 14, pp ISSN Hazard, N.F., Davis, U.C.: Cheddar cheese ripening aid [cit ]. Dostupné z: < 176

173 6. Gomez, M.J., Garde, S., Gaya, P., Medina, M., Nuñez, M.: Relationship between level of hydrophobic peptides in cheese made from pasteurized and raw milk. Journal of Dairy Research, 1997, vol. 64, pp ISSN Velíšek, J.: Chemie potravin, 1 díl. 2. vyd. Tábor: OSSIS, s. ISBN McSweeney, P. L. H., Fox, P. F.: Chemical methods for the characterisation of proteolysis in cheese during ripening. Lait, 1997, vol. 77, no. 1, pp ISSN McSweeney, P.L.H.: The flavour of milk and dairy products: III. Cheese: Taste. International Journal of Dairy Technology, 1997, vol. 50, no. 4, pp ISSN X 10. Soeryapranata, E., Powers, J.R., Fajarrini, F., Keller, K.M., Hill, H.H., Siena, W.F.: MALDI- TOF and prediction of bitterness intensity of aged Cheddar cheese. In: ITF Annual Meeting, New Orleans, USA, 2001 [online] [cit ]. Dostupné na www: < 11. Weimer, B., Joseph, P., Koka, R., Xie, Y.: Use of non-lactic acid bacterial enzymes to degrade bitter peptides in Cheddar cheese. In: ITF Annual Meeting, New Orleans, USA, 2001 [online] [cit ]. Dostupné na www: < 12. Soeryapranata, E., Powers, J.R., Weller, K.M., Hill, H.H., Siems, W.F.: Differentiation of intracellular peptidases of starter and adjunct cultures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Lebensmittel Wissenschaft und Technologie, 2004, vol. 37, pp ISSN Kilara, A., Panyam, D.: Peptides from milk proteins and their properties. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 2003, vol. 43, no. 6, pp ISSN Ishibashi, N., Kouge, K., Shinoda, I., Kanehisa, H., Okai, H.: A mechanism for bitter taste sensibility in peptides. Agricultural and Biological Chemistry, 1988, vol. 52, no. 3, pp ISSN Lee, K.D., Warthesen, J.J.: Preparative methods of isolating bitter peptides form Cheddar cheese. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1996, vol. 44, no. 4, pp ISSN Sommerer, N., Salles, C., Promé, D., Promé, J. C., LeQueré, J. L.: Isolation of oligopeptides from the water-soluble extract of goat cheese and their identification by mass spectrometry. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2001, vol. 49, pp ISSN Raksakulthai, R., Haard, N. F.: Exopeptidases and their aplication to reduce bitterness in food: a review. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 2003, vol. 43, pp ISSN Sihufe, G. A., Zorrilla, S. E., Rubiolo, A. C.: The effect of trichloroacetic acid on water-soluble fractions from Fynbo cheese. Food Chemistry, 2005, in press. ISSN Cikánek, D., Březina, P., Pavlíková Š.: Hořké peptidy v sýrech z analytického a senzorického hlediska. Mlékařské Listy, 1990, sv. 51, č. 1, s ISSN Šabata, D.: Změny lipidů a sensorické jakosti při zrání plísňových sýrů. Praha: VŠCHT, s., 2 s. příloh. Diplomová práce na Fakultě potravinářské a biochemické technologie Vysoké školy chemicko-technologické v Praze. Vedoucí diplomové práce: prof. Ing. Jan Pokorný, DrSc. 21. Vítová, E.: Hodnocení tvorby těkavých senzoricky účinných látek mikrobiálních metabolitů a jejich charakterizace. Brno, s. Disertační práce na Fakultě chemické Vysokého učení technického na Ústavu chemie potravin a biotechnologií. Školitel: prof. Ing. Pavel Březina, CSc. Kontaktní adresa: Ing. Jana Zemanová, Ph.D. Ústav chemie potravin a biotechnologií, Fakulta chemická VUT Purkyňova 118, Brno 177

174 EFEKT SOLÍ NA ph A AKTIVITU LIPÁZ Salis Andrea*, Pinna M. Cristina*, Bilaničová Dagmar*, Monduzzi Maura*, Ninham Barry W. #, Schmidt Štefan *Dipartimento di Scienze Chimiche, Università di Cagliari, Italy # Department of Applied Mathematics, A.N.U. Canberra, Australia Katedra potravinárskej technológie, FCHPT STU, Bratislava EFFECT OF SALTS ON PH AND LIPASE ACTIVITY Summary: Our contribution presents results of measurement of various anions on ph change of sodium phosphate buffers as well as on activity of lipase from Aspergillus niger. As a result, addition of NaBr (2 mol/l) to sodium phosphate buffer (5 mmol/l) enhanced activity of this lipase by cca 250%. V poslednom období sa pozornosť chemikov zameriava na využitie odpadov a vedľajších produktov v potravinárstve. Môžu byť vhodnými substrátmi pre reakcie, ich výhodou je nízka cena a biodegradabilita. Jedným z takýchto substrátov je aj laktóza. Laktóza ako mliečny cukor vďaka intolerancii mnohých konzumentov nachádza len obmedzené použitie v potravinárskom piemysle. 1. Laktóza ako substrát pre enzýmovú esterifikáciu Jednou z možností zúžitkovania tohto disacharidu je príprava jeho esterov s výššimi mastnými kyselinami (biotenzidov). Okrem chemickej syntézy takýchto cukorných esterov prinašajúcej rad technických a ekologických problémov sa hľadajú selektívnejšie a ekologicky prijateľnejšie cesty ich prípravy vrátane enzýmovej katalýzy. Enzýmová príprava esterov sacharidov katalyzovaná lipázami vyžaduje len jeden syntetický krok. Problémom týchto reakcií je však nájsť vhodné podmienky, pretože v reakcií sa spájajú dva z hľadiska polarity úplne odlišné substráty: polárny sacharid a nepolárna vyššia mastná kyselina. Ak do reacie vstupuje nemodifikovaná laktóza s vyššími mastnými kyselinami, jako kompromis sa používa ako reakčné prostredie polárne organické rozpúšťadlo, zväčša škodlivý pyridín [1., 2.]. Na zlepšenie rozpustnosti sacharidov v nepolárnych organických rozpúšťadlách sa využívajú namiesto voľných sacharidov modifikované sacharidy. V tomto prípade niektoré hydroxylové skupiny chýbajú, alebo sú chránené a sacharidy sa stávajú menej polárnymi v porovnaní s nemodifikovanými sacharidmi. V prípade laktózy je vhodnou a časovo nenáročnou cestou jej enzýmová premena na alkylgalaktozidy [3.]. Ďalšou prekážkou bežnej esterifikácie cukrov enzymaticky je nízka stabilita enzýmov v organických rozpúšťadlách. 2. Možnosti stabilizácie enzýmu Jednou z možnosti stabilizácie enzýmu je jeho imobilizácia buď fyzikálnou absorpciou alebo chemickou väzbou na rôzne typy pevných nosičov (ako napr. polypropylén, kaolín, silikagél, polyalkoholy a pod.). Takto stabilizované formy enzýmu majú až niekoľkonásobne vyššiu aktivitu oproti voľnej forme enzýmu a možno ich používať opakovane [4.-8.]. Nie v každom laboratóriu je však k dispozícii vhodný nosič pre ten-ktorý enzým. Okrem toho sa hľadajú aj iné cesty stabilizácie enzýmu. Stabilita a aktivita enzýmu ako proteínu je komplexom lokálneho alebo vonkajšieho pôsobenia van der Waalsových síl, vodíkových väzieb, disociačných rovnováh a iných fyzikálnochemických pôsobení medzi iónmi. Pôsobenie týchto síl môže byť regulované aj prídavkom anorganických solí. Vplyv aniónov sodných solí na precipitáciu bielkovín (ovoalbumínu) dokázal už v roku 1888 Hofmeister, korý zoradil testované anióny z pohľadu veľkosti tohto vplyvu nasledovne: H 2 PO - 4 >SO 2-4 > F - > Cl - > Br - > NO - 3 > I - > ClO - 4 > SCN - 178

175 s tvrdením, že je možnosť korelácie medzi precipitáciou bielkovín vplyvom solí a fyziologickými vlastnosťami bielkovín [9.], čo sa potvrdzuje aj súčasných štúdiach na rôznych typoch enzýmov ako napr. peroxidázy [10] a proteázy [11, 12]. Nás však zaujíma vplyv solí na lipázy. Špecifický vplyv aniónov solí na aktivitu lipázy z Aspergillus niger dokázala Pinna a kolektív [13]. 400 Špecifická aktivita enzýmu (μmol min -1 g -1 ) ,5 1 1,5 2 koncentrácia soli (mol L -1 ) Obr.1 Efekt solí na hydrolytickú aktivitu lipázy A (z Aspergillus niger) vo fosforečnanovom pufri (5mM, ph=7,00) s rastúcou koncentráciou prídaných solí: NaBr ( ), NaNO 3 ( ), NaCl ( ), NaClO 4 ( ).[13]. Ako z týchto výsledkov vyplýva, prídavok jednotlivých sodných solí zvýšil špecifickú hydrolytickú aktivitu lipázy A až niekoľnásobne. Hydrolytická aktivita tohto enzýmu bola meraná spektrofotometricky použitím p-nitrofenylacetátu ako substrátu rozpusteného v 2-propanole, objemový pomer vodný roztok (pufru alebo soli v pufri):2-propanol bol 9:1. Prídavok solí však mení ph roztoku. Zmena ph závisí od použitého pufru, jeho koncentrácie, ďalej od koncentrácie a typu pridanej soli. Testovali sme špecifický efekt pridanej soli na zmenu ph v rôznych pufroch. Pridané soli znížili ph danného pufru (5mM, počiatočné ph=7,00) v poradiach: Na/fosforečnanový pufor (5mM) a sodné soli: ClO 4 - > NO 3 - ~ I - > Br - > Cl - K/fosforečnanový pufor (5mM) a draselné soli: Br - > Cl - > NO 3 - > SCN - Na/kakodylatový pufor (5mM) a sodné soli: Br - > Cl - > NO 3 - > SCN - > I - [14]. Prídavok 2M NaBr do 5 mm Na/fosforečnanového pufru ph=7,00 znížil ph na 5,84. Bolo teda otázne, či zvýšenie aktivity lipázy A z Aspergillus niger spôsobil prídavok solí alebo zmena ph, keďže optimálne ph tejto lipázy merané v 5mM Na-fosforečnanovom pufri bez soli je ph=6,00 (špecifická aktivita: 160±5 μmol min -1 g -1 ). V ďalšom pokuse sa teda 2M NaBr pridal do pufru s počiatočným ph=6,00, pridaná soľ spôsobila zníženie ph na 4,89 a bola nameraná špecifická aktivita 324±7 μmol min -1 g -1 [13]. V tomto prípade bol teda dokázaný špecifický efekt aniónov solí na aktivitu lipázy A vo vodnom prostredí. Pre praktické využitie efektu solí na zvýšenie aktivity lipáz je však zaujímavejšie sledovať ich efekt na aktivitu enzýmu v organických rozpúšťadlách. Efekt prídavku solí na zvýšenie aktivity lipázy z Candida rugosa počas esterifikácie kyseliny laurovej 1-propanolom v izooktáne dokázal Yu a kolektív [15]. Ako soli boli použité chloridy lítia, sodíka a draslíka. Efekt solí na zvyšenie aktivity lipázy rástol v poradí: LiCl > NaCl >KCl, čím sa dokázal v tomto prípade špecifický efekt katiónov na stabilitu enzýmu v organickom rozpúšťadle. Soli boli pridané k roztoku enzýmu pred jeho lyofilizáciou a takto lyofilizovaný enzým bol použitý do sledovaných reakcií. Prídavok LiCl zvýšil aktivitu takto lyofilizovaného enzýmu až 3,4-krát. 179

176 3. Zhrnutie a diskusia Jednou z možností zúžitkovania laktózy je jej premena na biodegradabilné tenzidy enzýmovou cestou v organických rozpúšťadlách. Na stabilizáciu lipáz v organických rozpúšťadlách možno okrem imobilizácie použiť aj prídavok určitých anorganických solí. Majú špecifický efekt na aktivitu enzýmu nielen vo vodnom prostredí, ale aj v organických rozpúšťadlách. V našom prípade je najdôležitejším poznatkom to, že existuje táto jednoduchá možnosť stabilizácie lipáz a takto upravené reakčné podmienky môžu zvýšiť výťažky enzýmových esterifikácii. Literatúra: 1. Plusquellec D., Roulleau F., Bertho F., Lefeure M., Brown E. : Chimie des sucres sans groupements protecteur-i-esterification regioselective de l'hydroxyle anomere du lactose, du maltose et du glucose. Tetrahedron, 42, 1986, s Pedersen N. R., Wimmer R., Emmersen J., Degn P., Pedersen L. H.: Effect of fatty acid chain lenght on inizial reaction rates and regioselectivity of lipase-catalysed esterification of disaccharides. Carbohydrate Research, 337, 2002, s Bilaničová D., Mastihuba V., Kaufmanová J., Schmidt Š.:.Enzýmová syntéza alkylglykozidov. Seminář o tenzidech a detergentech, 3.-5.november 2003, Lázně Bohdaneč 4. Salis A., Sanjust E., Solinas V., Monduzzi M.: Characterisation of Accurel MP1004 polypropylene powder and its use as a support for lipase immobilisation. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 24-25, 2003, s Dumitriu E., Secundo F., Patarin J., Fechete I.: Preparation and properties of lipase immobilized on MCM-36 support. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 22, 2003, s Rahman M. B. A., Tajudin S. M., Hussein M. Z., Rahman R. N. Z. R. A., Salleh A. B., Basri M.: Application of natural kaolin as support for the immobilization of lipase from Candida rugosa as biocatalyst for effective esterification. Applied Clay Science, 29, 2005, s Goto M., Hatanasaka Ch., Goto M.: Immobilization of surfactant-lipase complexes and thei high heat resistance in organic media. Biochemical Engineering Journal, 24, 2005, Foresti M.L., Errazu A., Ferreira M.L.: Effect of several reaction parameters in the solvent-free ethyl oleate synthesis using Candida rugosa immobilised on polypropylene. Biochemical Engineering Journal, 25, 2005, s Kunz W., Henle J., Ninham B.W.: Zur Lehre von der Wirkung der Salze (about the science of the effect of salts): Franz Hofmeister's historical papers. Current Opinion in Colloid and Interface Science, Pinna M. C., Baudiun P., Touraud D., Monduzzi M., Ninham B. W., Kunz W.: Hofmeister Effect in Biology: Effect of Choline Addition on the Salt-Induced Super Activity of Horseradish Peroxidase and Its Implication for Salt Resistance of Plants. Journal of Physical Chemistry B, 109, 2005, s Wondrak E. M., Louis J. M., Oroszlan S.: The effect of salts on the Michaelis Menten constant of the HIV-1 protease correlates with the Hofmeister series. FEBS, 280, s Ru M. T., Hirokane S. Y., Lo A. S., Dordick J. S., Reimer J. A., Clark D. S.: On the Salt-Induced Activation of Lyophilized Enzymes in Organic Solvents: Effect of Salt Kosmotropicity on Enzyme Activity. Journal of the American Chemical Society, 122, 2000, s Pinna M. C., Salis A., Manduzzi M., Ninham B.W.: Hofmeister Series: The Hydrolytic Activity of Aspergillus niger Lipase Depends on Specific anion Effects. The Journal of Physical Chemistry B., 109, 2005, s Salis A., Pinna M.C, Bilaničová D., Monduzzi M., Lo Nostro P., Ninham B.W.: Specific anion effect on Glass Electrode ph Measurements of Buffer Solutions: Bulk and Surface Phenomena. The Journal of Physical Chemistry B., 110, Yu H.W., Chen H., Yang Y.Y., Ching C.B.: Effect of salts on activity, stability and enantioselectivity of Candida rugosa lipase in osooctane. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 35, 2005, s

177 KONTINUÁLNA PRÍPRAVA GALAKTOOLIGOSACHARIDOV V MEMBRÁNOVOM ENZÝMOVOM REAKTORE. Mišún Daniel, Čurda Ladislav, Šípalová Olga Ústav technologie mléka a tuků,vysoká škola chemicko-technologická v Praze CONTINUOUS PREPARATION OF GALACTOOLIGOSACCHARIDES IN MEMBRANE ENZYMATIC REACTOR Summary: Perspective way of processing lactose from whey, which arises in considerable amount as waste during cheesemaking, is the use of the reaction catalysed by β-galactosidase. The trans-galactosylation activity of this enzyme can be supported by the choice of suitable conditions for the formation of galactooligosaccharides (GOS), which are utilised e.g. in functional foods. The obstacle of practical application of this method is the high price of the enzyme for batch-process. Continuous process with using of membrane enzymatic reactor represents appropriate alternative. In this research lactose in phosphate buffer (ph 7.0; concentration of lactose 170 g/l), recombined whey (197.2 g/l), evaporated whey UF-permeate (320 g/l) were used as substrate and as enzyme Maxilact LX 5000 (2 g/l). Ceramic membrane in membrane unit ARNO 700 (Mikropur s.r.o) was first tested for the ability to retain the enzyme. The complete retention of the enzyme was proved for the membrane with cut of 150 kda. The concentrations of GOS were 8.5 g/l for lactose in phosphate buffer, 13.3 g/l for recombined whey and 26.6 g/l for evaporated permeate in the complete permeate. The maximal concentrations of GOS were in batch processing mode 14.5 g/l in buffer, 26.3 g/l in recombined whey and 41.2 g/l in evaporated permeate. Úvod Mliekarenský priemysel sa už niekoľko rokov zaoberá riešením problémov spracovania srvátky vznikajúcej pri výrobe syrov. Hľadajú sa nové cesty izolácie a vhodného využitia hodnotných komponentov srvátky (laktóza, srvátkové bielkoviny). Perspektívnou variantov pre spracovanie laktózy zo srvátky je produkcia galaktooligosacharidov, vznikajúcich pri hydrolýze laktózy transglykozylačnou aktivitou β-galaktozidáz (Mahoney, 1998). V potravinárstve nachádzajú galaktooligosacharidy významné uplatnenie hlavne vo funkčných potravinách. Vyskytujú sa prirodzene v materskom mlieku a pridávajú sa do kojeneckých a detských výživ. Obecne majú oligosacharidy pozitívni vplyv na ľudské zdravie. Slúžia ako prevencia rakoviny hrubého čreva, majú pozitívni vplyv na absorpciu minerálnych látok, atď. Enzýmová príprava galaktooligosacharidov môže byť uskutočnená vsádzkovo alebo kontinuálne. V prvom prípade je enzým po reakcii inaktivovaní. Druhou možnosťou je vytvorenie membránového enzýmového reaktora, ktorý využíva membránovú jednotku. Enzým je zadržiavaní membránou a ako retentát vrátení naspäť do reaktora, kde je pričerpávaní čerstvý substrát a produkt prechádza vo forme permeátu membránou. Kontinuálna produkcia oligosacharidov týmto spôsobom dovoľuje maximálne využitie enzýmu ( Czermak a kol., 2004). Materiál a metódy Ako membránový enzýmový reaktor slúžila laboratórna stanice ARNO 700 doplnená o dávkovacie čerpadlo. Použitá ultrafiltračná keramická membrána o s deliacou medzou 150 kda bola overená na schopnosti zadržať enzým. Ako substrát bol použitý roztok laktózy (potravinárska laktóza sladká) v citrátofosfátovom pufri o koncentrácií 170 g/l pri ph 7, obnovená sladká srvátka (197,2 g/l), zahustený UF - permeát srvátky o koncentrácií laktózy 320 g/l (PML, Nový Bydžov) a enzým Maxilact LX 5000 (DSM Food Specialities, Holandsko) o koncentrácií 2 g/l. Po 45 min reakcie pri 37 C v 2 l substrátu sa spustila filtrácia a do nádrže sa začal pričerpávať čerstvý substrát, približne rovnakou rýchlosťou akou odtekal permeát. Paralelne sa vykonala hydrolýza vsádzkovo. Celková doba hydrolýzy činila 4 hodiny. Stupeň hydrolýzy bol určený enzýmovým stanovením 181

178 glukózy a zastúpenie jednotlivých sacharidov pomocou HPLC s katexovou kolónou. Sacharidy sa stanovili na HPLC s katexovou kolónou (vápenatá forma sulfonovaného styrendivinylbenzenového kopolymeru) a ELSD detekciou. Ako mobilná fáza sa používala demineralizovaná voda (prietok 0,5 ml/min). Jednotlivé sacharidy boli identifikované porovnaním retenčných časov so štandardmi, glukózy, laktózy, galaktózy, rafinózy, a ich kvantita bola určená z pomeru plôch píkov daných cukrov a plochy píku štandardu. Výsledky a diskusia Kontinuálna hydrolýza laktózy v pufri Pre hydrolýzu v reaktore sa k počiatočnému objemu (2 l) postupne (do 120 min filtrácie) pričerpal čerstvý substrát (2,5 l). Podmienky pokusu zostali v priebehu celej filtrácie konštantné. Z výsledkov (Obr. 1) vidieť, že zo začiatku obsah laktózy mierne stúpa, čo je spôsobené vyššou rýchlosťou pričerpaného čerstvého substrátu oproti odtoku permeátu. Množstvo vyprodukovaných oligosacharidov počas kontinuálnej hydrolýzy na začiatku mierne klesalo a následne bolo relatívne konštantné. Celkový permeát po kontinuálnej hydrolýze laktózy v pufri obsahoval 8,54 g/l oligosacharidov, čo je 5,02 % zo všetkých sacharidov. Pri vsádzkovej hydrolýze, bolo maximálne množstvo vzniknutých oligosacharidov 14,53 g/l (Tab. I), čo odpovedá 8,26 % zo všetkých sacharidov (Obr. 2). koncentrácia (g/l) čas (min) oligosacharidy laktóza glukóza galaktóza Obr. 1 Zastúpenie sacharidov pri kontinuálnej hydrolýze laktózy v pufri (membrána 150 kda, tlak 0,25 MPa, teplota 37 C, ph 7, čas filtrácie 165 min) koncentrácia (g/l) čas (min) 182 oligosacharidy laktóza glukóza galaktóza Obr. 2 Zastúpenie sacharidov pri vsádzkovej hydrolýze laktózy v pufri pri teplote 37 C.

179 Kontinuálna hydrolýza laktózy v obnovenej srvátke Pri hydrolýze v dôsledku zníženia rýchlosti toku, čo viedlo k upchávaniu pórov membrány, bolo nutné postupne zvýšiť tlak (z 0,025 na 0,2 MPa). Čerstvý substrát (2,5 l) sa postupne (do 225 min) pridával k pôvodnému objemu (2 l). Počiatočný obsah laktózy sa znižuje a mierne prirastá glukóza a galaktóza (Obr. 3), čo je spôsobené vyššou rýchlosťou odtoku permeátu, ako prítoku čerstvého substrátu. Permeát po kontinuálnej hydrolýze laktózy v obnovenej srvátke obsahoval 13,26 g/l galaktooligosacharidov, čo predstavuje 6,7 % z celkového množstva sacharidov. Pri vsádzkovej hydrolýze, bolo získané maximálne množstvo oligosacharidov 26,32 g/l (Tab. I), čo predstavuje 12,5 % po 45 min reakcie (Obr. 4) koncentrácia (g/l) oligosacharidy laktóza glukóza galaktóza čas (min) Obr. 3 Zastúpenie sacharidov pri kontinuálnej hydrolýze laktózy v obnovenej srvátke (membrána 150 kda, teplota 37 C, ph 7, čas filtrácie 315 min). koncentrácia (g/l) čas (min) oligosacharidy laktóza glukóza galaktóza Obr. 4 Zastúpenie sacharidov pri vsádzkovej hydrolýze laktózy v obnovenej srvátke pri teplote 37 C. Kontinuálna hydrolýza laktózy v UF - permeáte srvátky K počiatočnému objemu (2 l) pre hydrolýzu v reaktore sa postupne pričerpával (do 250 min filtrácie) čerstvý substrát (3 l). Počiatočný tlak sa postupne zvyšoval z 0,25 na 2,5 MPa, aby bol prietok čerstvého substrátu a odtok permeátu pri celom procese približne rovnaký. Mierný pokles obsahu laktózy a naopak prírastok glukózy a galaktózy v počiatku hydrolýzy (Obr. 5) je spôsobený 183

180 vyššou rýchlosťou odtoku permeátu, ako prítoku čerstvého substrátu. Permeát po kontinuálnej hydrolýze laktózy v UF permeáte obsahoval 26,62 g/l galaktooligosacharidov, čo predstavuje 9,69 % z celkového množstva sacharidov v zmesi. Vsádzkovou hydrolýzou sa získalo maximálne množstvo oligosacharidov 41,2 g/l (Tab. I), t.j. 14,8 % po 45 min reakcie (Obr. 6) koncentrácia (g/l) oligosacharidy laktóza glukóza galaktóza čas (min) Obr. 5 Zastúpenie sacharidov pri kontinuálnej hydrolýze laktózy v UF - permeáte srvátky (membrána 150 kda, teplota 37 C, ph 7, čas filtrácie 280 min). 350 koncentrácia (g/l) oligosacharidy laktóza glukóza galaktóza čas (min) Obr. 6 Zastúpenie sacharidov pri vsádzkovej hydrolýze laktózy v UF - permeáte srvátky pri teplote 37 C. Tabuľka I Množstvo sacharidov po hydrolýze laktózy v jednotlivých substrátoch Vzorka Laktóza v pufri Laktóza v obnovenej srvátke Laktóza v UF-permeáte srvátky Spôsob hydrolýzy Kontinuálna (celkový permeát) Vsádzková (30 min) Kontinuálna (celkový permeát) Vsádzková (45 min) Kontinuálna (celkový permeát) Vsádzková (100 min) Oligosacharidy (g/l) 184 Laktóza (g/l) Glukóza (g/l) Galaktóza (g/l) 8,54 53,58 66,90 41,00 14,53 62,81 62,73 35,80 13,26 57,42 77,90 46,90 26,32 68,92 73,06 41,7 26,62 126,10 79,54 42,54 41,20 88,00 96,90 52,52

181 Záver Výhodou kontinuálneho enzýmového reaktora je získanie čistého produktu bez nutnosti tepelnej inaktivácie použitého enzýmu. Je reálny predpoklad, že pri dostatočnom množstve filtrovaného substrátu a predĺžení času filtrácie, bude získané vyššie množstvo galaktooligosacharidov v porovnaní so vsádzkovým spôsobom pri rovnakom množstve enzýmu. Práca bola podporená MŠMT ČR (MSM ). Použitá literatúra Czermak P., Ebrahimi M., Grau K., Netz S., Sawatzki G., Pfromm P. H. (2004): Membrane- Assisted Enzymatic Production of Galactosyl Oligosaccharides from Lactose in a Continuous process. J. Membrane Sci. 232: Mahoney R. R. (1998): Galaktosyl-oligosaccharide Formation during Lactose Hydrolysis: a Review. Food Chem., 63: Kontaktná adresa: Mišún Daniel, Ústav technologie mléka a tuků, VŠCHT, Technická 5, Praha 6 daniel.misun@vscht.cz 185

182 VLIV PŘÍDAVKU 1-MONOACYLGLYCEROLŮ NA KONZISTENCI PLNOTUČNÝCH TAVENÝCH SÝRŮ Buňka František 1), Pavlínek Vladimír 2), Hrabě Jan 1), Rop Otakar 1), Galářová Blanka 1), Janiš Rahula 1), Krejčí Jiří 1) 1) Ústav potravinářského inženýrství a chemie, 2) Centrum polymerních materiálů, Univerzita Tomáše Bati ve Zlíně THE EFFECT OF ADDITION OF 1-MONOACYLGLYCEROLS ON CONSISTENCY OF FULL-FAT PROCESSED CHEESES Summary: Consistency is a very important sensory characteristic of processed cheeses. The consistency of processed cheeses may be influenced by additions of substances, which are able to affect the process of emulsification of lipids, as are, for example, different emulgators. In the work, there were analyzed and compared the samples of processed cheeses with additions 1-glycerylmonocaprylate, 1-glycerylmonolaurate and 1-glycerylmonostearate, after 14 days of storage at 6 ± 2 o C using the dynamic oscillatory rheometry. With increasing number of carbons in molecule of fatty acid, which is esterally fixed in 1-monoacylglycerol, there increased especially the storage modulus G. Also the crossover point of the storage modulus G and the loss modulus G moved to lower frequencies with increasing number of carbons. After 120 days of storage at temperature 6 ± 2 o C there were increased both the storage modulus G and the loss modulus G, from which it can be deduced on increasing of rigidity during 4 months of storage. As the most stable there was evaluated the processed cheese with addition of 1-glycerylmonostearate there were found the smallest changes of observed parameters. Úvod Tavené sýry jsou vyráběny zahříváním směsi různých druhů přírodních sýrů, které mohou být v různém stupni prozrálosti, s tavicími solemi za mírného podtlaku a stálého míchání, až je dosažena homogenní hmota požadovaných vlastností. Ke směsi přírodních sýrů mohou být přidány jiné suroviny mléčného i nemléčného původu (Carić & Kaláb, 1997). V podmínkách České republiky definuje vyhláška Ministerstva zemědělství č. 77/2003 Sb. tavený sýr jako sýr, který byl tepelně upraven za přídavku tavicích solí. Tavené sýry jsou emulzí typu tuk ve vodě, kde roli emulgátorů zastávají především mléčné proteiny. Hlavními proteinovými frakcemi jsou frakce kaseinů, jejichž emulgační potenciál je zvyšován použitím emulgačních činidel s monovalentními kationty (sodné ionty) a polyvalentními anionty (zejména fosfáty) tzv. tavicích solí (Kwak, Choi, Ahn & Lee, 2002; Lee, Anema & Klostermeyer, 2004). Jedním z nejdůležitějších senzorických znaků je konzistence tavených sýrů. Kromě obsahu sušiny, tuku, stupně prozrálosti přírodních sýrů a směsi tavicích solí existuje mnoho faktorů, které mohou ovlivnit konzistenci finálního výrobku, například je možné jmenovat ph taveného sýra (Marchesseau, Gastaldi, Lagaude & Cuq, 1997; Lee & Klostermeyer, 2001), přítomnost tzv. krému (Caric & Kaláb, 1997), obsah vápenatých iontů, přídavek různých proteinů (French, Lee, DeCastro & Harper, 2002; Kwak et al., 2002), doba a intenzita zpracování taveniny (Bowland & Foegeding, 2001), přídavek substancí na bázi sacharidů a polysacharidů, chladící režim, skladovací podmínky apod. Kromě výše zmíněných faktorů zapříčiňují změny konzistence přídavky substancí, které jsou schopny ovlivnit proces emulgace tuku zejména přídavky emulgátorů (Awad, Abdel-Hamid, El-Shabrawy & Singh, 2002). Monoacylglyceroly, případně jejich deriváty, jsou v potravinářském průmyslu rozšířenými emulgátory. Známé je jejich využití např. při výrobě emulgovaných tuků a šlehaných mlékárenských výrobků (Pokorný, 1986; Moonen & Bas, 2004). Rozšířené jsou rovněž v pekárenství, kde zvyšují trvanlivost pečiva, mají rovněž příznivé účinky na reologické vlastnosti těsta (Ravi, Manohar & Rao, 2000) a upravují rozpustnost bílkovinné frakce. V dostupné literatuře 186

183 nebyly nalezeny dostatečné údaje o důsledcích přídavků monoacylglycerolů do tavených sýrů. Jediná zmínka, která byla autory nalezena, je v práci Caric & Kaláb (1997), kteří uvádí, že je možné vyrobit tavené sýry s polovičním množstvím tavicích solí za přídavku asi 1 % povrchově aktivních monoacylglycerolů. Cílem této práce bylo popsat vliv nízkého přídavku vybraných 1-monoacylglycerolů s různým počtem uhlíků v esterově vázané mastné kyselině na konzistenci a senzorickou jakost tavených sýrů s obsahem 50 % tuku v sušině. Materiál a metody Analyzovány byly tavené sýry s obsahem 41 % (w/w) sušiny a 50 % tuku v sušině (w/w), k jejichž výrobě byly použity: směs přírodních sýrů (eidamská cihla 30 % tuku v sušině w/w, eidamská cihla 45 % tuku v sušině w/w, Madeland), máslo, voda a komerčně dodávané tavicí soli. Tavené sýry byly vyráběny na zařízení Vorwerk Thermomix TM 21 blender cooker (Vorwerk & Co. Thermomix; GmbH, Wuppertal, Germany), při tavicí teplotě 92 o C a celkové době tavení cca 10 minut. Stejné zařízení pro výrobu tavených sýrů použili Lee et al. (2004). K taveným sýrům byly přidány 1-monoacylglyceroly v množství 0,25 % w/w, a to po rozmíchání v přidávané vodě, u které byl nejprve proveden ohřev na cca 70 o C. Pro zjištění vlivu počtu uhlíků v esterově vázané mastné kyselině v pozici 1 na monoacylglycerolu byly vybrány 1-monokaprylglycerol (MAG-C 8:0 ), 1-monolaurylglycerol (MAG-C 12:0 ) a 1-monostearylglycerol (MAG-C 18:0 ). Kromě tavených sýrů s přídavky 1-monoacylglycerolů byl vyroben také kontrolní vzorek. Tavené sýry byly po výrobě zchlazeny na 6 ± 2 o C a při této teplotě skladovány do doby provedení analýz. První rheologické posouzení bylo provedeno po 14 dnech a druhé po 120 dnech skladování. Senzorická analýza byla provedena pouze po dvoutýdenním skladování. Použité 1-monoacylglyceroly (MAG-C 8:0, MAG-C 12:0 a MAG-C 18:0 ) byly připraveny postupem podle Janiše, Krejčího & Kláska (2000). Produkty byly přečištěny rekrystalizací z etanolu za účelem odstranění reziduálního glycidolu a snížení obsahu chromitých iontů z katalyzátoru. Čistota 1-monoacylglycerolů byla ověřována pomocí HPLC (99% čistota) a byl zjištěn zbytkový obsah chromitých iontů pomocí AAS (< 50 mg kg -1 ). Reologické vlastnosti připravených tavených sýrů byly charakterizovány pomocí rotačního viskozimetru Bohlin Gemini (Bohlin Instruments, UK) v geometrii deska-deska (průměr 40 mm, štěrbina 1 mm) při teplotě 20 o C. Měření bylo prováděno v oscilačním režimu s amplitudou smykového napětí 20 Pa v oblasti lineární viskoelasticity. Elastický modul pružnosti G a ztrátový modul pružnosti G byly vyhodnocovány v rozsahu frekvencí 0,1 až 50 Hz. Senzorické posouzení bylo provedeno 16 vybranými posuzovateli (zaměstnanci Ústavu potravinářského inženýrství a chemie) vyškolených podle ČSN ISO Vzorky byly předkládány anonymně při pokojové teplotě (22 ± 2 o C). Hodnoceny byly 4 senzorické znaky (tuhost, roztíratelnost, chuť a vůně a intenzita pachutí), a to podle sedmibodových ordinálních stupnic s charakteristikou každého stupně. Pro statistické vyhodnocení byl použit Kruskal-Wallisův test (Hrabě, Kříž & Buňka, 2001). Výsledky a diskuse Viskoelastické chování kontrolního vzorku a tavených sýrů s přídavky vybraných 1-monoacylglycerolů (MAG-C 8:0, MAG-C 12:0 a MAG-C 18:0 ) bylo posuzováno a srovnáváno metodou dynamické oscilační reometrie. Na obrázku 1 jsou zobrazeny závislosti elastického modulu pružnosti G a ztrátového modulu pružnosti G na frekvenci (0,1 až 50 Hz) u tavených sýrů, které byly skladovány 14 dnů při teplotě 6 ± 2 o C. Z výsledků vyplývá, že s rostoucím počtem uhlíků v molekule nasycené mastné kyseliny, která je esterově vázaná v 1-monoacylglycerolu, se zvyšuje elastická složka a tavené sýry se stávají tužší. Rovněž průsečík křivek elastického 187

184 modulu pružnosti G a ztrátového modulu pružnosti G (tzv. crossover point) se s rostoucím počtem uhlíku posouvá do nižších frekvencí (u přídavku 1-monostearylglycerolu lze tento průsečík předpokládat u frekvencí menších než 0,1 Hz). Posun průsečíku obou sledovaných modulů do nižších frekvencí (doleva) indikuje změnu povahy gelu, který s rostoucím počtem uhlíků v molekule mastné kyseliny stále více vykazuje zvyšující se tuhost. To lze vysvětlit již výše zmíněnou skutečností, že s přídavky sloučenin, které zvýší intenzitu emulgace tuku, roste za jinak stejných podmínek i tuhost taveného sýra (Awad et al., 2002). Bylo rovněž prokázáno, že emulgační schopnost nasycených 1-monoacylglycerolů roste s počtem uhlíků v molekule mastné kyseliny v souladu s jejich hodnotami HLB (hydrofilic-lipofilic-balance) a povrchových napětí (Faur, 1996; Moonen & Bas, 2004). Vliv přídavku použitých 1-monoacylglycerolů na jakost tavených sýrů byl posuzován po 14 dnech skladování při teplotě 6 ± 2 o C rovněž senzorickou analýzou, jejíž výsledky je možné vidět v tabulce I. Z hodnocení vyplynulo, že pouze tavený sýr s přídavkem 0,25 % w/w 1-monostearylglycerolu je signifikantně tužší a méně roztíratelný ve srovnání s kontrolním vzorkem (P < 0,05). Pouze u tohoto vzorku tedy hodnotitelé zaznamenali významnou změnu ve srovnání s kontrolou (tavený sýr bez přídavku). U ostatních přídavků 1-monoacylglycerolů (MAG-C 8:0, MAG-C 12:0 ) nezaznamenali posuzovatelé v tuhosti a roztíratelnosti významné změny vzhledem ke kontrolnímu vzorku. Při posuzování chuti a vůně a intenzity pachutí se projevily výrazné nedostatky u vzorků s přídavky 1-monokaprylglycerolu a 1-monolaurylglycerolu, které posuzovatelé hodnotili jako nepřijatelné. Na obdobný problém v senzorické přijatelnosti přídavku 1-monokaprylglycerolu do mléka a mlékárenských výrobků upozorňují ve své práci Nair, Vasudevan, Hoagland & Venkitanarayanan (2004). Tavené sýry byly dynamickou oscilační reometrií posuzovány i po 120 dnech skladování při teplotě 6 ± 2 o C. Výsledky hodnocení ve srovnání s hodnotami po 14 dnech skladování při stejné teplotě jsou uvedeny na obrázku 2, kde jako referenční hodnota pro frekvenci byla zvolena 1 Hz. U všech tavených sýrů skladovaných 120 dnů při výše uvedené teplotě došlo ke zvýšení elastického G i ztrátového G modulu pružnosti, z čehož lze usuzovat na zvýšení tuhosti těchto sýrů ve srovnání se vzorky skladovanými pouze 14 dnů. K nejintenzivnější změně došlo u kontrolního vzorku bez přídavku 1-monoacylglycerolů. Naopak k relativně nejmenším změnám po 120denním skladování při teplotě 6 ± 2 o C došlo u taveného sýra s přídavkem 1-monostearylglycerolu. Tabulka I Výsledky senzorické analýzy tavených sýrů s přídavkem 0,25 % w/w použitých 1-monoacylglycerolů (vyjádřeno modální kategorií z ordinální stupnice) Použitý Senzorické hodnocení 1-monoacylglycerol Tuhost Roztíratelnost Chuť a vůně Intenzita pachutí Kontrola MAG-C 8: MAG-C 12: MAG-C 18: Tuhost: 1-velmi tuhý, 7-velmi měkký; Roztíratelnost: 1-vzorek není možné rozetřít, 4-optimální roztíratelnost, 7-tekutý vzorek; Chuť a vůně: 1-vynikající, 7-naprosto nepřijatelná; Intenzita pachutí: 1-nepostřehnutelné, 7-velmi silné 188

185 189 Obr. 1 Závislost hodnoty elastického modulu pružnosti G u kontrolního taveného sýra ( ) a tavených sýrù s pøídavky 1-monokaprylglycerolu (MAG-C8:0) ( ), 1-monolaurylglycerolu (MAG-C12:0) ( ) a 1-monostearylglycerolu (MAG-C18:0) ( ) a ztrátového modulu pružnosti G [Pa] u kontrolního taveného sýra ( ) a tavených sýrù s pøídavky 1-monokaprylglycerolu (MAG-C8:0) ( ),1-monolaurylglycerolu (MAG-C12:0) ( ) a 1-monostearylglycerolu (MAG-C18:0) ( ) na frekvenci [Hz] (skladováno 14 dnù pøi teplotì 6 ± 2 o C)

186 Obr. 2 Hodnoty elastického modulu pružnosti G a ztrátového modulu pružnosti G [Pa] pro referenční frekvenci 1 Hz u kontrolního taveného sýra a tavených sýrů s přídavky 1-monokaprylglycerolu, 1-monolaurylglycerolu a 1-monostearyl-glycerolu skladovaných 14 a 120 dnů při teplotě 6 ± 2 o C Závěr V práci byla srovnávána konzistence tavených sýrů s přídavky 1-monokaprylglycerolu, 1-monolaurylglycerolu a 1-monostearylglycerolu s kontrolním vzorkem, a to jak po 14 dnech tak i po 120 dnech skladování při teplotě 6 ± 2 o C. S rostoucím počtem uhlíků v molekule mastné kyseliny v 1-monoacylglycerolech roste i elastický a ztrátový modul pružnosti, tedy tavené sýry se stávají tužšími. Vybraní posuzovatelé (podle ČSN ISO ) však zaznamenali významný rozdíl pouze u taveného sýra s přídavkem 1-monostearylglycerolu ve srovnání s kontrolním vzorkem. Ostatní přídavky sice z hlediska dynamické oscilační rheometrie vykazují vyšší tuhost, prakticky ji však hodnotitelé nerozeznají od kontrolního taveného sýra. U vzorků s 1-monokaprylglycerolem a 1-monolaurylglycerolem byla posuzovateli stanovena nepřijatelnost z důvodu velmi intenzivních pachutí. Po 120 dnech skladování při výše uvedené chladírenské teplotě dojde ke zvýšení elastických i ztrátových modulů pružnosti u kontrolního vzorku i u tavených sýrů s přídavky 1-monoacylglycerolů, přičemž u kontrolního vzorku došlo k relativně největším změnám sledovaných modulů pružnosti (G a G ). Přídavek 1-monostearylglycerolu nejenže má schopnosti vytvořit nejtužší gel (ze sledovaných 1-monoacylglycerolů), ale je i senzoricky nejakceptovatelnější vzhledem k analyzovaným přídavkům 1-monoacylglycerolů a navíc je ho možné hodnotit jako nejstabilnější, neboť při jeho přídavku došlo ke relativně nejmenším změnám vyhodnocovaných reologických vlastností po 120 dnech skladování při teplotě 6 ± 2 o C. Poděkování Práce vznikla za podpory projektu MŠMT: MSM

187 Literatura 1. Awad, R.A., Abdel-Hamid, L.B., El-Shabrawy, S.A., Singh, R.K. (2002). Texture and Microstructure of Block Type Processed Cheese with Formulated Emulsifying Salt Mixtures. Lebensm.-Wiss. u.-technol., 35, Berger, W., Klostermeyer, H., Merkenich, K. & Uhlmann, G. (2002). Processed Cheese Manufacture. A JOHA Guide. Ladenburg: BK Giulini Chemie GmbH & Co. OHG, 238 p. 3. Bowland, E.L., Foegeding, E.A. (2001). Small Strain Oscillatory Shear and Microstructural Analyses of a Model Processed Cheese. J. Dairy Sci., 84, Carić, M., & Kaláb, M. (1997). Processed cheese products. In Fox, P.F. (ed.) Cheese: Chemistry, Physics and Microbiology. Volume 2. Major Cheese Groups, 2. ed. Elsevier Applied Science, London and New York, Faur, L. (1996). Margarine technology. In Karleskind, A. (ed.) Oils and Fats Manual. A comprehensive Treatise. Volume 2. Intercept Ltd., p French, S.J., Lee, K.M., DeCastro, M., Harper, W.J. (2002). Effects of different protein concentrates and emulsifying salt conditions on the characteristics of a processed cheese product. Milchwissenschaft, 57, 2, Guinee, T.P. (2003). Pasteurized processed cheese products. In Roginski, H., Fuquay, J.W., Fox, P.F. Encyklopedia of Dairy Science Volume 1 (pp ). London: Elsevier Science. 8. ISO (1993). Standard No :1993 Sensory analysis General guidance for the selection, training and monitoring of assessors Part 1: Selected assessors. International Organization for Standardization, Geneva. 9. Janiš, R., Krejčí, J. & Klásek, A. (2000). Preparation of 1-monoacylglycerols from glycidol and fatty acids catalyzed by the chromium(iii)-fatty acid system. European Journal of Lipid Science and Technology, 102, Kwak, H.S., Choi, S.S., Ahn, J. & Lee, S.W. (2002). Casein Hydrolysate Fractions Act as Emulsifiers in Process Cheese. Journal of Food Science, 67, Lee, S.K., Anema, S. & Klostermeyer, H. (2004). The influence of moisture content on the rhological properties of processed cheese spreads. International Journal of Food Science and Technology, 39, Lee, S.K., Klostermeyer, H. (2001). The Effect of ph on the Rheological Properties of Reduced-fat Model Processed Cheese Spreads. Lebensm.-Wiss. u.-technol., 34, Marchesseau, S., Gastaldi, E., Lagaude, A., Cuq, J.L. (1997). Influence of ph on Protein Interactions and Microstructure of Process Cheese. J.Dairy Sci., 80, Moonen, H., Bas, H. (2004). Mono- and diglycerids. In Whitehurst, R. J. (ed.) Emulsifiers in Food Technology. Blackwell Publishing, p Nair, M.K.M., Vasudevan, P., Hoagland, T., Venkitanarayanan, K. (2004). Inactivation of Escherichia coli O157:H7 and Listeria monocytogenes in milk by caprylic acid and monocaprylin. Food Microbiology, 21, Pokorný, J. (1986). Technologie tuků. Praha: SNTL, s Ravi, R., Manohar, R.S., Rao, P.H. (2000). Influence of additives on the rheological characteristic and baking quality of wheat flours. European Food Research and Technology, 210, Kontaktní adresa: Ing. František Buňka, Ph.D., Ústav potravinářského inženýrství a chemie, Fakulta technologická, Univerzita Tomáše Bati ve Zlíně, nám. T.G.Masaryka 275, Zlín, tel , bunka@ft.utb.cz 191

188 ZMĚNY BARVY STERILOVANÝCH TAVENÝCH SÝRŮ BĚHEM DVOULETÉHO SKLADOVÁNÍ Buňka František 1), Štětina Jiří 2), Hrabě Jan 1) 1) Ústav potravinářského inženýrství a chemie UTB ve Zlíně, 2) Ústav technologie mléka a tuků VŠCHT v Praze THE COLOUR CHANGES OF THE STERILIZED PROCESSED CHEESES DURING 2-YEARS STORAGE Summary: In this paper was evaluated the influence of 2-years storage at 8 ± 2 o C and 23 ± 2 o C on appearance and colour of sterilized processed cheese. The change of appearance and colour was observed by instrumental methods and also by sensory analysis (scale method and paired comparison test). The conclusions of both of instrumental methods and sensory analysis were confronted. Úvod V situacích, kdy není možné vojákům zabezpečit teplou stravu (odloučení od jednotky, bojové nasazení aj.), je možné ke stravování těmto osobám vydávat tzv. bojové dávky potravin. V současnosti jsou tyto dávky rovněž využívány k zabezpečení členům integrovaného záchranného systému při jejich operačním nasazení. Jednotlivé potravinové komponenty by měly mít dobu minimální trvanlivosti nejméně 2 roky při okolní teplotě (požadavek STANAG 2937) [1]. Součástí bojových dávek potravin armád zemí NATO (např. USA, Německo, Francie i Česká republika) je tavený sýr. Jednou z možností, jak v současné době dosáhnout u taveného sýra trvanlivosti nejméně 2 let, je jeho termosterilace. Experimenty provedené v roce 2003 [2] prokázaly vliv definovaného sterilačního záhřevu (117 o C po dobu 20 minut) na barvu u tavených sýrů, přičemž sterilované tavené sýry vykazovaly tmavší odstín než odpovídající vzorky nesterilované. Vzhledem k tomu, že dostupná literatura neuvádí uspokojující a dostatečné množství informací o změnách sterilovaných tavených sýrů během jejich dlouhodobého skladování, byly s těmito produkty založeny skladovací pokusy. Z práce KRISTENSENA a kol. [3] vyplývá, že u tavených sýrů skladovaných 1 rok dochází k intenzivnějším změnám barvy za vzniku tmavších odstínů, pokud jsou tyto produkty skladovány za vyšších teplot. Za hlavní příčinu tmavnutí sýrů bývá často označován komplex Maillardových reakcí [4,5]. Cílem práce bylo pomocí instrumentálních metod i senzorické analýzy srovnat barevné změny sterilovaných tavených sýrů během jejich dvouletého skladování při chladírenské teplotě (8 ± 2 o C) a při teplotě okolí, která byla zvolena na úrovni 23 ± 2 o C (tzv. pokojová teplota). Metodika práce Skladovací pokus byl založen se 4 řadami sterilovaných tavených sýrů (sušina 40 % w/w, tuk v sušině 45 % w/w), z nichž první dvě byly vyrobeny v roce 2002 v tehdejší Želetavské sýrárně, a. s. (řady I a II) a další dvě v roce 2003 ve společnosti MADETA, a. s. (řady III a IV). K výrobě tavených sýrů byla použita směs přírodních sýrů, máslo, tvaroh, voda a tavicí soli (fosfátové a polyfosfátové tavicí soli, u řad I a II byly použity rovněž citrátové tavicí soli). Je třeba zmínit odlišnost u čtvrté (poslední) výroby, kde byla do surovinové skladby použita sušená syrovátka v množství 0,5 % w/w. Celková doba tavení byla 5 minut a tavicí teplota činila 91 o C (řady I a II), resp. 94 o C (řady III a IV). Tavenina byla plněna do 100-gramových obalů z taženého hliníku uzavřených přivařitelným hliníkovým víčkem. Následoval sterilační záhřev, který byl proveden ve sterilátoru LUBECA při teplotě 117 o C s výdrží 20 minut, po té byly vzorky ve sterilátoru zchlazeny na 25 o C a odebrány ke skladovacím pokusům při různých teplotách. 192

189 Sterilované tavené sýry skladované při chladírenské teplotě 8 ± 2 o C, jsou označovány jako L a ty, které byly skladování při teplotě 23 ± 2 o C, jsou v této práci pod kódy S. Arabská číslice za mezerou pak označuje dobu skladování v měsících. Označení LII_24 tedy znamená sterilovaný tavený sýr II. řady skladovaný 24 měsíců při teplotě 8 ± 2 o C. Vliv doby a teploty skladování na barvu sterilovaných tavených sýrů byl sledován pomocí reflektančního difusního spektrofotometru LabScen XE (HunterLab, UK). Z taveného sýra byl vykrojen válec o průměru 35 mm a výšce cca 2 cm, který byl položen do petriho misky a ta byla umístěna pod měřící štěrbinu přístroje (průměr 17 mm). Difusní reflektanční spektrum řezu taveného sýra bylo měřeno v oblasti vlnových délek 400 až 700 nm s krokem 10 nm. Výsledky byly získány pro osvětlení D 65 (denní světlo s teplotou barvy 6500 K) a CIE o standardního pozorovatele a vyjádřeny ve stupnici CIE L*a*b*, kde [6,7]: L* - vyjadřuje jas (lightness), L 0;100, 0 náleží černé a 100 bílé, a* - vyjadřuje chromatičnost na ose zelená (-) až červená (+), a -80;+100, b* - vyjadřuje chromatičnost na ose modrá (-) až žlutá (+), b -80;+70. Uvedené výsledky jsou průměrem ze dvanácti měření (u každého sterilovaného taveného sýra byly hodnoceny 3 vykrojené válce, u kterých byly získány postupným otáčením vzorku vždy 4 spektra). Statistické vyhodnocení bylo provedeno jednofaktorovou neparametrickou analýzou rozptylu (Kruskal-Wallisův test) s 5% rizikem omylu (tj. s 95% spolehlivostí tato spolehlivost byla použita u všech testů statistických hypotéz). Vzhledem k tomu, že barevné změny tavených sýrů jsou často přičítány reakcím dusíkatých látek (především bílkovin a peptidů), jejichž vedlejším produktem může být amoniak, byly zjišťovány i koncentrace amoniaku v průběhu skladovacího pokusu, a to Conwayovou metodou [8]. Statistické vyhodnocení bylo provedeno regresní analýzou, metodou nejmenších čtverců. Z oblasti senzorické analýzy byl vliv doby a teploty skladování na barvu sterilovaných tavených sýrů hodnocen pomocí pětibodových jakostních ordinálních stupnic s charakteristikou každého stupně. První stupeň byl vyhrazen úrovni vynikající a pátý stupeň úrovni nevyhovující. Stupnicové metody byly doplněny párovou porovnávací zkouškou (srovnávaným znakem byl odstín sterilovaného taveného sýra), která dovoluje zachytit mezi srovnávanými vzorky menší odchylky ve srovnání se stupnicovými metodami. Statistické vyhodnocení bylo provedeno u stupnicových metod jednofaktorovou neparametrickou analýzou rozptylu (Kruskal-Wallisův test) a u párových porovnávacích zkoušek testem o parametru binomického rozdělení [9]. Výsledky a diskuse Změny v barvě tavených sýrů byly nejprve charakterizovány pomocí veličin L*, a*, b*, jejichž hodnoty lze najít v obrázku 1 (uvedeny jsou řady I a IV; II. řada vykazovala přibližně stejný vývoj v čase jako I. řada; III. řada měla podobný vývoj v čase jako IV. řada). Vývoj jasu (L*) tavených sýrů během jejich dvouročního skladování při chladírenské teplotě nebyl u všech 4 řad stejný. Tavené sýry řady I a II vykazovaly při skladování v lednici kolísání hodnot jasu, naproti tomu u produktů řady III a IV hodnota jasu klesala. Během dvou let skladování při teplotě 23 ± 2 o C se jas postupně snižoval, přičemž po 24 měsících byla tato změna u 3 ze 4 řad signifikantní (P < 0,05) ve srovnání s počátečními sterilovanými tavenými sýry, které vstupovaly do skladovacích pokusů. Z komparace 3 ze 4 řad sterilovaných tavených sýrů skladovaných při chladírenské a pokojové teplotě vyplynulo, že produkty skladované při pokojové teplotě mají statisticky významně nižší jas. 193

190 A) B) Obr. 1 Výsledky měření barvy ve stupnici L*a*b* u sterilovaných tavených sýrů řady I a IV během dvouletého skladování při teplotách 8 ± 2 o C a 23 ± 2 o C Poznámka: část A) obsahuje hodnoty charakteristik L*a*b* pro tavené sýry řady I a část B) obsahuje totéž pro řadu IV. Písmena nad sloupci v grafu značí statistickou významnost rozdílů (hladina významnosti α = 0,05) mezi jednotlivými sterilovanými tavenými sýry. Pokud mají kterékoliv dva sloupce (v rámci jednoho grafu) alespoň jedno písmeno stejné, pak rozdíl mezi uvedenými sterilovanými sýry, nebyl prokázán. Pokud však nemají srovnávané sloupce žádné společné písmeno, pak mezi danými sterilovanými tavenými sýry rozdíl existuje. 194

191 Hodnoty chromatičnosti na ose zelená-červená (a*) u chladírensky skladovaných výrobků kolísají stejně jako u hodnocení jasu. Již mnohem jednoznačnější jsou změny při skladovací teplotě 23 ± 2 o C. Během dvouletého skladování se zde odstín na ose zelená-červená blíží více červené oblasti, což z obrázku 1 jednoznačně vyplývá. Rovněž srovnání výrobků skladovaných při teplotách 8 ± 2 o C a 23 ± 2 o C ukázalo, že výrobky skladované při vyšší teplotě mají signifikantně vyšší hodnoty chromatičnosti na ose zelená-červená (a*), tedy že se odstín posouvá více od zeleného k červenému. Hodnoty chromatičnosti na ose modrá-žlutá (b*) u sterilovaných tavených sýrů uložených 24 měsíců při 8 ± 2 o C s výjimkou produktů řady II mírně vzrůstají, přičemž u většiny řad ke statisticky průkazným změnám nedochází. U výrobků skladovaných při teplotě 23 ± 2 o C došlo k signifikantnímu nárůstu (P < 0,05) hodnot b*, tzn. že se odstín posouvá od modrého více ke žlutému. V průběhu 24 měsíců skladování se vzhled a barva tavených sýrů hodnocená pomocí hédonické ordinální stupnice horšily (výsledky jsou uvedeny v tabulce I). U řady I a II se navíc objevily již v prvním skladování krystaly citrátových tavicích solí, které byly k jejich výrobě použity, což jednoznačně zhoršilo jejich hodnocení. Krystalizace byla rozsáhlejší u tavených sýrů skladovaných při chladírenské teplotě, a proto i jejich výsledné senzorické hodnocení bylo horší než u srovnatelných výrobků skladovaných při teplotě 23 ± 2 o C. Toto zjištění odpovídá názorům prezentovaným v pracích [5,10,11], kde se uvádí, že krystalizační procesy probíhají intenzivněji při nižších skladovacích teplotách. Naopak u řad III a IV byly tavené sýry uchovávané při vyšší teplotě hodnoceny hůře než výrobky uložené při 8 ± 2 o C. V těchto řadách již nebyly použity citrátové tavicí soli a ani krystaly se zde během 2 let skladování při žádné z teplot neobjevily (v rámci senzorické analýzy nebyly zaznamenány). Z párových porovnávacích zkoušek jednoznačně vyplynulo, že po celou dobu skladování vykazovaly tavené sýry skladované při teplotě 8 ± 2 o C statisticky významně světlejší odstín než výrobky uchovávané při 23 ± 2 o C, a to již od 6. měsíce skladování Barvené změny a zejména tmavnutí v závislosti na prodlužující se době skladování při vyšších teplotách (23 ± 2 o C) lze vysvětlovat především reakcemi dusíkatých látek (zejména bílkovin a peptidů), při nichž se může uvolňovat amoniak. V průběhu dvouletého skladování při obou teplotách docházelo k postupnému nárůstu obsahu amoniaku ve sterilovaných tavených sýrech. Zvyšování koncentrace NH 3 by mohlo být popsáno logaritmickou závislostí, tzn. že v prvních měsících skladování dochází k intenzivnějšímu průběhu výše zmíněných reakcí a následně se tato intenzita snižuje viz obrázek 2. Z obrázku 2 rovněž je rovněž patrné, že směrnice křivky u výrobků skladovaných při 23 ± 2 o C je vyšší v porovnání s chladírensky uchovávanými tavenými sýry, z čehož lze u produktů skladovaných při vyšší teplotě usoudit na intenzivnější průběh reakcí, při nichž se uvolňuje amoniak. Tato skutečnost tedy přispívá k vysvětlení rozsáhlejšího tmavnutí (hnědnutí) tavených sýrů skladovaných při vyšší teplotě. Z instrumentálního hodnocení i ze senzorického posuzování barvy rovněž vyplynulo, že nejintenzivnější změny během dvouletého skladování nastaly u IV. řady sterilovaných tavených sýrů. Příčinu lze hledat v komplexu Maillardových reakcí, které v důsledku přídavku sušené syrovátky (obsahující zejména redukující disacharid laktosu) pravděpodobně probíhaly intenzivněji než u ostatních řad sterilovaných tavených sýrů (I III) [12]. 195

192 Tabulka I Výsledky senzorického hodnocení vzhledu a barvy 4 pokusných řad sterilovaných tavených sýrů v průběhu jejich dvouročního skladování při teplotách 8 ± 2 o C a 23 ± 2 o C (hodnoceno 5-ti bodovou ordinální stupnicí) Řada I II III IV Skladovací teplota 8 ± 2 o C 23 ± 2 o C 8 ± 2 o C 23 ± 2 o C 8 ± 2 o C 23 ± 2 o C 8 ± 2 o C 23 ± 2 o C Doba Počet hodnotitelů, kteří zvolili stupeň skladování vynikající výborný dobrý méně dobrý nevyhovující vstupní hodnocení měsíců měsíců měsíců měsíců měsíců měsíců měsíců měsíců vstupní hodnocení měsíců měsíců měsíců měsíců měsíců měsíců měsíců měsíců vstupní hodnocení měsíců měsíců měsíců měsíců měsíců měsíců měsíců měsíců vstupní hodnocení měsíců měsíců měsíců měsíců měsíců měsíců měsíců měsíců

193 A) 400 Obsah amoniaku [mg/kg] y = 38,019Ln(x) + 214,24 R = 0,9798 y = 22,204Ln(x) + 212,78 R = 0,9331 Teplota skladování 8st.C Teplota skladování 23st.C Doba skladování [měsíce] B) 300 y = 26,552Ln(x) + 180,43 R = 0,9360 Obsah amoniaku [mg/kg] y = 11,514Ln(x) + 183,3 R = 0,8458 Teplota skladování 8st.C Teplota skladování 23st.C Doba skladování [měsíce] Obr. 2 Vývoj obsahu amoniaku [mg kg -1 ] ve sterilovaných tavených sýrech skladovaných 24 měsíců při teplotách 8 ± 2 o C a 23 ± 2 o C u řady I (část A) a řady IV (část B) Závěr V práci byl posuzován vliv skladovací teploty a délky skladování na barvu sterilovaných tavených sýrů. U produktů skladovaných při 8 ± 2 o C nedocházelo u instrumentálně hodnocených znaků k jednoznačným změnám, navíc se zde již v prvním roce skladování vyskytly senzoricky nepřijatelné krystaly citrátových tavicích solí. Sterilované tavené sýry uložené dva roky při 23 ± 2 o C vykazovaly snížení jasu, posun odstínu od zeleného do červeného a posun odstínu od modrého do žlutého. Produkty skladované při vyšší teplotě byly hodnoceny jako tmavší ve srovnání s chladírensky uchovávanými výrobky. Změny barvy byly nejintenzivnější u IV. řady pravděpodobně v důsledku realizovanému přídavku sušené syrovátky (0,5 % w/w). Příčinu barevných změn u všech analyzovaných řad lze hledat v reakcích dusíkatých látek, jejichž důkazem byl nárůst obsahu amoniaku ve skladovaných sterilovaných tavených sýrech. 197

194 Poděkování Práce vznikla za podpory projektu MŠMT: MSM Literatura 1. Standarditation Agreement (STANAG) Survival, Emergency and Individual Combat Ration - Nutritional Values and Packaging. 3. ed. Brussels: NATO/MAS, BUŇKA, F., ŠTĚTINA, J., HRABĚ, J. Vliv sterilačního záhřevu na konzistenci a barvu taveného sýra In Sborník Celostátní přehlídky sýrů Mléko a sýry Praha: Česká společnost chemická, 2003, s KRISTENSEN, D., HANSEN, E., ARNDAL, A., TRINDERUP, R.A., SKIBSTED, L.H. Influence of light and temperature on the colour and oxidative stability of processed cheese. Int. Dairy J. 11, 2001, CHRISTENSEN, J., POVLSEN, V.T., SØRENSEN, J. Application of Fluorescence Spectroscopy and Chemometrics in the Evaluation of Processed Cheese During Storage. J.Dairy Sci. 86, 2003, SCHÄR, W a BOSSET, J.O. Chemical and Physico-chemical Changes in Processed Cheese and Ready-made Fondue During Storage - A Review. Lebensm.-Wiss. u.-technol. 35, 2002, Commission Internationale de l Eclairage (CIE, 1978), Colorimetry, Bereau Central de la CIE, Paris. 7. Ammerican Society of Testing and Materials (1998): ASTM Standards on Color and Appearance Measurement, West Conshohocken, PA: ASTM. 8. BUŇKA, F., HRABĚ, J., KRÁČMAR, S. The effect of sterilisation on amino acid contents in processed cheese. Int.Dairy J. 14, 2004, HRABĚ, J., KŘÍŽ, O., BUŇKA, F. Statistické metody v senzorické analýze potravin. 1. vyd. Vyškov : VVŠ PV, 2001, 114 s. 10. CARIĆ, M., KALÁB, M. Processed cheese products. In Fox, P.F. (ed.) Cheese: Chemistry, Physics and Microbiology. Volume 2. Major Cheese Groups, 2. ed. Elsevier Applied Science, London and New York, 1997, UHLMANN, G., KLOSTERMEYER, H., MERKENICH, K. Kristallisations-erscheinungen in Schmelzkäseprodukten - I. Phänomen und Ursachen. Milchwissenschaft, 38, 1983, FRIEDMAN, M. Food Browning and Its prevention: An Overview. J.Agric.Food Chem. 44, 1996, Kontakt: Ing. František Buňka, Ph.D., Ústav potravinářského inženýrství a chemie, Fakulta technologická, Univerzita Tomáše Bati ve Zlíně, nám. T.G.Masaryka 275, Zlín, tel , bunka@ft.utb.cz 198

195 VLIV EXOPOLYSACHARIDŮ JOGURTOVÝCH KULTUR A KONCENTRACE BÍLKOVIN NA REOLOGICKÉ VLASTNOSTI JOGURTU Kánský Jiří, Štětina Jiří, Zábranská Dana Ústav technologie mléka a tuků, Vysoká škola chemicko-technologická v Praze THE INFLUENCE OF YOGURT CULTURE EXOPOLYSACCHARIDES AND PROTEIN CONCENTRATION ON THE RHEOLOGICAL PROPERTIES OF YOGURT Summary: Three yogurt cultures (MY 092, J2 ropy, RX nonropy) were used to study the influence of cultivation conditions: temperature (30, 45 C), final ph (4.7; 4.5; 4.3), protein concentration (3.2; 6.4; 9.6 %) and whey protein addition on the production of exopolysaccharides (EPS) and rheological properties of yogurt (gel firmness, viscosity and thixotropy). The production of EPS was comparable for all three cultures (around 40 mg/kg in substrate with 3.2 % protein, 45 C). With growing protein amount grew also EPS content. Production of EPS for J2 culture was the same at 30 and 45 C, for MY and RX it was higher at 30 C. Influence of temperature resulted in lower gel firmness for MY (30 C), for other gels the firmness was comparable. J2 culture showed the highest viscosity and thixotropy values. For J2 and RX with increasing ph decreased viscosity, for MY the influence wasn t proved. The viscosity of all cultures grew with protein concentration, but the highest increase of relative viscosity was observed for RX, therefore similar level as for culture MY was reached. The addition of whey proteins (2.6 %, ie. 43 % of whole protein content) resulted in higher gel firmness for MY and lower gel firmness for J2 and RX. Further the thixotropy of J2 gel decreased with whey proteins content. Úvod Exopolysacharidy (EPS) bakterií mléčného kvašení (LAB - lactic acid bacteria) jsou hlavní příčinou táhlovitosti zakysaných mléčných výrobků. Jejich využití může odstranit takové problémy jako je nízká viskozita nebo nadměrná synereze produktu, které se jinak řeší zvýšením mléčné sušiny nebo přídavkem stabilizátorů, jako jsou modifikované škroby či želatina. Použitím EPS produkujících kmenů LAB, například při výrobě míchaných (stirred) jogurtů je tedy možné zlepšit celkovou konzistenci, zabránit texturním změnám a zároveň se vyhnout použití stabilizátorů, což může učinit výrobek spotřebitelsky přijatelnějším (Bouzar et al., 1997). Produkce EPS je silně závislá na teplotě. Zatímco mezofilní LAB jich produkují nejvíce při suboptimálních podmínkách, termofilní naopak při podmínkách optimálních (De Vuyst et al., 1998; Laws and Marshall, 2001). Existují však i studie (Mozzi et al., 1995, pro Streptococcus thermophilus), ve kterých je produkce vyšší při nižších teplotách. Optimální ph pro produkci exopolysacharidů je přibližně 6,0. Vyšší ph zvyšuje produkci tím, že je prodloužena exponenciální fáze růstu kultury. Také se prodlužuje stacionární fáze růstu, kdy se snižuje produkce peptidoglykanu a kyseliny teichové, což může vést ke vzrůstu produkce exopolysacharidů. Ke zvýšení produkce exopolysacharidů se tedy dá použít dvoufázové kultivace; v prvním kroku je ph kontrolováno a udržováno kolem hodnoty 6,0, poté následuje druhá fáze, kdy ph již není regulováno, jeho snížením dochází ke koagulaci, čímž se prohloubí chuť a vůně. Tímto postupem se může produkce exopolysacharidů až zdvojnásobit (Degeest et al., 2001). Jedním z hlavních faktorů ovlivňujících produkci exopolysacharidů je též zdroj uhlíku v kultivačním médiu. Sacharidy totiž slouží jako zdroj energie pro růst mikroorganismu a zároveň pro biosyntézu exopolysacharidů. Využití různých zdrojů uhlíku pro syntézu exopolysacharidů je u každého kmene jogurtových bakterií individuální. Většina však lépe využívá laktosu a glukosu než jiné sacharidy (Grobben et al., 1997). Přítomnost galaktosy v médiu však může zvyšovat produkci EPS (Hassan et al., 2001), přičemž některé kmeny jsou schopny galaktosu pro tvorbu exopolysacharidů též syntetizovat. Pro produkci EPS je důležitý je též obsah a poměr uhlíkatých a 199

196 dusíkatých živin. Nejvyšší produkce exopolysacharidů byla zjištěna při obsahu bílkovin 4,2 % a 7,5 % laktosy (Degeest et al., 2001). EPS významně ovlivňují tokové a viskoelastické chování jogurtu. Jogurty s exopolysacharidy mají menší sklon k rozrušení struktury během míchání, čerpání, plnění a koagulát je méně citlivý vůči tepelným a fyzikálním změnám (Degeest and De Vuyst, 1999). Reologické vlastnosti jogurtů jsou však silně závislé na řadě faktorů, jako je například obsah bílkovin, kyselost koagulátu a rychlost srážení (Jaros and Rohm, 2003). Ty mohou ovšem ovlivňovat i funkční vlastnosti EPS. V řadě prací je předpokládána interakce EPS s mléčnými bílkovinami (Hassan 2003, Broadbent 2003), doposud ale nebyla přesně specifikována. Cílem práce bylo porovnat vliv podmínek kultivace, obsahu bílkovin a kyselosti na produkci EPS a reologické vlastnosti koagulátu získaného fermentací netáhlovité jogurtové kultury a kultur vykazujících táhlovitost, která je vyvolaná EPS produkovaných buď laktobacily nebo naopak streptokoky. Materiály a metody Jogurtová kultura RX - netáhlovitá kultura (Laktoflora Vokovice, ČR) J2 - táhlovitá kultura, táhlovitost vykazuje Lactobacillus bulgaricus (Laktoflora Vokovice, ČR) MY táhlovitá kultura, táhlovitost vykazuje Streptococcus thermophillus (Texel, Francie) Pokud není uvedeno jinak, kultivace byla provedena v obnoveném sušeném odstředěném mléce (10 g v 90 ml vody) při 45 C (1-2 % inokula) po dobu cca 4 hodiny (do dosažení ph 4,7). Před kultivací byl substrát sterilován při 100 C po dobu 20 minut. Příprava vzorků mléka s obsahem bílkovin zvýšeným ultrafiltrací Pro přípravu mléka o různých koncentracích bílkovin byla použita ultrafiltrace prováděná na Ultrafiltrační stanici Arno 700 (Mikropur, Hradec Králové) s keramickou membránu (Tami, Německo) s cut-off 150 kda. Ultrafiltrováno bylo odstředěné UHT mléko, které bylo zakoncentrováno na trojnásobný obsah bílkovin. Retentát a permeát byly pak pasterovány v pětilitrových kanystrech při 75 C po dobu 90 minut. Vzorky pro kultivaci byly připraveny smícháním permeátu a retentátu v takovém poměru, aby byl získán obsah bílkovin původního mléka a jeho dvojnásobek resp. trojnásobek (relativní obsah bílkovin, tzn. koncentrační faktor 1, 2 a 3). V retentátu i permeátu byl metodou dle Kjeldahla stanoven obsah čistých bílkovin a kaseinu, který byl použit pro výpočet obsahu bílkovin v jednotlivých vzorcích použitých pro kultivaci. Příprava vzorků mléka se zvýšeným obsahem syrovátkových bílkovin Substrát s celkovým obsahem bílkovin 6,4 %hm a podílem syrovátkových bílkovin 15 %, resp. 30 % a 44 % byl připraven obnovením 19 g sušeného odstředěného mléka (SOM, Promil, Nový Bydžov) v 81 g vody (vzorek sk 0), resp. 13 g SOM a 3,4 g koncentrátu syrovátkových bílkovin (WPC 65, Promil, Nový Bydžov) v 83,6 g vody (vzorek sk 3,4) a 10 g SOM a 5 g WPC v 85 g vody (vzorek sk 5). Před kultivací byl substrát pasterován při 85 C po dobu 15 minut. Izolace a stanovení EPS Vzorek byl protřepán a poté odstředěn (Universal 32R, Hettich, Německo) při 9000 rpm (10 min, 4 C). V supernatantu byly vysráženy bílkoviny působením kyseliny trichloroctové (konečná koncentrace 12 %). Po dalším odstředění a neutralizaci na ph 5 byl vzorek dialyzován (sáčky Sigma-Aldrich, cut-off Da) oproti demineralizované vodě. Obsah EPS byl stanoven fenol-sulfonovou metodou při 490 nm (Dubois et al., 1956). Kalibrace byla provedena na glukosu. Měření pevnosti gelu penetrometricky Na přístroji Instron Series 5500 (Velká Británie) byla sledována síla potřebná na vtlačování válcové sondy o průměru 10 mm do vzorku konstantní rychlostí 1 mm/s do hloubky 20 mm. Lokální maximum síly (Fmax) na zatěžovací křivce na počátku penetrace sondy, tzn. síla v okamžiku porušení struktury gelu, představuje pevnost gelu. 200

197 Hodnocení viskoelastických a tokových vlastností rozmíchaného koagulátu Měření probíhalo na rotačním reometru Rheostress RS 80 v systému koaxiálních válců Z40 (Haake, Německo) při teplotě 10 C. Vzorek byl před měřením definovaně rozmíchán lžičkou (10*ve a 10* proti směru hodinových ručiček). Další definované rozmíchání proběhlo v reometru působením konstantní smykové rychlosti 10 s -1 po dobu 5 minut. Pak byla sledována : o vzestupná větev tokové křivky - závislost smykového napětí, resp. zdánlivé viskozity na smykové rychlosti vzrůstající v rozmezí 10 s -1 až 100 s -1 za 90 s o závislost zdánlivé viskozity na době působení smykové rychlosti 100 s -1 o sestupná větev tokové křivky - závislost smykového napětí, resp. zdánlivé viskozity na smykové rychlosti klesající v rozmezí 100 s -1 až 0,1 s -1 za 5 minut Stanovení reologických vlastností bylo vždy provedeno opakovaně ze dvou vzorků. Pro porovnání reologických vlastností vzorků je použita hodnota zdánlivé viskozity při dosažení smykové rychlosti 100 s -1 a plocha hysterezní smyčky tokové křivky, jako míra tixotropie odpovídající práci potřebné na rozrušení struktury koagulátu. Výsledky a diskuse: Pro sledování vlivu ph bylo jako médium použito obnovené mléko s 9,6 % sušiny. Jogurtové kultury byly kultivovány při 45 C po dobu 4-6 hod, kdy kultivace byla přerušena po dosažení zvoleného ph (4,7; 4,5; 4,3). V průběhu chlazení pak obvykle ještě došlo k dalšímu poklesu ph. Byla provedeny tři opakované kultivace, při každé bylo stanovení reologických vlastností provedeno opakovaně ze dvou vzorků. Na Obr. 1 je uvedena závislost zdánlivé viskozity koagulátu na konečné hodnotě aktivní kyselosti. Je z něj patrné, že s výjimkou netáhlovité kultury RX nemělo snížení ph v rozmezí 4,1 4,7 průkazný vliv na viskozitu rozmíchaného koagulátu. Pro sledování vlivu teploty a doby kultivace na produkci exopolysacharidů byly provedeny dvě kultivace: 4,5 hodiny při 45 C a 16 hodin při 30 C. Jako médium bylo použito obnovené mléko s 18,5 % sušiny. Kultivace byla provedena dvakrát. Výsledky jsou shrnuty v tabulce I. U kultury J2 byla produkce exopolysacharidů nezávislá na podmínkách kultivace, zatímco u kultur RX, MY byla pro výnos exopolysacharidů lepší delší kultivace při 30 C. Tabulka I Vliv teploty kultivace na produkci EPS 16 hodin 30 C 4,5 hodin 45 C Kultura EPS (mg/kg) (mg/kg) EPS (mg/kg) (mg/kg) J MY RX = rozdíl mezi paralelními stanoveními Srovnání reologických vlastností je uvedeno na obr. 2. Pevnost gelu (obr. 2 A) při nižší teplotě kultivace se v případě kultury J2 mírně zvýšila, zatímco u kultur RX a především MY naopak snížila. Odlišné chování obou táhlovitých druhů jogurtových kultur lze přičíst snížené produkci EPS kulturou MY při vyšší teplotě, nebo odlišným typem EPS. Zatímco v kultuře MY produkuje EPS Lbc. bulgaricus, v kultuře J2 je za táhlovitost zodpovědný Str. thermophillus. Z porovnání hodnot zdánlivé viskozity (Obr. 2 B) a míry tixotropie (Obr. 2 C) je patrná výrazně vyšší hodnota jak viskozity, tak tixotropie (relativně větší pokles viskozity působením smykové rychlosti) kultury J2, zatímco mezi kulturami MY a RX nebyl nalezen významný rozdíl. Vliv podmínek kultivace nebyl průkazný, pouze v případě kultury J2 došlo při nižší teplotě k mírnému snížení tixotropie. 201

198 A viskozita (Pas) 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 Zdánlivá viskozita (RX) 4,0 4,2 4,4 4,6 4,8 ph 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 Síla vpichu Fmax (N) 45 C 30 C A B 0,6 Zdánlivá viskozita (J2) 1,4 Zdánlivá viskozita B 0,5 1,2 viskozita (Pas) 0,4 0,3 0,2 0,1 1,0 0,8 0,6 0,4 0,0 4,0 4,2 4,4 4,6 4,8 ph 0,2 0,0 45 C 30 C C 0,6 Zdánlivá viskozita (MY) 8000 Míra tixotropie C viskozita (Pas) 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 4,0 4,2 4,4 4,6 4,8 Obr. 1 Vliv konečné kyselosti na zdánlivou viskozitu (při 100 s -1 ) koagulátu získaného fermentací obnoveného odstředěného mléka kulturou RX (A), J2 (B) a MY (C) ph C 30 C Obr. 2 Vliv teploty kultivace (45 C 4 hod;, resp. 30 C 16 h) na pevnost gelu Fmax (A), zdánlivou viskozitu při 100 s -1 (B) a tixotropii (C) koagulátu získaného fermentací obnoveného odstředěného mléka (18,5 % sušiny) kulturou J2, MY a RX. Sousední sloupce představují opakovanou kultivaci, chybové úsečky diferenci paralelních stanovení. Vliv interakcí EPS s bílkovinami na reologické vlastnosti gelu sledovaných kultur byl hodnocen jednak porovnáním koagulátů vzorků s obsahem bílkovin zvýšeným ultrafiltrací, kdy je dominantní vliv kaseinu, a jednak porovnáním vzorků se zvýšeným podílem syrovátkových bílkovin, kterého bylo dosaženo částečnou náhradou SOM koncentrátem syrovátkových bílkovin. Výsledky jsou uvedeny na Obr. 3 a

199 A 1,6 Zdánlivá viskozita (RX) 0,35 Síla vpichu Fmax (N) A viskozita (Paa) 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0, rel.obsah bilkovin 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 sk 0 sk 3,4 sk 5 B 1,6 1,4 Zdánlivá viskozita (J2) 1,6 1,4 Zdánlivá viskozita (Pas) B viskozita(pas) 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0, rel.obsah bilkovin 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 sk 0 sk 3,4 sk 5 viskozita (Pas) C 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Zdánlivá viskozita (MY) rel.obsah bilkovin Obr. 1 Vliv zvýšení obsahu bílkovin ultrafiltrací mléka na zdánlivou viskozitu (při 100 s -1 ) koagulátu získaného fermentací odstředěného mléka kulturou RX (A), J2 (B) a MY (C) Tixotropie (Pa/s) sk 0 sk3,4 sk5 C Obr. 2 Vliv podílu syrovátkových bílkovin (sk 0 15 %; sk 3,4 30 %; sk 5-44 % z celkového obsahu bílkovin 6,4 %) v obnoveném mléce na pevnost gelu Fmax (A), zdánlivou viskozitu při 100 s -1 (B) a tixotropii (C) koagulátu získaného fermentací kulturou J2, MY a RX Sousední sloupce představují opakovanou kultivaci, chybové úsečky diferenci paralelních stanovení. Z porovnání viskozit pro různé koncentrace bílkovin (Obr. 3) vyplývá, že nejvyšší hodnoty viskozity vykazovala kultura J2 a nejmenší hodnoty kultura RX. Se zvyšujícím se obsahem bílkovin se ale rozdíly mezi kulturou MY a RX zmenšují. Bylo dále zjištěno, že s rostoucím obsahem bílkovin došlo též ke zvýšení produkce EPS, a to přibližně stejně pro všechny kultury (např. 40, 105 a 155 mg/l pro koncentrační faktory 1, 2, 3 a kulturu J2). Zdá se tedy, že v případě táhlovité kultury 203

200 MY vliv bílkovin při vyšší koncentraci převažuje nad vlivem EPS, protože nedochází k jejich vzájemné interakci, zatímco v případě kultury J2 se zde pravděpodobně uplatňuje synergické působení kaseinu a EPS. V případě vlivu podílu syrovátkových bílkovin bylo zjištěno, že se pevnost gelu vytvořeného fermentací kultury RX při jejich vyšším množstvím v mléce snižovala (jak lze očekávat vzhledem k nižšímu obsahu kaseinu), zatímco kultura J2 tvořila stejně pevné gely při přídavku 3,4 %hm syrovátkových bílkovin, ale při větším přídavku se pevnost gelu také snížila. U kultury MY byl trend opačný, s přídavkem syrovátkových bílkovin pevnost gelu rostla (obr. 4A). Dále lze konstatovat, že nejvyšší hodnoty viskozity ve všech médiích měla kultura J2. Hodnoty viskozit u MY a RX jsou podobně srovnatelné (obr. 4B) stejně jako v předchozích případech při vysokém obsahu bílkovin. Vliv syrovátkových bílkovin na viskozitu na počátku působení vysoké smykové rychlosti zde nebyl nalezen, zatímco tixotropie gelu se s obsahem syrovátkových bílkovin snižuje (obr. 4C). Tento pokles je zvláště patrný při použití kultury J2, zatímco u kultur MY a RX je málo průkazný. Hodnoty tixotropie byly nejvyšší pro kulturu J2 u všech medií, což signalizuje značnou citlivost funkčních vlastností EPS této kultury na smykové namáhání. Na závěr lze tedy říci, že ačkoliv byly zjištěny rozdílné reologické vlastnosti koagulátů testovaných jogurtových kultur, přímá závislost mezi množstvím vyizolovaných exopolysacharidů a reologickými charakteristikami nalezena nebyla, což ukazuje na dominantní vliv druhu EPS v důsledku např. rozdílné molekulové hmotnosti a struktury polysacharidového řetězce. Účinek sledovaných vlivů (kultivační teploty, konečné kyselosti koagulátu a obsahu bílkovin) byl závislý na druhu kultury, což pravděpodobně také souvisí s druhem produkovaných EPS, jejichž charakterizaci je potřeba věnovat další pozornost. Poděkování: Tato práce byla podpořena grantem MSM Použitá literatura: Bouzar F., Cerning J., Desmazeaud M. (1997): Journal of Dairy Science 80, Broadbent J. R., McMahon D. J., Welker D. L., Oberg C. J., Moineau S. (2003): Journal of Dairy Science 86, 407. Degeest B., De Vuyst L. (1999): Applied and Environmental Microbiology 65, Degeest B., Vaningelgem F., De Vuyst L. (2001): International Dairy Journal 11, 747. De Vuyst L., Vanderveken F., Van de Ven S., Degeest B. (1998): Journal of Applied Microbiology 84, Dubois M., Gilles K.A., Hamilton J.K., Rebers P.A., Smith F. (1956): Analytical Chemistry 28, 350. Grobben G. J., van Casteren W. H. M., Schols H. A., Oosterveld A., Sala G., Smith M. R., Sikkema J., de Bont J. A. M. (1997): Appl. Microbiol. Biotechnol. 48, 516. Jaros D., Rohm H. (2003): In: Dairy processing, Improving quality (ed. Smit G.), , Woodhead Publishing Limited, Cambridge. Hassan A. N., Frank J. F., Shalabi S. I. (2001): International Journal of Food Microbiology 64, 199. Hassan A.N., Ipsen R., Janzen T., Qvist K.B.(2003): Journal of Dairy Science 86, Laws A.P., Marshall V.M. (2001): International Dairy Journal 11, 709. Mozzi F., Oliver G., de Giori G.S., de Valdez G.F. (1995): Milchwissenschaft 50, 80. Kontaktní adresa: Ing. Jiří Štětina, CSc., Ústav technologie mléka a tuků, VŠCHT Praha, Technická 5, , Praha 6 jiri.stetina@vscht.cz 204

201 REOLOGICKÉ VLASTNOSTI GELŮ KARAGENANU S GALAKTOMANNANY V MLÉCE Loužecký Tomáš, Štětina Jiří Ústav technologie mléka a tuků, Vysoká škola chemicko-technologická v Praze RHEOLOGICAL PROPERTIES OF CARRAGEENAN GELS WITH GALACTOMANNANS IN MILK Summary: The influence of addition of representative hydrocolloids (guar gum, locust bean gum, tara gum, conjac gum) on rheological properties and release water from mixtures of refined carrageenan prepared in distilled water, phosphate buffer (ph 7) and reconstitute skim milk (10 % w/w) was evaluated. 1.5 % mixtures of hydrocolloids standardized to content 10 % of KCl, in which the part of galactomannans or glucomannans was 5-50 %, were used for gel preparation. Mechanical properties of gels were evaluated by the uniaxial compression method at the temperature 10 C. Solidity, deformability and firmness were evaluated. The biggest solidity was found in the gel, where the mixture of carrageenan with 20 % conjac gum was prepared in phosphate buffer (120 kpa), whereas the fewest solidity was found in the gel, where the mixture of carrageenan with 50 % guar gum was prepared in distilled water (11 kpa). The biggest deformability was found in the gel, where the mixture of carrageenan with 30 % conjac gum was prepared in phosphate buffer and distilled water (74 %), whereas the fewest deformability was found in the gel, where the mixture of carrageenan with 10 % guar gum was prepared in distilled water (39 %). The biggest firmness was found in the gel, where the mixture of carrageenan with 20 % conjac gum was prepared in reconstitute skim milk (128 kpa), whereas the fewest firmness was found in the gel, where the mixture of carrageenan with 50 % guar gum was prepared in distilled water (20 kpa). ÚVOD Karagenany jsou lineární sulfatované polysacharidy, vyskytující se v červených mořských řasách (Rhodophyceae), zejména v rodech Euchema, Chondrus, Gigartina [2]. Základní strukturní jednotkou karagenanu jsou 3,6-anhydro-β-D-galaktopyranosa (1 4) a α-d-galaktopyranosa (1 3) [4,5]. Existují tři základní typy karagenanů (kappa, iota, lambda), které se liší počtem a umístěním sulfátových skupin na jednotce galaktosy [7]. Kappa a iota karagenany vykazují želírující vlastnosti, které jsou závislé na řadě fyzikálně-chemických veličin, zejména na obsahu přítomných iontů (Na +, K +, Ca 2+ ), ph, iontové síle v roztoku, molekulové hmotnosti a dalších [1,5,6]. Galaktomannany jsou větvené polysacharidy, které se nacházejí v semenech mnoha rostlin. Základní řetězec tvoří β-d-mannopyranosa (1 4), na které je v určitých místech vázána α-dgalaktopyranosa (1 6). Mezi nejpoužívanější galaktomannany patří guarová guma, lokusová guma a tara guma [3,8]. Samotné galaktomannany gely netvoří, některé ovšem vykazují synergické působení s karagenanem, podobně jako glukomannan konjaková guma [8]. Želírujících vlastností karagenanů se často využívá i v mnoha mléčných výrobcích. Významná je z tohoto hlediska interakce směsí karagenanů s mléčnými bílkovinami, zejména s kaseinem. Požadované textury výrobku je často dosahováno kombinací karagenanu s guarovou nebo lokusovou gumou [9]. CÍL PRÁCE V práci byly sledovány mechanické vlastnosti karagenanů ve směsi s galaktomannany, rovněž byla hodnocena směs s konjakovou gumou, která patří do skupiny glukomannanů, s cílem získání podkladů pro přípravu stabilizátoru určeného ke tvorbě vhodné textury mléčných výrobků. 205

202 MATERIÁL A METODY Hydrokoloidy: rafinovaný κ-karagenan, guarová guma, lokusová guma, tara guma, konjaková guma (TRUMF International s.r.o., Dolní Újezd) Základní charakterizace vorků je uvedena v Tab. I Sušené odtučněné mléko (PML a.s., Nový Bydžov), 10 g mléka bylo obnoveno v 90 g destilované vody (sušina 9,6 %hm) Draselno-fosfátový pufr (konc. 20 mm, iontová síla 50 mm, ph 7) Směs hydrokoloidů: směs karagenanu s 5-50 % přídavného hydrokoloidu, standardizovaná na obsah KCl 10 % hm. Tab. I Složení vzorků hydrokoloidů (% hm.) sušina bílkoviny AIS popeloviny Cl - K Na Ca κ-karagenan 91,1 0,4 0,6 36,1 7,0 13,9 1,0 1,7 guarová guma 90,7 4,6 3,6 0,7 0,1 0,1 0,1 0,1 lokusová guma 90,5 5,7 6,7 1,5 0,3 0,3 0,1 0,1 tara guma 91,4 2,1 2,3 0,8 0,3 0,4 0,1 0,0 konjaková guma 90,0 0,8 1,3 1,1 0,2 0,3 0,1 0,0 AIS - látky nerozpustné v kyselině (acid insoluble substances) Příprava a hodnocení vzniklých gelů: V substrátu (destilovaná voda, fosfátový pufr nebo obnovené mléko) bylo rozmícháno 1,5 % hm. standardizované směsi hydrokoloidů. Vzniklá disperze byla ohřáta a temperována za současného míchání při 90 C po dobu 30 min, nalita do zkumavek (50 ml) a po 1 h chladnutí při pokojové teplotě dochlazena v termostatu při 10 C do druhého dne, kdy bylo provedeno stanovení množství uvolněné vody (% hm. z 250 g gelu po 1 dnu skladování při 10 C) a hodnocení mechanických vlastností. Hodnocení mechanických vlastností metodou stlačování mezi deskami: Na přístroji Universal testing machine Series 5500 (Instron Ltd., UK) byla zaznamenána závislost síly na pozici horní desky při stlačování válcového vzorku gelu (průměr 27 mm, výška 30 mm) na konečnou výšku odpovídající relativní deformaci 87%. Rychlost pohybu horní desky byla 1 mm/s. Ze zatěžovací křivky, vyjádřené jako závislosti napětí σ = F. h / (A 0. h 0 ) na relativní deformaci ε = 100 * ((h 0 -h)/h 0 ) byly vyhodnoceny následující veličiny (viz. Obr. 1): napětí na mezi pevnosti σ mp (Pa) jako ukazatel pevnosti gelu relativní deformace na mezi pevnosti ε mp (%) charakterizující deformovatelnost gelu modul pružnosti na mezi pevnosti E (Pa) - jako ukazatel tuhosti gelu E = σ mp /ε Hmp kde h...výška vzorku lomu, h 0 počáteční výška vzorku, h mp výška vzorku při lomu (mm)...f...síla (N), A 0...počáteční plocha vzorku ε Hmp Henckyho deformace na mezi pevnosti (-) ε Hmp = ln(h 0 /h mp ) 206

203 σ mp napětí σ (Pa) ε mp relativní deformace ε (%) Obr. 1 Příklad zatěžovací křivky při stlačování vzorku gelu mezi deskami a stanovení napětí σ mp a deformace ε mp na mezi pevnosti. VÝSLEDKY A DISKUSE Srovnání mechanických vlastností na mezi pevnosti gelů směsi karagenanu se sledovanými hydrokoloidy ve vodě, draselno-fosfátovém pufru (ph 7) a v obnoveném mléce je uvedeno na Obr. 2 ve formě tzv. texturní mapy, tzn. závislosti napětí na deformaci, při které došlo při stlačování k překonání pevnosti gelu a k jeho prasknutí. Texturní mapa vyjadřuje vliv sledovaných parametrů na změny mechanických vlastností a jejich vnímání při konzumaci potraviny. Kombinací změny pevnosti a deformovatelnosti jsou definovány čtyři charakteristiky změny textury. Vlivem sledovaných parametrů může tedy dojít ke změně ve směru k textuře křehké, tuhé (houževnaté), měkké a gumovité. Vliv sledovaných parametrů na zdánlivý modul pružnosti, který lze považovat za ukazatel tuhosti gelu, je uveden na Obr. 3. Množství uvolněné vody po jednom dnu skladování, které je ukazatelem synereze gelu, je uvedeno na Obr. 4. Z těchto výsledků vyplývají následující zjištění: Guarová guma snižuje pevnost a tuhost gelu. Deformovatelnost gelu v destilované vodě a v obnoveném mléce neprůkazně zvyšuje, zatímco ve fosfátovém pufru ji snižuje. Lokusová guma a tara guma do podílu 30 % ve směsi hydrokoloidů mírně zvyšují pevnost a tuhost gelu, zatímco deformovatelnost zvyšují v celém sledovaném rozmezí. Lokusová a tara guma tedy vykazovaly s karagenanem mírné synergické působení [8]. Konjaková guma do podílu 30 %, resp. 20 % ve směsi hydrokoloidů výrazně zvyšuje pevnost, resp. tuhost gelu, deformovatelnost zvyšuje v celém sledovaném rozmezí. U směsi obsahující 50 % konjakové gumy nedošlo ani při deformaci nad 87 % k lomu vzorku. Bylo zde tedy pozorováno silné synergické působení s karagenanem. Gely ve fosfátovém pufru měly nepatrně vyšší tuhost a pevnost než gely v destilované vodě, deformovatelnost gelů byla srovnatelná. Vliv fosfátových iontů byl rovněž závislý na doplňkovém hydrokoloidu ve směsi. Největší rozdíly byly dosaženy u směsí s konjakovou gumou. Gely v obnoveném mléce vykazovaly nejvyšší tuhost a pevnost. Výjimku tvořily směsi s konjakovou gumou, kde vyšší pevnosti dosahovaly gely ve fosfátovém pufru. Vliv konjakové, lokusové a tara gumy na deformovatelnost byl v obnoveném mléce menší než v destilované vodě, resp. fosfátovém pufru. 207

204 napětí na mezi pevnosti σmp(kpa) A. gely v destilované vodě křehkost houževnatost (tuhost) měkkost gumovitost deformace (%) napětí na mezi pevnosti σmp(kpa) B. gely ve fosfátovém pufru (ph 7) křehkost houževnatost (tuhost) měkkost gumovitost deformace (%) napětí na mezi pevnosti σmp(kpa) C. gely v obnoveném mléce křehkost měkkost deformace (%) 208 houževnatost (tuhost) gumovitost Obr. 2 Texturní mapa gelu karagenanu s doplňkovými hydrokoloidy v destilované vodě (A), fosfátovém pufru (B) a v obnoveném odtučněném mléce (C). Podíl doplňkového hydrokoloidu: 5%, 10%, 20%, 30%, 50%; guarová guma - světle šedé symboly, černé ohraničení; lokusová guma - černé symboly; tara guma - bílé symboly, černé ohraničení; konjaková guma - tmavě šedé symboly; samotný karagenan.

205 Nejvyšší pevnost a tuhost měl gel směsi karagenanu s 20 % konjakové gumy ve fosfátovém pufru. Stejnou tuhost, ale menší pevnost, měl gel samotného karagenanu v obnoveném mléce. Největší synerezi vykazovaly gely ve fosfátovém pufru, nejmenší v obnoveném mléce. Množství uvolněné vody z gelů ve fosfátovém pufru klesalo s podílem doplňkového hydrokoloidu. Naopak u gelů v destilované vodě byla největší synereze pozorována při podílu doplňkových hydrokoloidů 30 % samotný karagen guar lokus tara konjak samotný karagen guar lokus tara konjak samotný karagen guar lokus tara konjak modul pružnosti na mezi pevnosti E (kpa) destilovaná voda fosfátový pufr obnovené mléko Podíl doplňkového hydrokoloidu: 5% 10% 20% 30% 50% 0 Řada1 Obr. 3 Vliv substrátu a doplňkového hydrokoloidu na modul pružnosti gelu karagenanu 3,5 množství uvolněné vody (% hm.) 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 samotný karagen guar lokus tara konjak samotný karagen guar lokus tara konjak samotný karagen guar lokus tara konjak destilovaná voda fosfátový pufr obnovené mléko Podíl doplňkového hydrokoloidu: 5% 10% 20% 30% 50% 0 Řada1 Obr. 4 Vliv substrátu a doplňkového hydrokoloidu na množství uvolněné vody po 1 dnu skladování gelu karagenanu. 209

206 ZÁVĚR Byl charakterizován a kvantifikován vliv běžných galaktomannanů, resp. glukomannanu konjaková guma, na mechanické vlastnosti gelu karagenanu. Zatímco zvýšení podílu guarové gumy zvyšovalo gumovitost gelu (ve fosfátovém pufru měkkost), tara a lokusová guma v menší dávce mírně zvyšovaly jeho houževnatost. Největší vliv na gel karagenanu měl obsah konjakové gumy, která významně zvyšuje jeho houževnatost. Získané výsledky budou využity pro návrh směsí hydrokoloidů při konkrétních aplikacích karagenanu do mléčných desertů. Poděkování: Tato práce byla finančně podpořena z projektu Ministerstva průmyslu a obchodu ČR: MPO č.ft-ta/069 "Standardizace hydrokoloidů a jejich aplikace pro potravinářský průmysl. Projekt je řešen ve spolupráci se společností TRUMF International s.r.o., Dolní Újezd. Literatura: 1. Depypere Frédéric, Verbeken Dirk, Thas Olivier, Dewettinck Koen (2003): Mixture design approach on the dynamic rheological and uniaxial compression behaviour of milk desserts. Food Hydrocolloids, 17: Dyrby M., Petersen R.V., Larsen J., Rudolf B., Nørgaard L., Engelsen S.B. (2004): Towards on-line monitoring of the composition of commercial carrageenan powders. Carbohydrate Polymers, 57: Chen Y., Liao M.-L., Boger D.V., Dunstan D.E. (2001): Rheological characterisation of κ-carrageenan/locust bean gum mixtures. Carbohydrate Polymers, 46: Chen Yu, Liao Ming-Long, Dunstan Dave E. (2002): The rheology of K+ -κ-carrageenan as a weak gel. Carbohydrate Polymers, 50: MacArtain P., Jacquier J.C., Dawson K.A. (2003): Physical characteristics of calcium induced κ-carrageenan networks. Carbohydrate Polymers, 53: Nickerson M.T., Paulson A.T., Hallett F.R. (2004): Dilute solution properties of κ-carrageenan polysaccharides: effect of potassium and calcium ions on chain conformation. Carbohydrate Polymers, 58: Singh Harjinder, Tamehana Michelle, Hemar Yacine, Munro Peter A. (2003): Interfacial compositions, microstuctures and properties of oil-in-water emulsions formed with mixtures of milk proteins and κ-carrageenan: 1. Sodium caseinate. Food Hydrocolloids, 17: Tako Masakuni, Qi Zhi-Qing, Yoza Eriko, Toyama Seizen (1998): Synergistic interaction between κ-carrageenan isolated from Hypnea charoides LAMOUROUX and galactomannan on its gelation. Food Research International, 31: Thaiudom S., Goff H.D. (2003): Effect of κ-carrageenan on milk protein polysaccharide mixtures. International Dairy Journal, 13: Kontaktní adresa: Ing. Tomáš Loužecký, Ústav Technologie mléka a tuků, VŠCHT, Technická 5, , Praha 6 Dejvice tomas.louzecky@vscht.cz 210

207 SENZORICKÉ HODNOCENÍ SÝRU HERMADUR Jarošová Alžbeta, Šustová Květoslava, Jurčíková Radka Ústav technologie potravin, Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně SENSORY ANALYSIS HERMADUR CHEESE Summary: The subject of my thesis was to observe sensory properties of bacterial surface-ripened cheese Hermadur, which was elected by consumers like product of the year 2005, manufactured by the Pribina Přibyslav L.t.d. Co. The sensory analysis was carried out at the sensory laboratory of the department of food technology of MZLU in Brno. The sensory evaluation was provided by students of fifth year food technology study. Students met sensory analysis methods and conditions of sensory analysis during their sensory analysis course. There were two samples of cheese tested. First sample were tested buy just after and second at the stop time minimal durability. The following descriptors were tested: appearance, smell, textural properties (elasticity, adhesiveness, ability to triturate), taste and general impression. Graphic unstructured scales were used for evaluation. Commission preferred cheese that was analysed buy just after. Bacterial surface-ripened cheese, sensory analysis, smell, taste, textural properties ÚVOD Skupina měkkých sýrů zahrnuje velmi rozdílné druhy sýrů, jejichž složení a konzistence těsta je na rozhraní polopevných sýrů a velmi měkkých čerstvých sýrů. Povrch sýrů může být holý a suchý anebo porostlý různou mikroflórou. U nemnoha druhů skupiny měkkých sýrů se povrchová mikroflóra skládá z pestré směsi různých druhů kvasinek, bakterií Linens, mikrokoků a kmenů plísní (Görner, F. & Valík, Ľ. 2004). Jejich složení se mění zráním, vlivem mikroklimatu zracího sklepa a ošetřováním sýra. Mnohé měkké sýry jsou v mladém stavu poměrně pevné, jejich typický charakter měkkého sýra se vyvíjí teprve s pokračující zralostí (Teubner, Ch. & kol. 1998; Fox & kol. 1993). Sýr Hermadur je výsledkem unikátního spojení dvou výrobních technologií aromatických sýrů a sýrů typu camembert. Díky této kombinaci sýr vyniká výraznější, jedinečnou chutí a elegantním, jemným aroma, které jsou silnější než u Hermelínu. Jeho vzhled upoutá mírně probarvenou kůrou, pod kterou se nachází jemné, pružné a vláčné sýrové těsto s krémovou konzistence. Konzistence prozrálejšího sýra se stává postupně měkce vláčná až roztékavá. Před podáváním je vhodné sýr ponechat min. 30 minut odpočinout při pokojové teplotě, jen tak plně vyzní jeho senzorické vlastnosti. Kvalitativním ukazatelem těchto sýrů jsou mimo chemických parametrů i jejich senzorické charakteristiky. Pro zákazníka je v první řadě rozhodující vzhled výrobku, následně vůně, aroma a chuť. Tyto charakteristiky pak rozhodují o tom, zda se nový druh sýru stane pro zákazníka lákavým a je ochoten si ho opakovaně koupit. MATERIÁL A METODY 2.1 Materiál Vzorky Hermaduru, výrobce PRIBINA, spol. s r.o., Přibyslav, byly zakoupeny v obchodní sítí v listopadu Hodnoceny byly následující den po zakoupení a na konci doby minimální trvanlivosti (po 14 dnech skladování v chladničce při 5 C). 211

208 2.2 Metody Metody senzorické analýzy Senzorická analýza byla provedena v senzorické laboratoři Ústavu technologie potravin MZLU v Brně. Senzorické hodnocení prováděli studenti pátého ročníku oboru Technologie potravin. Studenti byly v rámci předmětu Senzorická analýza seznámeni s metodami senzorického hodnocení a dále s podmínkami vlastního senzorického hodnocení. Před vlastním senzorickým posuzováním byly sýry ponechány 30 minut při pokojové teplotě. Pro hodnocení vzhledu byl použit celý vzorek sýra a pro hodnocení ostatních charakteristik každý hodnotitel obdržel 1/8 sýra. Sledovaly se následující deskriptory: u vzhledu se hodnotila rovnoměrnost pokrytí plísní, celková příjemnost vzhledu a případné závady vzhledu, dále byla hodnocena vůně, chuť a texturní vlastnosti sýru (elasticita, mazlavost v ústech, roztíratelnost). U uvedených senzorických vlastnosti sledovaly se změny na začátku a na konci deklarované doby trvanlivosti sýru. K hodnocení byly použity grafické nestrukturované stupnice [1 mm = 1 bod (b)] se slovním popisem krajních bodů Statistické metody Statisticky výsledky byly zpracovány programem UNISTAT 5.5. Byl proveden T- test (společný rozptyl) na hladině významnosti 95 %. VÝSLEDKY Senzoricky byl hodnocen sýr Hermadur. Sledovaly se následující deskriptory: u vzhledu se hodnotila rovnoměrnost pokrytí plísní, celková příjemnost vzhledu a případné závady vzhledu, dále byla hodnocena vůně, chuť a texturní vlastnosti sýru (elasticita, mazlavost v ústech, roztíratelnost). K hodnocení byly použity grafické nestrukturované stupnice. Výsledky senzorického hodnocení byly zpracovány do pavučinových diagramů a sloupcových grafů. Při hodnocení vůně (po 14 dnech skladování) došlo k nárůstu cizí vůně, statisticky byl zjištěn průkazný rozdíl (obr. 1). U hodnocení chuti (po 14 dnech) byl zaznamenán úbytek máslové chuti a nárůst chuti hořké, (byl zjištěn statisticky velmi průkazný rozdíl), (obr. 2). V průběhu 14 denního skladování docházelo ke změnám v texturních vlastností, elasticita se zhoršila, naopak u mazlavosti byl zaznamenám nárůst. U obou deskriptoru byl zjištěn statisticky velmi průkazný rozdíl (obr. 3). U deskriptorů (příjemnost vzhledu, celková příjemnost vůně, roztíratelnost, hořká chuť a celková příjemnost vůně) byl rozdíl v senzorickém hodnocení statisticky průkazný. Při hodnocení rovnoměrnosti pokrytí plísní, tloušťky kůrky, chuti sladké, slané, po žampionech a při hodnocení vůně typické pro romadur nezaznamenali hodnotitelé žádný statisticky průkazný rozdíl. Při hodnocení celkového dojmu, následující den po zakoupení, hodnotilo Hermadur známkou 1 (vynikající) a 2 (velmi dobrý) 90 % hodnotitelů a po 14 dnech skladování 66 % hodnotitelů. Jako dobrý (po zakoupení) posoudilo Hermadur 8 % hodnotitelů, ale po 14 dnech již 27 % hodnotitelů (obr. 4). 212

209 po zakoupení po romaduru 100 po 14 dnech skladování po romaduru celková příjemnost cizí celková příjemnost cizí Obr. 1 Senzorické hodnocení vůně sýru Hermadur po zakoupení sladká 100 po 14 dnech skladování sladká 100 cizí 50 slaná cizí 50 slaná 0 0 po žampionech hořká po žampionech hořká máslová máslová Obr. 2 Senzorické hodnocení chuti sýru Hermadur po zakoupení po 14 dnech skladování elasticita 100 elasticita roztíratelnost mazlavost roztíratelnost mazlavost Obr. 3 Senzorické hodnocení textury sýru Hermadur 213

210 hodnotitelé celkový dojem 1-výborný,2-velmi dobrý, 3-dobry,4-vyhovující, 5-nevyhovující po zakoupení po 14 dnech skladování Obr.4 Hodnocení celkového dojmu sýru Hermadur ZÁVĚR Senzoricky byl hodnocen Hermadur, měkký zrající vysokotučný sýr s povrchovou kulturou. Vzorky byly zakoupeny v obchodní sítí a hodnoceny následující den po zakoupení a po 14 dnech t.z. na konci doby minimální trvanlivosti. Vzorky byly skladovány v chladničce při 5 C. V průběhu doby skladování vlastnosti sýra se měnily následujícím způsobem. Po 14 dnech skladování povrch sýra u některých vzorků nebyl rovnoměrně pokrýt plísní a u některých vzorků, i když pocházely z jedné výrobní šarže, se objevila mírně našedlá plíseň. Po 14 dnech skladování se ve zvýšené míře objevila cizí vůně a hodnotitele ji identifikovali jako vůni po plísních, hnilobnou a zatuchlou. U hodnocení chutí se zvýšila přítomnost hořké chutě. Z texturních vlastností po 14 dnech se měnila elasticita a mazlavost. Elasticita dosáhla nižších hodnot, naopak mazlavost zaznamenána v ústech se zvýšila. Při hodnocení celkového dojmu se hodnoty posunuly spíše do negativní oblasti. I když hodnoty hodnocení na konci doby minimální trvanlivosti se celkově zhoršily, na začátku hodnocení, to znamená v době kdy se sýr dostal do prodejní sítě, 90 % hodnotitelů se vyjádřilo o vzorku jako výborným až velmi dobrým. To svědčí i o skutečnosti, že tento sýr byl zvolen spotřebiteli výrobkem roku Použitá literatura: 1. Görner, F. & Valík, Ľ. Aplikovaná mikrobiológia poživatín. Vydavatelsvo Malé centrum Bratislava, 2004, 528s. ISBN Fox & kol. Cheese: chemistry, physics and microbiology, vol. 2. Chapman & Hall, London, 1993, 577p. ISBN Teubner, Ch. & kol. Sýry velká encyklopedie. Perfekt Bratislava, 1998, 255s. ISBN Kontaktní adresa: Kontaktní adresa : Doc. Ing. Alžbeta Jarošová, Ph.D., Mendelova zemědělská a lesnická univerzita, Agronomická fakulta, Ústav technologie potravin, Zemědělská 1, Brno ualja@mendelu.cz, tel

211 ORGANOLEPTICKÉ VLASTNOSTI UZENÝCH SÝRŮ V ZÁVISLOSTI NA DOBĚ OD OTEVŘENÍ ORIGINÁLNÍHO BALENÍ Kouřimská Lenka, Panovská Zdeňka, Babička Luboš, Šedivá Alena Katedra kvality zemědělských produktů, FAPPZ, ČZU v Praze Ústav chemie a analýzy potravin, FPBT, VŠCHT v Praze ORGANOLEPTIC PROPERTIES OF SMOKED CHEESE IN RELATION TO THE TIME FROM OPENING THE ORIGINAL PACKAGING Summary: Sensory profiles of threes samples of smoked cheese were evaluated by unstructured graphical scale. Samples were analysed immediately after opening the original packaging and 24 hours later. Descriptors in which assessors found the biggest differences after storage varied according to the type of cheese. Among descriptors with the smallest differences were also those which closely corresponded to smoking procedure (e.g. intensity of smoked taste). Intensity of smoked flavour was higher after 24 hours at 4 samples from 6. 4 samples had also more pleasant smoked taste after storage. Differences in intensity of smoked taste after 24 hours were not too significant (less than 10 %). Úvod Uzené sýry patří mezi oblíbené mléčné výrobky, vyhledávané pro své specifické organoleptické vlastnosti. V procesu uzení vzniká celá řada senzoricky aktivních látek, např. volných mastných kyselin, aminokyselin, aldehydů, jiných produktů proteolýzy nebo lipolýzy a reakcí jednotlivých složek sýra [Vasiliadou 2005, Shakeel-Ur-Rehman 2003, Iliadis 2004]. Z hygienického hlediska jsou nejvíce sledovanými látkami polyaromatické uhlovodíky, které se nejčastěji stanovují metodou plynové chromatografie za použití headspace solid-phase mikroextrakce [Guillen 2004 a 2005, Conde 2005]. Po vyuzení se sýry musí dokonale vychladit, aby nedošlo po zabalení k jejich zapaření a tím vzniku senzorických vad. Uzené sýry jsou baleny nejčastěji vakuově, a to buď v celých blocích, nebo dochází k jejich plátkování či jinému porcování. V prodejní síti jsou pak celé bloky sýrů rozbaleny a porcovány dle přání zákazníka. Vzhledem k tomu, že mezi rozbalením originálního balení a prodejem výrobku může uplynout nezanedbatelná doba, může dojít vlivem odvětrání ke změně aroma a chuti uzeného sýra. V této práci jsme se snažili sledovat změny aroma různých uzených sýrů 24 hodin po otevření originálního balení. Materiál a metodika Analyzovali jsme následující vzorky uzených sýrů: vzorek A polotvrdý, polotučný uzený sýr eidamského typu s česnekem, 56 % sušiny, 45 % tuku v sušině vzorek B uzený tavený salámový sýr, 50 % sušiny, 44 % tuku v sušině vzorek C polotučný uzený sýr eidamského typu, 57 % sušiny, 44 % tuku v sušině. Vzorky byly hodnoceny dvěma soubory hodnotitelů. Jeden tvořilo 19 školených hodnotitelů s dlouholetou praxí a druhý 18 zaškolených hodnotitelů bez praxe, kteří absolvovali 30 hodin základního senzorického kurzu. Hodnocení bylo provedeno čtyřikrát a to: H1 hodnocení vzorků školenými hodnotiteli ihned po otevření originálního balení H2 hodnocení vzorků školenými hodnotiteli 24 hod po otevření originálního balení S1 hodnocení vzorků zaškolenými hodnotiteli ihned po otevření originálního balení S2 hodnocení vzorků zaškolenými hodnotiteli 24 hod po otevření originálního balení. K hodnocení byla použita metoda senzorického profilu za použití grafické nestrukturované stupnice. Jednotlivé deskriptory a orientace stupnic je uvedena v tabulce I. 215

212 Tabulka I Hodnocené deskriptory uzených sýrů. Vzhled 0 % 100 % Celkový vzhled velmi špatný vynikající Intenzita zbarvení velmi světlé velmi tmavé Rovnoměrnost zbarvení naprosto nerovnoměrné zcela nerovnoměrné Vůně 0 % 100 % Příjemnost vůně odporná vynikající Intenzita vůně neznatelná velmi silná Intenzita kouřové vůně neznatelná velmi silná Intenzita dřevité vůně neznatelná velmi silná Intenzita netypické vůně neznatelná velmi silná Chuť 0 % 100 % Příjemnost celkové chuti odporná velmi příjemná Příjemnost slané chuti odporná velmi příjemná Intenzita slané chuti neznatelná velmi silná Příjemnost nakyslé chuti odporná velmi příjemná Intenzita nakyslé chuti neznatelná velmi silná Příjemnost hořké chuti odporná velmi příjemná Intenzita hořké chuti neznatelná velmi silná Příjemnost uzené chuti odporná velmi příjemná Intenzita uzené chuti neznatelná velmi silná Příjemnost kořeněné chuti odporná velmi příjemná Intenzita kořeněné chuti neznatelná velmi silná Pachutě celkově nepřítomné velmi silné Výsledky a diskuse Z naměřeného souboru výsledků jsme se nejprve zaměřili na organoleptické vlastnosti sýrů, u kterých po 24 hodinách zaznamenali školení hodnotitelé největší změny (obrázek 1, 2 a 3). Byla to změna intenzity nakyslé chuti (vzorek A), intenzita vůně (vzorek B) a intenzita kořeněné chuti (vzorek C). V tabulce II jsou naopak uvedeny vlastnosti, u kterých zaznamenali zkušení hodnotitelé nejmenší změny po 24 hodinách od otevření originálního balení. Největší změny - vzorek A [%] H1 H2 S1 S2 H1 H2 S1 S2 H2 S2 H1 S1 Intenzita nakyslé chuti Intenzita kouřové vůně Intenzita dřevité vůně Obr. 1 Největší změny organoleptických vlastností u vzorku A. 216

213 Největší změny - vzorek B [%] H1 S1 H2 S2 H2 S1 S2 H1 H1 S1 S2 H2 Intenzita vůně Příjemnost slané chuti Intenzita nakyslé chuti Obr. 2 Největší změny organoleptických vlastností u vzorku B. Největší změny - vzorek C [%] H1 H2 S1 S2 H1 H2 S1 S2 H1 H2 S1 S Intenzita kořeněné chuti Rovnoměrnost zbarvení Příjemnost kořeněné chuti Obr. 3 Největší změny organoleptických vlastností u vzorku C. Tabulka II Nejmenší změny organoleptických vlastností sýrů. Vzorek A Deskriptor H1 H2 S1 S2 1. Intenzita netypické vůně 19,1 % 17,4 % 9,2 % 23,6 % 2. Příjemnost slané chuti 58,0 % 59,8 % 65,5 % 63,1 % 3. Příjemnost vůně 58,2 % 61,4 % 64,7 % 58,1 % Vzorek B Deskriptor H1 H2 S1 S2 1. Intenzita uzené chuti 32,3 % 34,0 % 53,2 % 50,0 % 2. Intenzita kouřové vůně 30,6 % 32,8 % 49,8 % 37,6 % 3. Intenzita hořké chuti 29,1 % 31,6 % 26,7 % 22,8 % Vzorek C Deskriptor H1 H2 S1 S2 1. Intenzita uzené chuti 68,5 % 69,0 % 66,6 % 68,2 % 2. Příjemnost celkové chuti 65,2 % 65,8 % 52,2 % 75,5 % 3. Intenzita vůně 55,8 % 57,0 % 51,1 % 67,6 % 217

214 V závěrečné fázi experimentu jsme se zaměřili na změnu organoleptických vlastností, které jsou specifické pro uzené sýry. Mezi tyto vlastnosti jsme zařadili intenzitu kouřové vůně, intenzitu uzené chuti a příjemnost uzené chuti. Změny těchto vlastností u všech analyzovaných vzorků jsou graficky znázorněny na obrázcích 4 až 6. Intenzita kouřové vůně H2 S2 [%] H1 H2 S1 S2 H1 H2 S1 S2 H1 S Vzorek A Vzorek B Vzorek C Obr. 4 Změny intenzity kouřové vůně 24 hod po rozbalení vzorku. Intenzita uzené chuti [%] H1 H2 S1 S2 H2 H1 S1 S1 S2 S2 H1 H2 Vzorek A Vzorek B Vzorek C Obr. 5 Změny intenzity uzené chuti 24 hod po rozbalení vzorku. Příjemnost uzené chuti [%] S1 H1 H2 S2 H2 H1 S1 S2 S1 S2 H2 H1 Vzorek A Vzorek B Vzorek C Obr. 6 Změny příjemnosti uzené chuti 24 hod po rozbalení vzorku. 218

215 Závěr Z naměřených výsledků lze vyvodit následující závěry: Deskriptory, u kterých zaznamenali školení hodnotitelé největší a nejmenší změny organoleptických vlastností byly odlišné dle typu hodnoceného sýra. Z 9 deskriptorů, u kterých zaznamenali školení hodnotitelé největší změny byla u 5 deskriptorů shodná tendence hodnocení se zaškolenými hodnotiteli. Mezi deskriptory, u kterých zaznamenali školení hodnotitelé nejmenší změny jsou i ty, které úzce souvisí s uzením (např. intenzita uzené chuti). Intenzita kouřové vůně byla po 24 hod vyšší u 4 hodnocení ze 6. U 4 hodnocení ze 6 se rovněž zlepšila příjemnost uzené chuti po 24 hod. Rozdíly v intenzitě uzené chuti po 24 hod nebyly příliš významné (méně než 10 %, v 5 případech ze 6 méně než 4 %). Použitá literatura CONDE, F. J., AYALA, J. H., AFONSO A. M., GONZALES, V. (2005): Polycyclic aromatic hydrocarbons in smoke used to smoke cheese produced by the combustion of rock rose (Cistus monspeliensis) and tree heater (Erica arborea) wood. J. of Agr. and Food Chem., 53 (1): GUILLEN, M. D., SOPELANA, P. (2005).: Headspace solid-phase microextraction as a tool to estimate the contamination of smoked cheeses by polyciclic aromatic hydrocarbons. J. of Dairy Sci. 88 (1): GUILLEN, M. D., SOPELANA, P. (2004).: Occurence of polyciclic hydrocarbons in smoked cheese. J. of Dairy Sci. 87 (3): ILIADIS, K. N., ZOTOS, A., TAYLOR, A. K., PETRIDIS, D. (2004): Effect of pre-treatment and smoking process (cold and hot) on chemical, microbiological and sensory quality of mackerel (Scomber scombrus). J. of the Sci. of Food and Agr. 82 (12): SHAKEEL-UR-REHMAN, FARKYE, N. Y., DRAKE, M. A. (2003): The effect of application of cold natural smoke on the ripening of Cheddar cheese. J. of Dairy Sci. 86 (6): VASILIDOU, S., AMBROSIADIS, I., VARELTZIS, K., FLETOURIS, D., GAVRILIDOU, I. (2005): Effect of smoking on quality parameters of farmed gilthead sea bream (Sparus aurata L.) and sensory attributes of the smoked products. Europ. Food Research and Technol. 221 (3 4): Kontaktní adresa: Dr. Ing. Lenka Kouřimská, KKZP, FAPPZ, ČZU Praha, Kamýcká 129, Praha 6 - Suchdol 219

216 SENZORICKÉ POSOUZENÍ BÍLÝCH JOGURTŮ Panovská Zdenka, Šedivá Alena, Lukešová Dobromila, Pokorný Jan Ústav chemie a analýzy potravin, VŠCHT Praha SENSORY EVALUATION OF NATURAL YOGHURTS Summary: The aim of the study was to evaluate sensory properties of natural yoghurts. Samples were evaluated by two groups of consumers - group A (age 20-25) and group B (age 60-80). Declared frequency of yoghurt consumption in the consumer group A was 53% every day, 35% one a week, and 12% rarely. Content of fat and pleasantness of natural yoghurts were evaluated by two sensory methods (ranking test and profile method). Fat content in six samples was 10%, 3.7%, 3%, 2.7%, 1.5%, 0.1 %. No one of assessors was able to rank the yoghurts according the fat content. Only 44% of consumers determine the yoghurt with fat content 10% as the fattest. The yoghurt with highest fat content was considered better by both groups. The results of both methods were comparable. Samples were evaluated also by quantitative descriptive analysis (QDA). The yoghurt samples differed in pleasantness of taste, in texture and in intensity of milk taste. Intensity of saltiness and bitterness was similar in all samples. Úvod V současné době můžeme na našem trhu nalézt velké množství mléčných fermentovaných výrobků. Trh je velmi pestrý a pokud chce podnik se svým výrobkem uspět musí být schopen zajistit dobré vlastnosti výrobku a to jak po stránce zdravotní (což by mělo být samozřejmostí), tak hlavně po stránce senzorické kvality. Mezi nejstarší fermentovaný mléčný výrobek, který je známý přes 5000 let, patří jogurt. Na konferenci Mléko a sýry v roce 2002 byl prezentován náš příspěvek Obliba ovocných jogurtů, který byl zaměřen na preference mladých lidí k jogurtům a jejich příchutím. V roce 2005 jsme na tuto práci navázali a zjišťovali preference pro bílé jogurty. Také jsme se zabývali vlastním senzorickým hodnocením bílých jogurtů. Jogurty můžeme dělit podle obsahu tuku (tuk obecně zlepšuje pocity při žvýkání a polykání, ale zvyšuje obsah energie, nasycených kyselin a cholesterolu ve výrobku). Toto dělení je použito ve vyhlášce č.77/2003 Sb., (novelizováno ve vyhlášce č. 78/2005 Sb.), kterou se stanoví požadavky pro mléko a mléčné výrobky, mražené krémy, jedlé tuky a oleje. Nejtučnější jsou jogurty bílé smetanové, kde je obsah tuku více než 10,3% hmotnostních, jogurt bílý má obsah tuku více než 3%, jogurt bílý se sníženým obsahem tuku má méně než 3%, jogurt bílý nízkotučný nebo odtučněný obsahuje méně než 0,5% hmotnostních tuku. Z hlediska textury (viskozity) dělíme jogurty na pevné (tuhé), krémovité (pastovité) a tekuté. Typický jogurt je charakterizován jako hladký viskózní gel s charakteristickou chutí ostré kyselosti a chuti a vůně (tzv. flavour), zelené nebo zeleného jablka. Jogurt bílý nemá žádné přidávané aroma, zřídka je přislazován a je charakteristický mírně nahořklou chutí. Acetaldehyd, který produkují bakterie, je chemickou sloučeninou zodpovědnou za charakteristickou jogurtovou chuť a vůni zeleného jablka nebo tzv. zelenou tj. připomínající vůni rozdrceného listí nebo čerstvě posečené trávy. Další těkavé látky jogurtového aroma jsou octová kyselina, diacetyl a některé těkavé mastné kyseliny. Celková senzorická kvalita potravinářských výrobků zahrnuje hlavně vůni, chuť a texturu. Pro každý výrobek je vytvořen speciální slovník senzorických výrazů a deskriptorů, které jsou pro daný výrobek charakteristické. Pro senzorické posuzování jogurtů se sjednotila pravidla už v roce 1977, ta však zahrnují hlavně přípravu vzorků. Jogurt se pro účely senzorického hodnocení netemperuje, hodnotí se po vyndání z chladničky při teplotě mezi 1,7-10 C. Než se jogurt zamíchá je nutné pečlivě prohlédnout povrch, který musí být neporušený. Po krátkém zamíchání se hodnotí 220

217 barva a vzhled, textura a chuť. Při hodnocení chuti se především soustřeďujeme na hodnocení relativní hladiny kyselosti, ta může být příjemná, typická, příliš intenzivní, nedostatečná, nepřírodní. Dále se hodnotí sladká chuť, hořká aj. Po zahřátí jogurtu v ústech lze zaznamenat i těkavé látky. Doporučuje se ochutnat asi 4x jeden vzorek a pokaždé se musí hodnotitel soustředit na jeden deskriptor. Velmi důležitým parametrem při hodnocení jogurtů je textura, protože je významným faktorem jakosti. Přijatelnost textury je určena na molekulární úrovni interakcí proteinů, tuku a potravinářské matrice. (Pereira 2003) Textura jogurtů a obdobných výrobků se velmi liší v závislosti na typu mléka, použité mikroflóře, přítomnosti zahušťovadla a technologickém procesu (Cooper 1997). Mezi nejdůležitější positivní texturní parametry u jogurtů patří hladkost, hebkost, zatímco hrubost jeho přijatelnost snižuje (La Torre 2003). Vývojem vhodné metody pro senzorické posuzování jogurtů se zabývala a stále zabývá řada laboratoří. V poslední době se jako nejvhodnější metoda pro posouzení celkové kvalitu výrobku považuje kvantitativní popisná analýza (QDA quantitative descriptive analysis). Tato metoda popisuje všechny vjemy, které jsou pociťovány při hodnocení výrobku. Každá senzorická vlastnost jako vzhled, vůně, textura, chuť je hodnocena několika deskriptory, které jsou kvantitativně měřeny užitím vhodné stupnice. Výsledek popisné analýzy dává celkový pohled na výrobek. Jedna z nejnovějších prací, která se věnuje vlivu texturních vlastností na přijatelnost bílých jogurtů je práce polských autorů otištěná v roce 2005 (Jaworská 2005). Cílem jejich práce bylo porovnat hodnocení konzumentů s výsledky kvantitativní popisné analýzy a posoudit vliv texturních vlastností na celkovou senzorickou kvalitu a přijatelnost. Protože i na našem trhu jsou bílé jogurty široce zastoupeny a jsou k dostání od různých výrobců, rozhodli jsem se udělat obdobnou práci i na našem pracovišti a porovnat jak výsledky, tak i metodiku. Materiál a metody: Šest druhů přírodních jogurtů, běžně dostupných na trhu, s různým obsahem tuku, podrobnější popis tabulka I. Tabulka I Popis vzorků jogurtu Vzorek Obsah tuku (%hm) Složení výrobku uvedené výrobcem A 1,5 sušené odtučněné mléko, jogurtová kultura B 10,3 smetana, živé jogurtové kultury C 2,7 mléko, sušené odstředěné mléko, škrob, želatina, živé jogurtové kultury D 3,0 mléko, sušené mléko, škrob, živá jogurtová kultura, tuk 3% E 0,1 odstředěné mléko, sušené odstředěné mléko,škrob, mléčné bílkoviny, želatina, živé jogurtové kultury F 3,7 mléko, mléčná bílkovina, jogurtová kultura, probiotická kultura 221

218 Senzorické hodnocení: Vzorky hodnotila skupina 50 mladých konzumentů (věk 20-25) skupina A a 25 starších konzumentů (věk 60-80) skupina B. Mladí konzumenti hodnotili vzorky během čtyř sezení. Nejprve pomocí pořadové zkoušky řadili vzorky podle obsahu tuku, potom podle příjemnosti chuti a nakonec každý vzorek hodnotili profilovou zkouškou (3 vzorky během jednoho hodnocení). Starší hodnotitelé měli za úkol seřadit tři vybrané vzorky podle tučnosti a podle chuti. Profil výrobků byl hodnocen pomocí profilové zkoušky s použitím 100 mm nestrukturovaných grafických stupnic orientovaných popisem na obou jeho koncích. Starší hodnotitele řadili 3 vzorky podle tučnosti a podle příjemnosti chuti a párovou zkouškou porovnávali 2 vybrané vzorky. Vzorky byly hodnotitelům podávány v plastových kelímcích, značených čtyřmístným kódem. Hodnotitel obdržel 20 ml každého vzorku o teplotě 10 C ± 1 C. Hodnotitelé používaly před i mezi vzorky vodu jako neutralizátor. Statistické výpočty byly provedeny pomocí Microsoft Excel a SPSS 12. Před vlastním senzorickým hodnocením hodnotitelé vyplnili dotazník o konzumaci jogurtů. Výsledky: Dotazník o konzumaci jogurtů u mladých lidí: Dotazníkové akce se zúčastnilo 50 studentů, z toho 77% žen a 23% mužů. 53% dotazovaných uvedlo, že konzumuje bílý jogurt denně, 35 % alespoň jednou týdně a 12% asi tak jednou měsíčně. Při výběru jogurtu hrála největší roli cena výrobku (42% dotazovaných), výrobce nebo obsah tuku. Z výrobců studenti znají hlavně firmy Danone, Holandii, Mlékarny Kunín. Výsledky pořadové zkoušky: Seřadit šest vzorků jogurtů podle tučnosti se nikomu z hodnotitelů skupiny A nepodařilo. Nejtučnější jogurt poznalo a správně zařadilo 44% hodnotitelů. Jen 28% hodnotitelů správně určilo nejméně tučný jogurt a zařadilo na správné pořadí. Výpočtem podle Friedmana bylo prokázáno, že zorek B je odlišný od souboru a mezi ostatními vzorky není statisticky významný rozdíl na hladině významnosti 0,05 (F = 18,43, χ 2 (chi kvadrát) = 11,07). Výsledky uvádí tabulka II Tabulka II Shrnutí výsledků vzorek obsah tuku součty pořadí pro daný vzorek dle Friedmana Počet hodnotitelů v % 1 B 10, F 3, D 3, C 2, A 1, E 0, Procento hodnotitelů, kteří daný vzorek zařadili na správné pořadí Při vyhodnocení pořadové zkoušky podle Friedmana, kdy byly vzorky řazeny podle příjemnosti, byly mezi vzorky statisticky významné rozdíly. Jako nejlepší byl hodnocen vzorek B s nejvyšším obsahem tuku, a jako nejhorší vzorek E (nejmenší obsah tuku). Mezi ostatními vzorky nebyl statisticky významné rozdíly. Pořadí vzorků podle příjemnosti od nejlepšího bylo B, D, C a F, A, E. Skupina B měla za úkol seřadit podle tučnosti a příjemnosti pouze 3 vzorky, které se výrazně lišily obsahem tuku, tj. 10,3%, 3,7% a 0,1%. Všechny vzorky správně seřadilo 36% hodnotitelů. 72% správně určilo jogurt s nejvyšším obsahem tuku. Rozlišit vzorky s obsahem tuku 3,7% a 0,1% se podařilo jen polovině hodnotitelů. 222

219 Při hodnocení příjemnosti chuti 64% hodnotitelů uvedlo jako nejpříjemnější jogurt s obsahem tuku 3,7% a 36% hodnotitelů jogurt s obsahem tuku 10%. Jogurt s obsahem tuku 0,1% zařadilo na poslední místo 72% hodnotitelů. Schopnost rozeznat tučnost jogurtů byla u druhé skupiny testována i pomocí párové zkoušky. Hodnotitelé měli označit tučnější jogurt z dvojice jogurtů s obsahem 1,5 % a 3,7 %. Tučnost správně posoudilo 42% hodnotitelů, což ukazuje na neprůkazný rozdíl. Při posouzení příjemnosti párovou zkouškou označilo 55% hodnotitelů za příjemnější chuť jogurtu s 1,5% obsahem tuku a 45% hodnotitelů jogurt s obsahem tuku 3,7%, rozdíly se tedy nejeví jako statisticky průkazné. Profilová zkouška U všech vzorků byl udělán jejich senzorický profil. Autoři polského článku použili pro hodnocení jogurtu pomocí kvantitativní popisné analýzy 15 deskriptorů, z toho pět se týkalo vůně, dva textury a 8 chuťových vlastností. Při našem hodnocení jsme počet deskriptorů snížili, protože podle našich zkušeností nejsou konzumenti schopni bez předchozích školení správně určit jednotlivé vůně. Hodnotitelé hodnotili jak příjemnost, tak intenzitu jednotlivých parametrů. Z profilové zkoušky vyplynulo, že jako nejchutnější byl hodnocen vzorek B (obsah tuku 10% a vzorek F obsah tuku 3,7 %.), viz graf 1. Výsledky dalších parametrů jsou shrnuty v tabulce III. Celková příjemnost chuti Celková příjemnost chuti Vzorek A Vzorek B Vzorek C Vzorek D Vzorek E Vzorek F Obr. 1 Porovnání příjemnosti chuti jednotlivých vzorků (hodnoty v mm). Jak vyplývá z tabulky III největší rozdíly mezi vzorky byly v příjemnosti chuti, textury, v příjemnosti a intenzitě mléčné chuti. Malé rozdíly mezi vzorky byly v příjemnosti a intenzitě slané a hořké chuti. Na internetu na serveru spotřebitel.cz proběhlo v roce 2005 hlasování o nejčastěji kupovaném bílém jogurtu, kterého se zúčastnilo 519 hlasujících. Z tohoto průzkumu vyplynulo, že nejoblíbenějšími byly jogurt Selský bílý (obsah tuku 3,7%) a Max Bílý Choceňský smetanový jogurt (10,3% tuku, ), což odpovídá i našemu hodnocení. 223

220 Tabulka III Výsledky profilové zkoušky Hodnocené deskriptory Vzorky A B C D E F Celková příjemnost chuti Příjemnost vůně Příjemnost textury Příjemnost kyselé chuti Příjemnost sladké chuti Příjemnost slané chuti Příjemnost mléčné chuti Příjemnost hořké chuti Viskozita vzorku Intenzita kyselé chuti Intenzita sladké chuti Intenzita slané chuti Intenzita hořké chuti Intenzita mléčné chuti Intenzita pachutí Krupičkovitost Pocit v ústech U příjemností vyšší hodnota znamená vyšší příjemnost Závěr Hodnocení příjemnosti chuti šesti vzorků jogurtů bylo provedeno jak pomocí pořadové zkoušky, tak i profilovou metodou. Výsledky obou zkoušek byly v dobré shodě. Pořadí vzorků získané pořadovou zkouškou bylo B, D, C a F, A, E a pomocí profilové zkoušky B, C, F, D, A, E. Obě metody jako nejlepší určily vzorek B a jako nejméně příjemné vzorky A, E. U vzorků C, F, D, nebyly prokázány statisticky významné rozdíly. Ukázalo se, že obsah tuku má vliv na hodnocení příjemnosti chuti, ale hodnotitelé nejsou schopni obsah tuku správně určit. Z dotazníku vyplynulo, že bílé jogurty jsou velmi oblíbené. Vzhledem ke škále výrobků si každý může najít svojí oblíbenou chuť a značku. Použitá literatura: 1. H.R. Cooper (2003) Texture in dairy products and its sensory evaulation. In Food Texture- Instrumental and Sensory Measurement, str , Moskowitz H R. ed. New York and Basel: Marcel Dekker. 2. D. Jaworská, B. Waskiewicz-Robak, W. Kolanowski, F.Swiderski,(2005) Relative importance of texture properties in the sensory quality and acceptance of natural yoghurts. International Journal of Dairy Technology, Vol 58. No.1, str R.B. Pereira, H. Singha, P.A. Munro, K.S. Luckman (2003) Sensory and instrumental characteristc of acid milk gels. International Dairy Journal, Vol. 13, str L.La. Torre, A. Y. Tamini, D.D. Muir (2003) Rheology and sensory profiling of set-type fermented milks made with different commercial probiotic and yoghurt starter cultures. International Journal of Dairy Technology, Vol. 56, No. 3, str Internet, server spotrebitel.cz, Kontaktní adresa: Zdenka.panovska@vscht.cz 224

221 ANIMOVANÉ OBJEKTY V ODBORNÝCH POTRAVINÁŘSKÝCH DATABÁZÍCH Uvíra Roman, Pudil František Ústav chemie a analýzy potravin, Vysoká škola chemicko-technologická v Praze ANIMATED OBJECTS IN SCIENTIFIC FOOD-STUFF DATABASES Summary: Nowadays, electronic databases with multimedia content provide new opportunities to gather and present information about food and food materials. An example of a multimedia presentation is an interactive presentation (animation) composed of real images (digital photographs). These animations find use especially in food commodities expertise. In other fields like food chemistry or food analysis digital data provide a way to connect other forms of information (texts, chromatograms, chemical structures, etc.). Animations can also demonstrate dynamic processes such as chemical changes occurring during food treatment, storage, decay, etc. Photographs of cheese were the main subject of animated objects. Images were captured using Hitachi HV-C20 TV camera or Canon EOS 300D digital camera. Animation structure and interactive parts were created using Macromedia Flash 8 software. Presenting information with properly formed animations is more obvious and comprehensible compared to usual methods. Other advantages include small file size of final objects and relatively simple connection through other electronic systems. SOUHRN Multimediální elektronické databáze nabízejí v současné době nové možnosti pro shromažďování a prezentování informací o potravinách a potravinářských materiálech. Příkladem multimediální prezentace je interaktivní animace sestavená z reálných obrázků (digitálních fotografií). Uplatnění nachází tyto animace zejména ve zbožíznalství. Pro využití v dalších oborech jako např. chemie potravin nebo analýza potravin je možno díky digitální podobě dat připojovat i další informace (odborné texty, chromatogramy, vzorce chemických struktur aj.). Animace mohou také znázorňovat dynamické děje, např. chemické změny probíhající během úprav, skladování, rozkladu potravin atd. Hlavní součástí animovaných objektů byly fotografie sýrů. Snímky byly pořízeny TV kamerou Hitachi HV-C20 nebo digitálním fotoaparátem Canon EOS 300D. Struktura animace a interaktivní prvky byly vytvořeny pomocí softwarového nástroje Macromedia Flash 8. Prezentování informací pomocí vhodně vytvořených animací je oproti obvyklým způsobům mnohem názornější a obsažnější. Výhodami jsou také nízká datová velikost výsledných objektů a relativně snadná propojitelnost s dalšími elektronickými systémy. ÚVOD S rychlým rozvojem informačních technologií dochází k jejich využívání prakticky ve všech vědních oborech. Množství různých dat (digitálních) neustále roste a je nutno tyto informace systematicky uchovávat a zpracovávat. Vhodným řešením pro úchovu a správu dat jsou relační databáze [1]. Ty umožňují ukládat téměř neomezené množství informací, jediným omezením bývá často pouze kapacita datových úložišť. Za použití dalších softwarových nástrojů je pak možno tyto informace prezentovat na internetu [2]. V praxi mají digitální data několik základních forem. Stále převažují textová data, dále jsou velmi rozšířené obrazové informace (fotografie, obrázky, grafy apod.). Dalšími obvyklými formáty jsou video a zvuk. Jednotlivé formáty se také často kombinují. Vznikají tak multimediální aplikace [3]. Jednou z forem multimediálních aplikací jsou animované objekty animace [4]. Animace umožňují spojovat jednotlivé druhy informací (texty, grafy, chromatogramy aj.) podle určitého scénáře do celků. Přijímání informací v této podobě je pak snadnější a rychlejší. 225

222 Další výhodou je pak možnost přidat interaktivní prvky, pomocí kterých může uživatel sám ovlivňovat chod aplikace. Ve vědách o potravinách a potravinářských materiálech lze animace využít při tvorbě zbožíznaleckých dokumentů, k pedagogickým účelům nebo ke znázorňování dynamických dějů (během skladování potravin, jejich úprav, rozkladu atd.) [5,6,7]. MATERIÁL A METODY V obchodním řetězci Delvita byly zakoupeny tři běžně dostupné sýry: Sedlčanský Hermelín zrající sýr s bílou plísní na povrchu (Povltavské mlékárny, Česká republika), Jihočeská Niva sýr s plísní uvnitř hmoty (Madeta, Česká republika) a Jadel pařený bílý sýr (Net Plasy, Česká republika). Fotografie sýru v obale byly pořízeny digitálním fotoaparátem Canon EOS 300D (Canon, Japonsko). Obal bez sýru byl naskenován pomocí skeneru Canon CanoScan 8400F (Canon, Japonsko). Samotný sýr a jeho části byly nasnímány pomocí TV kamery Hitachi HV-C20 (Hitachi, Japonsko). Těkavé látky jednotlivých sýrů byly extrahovány po dobu 45 min metodou SPME za použití 65 µm vlákna Carbowax/Divinylbenzen (Supelco, USA) a analyzovány plynovou chromatografií. Pro separaci a identifikaci látek bylo použito plynového chromatografu GC 8000 s hmotnostním detektorem MSD 800 (oba Fisons Instruments, Itálie). Analyty byly separovány na koloně DB-5 (Supelco, USA) o rozměrech 25 m 0,2 mm a tloušťce filmu 0,33 µm. Nosným plynem bylo helium, průtok byl nastaven na 2 ml/min. Teplota injektoru byla 220 C, teplota detektoru byla 230 C. Parametry teplotního programu: počáteční teplota byla 50 C, dvě minuty po nástřiku začala teplota růst rychlostí 5 C/min, po dosažení 220 C byla tato teplota ponechána po dobu 20 minut. Naměřená spektra byla porovnána s knihovnou spekter NIST (National Institute of Standards and Technology, USA). Jednotlivé animované objekty byly vytvořeny pomocí softwarového nástroje Macromedia Flash 8 (Adobe Systems, USA). VÝSLEDKY Ze získaných fotografií, naměřených dat a textových informací publikovaných v literatuře byly vytvořeny ukázkové animace reprezentující vlastnosti analyzovaných vzorků (Obr. 1). Obr. 1 Úvodní obrazovky vytvořených ukázkových animací. Rozbor animace zobrazující informace o sýru hermelín ukazuje Obr. 2. V animaci jsou obsaženy fotografie sýru v obale, samotného obalu, samotného sýru, jeho řezů a detailů. Přechod mezi jednotlivými fotografiemi zajišťují zabudované interaktivní prvky. K animaci jsou připojeny textové informace z odborné literatury. Dále je připojen chromatogram analýzy těkavých látek s tabulkou identifikovaných složek. 226

223 Obr. 2 Jednotlivé kroky ukázkové animace zobrazující informace o sýru hermelín. 227

224 Díky použitému softwarovému nástroji je výsledná datová velikost jednotlivých objektů velmi malá, pohybuje se v řádu stovek kilobajtů. ZÁVĚR Vhodně vytvořené animované objekty nám mohou podávat různé informace v ucelenější formě. Díky digitálnímu charakteru animací je jejich uchovávání, přenášení a prezentování relativně jednoduché. Ve spojení s databázovými technologiemi je pak možno vytvářet rozsáhlé odborně zaměřené webové aplikace. LITERATURA A INTERNETOVÉ ZDROJE Uvíra R., Pudil F.: Příprava multimediálních výukových programů, přednáška, str , Sborník příspěvků, XXXVI. Symposium o nových směrech výroby a hodnocení potravin, Skalský Dvůr, , ISBN Kontaktní adresa: Ing. Roman Uvíra, Ústav chemie a analýzy potravin, VŠCHT Praha, Technická 5, Praha 6 Dejvice, 16628, roman.uvira@vscht.cz Ing. František Pudil, CSc., Ústav chemie a analýzy potravin, VŠCHT Praha, Technická 5, Praha 6 Dejvice, 16628, pudilf@vscht.cz 228

225 BAKTERIE MLÉČNÉHO KVAŠENÍ V SÓJOVÝCH VÝROBCÍCH Dvořák Milan, Šůchová Eva, Chumchalová Jana Ústav technologie mléka a tuků, Vysoká škola chemicko-technologická v Praze LACTIC ACID BACTERIA IN SOYA PRODUCTS Summary: The work is focused on research of eight foreign fermented soy products with different base mixes, flavouring and aroma additives, produced by two companies - BIOPURE and ALPRO EU (with the trademarks ALPRO and PROVAMEL). The quality of these products was evaluated by total counts of yoghurt culture (Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus and Streptococcus thermophilus), and values of titratable acidity and active acidity at the end of the expiration date. Some of the branch products of ALPRO and PROVAMEL, labelled as dairy free alternatives to yoghurt and dessert, reached less than 10 4 CFU.g -1 viable cells of lactobacilli and 10 7 CFU.g -1 viable cells of streptococci. The highest total counts of yoghurt culture in the tested fermented soy products were detected in BIOPURE products (higher than 10 8 CFU.g -1 viable cells of yoghurt culture). Úvod: Bakterie mléčného kvašení nacházejí v posledních letech využití kromě mléčných výrobků i v dalších odvětvích potravinářského průmyslu jako například při zpracování zeleniny, obilovin a při výrobě masných výrobků [1] a konzervaci potravin [2]. Mezi méně známé výrobky patří i některé fermentované výrobky připravené na bázi luštěnin (sójových bobů) s přidáním bakterií mléčného kvašení [3, 4]. Základní vlastností bakterií mléčného kvašení je tvorba kyseliny mléčné doprovázená vznikem řady organických kyselin a dalších aromatických látek během fermentace sacharidů [5]. Sójové boby jako základní surovina sójových fermentovaných výrobků mají významné funkční vlastnosti. V odborné literatuře je uváděno, že sójové výrobky jsou uznávanou prevencí kardiovaskulárních onemocnění, snižují hladinu LDL cholesterolu v krevní plazmě [7], snižují při pravidelné konzumaci riziko vzniku lidského karcinomu, výskyt osteoporosy a zmírňují symptomy menopausy [8, 9]. Je obvyklé, že výrobci na obalech sójových fermentovaných výrobků zdůrazňují jejich výhody formou nutričních tvrzení (bez cholesterolu, bez laktosy, bez lepku) a odkazují se na doporučení od významných zdravotních organizací (např. Heart Association). Podle zákona o potravinách 110/1997 Sb. a prováděcí vyhlášky 329/1997 Sb. nejsou požadavky na sójové fermentované výrobky dostatečně klasifikovány. Minimální požadavky na počty jogurtové kultury 10 7 JTK.g -1 jsou deklarovány pouze pro fermentované mléčné výrobky (vyhláška 124/2004 Sb.). Označení výrobků slovy jogurt, jogurtový a mléčný je definováno pouze pro mléčné výrobky zmíněnou vyhláškou [6]. Cílem práce bylo zkoumat vybrané fermentované sójové výrobky ze zahraničního trhu. Metody: Kvalita fermentovaných sójových výrobků (viz Tabulka I) byla posuzována měřením titrační a aktivní kyselosti, dále počtem bakterií mléčného kvašení a přítomností nežádoucích plísní a kvasinek. Výrobky byly skladovány při teplotě 6 8 C do data spotřeby a následně analyzovány. Aktivní kyselost fermentovaných výrobků byla stanovena pomocí ph metru se skleněnou kombinovanou elektrodou a teplotním čidlem. Titrační kyselost byla určena titrací 25,0 ± 0,1 g vzorku s přídavek 1 ml 2% fenoftaleinu roztokem NaOH (0,1 mol.l -1 ) do ph 8,3. Výsledek byl uveden v mmol.kg -1 [11]. Pro výpočet byl použit vztah látkového obsahu kyselin: b c 1000 TK = [mmol.kg -1 ], a kde: a - množství vzorku použitého k titraci [g]; b - spotřeba NaOH o dané koncentrace [ml]; c - koncentrace standardního roztoku NaOH [mol.l -1 ]. 229

226 Stanovení počtu mikroorganismů. Počty bakterií Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (resp. rod Lactobacillus) byly stanoveny na půdě MRS agar o ph 6,2 ± 0,2. Inkubace probíhala při teplotě 37 C v anaerobních podmínkách po dobu 3 dnů. Počty bakterií Streptococcus thermophilus na ST agaru o ph 6,8 ± 0,2. Inkubace probíhala při teplotě 42 C aerobně 1 den. Pro stanovení kvasinek a plísní byla použita půda GKCH při ph 6,6 ± 0,2. Inkubace probíhala aerobně při teplotě 25 C 5 dní. Metoda počtu kolonií na plotnách [12, 13]. Počet mikroorganismů N přítomných ve zkoumaném vzorku byl spočten podle vzorce: C N =, ( n1 + 0,1 n2 ) d kde: ΣC součet kolonií na všech plotnách použitých pro výpočet; n 1 počet ploten použitých pro výpočet z prvního zvoleného ředění; n 2 počet ploten použitých pro výpočet z druhého zvoleného ředění; d ředění odpovídající pro první zvolené ředění. Tabulka I Vybrané sójové zakysané výrobky pro rozbor Popis Název Výrobce Složení Obsah Skladování A BIOPURE natural BIOPURE Rakousko sójový základ (voda, sójové boby 8,8 %), jogurtová kultura 150 g 2-6 C B BIOPURE jahoda BIOPURE Rakousko sójový základ (voda, sójové boby 7 %), jahody 10 %, třtinový cukr, voda, šťáva z černých jeřabin, citrónová šťáva, pektin, karob, jogurtová kultura 150 g 2-6 C C BIOPURE lesní směs BIOPURE Rakousko sójový základ (voda, sójové boby 7 %), třtinový cukr, jahody 4 %, voda, maliny 2 %, šťáva z černého rybízu 2 %, borůvky 2 %, šťáva z černých jeřabin, pektin, karob, jogurtová kultura 150 g 2-6 C D PROVAMEL natural PROVAMEL Belgie sójový základ (voda, sójové boby 9,4 %), rýžový sirup, mořská sůl, regulátor kyselosti (kyselina citrónová), jogurtová kultura 125 g 2-6 C E PROVAMEL broskev PROVAMEL Belgie sójový základ (voda, sójové boby 7,6 %), kukuřičný sirup, broskev 6,8 %, rýžový sirup, kukuřičný škrob, pektin, karob, regulátor kyselosti (citráty, kyselina citrónová), jogurtová kultura 125 g 2-6 C G PROVAMEL vanilka PROVAMEL Belgie sójový základ (voda, sójové boby 7,6 %), kukuřičný sirup, rýžový slad, pektin, karob, přírodní aroma, mořská sůl, regulátor kyselosti (kyselina citrónová, kyselina mléčná), vanilkový prášek, jogurtová kultura, kurkumový extrakt 500 g 2-6 C H ALPRO višeň ALPRO Anglie sójový základ (voda, sójové boby 7,6 %), kukuřičný sirup, višeň 7 %, rýžový sirup, kukuřičný škrob, pektin, karob, citrónová šťáva, přírodní aroma, šťáva z červené řepy, mořská sůl, regulátor kyselosti (kyselina citrónová), jogurtová kultura 125 g 2-6 C I ALPRO Mango +broskev ALPRO Anglie sójový základ (voda, sójové boby 7,6 %), kukuřičný sirup, broskev 6 %, mango 1 %, rýžový sirup, kukuřičný škrob, pektin, citrónová šťáva, přírodní aroma, mořská sůl, regulátor kyselosti (kyselina citrónová), jogurtová kultura 125 g 2-6 C 230

227 Výsledky a diskuse: Celkem bylo hodnoceno 8 fermentovaných sójových výrobků od 2 výrobců - rakouského výrobce BIOPURE a belgického ALPRO EU s provozy v Belgii a Anglii (viz Tabulka I). Kvalita výrobků byla posuzována měřením titrační a aktivní kyselosti, dále počtem bakterií mléčného kvašení a přítomností nežádoucích plísní a kvasinek. Sledování titrační a aktivní kyselosti Všechny zkoumané sojové výrobky (viz Tabulka II) vykazovaly hodnotu aktivní kyselosti blízkou hodnotě fermentovaných výrobků z kravského mléka [5]. Hodnoty aktivní kyselosti se pohybovaly od 3,8 do 4,4. Nejnižší hodnoty ph dosahovaly výrobky s přídavkem ovoce, zejména pak výrobky ALPRO s exotickým ovocem (vzorek H). Výrobky s nižší aktivní kyselostí obsahovaly i nižší počty jogurtové kultury. Titrační kyselost je nižší než u mléčných fermentovaných výrobků [5], pohybovala u zkoumaných sójových výrobků od mmol.kg -1. Nejvyšší hodnoty (82 84 mmol.kg -1 ) vykazovaly vzorky ALPRO (H) s exotickým ovocem a višněmi (G), naopak nejnižší neochucené výrobky - výrobek (A) BIOPURE natural (pouze 52 mmol.kg -1 ) a výrobek (D) PROVAMEL natural (68 mmol.kg -1 ). Porovnáním výsledků a složení ochucených výrobků ALPRO a PROVAMEL vyplynulo, že nízké hodnoty aktivní a titračních kyselosti mohou krom vlastního prokysání být způsobeny přídavkem kyseliny citrónové, popř. kyseliny mléčné do výrobní směsi. Tabulka II Hodnoty titrační a aktivní kyselosti na konci doby spotřeby Zkratka název výrobku Aktivní kyselosti ph Titrační kyselost [mmol/kg] A BIOPURE natural 4,4 52 B BIOPURE jahoda 4,2 71 C BIOPURE lesní směs 4,0 77 D PROVAMEL natural 4,1 68 E PROVAMEL broskev 4,0 71 F PROVAMEL vanilka 4,1 73 G ALPRO višeň 4,0 84 H ALPRO mango+broskev 3,8 82 Počty jogurtové kultury Celkové počty jogurtové kultury jsou dány součtem počtů laktobacilů a streptokoků (viz Tabulka III). Ze získaných výsledků vyplývá, že všechny výrobky BIOPURE a PROVAMEL obsahovaly celkové počty jogurtové kultury v řádu nejméně 10 7 JTK.g -1. Výrobky značky ALPRO, označené jako analogy jogurtu povahy desertu, dosahovaly nižších hodnot (v řádu 10 6 JTK.g -1 ) a není vyloučeno, že tyto výrobky nebyly tepelně ošetřeny. Obecně u všech výrobků, krom výrobku BIOPURE natural, byl patrný nižší počet laktobacilů a naopak vyšší zastoupení streptokoků, což je charakteristické pro zakysané sójové výrobky [10]. I přesto u výrobků BIOPURE byly počty laktobacilů v řádu 10 8 JTK.g

228 Počty kvasinek a plísní Kromě hodnot titrační a aktivní kyselosti, počtu mikroorganismů jogurtové kultury určuje kvalitu zakysaných výrobků a tím i trvanlivost výrobku také přítomnost plísní a kvasinek. Maximální přípustné hodnoty nejsou u sójových zakysaných výrobků definovány, nicméně výrobky tyto nežádoucí mikroorganismy neobsahovaly [9]. Tabulka III Celkové počty laktobacilů, streptokoků a plísní a kvasinek stanoveny na konci doby spotřeby Zkratka Název výrobku Streptokoky [JTK.g -1 ] laktobacily [JTK.g -1 ] Plísně a kvasinky [JTK.g -1 ] A BIOPURE natural 1,3 x ,6 x 10 8 «10 **) B BIOPURE jahoda 3,5 x ,1 x 10 8 «10 **) C BIOPURE lesní směs 4,5 x ,8 x 10 8 «10 **) D PROVAMEL natural 1,5 x 10 7 «10 4 *) «10 **) E PROVAMEL broskev 1,4 x 10 7 «10 4 *) «10 **) F PROVAMEL vanilka 2,1 x ,4 x 10 7 «10 **) G ALPRO višeň 3,5 x 10 6 «10 4 *) «10 **) H ALPRO mango+broskev 5,1 x 10 6 «10 4 *) «10 **) Poznámka: * - hodnoty nižší než 4. řádu; ** hodnoty nižší než 1. řádu. Závěr: Bylo zjištěno, že na trhu existují fermentované sójové výrobky, které splňují požadavky určené pro celkové počty jogurtové kultury v mléčných výrobcích (10 7 JTK.g -1 ). Měřením titrační kyselosti se potvrdilo, že sójové fermentované výrobky dosahují nižších hodnot titrační kyselosti než u výrobků mléčných. Fermentované sójové výrobky s ovocným komponentem jsou senzoricky více zajímavé, něž výrobky bez příchutě. Ovocným komponentem je u těchto výrobků potlačena luštěninová chuť. Poděkování: Tato práce byla podpořena grantem MŠMT ČR, projekt CEZ: MSM Použitá literatura: 1. Carr FJ, Chill D, Maida N. (2002): The lactic acid bacteria: A literature survey. Critical Reviews in Microbiology 2002;28(4): Ross RP, Morgan S, Hill C. (2002): Preservation and fermentation: past, present and future. International Journal of Food Microbiology ;79(1-2): Liu K. (1997): Soybeans: Chemistry, Technology and Utilization. Chapman & Hall, USA; Dvořák M., Šůchová E., Chumchalová J. (2005): Sledování kvality fermentovaných sójových výrobků. Sborník semináře Mikrobiologie potravin 2005, Třešť. 5. Schnürer J, Magnusson J. (2005): Antifungal lactic acid bacteria as biopreservatives. Trends in Food Science & Technology 2005;16(1-3): Zákon o potravinách a tabákových výrobcích a o změně a doplnění některých souvisejících zákonů a vyhlášek, č.110/1997 Sb. 7. Henkel J. (2000): Soy: Health Claims for Soy Protein, Questions About Other Components, FDA Consumer magazine 2000; 34 (3). 232

229 8. Moravcová J., Kleinová (2002): Fytoestrogeny ve výživě přinášejí užitek či riziko?, Chemické listy 2002; 96(5): Pyo YH, Lee TC, Lee YC (2005): Effect of lactic acid fermentation on enrichment of antioxidant properties and bioactive Isoflavones in soybean. Journal of Food Science 2005;70(3):S215-S Wang H.L., Kraidej L. Hesseltine C.W (1974) : Lactic acid fermentation of soybean milk. J. Milk Food Technol 37(2): ČSN Metody zkoušení mléka a tekutých mléčných výrobků. Český normalizační institut, Praha, ČSN ISO 7218 ( ) Mikrobiologie potravin a krmiv Všeobecné pokyny pro mikrobiologické zkoušení. Český normalizační institut, Praha, ČSN ISO 8261 ( ) Mléko a mléčné výrobky Příprava analytických vzorků a ředění pro mikrobiologické zkušení. Český normalizační institut, Praha, Kontaktní adresa: Milan Dvořák (milan.dvorak@vscht.cz), Ústav technologie mléka a tuků, Vysoká škola chemicko- technologická v Praze, Technická 5, Praha

230 SLEDOVÁNÍ PRODUKCE ORGANICKÝCH KYSELIN KMENY LACTOBACILLUS V RŮZNÝCH MÉDIÍCH Hudáček Jaroslav, * Zalán Zsolt, Štětina Jiří, Chumchalová Jana, * Halász Anna Ústav technologie mléka a tuků, Vysoká škola chemicko-technologická, Praha * Central Food Research Institute, Budapest DETERMINATION OF THE PRODUCTION OF ORGANIC ACIDS IN THREE DIFFERENT MEDIA BY LACTOBACILLUS STRAINS Summary: The aim of this study was an observation of organic acids production by LAB. Ten identified lactobacilli of species Lb. casei, Lb. rhamnosus, Lb. plantarum, Lb. paracasei and Lb. curvatus were chosen after cultivation in skim milk, MRS broth and Jerusalem Artichoke (JA) for a determination of production organic acids. The type and amount of organic acids were measured by isotachophoresis. Was found, that the highest acidity has been reached after cultivation in MRS broth. The worse of acidification was given out after cultivation in Jerusalem Artichoke (JA) broth. The faintest fermentation was reached after cultivation in skim milk. In all media has been measured the highest titratable acidity by strain Lb. casei Shirota and the lowest by strain Lb. rhamnosus VT1. All strains produced lactic acid in MRS broth, skim milk and JA broth. In MRS broth was acetic acid produced by all of strains whitout Lb. curvatus 2768 and Lb. casei Shirota, in JA broth whitout Lb. paracasei SF1 and in skim milk whitout Lb. casei 2750, Lb. curvatus 2768, Lb. curvatus 2775 and Lb. casei Shirota. All strains except Lb. plantarum 01 produced only in MRS broth butyric acid. From other acids were produced in MRS broth - formic acid, citric acid, succinic acid and glutamic acid, in skim milk formic acid and succinic acid and in JA broth succinic acid. The study confirmed differences in production of organic acids depending on used media and strain. Úvod V mlékárenském průmyslu se využívá činnosti bakterií mléčného kvašení, jejichž významným zástupcem je rod Lactobacillus. Je využíván k výrobě fermentovaných mléčných výrobků, sýrů a některé druhy jsou nositeli protektivních vlastností. Antimikrobiální aktivita laktobacilů je dána především produkcí kyseliny mléčné, octové, mravenčí, kapronové, propionové, máselné a valerové [1]. Kromě kyselin laktobacily, produkují i další inhibiční látky jako H 2 O 2 [2], CO 2, diacetyl, bakteriociny, nízkomolekulární a tepelně stabilní sloučeniny [3]. Účinek kyselin je závislý na ph, aktivní jsou jen v nedisociované formě. Nejvíce se na inhibičním účinku podílí kyselina mléčná, octová a kapronová. Všeobecně uznávanou konzervační látkou je kyselina octová, protože inhibuje růst gram-pozitivních a gram-negativních bakterií, ale také i plísní. Acidita způsobená kyselinou mléčnou zvyšuje inhibici kyseliny octové, protože kyselina mléčná snižuje ph, a proto je více kyseliny octové v nedisociované formě [4]. Některé kyseliny jako benzoová, sorbová, fumarová, propionová a mléčná jsou přidávány jako prevence růstu patogenních a hnilobných bakterií a jsou záměrně přidávány do potravin jako konzervační činidla [5]. Produkce a aktivita antifungálních látek je závislá na složení kultivačního média, ve kterém jsou mikroorganismy kultivovány. Mezi vlivy musíme v prvé řadě jmenovat přítomnost různých nutričních látek či konkurenční růst mikroorganismů. Nesmíme však zapomenout zohlednit vliv okolních podmínek, jako je doba a teplota inkubace, ph a kmen [6]. Cíl práce Bylo vybráno celkem deset kmenů izolovaných z různých zdrojů, z nichž pět pocházelo od českého řešitele a pět od maďarského spoluřešitele. U těchto kmenů byla sledována fermentace média metodou měření aktivní a titrační kyselosti, a kvantitativní a kvalitativní detekce produkce organických kyselin pomocí izotachoforezy za stejných podmínek po kultivaci kmenů v MRS bujónu, odstředěném mléce a v artyčokovém mediu. Tato media byla vybrána s ohledem uplatnění kmenů při přípravě fermentovaných mléčných a zeleninových potravin. 234

231 Materiál a metody mikroorganizmy: Lb. plantarum 01, Lb. paracasei 05, Lb. casei 154, Lb. paracasei SF1, Lb. rhamnosus VT1, Lb. plantarum 2142, Lb. casei 2750, Lb. curvatus 2768, Lb. curvatus 2775, Lb. casei Shirota kultivace laktobacilů v 100 ml příslušného média: MRS bujón, obnovené odstředěné mléko, Jerusalem Artichoke (JA), 18 hod, 37 C měření aktivní a titrační kyselosti po kultivaci v médiích filtrace fermentovaných médií, filtrát se analyzuje izotachoforeticky Podmínky analýzy izotachoforéza (ITP) vodící elektrolyt : 0,01 mol/l HCl; protion = kys. 6-aminomáselná; ph 4,25 zakončující elektrolyt : 0,005 mol/l kys. kapronová; 0,005 mol/l histidin; ph 5,0 proud : 250 a 50 µa Izotochoforeogram vodivostního detektoru má tvar různě dlouhých a různě vysokých schodů. Nejvyšší hodnota vodivosti (počáteční) odpovídá chloridovým iontům (vodícímu elektrolytu), nejnižší hodnota (konečná) kyselině kapronové (koncovému elektrolytu). Sloučeniny obsažené ve standardu následují po vodícím elektrolytu v pořadí kys. mravenčí až po kys. valerová. Jejich kvalitativní charakteristikou je relativní výška zóny (schodu). Koncentraci látky ve vzorku je úměrná délka zóny. Kvantitativní vyhodnocení se provádí kalibrací stanovením modelových směsí sledovaných sloučenin o různé koncentraci [3]. Výsledky Sledování fermentace média metodou měření aktivní a titrační kyselosti Měřením aktivní a titrační kyselosti po kultivaci kmenů v médiích bylo zjištěno, že nejlepší fermentace byla dosažena po kultivaci v MRS bujónu (ph 3,7-4,1; 74,8-48,0 o SH). K horšímu prokysání docházelo po kultivaci kmenů v artyčokovém mediu (ph 3,8-4,1; 30,2-15,0 o SH). V odstředěném mléce byla fermentace nejslabší (ph 5,5-6,2; 16,5-10,2 o SH) (Obr. 1-2). Ve všech mediích byla naměřena nejvyšší titrační kyselost u kmene Lb. casei Shirota a nejnižší u kmene Lb. rhamnosus VT ph O1 O5 154 SF1 VT1 kontrola Shirota kmen MRS bujón mléko JA bujón Obr. 1. Aktivní kyselost laktobacilů v rozličných médiích kultivovaných 18 hod. při 37 C. 235

232 SH O1 O5 154 SF1 VT1 kontrola Shirota kmen mléko MRS bujón JA bujón Obr. 2. Titrační kyselost laktobacilů v rozličných médiích kultivovaných 18 hod. při 37 C. Diskuse Důležitou charakteristikou kmenů bakterií mléčného kvašení je schopnost růstu v komplexním médiu a pro mlékárenský průmysl je nejdůležitější vlastností schopnost růstu v mléce. Významným znakem kmenů, které se využívají při výrobě fermentovaných mléčných výrobků, je produkce organických kyselin. V naší práci byly vybrány kmeny Lb. plantarum 01, Lb. paracasei 05, Lb. casei 154, Lb. paracasei SF1, Lb. rhamnosus VT1, Lb. plantarum 2142, Lb. casei 2750, Lb. curvatus 2768, Lb. curvatus 2775, Lb. casei Shirota, které vykazují antifungální aktivitu, pro sledování produkce organických kyselin měřením aktivní a titrační kyselosti po kultivaci kmenů v příslušných médiích a následnou kvalitativní a kvantitativní analýzou organických kyselin metodou izotachoforéza. V mlékárenství se homofermentativní kmeny používají při výrobě sýrů. Některé druhy se používají při výrobě kysaných mléčných výrobků slouží k průmyslové výrobě kyseliny mléčné z melasy, protože zkvašují laktosu. Lactobacillus plantarum našel uplatnění při konzervaci okurek a zelí, je také součástí kefírových zrn a spolu s Lactobacillus brevis a Lactobacillus fermentum se vyskytuje v pekařském kvásku [7], [8], [9]. V posledních letech se zkoumá využití laktobacilů k ochraně cereálních výrobků. Jedná se zvláště o využití kmenů vyizolovaných z kvásku, jako např. Lactobacillus plantarum nebo využití kmene s potvrzenou antifungální aktivitou Lactobacillus rhmanosus VT1 [10]. Kultivace příslušných kmenů probíhala při 37 C. Také z práce, kterou se zabývala Petráková (2002) vyplývá, že optimální teplota pro kultivaci kmene Lactobacillus rhamnosus je 37 C [11]. Optimální teplotou růstu pro zbylé kmeny Lactobacillus paracasei, Lactobacillus plantarum a Lactobacillus casei se zabývala Vychodilová (2003) a ta rovněž určila teplotu 37 C za optimální i pro ostatní druhy laktobacilů [12]. Pro sledování produkce organických kyselin jsme zvolili příslušné media: MRS bujón, obnovené odstředěné mléko a Jerusalem Artichoke (JA). Bylo možné sledovat odlišnosti v hodnotách aktivní a titrační kyselosti mezi kultivačními médii, u všech kmenů kultivovaných v příslušném médiu. Z výsledků vyplývá, že všechny testované kmeny nejlépe rostou v komplexním médiu. To je pravděpodobně způsobeno vhodným složením a přítomností všech složek potřebných pro jejich růst. Na obr. 1-2 jsou porovnány aktivní a titrační kyselosti v jednotlivých kultivačních médiích. Z výsledků je patrný vyšší růst a větší produkce kyseliny mléčné v komplexních médiích. Měření produkce organických kyselin pomocí izotachoforezy Media po fermentaci byla použita pro určení kvalitativního a kvantitativního zastoupení organických kyselin. Koncentrace naprodukovaných kyselin byly rozdílné v závislosti na použitém mediu a kmeni. V MRS bujónu produkovaly všechny kmeny kyselinu mléčnou (400 až 851 mm/l), dále bez dvou kmenů (Lb. curvatus 2768 a Lb. casei Shirota) kyselinu octovou (25 až 150 mm/l), a bez kmene Lb. plantarum 01 kyselinu máselnou (Obr. 3a). 236

233 a) c [mm/l] O1 O5 154 SF1 VT Shirota kmen kys. mravenčí kys. cintronová kys. mléčna kys. jantarová kys.octová kys. glutamová kys. máselná b) c [mm/l] O1 O5 154 SF1 VT Shirota kmen kys. mravenčí kys. mléčna kys. jantarová kys. octová c) c [mm/l] O1 O5 154 SF1 VT Shirota kmen kys. mléčna kys. jantarová kys. octová Obr. 3. Koncentrace naprodukovaných organických kyselin po kultivaci laktobacilů v: a) MRS bujóne; b) obnoveném odstředěném mléce; c) JA bujóne V odstředěném mléce kyselina mléčná byla naprodukována v koncentracích 13 až 127 mm/l, kyselinu octovou produkovalo pouze šest kmenů v rozmezí 8 až 100 mm/l (Obr. 3b). V artyčokovém mediu kyselina mléčná dosáhla koncentrace 110 až 337 mm/l, kyselina octová, která byla produkována všemi kmeny kromě Lb. paracasei SF1, se pohybovala v rozmezí 9 až 180 mm/l (Obr. 3c). V MRS bujónu produkoval pouze kmen Lb. plantarum 01 kyselinu mravenčí, tři kmeny kyselinu citronovou (Lb. plantarum 01, Lb. paracasei 05 a Lb. rhamnosus VT1), 237

234 dva kmeny kyselinu glutamovou (Lb. paracasei 05 a Lb. paracasei SF1) (Obr. 3a). V mléce kromě kyseliny mléčné a octové produkovaly čtyři kmeny kyselinu mravenčí (Lb. plantarum 01, Lb. paracasei 05, Lb. paracasei SF1 a Lb. rhamnosus VT1) a čtyři kmeny kyselinu jantarovou (Lb. casei 154, Lb. rhamnosus VT1, Lb. casei 2750 a Lb. curvatus 2768) (Obr. 3b) a v artyčokovém mediu opět kromě kyseliny mléčné a octové pouze dva kmeny kyselinu jantarovou (Lb. casei 154 a Lb. casei 2750) (Obr. 3c). Diskuse Některé bakterie mléčného kvašení produkují antibakteriální, ale i antifungální látky. Tyto látky se dají využít jako přírodní konzervanty a mohly by prodloužit skladovatelnost potravin. Jedná se o různorodé látky, ale dominantní postavení mají organické kyseliny [13]. Takto účinné organické kyseliny mají v molekule jednu až tři karboxylové skupiny, různý počet uhlíků, dvojných vazeb, hydroxylových skupin a mohou mít ve skeletu aromatické jádro [5]. Všeobecně uznávanou konzervační látkou je kyselina octová, protože inhibuje růst gram-pozitivních a gram-negativních bakterií, ale také i plísní. Tato kyselina, produkovaná kmeny Lactobacillus casei a Lactobacillus plantarum silně inhibovala růst plísně Penicillium discolor, ale inhibiční efekt byl závislý na ph [4]. Mezi obligátně heterofermentatvní kmeny laktobacilů, které produkují antifungální látky patří Lactobacillus sanfrancisco CB1, který byl vyizolován u kvásku. Tento kmen, kultivovaný na WHF agaru při 30 C; 48 hod., produkuje široké spektrum organických kyselin s antifungální aktivitou. Mezi ně patří kyselina octová (13,75 mg/kg) a kapronová (0,88 mg/kg), které inhibují růst plísně Fusarium graminearum [1]. Bakterie mléčného kvašení produkují kyselinu mléčnou ve dvou formách, jako L(+) nebo D(-). Jsou druhy, které preferují produkci jen jedné formy, ale vyskytly se i ty, které produkují racemickou směs kyseliny mléčné. U Lactobacillus plantarum MiLAB 393, kultivovaného v MRS bujóně při 30 C; 48 hod., byla kromě cyklických dipeptidů vyizolována kyselina 3-fenylmléčná s poměrem L(+) a D(-) 9:1 (7,5 mg/kg). Toto spektrum látek působilo inhibičně proti Fusarium sporotrichioides a Aspergillus fumigatus [14]. Acidita způsobená kyselinou mléčnou zvyšuje inhibiční účinky kyseliny octové, protože kyselina mléčná snižuje ph, a proto je více kyseliny octové v nedisociované formě [4]. Nové typy sloučenin produkoval kmen Lactobacillus plantarum. Konkrétně se jednalo o kyselinu benzoovou a 5-methyl-2,4- imidazolidinedion. Látky byly aktivní samotné, ale hlavně s 1% přídavkem kyseliny mléčné, kdy účinek vzrostl. Jejich inhibiční aktivita byla hlavně proti Fusarium avenaceum [13]. Kmen Lactobacillus plantarum 21B, kultivovaný na WHF agaru při 30 C; 48 hod., poskytl 4- hydroxymléčnou (10,05 mg/kg) a fenylmléčnou kyselinu (31,34 mg/kg). U obou kyselin se prokázalo, že mají podobnou inhibiční aktivitu a přirozeně se vyskytují v metabolismu fenylalaninu [15]. Z antimikrobiální frakce Lactobacillus plantarum VTTE byl identifikován mevalonolakton, který v kombinaci s kyselinou mléčnou inhiboval růst plísně Penicillium agglomerans na rozdíl od jiných izolovaných látek z této frakce (kyselina benzoová, methylhydantion), které inhibici snižovaly [13]. Závěr Nejvyšší kyselosti bylo dosaženo po kultivaci kmenů v MRS bujónu. Ve všech mediích byla naměřena nejvyšší titrační kyselost u kmene Lb. casei Shirota a nejnižší u kmene Lb. rhamnosus VT1. Ze získaných výsledků vyplynulo, že produkce metabolitů, ale hlavně kyseliny mléčné je ovlivněna složením růstového média. Dále se bude sledovat vzájemná inhibiční aktivita laktobacilů cross-streak metodou. Výsledkem práce by mělo být vytvoření směsné laktobacilové kultury pro výrobu produktů obsahujících mléčnou a cereální složku. Poděkování: Táto práce byla podpořená grantem CZ-HU 5/2004 AIP 238

235 Použitá literatura: 1. CORSETTI A., GOBETTI M., ROSSI J., DAMINIANI P. Antimould activity of sourdough lactic acid bacteria: identification of mixture of organic acids by Lactobacillus sanfrancisco CB1. Appl. Microbiol. Biotechnol., 1998, vol. 50, pp RODRÍGUES E., TOMILLO J., NUÑEZ M., MEDINA M. Combined effect of bacteriocinproducing lactic acid bacteria and lactoperoxidase system activation on Listeria monocytogenes in refrigerated milk. Journal of Applied and Environmental Microbiology, 1997, vol. 83, pp PLOCKOVÁ M., STILES J., CHUMCHALOVÁ J., HALFAROVÁ R. Control of mould growth by Lactobacillus rhamnosus VT1 and Lactobacillus reuteri CCM 3625 on milk agar plates. Czech J. Food Sci., 2001, vol. 19, pp CABO M. L., BRABER A. F., KOENRAAD P. M. F. J. Apparent antifungal activity of several lactic acid bacteria against Penicillium discolor is due to acetic acid in the medium. J. Food Prot., 2002, vol. 65, pp HSIAO C. P., SIEBERT K. J. Modeling the inhibitory of organic acids on bacteria. Int. J. Food Microbiol., 1999, vol. 47, pp GOURAMA H., BULLERMAN L. B. Anti-aflatoxigenic activity of Lactobacillus casei pseudoplantarum. Int. J. Food Microbiol., 1997, vol. 34, pp GOBETTI M., CORSETTI J. Lactobacillus sanfrancisco a key sourdough lactic acid bacterium: a review. Food Microbiol., 1997, vol. 14, pp ŠILHÁNKOVÁ L. Mikrobiologie, str , 297, , Victoria Publishing, Praha LAVERMICOCCA P., VALERIO F., VISCONTI A. Antifungal activity of phenyllactic acid against molds isolated from bakery products. Appl. Environ. Microbiol., 2003, vol. 69, pp LAITILA A., ALAKOMI H-L., RAASKA L., MATTILA-SANDHOLM T., HAIKARA A. Antifungal activities of two Lactobacillus plantarum strains against Fusarium moulds in vitro nad in malting of barley. J. Appl. Microbiol., 2002, vol. 93, pp PETRÁKOVÁ H. Diplomová práce, VŠCHT, Praha, VYCHODILOVÁ Z. Diplomová práce, VŠCHT, Praha, NIKU-PAAVOLA M. L., LAITILA A., MATTILA-SANDHOLM T., HAIKARA A. New types of antimicrobial compounds produced by Lactobacillus plantarum. J. Appl. Microbiol., 1999, vol. 87, pp STRÖM K., SJÖGREN J., BROBERG A., SCHNÜRER J. Lactobacillus plantarum MiLAB 393 produces the antifungal cyclic dipeptides cyclo(l-phe-l-pro) and cyclo(l-phe-trans-4- hydroxy-l-pro) and 3-Phenyllactic acid. Appl. Environ. Microbiol., 2002, vol. 68, pp LAVERMICOCCA P., VALERIO F., EVIDENTE A., LAZZARONI S., CORSETTI A., GOBETTI M. Purification and characterization of novel antifungal compounds from the sourdough Lactobacillus plantarum strain 21 B. Appl. Environ. Microbiol., 2000, vol. 66, pp Kontaktní adresa: jaroslav.hudacek@vscht.cz 239

236 APLIKACE METODY FISH PRO IDENTIFIKACI LAKTOBACILŮ Z MAJONÉZOVÝCH VÝROBKŮ A SUROVIN Chumchalová Jana, Fialová Jana, Míková Kamila 1, Navrátilová Jiřina Ústav technologie mléka a tuků, 1 Ústav chemie a analýzy potravin, VŠCHT Praha APPLICATION OF FISH METHOD FOR IDENTIFICATIN OF LACTOBACILLI FROM MAYONNAISE-BASED PRODUCTS AND RAW MATERIALS Summary: Strains of genus Lactobacillus (124) were isolated from raw materials and mayonnaisebased products. The strains were characterized by selected phenotypic criteria such as optimal ph of the cultivation media, optimal temperature of the cultivation and gas production from glucose. A group of 14 strains selected under metabolism and origin was further characterized by their carbohydrate fermentation pattern using the API-50CH system. Classification into genus Lactobacillus was done by a genus-specific probe using fluorescence in situ hybridization (FISH). Of the 14 selected strains, 9 strains were identified by API 50-CH as Lactobacillus plantarum. In addition, Lb. pentosus, Lb. rhamnosus, Lb. sakei and Lb. casei were also identified. Preliminary classification into genus Lactobacillus was proven by a genus-specific probe using FISH. It was confirmed, that FISH is a method that could be used for genus classification of lactobacilli from mayonnaise-based products. Úvod Mezi hlavní mikrobiální rizika majonézových výrobků v současné době patří kvasinky a bakterie mléčného kvašení (BMK), zejména rod Lactobacillus a Lactococcus. V důsledku jejich výskytu ve výrobcích dochází k nežádoucí chuti a vůni, ke změně konzistence i k tvorbě plynu [1,2,3,4]. Jedním z hlavních zdrojů BMK vyskytujících se v majonézových výrobcích je zelenina [5], kontaminovaný vaječný žloutek, hořčice [6] nebo koření [7,8]. BMK se mohou ve výrobcích objevit také v důsledku nedostatečné hygieny výroby a výrobních prostor. Při identifikaci bakterií rodu Lactobacillus se často uplatňují fenotypové metody založené na kultivaci v selektivním mediu. K nevýhodám klasických metod se řadí náročnost na čas a prostor, leckdy i značná nepřesnost, jelikož sledované fenotypové vlastnosti mikroorganismů se mohou v závislosti na prostředí měnit. Proto se stále častěji zařazují při identifikaci také rychlé genotypové metody např. fluorescenční hybridizace in-situ (FISH), která je založena na detekci hybridizovaných sekvencí nukleových kyselin, na kterých jsou navázány fluorescenčně označené sondy [9,10]. Cíle Izolace bakterií rodu Lactobacilus z majonézových výrobků a surovin pro jejich výrobu a následná identifikace vybraných kmenů fenotypovými a genotypovými metodami. Ověření možnosti použití metody FISH pro rodovou identifikaci izolátů z majonézových výrobků a jejich surovin. Materiál a metody Mikroorganismy Izoláty ze surovin a z majonézových výrobků Bylo izolováno celkem 124 kmenů rodu Lactobacillus ze surovin a majonézových výrobků uvedených v tab. I a II. Pro izolaci byly použity komerční majonézové výrobky a výrobky připravené laboratorně na Ústavu technologie mléka a tuků (ÚTMT), VŠCHT Praha. Kontrolní kmen: Lactobacillus acidophilus CH5 ze sbírky ÚTMT, VŠCHT Praha. 240

237 Izolace, kultivace a uchování kmenů BMK Kmeny byly izolovány na MRS agaru (Oxoid, Anglie) a uchovávány při -80 o C v MRS bujonu s glycerolem. Před identifikací byly kmeny kultivovány v MRS bujónu při 37 C po dobu h anaerobně zaočkováním 1% obj. inokula. Mikroskopická kontrola bakterií Čistota izolovaných kmenů a jejich morfologie se zjišťovala pomocí fixovaného preparátu obarveného methylenovou modří [11]. Preparát se mikroskopoval pomocí mikroskopu DMLS (Leica, SRN) s analogovou kamerou Tk C1381 EG (JVC, Japonsko). Fenotypová charakterizace Všechny izoláty byly nejprve sledovány z hlediska morfologie kolonií. Dále byly podrobeny KOH testu na Gramovo rozlišení [12], testu na sledování přítomnosti katalasy [11] a produkci plynu z glukosy. Izoláty byly dále charakterizovány z hlediska růstu na MRS agaru při teplotě 15 C, 30 C, 37 C a 45 C a růstu na MRS agaru s upraveným ph (4,5; 7,0 a 9,6). Po kultivaci se hodnotila intenzita nárůstu kultury, podle intenzity nárůstu se určila optimální teplota resp. optimální ph media. Vybrané izoláty byly identifikovány na úroveň druhu pomocí API-50CH testu (biomérieux, Francie) po kultivaci v MRS bujónu. Sledování způsobu fermentace Do zkumavky obsahující 10 ml MRS bujónu a plynovku, se naočkovala čerstvá kultura (1 % obj. inokulum). Naočkované zkumavky se nechaly kultivovat při 37 C po dobu 18 h anaerobně. Poté se hodnotil výskyt plynu. Pokud se tvoří plyn, jedná se o heterofermentativní mikroorganismus. Při negativní reakci se jedná o homofermentativní mikroorganismus. Genotypová identifikace laktobacilů pomocí in situ fluorescenční hybridizace Pro rodovou identifikaci byl použit hybridizační kit firmy MicroScreen B.V. (Groningen, Nizozemí) založený na principu FISH. Identifikace probíhala přesně podle uvedeného návodu po kultivaci kmenů v MRS bujónu. Jako kontrolní kmen byl použit Lactobacillus acidophilus CH5. Výsledky a diskuse Byly izolovány bakterie z majonéz, omáček a ze surovin používaných pro jejich výrobu a také ze surovin používaných pro výrobu dalších majonézových výrobků. Z celkového počtu 124 Grampositivních katalasa negativních kmenů tvořících tyčinky 100 kmenů pocházelo z výrobků a 24 ze surovin (Tab. I a II). Většina kmenů vykazovala stejný nárůst při teplotách 30 C a 37 C, všechny kmeny rostly při teplotě 15 C a 45 C. Všechny kmeny rostly na MRS agaru s upraveným ph na hodnotu 4,5 a 7,0, slabý nárůst byl zaznamenán při ph 9,6. Ze 124 kmenů laktobacilů bylo 80 kmenů homofermentativních a 44 kmenů heterofermentativních. Celkem 38 heterofermentativních kmenů pocházelo z výrobků a zbývajících 6 ze surovin. K identifikaci pomocí komerčních testů bylo vybráno 14 izolovaných kmenů. Ve výběru byl zohledněn nárůst laktobacilů při teplotě 15 C (tato teplota je maximální povolená teplota skladování pro kladování studených emulgovaných omáček), typ metabolismu a původní zdroj. Pro rodovou identifikaci byla použita genotypová metoda FISH a pro druhovou identifikaci systém API-50CH testů založený na průkazu fenotypových vlastností. Výsledky jsou uvedeny v Tab. III. Identifikací pomocí API-50CH testu bylo zjištěno, že nejvíce byl zastoupen ve vzorcích druh Lactobacillus plantarum (9). Tyto výsledky jsou v souladu s literaturou, kde se uvádí jako nejvíce rozšířený druh v majonézových výrobcích Lactobacillus plantarum [1,2]. Dále byly izolovány kmeny druhu Lb. pentosus (1), Lb. rhamnosus (2), Lb. sakei (1) a Lb. casei (1). V koření Gourmet byl nalezen druh Lb. rhamnosus a Lb. sakei. Kmen Lb. pentosus byl nalezen v zelených 241

238 olivách. Také v literatuře byl jeho výskyt popsán při fermentaci oliv [13,14]. V jiné práci byl jako dominující kmen při fermentaci oliv zaznamenán Lb. casei (50 % z celkového počtu izolátů) a Lb. brevis [15]. Kmen Lb. rhamnosus byl izolován z hořčice. Fermentace hořčice rodem Lactobacillus bývá spojována s druhy Lb. agilis [16], Lb. brevis a Lb. plantarum [17]. Předběžné zařazení bakterií do rodu Lactobacillus na základě fenotypových znaků bylo ověřováno metodou FISH. Příklad výsledku měření je uveden na Obr. 1. Tabulka I Počty izolovaných kmenů z surovin a z prostředí Surovina Výrobce Počet kmenů rodu Lactobacillus Škrob Cerestar, Velká Británie 3 Žloutek Belovo, Belgie 2 Hořčice Boneco a.s., Benešov 2 Zeleninová směs Alibona, Litovel 1 Kečup Boneco a.s., Benešov 2 Kořenící směs Aromat, Knorr Unilever, ČR 2 Koření Gourmet Italian DipMix b, Christian Hansen 2 Olivy zelené Jolca, Španělsko 2 Voda Český výrobce 6 Prostředí Český výrobce 2 Obr. 1 Mikroskopický preparát Lb. plantarum TAT K12, vizualizace metodou FISH 242

239 Tabulka II Počty izolovaných kmenů rodu Lactobacillus z výrobků firmy Boneco a.s., Benešov a připravených laboratorně na ÚTMT, VŠCHT Praha Výrobek Majonéza Majonéza Delika Francouzská majonéza Tatarská omáčka s feferonkami Komerční Tatarská omáčka Italská omáčka Laboratorní výroba Komerční Laboratorní výroba Obsah oleje [% hm.] Počet kmenů Tabulka III Základní charakteristiky izolovaných kmenů Kmen Zdroj Potvrzení rodu Lactobacillus metodou FISH Teplota ph Identifikace API50-CH systemem 15 C 30 C 37 C 45 C 4,5 7 9,6 LBM Majonéza + Lb. plantarum + Lb. plantarum LBT2 Tatarská omáčka TAT K12 Tatarská omáčka + Lb. plantarum TAT A21 Tatarská omáčka + Lb. plantarum IT D13 Italská omáčka + Lb. plantarum LBFr 1 Francouzská majonéza + Lb. plantarum LNV 3 Voda + Lb. plantarum H 23 Hořčice + Lb. rhamnosus LBOZ1 Zelené olivy + Lb. pentosus ZS 2 Zeleninová směs + Lb. casei KG 21 Koření Gourmet + Lb. sakei TAT A2 Koření Gourmet + Lb. plantarum DEL 1 Koření Gourmet + Lb. rhamnosus FEF B2 Koření Gourmet + Lb. plantarum CH5 1 Čistá mlékařská kultura + Lb. acidophilus Vysvětlivky: + mírný nárůst; ++ střední nárůst; +++ výrazný nárůst, 1 kontrolní kmen

240 Při pozitivní reakci tedy potvrzení rodového zařazení docházelo k vývinu fluorescence. Metodou FISH bylo potvrzeno, že všech 14 kmenů může být zařazeno do rodu Lactobacillus. Metoda FISH byla již dříve použita při identifikaci rodu Lactobacillus v mikrobiální populaci trávicího traktu [17,18] nebo při identifikaci buněk termofilních laktobacilů přítomných v průmyslových startérových kulturách nebo rostoucích v mléce [19]. Uvádí se, že metodu FISH lze aplikovat na jakékoliv potravinářské výrobky, kde očekáváme výskyt mikroorganismů, ať už na fermentované výrobky či zkažené potraviny. Nevýhodou této metody je nedostatečná citlivost (umožní stanovit mikroorganismy až od hustoty 10 5 JTK/g), autofluorescence mikrobů, okolního prostředí nebo materiálu, nedostatečná penetrace sond do buněk a nespecifita sond [20]. Závěr Pro dosažení vysoké kvality a dlouhé doby použitelnosti výrobku je nezbytné zajistit použití surovin, které kromě fyzikálně-chemických vlastností dosahují nízkého počtu nežádoucích mikroorganismů. Proto byl v této studii sledován výskyt bakterií rodu Lactobacillus v majonézových výrobcích a v surovinách pro jejich výrobu klasickými metodami a metodou FISH. Metoda FISH může najít uplatnění jako rychlá metoda pro rodovou identifikaci izolátů z majonézových výrobků a surovin pro jejich výrobu předběžně zařazených do rodu Lactobacillus. Literatura 1. Hammes W.P., Weiss N., Holzapfel W v knize: The Prokaryotes (Balows A., Trüper H.G., Dworkin M., Harder W., Schleifer K.-H.), str , Springer - Verlag Inc., New York Erickson J.P., Bloom J.S., Mc Kenna D.N., Woodruff M.A Fate of Salmonella sp., Listeria monocytogenes and indigenous spoilage microorganisms in home-style salads prepared with commercial real mayonnaise or reduced calorie mayonnaise dressings. Journal of Food Protection 56: Hejlová: Hygiena a technologie vajec a vaječných výrobků, str. 67, I Straka, Brno Míková K Majonézy. Maso, příloha Lahůdka, 1: Gardner N.J., Savard T., Obermier P., Caldwell G., Champagne C.P Selection and charakterization of mixed starter cultures for laktic acid fermentation of carrot, cabage, beet and onion vegetable mixtures. International Journal of Food Microbiology 64: Chung-Tsuen-Huang, Chit-Kuang-Chiu, Hung-Chao-Lee Mixed culture fermentation of mustard juice with lactic acid bacteria and a yeast. Abstract, Journal of the Chinese Agricultural Chemical Society 31: Paludan-Müller Ch., Huss H.H., Gram L Characterization of lactic acid bacteria isolated from Thai low-salt fermented fish product and the role of garlic as substrate for fermentation. International Journal of Food Microbiology 46: Fuselli S.R., Casales M.R., Fritz R., Yannes M.I Typical microorganisms in cold marinated anchovies (Engraulis anchoita) filled with corn oil and spices. Abstract, Journal of Aquatic Food Product Technology 12: Schleifer, K.-H., Hermann, M., Beimfohr, C., Brockmann, E., Ludwig, W., Amann, R Application of molecular methods for the classification and identification of lactic acid bacteria. International Dairy Journal 5, Fialová J., Chumchalová J., Plocková M Fluorescenční hybridizace in situ a její použití při studiu mikroorganismů. Mlékařské listy 81: Harrigan W.F. v knize: Laboratory Methods in Food Microbiology, 3th ed., Academic Press, London

241 12. Halebian S., Harris B., Finegold S.M., Rolfe R.D Rapid methods that aid in distinguishing Gram-positive from Gram-negative anaerobic bacteria. J Clin. Microbiol. 13: De Castro A., Montano A. Casado F.-J., Sánchez A.-H., Rejano L Utilization of Enterococcus casseliflavus and Lactobacillus pentosus as starter cultures for Spanish-style green olive fermentation. Food Microbiology 19: Sánchez A.H., Rejano L., Montano A., De Castro A Utilization at high ph of starter cultures of lactobacilli for Spanish-style green olive fermentation. International Journal of Food Microbiology 67: Randazzo C.L., Restuccia C., Romano A.D., Caggia C Lactobacillus casei, dominant species in naturally fermented Sicilian green olives. International Journal of Food Microbiology 90(1): Palop M. L.L., Smiths J.P., ten Brink B Degradation of sinigrin by Lactobacillus agilis strain R16. International Journal of Food Microbiology 26(2): Rinne M.M., Gueimonde M., Kalliomäki M., Hoppu U, Salminen S.J., Isolauri E Similar bifidogenic effects of prebiotic-supplemented partially hydrolyzed infant formula and breastfeeding on infant gut microbiota. FEMS Immunology and Medical Microbiology 43(1): Vulevic J., Rastall R.A., Gibson G.R Developing a quantitative approach for determining the in vitro prebiotic potential of dietary oligosaccharides. FEMS Microbiology Letters 236(1): Matte-Tailliez O., Quenee P., Cibik R., van Opstal J., Dessevre F., Firmesse O., Tailliez P Detection and identification of lactic acid bacteria in milk and industrial starter culture with fluorescently labeled rrna-targeted peptide nucleic acid probes. Lait 81(1-2): Moter, A., Göbel, U.B Fluorescence in situ hybridization (FISH) for direct visualization of microorganisms. Journal of Microbiological Methods 41, Poděkování Tato práce byla podpořena grantem MŠMT ČR, projekt CEZ: MSM Autoři dále děkují Prof. Ing. V. Radovi, CSc. z katedry mikrobiologie, výživy a dietetiky, Agronomická fakulta, Česká zemědělská univerzita v Praze za pomoc při identifikaci laktobacilů metodou FISH. Kontaktní adresa: Jana.Chumchalova@vscht.cz 245

242 ANTIMIKROBIÁLNE PÔSOBENIE LACTOBACILLUS RHAMNOSUS VT1 V MLIEKU A V POTRAVINÁCH S MLIEČNOU ZLOŽKOU Koreňová Janka 1), Valík Ľubomír 2), Liptáková Denisa 2), Petríková Jana 1) 1) Výskumný ústav potravinársky Bratislava, Odd. hygieny, sanitácie a mikrobiológie potravín, 2) Slovenská technická univerzita Bratislava, Fakulta chemickej a potravinárskej technológie, Ústav biochémie, výživy a ochrany zdravia, Oddelenie výživy a hodnotenia potravín ANTIMICROBIAL INFLUENCE OF LACTOBACILLUS RHAMNOSUS VT1 IN MILK AND IN FOODSTUFF WITH MILKY COMPONENT Summary: Results of reciprocal antimicrobial activity of L. rhamnosus VT1 addition (0-10%) and various temperature of storage 8 C, 10 C, 12 C, 14 C, 16 C a 20 C on growth dynamics of technologically and health undesirable psychrotrophic strain Bacillus cereus was presented in this study. Effect of both factors was observed in artificial inoculated UHT milk and real food products (milk rice, mayonnaise) and was mathematicaly analysed. Growth parameters of microorganisms were received from mathematical modelling and they were used in prediction of shelf-life, food safety and food hygiene.it was observed that addition of lactic acid bacteria, L. rhamnosus VT1,had significantly influence on the growth rate of B. cereus as in model as in real food conditions. Lactic acid bacteria can increase food safety and extended shelf-life of food products. ÚVOD Mliečne baktérie produkujú množstvo antimikrobiálne pôsobiacich látok, ktoré sú významné pri fermentácii potravín a krmív a biokonzervácii, a tiež látky ovplyvňujúce senzorické vlastnosti a proces zrenia fermentovaných výrobkov. Antagonistický účinok mliečnych baktérií sa spája hlavne s koncovými produktmi fermentácie, ako sú kyselina mliečna a octová, diacetyl, peroxid vodíka, enzýmy, alebo s produkciou bakteriocínov. Niektoré kmene Lactobacillus rhamnosus (obr. 1) (L. rhamnosus E-97800, L. rhamnosus LC-705, L. rhamnosus GG) sa používajú ako štartovacie kultúry s biokonzervačným a probiotickým účinkom [1, 2, 3, 4]. U kmeňa L. rhamnosus VT1 boli zistené antifungálne a antimikrobiálne účinky [5, 6, 7, 8, 9]. Bacillus cereus (obr.1) je bežným kontaminantom všetkých primárnych poľnohospodárskych produktov (mlieko, rastliny, ryža) [3, 10, 11] a následne prežíva aj ošetrenie pasterizáciou vo forme spór [12, 13, 14]. Podľa literatúry [15, 16, 17], psychrotrófne kmene B. cereus limitujú dobu údržnosti čerstvých chladených mliečnych a lahôdkárskych výrobkov, a tiež hotových jedál skladovaných pri chladiarenských teplotách. Reálne podmienky pre rast B. cereus teda môžu tvoriť okrem samotného mlieka, aj nátierky s mliečnym alebo zeleninovým základom. Zdrojom kontaminanta vo výrobku môže byť samotný potravinový základ výrobku, aj pridané pochutiny a koreniny rastlinného pôvodu. Určitou prekážkou vyklíčenia spór a rastu B. cereus môže byť nízka hodnota ph výrobku (<5,5), ale nemožno vylúčiť výskyt technologických chýb a priame ohrozenie nízkokyslých mliečnych výrobkov (ph>5,5). Obr. 1 Bacillus cereus a Lactobacillus rhamnosus (Dr.M.Kaláb, Agriculture and Agri-Food, Canada) 246

243 MATERIÁL A METÓDY Mikroorganizmy: Kmeň Bacillus cereus PM1 bol vyizolovaný z pasterizovaného mlieka s obsahom tuku 15 g/l vyočkovaním na povrch tuhej selektívno-diagnostickej pôdy podľa Mossela. Vyrastené kolónie boli mikrobiologicky posúdené a potvrdené biochemickými testami podľa [18]. Kmeň Lactobacillus rhamnosus VT1 izolovaný z tatárskej omáčky je zaradený do Zbierky mikroorganizmov ÚTMT VŠCHT Praha pod č. DMF a bol zapožičaný Doc. Ing. M. Plockovou CSc. Z ÚTMT VŠCHT Praha. Príprava suspenzií a inokulácia: Na prípravu suspenzií buniek B. cereus PM1 bola použitá sterilná peptónová voda. Kmeň L. rhamnosus VT1 bol kultivovaný v MRS bujóne pri 37 C 18 hodín. Obe štandardne pripravené suspenzie boli použité na inokuláciu UHT mlieka a výrobkov s počiatočnou denzitou B. cereuis PM KTJ/ml a koncentráciou inokula L. rhamnosus VT1 od 1 do 10% (v/v), pre výrobky 1% (v/v) s denzitou 10 8 KTJ/ml. Matematická analýza rastu: Namerané hodnoty dynamiky rastu testovaných mikroorganizmov boli v závislosti od času inkubácie matematicky spracované podľa D-modelu [19]. Primárna fáza modelovania rastu bola ďalej podrobená matematickému vyhodnoteniu za použitia software viacparametrovej lineárnej regresie [20]. Pre sekundárne modelovanie sa použil Ratkowského model a Arrheniov model. Rovnice získané sekundárnym modelovaním sa využili pri predikcii doby trvanlivosti. VÝSLEDKY A DISKUSIA Z experimentálne nameraných údajov v prostredí UHT mlieka sme matematickým modelovaním získali rastové charakteristiky B. cereus pre skladovacie teploty 8 C, 10 C, 12 C [21] a 14 C, 16 C, 20 C a pre šesť rôznych objemových koncentrácií prídavku L. rhamnosus VT1 (0%, 1%, 3%, 5%, 7%, 10 %). V sekundárnej časti modelovania sme získali matematické vyjadrenie závislosti rastovej rýchlosti B. cereus od pridanej koncentrácie L. rhamnosus VT 1, pre jednotlivé skladovacie teploty zvlášť (obr. 2). Prídavok ochrannej kultúry L. rhamnosus VT1 do matríc potravinárskych lahôdkárskych výrobkov pri sledovaných teplotách (8 C, 10 C, 12 C) predĺžil generačný čas buniek B. cereus o 40% až 50% pri 12 C, o 60% až 80% pri 10 C a o 100% pri teplote 8 C (tab. I). Na základe nameraných parametrov uvedených v tabuľke č.1 sme prostredníctvom matematických vzťahov mohli predpovedať dobu trvanlivosti výrobkov ohrozených výskytom a možnosťou rozmnožovania kontaminanta B. cereus, počas skladovania bez ochrannej kultúry alebo s 1% (v/v) prídavkom L. rhamnosus VT1 (tab. II). 247

244 0,3 0,25 14 C y 14 C = -0,0127x + 0,1331 R 2 = 0,942 rastová rýchlosť [h -1 ] 0,2 0,15 0,1 0,05 16 C 20 C 8 C y 16 C = -0,0169x + 0,1685 R 2 = 0,9306 y 20 C = -0,0216x + 0,257 R 2 = 0,922 y 8 C = -0,0038x + 0,0272 R 2 = 0, C C -0,05 konc. Lb. rhamnosus VT1 [%] y 10 C = -0,0061x + 0,0566 R 2 = 0,9667 y 12 C = -0,009x + 0,081 R 2 = 0,9324 Obr. 2 Závislosť rastovej rýchlosti B. cereus od teploty a objemovej koncentrácie prídavku L. rhamnosus VT1 v UHT mlieku (1,5% tuku). Tabuľka I Rastové charakteristiky B. cereus počas kultivácie vo vzorkách výrobkov pri teplote 8 C, 10 C a 12 C bez prídavku, alebo s 1% (v/v) prídavkom suspenzie L. rhamnosus VT1. (rastová rýchlosť (μ), lag fáza (λ), generačný čas (GT), počiatočné ph výrobku (ph 0), ph výrobku na konci exp. fázy rastu B.cereus (ph k ) Vzorka Mliečna ryža Majoné za L.rh. 8 C 10 C 12 C VT1 µ λ GT ph 0 / µ λ GT ph 0 / µ λ GT [%] [h -1 ] [h] [h] ph k [h -1 ] [h] [h] ph k [h -1 ] [h] [h] 0 0,037 60,28 8,10 6,61/ 6,64/ 0,074 25,67 4,07 6,40 6,31 0,092 15,3 3,27 1 0,018 45,58 16,9 6,46/ 6,50/ 0,044 29,85 7,37 5,25 6,10 0,061 18,3 4,97 0 0,039 40,19 8,45 6,58/ 6,63/ 0,072 1,92 4,16 6,13 5,95 0,108 8,67 2,78 1 0,018 63,58 16,8 6,35/ 6,27/ 0,046 19,75 6,50 5,38 5,63 0,075 5,27 4,01 ph 0 / ph k 6,71/ 6,44 6,50/ 5,85 6,60/ 5,93 6,25/ 5,77 Tabuľka II Predikcia doby trvanlivosti (DT) v dňoch [d], za ktorú dosiahne obsah počtu B. cereus hygienický limit pre tepelne ošetrené výrobky (10 4 KTJ/g) pri 8 C, 10 C a 12 C bez ochrannej kultúry (0% L.r. VT1) a s prídavkom 1% (v/v) kultúry L. rhamnosus (1% L.r. VT1), keď počiatočná hodnota počtu zárodkov B. cereus vo výrobku je N 0 = 1 Predĺženie doby trvanlivosti [%] výrobku s ochrannou kultúrou. 8 C 10 C 12 C L.r.VT1 Potravina Predikcia Predĺženie Predikcia Predĺženie Predikcia Predĺženie [%(v/v)] DT [d] DT [%] DT [d] DT [%] DT [d] DT [%] Mliečna 0% 7,50 3,33 2, ryža 1% 11,26 5,32 3,51 0% 6,30 2,38 1,90 Majonéza % 11,93 4,42 2,43 248

245 ZÁVER Rastová rýchlosť B. cereus (μ) so zvyšujúcou sa počiatočnou koncentráciou prítomného L. rhamnosus VT 1 v modelovom systéme klesá pre všetky skladovacie teploty. So stúpajúcou teplotou sa rastová rýchlosť B. cereus zvyšuje pre každý prídavok L. rhamnosus VT 1. Rastové údaje z primárneho modelovania sa matematicky vyhodnotili. Závislosť rastovej rýchlosti ako funkcie času, teploty a pridaného objemu L. rhamnosus VT1 vyjadruje nasledovná rovnica: μbc = -0,0294+0,0005*t + 0,0045*V0 + 0,0008*T2-0,0015*T*V0+0,0005*V02 Inokulácia ochrannej kultúry v technologicky prípustnom množstve 1% (v/v) do matríc potravinárskych výrobkov sa ukázala ako účinná na znižovanie rastovej rýchlosti kontaminanta B. cereus a zároveň prispela k predĺženiu doby trvanlivosti výrobkov od 28% (12 C) až po 90% (8 C). Použitá literatura: 1. Østlie, H., Helland, M. H., Narvhus, J. A.: Growth and metabolism of selected strains of probiotic bacteria in milk. International Journal of Food Microbiology, 87, 2003, Työppönnen, S., Markkula, A., Petäjä, E., Suihko, M.-L., Mattila-Sandholm, T.: Survival of in North European type dry sausages fermented by bioprotective meat starter cultures. Food Control, 14, 2003, Røssland, E., Borge, G. I. A., Langsrud, T., Sørhaug, T.: Inhibition of B. cereus by strains of Lactobacillus and Lactoccocus in milk. International Journal of Food Microbiology, 89, 2003, Røssland, E., Langsrud, T., Granum, P. E., Sørhaug, T.: Production of antimicrobial metabolites by strains of Lactobacillus or Lactococcus co-cultured with Bacillus cereus in milk. International Journal of Food Microbiology, 98, 2005, Plocková, M., Chumchalová, J., Giesová, M., Boušková, O.: Antifungal effectiveness of Lactobacillus rhamnosus VT1 at different temperatures. Advances in Food Science, 26 (2), 2004, Lauková, D., Valík, Ľ., Görner, F., Petríková, J.: Effect of Lactobacillus rhamnosus VT1 and temperature on growth dynamics of Candida maltosa YP1. Book of Abstracts 2 nd Central European Congress on Food, Budapest, April 2004, Lauková, D., Valík, Ľ., Koreňová, J., Görner, F.: Matematické modelovanie vplyvu Lactobacillus rhamnosus a teploty na rast Bacillus cereus. Bulletin potravinárskeho výskumu, 44 (1-2), 2005, Petríková, J., Lauková, D., Valík, Ľ.: Vplyv Lactobacillus rhamnosus a teploty na dynamiku rastu Listeria monocytogenes 272. Sborník přednášek semináře Mléko a sýry 2005, Česká společnost chemická 2005, Valík, Ľ., Lauková, D., Polka, P., Bajúsová, B.: Kvantitatívna analýza potenciálneho antimikrobiálneho pôsobenia Lactobacillus rhamnosus VT1 v mlieku. Sborník přednášek semináře Mléko a sýry 2005, Česká společnost chemická 2005, Loss, C. R., Hotchkiss, J. H.: Effect of dissolved carbon dioxid on thermal inactivation of microorganisms in milk. Journal of Food Protection, 65 (12) 2002, Simmonds, P., Mossel, B. L., Intaraphan, T., Deeth, H. C.: Heat resistance of Bacillus spores when adhered to stainless steel and its relationship to spore hydrophobicity, Journal of Food Protection, 66 (11) 2003, Dufrenne, J., Bijward, M., Giffel, M., Beumer, R., Notermans, S.: Characteristics of some psychrotrophic B. cereus isolates. International Journal of Food Microbiology, 27, 1995, Valík, Ľ., Petríková, J., Lauková, D., Koreňová, J.: Growth prediction of Bacillus cereus and shelf-life of pasteurised milk. Proceeding of 3d Croatian Congress of Microbiology with international participation. Croatian Microbiological Society Zagreb, 3, 2004, str

246 14. Petríková, J., Lauková, D., Koreňová, J., Valík, Ľ.: Dynamika rastu B. cereus a CPM v pasterizovanom mlieku so 7-dňovou dobou trvanlivosti. Sborník přednášek semináře Mléko a sýry 2004, Česká společnost chemická, Praha, 2004, Guinebretiere, M. H., Girardin, H., Dargaignaratz, C., Carlin, F., Nguyen-The, C.: Contamination flows of Bacillus cereus and spore-forming aerobic bacteria in cooked, pasteurised and chilled zucchini purée processing line. International Journal of Food Microbiology, 82, 2003, Faille, Ch., Membre, J. M., Kubaczka, M., Gavini, F.: Altered ability of Bacillus cereus spores to grow under unfavourable condition following heat treatment during sporulation. Journal of Food Protection 65 (12), 2002, Sarrías, J. A., Valero, M., Salmerón, M. C.: Enumeration, isolation and characterisation of Bacillus cereus strains from Spanish raw rice. Food Microbiology, 19, 2002, STN ISO7932 ( ) Mikrobiológia. Všeobecné pokyny na stanovenie počtu baktérií B. cereus. Metóda počítania kolónií kultivovaných pri 30 C, Baranyi, J., Roberts, T. A., McClure, P.: A non-autonomous differential equation to model bacterial growth. Food Microbiology, 10, 1993, Steppan, D., Werner, J., Yeater, B.: Essential Regression and Experimental Design (software), 1998, Koreňová, J., Lauková, D., Valík, Ľ., Petríková, J.: Vplyv Lactobacillus rhamnosus VT1 a teploty na dynamiku rastu Bacillus cereus. Sborník přednášek semináře Mléko a sýry 2005, Česká společnost chemická, Praha, 2005, Kontaktná adresa: Ing. Janka Koreňová, Výskumný ústav potravinársky, Kostolná 7, Modra, Slovensko JKorenova@zoznam.sk 250

247 ANTIMIKROBIÁLNE ÚČINKY ROZMARINOVÝCH A ŠALVIOVÝCH EXTRAKTOV NA RAST POTRAVINÁRSKY NEŽIADÚCICH MIKROORGANIZMOV Krajčová Eva, Adamová Adriana, Sekretár Stanislav, Schmidt Štefan, Greifová Mária STU Fakulta Chemickej a Potravinárskej Technológie v Bratislave, Slovenská Republika ANTIMICROBIAL EFFECTS OF ROSEMARY AND SAGE EXTRACTS ON GROWTH OF FOOD CONTAMINANTS Summary: Microbial properties of food products are important for their quality and durabilty. Rosemary and sage, which are rich in antioxidants, belong to widely used food ingredients. Antioxidants from these plants posses both antioxidant and antimicrobial activity. These substances were tested for their activity against common contaminants of food and cosmetic products (Bacillus cereus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes). The antimicrobial activity was tested by two-dimensional diffusion method and by description of growth curves of tested microorganisms. The antimicrobial effect of rosemary and sage extracts were correlated to their concentrations and compared each to other. The best antimicrobial effect was observed at extract concentration 0.1%. This result confirms our expectation that our extracts act in food not only as antioxidants but also as antimicrobial agents. Úvod: V súvislosti so súčasným svetovým trendom uprednostňovania prírodných látok pred syntetickými vzrastá požiadavka nahradiť syntetické potravinárske aditívne látky prírodnými. Množstvo prírodných látok okrem toho, že sú významné z výživového hľadiska sú veľmi dôležité z mikrobilogického hľadiska. Mikrobiologické vlastnosti potravín sú dôležité najmä z hľadiska trvanlivosti a kvality. Medzi prírodné látky, ktoré sa pridávajú do potravín, patrí rozmarín lekársky (Rosmarinus officinalis L.) a šalvia lekárska (Salvia officinalis). Antioxidanty, ktoré sú súčasťou rozmarínu a šalvie, pôsobia v potravinárskych výrobkoch nielen antioxidačne ale aj antimikrobiálne. Listnatá časť rastlín rozmarínu, šalvie patrí do čelade Labiaceae. Rastliny z tejto čelade sú pridavané do mäsa, rýb a iných potravinárských výrobkov už niekoľko rokov [1]. Cieľom tejto práce bolo sledovať antimikrobiálny účinok rozmarínových a šalviových extraktov na potravinársky nežiadúce mikroorganizmy (Bacillus cereus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes). Materiál a metódy: Testované druhy mikroorganizmov Bacillus cereus izolovaný z mlieka na Katedre potravinárskej technológie, (FCHPT, STU, Bratislava) Escherichia coli CCM 3988 Pseudomonas aeruginosa CCM 3955 Staphylococcus aureus CCM 3953 Listeria monocytogenes NCTC 4886 Testované rozmarínové a šalviové extrakty Sušené rastliny boli extrahované počas 4 hodín Soxhletovou extrakciou 96% etanolom. Extrakty boli potom odparené do sucha pomocou vákuovej rotačnej odparky [8]. 251

248 Stanovenie inhibičného účinku na vybrané druhy mikroorganizmov Na stanovenie inhibičného účinku extraktov bola použitá dvojrozmerná difúzia, ako je radiálna difúzia z otvorov vykrojených v agare. Vyhodnocovali sa priemery inhibičných zón, čo indikuje citlivosť alebo rezistenciu vybraného druhu mikroorganizmu[2,3,4]. Mikrotitračné metódy Na prácu bola použitá vždy čerstvú 16 hodinová kultúra mikroorganizmov. Do skúmaviek s BHI bujónom sa pridalo inokulum baktérií tak, aby jeho výsledná koncentrácia bola 10 7 KTJ/ml. Z každého takto naočkovaného BHI bujónu sa pipetovalo 3 x 200 µl do jamiek v mikrotitračnej platni. Okrem daných mikrooragnizmov boli do mikrotitračných platničiek rozpipetované rozpúšťadlo DMSO a jednotlivé koncentrácie (0,1%, 0,05%, 0,02%, 0,01%) rozmarínoveho, šalviového extraktu a gentamicínu v množstve 20 µl. Mikrotitračná platňa sa stacionárne inkubovala v termostate pri 37ºC. V dvojhodinových časových intervaloch sa odčítavali hodnoty absorbancií pri 630 nm na readeri. Zo získaných výsledkov sa zostrojila rastová krivka A 630 =f (t). V 12 hodine bolo z jamiek mikrotitračnej platničky jednotlivých extraktov a antibiotika odobrané množstvo, kde sa prejavil inhibičný účinok, a následne bolo rozočkované na Petriho misky na stanovenie mikrobicídneho a mikrostatického účinku [2,3]. Výsledky a diskusia Úlohou práce bolo otestovať rozmarínové a šalviové extrakty, ktoré sa pridávajú do potravín alebo kozmetiky, kde pôsobia aj ako antioxidanty a zabraňujú predčasnej oxidácii. Preto nás veľmi zaujímalo, či dané antioxidanty pôsobia aj antimikrobiálne a zároveň zabraňujú kazeniu potravinárskych a kozmetických výrobkov. Ich antimikrobiálny účinok sme najskôr sledovali meraním inhibičných zón radiálnou difúznou metódou a na porovnanie sme použili tiež disky s penicilínom G, ampicilínom, tetracyklínom, a erytromycínom. U šalviového extraktu sme nepozorovali vyjasnené inhibičné zóny pri žiadnej zo zvolených koncentrácií, rozmarínový extrakt vykazoval inhibičné zóny ale iba pri najvyššej koncentrácií (0,1%). Porovnávaním citlivosti na vybrané druhy mikrorganizmov rozmarínového extraktu mal najvyšší inhibičný efekt na Pseudomonas aeruginosa a Bacillus cereus, slabší účinok na Listeria monocytogenes, na Staphylococcus aureus a Escherichia coli sa inhibičný účinok vôbec neprejavil (Obr. 1). Je známe, že kompozícia jednotlivých extraktov a ich antimikrobiálny efekt závisí od špecifickosti rastliny a prírodných podmienok. Sagdic [1] uvádza vo svojej štúdii antimikrobiálnej aktivity rozmarínu a šalvie, že jednotlivé extrakty neprejavili žiaden inhibičný účinok na ním testované mikroorganizmy. Vo svojej práci používal tiež radiálnu difúznu metódu. Antibiotiká, ktoré sme použili na porovnanie vykazovali dostatočné inhibičné zóny pri rôznych koncentráciach (Obr.2 a 3). Rozmarín 0,1% gentamicín Inhibičné zóny (mm) 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 STA BCE PSE ECO LM inhibičné zóny(mm) STA BCE PSE ECO LM 0,01% 0,02% 0,05% 0,10% Obr.1 Veľkosti inhibičných zón rozmarínového extraktu Obr.2 Veľkosti inhibičných zón gentamicínu 252

249 14 inhibičné zóny (mm) U 10ug 30ug 15ug 0 STA BCE PSE ECO LM Obr.3 Veľkosti inhibičných zón penicilínu G, ampicilínu, tetracyklínu, erytromycínu. Metódou rastových kriviek je možné posúdiť účinnok aj nižších koncentrácií testovaných extraktov látok a preto sme okrem radiálnej difúzii sledovali ako sa mení rast potravinársky nežiadúcich mikroorganizmov v závislosti od prídavku jednotlivých koncentrácií rozmarínových, šalviových extraktov ako aj gentamicínu, rovnakých koncentrácií ako boli pripravené dané extrakty mikrotitračnou metódou (Obr. 4 až 6). Pri porovnaní antimikrobiálneho účinku rozmarínového a šalviového extraktu sme zistili, že rozmarínový extrakt má lepší antimikrobiálny účinok ako šalviový. Samotný rozmarín bol účinný už pri koncentrácii 0,02% u všetkých testovaných mikroorganizmov. 1,2 1,0 čk DMSO 0,1% 0,05% 0,02% 0,01% 1,2 1,0 čk DMSO 0,1% 0,05% 0,02% 0,01% A 630 nm 0,8 0,6 A 630nm 0,8 0,6 0,4 0,4 0, čas [h] 0, čas [h] Obr. 4 Rast S. aureus s prídavkom šalviového extraktu koncentrácie 0,01% až 0,1%. Obr. 5 Rast S. aureus s prídavkom rozmarínového extraktu koncentrácie 0,01% až 0,1%. 253

250 1,2 1,0 čk 0,1% 0,05% 0,02% 0,01% A 630nm 0,8 0,6 0,4 0, čas [h] Obr. 6: Rast S. aureus s prídavkom gentamicínu koncentrácie 0,01% až 0,1. Na rastových krivkách môžeme vidieť, že pri týchto koncentráciách došlo k predĺženiu lag- fázy a spolmaleniu rýchlosti rastu danej sklonom krivky. Šalviový extrakt bol účinný až pri koncentráciach 0,05%, 0,1%. Ostatné grafy sú uvedené posterovou formou alebo u autora. Je veľmi ťažké porovnávať tieto výsledky s výsledkami iných autorov v tomte type štúdie. Pretože každý autor vypracováva štúdiu na rastlinách dostupných v jeho krajine. Dôležitým faktorom sú aj prírodné podmienky, proces spracovania rastlín a aj proces prípravy jednotlivých extraktov[5,6,7]. Nakoniec sme zohľadňovali mikrobicídny alebo mikrostatický účinok daných extraktov a antibiotika gentamicínu Tab.I. Tabuľka I Prehľad účinkov rozmarínového, šalviového extraktu a gentamicínu. Staphylococcus aureus šalvia šalvia rozmarín rozmarín rozmarín gentamicín gentamicín 0,05% 0,1% 0,02% 0,05% 0,1% 0,05% 0,1% MS MS MS MS MS MS MB Bacillus cereus MS MS MS MS MS MS MS Pseudomonas aeruginosa MS MS MS MS MS MS MS Escherichia coli MS MS MS MS MS MS MB Listeria monocytogenes MS MS MS MS MS MS MB MS: mikrostatický účinok MB: mikrobicídny účinok V tabuľke I vidieť, že vybrané koncentrácie rozmarínového, šalviového extraktu majú mikrostatický účinok. U antibiotika gentamicínu koncentrácie 0,1% vidieť, že daná koncentrácia pôsobí na mikroorganizmy Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Listeria monocytogenes mikrobicídnym účinkom. 254

251 Záver: V tejto práci je potvrdené, že skúmané rozmarínové a šalviové extrakty pôsobia v potravinárskych výrobkoch nielen antioxidačne, ale aj antimikrobiálne. Antimikrobiálne účinky boli zistené u rozmarínového extraktu s koncentráciou 0,02, 0,05 a 0,1 % počas 12 hodinového rastu zvolených potravinársky nežiaducich mikroorganizmov. Šalviový extrakt prejavil antimikrobiálne účinky pri koncentráciach 0,05 a 0,1%.. V budúcnosti bude práca zameraná na antimikrobiálne účinky iných v potravinách a v kozmetike použivaných rastlinných extraktov. Táto práca vznikla s podporou VEGA projektu 1/2392/05 Použitá literatúra: [1] Sagdic, O., Özcan, M.: Antibacterial activity of Turkish spice hydrolsols s. Food Control, 14, [2] Betina, V. a kol.: Mikrobiologické laborátorne metódy. 1.vyd., Bratislava, Alfa s. [3] Görner, F., Valík, Ľ.: Aplikovaná mikrobiológia požívatín. 1. vyd., Bratislava, Malé centrum s. [4] Horáková, K.; Greifová, M.; Seemanová, Z.; Gondová, B.; Wyatt, G.: 2004 Acomparison method for monitoring the growth characteristics of Listeria species. J. of App. Microbiol. 38, [5] Ginesta-Peris., E., Garcia-Breijo, F.J., Primo-Zúfera, E., Antimicrobial activity of xanthanin from Xanthium spinosum L. Letters in Applied Microbiology 18, [6] Kim, J., Wei, C.I., Marshall, M.R., Antibacterial activity of some essential oil components against five foodborne pathogens. Journal of Agricultural and Food Chemistry 48, [7] Hsieh, P.-C., Mau, J.-L., Huang, S.-H., Antimicrobial effect of various combinations of plant extracts. Food Microbiology 18, [8] Koman, V., Hojerová, J., Schmidt, Š.: Chémia a technológia tukov I ( skriptum). 1. Vyd., Bratislava, Edičné stresisko SVŠT s. Kontaktná adresa: Ing. Eva Krajčová, Slovenská technická univerzita v Bratislave, Fakulta chemickej a potravinárskej technológie, Ústav biotechnológie a potravinárstva, Oddelenie potravinárskej technológie, Radlinského 9, Bratislava, Slovenská republika. eva.krajcova@stuba.sk 255

252 ANTIBAKTERIÁLNÍ AKTIVITA IZOLÁTŮ Z MAJONÉZOVÝCH VÝROBKŮ Kučerová Kateřina, Chumchalová Jana, Míková Kamila *, Navrátilová Jiřina Ústav technologie mléka a tuků, * Ústav chemie a analýzy potravin, Vysoká škola chemicko-technologická v Praze ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF BACTERIA ISOLATED FROM DELICACY PRODUCTS Summary: This work was focused on a determination of an antibacterial activity of 144 lactic acid bacteria isolated from delicacy products and raw material used for their preparation. Only three strains (EN3, EN14 and EN15) out of this collection showed the antibacterial activity. According to the phenotypical identification they were classified as Enterococcus genus. These three strains inhibited the indicator strains Lbc. sakei DMF3017 and lactobacilli (heterofermentative isolates from delicacy products and strains of czech and foreign collections of microorganisms). They showed activity also against lactococci, Bacillus sp. and the strain EN3 inhibited also Listeria monocytogenes. Úvod Hlavní mikrobiální riziko u průmyslově vyráběných majonézových výrobků, vzhledem k charakteru jejich výroby, netvoří překvapivě patogenní mikroorganismy (např. Salmonella, Escherichia coli O157:H7 a Listeria monocytogenes). Jedná se spíše o kvasinky a bakterie mléčného kvašení, které výrobek znehodnocují senzoricky (nežádoucí barva, vůně a změny konzistence) [1]. Tyto mikroorganismy jsou navíc obvykle tolerantní k přídavku klasických potravinových konzervačních látek (kyselina benzoová a její soli, kyselina sorbová a její soli). Vzhledem k současnému trendu vytlačování chemické konzervace a jejímu nahrazení přirozenou ochrannou je obrovský zájem o využití protektivních kultur (buď přímo mikroorganismů nebo jejich metabolitů), a to zejména bakterií mléčného kvašení, jako biopreservativ [2, 3]. Tato skutečnost vede ke snaze o izolaci homofermentativních laktobacilů a laktokoků z majonézových výrobků, jež by produkovali bakteriociny nebo látky bakteriocinům podobné. U těchto kmenů lze pak uvažovat o jejich potenciální aplikaci do potravin. Cíl práce Cílem této práce bylo izolovat z majonézových výrobků a surovin použitých pro jejich výrobu bakterie mléčného kvašení s antimikrobiální aktivitou. Materiál a metody Použité kmeny: Testované kmeny: BMK izolované z majonézových výrobků a surovin použitých na jejich výrobu, Lactobacillus acidophilus CH5 (kontrolní kmen) Indikátorové kmeny: o BMK (heterofermentativní laktobacily izolované z majonézových výrobků, sbírkové laktobacily, laktokoky) o Gram-pozitivní bakterie (bacily, Listeria monocytogenes atd.) o Gram-negativní bakterie (Escherichia coli, Pseudomonas sp. atd.) Identifikace: fenotypická: Gramovo barvení, morfologie, test na katalasu, produkce CO 2 z glukosy, tolerance k ph, NaCl a methylenové modři (MM), růst na Slanetz Bartley agaru Příprava supernatantů: Čerstvě narostlý produkční kmen se odstředí (6 000 ot./ min., 4 C, 15 min.). U supernatantu se upraví jeho ph na hodnotu 6 6,5 pomocí NaOH (1 a 10 % hm.) a takto upravený supernatant se přefiltruje přes mikrofiltr (průměr pórů 0,45 μm). Přefiltrovaný supernatant se tepelně ošetří (90 C, 10 min.) a skladuje se při teplotě -20 C [4]. 256

253 Testování antibakteriální aktivity agarovou vpichovou metodou: Čerstvě narostlý indikátorový kmen se naředí bujónem v poměru 1:10 a 7 ml soft agaru se zaočkuje 1 % obj. takto připraveného inokula. Zaočkovaný agar se nalije na Petriho misku a po jeho zaschnutí a předsušení se do agaru nadávkuje vpichem 5 10 μl testovaného kmene nebo jeho supernatantu, který je různě upraven. Následuje inkubace při optimální teplotě kultivace indikátorového kmene po dobu 17 h a sleduje se vznik inhibičních zón, které indikují antibakteriální aktivitu [5]. Výsledky Izolace a identifikace Celkem bylo vyizolováno 144 kmenů bakterií mléčného kvašení z hotových výrobků (majonéza, Tatarská omáčka, Francouzská majonéza) a také ze surovin použitých na jejich přípravu (voda, zeleninová směs, hořčice, chilli koření, kečup, zelené olivy, sušený žloutek, petržel). Z kolekce testovaných izolátů bakterií mléčného kvašení vykazovalo pouze 6 kmenů antimikrobiální aktivitu: kmeny EN3, EN14 a EN15 měly aktivitu antibakteriální a kmeny EN7, EN8 a EN10 měly aktivitu antifungální. Kmeny EN3, EN14 a EN15 byly katalasa negativní koky, které na Slanetz-Bartley agaru tvořily kaštanovitě hnědé kolonie. Výsledky jejich tolerance k teplotě, ph, NaCl a methylenové modři jsou shrnuty v tab. I. Na základě výše uvedených výsledků byly kmeny EN3, EN14 a EN15 identifikovány jako Enterococcus sp. Tabulka I Charakteristika homofermentativních izolátů BMK s antibakteriální aktivitou Teplota [ C] ph NaCl Kmen Zdroj ,5 7 9,6 6,5 % hm 257 MM 0,1 % EN3 Tatarská omáčka EN14 chilli koření EN15 chilli koření slabý nárůst, ++ silný nárůst, +++ velmi silný nárůst Antibakteriální aktivita Antibakteriální aktivita byla testována agarovou vpichovou metodou. Testovala se aktivita živých buněk a následně i aktivita supernatantů. Pro screening byl vybrán soubor bakterií, které znehodnocují majonézové výrobky senzoricky (např. bakterie mléčného kvašení, bacily), a také bakterie, které mohou způsobit onemocnění (např. Listeria monocytogenes). Kmen Lactobacillus acidophilus CH5 byl použit jako kontrolní kmen. Během izolace bakterií s antibakteriální aktivitou bylo také vyizolováno z majonéz a tatarek 20 heterofermentativních laktobacilů, které byly použity jako indikátorové kmeny. Z této kolekce 20 heterofermentativních laktobacilů kmen EN3 inhiboval růst 19-ti kmenů a kmeny EN14 a EN15 inhibovaly 14 z nich (viz tab. II). Na obr. 1 je výsledek stanovení antibakteriální aktivity za použití indikátorového kmene Lactobacillus sp. T7. Schopnost enterokoků inhibovat laktobacily byla popsána již dříve. E. durans L28-2 inhiboval růst Lbc. sakei, Lbc. sanfranciscensis, Lbc. coryniformis subsp. coryniformis, Lbc. plantarum, Lbc. animalis, Lbc. pentosus, Lbc. gasseri, Lbc. rhamnosus, Lbc. helveticus a Lbc. amylophilus [6]. E. faecium 6T1a inhiboval Lbc. fermentum a Lbc. plantarum [7], enterocin 012 produkovaný kmenem E. gallinarum inhiboval růst Lbc. sakei a Lbc. acidophilus [8]. V tab. III jsou shrnuty výsledky antibakteriální aktivity enterokoků EN3, EN14 a EN15 vůči dalším vybraným bakteriím (sbírkovým laktobacilům a laktokokům, Gram pozitivním a negativním bakteriím). Jak je patrno, kmen EN3 měl nejvyšší antibakteriální aktivitu. Byl schopen potlačit růst sbírkových laktobacilů a laktokoků, dále potlačil růst několika bacilů (např. Bacillus cereus DMF 2001) a jako jediný inhiboval Listeria monocytogenes CCM 5576.

254 Obr. 1 Antibakteriální aktivita za použití indikátorového kmene Lactobacillus sp. T7, živé buňky: A EN3, B EN5, C EN7, D EN8, E EN10, F EN14, G EN15, H Lbc. acidophilus CH5 Tabulka II Antibakteriální aktivita izolátů vůči heterofermentativním laktobacilům izolovaným z lahůdkových výrobků Indikátorový kmen Lactobacillus sp. Testovaný kmen Enterococcus sp. EN3 EN14 EN15 H1 +/+ +/- -/- H2 +/- -/- -/- H3 +/+ -/- -/- H4 +/+ +/- -/- H5 +/+ -/- -/- H6 +/+ -/- -/- M1 +/+ +/+ +/+ M3 +/+ +/+ +/+ 2M2 +/+ +/+ +/+ 2M3 +/+ +/+ +/+ 2M4 +/+ +/+ +/+ 2M8 +/+ +/+ +/+ T3 +/+ +/+ +/+ T4 +/+ +/+ +/+ T5 +/+ +/+ +/+ T6 +/+ +/+ +/+ T7 +/+ +/+ +/+ 2T5 +/+ +/+ +/+ 2T10 +/+ +/+ +/+ 2T12 +/+ +/+ +/+ aktivita živých buněk/ aktivita supernatantu, + inhibice, - žádná inhibice 258

255 Tabulka III Antibakteriální aktivita izolátů vůči vybraným bakteriím Indikátorový kmen Testovaný kmen Enterococcus sp. EN3 EN14 EN15 Lactobacillus sp. Lbc. sakei DMF /+ +/+ +/+ Lbc. rhamnosus VT1 +/+ +/+ +/+ Lbc. plantarum 195 +/- +/- +/- Lbc. rhamnosus CCM /+ +/+ +/+ Lbc. casei 161 -/- -/- -/- Lbc. brevis DMF /- -/- -/- Lactococcus sp. Lc. lactis subsp. cremoris MG /+ +/+ +/+ Lc. lactis subsp. cremoris NIZO B33 +/- +/- +/- Lc. lactis subsp. lactis NIZO B643 +/+ +/+ +/+ Lc. lactis subsp. lactis NCDO /- -/- -/- Lc. lactis HMM 81 +/+ +/+ +/+ Gram pozitivní Enterococcus faecalis DMF /- -/- -/- Geobacillus stearothermophilus DMF /- -/- -/- Bacillus subtilis DMF /- -/- -/- Bacillus cereus mycoides DMF /- -/- -/- Bacillus pumilis DMF /+ +/- +/+ Bacillus cereus DMF /+ +/- +/- Listeria monocytogenes CCM /+ -/- -/- Staphylococcus aureus CCM /- -/- -/- Gram negativní Enterobacter cloacae DMF /- -/- -/- Pseudomonas aeuroginasa DMF /- -/- -/- Pseudomonas fluorescens DMF /- -/- -/- Escherichia coli DMF /- -/- -/- Escherichia coli CCM /- -/- -/- Aktivita živých buněk/ aktivita supernatantu, + inhibice, - žádná inhibice Antibakteriální aktivita kmenů EN14 a EN15 byla přibližně stejná. Tyto 2 kmeny inhibovaly růst některých laktobacilů a laktokoků, ale již neinhibovaly zbylé vybrané bakterie. Pouze kmen EN15, na rozdíl od kmene EN14, byl schopen potlačit růst Bacillus pumilis DMF Tyto výsledky jsou shodné s informacemi v literatuře. E. faecium EK13 [9] a E. faecium EF55 [10] inhibovaly růst kmenů Lc. lactis sp. Na druhou stranu kmeny E. faecium JBL1061, JBL1083 a JBL1351 [11] neinhibovaly kmeny Lc. lactis subsp. lactis. Růst Bacillus cereus byl potlačen enterocinem AS-48RJ [12], ale nebyl potlačen E. faecalis BFE1071 [13], Staphylococcus aureus nebyl potlačen E. faecalis BFE1071 [13], ale byl inhibován kmenem E. faecium GM-1 [14]. Růst kmene E. faecalis nebyl potlačen enterocinem AS-48RJ [12], ale kmen E. faecium 6T1 jej inhiboval [7]. E. faecium JBL1061, JBL1083 a JBL1351 inhibovaly 8 kmenů Listeria monocytogenes, ale kmen JBL1004 ji neinhiboval [11]. Escherichia coli byla potlačena enterocinem AS-48RJ [12] and E. faecium ST311LD [15], ale nebyla inhibována kmeny E. gallinarum [8], E. faecium EF55 [10]. Enterobacter cloacae nebyl potlačen kmenem E. faecium ST311LD [15]. Kmen E. faecium P21 neinhiboval Pseudomonas fluorescens [16]. 259

256 Závěr Z kolekce 144 izolátů bakterií mléčného kvašení pouze 3 kmeny (EN3, EN14 a EN15) vykazovaly antibakteriální aktivitu. Na základě fenotypizace byly tyto 3 kmeny identifikovány jako Enterococcus sp. Kmeny EN3, EN14 a EN15 inhibovaly heterofermentativní laktobacily, některé bacily (např. Bacillus pumilis DMF 2007) a kmen EN3 inhiboval také Listeria monocytogenes CCM Kmen EN3 vykazoval nejsilnější spektrum inhibice vůči vybraným indikátorovým mikroorganismům, proto další práce budou zaměřeny na charakterizaci metabolitů produkovaných tímto kmenem. Tato práce byla podpořena výzkumným záměrem MSM Použitá literatura: 1. MÍKOVÁ K Majonézy. Maso (příloha Lahůdka), 2001, č. 3, 5-6 str. 2. CLEVELAND J, MONTVILLE TJ, NES IF, CHIKINDAS ML Bacteriocins: safety, natural antimicrobials for food preservation. Int. J. Food Microbiol., 2001, vol. 71, 1-20 p. 3. O SULLIVAN L, ROSS RP, HILL C Potential of bacteriocins-producing lactic acid bacteria for improvements in food safety and quality. Biochimie, 2002, vol. 84, p. 4. FRANZ CMPA, SCHILLINGER U, HOLZAPFEL WH Production and characterization of enterocin 900, a bacteriocin produced by Enterococcus faecium BFE 900 from black olives. Int. J. Food Microbiol., 1996, vol. 29, p. 5. SCHILLINGER U, STILES ME, HOLZAPFEL WH Bacteriocin production by Carnobacterium piscicola LV61. Int. J. Food Microbiol., 1993, vol. 20, p. 6. YANAGIDA F, CHEN Y, ONDA T, SHINOHARA T Durancin L28-1A, a new bacteriocin from Enterococcus durans L28-1, isolated from soil. Lett Appl Microbiol., 2005, vol. 40, p. 7. FLORIANO B, RUIZ-BARBA JL, JIMÉNEZ-DÍAZ R Purification and genetic characterization of enterocin I from Enterococcus faecium 6T1a, a novel antilisterial plasmid-encoded bacteriocin which does not belong to the pediocin family of bacteriocins. Appl Environ Microbiol., 1998, vol. 64 (no 12), p. 8. JENNES W, DICKS LTM, VERWOERD JD Enterocin 012, a bacteriocin produced by Enterococcus gallinarum isolated from the intestinal tract of ostrich. J Appl Microbiol., 2000, vol. 88, p. 9. MAREKOVÁ M, LAUKOVÁ A, DEVUYST L, SKAUGEN M, NES IF Partial characterization of bacteriocins produced by environmental strain Enterococcus faecium EK13. J Appl Microbiol., 2003, vol. 94, p. 10. STROMFOVÁ V, LAUKOVÁ A, MUDROŇOVÁ D Effect of bacteriocin-like substance produced by Enterococcus faecium EF55 on the composition of avian gastrointestinal microflora. Acta Vet Brno, 2003, vol. 72, p. 11. ARIHARA K, CASSENS RG, LUCHANSKY JB Characterization of bacteriocins from Enterococcus faecium with activity against Listeria monocytogenes. Int J Food Microbiol., 1993, vol. 19, p. 12. ABRIOUEL H, LUCAS R, BEN OMAR N, VALDIVIA E, MAQUEDA M, MARTÍNEZ- CAÑAMERO M, GÁLVEZ A Enterocin AS-48RJ: a variant of enterocin AS-48 chromosomally encoded by Enterococcus faecium RJ16 isolated from food. System Appl Microbiol., 2005, vol. 28, p. 13. BALLA E, DICKS LTM, DU TOIT M, VAN DER MERWE JM, HOLZAPFEL WH Characterization and cloning of the genes encoding enterocin 1071A and enterocin 1071B, two antimicrobial peptides produced by Enterococcus faecalis BFE Appl Environ Microbiol., 2000, vol. 66 (no 4), KANG JH, LEE MS Characterization of a bacteriocin produced by Enterococcus faecium GM-1 isolated from an infant. J Appl Microbiol., 2005, vol. 98, p. 15. TODOROV SD, DICKS LTM Characterization of bacteriocins produced by lactic acid bacteria isolated from spoiled black olives. J Basic Microbiol., 2005, vol. 45 (no 4), p. 16. HERRANZ C, CASAUS P, MUKHOPADHYAY S, MARTÍNEZ JM, RODRÍGUEZ JM, NES IF, HERNÁNDEZ PE, CINTAS LM (2001) Enterococcus faecium P21: a strain occurring naturally in dryfermented sausages producing the class II bacteriocins enterocin A and enterocin B. Food Microbiol., 2001, vol. 18, p. Kontaktní adresa: Kateřina Kučerová, Ústav technologie mléka a tuků, FPBT, VŠCHT, Technická 5, Praha 6 katerina.kucerova@vscht.cz 260

257 VYUŽITÍ PETRIFILMU K IZOLACI STAPHYLOCOCCUS AUREUS ZE SYROVÉHO KOZÍHO A KRAVSKÉHO MLÉKA Pospíšilová Markéta 1, Karpíšková Renata 2 1 Ústav hygieny a technologie mléka, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno 2 Centrum hygieny potravinových řetězců v Brně, Státní zdravotní ústav Praha USING PETRIFILM FOR ISOLATION OF STAPHYLOCOCCUS AUREUS STRAINS FROM RAW GOAT S AND COW S MILK Summary: Raw goat s and cow s milk can be source of enterotoxigenic Staphylococcus aureus strains. Isolation and subsequent confirmation of S. aureus from milk samples according the guideline ČSN EN ISO (1999) is rather time-consuming. The appearance of S. aureus colonies isolated from raw milk on the Baird-Parker medium (B-P) is rather variable and also atypical colonies often appear. The aim of this study was the use of additional medium - the 3M TM Petrifilm TM Staph Express Count System (Petrifilm) for the detection of S. aureus in raw milk samples. The Petrifilm contains chromogenic, modified Baird-Parker medium that is selective and differential for S. aureus. Confirmation of S. aureus is performed using a disk that facilitates the visualization of deoxyribonuclease (DNase) reactions. The disk contains toluidine blue-o that reacts to produce a distinct pink zone around S. aureus colonies. The prevalence of S. aureus from milk samples processed using Petrifilm was significantly higher than the prevalence of milk samples processed using standard microbiological techniques. Úvod Staphylococcus aureus je významným a častým původcem mastitid u koz i krav (Contreras et al., 2003; Lim et al., 2004) a jeho výskyt na mléčných farmách představuje finanční ztráty především z důvodu poklesu produkce mléka a snížení jeho kvality (Guidry et al., 1997; Lim et al., 2004). Některé kmeny tohoto patogena jsou schopny produkovat stafylokokové enterotoxiny a syrové mléko tak může být potenciálním zdrojem enterotoxigenních S. aureus v mléce a mléčných výrobcích (Ercolini et al., 2004; Lim et al., 2004). Hlavní riziko však představují termostabilní enterotoxiny produkované S. aureus (Ercolini et al., 2004). V minulosti již bylo zaznamenáno několik případů stafylokokových enterotoxikóz vyvolaných po konzumaci mléka, z mléka připravených pokrmů a nebo mléčných výrobků (Zschöck et al., 2000). Stafylokokové enterotoxiny jsou díky svému složení velice stabilní proteiny odolné vůči působení proteolytických enzymů pepsinu, trypsinu, chymotrypsinu, reninu a papainu (Balaban and Rasooly, 2000) a lze je inaktivovat teprve záhřevem na 100 C po dobu několika minut (Atanassova et al., 2001). Již velmi nízké koncentrace enterotoxinu (0,5 0,75 ng.ml -1 ) v mléce nebo mléčném výrobku mohou vyvolat alimentární intoxikaci. Z hlediska bezpečnosti potravin je proto nutné používat rychlé a dostatečně citlivé metody jak pro detekci S. aureus tak i samotných enterotoxinů (Soejima et al., 2004). Při kultivaci syrového mléka na médiu Baird-Parker (B-P) často nacházíme atypické kolonie, které svojí morfologií neodpovídají vzhledu suspektních kolonií tak, jak jsou definovány v ČSN EN ISO (1999). Proto jsme při vyšetření této matrice zařadily další kultivační médium 3M TM Petrifilm TM Staph Express systém (Petrifilm), (Noack, A). Tento detekční systém se skládá z počítací destičky a disku. Na počítací destičce je naneseno chromogenní modifikované B-P médium a kolonie S. aureus na destičce rostou červenofialově. V případě výskytu i jiných koloniích než červenofialových se použije disk detekující deoxyribonukleázovou reakci typickou pouze pro S. aureus. Tento systém umožňuje snadné odlišení S. aureus od dalších druhů stafylokoků, protože po přiložení disku na povrch inkubovaného Petrifilmu se kolem kolonií s pozitivní DNázovou reakcí vytvoří růžová zóna. 261

258 Materiál a metodika Vzorky kozího a kravského mléka byly získány z farem se sídlem na jižní Moravě a byly zpracovány podle ČSN EN ISO (1999). Z každé misky byly vybrány kolonie s typickým (černé, lesklé a vypouklé obklopené zónou projasnění a opalescentním prstencem) a kolonie s atypickým (bez zóny projasnění, s úzkým bílým okrajem a bez přítomnosti opalescentního prstence) růstem na B-P médiu a tyto kolonie byly dále konfirmovány (koagulázový test, clumping faktor). Všechny izoláty byly testovány na přítomnost genu pro termonukleázu (nuc gen) metodou PCR, která potvrdila nebo vyvrátila zařazení izolátů k druhu S. aureus. Vzorky mléka byly souběžně očkovány na B-P médium a Petrifilm (Noack, A). Kolonie s typickým růstem na Petrifilmu byly vyočkovány na B-P médium a dále konfirmovány výše uvedeným způsobem. Současně byly na obou uvedených médiích sledovány a vyhodnocovány počty S. aureus. Výsledky Celkem bylo vyšetřeno 57 vzorků syrového mléka. Z toho 26 vzorků bylo syrové kozí mléko (u 21 vzorků byl detekován suspektní S. aureus) a 31 vzorků syrové kravské mléko (16 vzorků bylo kontaminováno S. aureus). Suspektní S. aureus izolované z Petrifilmu byly metodou PCR ve všech případech určeny jako S. aureus, zatímco suspektní izoláty z B-P média nebyly metodou PCR vždy potvrzeny. Ze syrového kozího mléka bylo izolováno 28 kmenů S. aureus, ze kterých 22 izolátů tvořilo na B-P médiu atypické kolonie a 6 izolátů typické kolonie. A ze syrového kravského mléka bylo izolováno 21 kmenů S. aureus s typickým profilem kolonií na B-P médiu a 1 kmen S. aureus s atypickým růstem. V jednom vzorku mléka se v některých případech vyskytovaly současně typické i atypické kolonie S. aureus. Ve vzorcích mléka se počty S. aureus řádově pohybovaly od 10 0 do 10 3 KTJ.ml -1 mléka. Počty na Petrifilmu byly vyšší než při kultivaci normovanou mikrobiologickou metodou. Tabulka I Přehled vyšetřených vzorků a počty konfirmovaných (metodou PCR) typických i atypických kolonií Mléko Počet vyšetřených Počet kontaminovaných Konfirmace kolonií z B-P média vzorků vzorků typické atypické Kozí Kravské Celkem Diskuse S. aureus izolovaný ze syrového kozího mléka často tvoří atypické kolonie (ČSN EN ISO , 1999), které lze snadno odečíst jako falešně negativní. Podle požadavků normy ČSN EN ISO (1999) je nutné provést biochemickou konfirmaci 5 typických a 5 atypických kolonií, jsou-li přítomny oba druhy. V případě výskytu obou typů kolonií současně je celkové vyšetření vzorku časově i finančně náročné. Použití Petrifilmu je jednoduché a představuje značnou časovou úsporu a kolonie S. aureus jsou dobře identifikovatelné. Problém může nastat pouze při odečítání intenzity zbarvení zóny vytvořené kolem kolonií po přiložení disku na povrch inkubovaného Petrifilmu různými pracovníky. Každý kmen S. aureus produkuje různé množství DNázy a z tohoto důvodu se jednotlivé zóny liší velikostí a intenzitou zabarvení a vyhodnocující pracovník tak může chybně interpretovat výsledek. Proto je potřeba standardizovat interpretační kritérium pro vyhodnocování Petrifilmů s disky (Silva et al., 2005). DNázová reakce je kromě S. aureus také pozitivní pro S. hyicus a S. intermedius. Tyto dva druhy lze od S. aureus odlišit na základě clumping faktoru (Lancette and Tatini, 1992; Petráš, 2001) nebo metodou PCR testováním na přítomnost genu pro termonukleázu (nuc gen), který je specifický pro S. aureus (Brakstad et al., 1992; Martineau et al., 1998). 262

259 Minimální detekční limit Petrifilmu při izolaci S. aureus je 1 KTJ.ml -1 vzorku. Čím nižší detekční limit je používán, tím se zvyšuje riziko výskytu falešně-pozitivních výsledků. Při použití Petrifilmu je odečítaný počet kolonií S. aureus přesnější (vyšší), než standardní normovanou metodou (Silva et al., 2005). Závěr Průkaz a stanovení počtu S. aureus ze syrového mléka na systému Petrifilm jsou pracovně i finančně méně náročné než kultivace na médiu B-P podle normované mikrobiologické metody. Při použití Petrifilmu se získají výsledky do hodin, při konfirmaci standardními metodami až za 48 hodin. Studie byla financována z Výzkumného záměru MŠMT - Veterinární aspekty bezpečnosti a kvality potravin MSM Použitá literatura 1. ATANASSOVA, V., MEINDL, A., RING, C. Prevalence of Staphylococcus aureus and staphylococcal enterotoxins in raw pork and uncooked smoked ham a comparison of classical culturing detection and RFLP-PCR. International Journal of Food Microbiology, 2001, vol. 68, p BALABAN, N., RASOOLY, A. Staphylococcal enterotoxins. International Journal of Food Microbiology, 2000, vol. 61, p BRAKSTAD, O.G., AASBAKK, K., MAELAND, J.A. Detection of Staphylococcus aureus by polymerase chain reaction amplification of the nuc gene. Journal of Clinical Microbiology, 1992, vol. 30, no. 7, p CONTRERAS, A., LUENGO, C., SÁNCHEZ, A., CORRALES, J. C. The role of intramammary pathogens in dairy goats. Livestock Production Science, 2003, vol. 79, p ČSN EN ISO Mikrobiologie potravin a krmiv Horizontální metoda stanovení počtu koagulázopozitivních stafylokoků (Staphylococcus aureus a další druhy) Část 1: Technika s použitím agarové půdy podle Baird-Parkera. Praha: Český normalizační institut, 1999, s ERCOLINI, D., BLALOTTA, G., FUSCO, V., COPPOLA, S. PCR-based detection of enterotoxigenic Staphylococcus aureus in the early stages of raw milk cheese making. Journal of Applied Microbiology, 2004, vol. 96, p GUIDRY, A., FATTOM, A., PATEL, A., O BRIEN, C. Prevalence of capsular serotypes among Staphylococcus aureus isolates from cows with mastitis in the United States. Veterinary Microbiology, 1997, vol. 59, p LANCETTE, G.A., TATINI, S.R. Staphylococcus aureus, In: Vanderzant C., Splittstoesser F. Compendium of methods for the microbiological examination of foods. Washington: American Public Health Association, ISBN pp. 9. LIM, S., JOO, Y., MOON, J., LEE, A., NAM, H., WEE, S., KOH, H. Molecular typing of enterotoxigenic Staphylococcus aureus isolated from bovine mastitis in Korea. Journal of Veterinary Medical Science, 2004, vol. 66, no. 5, p MARTINEAU, F., PICARD, F.J., ROY, P.H., OULLETTE, M., BERGERON, M.G. Speciesspecific and ubiquitous-dna-based assays for rapid identification of Staphylococcus aureus. Journal of Clinical Microbiology, 1998, vol. 36, no. 3, p PETRÁŠ, P. Latexová detekce clumping (shlukovacího) faktoru u stafylokoků. Zprávy CEM (SZÚ Praha), 2001, roč. 10, č. 10, s

260 12. SILVA, B. O., CARAVIELLO, D. Z., RODRIGUES, A. C., RUEGG, P. L. Evaluation of Petrifilm for the isolation of Staphylococcus aureus from milk samples. Journal of Dairy Science, 2005, vol. 88, no. 8, p SOEJIMA, T., NAGAO, E., KUBOTA, T., YAMAGATA, H., KAGI, H. Comparision between ultrafiltration and trichloroacetic acid precipitation method for concentration of Staphylococcus aureus enterotoxin in dairy samples. International Journal of Food Microbiology, 2004, vol. 93, p ZSCHÖCK, M., BOTZLER, D., BLÖCHER, S., SOMMERHÄUSER, J., HAMANN, H.P. Detection of genes for enterotoxins (ent) and toxic shock syndrome toxin-1 (tst) in mammary isolates of Staphylococcus aureus by polymerase-chain-reaction. International Dairy Journal, 2000, vol. 10, p Kontaktní adresa: Ing. Markéta Pospíšilová Ústav hygieny a technologie mléka, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno Palackého 1 3, Brno mpospisilova@vfu.cz 264

261 SUBLETÁLNÍ POŠKOZENÍ A DETEKCE CANDIDA UTILIS DMF 1021 A KLUYVEROMYCES MARXIANUS VAR. MARXIANUS DMF 1005 Šviráková Eva 1, Linda Horníková 1, Jaromír Fiala 2, Plocková Milada 1 1 Ústav technologie mléka a tuků, 2 Ústav kvasné chemie a bioinženýrství, VŠCHT Praha SUBLETHAL INJURY AND DETECTION OF CANDIDA UTILIS DMF 1021 AND KLUYVEROMYCES MARXUANUS VAR. MARIANUS DMF 1005 Summary: This work was directed to study the effect of physical (heating, freezing) and chemical (EDTA, mixture of organic acids, NaCl, nisin) stress factors to the growth and viability of two yeast strains of Candida utilis DMF 1021 and Kluyveromyces marxianus var. marxianus DMF 1005 and to consequential detection of these strains after sublethal injuries. For the detection of yeast strains after their sublethal injuries were used the flow cytometry and the microscopy. The maximal inhibitive effects on the growth of both yeast strains (99% reduction relative to their original cell populations) were reached with the EDTA effect (20 mmol l -1 ), acting separately. The addition of nisin (2.5 mg l -1 ) decreased the inhibitory effect of EDTA on both tested strains. Partial cell reparations of both tested strains treated by EDTA and also by EDTA with nisin occurred after a two-hour incubation in the reparation solutions containing pyruvic acid, Mg 2+ and Mn 2+ ions. Reparations were more successful for cells treated by EDTA and nisin for both tested strains. Determination of the behaviour of sublethally injured yeasts can be achieved using combinations of different detection methods, for example the flow cytometry and the plate method with some selective and non-selective media. Úvod Technologicky významné a nežádoucí mikroorganismy jsou často subletálně nebo letálně poškozovány v potravinářském průmyslu během různých technologických operací (např. záhřevu, mrazení, přídavku přírodních nebo chemických antimikrobiálně působících látek). Nežádoucí, subletálně poškozené mikroorganismy přítomné v potravinách se mohou za vhodných podmínek reparovat a následně tak způsobit kažení potravin. Buňky subletálně poškozených mikroorganismů je obtížné odlišit od mrtvých buněk pomocí běžných mikroskopických metod a testů. Moderními metodami pro detekci subletálně poškozených mikroorganismů (např. bakterií a kvasinek) pocházejících z potravin se řadí průtoková cytometrie, metoda využívající fluorescenční sondu, spektrofotometrická metoda, mikroskopická metoda, polymerasová řetězová reakce a plotnová metoda s různými modifikacemi. Cíle práce Tato práce byla zaměřena na účinek samostatně působících chemických (EDTA, směs organických kyselin, NaCl, nisin) a fyzikálních (záhřev, mrazení) stresových faktorů nebo jejich kombinací na růst a životaschopnost dvou kvasinkových kmenů Candida utilis DMF 1021 a Kluyveromyces marxianus var. marxianus DMF 1005, a na detekci subletálně poškozených kvasinek průtokovou cytometrií a mikroskopicky. Materiál a metody Použité kvasinkové kmeny. Pro práci byly použity dva kvasinkové kmeny Candida utilis DMF 1021 (Sbírka mikroorganismů, Ústav biochemie a mikrobiologie, VŠCHT v Praze, ČR) (dále jen C. utilis) a Kluyveromyces marxianus var. marxianus DMF 1005 (Sbírka čistých mlékařských mikroorganismů Laktoflora, Milcom a.s., Praha, ČR) (dále jen K. marxianus). Oba kmeny rostly (1% obj. inokulum) v bujónu s maltosovým extraktem (Oxoid, Basingstoke, VB) při teplotě 25 C po dobu 3 dnů za aerobních podmínek. Pro stanovení počtu kvasinek byla použita plotnová metoda (ČSN/ISO 7954 (560089), 1994); kultivace kvasinek probíhala na agaru s maltosovým extraktem (Oxoid, Basingstoke, VB) při teplotě 25 C po dobu 5 dnů za aerobních podmínek. 265

262 Subletální poškození kvasinek působením EDTA. Kmeny C. utilis a K. marxianus byly kultivovány (1% obj. inokulum) v bujónu s maltosovým extraktem s EDTA (7440 mg.l -1 ) při teplotě 25 C po dobu 3 dnů. Růst kvasinek v procentech (rovnice 1) byl vypočítán z naměřených hodnot absorbancí (A 615 ) a počtu jednotek tvořících kolonie (JTK.ml -1 ). Růst buněk [%] = A615 (x) / A615 (o) x 100 (rovnice 1). Absorbance A615 (x) představuje absorbanci kvasinkové kultury v bujónu s maltosovým extraktem s EDTA (7440 mg.l -1 ) za existujících kultivačních podmínek (absorbance byla měřena oproti sterilnímu bujónu s maltosovým extraktem s EDTA (7440 mg.l -1 )). Absorbance A 615 (o) představuje absorbanci kvasinkové kultury, která byla kultivována v bujónu s maltosovým extraktem za existujících kultivačních podmínek (absorbance byla měřena oproti sterilnímu bujónu s maltosovým extraktem). Subletální poškození kvasinek působením směsi organických kyselin. Kmeny C. utilis a K. marxianus byly kultivovány (1% obj. inokulum) v bujónu s maltosovým extraktem se směsí organických kyselin při teplotě 25 C po dobu 3 dnů. Pro přípravu směsi organických kyselin byly použity koncentrované roztoky následujících kyselin: kyselina mléčná (98 % hm.), kyselina octová (99 % hm.), kyselina propionová (99 % hm.) (všechny chemikálie: Sigma-Aldrich, St. Louis, USA), které byly v poměru 40:16:16 % (obj.) smíchány se sterilní destilovanou vodou (ph 5,5) (Kalchayanand et al., 1992). Finální koncentrace organických kyselin v bujónu s maltosovým extraktem byly: kyselina mléčná (272 mg.l -1 ), kyselina octová (1030 mg.l -1 ), kyselina propionová (835 mg.l -1 ). Růst kvasinkových kmenů v procentech (rovnice 1), po jejich subletálních poškozeních směsí organických kyselin, byl počítán z naměřených hodnot absorbancí (A 615 ) a počtu jednotek tvořících kolonie (JTK.ml -1 ). Subletální poškození kvasinek působením chloridu sodného. Kmeny C. utilis a K. marxianus byly kultivovány (1% obj. inokulum) v bujónu s maltosovým extraktem s NaCl (6 % hm.) (na základě experimentálně zvolených podmínek) (Oxoid, Basingstoke, VB) při teplotě 25 C po dobu 3 dnů. Růst kvasinkových kmenů v procentech (rovnice 1), po jejich subletálních poškozeních chloridem sodným, byl počítán z naměřených hodnot absorbancí (A 615 ) a počtu jednotek tvořících kolonie (JTK.ml -1 ). Subletální poškození kvasinek záhřevem. Kmeny C. utilis a K. marxianus byly subletálně poškozené záhřevem (na vodní lázni) při teplotě 63 C po dobu 5 min (na základě experimentálně zvolených podmínek). Růst kvasinkových kmenů v procentech (rovnice 1), po jejich subletálních poškozeních záhřevem, byl počítán z naměřených hodnot absorbancí (A 615 ) a počtu jednotek tvořících kolonie (JTK.ml -1 ). Subletální poškození mrazením. Kmeny C. utilis a K. marxianus byly subletálně poškozené mrazením (v mrazícím boxu) při teplotě 18 C po dobu 24 h (na základě experimentálně zvolených podmínek). Růst kvasinkových kmenů v procentech (rovnice 1), po jejich subletálních poškozeních mrazením, byl počítán z naměřených hodnot absorbancí (A 615 ) a počtu jednotek tvořících kolonie (JTK.ml -1 ). Stanovení účinku nisinu na nepoškozené kvasinky. Kmeny C. utilis a K. marxianus byly zaočkovány (1% obj. inokulum) do bujónu s maltosovým extraktem s nisinem (0; 0,0025; 0,0250; 0,2500; 2,5000 mg.l -1 ), kde následně rostly při teplotě 25 C po dobu 3 dnů. Byly měřeny absorbance (A 615 ) suspenzí kvasinek a byl počítán růst kvasinkových kmenů v procentech (rovnice 1). U kvasinek byl také stanoven jejich počet (JTK.ml -1 ). Stanovení účinku nisinu na subletálně poškozené kvasinky. Subletálně poškozené kmeny C. utilis a K. marxianus byly kultivovány (1% obj. inokulum) v bujónu s maltosovým extraktem s nisinem (2,5 mg.l -1 ) při teplotě 25 o C po dobu 3 dnů. Růst kvasinek v procentech (rovnice 1) byl počítán z naměřených hodnot absorbancí (A 615 ) a počtu jednotek tvořících kolonie (JTK.ml -1 ). 266

263 Reparace subletálně poškozených kvasinek. Pro reparaci kmenů C. utilis a K. marxianus byl použit vodný reparační roztok (ph 7) obsahující následující chemikálie: MgSO 4.7 H 2 O (0,1 % hm.), MnSO 4 (0,1 % hm.), KH 2 PO 4 (0,5 % hm.), kyselinu pyrohroznovou (0,1 % hm.) (všechny chemikálie: Sigma-Aldrich, St. Louis, USA). Poškozené kvasinky byly odstředěny (4000 ot.min -1, 4 C, 15 min) a suspendovány v reparačním roztoku. Kvasinky byly po reparaci zaočkovány (1% obj. inokulum) do bujónu s maltosovým extraktem a následně kultivovány při teplotě 25 o C po dobu 3 dnů. Růst kvasinek v procentech (rovnice 1) byl počítán z naměřených hodnot absorbancí (A 615 ) a počtu jednotek tvořících kolonie (JTK.ml -1 ). Detekce subletálně poškozených kvasinek průtokovou cytometrií. Subletálně poškozené kvasinky byly detekovány během následujících experimentálních kroků: po subletálním poškození buněk konkrétním chemickým nebo fyzikálním stresem; po následném působení nisinu na poškozené buňky; po reparaci buněk. Subletálně poškozené buňky kmenů C. utilis a K. marxianus byly detekovány průtokovou cytometrií (Crissman et al., 1985) za použití propidium jodidu jako fluorescenčního barviva. Pro tuto práci byl použit průtokový cytometr PAS III využívající software Partec Flo Max (Partec, SRN). Procenta živých, mrtvých a subletálně poškozených kvasinek byla stanovena na základě intenzity fluorescence buněčných obsahů (DNA). Detekce subletálně poškozených kvasinek mikroskopicky. Subletálně poškozené kvasinky byly detekovány během následujících experimentálních kroků: po subletálním poškození buněk konkrétním chemickým nebo fyzikálním stresem; po následném působení nisinu na poškozené buňky; po reparaci buněk. Subletálně poškozené buňky kmenů C. utilis a K. marxianus byly detekovány mikroskopicky (Woo et al., 2000). Pro tuto práci byl použit optický, laboratorní mikroscop DMLS (Leica, SRN) (100-násobné zvětšení objektivem) s analogovou kamerou (10-ti násobné zvětšení kamerou). K následným úpravám nasnímaných mikroskopických obrazů byl použit software Lucia G (750 krát 550 pixelů). Mikroskopické preparáty kvasinek byly před mikroskopováním fixovány teplem a obarveny methylenovou modří (Harrigan, 1998). Výsledky 120 C. utilis K. marxianus ,4 94,8 Růst buněk [%] ,8 69,9 51,4 51,4 81,8 76, Kontrola Záhřev Mrazení EDTA Organické kyseliny Obr. 1 Účinek samostatného působení fyzikálních (záhřev, mražení) a chemických (EDTA, organické kyseliny, NaCl) stresových faktorů na růst kvasinkových kmenů C. utilis DMF 1021 a K. marxianus var. marxianus DMF ,9 NaCl 267

264 120 C. utilis K. marxianus ,3 85,9 88,3 90,3 Růst buněk [%] ,4 65, Kontrola Nisin EDTA EDTA + reparace 1 1,9 4,4 4,4 EDTA + nisin EDTA + nisin + reparace Obr. 2 Přímý účinek nisinu (2,5 mg.l -1 ), účinek EDTA (7440 mg.l -1 ), účinek EDTA (7440 mg.l -1 ) s následným působením nisinu (2,5 mg.l -1 ) a účinek reparační procedury po kultivaci kvasinkových kmenů C. utilis DMF 1021 a K. marxianus var. marxianus DMF 1005 v bujónu s maltosovým extraktem při teplotě 25 o C po dobu 3 dnů ,5 94,7 106,4 103,6 C. utilis K. marxianus 103,3 95,7 94,3 85,9 Růst buněk [%] ,0000 0,0025 0,0250 0,2500 2,5000 Koncentrace nisinu [mg.l -1 ] Obr. 3 Přímý účinek nisinu (0; 0,0025; 0,0250; 0,2500; 2,5000 mg.l -1 ) na nepoškozené buňky kvasinkových kmenů C. utilis DMF 1021 a K. marxianus var. marxianus DMF 1005 po jejich po kultivacích v bujónu s maltosovým extraktem s nisinem při teplotě 25 o C po dobu 3 dnů. 268

265 Tabulka I Detekce subletálně poškozených kvasinkových kmenů C. utilis DMF 1021 a K. marxianus var. marxianus DMF 1005 průtokovou cytometrií (subletální poškození kmenů působením EDTA (7440 mg.l -1 ) Kmen Živé buňky [%] Mrtvé buňky [%] Subletálně poškozené buňky [%] EDTA (7440 mg.l -1 ) Candida utilis DMF 1021 EDTA + nisin (2,5 mg.l -1 ) Finální reparace (25 o C/ 2 h) Kluyveromyces marxianus var. marxianus DMF 1005 EDTA (7440 mg.l -1 ) EDTA + nisin (2,5 mg.l -1 ) Finální reparace (25 o C/ 2 h) 89,90 96,70 98,70 67,50 97,40 78,90 4,40 2,00 0,70 22,20 1,00 12,10 5,70 1,30 0,60 10,30 1,60 9,00 Závěry Maximálního inhibičního účinku na růst obou kvasinkových kmenů (99,0% redukce růstu kmene C. utilis a 98,1% redukce růstu kmene K. marxianus) bylo dosaženo působením EDTA (7440 mg.l -1 ). Maximálního inhibičního účinku na růst obou nepoškozených kvasinkových kmenů C. utilis a K. marxianus bylo dosaženo přímým působením nisinu (2,5 mg.l -1 ). Kvasinky vykazovaly k přímému účinku nisinu (0; 0,0025; 0,0250; 0,2500; 2,5000 mg.l -1 ) pouze nepatrnou citlivost. Růst subletálně poškozených kvasinek byl stimulován proteiny a uhlíkatými sloučeninami pocházejícími z nisinového preparátu Nisaplin (2,5 mg nisinu.l -1 ). Pro detekci subletálně poškozených kvasinkových kmenů C. utilis a K. marxianus byla úspěšně použita průtoková cytometrie a mikroskopie. Tato práce byla podpořena Ministerstvem školství, mládeže a tělovýchovy (Výzkumný záměr MSM ). Použitá literatura: Crissman H.A., Steinkamp, J.A.: Cytometry. Science 28, 1321 (1985) Harrigan W.F.: Laboratory Methods in Food Microbiology, s Academic Press Limited, London Kalchayanand N., Hanlin M.B., Ray B.: Sublethal injury makes Gram-negative and resistant Grampositive bacteria sensitive to the bacteriocins, pediocin AcH and nisin. Lett. Appl. Microbiol. 15, č. 6, (1992). Woo I.S., Rhee I.K., Park H.D.: Differential damage in bacterial cells by microwave radiation on the basis of cell wall structure. Appl. Environ. Microbiol. 66, č. 5, (2000). ČSN (560087)/ ISO 7954: Mikrobiologie. Všeobecné pokyny pro stanovení počtu kvasinek a plísní. Technika počítání kolonií vykultivovaných při 25 o C. ČNI, Praha Kontaktní adresa: Eva Šviráková, Ústav technologie mléka a tuků, FPBT, VŠCHT v Praze, Technická 5, Praha 6, Česká republika, tel: , fax: , Eva.Svirakova@vscht.cz 269

266

267

268 Specialisté v oboru molekulové spektroskopie FT-NIR analyzátory potravinářských výrobků Stanovení běžných parametrů potravinářských výrobků za několik minut, bez destrukce vzorku a potřeby chemikálií. Zakázkový vývoj metod, včetně automatizace stanovení, bezplatné předvedení přístrojů s možností měření vlastních vzorků. Aplikační, servisní a obchodní středisko: Nicolet CZ s.r.o. Nad Trnkovem Praha 10 T/F: , Mobil: 602/325829, 603/554788, 603/ ThermoNicolet FTIR, FTNIR, Raman, Microscopy Kvalita spektrometrů Nicolet ověřena více než 200 uživateli v ČR a SR.

269