STRUKTURA A FUNKCE PLAZMIDŮ KLINICKY VÝZNAMNÝCH KMENŮ STAPHYLOCOCCUS AUREUS

Transkript

1 MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE STRUKTURA A FUNKCE PLAZMIDŮ KLINICKY VÝZNAMNÝCH KMENŮ STAPHYLOCOCCUS AUREUS Dizertační práce Lucie Kuntová Vedoucí práce: Prof. RNDr. Jiří Doškař, CSc. Brno 2013

2 Bibliografický záznam Autor: Název práce: Studijní program: Mgr. Lucie Kuntová Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav experimentální biologie Struktura a funkce plazmidů klinicky významných kmenů Staphylococcus aureus Biologie Studijní obor: Molekulární a buněčná biologie Vedoucí práce: Prof. RNDr. Jiří Doškař, CSc. Akademický rok: 2012/2013 Počet stran: 74+4 Klíčová slova: Staphylococcus aureus, horizontální přenos genů, plazmidy, mobilní genetické elementy, klonální skupina, bakteriofágy

3 Bibliographic Entry Author: Title of Thesis: Degree programme: Mgr. Lucie Kuntová Faculty of Science, Masaryk University Department of Experimental Biology Structure and function of plasmids from clinical important Staphylococcus aureus strains Biology Field of Study: Molecular and Cellular Biology Supervisor: Prof. RNDr. Jiří Doškař, CSc. Academic Year: 2012/2013 Number of Pages: 74+4 Keywords: Staphylococcus aureus, horizontal gene transfer, plasmid, mobile genetic elements, clonal cluster, bacteriophages

4 Abstrakt Mobilní genetické elementy (MGE) tvoří zásadní složku variabilní části bakteriálního genomu. U druhu Staphylococcus aureus se podílí na multirezistenci a virulenci kmenů a poskytují tak evoluční výhodu, která spolu s dalšími faktory vede k vytvoření vysoce klonálního charakteru populace S. aureus. Z hlediska přenosu genů rezistence k antimikrobiálním látkám jsou nejvýznamnějšími zástupci MGE plazmidy. Tato práce přináší ucelenou informaci o obsahu a charakteru plazmidů v populaci S. aureus v České republice. Reprezentativní soubor 73 kmenů byl získán z 15-ti českých nemocnic v letech Kombinací mikrobiologických a molekulárně biologických metod bylo zjištěno, že v analyzovaném souboru kmenů bylo 24 různých typů plazmidů o velikostech v rozmezí od 1,3 do 55 kb. 89 % kmenů obsahovalo jeden nebo více plazmidů. Dále bylo stanoveno, že obsah konkrétních typů plazmidů ve většině případů koreluje s příslušností kmene k určité klonální skupině (clonal cluster, CC), případně se plazmidy vyskytují u příbuzných klonů dle zásad variability restrikčně modifikačních (RM) systémů tak, jak je popsal Corvaglia a kol. (2010). Byla stanovena kompletní sekvence tří plazmidů pdlk1-3. Srovnávací analýza sekvencí plazmidů pdlk1 a pdlk2 v databázi GenBank ukázala, že tyto plazmidy existují v populaci S. aureus v téměř nezměněné podobě již desítky let, což svědčí o jejich strukturní a evoluční stabilitě. pdlk3 je mozaikovitý kryptický plazmid, který nese geny pro několik replikačních proteinů a také analog orit místa, které je zásadní pro iniciaci přenosu plazmidů. Dále byly v souboru zjištěny velké (>20 kb) penicilinázové plazmidy a plazmid nesoucí gen pro enterotoxin D, malé plazmidy kódující rezistenci k erytromycinu, tetracyklinu nebo chloramfenikolu a řada kryptických plazmidů. V souboru kmenů epidemického klonu USA300 bylo experimentálně prokázáno, že jedním z hlavních vektorů přenosu plazmidů jsou transdukující fágy, a to jak laboratorní, tak fágy přirozeně se vyskytující v kmenech. Metodou qpcr byla prokázána vysoká frekvence sbalování plazmidů do fágových částic 10-5 CFU/PFU. Rovněž bylo prokázáno, že geny rezistence nesené na plazmidech se transdukcí nejen přenesou do nové hostitelské buňky, ale je zachována i jejich exprese. Celkově práce přináší podrobnou informaci o výskytu, charakteru a přenosu plazmidů v české populaci S. aureus. Výsledky přispěly k bližšímu pochopení klonální struktury a evolučních vztahů mezi kmeny a mohou se stát podkladem pro vypracování systému kontroly šíření viruentních faktorů a genů rezistence k antimikrobiálním látkám, které významně zvyšují patogenitu těchto kmenů.

5 Abstract Mobile genetic elements (MGEs) represent a substantial part of variable part of bacterial genome. MGEs contribute to multiresistance and virulence of Staphylococcus aureus strains and together with other factors lead to highly clonal character of S. aureus population. As far as antimicrobial resistance genes transfer is concerned the most important MGE type are plasmids. This study provides comprehensive information about plasmid content of S. aureus population in Czech Republic. For this purpose, we collected 73 strains from 15 Czech hospitals in By combination of microbiological and molecular biological methods it was found, that there were 24 different plasmid types in range from 1.3 to 55 kb in the analyzed set of strains, and that 89 % of S. aureus isolates contained one or more plasmid types. We also found, that occurrence of particular plasmid types was in most cases in correlation with certain clonal clusters (CC) or that individual plasmid types were harboured by strains classified to cognate CC based on the variability in their restriction modification (RM) systems as described by Corvaglia a kol. (2010). We determined sequences of three plasmids pdlk1-3. A comparative sequence analysis showed, that plasmids pdlk1 and pdlk2 occurred in S. aureus population in nearly unchanged form for dozen of years, which give an evidence about their structure and evolutionary stability. pdlk3 was cryptic plasmid with highly mosaic structure, that carried genes coding for several replication proteins as well as a site for plasmid transfer initiation orit. We also found many large (>20 kb) penicillinase plasmids and enterotoxin D positive plasmid, small plasmids coding for erythromycin, tetracycline or chloramphenicol resistance, and cryptic plasmids in analysed strain collection. In the set of strains classified to epidemic clone USA300 we experimentally proved, that both laboratory and naturally occurring transducing bacteriophages represent one of the main plasmid transfer vectors. By qpcr method, the high frequency (10-5 CFU/PFU) of packaging of plasmids into phage particles was established. We also demonstrated, that expression of plasmid bore genes transduced to new host cell is preserved. Altogether our study provides detailed description of occurrence, types and transfer of plasmids in Czech population of S. aureus. Our results contribute to further understanding of clonal structure and evolution of S. aureus strains and on the basis of our data it could be developed a new control system for preventing the spread of staphylococcal virulence and resistance factors.

6 Poděkování Na tomto místě bych ráda poděkovala svému školiteli Prof. RNDr. Jiřímu Doškařovi, CSc. za jeho cenné rady a připomínky v průběhu celého mého postgraduálnho studia. Dále bych ráda poděkovala Doc. RNDr. Romanu Pantůčkovi, Ph.D., doc. RNDr. Vladislavě Růžičkové, CSc., Daně Kadaňkové a celému kolektivu Laboratoře molekulární diagnostiky mikroorganismů za veškerou odbornou i přátelskou pomoc. V neposlední řadě moje poděkování patří mým rodičům za podporu v průběhu celého mého studia na Masarykově univerzitě. Lucie Kuntová, Masarykova univerzita, 2013

7 Obsah: Obsah:... 7 Seznam použitých zkratek Úvod Charakteristika druhu Staphylococcus aureus a jeho taxonomické zařazení Staphylococcus aureus rezistentní k meticilinu Stafylokoková chromozomová kazeta SCCmec Klonální struktura populace S. aureus Genom S. aureus Charakteristika plazmidů S. aureus Procesy ovlivňující obsah plazmidů v hostitelské buňce u S. aureus Inkompatibilita plazmidů S. aureus Restrikčně modifikační systémy (RMS) Vliv vnějšího prostředí Horizontální přenos plazmidových genů u stafylokoků Transdukce Fágem zprostředkovaná konjugace Konjugace a mobilizace Mezidruhový přenos plazmidů Cíle Materiál a metody Výsledky ve vložených publikacích I. Characteristics and distribution of plasmids in a clonally diverse set of methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains II. Bacteriophages of Staphylococcus aureus efficiently package various bacterial genes and mobile genetic elements including SCCmec with different frequencies III. Efficient transfer of antibiotic resistance plasmids by transduction within methicillinresistant Staphylococcus aureus USA300 clone Diskuse Závěr Literatura Příloha Příloha č. 1 Evoluční model vzniku MRSA klonů CC5, CC8, CC22, CC30, CC45 podle Robinsona a Enrighta Příloha č. 2 Dodatkový materiál k publikaci Kuntová a kol., 2012 (supplementary material)

8 Seznam použitých zkratek CA-MRSA - Community Acquired - methicillin resistant Staphylococcus aureus, meticilin-rezistentní Staphylococcus aureus, komunitní meticilin rezistentní Staphylococcus aureus CC - Clonal Cluster, klonální skupina CCC - covalently closed circle, uzavřená cirkulární forma (plazmidu) ccr - cassette chromosome recombinase CFU - colony forming units, jednotky tvořící kolonie CO-MRSA - Community Onset - methicillin resistant Staphylococcus aureus, meticilin rezistentní Staphylococcus aureus pocházející z komunity DNA - deoxyribonucleic acid, deoxyribonukleová kyselina dso - double-strand origin, dvouřetězcový počátek replikace ETB - exfoliativní toxin B HA-MRSA - Hospital Acquired - methicillin resistant Staphylococcus aureus, nemocniční Staphylococcus aureus rezistentní k meticilinu Inc - incompatibility, inkompatibilní skupina (plazmidů) J-region - Junkyard region LA-MRSA - Livestock Associated - methicillin resistant Staphylococcus aureus, Staphylococcus aureus rezistentní k meticilinu asociovaný s živočišnou výrobou MGE - mobile genetic element, mobilní genetický element MIC - minimal inhibitory concentrations, minimální inhibiční koncentrace MRSA - methicillin resistant Staphylococcus aureus, Staphylococcus aureus rezistentní k meticilinu MSSA - methicillin sensitive Staphylococcus aureus, Staphylococcus aureus citlivý k meticilinu OC - open circular, otevřená cirkulární forma (plazmidu) ORF - open reading frame, otevřený čtecí rámec PCR - polymerase chain reaction, polymerázová řetězová reakce PFU - plaque forming unit, jednotka tvořící plaky qpcr - quantitative polymerase chain reaction in real time, kvantitativní polymerázová řetězová reakce v reálném čase RCR - rolling circle replication, replikace otáčivou kružnicí 8

9 RMS - restrikčně modifikační systémy RNA - ribonucleic acid, ribonukleová kyselina SCCmec - Staphylococcal Cassette Chromosome mec, stafylokoková chromozomální kazeta mec sso - single-strand origin, jednořetězcový počátek replikace ST - Sequence Type, sekvenční typ 9

10 1. Úvod 1.1. Charakteristika druhu Staphylococcus aureus a jeho taxonomické zařazení Staphylococcus aureus byl poprvé popsán a pojmenován roku 1884 F. Rosenbachem. Jeho taxonomické zařazení je následující: Říše: Eubacteria Kmen: Firmicutes Třída: Bacilli Řád: Bacillales Čeleď: Staphylococcaceae Rod: Staphylococcus Druh: Staphylococcus aureus Poddruh: Staphylococcus aureus subsp. anaerobious Poddruh: Staphylococcus aureus subsp. aureus Jedná se o grampozitivní, nesporulující, nepohyblivé a většinou neopouzdřené sférické koky o průměru asi 1 µm. Zlatavá barva kolonií, ve škále od bílé po sytě žlutou, dala tomuto druhu název aureus. Rostou na běžných kultivačních půdách.velmi dobře snášejí zvýšený obsah solí, čehož se využívá k přípravě selektivní půdy s obsahem 10% NaCl. Na základě produkce koagulázy je S. aureus řazen do skupiny koaguláza pozitivních stafylokoků. Z klinického hlediska je významná jeho schopnost tvořit biofilm, který tomuto druhu umožňuje lépe odolávat antibiotické terapii a rovněž významným způsobem ovlivňuje horizontální přenos genů, a to jak v rámci druhu S. aureus, tak mezidruhově (Weigel a kol., 2007). Dalším klinicky významným faktorem je jeho afinita k pojivovým tkáním a schopnost tvořit abscesy (Cheng a kol., 2011). Z výše uvedených vlastností je patrné, že S. aureus je mnohostranný patogen, a to jak humánní, tak zvířecí, který způsobuje infekce v rozsahu od relativně mírných zánětů kůže a měkkých tkání, až po život ohrožující sepse, nekrotizující pneumonie nebo syndrom toxického šoku a další toxikózy. Podrobný přehled onemocnění způsobených S. aureus je uveden v tab. 1. Přítomnost kmenů však ještě nemusí znamenat ohrožení hostitele. Literatura uvádí, že až 1/3 populace jsou tzv. bezpříznakoví nosiči, kdy 10

11 ložisko je nejčastěji v nose těchto osob. Většina lidí se navíc během života stane tzv. dočasným nosičem, aniž pozoruje zdravotní problémy. Tabulka 1: Přehled onemocnění způsobených kmeny Staphylococcus aureus. Infekce kůže a podkoží Hluboké a systémové infekce Toxikózy Furunkly (vředy nebo infekce vlasových folikulů) Impetigo (povrchová infekce kůže) Celulitidy (infekce dermis a podkožní tkáně) Osteomyelitida (infekce kostní dřeně, která může vést až k rozpuštění kosti s nutností umělé náhrady př. obratle, pooperační infekce umělé náhrady kyčelního kloubu apod. Endokarditida (infekce srdečních chlopní, může vést až k devastaci tkáně s nutností použití umělé chlopně) Sekundární pneumonie (nekrotizující zánětlivé onemocnění plic, které nastupuje po předchozí nejčastěji virové infekci plic) Celková sepse (infekce krevního řečiště, často spojeno s embolizací do kůže) Infekce chirurgických ran a invazivních pomůcek (např. katétrů) Akutní otravy z jídla (spojeno s produkcí enterotoxinů) Syndrom toxického šoku (spojeno s produkcí toxinu syndromu toxického šoku, což je silný superantigen nespecificky stimulující T-lymfocyty a tím silnou zánětlivou odpověď organismu, což vede k multiorgánovému selhání; rozlišuje se menstruační (spojeno s užíváním vaginálních tamponů) a nemenstruační forma Syndrom opařené kůže (SSSS) (spojeno s produkcí exfoliativních toxinů, jde o plošnou epidermolýzu) 1.2. Staphylococcus aureus rezistentní k meticilinu Za MRSA (methicillin resistant Staphylococcus aureus) je považován kmen S. aureus vykazující minimální inhibiční koncentraci (MIC) pro meticilin 4 mg/l (Tiemersma a kol., 2004). Meticilin je syntetické antibiotikum β-laktamového typu, které bylo vyvinuto v 60. letech 20. stol. jako alternativa ke klasickým penicilinovým antibiotikům, která přestávala být účinná v důsledku zvyšujícího se počtu kmenů produkujících β-laktamázu. Již v prvním roce po zavedení meticilinu do praxe byly však zaznamenány první kmeny S. aureus s redukovanou citlivostí k tomuto antibiotiku. Od té doby se MRSA stal celosvětovým problémem nejdříve především v nemocnicích, kde jsou tyto kmeny detekovány převážně v 11

12 centrech pro popáleniny, odkud se popřípadě šíří do dalších oddělení (Hanslianová, 2003). Jako nejčastější cesta přenosu těchto nozokomiálních kmenů jsou uváděny ruce ošetřujícího personálu. Léčba meticilin rezistentního Staphylococcus aureus je velmi obtížná, protože tento patogen je obvykle rezistentní k širokému spektru antibiotik (všechna β-laktamová antibiotika, tetracykliny, aminoglykozidy, makrolidy). V posledních letech se však stále častěji objevují izoláty, které nepocházejí z prostředí nemocnice. Tyto kmeny jsou označovány jak komunitní (odtud označení CA-MRSA). Podrobný přehled a charakteristika skupin MRSA kmenů, které jsou rozlišované v současné odborné literatuře je uveden v tab. 2. Tabulka 2: Přehled a charakteristika skupin MRSA kmenů. Označení Anglický název (český ekvivalent) Charakteristika HA-MRSA CA-MRSA CO-MRSA LA-MRSA Hospital Acquired- (nemocniční/nozokomiální) Community Acquired- (komunitní) Community Onset- (pocházející z komunity) Livestock Associated (asociovaný s živočišnou výrobou) - kmeny pocházející z prostředí nemocnice - typicky multirezistentní k antibiotikům - typicky SCCmec kazeta typu I, II, III - omezený počet klonů (v jedné geografické lokalitě často jen 1 nebo 2 klony), nejčastěji spadají do jedné z následujících klonálních skupin (CC) CC5, 8, 22, 30, 45 - kmeny pocházející z komunity, kde také způsobují onemocnění - typicky citlivé k antibiotikům (kromě rezistence k β-laktamovým antibiotikům), objevuje se rezistence k makrolidům nebo tetracyklinu - typicky SCCmec kazeta typu IV, V, VI, VII a jejich varianty - typicky nesou gen pro Pantonův-Valentinův leukocidin (PVL) - omezený počet klonů, nejčastěji spadají do jedné z následujících klonálních skupin (CC) CC1, 30, 59, 80, 93, 8 - kmeny komunitního původu, které osídlily nemocniční prostředí a jsou pak původci nozokomiálních infekcí - ostatní charakteristiky viz. CA-MRSA - kmeny asociované s živočišnou výrobou - typicky rezistentní k antibitoikům používaným ve veterinární medicíně, jako jsou β-laktamy a tetracykliny - typicky SCCmec kazeta typu V - typická klonální skupina CC398 Použitá literatura: Robinson a Enright, 2003, Tristan a kol., 2007, Gordon a kol., 2008, Skov a kol., 2009, Golding a kol., 2010, Schulz a kol.,

13 Podíl izolátů S. aureus rezistentních k meticilinu v České republice tak, jak byl zpracován v databázi EARS-Net (European Antimicrobial Resistance Surveillance Network, dříve EARSS), je přehledně uveden v tab. 3. V rámci Evropy je pozorován severojižní gradient výskytu tohoto závažného patogena. Vysoký výskyt je zaznamenáván v Jižní Evropě, kde již byla překročena 25% hranice, zatímco v severských státech jako je Norsko nebo Švédsko je MRSA potvrzen méně než v 5% izolátů S. aureus. Tabulka 3: Citlivost izolátů Staphylococcus aureus k meticilinu v České republice v letech Rok izolace N R % R % % % % % % % % % % % N - celkový počet izolátů, R - počet rezistentních izolátů, % R - procentuální zastoupení rezistentních izolátů Zdroj (upraveno): Stafylokoková chromozomová kazeta SCCmec Evoluční studie ukazují, že MRSA vznikl z meticilin citlivého S. aureus (MSSA), do jehož genomu byla integrována stafylokoková chromozomová kazeta SCCmec (Robinson a kol., 2003, Lencastre a kol., 2007). Jedná se o mobilní genetický element o velikosti v rozmezí od 21 kb do 67 kb, který obsahuje genový komplex meca a dále genový komplex ccr (cassette chromosome recombinase), který kóduje místně specifické rekombinázy zodpovědné za mobilitu tohoto genetického elementu. Gen meca kóduje alternativní penicilin vázající protein 2a (PBP2a) s nízkou afinitou k β-laktamovým antibiotikům, což konkrétně vede k rezistenci k meticilinu, oxacilinu a cefoxitinu. Je známo jedenáct základních typů této kazety, které jsou charakterizovány specifickou kombinací genových komplexů ccr a meca (Hiramatsu a kol., 2001, Ito a kol., 2004, Hanssen a kol., 2006), přičemž dosud bylo popsáno 13

14 8 různých ccr komplexů a 6 tříd komplexu meca. Oblast mimo tyto dva komplexy je označována jako J-region (Junkyard region), obsahuje různé geny nebo pseudogeny, z nichž mnohé jsou derivovány z plazmidů nebo transpozonů. Na základě J-regionu jsou definovány varianty SCCmec typů. V současné době jsme však svědky evoluce tohoto elementu, což je spojeno s expanzí nových variant SCCmec. V některých typech SCCmec jsou navíc integrovány další mobilní genetické elementy. Jde především o transpozony (např. Tn554 u SCCmec typů II, III, IIIA), IS elementy (IS 431) a plazmidy (pt181 u SCCmec typu III, pub110 u SCCmec typu II (Milheirico a kol., 2007). Chromozomová kazeta SCCmec byla do genomu stafylokoka začleněna pravděpodobně z jiného druhu bakterií zatím neznámým způsobem. V případě elementů menších než 45 kb je za možný způsob přenosu považována obecná transdukce. Jako možné zdroje jsou uváděny především koaguláza-negativní stafylokoky (Brakstad and Mæland, 1997, Jeljaszewicz a kol., 1998). Za možného evolučního předchůdce genu meca je označován buď druh Staphylococcus sciuri nebo Staphylococcus hominis (Wu a kol., 2001, Bouchami a kol., 2011, Tsubakishita akol., 2010) Klonální struktura populace S. aureus Rountree a kol. (1955, 1958) již v 50-tých letech 20. stol. provedl první studie struktury populace S. aureus založené na fagotypizaci, které naznačily značnou míru klonality kmenů. Existence klonů kmenů S. aureus je považována za jeden z hlavních znaků stafylokokové populace. V roce 2003 Robinson a Enright publikovali evoluční model (viz. příloha č. 1) vzniku pěti dominantních klonů nemocničních kmenů MRSA (CC5, CC8, CC22, CC30 a CC45), a to na základě srovnávání sekvencí spa (gen pro stafylokokový protein A), sas (geny pro povrchové proteiny) a tzv. provozních (housekeeping) genů, které pocházely ze souboru meticilin citlivých i rezistentních kmenů S. aureus (Robinson a Enright, 2003). Zároveň byl sledován výskyt a typ SCCmec. Bylo zjištěno, že meticilinová rezistence vznikla v pěti fylogeneticky odlišných liniích, a to jako důsledek ne jedné, ale mnoha genetických událostí v rámci dané linie (Enright a kol., 2002). Úspěch těchto typů CC jako vysoce patogenních kmenů je do jisté míry ovlivňován i jejich schopností přijímat MGE včetně plazmidů (Shearer akol., 2011). Tento trend je patrný také v populaci S. aureus v ČR. U komunitních kmenů MRSA převažuje invazivní klon ST8 (CC8) označovaný jako USA300, který v Evropě od roku

15 postupně vytlačuje předchozí klon ST80 označovaný jako Evropský. Nozokomiální kmeny patří k Brazilskému (ST239), regionální variantě Českému (ST239), a Iberskému klonu (ST247) z klonální skupiny CC8. Od roku jsou postupně nahrazovány kmeny souhrnně označované jako tzv. Rhine Hesse clone (CC5) a kmeny tvořící tzv. EMRSA-15 klon (CC22) (Jakubu a kol., 2008, Melter a kol., 2006). Podle informací Národní referenční laboratoře pro stafylokoky v Praze dojde v českých nemocnicích průměrně ke 4 až 5 epidemiím stafylokokových epidermolýz ročně, přičemž jde zpravidla o izoláty patřící ke stejnému klonu Genom S. aureus V současné době je známa kompletní sekvence 35 genomů druhu S. aureus a řada dalších je sekvenována, což spolu s využitím technologie mikročipů umožňuje jejich efektivní srovnávání a rovněž získání přesných informací o struktuře genomu. Tímto přístupem bylo zjištěno, že genom S. aureus se skládá z konzervativní části (core genome, ~75 %), variabilní složky (core variable genome, ~10 %) a mobilních genetických elementů (MGE) jako jsou plazmidy, bakteriofágy, transpozony a ostrovy patogenity, které tvoří přibližně 15 % genomu (Lindsay a kol., 2006b). Vlastní bakteriální chromozom S. aureus je tvořen kružnicovou DNA o velikosti 2,7-2,9 Mbp s nízkým obsahem GC párů (průměrně 32,8 %). Celkem genom kóduje přibližně 2700 otevřených čtecích rámců (ORF) a řadu strukturních a regulačních RNA. Přibližně 38 % ze všech ORF nemá dosud přiřazenou funkci, přičemž řada z nich je specifická pro druh S. aureus (Lindsay a kol., 2006a, Holden a kol., 2004). Uvádí se, že většina ORF, ve kterých se jednotlivé kmeny mezi sebou liší, jsou součástí MGE (Ito a kol., 1999) Charakteristika plazmidů S. aureus. Plazmidy jsou autonomně se replikující extrachromozomální elementy tvořené kružnicovou DNA. Kromě genů zajišťujících jejich vlastní replikaci a u některých typů plazmidů také mobilitu, obsahují dále geny, které nejsou pro buňku esenciální. Často jsou to geny kódující faktory virulence a rezistence k antimikrobiálním látkám. Expresí těchto genů se zvyšuje odolnost a také virulence hostitelské bakterie a plazmidy se tak významně podílí na celkovém fenotypu hostitelské buňky. 15

16 Plazmidová DNA u MRSA kmenů má v porovnání s chromozomální DNA zpravidla nižší obsah GC bazí, a to 28,3-28,9 % (Kuroda a kol.,2001, Baba a kol.,2002). Molekuly plazmidové DNA se v buňkách přirozeně vyskytují v superhelikální formě (CCC). Tato uzavřená cirkulární forma však díky zlomům konvertuje na otevřenou cirkulární formu (OC), která je spolu s relaxovanou formou plazmidu stabilnější. V buňce o formě plazmidu rozhodují enzymy označované jako DNA gyrázy, které za spotřeby energie z ATP zavádějí superhelikální smyčky do plazmidové DNA a enzymy navozující relaxovaný stav (relaxázy). Během replikace se mohou vytvářet formy obsahující více než jednu molekulu stejné plazmidové DNA. Nejčastěji jsou vytvářeny dimery nebo trimery. Při vizualizaci plazmidové DNA gelovou ekektroforézou jsou jednotlivé formy v různých pozicích - nejdále gelem migruje převažující CCC forma, která je nejvíce kondenzovaná a tedy nejmenší, následuje lineární forma, OC forma, dimery, trimery, atd. Velikost plazmidové DNA u S. aureus je značně variabilní, pohybuje se v rozmezí od 1,3 kbp po několik desítek kbp. V zásadě se na základě velikosti a způsobu replikace rozlišují tři skupiny stafylokokových plazmidů a do čtvrté třídy jsou řazeny plazmidy, které svými charakteristikami nepatří do prvních tří skupin (Mlynarczyk a kol., 1998, Novick, 1989). I. Do první skupiny se řadí malé (1,3-4,6 kbp), vysokokopiové (10-55 kopií na buňku) plazmidy, které se zpravidla replikují mechanizmem otáčivé kružnice (RCR). Iniciace RCR je zajištěna replikačním proteinem kódovaným plazmidovým genem rep, který specificky štěpí plazmidovou DNA a dochází k rozvolnění DNA v oblasti dvouřetězcového počátku replikace(dso). Dochází k syntéze dvouřetězcové DNA a zároveň je vytlačován jeden řetězec, který posléze slouží jako templát pro syntézu druhého dvojřetězce. Pro druhou syntézu je esenciální přítomnost tzv. jednořetězcového počátku replikace (sso). Z hlediska přítomnosti dalších - neesenciálních - genů jde většinou o plazmidy kryptické nebo nesou jeden, vzácně dva geny pro rezistenci k antibiotikům. Tato skupina obsahuje čtyři rodiny plazmidů pojmenované podle prototypového plazmidu dané rodiny pt181, pc194, psn2 a pe194. Plazmidy skupiny I jsou často součástí jiných MGE včetně SCCmec kazety. Jejich přenos se děje nejčastěji transdukcí (Ubelaker a Rosenblum, 1978) nebo mobilizací (Projan a kol., 1989). II. Druhou skupinu tvoří velké (15-46 kbp), nízkokopiové (4-6 kopií na buňku) plazmidy, které zpravidla využívají theta mechanizmus replikace. Při theta mechanizmu probíhá replikace po rozvolnění DNA v místě počátku replikace oběma směry až do vytvoření dvou výsledných plazmidů, které jsou od sebe na závěr odštěpeny. Tyto plazmidy 16

17 zpravidla obsahují několik genů kódujících rezistenci k antibiotikům a genům virulence. Do skupiny je řazena většina penicilinázových plazmidů (čtyři rodiny α, β, γ a δ) (Mlynarczyk a kol., 1998), psk1 rodina aminoglykozid-trimetoprim rezistentních plazmidů a další dále neklasifikované plazmidy. Často jsou do nich integrovány další MGE (plazmidy z první skupiny, transpozony, inzerční sekvence) a jejich přeskupováním pak vznikají další varianty plazmidů druhé skupiny (Thomas a kol., 1989). Tyto plazmidy se pravděpodobně převážně přenáší transdukujícími bakteriofágy (Smillie a kol., 2010, Shearer a kol., 2011). III. Třetí skupina je zastoupena plazmidy konjugativními, které dosahují velikosti až 60 kb. Jejich základní charakteristika se neliší od skupiny II, až na přítomnost tzv. tra oblasti, která obsahuje geny esenciální pro vlastní konjugaci. Konjugativní plazmidy umožňují rovněž mobilizaci plazmidů, které mohou vytvářet relaxační komplexy. Tyto multiproteinové komplexy jsou kódovány geny operonu mob kódující relaxázy MobA, MobB a obsahují rozpoznávací místo MobS. K mobilizaci dochází se 100 krát vyšší frekvencí než k přenosu konjugativního plazmidu (Novick, 1991). Tento typ plazmidů však není u S. aureus příliš častý. Shearer a kol. (2011) ve své práci uvádí, že v databázi NCBI Ref Seq je uvedeno 195 kompletních sekvencí stafylokokových plazmidů, z nichž 45 % bylo > 20 kb a 22 % bylo > 30 kb a tedy dostatečně velkých na to, aby kódovaly konjugativní aparát a celkově jen 6 % obsahuje tzv. tra oblast nutnou pro konjugativní přenos. Kromě výše uvedeného klasického členění jsou v literatuře navrhovány další možnosti klasifikace plazmidů S. aureus, jejichž společným kritériem je vždy způsob relikace resp. příbuznost replikačních genů. Je to jednak rozdělení plazmidů do tzv. inkompatibilních skupin (Inc) (Udo a Grubb, 1991) a dále PCR amplifikace konzervativních oblastí genů pro iniciaci replikace (rep), což je v současnosti nejvíce diskutovaný způsob klasifikace (Jensen a kol., 2010, Lozano a kol., 2012). Ze sekvenčních dat plazmidů S. aureus je zřejmé, že řada z nich obsahuje otevřené čtecí rámce (ORF), které nebyly dosud popsány, což svědčí o širokém spektru genů nesených na plazmidech S. aureus. Přehled nejčastěji nesených genů rezistence a virulence je uveden v tab. 4. U plazmidů nesených kmeny S. aureus rezistentních k meticilinu je kromě epizomální formy plazmidu popisována také integrace některých typů plazmidů (např. pt181, pub110) 17

18 do chromozomové kazety SCCmec, což vede k vytvoření multirezistentního genomického ostrova. Takto vložené plazmidy jsou ohraničeny IS257, která zřejmě zprostředkovává jejich zabudování do chromozomu. 18

19 Tabulka 4: Přehled genů nesených na plazmidech S. aureus resp. MRSA. Geny kódující determinanty rezistence k antibiotikům Geny Antibiotikum Poznámka Použitá literatura: msra Efluxní pumpa (ATP-vázající protein), která umožní vyčerpání antibiotika ven z buňky. Přítomnost msra a jeho analogů na plazmidech S. aureus není příliš častá, je však typická pro velké plazmidy CA-MRSA kmenů klonu USA300. Matsuoka a kol., 1997 Melter a kol., 2003 Highlander a kol., 2007 Makrolidy Metylace (23S RNA-metyláza) blokuje navázání antibiotika na ribozomální RNA, čímž je obnovena syntéza proteinů. Nejčastěji se u MRSA vyskytuje gen erma nesený erma/b/c transpozonem Tn554, který bývá začleněn do chromozomu, ale přenos na plazmid není Spiliopoulou a kol., 2004 vyloučen. Častý je gen ermc, který je typicky popisován na malých plazmidech o Khan a kol., 2000 velikosti cca 2,5 kbp, přičemž se může vyskytovat současně s genem erma. Ojediněle je nacházen gen ermb, a to na velkých plazmidech. tetk Efluxní pumpa (protein v cytoplazmatické membráně, který vyčerpává z buňky komplex Mg-tetracyklin). Typicky se vyskytuje na malých mobilizovatelných plazmidech typu pt181-like. Michalová a kol., 2004 Strommenger a kol., 2003 Tetracykliny Aanalog elongačního faktoru s ribozom dependentní GTP-ázovou aktivitou, který chrání tetm ribozom před navázáním antibiotika, a tak obnovuje syntézu proteinů v buňce. Součást transpozonu Tn916, který může být začleněn jak v chromozomu, tak na Michalová a kol., 2004 Strommenger a kol., 2003 plazmidu. Chloramfenikol acetyltransferáza váže acetylovou skupinu, dochází k chemické změně cat Chloramfenikol struktury antibiotika, které se následně není schopno vázat na ribozom, čímž je obnovena syntéza proteinů v buňce. Typicky se vyskytuje na malých mobilizovatelných Taylor a kol., 2004 Projan a kol., 1989 plazmidech. 19

20 Inaktivace aminoglykosidů modifikujícími enzymy s acetyltransferázovou (AAC), adenyltransferázovou (ANT) nebo fosfotransferázovou (APH) aktivitou, což vede ke ztrátě schopnosti antibiotika vázat se na ribozom a blokovat tak proteosyntézu. U MRSA aac(6 )-Ie+aph(2 ) (také označovaný aph(3 )-IIIa Aminoglykozidy kmenů je rezistence ke gentamicinu, tobramycinu a kanamycinu nejčastěji zajištěna enzymem s AAC i APH aktivitou, který je kódován genem aac(6 )-Ie+aph(2 ) (také označovaný aaca-aphd) umístěným na transpozonu Tn4001. Takto je začleňován jak do chromozomální, tak do plazmidové DNA. Méně často jsou nacházeny geny ant(4 )-Ia a Schmitz a kol., 1999 aph(3 )-IIIa kódující příslušné enzymy modifikující především neomycin a kanamycin. I tyto geny se vyskytují jak na chromozomu, tak na plazmidech, kam jsou přenášeny pomocí IS257 respektive Tn5405. Enzym β-laktamáza (také označován jako penicilináza), který hydrolyzuje β-laktamový kruh antibiotika a tím zamezí jeho navázání na transpeptidázu buněčné stěny a obnoví její normální biosyntézu. Bylo popsáno, že regulační geny blai, blari genu blaz i jejich analogy meci, mecri genu blaz β laktamy meca jsou po aktivaci β-laktamovými antibiotiky schopny aktivovat expresi obou genů (blaz i meca). Rozdíl je však v kinetice přenosu signálu. Zatímco transdukce signálu Zscheck a kol., 1993 zprostředkovaná proteinem BlaR1 vede k indukci transkripce genů blaz a meca během několika minut, protein MecR1 indukuje transkripci genu meca až za několik hodin. Typicky je gen nesen transpozonem Tn552 integrovaným nejčastěji velkými (cca 20 kbp) plazmidy (odtud označení penicilinázové plazmidy). mupa Mupirocin Produkce alternativní izoleucyl-trna syntetázy se sníženou afinitou k tomuto antibiotiku, čímž je obnovena normální syntéza proteinů v buňce. Capobianco a kol., 1989 Gilbart a kol., 1993 Udo a kol.,

21 Produkce alternativního prekurzoru buněčné stěny, kdy je místo standardního D-alanyl- D-alaninu syntetizován D-alanyl-D-laktát, který není glykopeptidy rozeznáván, čímž je vana Glykopeptidy obnovena tvorba buněčné stěny. Gen je nesen na Tn1546 integrovaném ve velkých plazmidech. Původně byl tento mobilní Severin a kol., 2004 Clark a kol., 2005 element popsán u enterokoků, později však také u kmenů MRSA rezistentních k vankomycinu. Geny kódující toxiny Geny Toxiny Poznámka etb Exfoliativní toxin B Exfoliativního toxin B (ETB) je lokalizován na plazmidu zpravidla společně s geny pro bakteriociny a rezistenci ke kadmiu. Bylo zjištěno, že organizace plazmidů s ETB z různých klinických zdrojů je velmi konzervativní, ačkoliv jejich velikost je rozdílná. Yamaguchi a kol., 2001 Geny lokalizovány výhradně na plazmidech a často jsou na jedné molekule plazmidové Stafylokokové DNA obsaženy všechny tři geny najednou. Bez ohledu na jednotlivé typy vykazují sed, sej, ser enterotoxiny všechny enterotoxiny homologii ve svých funkčních oblastech. Přesný mechanizmus Omoe a kol., 2003 D, J a R působení, ani důvod přítomnosti hned několika enterotoxinů a často i dalších superantigenů v jednom genomu S. aureus není dosud dostatečně objasněn. 21

22 Procesy ovlivňující obsah plazmidů v hostitelské buňce u S. aureus Obsah plazmidů kmenů S. aureus je velmi variabilní, což bylo potvrzeno i daty ze sekvenačních projektů, ze kterých vyplývá, že některé kmeny se sekvenovanými genomy neobsahují žádný plazmid, zatímco jiné mají až tři plazmidy. Množství epidemiologických dat, která by vypovídala o obsahu plazmidů MRSA kmenů v Evropě, je však omezené. Některé studie popisují až 100 % přítomnost plazmidů, jako například Coia a kol. (1988), kteří ve své práci studovali soubor MRSA kmenů izolovaných z britských nemocnic. Jiné studie uvádí, že téměř 40 % MRSA kmenů žádnou extrachromozomální plazmidovou DNA neobsahovala (Cristino a kol., 1989). Caddick a kol. (2005), kteří se ve své studii zaměřili na multirezistentní izoláty britské nemocnice, dokonce nezjistili přítomnost plazmidů u žádného ze studovaných kmenů. Je známo, že obsah plazmidů je ovlivňován řadou procesů probíhajících v rámci hostitelské buňky samotné, jako je především inkompatibilita a přítomnost restrikčně modifikačních systémů a s tím související příslušnost k určité klonální skupině. Značný vliv má také prostředí, ve kterém se daná bakteriální buňka vyskytuje Inkompatibilita plazmidů S. aureus Plazmidy S. aureus, které mají blízce příbuzný systém kontroly replikace, nejsou schopny se stabilně udržovat ve stejné hostitelské buňce. Je to způsobeno soutěžením o společné regulační faktory řídící vlastní replikaci a tím nepřímo i počet kopií obsažených v buňce. Takové plazmidy patří do stejné inkompatibilní skupiny (Inc), u S. aureus bylo dosud identifikováno 15 Inc skupin (Taylor a kol., 2004, Udo a Grubb, 1991). Protože tento jev odráží určitou příbuznost plazmidů, je inkompatibilita používána jako jedno z kritérií jejich klasifikace. Přiřazení Inc skupiny je však značně znesnadněno problematickou metodikou. Na plazmidu může chybět vhodný marker, plazmid není možné přenést do testované buňky nebo mohou plazmidy obsahovat více replikačních systémů. Navíc bylo zjištěno, že některé plazmidy z různých Inc skupin jsou značně homologní na úrovni DNA (pt181, pc221, ps194 aj.), z čehož vyplývá, že plazmidy z různých Inc skupin nemusí být nutně nepříbuzné, pouze se liší svým replikačním aparátem. 22

23 Restrikčně modifikační systémy (RMS) Je všeobecně uznáváno, že restrikčně modifikační (RM) systémy představují pro bakteriální buňku zásadní způsob, jakým mohou regulovat přenos genetické informace. Předpokládá se, že hlavní funkcí RM systémů je zabránit příjmu takové DNA, která je pro buňku potencionálně nebezpečná nebo jejíž exprese je pro metabolizmus buňky zatěžující nebo přímo fatální. Podle současných studií existují u S. aureus RM systémy (konkrétně Sau1), které mají vliv na horizontální přenos genů mezi jednotlivými kmeny. Lindsay (2012) ve své práci uvádí, že z hlediska plazmidů, které jsou předmětem studia této práce, fungují RM systémy jako určité bariéry bránící jejich volnému šíření. Waldron a Lindsay (2006) ve své studii uváddějí, že S. aureus si vytvořil specifický mechanizmus - RM systém Sau1 - který do určité míry řídí mezikmenový a mezidruhový přenos MGE a také má dopad na evoluci jeho genomu. Podrobněji je Sau1 a další RM systémy popsán níže. Společnou podstatou fungování všech RM systémů je proces modifikace (enzym metyltransferáza) a restrikce (enzym restrikční endonukleáza) DNA, po které následuje biologická degradace takto fragmentované DNA. U S. aureus byly popsány tři hlavní typy těchto systémů (Roberts a kol., 2007, Corvaglia a kol., 2010): RM systém typu I jeho hlavní funkcí je zabránění vniku cizorodé DNA pocházející z jiné linie S. aureus do buňky představuje ho multifunkční enzym katalyzující restrikci i modifikaci DNA, který se skládá ze 3 proteinových jednotek HsdR, HsdM, HsdS např. SauS2I, Sau1 RM systém typu II skupina RM systémů s největším zastoupením napříč bakteriálními druhy představují ho dva samostatné enzymy - restrikční endonukleáza a metyltransferáza vzhledem k tomu, že narozdíl od RM systémů typu I a III nepotřebují ke štěpení DNA ATP a štěpí DNA přímo v rozpoznávacím místě, využívají se enzymy tohoto systému při DNA manipulacích v molekulárně biologických laboratořích příkladem těchto enzymů jsou Sau3A, Sau96 23

24 RM systém typu III jeho hlavní funkcí je zabránění vniku cizorodé DNA pocházející z jiného bakteriálního druhu do buňky nejméně početná skupina RM systémů; u S. aureus není dosud podrobně charakterizována, nicméně Corvaglia a kol. (2010) přináší ve své studii informaci o existenci restrikční endonukleáze typu RM III u řady kmenů S. aureus představuje ho multifunkční enzym s funkcí restrikční endonukleázy i metyltransferázy, který je tvořen dvěmi podjednotkami Res a Mod Vzhledem k zaměření této práce uvádím na tomto místě souhrn publikovaných informací o RM systému Sau1 a jeho vlivu na horizontální přenos MGE resp. plazmidů. Jak bylo uvedeno výše, RM systém Sau1 je tvořen enzymem složeným ze tří proteinových podjednotek HsdR, HsdM, HsdS, které jsou kódovány geny sauihsdr, sauihsdm a sauihsds. Waldron a Lindsay (2006) zjistili, že zatímco geny sauihsdr a sauihsdm jsou u všech kmenů S. aureus vysoce homologní, gen sauihsds určující sekvenční specifitu enzymu je variabilní a právě v něm se mezi sebou lisí RM systémy jednotlivých linií S. aureus. Autoři dále uvádějí, že důsledkem této variability je skutečnost, že DNA kmene patřícího do jedné linie je kmenem z odlišné linie považována za cizorodou a následně degradována. A tedy, že frekvence horizontálního přenosu mezi kmeny bude vyšší v případě, že tyto kmeny budou patřit do stejné linie, než kdyby byly v odlišných liniích. Rovněž je přijímán fakt, že kmeny s defektivním RM systémem získávají MGE s vyšší frekvencí, a tím u nich dochází k akumulaci faktorů virulence a genů rezistence k antimikrobiálním látkám a mají tak větší potenciál stát se tzv. super-bakterií (z angl. superbug) (Corvaglia a kol., 2010, Sung a Lindsay, 2007, Waldron a Lindsay, 2006) Vliv vnějšího prostředí Prostředí, ve kterém se daný kmen S. aureus nachází působí selektivně na v nich přítomné plazmidy. Jde především o pozitivní selekci těch typů plazmidů, které poskytují výhodu svému hostiteli. Typickým příkladem jsou nozokomiální kmeny S. aureus (resp. MRSA), které nesou zpravidla více typů genů rezistence často nesených právě na plazmidech - ať už epizomálních nebo integrovaných do jiných částí stafylokokového genomu včetně SCCmec kazety. 24

25 Horizontální přenos plazmidových genů u stafylokoků Předpokládá se, že horizontální přenos genů je u stafylokoků nejčastěji zprostředkován bakteriofágy, které hrají hlavní roli v jejich evoluci. V literatuře jsou popsány dva možné způsoby horizontálního přenosu genů bakteriofágy. Prvním způsobem je obecná transdukce (viz. níže), druhým potom infekce buňky fágem a integrace jeho genomu obsahujícího cizorodý gen do bakteriálního genomu (lyzogenní konverze). U stafylokoků byl navíc identifikován málo prostudovaný mechanizmus genetické výměny označovaný jako fágem zprostředkovaná konjugace. Přenos molekul plazmidové DNA a tím i genů na nich nesených je zajišťován také mechanizmy nevyužívajících přítomnost bakteriofágů, a to konjugací a mobilizací. Přenos je možný jak mezi jednotlivými kmeny daného druhu, tak i mezidruhově. Přednostně však k výměně genetického materiálu dochází v rámci druhu a u S. aureus dokonce v rámci jednotlivých linií (Lindsay, 2008) Transdukce Jak už bylo zmíněno, transdukce je přenos bakteriální DNA pomocí bakteriofágů. Tuto schopnost mají fágy S. aureus serologické skupiny B a některé fágy ze skupiny F. Za prototyp transdukujícího fága je považován temperovaný fág 11 (φ11) serologické skupiny B, který je schopen zabalovat plazmidovou nebo chromozomální DNA až do velikosti svého genomu, tj. 45 kbp. Malé plazmidy jsou přenášeny jako lineární konkatemery, v recipientní buňce jsou pak převedeny na kružnicovou formu a následuje rozštěpení na monomery. Byl popsán také společný přenos dvou různých plazmidů (tzv. kotransdukce), která je umožněna kointegrací těchto elementů pomocí místně specifické rekombinace v místech homologních sekvencí (RS sekvence). Velké plazmidy, jejichž velikost přesahuje velikost fágového genomu, mohou být před zabalením do fágového obalu zmenšeny. Přesný mechanizmus transdukce není znám. Předpokládá se, že u stafylokoků převažuje obecná transdukce, při které dochází k náhodnému sbalování DNA. Dosud jediným popsaným společným znakem transdukujících fágů je již výše zmíněná serologická skupina B. Ačkoliv název napovídá, že jde o klasifikaci založenou na serologických vlastnostech fágů, v současné době jsou bakteriofágy řazeny do jednotlivých skupin na základě PCR detekce genů pro proteiny bičíku a integrázy (Goerke a kol., 2009, Kahánková a kol., 2010), přičemž výsledky serologie a PCR spolu korespondují. 25

26 Fágem zprostředkovaná konjugace Princip tohoto typu přenosu, který je některými autory také označován jako transdukce ve smíšené kultuře (mixed-culture), není dosud přesně popsán. Víme však, že tento jev je jedinečný pro stafylokoky (Novick, 1991). Je známo, že pro úspěšný přenos je třeba přímý kontakt donorové buňky obsahující plazmid a buňky recipientní a dále přítomnost pomocného fága v donorové buňce. Narozdíl od klasické transdukce však filtrát smíšené kultury nemusí obsahovat agens zodpovědné za přenos plazmidové DNA a přesto přenos probíhá při vysoké frekvenci (Lacey, 1980). Předpokládá se totiž, že přítomné bakteriofágy jsou defektní (Lacey a Stokes, 1979). Přítomnost jejich genomu v buňce pravděpodobně způsobuje adhezi buněk k sobě pomocí fágových proteinů na jejich povrchu (Lacey, 1980, Thompson a Pattee, 1977). Fágem zprostředkovaná konjugace probíhá přednostně v tekutém prostředí např. v moči, mléce. Předpokládá se, že stupeň hydratace buněk je jedním z faktorů rozhodujícím o způsobu přenosu plazmidu. Typicky se objevuje u plazmidů nesoucích geny pro exfoliativní toxiny např. petb (Yamaguchi a kol., 2001) Konjugace a mobilizace Konjugace je mechanizmus přenosu typický pro skupinu plazmidů označovaných jako konjugativní. Stafylokokové konjugativní plazmidy jsou charakterizovány přítomností oblasti tra skládající se z několika transkripčních jednotek, která je zodpovědná za vlastní přenos plazmidu. Předpokladem konjugace je přímý kontakt buněk, který je umožněn multiproteinovým komplexem označovaným jako konjugativní aparát. Narozdíl od gramnegativních bakterií, kde jsou jednotlivé proteiny dobře popsány, u gram-pozitivních bakterií nebyl tento aparát dosud přesně identifikován (Grohmann a kol., 2003). Je známo, že hlavní roli v iniciaci přenosu konjugativních plazmidů hrají DNA relaxázy (u S. aureus především TraA). Relaxáza se váže na oblast nic počátku přenosu označovaného jako orit, kde specificky štěpí superhelikální smyčky k němu přiléhající. Bylo zjištěno, že sekvence repetic tvořících tyto smyčky nejsou u žádného dosud analyzovaného konjugativního ani mobilizovatelného plazmidu homologní, jejich lokalizace vzhledem k orit je však podobná. U gram-pozitivních bakterií je konjugace navozena produkcí tzv. sexferomonů. Tyto signální látky proteinové povahy jsou rozpoznávány buňkami nesoucími na svém povrchu potřebné receptory, čímž dojde k iniciaci konjugace. U S. aureus byly nalezeny analogy sexferomonů 26

27 v podobě lipoproteinových prekurzorů vykazujících značnou podobnost s feromony Enterococcus faecalis (Grohmann a kol., 2003). Konjugace probíhá přednostně na pevném podkladě, např. na lidské kůži, chirurgické gáze a podobně, a to s frekvencí na donorovou buňku. Konjugativní plazmidy S. aureus mají schopnost mobillizace dalších plazmidů, a to takových, které nesou rozpoznávací místo MobS a mohou vytvářet relaxační komplexy. Tyto multiproteinové komplexy jsou kódovány geny operonu mob kódujícího relaxázy MobA, MobB. K mobilizaci dochází se 100 krát vyšší frekvencí než k přenosu konjugativního plazmidu (Novick, 1991) Mezidruhový přenos plazmidů Mezidruhový přenos plazmidů je často spojen s konjugativními plazmidy streptokoků a enterokoků, které vykazují široké rozmezí hostitelů. Tímto mechanizmem byl prokázán přenos plazmidů mezi kmeny S. aureus a kmeny některých druhů koaguláza negativních stafylokoků (Gordon a kol., 1991). Příkladem může být dobře popsaný přenos konjugativního plazmidu nesoucího rezistenci ke gentamicinu ze Staphylococcus epidermidis do Staphylococcus aureus na lidské kůži (Grohmann a kol., 2003) nebo přenos konjugativního plazmidu nesoucího rezistenci ke vankomycinu z Enterococcus faecalis do Staphylococcus aureus (Showsh a kol., 2001). Dosud však nebyl popsán přenos opačným směrem, tedy z druhu S. aureus do jiných bakteriálních druhů. Mezidruhový přenos plazmidů transdukcí byl demonstrován v infikovaných tkáních a na kůži pacientů (Novick, 1991). 27

28 2. Cíle Předkládaná práce studuje obsah a strukturu plazmidů kmenů S. aureus a také si klade za cíl postihnout základní vztahy mezi plazmidy a jejich hostitelskými kmeny populace S. aureus v České republice. V tomto směru práce navazuje na předchozí práce pracoviště zabývající se popisem genů rezistence k antimikrobiálním látkám nesených na plazmidech S. aureus a také studiem stafylokokových bakteriofágů a jejich transdukčních schopností. Mobilní genetické elementy (MGE) jsou významnou součástí variabilní části bakteriálního genomu, a to především jako vektory přenosu genů rezistence k antimikrobiálním látkám a genů virulence. U druhu Staphylococcus aureus se podílí na multirezistenci a zvýšené virulenci kmenů tohoto závažného humánního a veterinárního patogena a také se spolupodílí na vysoké klonalitě stafylokokové populace. Z hlediska přenosu genů rezistence k antibiotikům jsou nejdůležitější plazmidy, jakožto autonomně se replikující MGE. Většina plazmidů S. aureus je přenášena mezi buňkami hostitele pomocí transdukujících bakteriofágů, některé plazmidy jako jsou např. plazmidy konjugativní nesou geny pro vlastní mobilitu. Práce byla zaměřena na charakterizaci plazmidů vyskytujících se v české populaci kmenů S. aureus, a to včetně kompletní sekvenace vybraných plazmidů. Pro tyto účely byl vytypován reprezentativní soubor kmenů, které byly podrobně genotypově popsány a bylo tak možné sledovat vztah mezi obsahem konkrétních plazmidů a příslušností kmene ke klonální skupině (CC). Část práce byla také věnována optimalizaci metodiky obecné transdukce pro potřeby druhu S. aureus, a to za účelem studia možného způsobu přenosu plazmidů bakteriofágy. Hlavními cíli práce bylo: Stanovení obsahu a bližší charakterizace plazmidů u reprezentativního souboru kmenů české populace S. aureus. Sledování vzájemných vztahů mezi přítomností určitých typů plazmidů a příslušností kmenů S. aureus do jednotlivých klonálních skupin (CC). Experimentální průkaz přenosu vybraných plazmidů prostřednictvím transdukujících bakteriofágů u klinicky významných kmenů S. aureus. 28

29 3. Materiál a metody Pro účely práce byl vytvořen soubor více než 150 kmenů S. aureus izolovaných v letech v 15-ti nemocnicích v ČR. Z nich bylo na základě SmaI makrorestrikčních spekter vytypováno 73 různých izolátů, které byly dále podrobně genotypově charakterizovány, jak je přehledně uvedeno v tab. 5. Izoláty byly poskytnuty Fakultní nemocnicí Brno (Nemocnice Bohunice) a Státním zdravotním ústavem (SZÚ) v Praze. Pro účely genotypové charakterizace kmenů byly použity následující metodiky: stanovení antibiogramu diskovou metodou sekvenční stanovení spa typu PCR stanovení agr typu PCR stanovení typu SCCmec kazety PCR stanovení profágových charakteristik - typ integrázy a příslušnost k serologické skupině PCR stanovení profilu sau1hsds genu jako důkaz přítomnosti Sau1 typu RM systému Pro účely charakterizace plazmidů byly použity následující metodiky: izolace plazmidové DNA a její vizualizace elektroforézou v agarózovém gelu štepení plazmidové DNA restrikčními endonukleázami HindIII a EcoRI a vizualizace získaných fragmentů elektroforézou v agarózovém gelu sekvenace vybraných plazmidů a následná komparativní analýza získaných sekvencí v databázi GenBank PCR detekce plazmidových genů rezistence a virulence s použitím primerů navržených pro tuto práci provedení DNA hybridizace na plazmidovou DNA pro důkaz přítomnosti vybraných genů rezistence na plazmidech PCR detekce tra oblasti případných konjugativních plazmidů eliminace vybraných plazmidů metodou propagace hostitelského kmene na živném médiu s 0,002 % SDS stanovení produkce β-laktamázy diskovou metodou 29

30 Pro účely studia přenosu plazmidů byly použity následující metodiky: Testování následujícího transdukčního systému: Donor: kmeny klonu USA300 (07/759, 98/019, 08/629, 08/986) Recipient: laboratorní kmen RN4220 Transdukující fág: φ80α Transdukce do recipientního kmene 07/235 pomocí transdukujícího bakteriofága φ80α Testování takto získaných transduktant z hlediska potvrzení přítomnosti přenášeného plazmidu a funkčnosti na něm nesených genů (viz. výše - metodiky pro charakterizaci plazmidů) Pokud není uvedeno jinak, byly primery pro provedení PCR převzaty z literatury viz. publikace. Konkrétní podmínky jednotlivých postupů a primery navržené pro tuto práci jsou uvedeny v publikacích. 30

31 Tabulka 5: Genotypové charakteristiky analyzovaných kmenů. Původ kmene SCC MRSA Profágy Plazmidy Kmen spa typ Místo Rok CC mec CA/HA Agr Antibiogram int/ser. sk. vel. kb profil 31

32 Pozn. T - tetracyklin, Cmp chloramfenikol, O - axacilin, E - erytromycin, G - gentamicin, Cli klindamycin, Cot kotrimoxazol, Rif rifampicin, Cip ciprofloxacin, AMC ampicilin, CC - klonální skupina (z angl. clonal cluster), int/ser sk. - integráza/serologická skupina. 32

33 4. Výsledky ve vložených publikacích Získané výsledky jsou přehledně uvedeny v českýh abstraktech, které předcházejí jednotivým publikacím a podrobně sepsány ve vložených publikacích. Nejvýznamnější závěry jsou pak rovněž shrnuty na konci předkládané dizertační práce v kapitole Závěry. Před každou publikací je uveden přehled konkrétní práce, kterou jsem se na dané publikaci podílela. Vložené publikace: I. Characteristics and distribution of plasmids in a clonally diverse set of methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains (Kuntová a kol., 2012) Dodatkový materiál k publikaci Kuntová a kol., 2012 (supplementary material) je uveden v příloze č. 2. II. Bacteriophages of Staphylococcus aureus efficiently package various bacterial genes and mobile genetic elements including SCCmec with different frequencies (Mašlaňová a kol., 2013) III. Efficient transfer of antibiotic resistance plasmids by transduction within methicillinresistant Staphylococcus aureus USA300 clone (Varga a kol., 2012)

34 I. Characteristics and distribution of plasmids in a clonally diverse set of methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains Lucie Kuntová, Roman Pantůček, Jana Rájová, Vladislava Růžičková, Petr Petráš, Ivana Mašlaňová a Jiří Doškař Abstrakt (česky): Cílem této práce bylo srovnat obsah plazmidů v souboru meticilin rezistentních kmenů Staphylococcus aureus (MRSA), které patřili do různých klonálních skupin (CCs z anglického clonal clusters). Izoláty byly v letech získány z 15ti českých nemocnic. Plazmidová DNA byla zjištěna u 65 (89 %) kmenů, přičemž 33 z nich obsahovalo více než jeden typ plazmidů. Celkem bylo identifikováno 24 různých typů plazmidů, jejichž velikost se pohybovala v rozmezí od 1,3 do 55 kb. Pro jejich bližší charakteristiku byla použita metoda porovnávání restrikčních spekter, eliminace plazmidů, DNA hybridizace a sekvencování. Bylo zjištěno, že konjugativní plazmidy, plazmidy nesoucí determinanty rezistence k erytromycinu a plazmidy kódující enterotoxin D byly přítomny v kmenech patřících do různých CCs. Na druhou stranu, plazmidy kódující determinanty rezistence k chloramfenikolu a tetracyklinu a většina penicilinázových a kryptických plazmidů byla detekována pouze v určitých CCs. Nejmarkantněji to bylo pozorováno u kmenů klonu USA300, kde byly nalezeny výhradně plazmidy označené jako pusa300-like, tedy plazmidy podobné plazmidům pusa300. Z velké variability obsahu plazmidů zjištěné v této studii lze usuzovat, že plazmidy hrají významnou roli v evoluci klonálních linií MRSA. 34

35 Na uvedené studii jsem se podílela následující prací: Stanovení genotypových charakteristik kmenů S. aureus sekvenční stanovení spa typu PCR stanovení agr typu PCR stanovení typu SCCmec kazety PCR stanovení profágových charakteristik - typ integrázy a příslušnost k serologické skupině PCR stanovení profilu sau1hsds genu jako důkaz přítomnosti Sau1 typu RM systému přiřazení kmene k CC a k CA/HA MRSA na základě výše uvedených genotypových charakteristik Charakteristika plazmidů studovaných kmenů S. aureus izolace plazmidové DNA a její vizualizace elektroforézou v agarózovém gelu štepení plazmidové DNA restrikčními endonukleázami HindIII a EcoRI a vizualizace získaných fragmentů elektroforézou v agarózovém gelu sekvenace vybraných plazmidů a následná komparativní analýza získaných sekvencí v databázi GenBank stanovení velikosti plazmidů vyhodnocením výše uvedených charakteristik PCR detekce plazmidových genů rezistence a virulence provedení DNA hybridizace na plazmidovou DNA pro důkaz přítomnosti vybraných genů rezistence na plazmidech PCR detekce tra oblasti případných konjugativních plazmidů eliminace vybraných plazmidů z hostitelského kmene a následný popis získaných eliminant metodami PCR detekce plazmidových genů, stanovení antibiogramu diskovou metodou a stanovení produkce β-laktamázy diskovou metodou Vyhodnocení vzájemných vztahů mezi výskytem konkrétních plazmidů a příslušností kmene k CC na základě stanoveného podrobného genotypového popisu kmenů a plazmidů 35

36 Kuntova a kol.-1 36

44 II. Bacteriophages of Staphylococcus aureus efficiently package various bacterial genes and mobile genetic elements including SCCmec with different frequencies Ivana Mašlaňová, Jiří Doškař, Marian Varga, Lucie Kuntová, Jan Mužík, Denisa Malúšková, Vladislava Růžičková a Roman Pantůček Abstrakt (česky): Staphylococcus aureus je závažný lidský a veterinární patogen. V jeho populaci se objevují nové kmeny, které jsou v důsledku získávání nových, horizontálně přenášených genů stále virulentnější a mají vyšší míru rezistence k antimikrobiálním látkám. Obecně je uznáváno, že významnou roli v přenosu genů hrají temperované bakteriofágy. V této práci jsme se zaměřili na detekci a kvantifikaci bakteriálních genů kmene S. aureus COL přímo ve fágových částicích prostřednictvím qpcr. Z neparametrické statistické analýzy vyplývá, že transdukující bakteriofágy séroskupiny B φ11, φ80 a φ80α, ve srovnání s bakteriofágem φ81 patřícím do séroskupiny A, účinně sbalují vybrané bakteriální geny lokalizované ve 4 různých lokusech chromozomu a 8 genů kódovaných na variabilních genetických elementech (SCCmec, SaPI, genomické ostrovy vsaα a vsaβ a plazmidy) s různou frekvencí. Počet kopií bakteriálních genů na 1 ng fágové DNA (GC/ng) bylo v rozmezí 1, pro plazmidový gen rezistence tetk do 3, pro gen kódující integrázu lokalizovaný na SaPI1. Novým a stěžejním výsledkem bylo zjištění, že bakteriofágy sérologické skupiny B sbalují geny ccra1 (1, ) a meca (1, ) lokalizované na SCCmec elementu typu I do svých virionů a mohou přispívat k horizontálnímu přenosu tohoto elementu a hrát tak důležitou roli v evoluci nových meticilin-rezistentních klonů. Na uvedené studii jsem se podílela následující prací: Izolace a bližší charakterizace plazmidu pusa300-houmr-like (penicilinázový plazmid o velikosti 27 kb, který byl izolován z kmene S. aureus NRL/St 07/759 patřícího ke klonu USA300) Příprava kmene S. aureus COL (pt181, pusa300-houmr-like), což zahrnovalo transdukci plazmidu pusa300-houmr-like z původního hostitelského kmene S. aureus NRL/St 07/759 do kmene S. aureus COL (pt181) pomocí bakteriofága φ80α 44

45 Maslanova a kol.-1 45

53 III. Efficient transfer of antibiotic resistance plasmids by transduction within methicillin-resistant Staphylococcus aureus USA300 clone Marian Varga, Lucie Kuntová, Roman Pantůček, Ivana Mašlaňová, Vladislava Růžičková a Jiří Doškař Abstrakt (česky): Epidemický komunitní meticilin-rezistentní klon Staphylococcus aureus USA300 je hlavním zdrojem infekcí kůže a měkkých tkání a zahrnuje kmeny s obsahem různých genů rezistence. V této práci přinášíme důkaz transdukce penicilinázového a tetracyklinového plazmidu bakteriofágy φ80α a φjb mezi různými klinickými izoláty, které patří do klonu USA300. Vysoká frekvence transdukce ( CFU/PFU) byla zjištěna jak v případě bakteriofágů propagovaných na donorovém kmeni, tak v případě profágů indukovaných z donorového kmene UV zářením. Metoda kvantitativní real-time PCR byla použita k detekci penicilinázového plazmidu ve fágových částicích a k určení poměru mezi počtem transdukujících bakteriofágů a infekčních částic (poměr byl přibližně 1:1700). Úspěšný přenos plazmidů mezi kmeny klonu USA300 ukazuje, že transdukce je efektivním mechanizmem šíření plazmidů v rámci tohoto klonu. Takový přenos DNA přispívá k evoluci a šíření nových multirezistentních kmenů tohoto úspěšného klonu. Na uvedené studii jsem se podílela následující prací: Stanovení obsahu a charakterizace plazmidů nesených kmeny klonu USA300 Testování následujícího transdukčního systému: Donor: kmeny klonu USA300 (07/759, 98/019, 08/629, 08/986), Recipient: laboratorní kmen RN4220, Transdukující fág: φ80α Přenos penicilinázového plazmidu (27 resp. 31 kb) z kmenů klonu USA300 (07/759, 98/019, 08/629, 08/986) do recipientního kmene 07/235 pomocí transdukujícího bakteriofága φ80α a testování takto získaných transduktant z hlediska potvrzení přítomnosti přenášeného plazmidu a funkčnosti na něm nesených genů (test produkce ß- laktamázy, růst na selekčním médiu, PCR detekce genů rezistence blaz a cadd a srovnávání HindIII restrikčního spektra) 53

54 Varga a kol.-1 54

61 5. Diskuse Analýza plazmidové DNA byla jedna z prvních molekulárně biologických metod používaných pro typizaci a bližší charakterizaci bakteriálních kmenů S. aureus (resp. MRSA) (Zuccarelli a kol., 1990). Metoda je výhodná svou jednoduchostí a dostupností potřebného vybavení, ačkoliv v posledních letech se od prosté vizualizace nativních nebo restrikčními endonukleázami štěpených molekul plazmidové DNA na agarózovém gelu přešlo spíše k PCR detekci plazmidových genů a sekvenaci DNA, které přináší mnohem přesnější a ucelenější informaci o této části genomu. Metoda má však i určitá omezení plynoucí především z faktu, že plazmidy patří mezi mobilní genetické elementy (MGE) a mezi kmeny se přenáší, i když, jak dokazuje právě i tato práce, horizontální přenos plazmidů S. aureus neprobíhá zcela nahodile, ale řídí se určitými pravidly. S rozvojem sofistikovanějších molekulárně biologických metod a dostupnosti kompletních sekvenací genomů S. aureus ustoupila tato metoda poněkud do pozadí. Je však nepostradatelnou při studiu a charakterizaci epidemických klonů, jejich šíření a rovněž při snaze postihnout šíření genů rezistence a také řady genů virulence nesených právě na plazmidech S. aureus. Analýzu plazmidové DNA je vhodné doplnit informací o počtu kopií v buňce, a to např. metodou qpcr, jak jme ukázali v práci Mašlaňová a kol. (2012). Z dat dostupných v genomových databázích pro S. aureus ( vyplývá, že 11 (61 %) z 18 genomů MRSA obsahuje alespoň jeden extrachromozomální plazmid. Stejný obsah plazmidů zjistili Cristino a Pereira (1989) ve své studii MRSA kmenů pocházejících z portugalské nemocnice. Naproti tomu Coia a kol. (1988) a stejně tak Caddick a kol. (2005) nedetekovali ve svých souborech kmenů MRSA získaných z britských nemocnic i komunity žádný izolát bez plazmidu. V naší studii byl zjištěn podíl kmenů obsahujících plazmidy relativně vysoký, a to 89 %, což je hodnota, ke které dospěl ve své studii zahrnující analýzu plazmidů kmenů S. aureus z různých geografických oblastí (USA, Austrálie, Velká Británie) také Shearer a kol. (2011). Zdá se tedy, že obsah plazmidů kmenů MRSA je značně variabilní. Podle studie Bradyho a kol. (2007) však existuje spojitost mezi úspěšností určitého klonu a jeho plazmidovým profilem. Ve své práci dospěli k závěru, že kompatibilní plazmidy se podílí na celkové fitness daného klonu. O evoluční důležitosti a zároveň strukturní stabilitě plazmidů svědčí i fakt, že ačkoliv se populace S. aureus (MRSA) dynamicky vyvíjí a určitý klon je postupně nahrazován jiným, mnoho plazmidů cirkuluje v populaci řadu let v téměř nezměněné podobě. Dobře lze tento jev pozorovat například na výskytu plazmidu pt181, který byl detekován u prvního popsaného 61

62 MRSA kmene COL (izolován v roce 1960 ve Velké Británii) a plazmid s téměř identickou sekvencí byl popsán u epidemického klonu USA300 o téměř padesát let později. V naší studii jsme tento fakt potvrdili sekvenční analýzou plazmidů pdlk1 a pdlk2 a také analýzou restrikčního profilu plazmidu kódujícího enterotoxin D, při které bylo zjištěno, že analogy těchto plazmidů jsou u kmenů S. aureus popisovány již desítky let, a to v geograficky různých populacích tohoto patogena (Omoe a kol., 2003, Catchpole a kol,. 1988, Horinouchi a Weisblum, 1982). Podobně, námi popsané typy velkých plazmidů detekoval ve své studii zahrnující plazmidy kmenů získaných v růzém čase i geografickém místě také Shearer a kol., (2011). Determinanty rezistence k antimikrobiálním látkám patří, z hlediska výsledného fenotypu kmene, k nejvýznamnějším a také nejsledovanějším plazmidovým genům. Ve většině námi analyzovaných izolátů rezistence kódovaná plazmidovými geny korespondovala s antibiogramem zjištěným u daného kmene. Výjimkou byly kmeny tzv. českého klonu (spa typ t037/ SCCmec kazeta typ IIIA), které i přes svou multirezistenci obsahovaly buď pouze kryptický plazmid nebo kryptický společně s plazmidem kódující determinantu rezistence k erytromycinu. V souladu s informacemi, které poskytují sekvenační projekty genomů S. aureus, předpokládáme, že relevantní geny jsou neseny na transpozonech nebo plazmidech integrovaných do bakteriálního chromozomu (Holden a kol., 2004; Oliveira a kol., 2000; Rolain a kol., 2009). U penicilinázových plazmidů jsme jejich eliminací z příslušného kmene zjistili, že spolu s plazmidy došlo ke ztrátě jak genu pro β-laktamázu, tak schopnosti produkovat tento enzym. Nijak se však nezměnila rezistence k oxacilinu ani penicilinu, což je pravděpodobně způsobeno produktem genu meca přítomným na SCCmec kazetě (Hiramatsu a kol., 1990). U poloviny kmenů jsme překvapivě detekovali plazmidy, jejichž fenotyp se nepodařilo objasnit a pravděpodobně se tedy jedná o plazmidy kryptické. Ačkoliv je známa kompletní sekvence DNA řady kryptických plazmidů S. aureus, stále chybí uspokojivé informace o tom, jaká je jejich role v evoluci stafylokoků a jakou výhodu poskytují své hostitelské bakterii. Waldron and Lindsay (2006) ve své práci došli k závěru, že k výměně DNA mezi kmeny S. aureus z různých linií dochází v menší míře, než je tomu u kmenů ze stejné linie, a to především díky přítomnosti RM systémů. Toto zjištění je v souladu s naší studií, ve které jsme většinu typů plazmidů detekováli výhradně v rámci konkrétní CC. Corvaglia a kol. (2010) s touto teorií dále pracoval a přinesl podrobná data o SauI RM systému, konkrétně upozornil na variabilitu v proteinové sekvenci HsdS mezi CC klastry. Následkem této variability dochází přednostně k přenosu plazmidové DNA z jednoho CC do jiného, avšak ne 62

63 do kmenů CC jiného typu, např. přenos z kmenů CC8 je možný do kmenů CC5, ale ne do kmenů CC30. Tomuto přesně odpovídá námi popsaný výskyt plazmidů nesených napříč liniemi. Všechny tři typy takto detekovaných plazmidů byly nejdříve izolovány z kmenů CC8 a o dva roky později z kmenů CC5, žádný z nich nebyl popsán v kmeni CC30. Tato práce dále přináší důkaz o tom, že obsah plazmidů se u genotypově příbuzných kmenů může měnit, a to v relativně krátkém časovém období. Konkrétně byla zjištěna variabilita obsažených plazmidů u kmenů patřících do českého, berlínského a USA300 klonu. Z hlediska kmenů klonu USA300 můžeme konstatovat, že variabilita plazmidové DNA přispívá k rychlé evoluci tohoto invazivního kmene, což je v souladu s prací Highlander a kolektivu (Highlander a kol., 2007). Analýza plazmidů dále přináší informaci o klonálním šíření kmenů. Podobně jako Kennedy a kol. (2010) jsme zjistili, že kmeny klonu USA300 obsahují v podstatě identické plazmidy v různých kombinacích, a tedy, že se tyto kmeny rozšířily klonálně a v nedávné době. Plazmidy jakožto MGE disponují schopností přenosu z jedné hostitelské buňky do jiné. Bylo popsáno, že jedním z hlavních způsobů přenosu plazmidů u kmenů S. aureus je jejich obecná transdukce, tedy přenos zprostředkovaný bakteriofágem (Lindsay, 2008). Výjimku tvoří konjugativní a tzv. mobilizovatelné plazmidy, které nesou vlastní geny pro svůj přenos, u kmenů S. aureus však nejsou příliš frekventované. Ve studii Varga a kol. (2012) jsme experimentálně prokázali přenos penicilinázového a tetracyklinového plazmidu transdukujícími fágy z kmene klonu USA300 do laboratorního kmene RN4220, ale také do bezplazmidového kmene ze stejného klonu. Pro potřeby studie Mašlaňová a kol. (2012) byl rovněž úspěšně přenesen penicilinázový plazmid z kmene USA300 do kmene COL, který patří stejně jako všechny kmeny tohoto klonu do CC8. Všechny transdukce v rámci kmenů klonu USA300 vykazovaly vysokou frekvenci přenosu pohybující se kolem hodnoty 10-5 CFU/PFU, což je průkazně vyšší hodnota než uvádějí původní práce Asheshov (1969) nebo Kayser a kol. (1972). V naší studii Mašlaňová a kol. (2012) bylo metodou qpcr jednoznačně prokázáno a také kvantifikováno, že transdukující bakteriofágy sbalují do svého virionu plazmidy resp. plazmidové geny, a to s relativně vysokou frekvencí. Je tedy zřejmé, že transdukující bakteriofágy jakožto vektory přenosu plazmidů hrají v evoluci MRSA kmenů významnou roli a rovněž přispívají k šíření a adaptabilitě invazivních epidemických klonů jakým je např. výše uvedený USA300. Na závěr lze tedy shrnout, že plazmidy představují důležitou část MRSA genomu, a to tím, že přispívají k rezistenci k antibiotikům a také virulenci kmenů. Dále bylo zjištěno, že 63

64 obsah plazmidů u kmenů MRSA zachycených v České republice ve velké míře koreluje s příslušností kmenů k CCs a jejich subklonům. V neposlední řadě přítomnost tolika různých typů plazmidů v různých kombinacích vede k závěru, že tyto autonomní molekuly DNA hrají významnou roli v evoluci klonálních linií MRSA a v jejich genotypové různorodosti. Zásadními mediátory horizontálního transferu plezmidů jsou transdukující bakteriofágy, a to včetně přirozených profágů daných kmenů (Varga a kol., 2012, Maslanova a kol., 2012). 64

65 6. Závěr V následujícím přehledu jsou uvedeny nejdůležitější výsledky a z nich vyplývající závěry, ke kterým jsem během studia výše uvedené tématiky dospěla, a které byly rovněž uvedeny ve vložených publikacích. Z hlediska obsahu plazmidů byl studován soubor více než stočtyřiceti kmenů MRSA. Po podrobné charakterizaci kmenů s využitím současných molekulárně biologických a mikrobiologických metod bylo vytypováno 73 izolátů s různým genetickým pozadím, u kterých byla provedena podrobná analýza plazmidové DNA. Bylo zjištěno, že 89 % kmenů obsahovalo alespoň jeden extrachromozomální plazmid. Celkově bylo určeno 24 různých typů plazmidů, což představuje reprezentativní vzorek tohoto typu MGE u S. aureus. Byla stanovena kompletní sekvence tří plazmidů označených pdlk1, pdlk2 a pdlk3 (jejich přístupová čísla pro databáze GenBank/EMBL/DDBJ jsou GU562624, GU562625, GU562626). Srovnávací analýza sekvencí vedla ke zjištění, že plazmidy pdlk1 a pdlk2 jsou analogy již dříve popsaných plazmidů, což ukazuje na strukturní stabilitu a evoluční významnost plazmidů MRSA. Plazmid pdlk3 je naopak vysoce mozaikový plazmid obsahující specifické sekvence esenciální pro plazmidový přenos, z čehož vyplývá jeho možná role při horizontálním transferu plazmidů a také jde o důkaz rekombinace stafylokokových plazmidů. Dále byla sledována korelace mezi obsahem konkrétních typů plazmidů a příslušností kmene k CC. Bylo zjištěno, že většina plazmidů koreluje s CC typy. U plazmidů, které byly nalezeny u více typů CC, pak bylo zjištěno, že se vyskytují jen u omezeného množství konkrétních typů CC dle zásad variability v HsdS proteinu SauI RM systému tak, jak to popsal Corvaglia a jeho kolektiv. Variabilní obsah v podstatě identických plazmidů kmenů klonu USA300 ukazuje jednak na nedávné klonální říšení těchto kmenů, a také na roli plazmidů v evoluci klonu USA300. Dále bylo experimentálně prokázáno, že transdukující bakteriofágy se 65

66 významně podílí na přenosu plazmidů mezi kmeny tohoto klonu, a že jejich přirozené profágy mohou být po vhodné indukci - v našem případě po indukci UV zářením - rovněž úspěšným mediátorem horizontálního transferu plazmidů. S využitím metody qpcr byla provedena kvantifikace plazmidů v transdukujících fágových částicích získaných pomnožením na kmenech klonu USA300. Z výsledků byla patrná vyšší frekvence přenosu plazmidů v rámci stejné klonální linie. 66

67 7. Literatura 1. Asheshov E. H. (1969) The genetics of penicillinase production in Staphylococcus aureus strain PS80. J. Gen. Microbiol. 59: Baba T., Takeuchi F., Kuroda M., Yuzawa H., Aoki K., Oguchi A., Nagai Y., Iwama N., Asano K., Naimi T., Kuroda H., Cui L., Yamamoto K., Hiramatsu K. (2002) Genome and virulence determinants of high virulence community-acquired MRSA. Lancet 359: Bouchami O., Ben Hassen A., De Lencastre H., Miragaia M. (2011) Molecular epidemiology of methicillin-resistant Staphylococcus hominis (MRSHo): low clonality and reservoirs of SCCmec structural elements. PLoS One 6: e Brakstad O. G., Mæland J. A. (1997) Mechanisms of methicillin resistance in staphylococci. Review article. APMIS 105: Brady J. M., Stemper M. E., Weigel A., Chyou P. H., Reed K. D., Shukla S. K. (2007) Sporadic transitional community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains from health care facilities in the United States. J. Clin. Microbiol. 45: Caddick J. M., Hilton A. C., Rollason J., Lambert P. A., Worthington T., Elliott T. S. (2005) Molecular analysis of methicillin-resistant Staphylococcus aureus reveals an absence of plasmid DNA in multidrugresistant isolates. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 44: Capobianco J. O., Doran C. C., Goldman R. C. (1989) Mechanism of mupirocin transport into sensitive and resistant bacteria. Antimicrob. Agents Chemother. 33: Catchpole I, Thomas C, Davies A, Dyke KG (1988) The nucleotide sequence of Staphylococcus aureus plasmid pt48 conferring inducible macrolide lincosamide streptogramin B resistance and comparison with similar plasmids expressing constitutive resistance. J. Gen. Microbiol. 134: Clark N. C., Weigel L. M., Patel J. B., Tenover F. C. (2005) Comparison of Tn1546-like elements in vancomycin-resistant Staphylococcus aureus isolates from Michigan and Pennsylvania. Antimicrob. Agents Chemother. 49: Coia J. E., Noor-Hussain I., Platt D. J. (1988) Plasmid profiles and restriction enzyme fragmentation patterns of plasmids of methicillin-sensitive and methicillin-resistant 67

68 isolates of Staphylococcus aureus from hospital and the community. J. Med. Microbiol. 27: Corvaglia A. R., Francois P., Hernandez D., Perron K., Linder P., Schrenzel J. (2010) A type III-like restriction endonuclease functions as a major barrier to horizontal gene transfer in clinical Staphylococcus aureus strains. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107: Cristino J. A. G., Pereira A. T. (1989) Plasmid analysis of 219 methicillinresistant Staphylococcus aureus strains with uncommon profiles isolated in Lisbon. J. Hosp. Infect. 13: De Lencastre H., Oliveira D., Tomasz A. (2007) Antibiotic resistant Staphylococcus aureus: a paradigm of adaptive power. Curr. Opin. Microbiol. 10: Enright M. C., Robinson D. A., Randle G., Feil E. J., Grundmann H., Spratt B. G. (2002) The evolutionary history of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99: Gilbart J., Perry C. R., Slocombe B. (1993) High-level mupirocin resistance in Staphylococcus aureus: evidence for two distinct isoleucyl-trna synthetases. Antimicrob. Agents Chemother. 37: Goerke C., Pantůček R., Holtfreter S., Schulte B., Zink M., Grumann D., Bröker B. M., Doskar J., Wolz C. (2009) Diversity of prophages in dominant Staphylococcus aureus clonal lineages. J. Bacteriol. 191: doi: /JB Golding G. R., Bryden L., Levett P. N., McDonald R. R., Wong A., Wylie J., Graham M. R., Tyler S., Van Domselaar G., Simor A. E., Gravel D., Mulvey M. R. (2010) Livestockassociated Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Sequence Type 398 in Humans, Canada. Emerg Infect Dis. 16: doi: /eid Archer G. L., Scott J. (1991) Conjugative transfer genes in staphylococcal isolates from the United States. Antimicrob. Agents. Chemother. 35: Gordon R. J., Lowy F. D. (2008) Pathogenesis of methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection. Clin. Infect. Dis. 46(Suppl 5):S Grohmann E., Muth G., Espinosa M. (2003) Conjugative plasmid transfer in grampositive bacteria. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 67: Hanssen A. M., Ericson Sollid J. U. (2006) SCCmec in staphylococci: genes on the move. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 46: Hanslianová M. (2003) Meticilin rezistentní Staphylococcus aureus-výskyt ve fakultní nemocnici Brno. Oddělení Klinické mikroboilogie FN Brno. Brno. 68

69 23. Highlander S. K., Hultén K. G., Qin X. a kol. (2007) Subtle genetic changes enhance virulence of methicillin resistant and sensitive Staphylococcus aureus. BMC Microbiol. 7:99. doi: / Hiramatsu K, Suzuki E, Takayama H, Katayama Y, Yokota T. (1990) Role of penicillinase plasmids in the stability of the meca gene in methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob. Agents Chemother. 34: Hiramatsu K., Cui L., Kuroda M., Ito T. (2001) The emergence and evolution of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. TRENDS Microbiol. 9: Holden M. T., Feil E. J., Lindsay J. A. a kol. (2004) Complete genomes of two clinical Staphylococcus aureus strains: evidence for the rapid evolution of virulence and drug resistance. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101: Horinouchi S., Weisblum B. (1982) Nucleotide sequence and functional map of pc194, a plasmid that specifies inducible chloramphenicol resistance. J. Bacteriol. 150: Cheng A. G., DeDent A. C., Schneewind O., Missiakas D. (2011) A play in four acts: Staphylococcus aureus abscess formation. Trends Microbiol. 19: doi: /j.tim Epub 2011 Feb Ito T., Katayama Y., Hiramatsu K. (1999) Cloning and nucleotide sequence determination of the entire mec DNA of pre-methicillin-resistant Staphylococcus aureus N315. Antimicrob. Agents Chemother. 43: Ito T., Ma X. X., Takeuchi F., Okuma K., Yuzawa H., Hiramatsu K. (2004) Novel type V staphylococcal cassette chromosome mec driven by a novel cassette chromosome recombinase, ccrc. Antimicrob. Agents Chemother. 48: Jakubu V., Zemlickova H., Urbaskova P., Machova I. (2008) Meticillin-resistant Staphylococcus aureus clones recovered from bloodstream infections in Czech hospitals in Clin. Microbiol. Infect. 14: S Jeljaszewicz J., Młynarczyk A., Młynarczyk G. (1998) Present and future problems of antibiotic resistance in gram-positive cocci. Infection Jensen L. B., Garcia-Migura L., Løhr M., Aarestrup F. M. (2010) A classification system for plasmids from enterococci and other Gram-positive bacteria. J. Microbiol. Methods 80: Kahánková J., Pantůček R., Goerke C., Růžičková V., Holochová P., Doškař J. (2010) Multilocus PCR typing strategy for differentiation of Staphylococcus aureus siphoviruses reflecting their modular genome structure. Environ. Microbiol. 12:

70 35. Kayser F. H., Wust J., Corrodi P. (1972) Transduction and elimination of resistance determinants in methicillinresistant Staphylococcus aureus. Antimicrob. Agents Chemother. 2: Kennedy A. D., Porcella S. F., Martens C. a kol. (2010) Complete nucleotide sequence analysis of plasmids in strains of Staphylococcus aureus clone USA300 reveals a high level of identity among isolates with closely related core genome sequences. J. Clin. Microbiol. 48: Khan S. A., Nawaz M. S., Khan A. A., Cerniglia C. E. (2000) Transfer of erythromycin resistance from poultry to human clinical strains of Staphylococcus aureus. J. Clin. Microbiol. 38: Kuntová L., Pantůček R., Rájová J., Růžičková V., Petráš P., Mašlaňová I., Doškař J. (2012) Characteristics and distribution of plasmids in a clonally diverse set of methicillinresistant Staphylococcus aureus strains. Arch. Microbiol. 194: Kuroda M., Toshiko O., a kol. (2001) Whole genome sequencing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Lancet 357: Lacey R. W. (1980) Evidence for two mechanisms of plasmid transfer in mixed cultures of Staphylococcus aureus. J. General Microbiol. 119: Lacey R. W., Stokes A. (1979) Studies on recently isolated cultures of methicillin resistant Staphylococcus aureus. J. General Microbiol. 114: Lindsay, J. (2008) Staphylococcus: molecular genetics. Caister Academics, Norfolk, United Kingdom. 43. Lindsay J. A., Holden M. T. (2006a) Understanding the rise of the superbug: investigation of the evolution and genomic variation of Staphylococcus aureus. Funct. Integr. Genomics. 6: Lindsay J. A., Knight G. M., Budd E. L., McCarthy A. J. (2012) Shuffling of mobile genetic elements (MGEs) in successful healthcare-associated MRSA (HA-MRSA). Mob. Genet. Elements. 2: doi: /mge Lindsay J. A., Moore C. E., Day N. P., Peacock S. J., Witney A. A., Stabler R. A., Husain S. E., Butcher P. D., Hinds J. (2006b) Microarrays reveal the each of the ten dominant lineages of Staphylococcus aureus has a unique combination of surface-associated and regulatory genes. J. Bacteriol. 188: Lozano C., García-Migura L., Aspiroz C., Zarazaga M., Torres C., Aarestrup F. M. (2012) Expansion of a plasmid classification system for Gram-positive bacteria and 70

71 determination of the diversity of plasmids in Staphylococcus aureus strains of human, animal, and food origins. Appl. Environ. Microbiol.78: Mašlaňová I., Doškař J., Varga M., Kuntová L., Mužík J., Malúšková D., Růžičková V., Pantůček R. (2013) Bacteriophages of Staphylococcus aureus efficiently package various bacterial genes and mobile genetic elements including SCCmec with different frequencies. Environ. Microbiol. Reports 5: doi: /j x 48. Matsuoka M., Endou K., Kobayashi H., Inoue M., Nakajami Y. (1997) A dyadic plasmid that shows MLS and PMS resistance in Staphylococcus aureus. FEMS Microbiol. lett. 148: Melter O., De Sousa M. A., Urbášková P., Jakubů V., Žemličková H., De Lencastre H. (2003) Update on the major clonal types of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in the Czech Republic. J. Clin. Microbiol. 41: Melter O., Urbaskova P., Jakubu V., Mackova B., Zemlickova H. (2006) Czech participants in EARSS. Emergence of EMRSA-15 clone in hospitals throughout the Czech Republic. Euro Surveill 11: Available online: Michalová E., Novotná P., Schlegelová J. (2004) Tetracyklines in veterinary medicine and bacterial resistance to them. Vet. Med. Czech 49: Milheirico C., Oliveira D. C., De Lencastre H. (2007) Multiplex PCR strategy for subtyping the staphylococcal cassette chromosome mec type IV in methicillin-resistant Staphylococcus aureus: 'SCCmec IV multiplex'. J. Antimicrob. Chemother. 60: Mlynarczyk A., Mlynarczyk G., Jeljaszewicz J. (1998) The genome of Staphylococcus aureus: a review. Zentralbl. Bakteriol. 287: Novick R. P. (1989) Staphylococcal plasmids and their replication. Annu. Rev. Microbiol. 43: Novick R. P. (1991) Genetic systems in staphylococci. Methods. Enzymol. 204: Oliveira D. C., Wu S. W., de Lencastre H. (2000) Genetic organization of the downstream region of the meca element in methicillinresistant Staphylococcus aureus isolates carrying different polymorphisms of this region. Antimicrob. Agents Chemother. 44: Omoe K., Hu D. L., Omoe H. T., Nakane A., Shinagawa K. (2003) Identification and characterisation of a new staphylococcal enterotoxin-related putative toxin encoded by two kinds of plasmids. Infect. Immun. 71:

72 58. Projan S.J., Archer G.L. (1989) Mobilization of the relaxable Staphylococcus aureus plasmid pc221 by the conjugative plasmid pgo1 involves three pc221 loci. J. Bacteriol. 171: Roberts R. J., Vincze T., Posfai J., Macelis D. (2007) REBASE enzymes and genes for DNA restriction and modification. Nucleic. Acids. Res. 35: D269-D Robinson D. A., Enright M. C. (2003) Evolutionary Models of the Emergence of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob. agents chemother. 47: Rolain J. M., Francois P., Hernandez D. a kol. (2009) Genomic analysis of an emerging multiresistant Staphylococcus aureus strain rapidly spreading in cystic fibrosis patients revealed the presence of an antibiotic inducible bacteriophage. Biol Direct 4: Rountree, P. M., and Freeman, B. M. (1955). Infections Caused by a Particular Phage Type of Staphylococcus aureus. Med. J. Aust. 2: Rountree P. M., Beard M. A. (1958) Further observations on infection with phage type 80 staphylococci in Australia. Med. J. Aust. 45: Severin A., Wu S. W., Tabei K., Tomasz A. (2004) Penicillin-binding protein 2 is essential for expression of high-level vancomycin resistance and cell wall synthesis in vancomycin-resistant Staphylococcus aureus carrying the enterococcal vana gene complex. Antimicrob. Agents Chemother. 48: Shearer J. E. S., Wireman J., Hostetler J. a kol. (2011) Major families of multiresistant plasmids from geographically and epidemiologically diverse staphylococci. G3 (Bethesda) 1: Showsh S. A., De Boever E. H., Clewell D. B. (2001) Vancomycin resistance plasmid in Enterococcus faecalis that encodes sensitivity to a sex pheromone also produced by Staphylococcus aureus. Antimicrob. Agents Chemother. 45: Schmitz F. J., Fluit A. C., Gondolf M., Beyrau R., Lindenlauf E., Verhoef J., Heinz H. P., Jones M. E. (1999) The prevalence of aminogycoside resistance and corresponding resistance genes in clinical isolates of staphylococci from 19 European hospitals. J. Antimicrob. Chemother. 43: Schulz J., Friese A., Klees S., Tenhagen B. A., Fetsch A., Rösler U., Hartung J. (2012) LA-MRSA contamination of air and soil surfaces in the vicinity of pig barns: A longitudinal study. Appl. Environ. Microbiol. 78:

73 69. Skov R. L., Jensen K. S. (2009) Community-associated meticillin-resistant Staphylococcus aureus as a cause of hospital-acquired infections. J. Hosp. Infect. 73: Smillie C., Garcillan-Barcia M. P., Francia M. V., Rocha E. P. C., De La Cruz F. (2010) Mobility of plasmids. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74: Spiliopoulou I., Petinaki E., Papandreou P., Dimitracopoulos G. (2004) Erm(C) is the predominant genetic determinant for the expression of resistance to macrolides among methicillin-resistant Staphylococcus aureus clinical isolates in Greece. J. Antimicrob. Chemother. 53: Strommenger B., Kettlitz C., Werner G., Witte W. (2003) Multiplex PCR assay for simultaneous detection of nine clinically relevant antibiotic resistance genes in Staphylococcus aureus. J. Clin. Microbiol. 41: Sung J. M., Lindsay J. A. (2007) Staphylococcus aureus strains that are hypersusceptible to resistance gene transfer from enterococci. Antimicrob. Agents Chemother. 51: Taylor D. E., Gibreel A., Lawley T. D., Tracz D. M. (2004) Antibiotic resistance plasmids. p in Plasmid biology. Eds B. E. Funnell, G. J. Phillips ASM Press, Washington, Thomas W. D., JR., Archer G.L. (1989) Identification and cloning of the conjugative transfer region of Staphylococcus aureus plasmid pgo1. J. Bacteriol. 171: Thompson N. E., Pattee P. A. (1977) Transformation in Staphylococcus aureus: Role of bacteriophage and incidence of competence among strains. J. Bacteriol. 129: Tiemersma E. W., Bronzwaer S. L., Lyytikainen O., Degener J. E., Schrijnemakers P., Bruinsma N., Monen J., Witte W., Grundman H. (2004) European Antimicrobial Resistance Surveillance System Participants. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus in Europe, Emerg. Infect. Dis. 10: Tristan A., Bes M., Meugnier H., Lina G., Bozdogan B., Courvalin P., Reverdy M. E., Enright M. C., Vandenesch F., Etienne J. (2007) Global distribution of Panton-Valentine leukocidin positive methicillin-resistant Staphylococcus aureus, Emerg. Infect. Dis. 13: Tsubakishita S., Kuwahara Arai K., Sasaki T., Hiramatsu K. (2010) Origin and molecular evolution of the determinant of methicillin resistance in staphylococci. Antimicrob. Agents. Chemother. 54:

74 80. Ubelaker M. H., Rosenblum E.D. (1978) Transduction of plasmid determinants in Staphylococcus aureus and Escherichia coli. J. Bacteriol. 133: Udo E. E., Jacob L. E., Mathew B. (2001) Genetic analysis of methicillin-resistant Staphylococcus aureus expressing high- and low-level mupirocin resistance. J. Med. Microbiol. 50: Udo E. E., Grubb W. B. (1991) A new incompatibility group plasmid in Staphylococcus aureus. FEMS Microbiol. Lett. 78: Varga M., Kuntová L., Pantůček R., Mašlaňová I., Růžičková V., Doškař J. (2012) Efficient transfer of antibiotic resistance plasmids by transduction within methicillinresistant Staphylococcus aureus USA300 clone. FEMS Microbiol. Let. 332: Waldron D. E., Lindsay J. A. (2006) Sau1: a novel lineage-specific type I restrictionmodification system that blocks horizontal gene transfer into Staphylococcus aureus and between S. aureus isolates of different lineages. J. Bacteriol. 188 : Weigel L. M., Donlan R. M., Shin D. H., Jensen B., Clark N. C., McDougal L. K., Zhu W., Musser K. A., Thompson J., Kohlerschmidt D., Dumas N., Limberger R. J., Patell J. B. (2007) High-level vancomycin-resistant Staphylococcus aureus isolates associated with a polymicrobial biofilm. Antimicrob. Agents Chemother. 51: Wu S. W., de Lencastre H., Tomasz A. (2001) Recruitment of the meca gene homologue of Staphylococcus sciuri into a resistance determinant and expression of the resistant phenotype in Staphylococcus aureus. J. Bacteriol. 183: Yamaguchi T., Hayashi T., Takami H., Ohnishi M., Murata T., Nakayama K., Asakawa K., Ohara M., Komatsuzawa H., Sugai M. (2001) Complete nucleotide sequence of a Staphylococcus aureus exfoliative toxin B plasmid and identification of a novel ADPribosyltransferase. Infect. Immun. 69: Zscheck K. K., Murray B. E. (1993) Genes involved in the regulation of β-lactamase production on Enterococci and Staphylococci. Antimicrob. Agents Chemother. 37: Zuccarelli A. J., Roy I., Harding G. P., Couperus J. J. (1990) Diversity and stability of restriction enzyme profiles of plasmid DNA from methicillin-resistant Staphylococcus aureus. J. Clin. Microbiol. 28:

75 8. Příloha 8.0 Příloha č. 1 Evoluční model vzniku MRSA klonů CC5, CC8, CC22, CC30, CC45 podle Robinsona a Enrighta. Model byl vytvořen na základě analýzy sekvencí sas a housekeeping genů a dále spa a SCCmec typů. Velké kruhy představují předchůdce daných klonů. Menší kruhy představují nastupující klony. Šipky indikují směr a relativní množství změn mezi izoláty. U každého klonu je uvedeno jeho označení a země, kde byl izolován. Čísla v závorkách uvedená za názvem země udávají množství klonů. Kompletní genotyp je uveden vždy u předchůdce klonu: housekeeping geny arcc-aroe-glpf-gmk-pta-tpi-yqil (horní řádek), sas geny sasasasb-sasd-sase-sasf-sash-sasi (prostřední řádek) a spa repetice (spodní řádek). Empirická označení klonů jsou uvedeny v černých rámečcích. Tečkované čáry představují alternativní evoluční hypotézy. Izoláty pocházející z 50- a 60-tých let jsou označeny hvězdičkou, ostatní izoláty jsou z 80- a 90-tých let 20. stol. Zkratky zemí znamenají: Aus, Austrálie; Pol, Polsko; Por, Portugalsko; Slo, Slovensko; Swe, Švédsko; UK, Velká Británie; USA, Spojené státy americké. Zdroj: Robinson a Enright,

76 76

77 77

78 8.0 Příloha č. 2 Dodatkový materiál k publikaci Kuntová a kol., 2012 (supplementary material). Supplemental Figure 1. Twenty-four different plasmid types ranging in size from 1.3 to 55 kb and designated P1 P24 were revealed based on undigested (a) as well as HindIII digested (b) plasmid DNA analysis by agarose gel electrophoresis. Lanes: molecular weight markers SC (Supercoiled Ladder), 2Log (2- Log DNA Ladder), plasmid profiles P1 P24. The plasmid profiles contain the particular plasmid types from Table 1 as follows: Penicillinase plasmids 20 kb (P15), 26 kb (P12), 27 kb (P9, P11), 28 kb (P14), 30 kb (P16, P17), 31 kb (P10), 36 kb (P21), and 55 kb (P1); Conjugative plasmid 38 kb (P6, P7); Enterotoxin D plasmid kb (P20, P23, P24); Tetracycline resistance plasmid 4 kb (P7); Erythromycin resistance plasmid 2.4 kb(p2, P12, P13, P23, P24); Chloramphenicol resistance plasmid 2.9 kb (P12, P13); Cryptic plasmids 1.3 kb (P15), 1.5 kb (P17), 2 kb (P3), 2.2 kb (P2, P4), 3 kb (P8, P9), and 3.5 kb (P5). 78

Zobrazit více