Pfiíruãka QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit

Transkript

1 Leden 2004 Pfiíruãka QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit Σ 50 IVD Souprava QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit je generický systém, který využívá technologii QIAamp pro manuální izolaci a purifikaci genomové DNA ze vzorků plné lidské krve pro in vitro diagnostické účely. Souprava není určena k použití pro tkáňové vzorky nebo pro vzorky stolice. Souprava není rovněž určena k izolaci nebo purifikaci bakteriálních, fungálních nebo parazitárních nukleových kyselin ani k izolaci a purifikaci RNA. Účinnost soupravy při izolaci a purifikaci virové DNA nebyla hodnocena. Účinnost soupravy nebyla hodnocena pro krevní sraženinu, kultivované nebo izolované buňky, stěry, zaschlé krevní skvrny a bezbuněčné tkáňové tekutiny, jakými jsou například likvor, plazma nebo moč. Pouze pro in vitro diagnostické účely. REF H B /2004 QIAGEN GmbH, D Hilden, Tel: R1 MAT CZ

2 Ochranné známky: QIAGEN, QIAamp, QIAvac (QIAGEN Group); BD Vacutainer (Becton, Dickinson and Company); Eppendorf (Eppendorf-Netheler- Hinz GmbH); Monovette (Sarstedt AG & Co.); Vacuette (Greiner Bio-One). Registrované názvy, ochranné známky, atd. používané v tomto dokumentu, dokonce ani pokud nejsou jako takové označeny, nelze považovat za nechráněné právními předpisy. Technika PCR je chráněna U.S. Patenty 4,683,195 a 4,683,202 a ekvivalentními zahraničními patenty ve vlastnictví firmy Hoffmann-La Roche AG QIAGEN, všechna práva vyhrazena. 2 Příručka QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 01/2004

3 Obsah SloÏení soupravy 4 Symboly 5 Uchovávání 6 ízení jakosti 6 Zam lené pouïití 6 Omezení pro pouïití produktu 6 Bezpeãnostní informace 7 Úvod 9 Princip a popis metody 9 Vybavení a reagencie, které má zajistit uïivatel 14 DÛleÏité poznámky 15 Důležité body před zahájením protokolu 15 Příprava reagencií a pufrů 15 Eluce genomové DNA 16 Výtěžek a kvalita genomové DNA 16 Nastavení vakuového systému QIAvac 24 Plus 17 Protokoly Izolace a purifikace genomové DNA z krevních vzorkû pomocí vakuového systému 20 Izolace a purifikace genomové DNA z krevních vzorkû pomocí mikrocentrifugace 23 Distributofii firmy QIAGEN 27 Příručka QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 01/2004 3

4 SloÏení soupravy Pfiíruãka QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit Katalogové ãíslo Poãet stanovení 50 QIAamp Mini Kolonky QIAamp Mini Spin COL 50 Spin s promývacími zkumavkami (WT) (2 ml) ET Eluční zkumavky (1,5 ml) ELU TUBE 50 VC Vakuové konektory (VacConnectors) VAC CON 50 LT Lyzační zkumavky (1,5 ml) LYS TUBE 50 WT Promývací zkumavky (2 ml) WASH TUBE 3 x 50 AL Lyzační pufr* LYS BUF 12 ml AW1 Promývací pufr 1* (koncentrát) WASH BUF 1 CONC 19 ml AW2 Promývací pufr 2 (koncentrát) WASH BUF 2 CONC 13 ml AE Eluční pufr ELU BUF 25 ml PS Roztok pro ředění proteáz QPROT SOLV 2 ml QP QIAGEN Proteáza QPROT 1 lahvička CD H B 1 Příručka H B 1 * Obsahuje guanidin hydrochlorid. Není kompatibilní s dezinfekčními přípravky obsahujícími bělící prostředky. Bližší informace: viz strana 7. Obsahuje azid sodný jako konzervační látku. Rozpouštěcí objem 1,2 ml. 4 Příručka QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 01/2004

5 2 C 8 C Symboly Σ 50 i IVD REF LOT MAT COMP VOL i Souprava obsahuje reagencie pro přípravu 50 vzorků Viz informace v příručce Použít do (datum exspirace) Prostředky zdravotnické techniky pro in vitro diagnostiku Katalogové číslo Číslo šarže Číslo materiálu Komponenty Objem Teplotní meze Oprávněný výrobce Při doručení Důležitá poznámka Po provedení daného kroku protokolu s tímto označením si vyměňte rukavice Otevřít při převzetí; uchovávejte kolonky QIAamp Mini Spin při 2 8 C? EtOH ADD CONT LYOPH RCNS EtOH GuHCI SUBT Zapište datum přidání ethanolu do lahve Přidání Obsahuje Lyofilizováno Rozpusťte v Ethanol Guanidin hydrochlorid Subtilisin Pokračujte směrem k Příručka QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 01/2004 5

6 Uchovávání Kolonky QIAamp Mini Spin je nutné po převzetí uchovávat při teplotě 2 8 C. Všechny pufry mohou být uchovávány při laboratorní teplotě (15 25 C). Lyofilizovaná proteáza QIAGEN (QP) může být uchovávána při laboratorní teplotě (15 25 C) po dobu až 2 let, aniž by došlo ke snížení její účinnosti. Rozpuštěná proteáza QIAGEN (QP) uchovávaná při teplotě 2 8 C je stabilní po dobu jednoho roku. Rozpuštěný promývací pufr 1 (AW1) a rozpuštěný promývací pufr 2 (AW2) jsou stabilní po dobu 1 roku, pokud jsou uchovávany při laboratorní teplotě (15 25 C). ízení jakosti V souladu s certifikovaným systémem řízení jakosti firmy QIAGEN (Total Quality Management System) je každá šarže soupravy QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit podrobena testům předem definovaných parametrů, které zajišťují odpovídající jakost produktů. Zam lené pouïití Souprava QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit je generický systém, který využívá technologii QIAamp pro manuální izolaci a purifikaci genomové DNA ze vzorků plné lidské krve pro in vitro diagnostické účely. Jako vzorek je možné použít čerstvou nebo zmraženou lidskou krevní plazmu ošetřenou EDTA nebo citratem, avšak nikoliv heparinem, získanou prostřednictvím běžných systémů pro odběr krve. Produkt je určen k použití profesionálními pracovníky, např. techniky nebo lékaři školenými v technikách molekulární biologie. Je určen k použití s jakoukoliv následnou diagnostickou aplikací využívající enzymatickou amplifikaci nebo jinou enzymatickou modifikaci DNA a následovanou detekcí nebo amplifikací signálu. Veškeré diagnostické výsledky získané pomocí postupu pro přípravu vzorků v souladu s jakýmkoliv následným diagnostickým testem musí být interpretovány s přihlédnutím k ostatním klinickým a laboratorním nálezům. Pro minimalizaci odchylek diagnostických výsledků je nutné použít adekvátní kontroly pro následné aplikace. Omezení pro pouïití produktu Souprava není určena k použití pro tkáňové vzorky nebo pro vzorky stolice. Souprava není rovněž určena k izolaci nebo purifikaci bakteriálních, fungálních nebo parazitárních nukleových kyselin ani k izolaci a purifikaci RNA. Účinnost soupravy při izolaci a purifikaci virové DNA nebyla hodnocena. Účinnost soupravy nebyla hodnocena pro krevní sraženinu, kultivované nebo izolované buňky, stěry, zaschlé krevní skvrny a bezbuněčné tkáňové tekutiny, jakými jsou například likvor, plazma nebo moč. 6 Příručka QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 01/2004

7 Bezpeãnostní informace Při práci s chemikáliemi vždy používejte vhodný laboratorní plášť, rukavice na jedno použití a ochranné brýle. Další informace jsou uvedeny v odpovídajících bezpečnostních listech. Bezpečnostní listy jsou k dispozici online v pohodlném a kompaktním formátu PDF na stránkách kde můžete nalézt, zobrazit a vytisknout příslušný bezpečnostní list pro každou soupravu QIAGEN a pro každou komponentu těchto souprav. POZOR: NEP IDÁVEJTE roztoky bûlících prostfiedkû nebo kyselin pfiímo do odpadních materiálû z pfiípravy vzorkû. Lyzační pufr (AL) a promývací pufr 1 (AW1) obsahují guanidin hydrochlorid, který může v kombinaci s bělícími prostředky tvořit vysoce reaktivní látky. V případě rozlití tekutin obsahujících tyto pufry vyčistěte kontaminované místo vhodným laboratorním detergentem a vodou. Pokud rozlitá tekutina obsahuje potenciálně infekční látky, vyčistěte zasaženou oblast nejprve laboratorním detergentem a vodou a poté 1% (vol) roztokem chlornanu sodného. Jestliže jsou lahve s pufrem poškozeny nebo prosakují, použijte při likvidaci těchto lahví rukavice a ochranné brýle, abyste zabránil/a poškození vašeho vlastního zdraví nebo zdraví jiných osob. Firma QIAGEN netestuje tekutý odpad vzniklý použitím metody QIAamp DSP DNA Blood Mini na přítomnost reziduálních infekčních materiálů. Kontaminace odpadní tekutiny reziduálními infekčními materiály je vysoce nepravděpodobná, nelze ji však zcela vyloučit. Tekutý odpad je proto nutné považovat za infekční a je nutné s ním zacházet a likvidovat jej v souladu s místními bezpečnostními předpisy. Příručka QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 01/2004 7

8 Pro komponenty soupravy QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit platí tyto R-věty a S-věty: Lyzaãní pufr (AL) a prom vací pufr 1 (AW1) Obsahuje guanidin hydrochlorid: zdraví škodlivý, dráždivý R-věty a S-věty:* R22-36/38, S Proteáza QIAGEN (QP) Obsahuje subtilisin: senzitizující, dráždivý R-věty a S-věty:* R37/ , S /37/ hodinová nouzová linka Nouzové lékařské informace je možné získat v anglickém, francouzském a německém jazyce 24 hodin denně na telefonním čísle: Poison Information Center Mainz, Německo Tel: * R22: Zdraví škodlivý při požití; R36/38: Dráždí oči a kůži; R37/38: Dráždí dýchací orgány a kůži; R41: Nebezpečí vážného poškození očí; R42: Může vyvolat senzibilizaci při vdechování; S13: Uchovávejte odděleně od potravin, nápojů a krmiv; S22: Nevdechujte prach; S24: Zamezte styku s kůží; S26: Při zasažení očí okamžitě důkladně vypláchněte vodou a vyhledejte lékařskou pomoc; S36: Používejte vhodný ochranný oděv; S36/37/39: Používejte vhodný ochranný oděv, ochranné rukavice a ochranné brýle nebo obličejový štít; S46: Při požití okamžitě vyhledejte lékařskou pomoc a ukažte tento obal nebo označení. 8 Příručka QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 01/2004

9 Úvod Souprava QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit využívá zavedenou technologii k rychlé a jednoduché izolaci a purifikaci genomové DNA ze vzorku plné krve o objemu 200 µl. Purifikovanou DNA je možné spolehlivě použít v následných aplikacích, např. v PCR. Jednoduchá metoda QIAamp DSP DNA Blood Mini, která je určena pro simultánní zpracování několika krevních vzorků, umožňuje získat čistou DNA pro další použití. Metoda je vhodná k použití s čerstvou nebo zmraženou plnou krví a s krví ošetřenou citratem nebo EDTA. Předchozí separace leukocytů není nutná. Metoda nevyžaduje fenol/chloroformovou extrakci ani precipitaci alkoholem; metoda vyžaduje pouze minimální zásahy ze strany uživatele a umožňuje tak bezpečné zacházení s potenciálně infekčními vzorky. Metody jsou navrženy tak, aby nedocházelo ke křížové kontaminaci vzorků. Purifikovanou DNA lze použít v PCR nebo v jiných aplikacích nebo může být skladována při 20 C pro pozdější použití. Princip a popis metody Každá metoda QIAamp DSP DNA Blood Mini zahrnuje 4 kroky: Lyze erytrocytů v krevním vzorku Vázání genomové DNA v buněčném lyzátu k membráně kolonky QIAamp Mini Spin Promytí membrány Eluce genomové DNA z membrány Tato příručka obsahuje protokoly pro 2 alternativní metody QIAamp DSP DNA Blood Mini : centrifugační (spin) metodu, který vyžaduje centrifugu, a vakuovou metodu s využitím vakuového systému, která vyžaduje použití centrifugy a vakuového systému (viz schéma, strana 13). Vzorek Po provedení odběru je možné uchovávat vzorky krve při laboratorní teplotě (15 25 C) po dobu až 6 hodin nebo při teplotě 2 8 C po dobu max. 24 hodin. Pro dlouhodobé skladování doporučujeme zamražení vzorků při 20 C nebo 80 C. Kryoprecipitáty vznikající při rozmražování zmražených vzorků mohou ucpat membránu kolonky QIAamp Mini Spin. Pokud jsou patrné kryoprecipitáty, dbejte na to, aby nedošlo k jejich nasátí při aspiraci vzorku. Byl prokázán vliv zmrazování a rozmrazování krevních vzorků na purifikaci DNA pomocí soupravy QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit (Obrázek1). Příručka QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 01/2004 9

10 Vliv opakovan ch cyklû zmrazování a rozmrazování na v tûïek DNA z krve o etfiené pomocí EDTA 125 Yield normalized to fresh sample (%) Fresh Number of freeze/thaw cycles Obrázek 1 Krev ošetřená EDTA byla zamražena a rozmražena celkem třikrát a poté byla použita k purifikaci DNA pomocí soupravy QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit. Vypočítané výtěžky DNA jsou vztaženy na výtěžek z čistého vzorku (100%). Každý sloupec grafu zahrnuje výsledky ze 32 opakování (průměr ± standardní odchylka). Množství DNA purifikované metodami QIAamp DSP DNA Blood Mini závisí na obsahu bílých krvinek v jednotlivých krevních vzorcích. Pomocí centrifugační (spin) nebo vakuové metody se provádí purifikace genomové DNA ze vzorků krve o objemu 200 µl získaných od zdravých dárců. K odběru vzorků krve pro metody QIAamp DSP DNA Blood Mini (Tabulka 1) je možné použít různé odběrové zkumavky a antikoagulační přípravky. Tabulka 1. PrÛmûrné relativní v tûïky DNA ze vzorkû krve odebran ch pomocí rûzn ch odbûrov ch zkumavek a antikoagulaãních látek Nominální PrÛmûrn Odbûrová zkumavka V robce Kat. ã. objem v tûïek* BD Vacutainer 9NC BD ml 6,4 µg BD Vacutainer K3E BD ml 6,6 µg BD Vacutainer K2E BD ml 6,4 µg S-Monovette EDTA Sarstedt ml 6,5 µg S-Monovette CPDA1 Sarstedt ,5 ml 6,3 µg Vacuette K3E Greiner ml 6.5 µg Bio-One Vacuette 9NC Greiner ml 6,3 µg Bio-One * Pro každou odběrovou zkumavku byl stanoven průměrný výtěžek z 11 vzorků měřených ve třech opakováních. 10 Příručka QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 01/2004

11 Lineární rozsah výtěžku DNA získaného pomocí vakuové metody QIAamp DSP DNA Blood Mini byl stanoven pro krev ze zdravých dárců s počtem leukocytů 3,8 x ,34 x 10 7 buněk/ml (Obrázek 2). Lineární rozsah v tûïku DNA získaného pomocí vakuové metody QIAamp DSP DNA Blood Mini z 200 µl eluãního objemu. 14 Yield (µg/sample) White blood cell count (x 10 6 cells/ml) Obrázek 2 Stanovené počty leukocytů u zdravých dárců se pohybovaly v rozmezí 3,8 x ,34 x 10 7 buněk/ml. DNA byla purifikována z krevních vzorků pomocí vakuové metody QIAamp DSP DNA Blood Mini z 200 µl elučního objemu. Bylo zpracováno osmdesát sedm vzorků, každý ve třech opakováních. Lyze krevních bunûk Vzorky jsou lyzovány za denaturačních podmínek při zvýšených teplotách. Lyze se provádí v přítomnosti proteázy QIAGEN (QP) a lyzačního pufru (AL). Vázání genomové DNA k membránû kolonky QIAamp Mini Spin Pro optimalizaci vázání genomové DNA k membráně kolonky QIAamp Mini Spin se nejprve přidá k lyzátům ethanol. Poté se každý lyzát nanese na kolonku QIAamp Mini Spin a genomová DNA je adsorbována na silikagelovou membránu při průchodu lyzátu indukovaném podtlakem nebo odstředivou silou. Odstranûní reziduálních kontaminant Zatímco genomová DNA zůstává vázána na membránu kolonky QIAamp Mini Spin, kontaminanty se účinně vymývají nejprve promývacím pufrem 1 (AW1) a poté promývacím pufrem 2 (AW2). Příručka QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 01/

12 Eluce ãisté genomové DNA Genomová DNA je eluována z membrány kolonky QIAamp Mini Spin pomocí µl elučního pufru (AE). Eluovanou DNA lze použít v dalších následných testech. Byl prokázán vliv elučního objemu a objemu eluátu používaného při PCR na účinnost PCR (Tabulka 2). Tabulka 2. Vliv elučního objemu a objemu eluátu používaného při PCR na účinnost PCR Objem eluátu pro 50 µl PCR* Eluãní objem 2 µl 5 µl 10 µl 50 µl 100 % 100 % 100 % 100 µl 100 % 100 % 97 % 200 µl 100 % 100 % 100 % * Hodnoty ukazují úspěšnost PCR a představují průměr ze 48 vzorků. Při testech vlivu skladování na eluáty získané pomocí soupravy QIAamp DNA Blood Mini Kit, tj. soupravy pro běžné laboratorní použití využívající identickou technologii, bylo prokázáno, že DNA eluovaná z kolonek QIAamp Mini Spin v pufru AE je stabilní po dobu 8 let, pokud je uchovávána při teplotě buď 5 C nebo 20 C (Obrázek 3). Dlouhodobé studie stability eluátů získaných pomocí soupravy QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit probíhají a dosud nebyly dokončeny. Dlouhodobá stabilita DNA izolované a purifikované na kolonkách QIAamp Mini Spin M 2 8 C 20 C M Obrázek 3 DNA byla purifikována pomocí soupravy QIAamp DNA Blood Mini Kit, eluována ve 200 µl pufru AE a uchovávána buď při 2 8 C nebo při 20 C po dobu 8 let. Vzorky DNA byly analyzovány na agarózovém gelu po obarvení ethidium bromidem. M: marker. 12 Příručka QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 01/2004

13 Spin Procedure Sample Metody QIAamp DSP DNA Blood Mini Vacuum Procedure Sample Pfied zahájením si peãlivû proãtûte protokoly (strana 20 a 23) Do LT přidejte 20 µl QP, 200 µl vzorku a 200 µl AL Lyse Míchejte 15 s na vortexu Inkubujte 10 min (±1 min) při 56 C (±1 C) Přidejte 200 µl ethanolu Míchejte 15 s na vortexu Bind Přeneste lyzát na kolonku QIAamp Mini Spin Vacuum Centrifugační (spin) metoda: centrifugujte 1 minutu přibližně při 6000 x g Vakuová metoda: vytvořte podtlak Wash (AW1) Vacuum Centrifugační (spin) metoda: vložte kolonku QIAamp Mini Spin do nové zkumavky WT, přidejte 500 µl AW1, a centrifugujte 1 minutu přibližně při 6000 x g Wash (AW2) Vakuová metoda: přidejte 750 µl AW1 a vytvořte podtlak Vacuum Centrifugační (spin) metoda: vložte kolonku QIAamp Mini Spin do nové zkumavky WT, přidejte 500 µl AW2, a centrifugujte 1 minutu přibližně při x g Dry Spin Vakuová metoda: přidejte 750 µl AW2 a vytvořte podtlak Vložte kolonku QIAamp Mini Spin do zkumavky WT Elute Centrifugujte 3 minuty přibližně při x g Vložte kolonku QIAamp Mini Spin do zkumavky ET Přidejte µl AE a inkubujte 1 minutu Pure genomic DNA Centrifugujte 1 minutu přibližně při 6000 x g Příručka QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 01/

14 Vybavení a reagencie, které má zajistit uïivatel. Při práci s chemikáliemi vždy používejte vhodný laboratorní plášť, rukavice na jedno použití a ochranné brýle. Další informace jsou uvedeny v odpovídajících bezpečnostních listech, které lze získat od dodavatele produktu. Pro centrifugaãní (spin) metodu a vakuovovu metodu Ethanol (96 100%) Pipety* a pipetovací špičky (pro zamezení křížové kontaminace doporučujeme používat pipetovací špičky s aerosolovými bariérami) Rukavice na jedno použití Termoblok* pro lyzi vzorků při 56 C (doporučujeme Eppendorf Thermomixer comfort s termoblokem pro 1,5 ml mikrozkumavky ) Mikrocentrifuga* Odměrný válec (50 ml) Vortex Pouze pro vakuovou metodu Vakuový systém QIAvac 24 Plus (QIAvac 24 Plus, kat. č , QIAvac Connecting System, kat. č , a vakuová pumpa Vacuum Pump kat. č ) nebo ekvivalentní standardní laboratorní vakuový systém * Pro zajištění správného zpracování vzorků při metodách DSP DNA Blood Mini doporučujeme použití nástrojů (tj. pipet a zahřívacích bloků) kalibrovaných podle doporučení výrobce. Uvedený výčet není úplný a nezahrnuje řadu důležitých materiálů a pomůcek používaných v biologické laboratoři. 14 Příručka QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 01/2004

15 DÛleÏité poznámky DÛleÏité body pfied zahájením protokolu Po obdržení soupravy zkontrolujte, zda nejsou její komponenty poškozeny. V případě poškození blistrového obalu kontaktujte oddělení technických služeb QIA- GEN Technical Services nebo místního distributora. V případě rozlití postupujte podle bezpečnostních pokynů (strana 7). Nepoužívejte poškozené komponenty soupravy, použití poškozených komponent by mohlo negativně ovlivnit účinnost soupravy. Před každým přenosem kapalných materiálů vyměňte pipetovací špičku. Pro zamezení křížové kontaminace doporučujeme použít pipetovací špičky s aerosolovou bariérou. Všechny kroky centrifugace se provádějí při laboratorní teplotě (15 25 C). Používejte vždy rukavice na jedno použití a pravidelně kontrolujte, zde nedošlo k jejich kontaminaci testovaným vzorkem. Pokud dojde ke kontaminaci rukavic, vyhoďte rukavice do odpadu. Pro zamezení křížové kontaminace neotevírejte více zkumavek současně. Při práci se soupravou nepoužívejte komponenty jiných souprav, pokud nemají stejné číslo šarže. Zamezte mikrobiální kontaminaci reagencií soupravy. Pro zajištění ochrany před potenciálně infekčními materiály doporučujeme pracovat za podmínek laminárního proudění až do lyze vzorků. Tuto soupravu smí používat pouze personál školený v in vitro laboratorních metodách. Pfiíprava reagencií a pufrû Pfiíprava QIAGEN proteázy Přidejte 1,2 ml roztoku pro ředění proteázy (PS) do lahvičky s lyofilizovanou proteázou QIAGEN (QP) a důkladně promíchejte. Pro zamezení tvorby pěny míchejte několikanásobným převrácením lahvičky. Ujistěte se, že je QIAGEN proteáza (QP) zcela rozpuštěná. i Nepřidávejte QIAGEN proteázu (QP) přímo do lyzačního pufru (AL). Pfiíprava prom vacího pufru 1 Pomocí odměrného válce přidejte 25 ml ethanolu (96 100%) do lahve obsahující 19 ml koncentrátu promývacího pufru 1 (AW1). Rozpuštěný promývací pufr 1 (AW1) uchovávejte při laboratorní teplotě (15 25 C). i Před zahájením metody vždy promíchejte rozpuštěný promývací pufr 1 (AW1) několikanásobným převrácením lahve. Příručka QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 01/

16 Pfiíprava prom vacího pufru 2 Pomocí odměrného válce přidejte 30 ml ethanolu (96 100%) do lahve obsahující 13 ml koncentrátu promývacího pufru 2 (AW2). Rozpuštěný promývací pufr 2 (AW2) uchovávejte při laboratorní teplotě (15 25 C). i Před zahájením metody vždy promíchejte rozpuštěný promývací pufr 2 (AW2) několikanásobným obrácením lahve. Pfiíprava eluãního pufru Jedna lahev elučního pufru (AE) je součástí soupravy. Protože je nutné zamezit kontaminaci elučního pufru (AE), doporučujeme k pipetování elučního pufru (EF) z lahve používat pipetovací špičky s aerosolovou bariérou a okamžitě po odpipetování pufru vyměnit uzávěr lahve. Po prvním použití lahve s elučním pufrem (AE) uchovávejte lahev při teplotě 2 8 C. Před každým dalším použitím vytemperujte eluční pufr (AE) na laboratorní teplotu (15 25 C). i Eluční pufr (AE) obsahuje jako konzervační látku azid sodný, který vykazuje absorbanci při 260 nm. Při kvantifikaci DNA v eluátu měřením absorbance při 260 nm, při stanovení čistoty DNA v eluátu měřením absorbance při 260 nm a 280 nm, nebo při skenování absorbance v rozmezí vlnových délek 220 nm až 250 nm proto vždy dbejte na to, aby blank obsahoval stejnou koncentraci azidu sodného jako eluát. Například při přípravě eluátu pro měření absorbance ředěním 50 µl eluátu ve 100 µl vody je nutné připravit blank ředěním 50 µl elučního pufru (AE) ve 100 µl vody. Pro ředění používejte čerstvou destilovanou vodu. Eluce genomové DNA Objem DNA eluované z kolonky QIAamp Mini Spin může být až o 20 µl nižší než objem elučního pufru (AE) naneseného na kolonku. Objem získaného eluátu závisí na povaze vzorku. Eluční pufr (AE) je nutné před aplikací na kolonku vytemperovat na laboratorní teplotu (15 25 C). Eluovaná DNA se jímá do elučních zkumavek (ET). V případě skladování DNA po dobu do 4 týdnů doporučujeme uchovávat při teplotě 2 8 C. Pro dlouhodobé skladování doporučujeme uchovávat při teplotě 20 C. V tûïek a kvalita genomové DNA Výnosem a kvalitou je izolovaná genomová DNA vhodná pro všechny typy následných detekčních metod v molekulární diagnostice. Diagnostické testy musí být prováděny podle pokynů výrobce. 16 Příručka QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 01/2004

17 Nastavení vakuového systému QIAvac 24 Plus Dbejte na správné nastavení kolonky QIAamp Mini Spin, vakuového konektoru (Vac- Connector - VC) a vakuového ventilku (VacValve) (viz Obrázek 4) Obrázek 4 Sestavení komponent soupravy QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit pro vakuové zpracování vzorků: 1: Vakuový ventilek (VacValve) (dodává se s vakuovým systémem) 3: Kolonka QIAamp Mini Spin 2: Vakuový konektor (VacConnector) (VC) V případě použití vakuové metody se systémem QIAvac 24 Plus doporučujeme označit lyzační zkumavky (LT), eluční zkumavky (ET) a kolonky QIAamp Mini Spin podle schématu na obrázku 5, tímto značením se zamezí záměně vzorků. Obrázek je možné oxeroxovat a označit názvy vzorků. Doporučujeme použít obdobné schéma i v případě použití jiných vakuových systémů nebo centrifugačních (spin) metod. Příručka QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 01/

18 Příručka QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 01/2004

19 Datum: UÏivatel: Pracovní ID ãíslo: Obrázek 5 Schéma značení pro lyzační zkumavky (LT), eluční zkumavky (ET) a kolonky QIAamp Mini Spin pro použití s vakuovým systémem QIAvac 24 Plus. Příručka QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 01/

20 Vacuum Protocol Protokol: Izolace a purifikace genomové DNA z krevních vzorkû pomocí vakuového systému Pro izolaci a purifikaci genomové DNA ze vzorku 200 µl plné krve ošetřené EDTA nebo citratem pomocí vakuového systému, např. QIAvac 24 Plus. DÛleÏit bod pfied zahájením Níže uvedený postup obsahuje pokyny pro zpracování jednoho vzorku krve. Pomocí vakuového systému QIAvac 24 Plus je však možné zpracovat až 24 vzorků současně. Co je nutné provést pfied zahájením Vytemperujte vzorky na laboratorní teplotu (15 25 C) a důkladně je promíchejte. Pokud se v lyzačním pufru (AL) vytvořil precipitát, rozpusťte jej zahřátím ve vodní lázni při 56 C. Promývací roztok 1 (AW1), promývací roztok 2 (AW2) a proteáza QIAGEN (QP) musí být připraveny podle pokynů v důležitých poznámkách na straně 15. Pro použití v kroku 14 vytemperujte eluční pufr (AE) na laboratorní teplotu (15 25 C). Nastavte zahřívací blok na 56 C pro použití v kroku 4. Pro zamezení křížové kontaminace vložte vakuový konektor (VacConnector VC) do každého luer adaptéru vakuového systému. Zkontrolujte, zda je prázdná nádoba na odpadní materiály a zda jsou všechny spoje řádně propojeny. Podrobné informace o provozu vakuového systému, zejména informace o údržbě, jsou uvedeny v příručce přiložené k tomuto systému. Postup 1. Pomocí pipety naneste 20 µl proteázy QIAGEN (QP) do lyzaãní zkumavky (LT). i Před použitím zkontrolujte datum exspirace rozpuštěné proteázy. 2. Pfiidejte 200 µl vzorku krve do lyzaãní zkumavky (LT). 3. Pfiidejte 200 µl lyzaãního pufru (AL) do lyzaãní zkumavky (LT), uzavfiete víãko a míchejte po dobu 15 s na pulsním vortexu. Pro zajištění účinné lyze je nezbytné důkladně promíchat vzorek a lyzační pufr (AL) do homogenního roztoku. i Vzhledem k vysoké viskozitě lyzačního pufru (AL) dbejte na přidání správného množství lyzačního pufru (AL) pečlivým odpipetováním nebo použitím vhodné pipety, například vícekrokové pipety Eppendorf nebo ekvivalentního zařízení. i Nepřidávejte QIAGEN proteázu (QP) přímo do lyzačního pufru (AL). 20 Příručka QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 01/2004

21 4. Inkubujte 10 min (±1 min) pfii 56 C (±1 C). 5. Centrifugujte lyzaãní zkumavku (LT) po dobu minimálnû 5 sekund pfii maximální rychlosti, tímto krokem se odstraní kapky z vnitfiní strany víãka. 6. Pfiidejte 200 µl ethanolu (96 100%) do lyzaãní zkumavky (LT), uzavfiete víãko a promíchejte dûkladnû po dobu 15 s na pulsním vortexu. 7. Centrifugujte lyzaãní zkumavku (LT) po dobu minimálnû 5 sekund pfii maximální rychlosti, tímto krokem se odstraní kapky z vnitfiní strany víãka. 8. VloÏte kolonku QIAamp Mini Spin do vakuového konektoru (VacConnector VC) vakuového systému. 9. Opatrnû naneste cel lyzát z kroku 6 na kolonku QIAamp Mini Spin, aniï by do lo k navlhãení jejího okraje. Nedot kejte se membrány kolonky QIAamp Mini Spin pipetovací piãkou. i V případě souběžného zpracování několika vzorků mějte vždy otevřenou pouze jednu lyzační zkumavku (LT). 10. Zapnûte vakuovou pumpu. Po prûchodu lyzátu pfies kolonku QIAamp Mini Spin otevfiete ventil vakuového systému a uvolnûte podtlak. i Při souběžném zpracování několika kolonek QIAamp Mini Spin doporučujeme po průchodu lyzátu uzavřít vakuový ventilek (VacValve) každé kolonky, tímto postupem se sníží doba potřebná k uskutečnění tohoto kroku. i Pokud lyzát neprojde zcela membránou do 10 minut, vložte kolonku QIAamp Mini Spin do čisté promývací zkumavky (WT), uzavřete víčko a centrifugujte při 6000 x g (8000 rpm) po dobu 3 minut nebo až do úplného průchodu lyzátu. Vložte kolonku QIAamp Mini Spin do další čisté promývací zkumavky (WT) a pokračujte krokem 10 protokolu na straně 24. i Pro rychlé uvolnění podtlaku se má používat ventilek vakuového systému. 11. Naneste na kolonku QIAamp Mini Spin 750 µl prom vacího pufru 1 (AW1), aniï by do lo k navlhãení okraje kolonky. Nedot kejte se membrány kolonky QIAamp Mini Spin pipetovací piãkou. Nechte víãko kolonky otevfiené a uzavfiete ventilek vakuového systému. Po prûtoku prom vacího pufru 1 (AW1) pfies kolonku QIAamp Mini Spin otevfiete ventilek a uvolnûte podtlak. 12. Naneste na kolonku QIAamp Mini Spin 750 µl prom vacího pufru 2 (AW2), aniï by do lo k navlhãení okraje kolonky. Nedot kejte se membrány kolonky QIAamp Mini Spin pipetovací piãkou. Nechte víãko kolonky otevfiené a uzavfiete ventilek vakuového systému. Po prûtoku prom vacího pufru 2 (AW2) pfies kolonku QIAamp Mini Spin otevfiete ventilek a uvolnûte podtlak. Vacuum Protocol Příručka QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 01/

22 Spin Protocol 13. Zavfiete víãko kolonky QIAamp Mini Spin, odpojte ji od vakuového systému a vyhoìte vakuov konektor (VacConnector VC) do odpadu. VloÏte kolonku QIAamp Mini Spin do ãisté prom vací zkumavky (WT) a centrifugujte pfii maximální rychlosti (pfiibliïnû x g, tj rpm) po dobu 3 minuty, pfii centrifugaci dojde k úplnému vysu ení mambrány. i Vynechání této centrifugace, při niž dochází k vysušení kolonky, může vést k inhibici následného testu. 14. VloÏte kolonku QIAamp Mini Spin do ãisté eluãní zkumavky (ET) a vyhoìte prom vací zkumavku (WT) obsahující filtrát do odpadu. Opatrnû otevfiete víãko kolonky QIAamp Mini Spin a naneste 50 aï 200 µl eluãního pufru (AE) na stfied membrány. Zavfiete víãko a inkubujte pfii laboratorní teplotû (15 25 C) po dobu 1 minuty. Centrifugujte pfii 6000 x g (8000 rpm) po dobu 1 minuty; centrifugací dojde k eluci DNA. i Po provedení tohoto protokolu proveďte údržbu vakuového systému (bližší informace: viz příručka dodávaná s vakuovým systémem). 22 Příručka QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 01/2004

23 Protokol: Izolace a purifikace genomové DNA z krevních vzorkû pomocí mikrocentrifugace Pro izolaci a purifikaci genomové DNA ze vzorku 200 µl plné krve ošetřené EDTA nebo citratem sodným pomocí mikrocentrifugace. DÛleÏit bod pfied zahájením Níže uvedený postup obsahuje pokyny pro zpracování jednoho vzorku krve. Souběžně je však možné zpracovat několik vzorků krve; jejich počet závisí na kapacitě použité mikrocentrifugy. Co je nutné provést pfied zahájením Vytemperujte vzorky na laboratorní teplotu (15 25 C) a důkladně je promíchejte. Pokud se v lyzačním pufru (AL) vytvořil precipitát, rozpusťte jej zahřátím ve vodní lázni při 56 C. Promývací roztok 1 (AW1), promývací roztok 2 (AW2) a proteáza QIAGEN (QP) musí být připraveny podle pokynů v důležitých poznámkách na straně 15. Pro použití v kroku 15 vytemperujte eluční pufr (AE) na laboratorní teplotu (15 25 C). Nastavte zahřívací blok na 56 C pro použití v kroku 4. Postup 1. Pomocí pipety naneste 20 µl proteázy QIAGEN (QP) do lyzaãní zkumavky (LT). i Před použitím zkontrolujte datum exspirace rozpuštěné proteázy. 2. Pfiidejte 200 µl vzorku krve do lyzaãní zkumavky (LT). 3. Pfiidejte 200 µl lyzaãního pufru (AL) do lyzaãní zkumavky (LT), uzavfiete víãko a míchejte po dobu 15 s na pulsním vortexu. Pro zajištění účinné lyze je nezbytné důkladně promíchat vzorek a lyzační pufr (AL) do homogenního roztoku. i Vzhledem k vysoké viskozitě lyzačního pufru (AL) dbejte na přidání správného množství lyzačního pufru (AL) pečlivým odpipetováním nebo použitím vhodné pipety, například vícekrokové pipety Eppendorf nebo ekvivalentního zařízení. i Nepřidávejte QIAGEN proteázu (QP) přímo do lyzačního pufru (AL). 4. Inkubujte 10 min (±1 min) pfii 56 C (±1 C). 5. Centrifugujte lyzaãní zkumavku (LT) po dobu minimálnû 5 sekund pfii maximální rychlosti, tímto krokem se odstraní kapky z vnitfiní strany víãka. 6. Pfiidejte 200 µl ethanolu (96 100%) do lyzaãní zkumavky (LT), uzavfiete víãko a promíchejte dûkladnû po dobu 15 s na pulsním vortexu. Příručka QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 01/

24 7. Centrifugujte lyzaãní zkumavku (LT) po dobu minimálnû 5 sekund pfii maximální rychlosti, tímto krokem se odstraní kapky z vnitfiní strany víãka. 8. Opatrnû naneste cel lyzát z kroku 6 na kolonku QIAamp Mini Spin, aniï by do lo k navlhãení jejího okraje. Nedot kejte se membrány kolonky QIAamp Mini Spin pipetovací piãkou. V případě souběžného zpracování několika vzorků mějte vždy otevřenou pouze jednu lyzační zkumavku (LT). 9. Zavfiete víãko kolonky QIAamp Mini Spin a centrifugujte pfii 6000 x g (8000 rpm) po dobu 1 minuty. VloÏte kolonku QIAamp Mini Spin do ãisté prom vací zkumavky (WT) a vyhoìte zkumavku obsahující filtrát do odpadu. Pokud veškerý lyzát neprojde přes membránu po centrifugaci při 6000 x g (8000 rpm), centrifugujte znovu při maximální rychlosti (přibližně x g, tj rpm) po dobu 1 minuty. 10. Opatrnû otevfiete kolonku QIAamp Mini Spin a pfiidejte 500 µl prom vacího pufru 1 (AW1), aniï by do lo k navlhãení okraje kolonky. Nedot kejte se membrány kolonky QIAamp Mini Spin pipetovací piãkou. 11. Zavfiete víãko kolonky QIAamp Mini Spin a centrifugujte pfii 6000 x g (8000 rpm) po dobu 1 minuty. VloÏte kolonku QIAamp Mini Spin do ãisté prom vací zkumavky (WT) a vyhoìte zkumavku obsahující filtrát do odpadu. 12. Opatrnû otevfiete kolonku QIAamp Mini Spin a pfiidejte 500 µl prom vacího pufru 2 (AW2), aniï by do lo k navlhãení okraje kolonky. Nedot kejte se membrány kolonky QIAamp Mini Spin pipetovací piãkou. 13. Zavfiete víãko kolonky QIAamp Mini Spin a centrifugujte pfii maximální rychlosti (pfiibliïnû x g, tj rpm) po dobu 1 minuty. VloÏte kolonku QIAamp Mini Spin do ãisté prom vací zkumavky (WT) a vyhoìte zkumavku obsahující filtrát do odpadu. 14. Centrifugujte pfii maximální rychlosti (pibliïnû x g, nebo rpm) po dobu 3 minuty, bûhem centrifugace dojde k úplnému vysu ení membrány. Vynechání této centrifugace, při niž dochází k vysušení kolonky, může vést k inhibici následného testu. 15. VloÏte kolonku QIAamp Mini Spin do ãisté eluãní zkumavky (ET) a vyhoìte prom vací zkumavku (WT) obsahující filtrát do odpadu. Opatrnû otevfiete víãko kolonky QIAamp Mini Spin a naneste 50 aï 200 µl eluãního pufru (AE) na stfied membrány. Zavfiete víãko a inkubujte pfii laboratorní teplotû (15 25 C) po dobu 1 minuty. Centrifugujte pfii 6000 x g (8000 rpm) po dobu 1 minuty; centrifugací dojde k eluci DNA. 24 Příručka QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 01/2004

25 QIAGEN Companies Kontaktní informace na vaše místní zastoupení firmy QIAGEN jsou uvedeny na zadních deskách příručky. Distributofii firmy QIAGEN Argentina Tecnolab S.A. Tel: (011) Fax: (011) Web site: Denmark VWR International A/S Tel: Fax: Web site: Mexico Quimica Valaner S.A. de C.V. Tel: (55) Fax: (55) Web site: South Africa Southern Cross Biotechnology (Pty) Ltd Tel: (021) Fax: (021) Austria VWR International GmbH Tel: (01) Fax: (01) info@at.vwr.com Web site: Egypt Clinilab Tel: Fax: Clinilab@link.net The Netherlands Westburg b.v. Tel: (033) Fax: (033) info@westburg.nl Web site: Spain IZASA, S.A. Tel: (93) Fax: (93) suministros@izasa.es Belgium/Luxemburg Westburg b.v. Tel: Fax: (31) info@westburg.nl Web site: Brazil Uniscience do Brasil Tel: Fax: info@uniscience.com Web site: China Gene Company Limited Tel: (852) Fax: (852) Hong Kong: info@genehk.com Beijing: info_bj@genecompany.com Shanghai: info_sh@genecompany.com Chengdu: gene@public.cd.sc.cn Guangzhou: info_gz@genecompany.com Croatia INEL Medicinska Tehnika d.o.o. Tel: (01) Fax: (01) inel-medicinskatehnika@zg.htnet.hr Cyprus Scientronics Ltd Tel: Fax: a.sarpetsas@biotronics.com.cy Czech Republic BIO-CONSULT spol. s.r.o. Tel/Fax: (420) info@bioconsult.cz Web site: Finland VWR International Oy Tel: (09) Fax: (09) info@fi.vwr.com Web site: Greece BioAnalytica S.A. Tel: (210) Fax: (210) bioanalyt@hol.gr Web site: Hungary Kasztel-Med Co. Ltd. Tel: (01) Fax: (01) info@kasztel.hu Web site: India Genetix Tel: (011) or (011) Fax: (011) genetix@nda.vsnl.net.in Israel Westburg (Israel) Ltd. Tel: /4 or (toll free) Fax: info@westburg.co.il Web site: Korea LRS Laboratories, Inc. Tel: (02) Fax: (02) webmaster@lrslab.co.kr Web site: Malaysia RESEARCH BIOLABS SDN. BHD. Tel: (603) Fax: (603) biolabs@tm.net.my Web site: New Zealand Biolab Ltd Tel: (09) or Fax: (09) biosciences@nzl.biolabgroup.com Web site: Norway VWR International AS Tel: Fax: info@no.vwr.com Web site: Poland Syngen Biotech Sp.z.o.o. Tel: (071) or Fax: (071) info@syngen.pl Web site: Portugal IZASA PORTUGAL, LDA Tel: (21) Fax: (21) Singapore Research Biolabs Pte Ltd Tel: Fax: sales@researchbiolabs.com Slovak Republic BIO-CONSULT Slovakia spol. s.r.o. Tel/Fax: (02) bio-cons@cdicon.sk Web site: Slovenia MEDILINE d.o.o. Tel: (01) Fax: (01) or (01) mediline@siol.net Sweden VWR International AB Tel: (08) Fax: (08) info@se.vwr.com Web site: Taiwan TAIGEN Bioscience Corporation Tel: (02) Fax: (02) taigen@ms10.hinet.net Thailand Theera Trading Co. Ltd. Tel: (02) Fax: (02) theetrad@samart.co.th Turkey Medek Medikal Ürünler ve Saglik Hizmetleri A. S. Tel: (216) Fax: (216) makialp@med-ek.com All other countries QIAGEN GmbH, Germany Příručka QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 01/

26 Australia QIAGEN Pty Ltd ABN PO Box 25 Clifton Hill Victoria 3068 Orders Fax Technical Canada QIAGEN Inc Argentia Road Unit 7 Mississauga Ontario L5N 8L2 Orders Fax Technical 800-DNA-PREP ( ) France QIAGEN S.A. 3 avenue du Canada LP COURTABOEUF CEDEX Orders Fax Technical Germany QIAGEN GmbH QIAGEN Strasse Hilden Orders Fax Technical Italy QIAGEN S.p.A. Via Grosio, 10/ Milano Orders Fax Technical Japan QIAGEN K.K. Forefront Tower II 13-1, Kachidoki 3 Chome Chuo-ku, Tokyo Telephone Fax Technical Switzerland QIAGEN AG Auf dem Wolf Basel Orders Fax Technical UK and Ireland QIAGEN Ltd. QIAGEN House Fleming Way Crawley West Sussex, RH10 9NQ Orders Fax Technical USA* QIAGEN Inc Turnberry Lane Valencia CA Orders Fax Technical 800-DNA-PREP ( ) * Adresy platné od 1. února V případě zájmu o adresu platnou před tímto datem zašlete dotaz na adresu QIAGEN Inc., Avenue Stanford, Valencia, CA /2004