SLOVENSKÁ POĽNOHOSPODÁRSKA UNIVERZITA V NITRE FAKULTA AGROBIOLÓGIE A POTRAVINOVÝCH ZDROJOV KATEDRA GENETIKY A ŠĽACHTENIA RASTLÍN

Transkript

1 SLOVENSKÁ POĽNOHOSPODÁRSKA UNIVERZITA V NITRE FAKULTA AGROBIOLÓGIE A POTRAVINOVÝCH ZDROJOV KATEDRA GENETIKY A ŠĽACHTENIA RASTLÍN Prednáška zo Základov biologickej bezpečnosti Metódy identifikácie cudzorodých génov v organizmoch. prof. RNDr. Milan BEŽO, CSc.

2 Rastlina tabaku transformovaná génom pre enzým luciferázu (gén izolovaný z hmyzu). Pes transformovaný génom pre bielkovinu fluoreskujúcu do červena (gén izolovaný z morských korálov). ( ) Ako rozlíšime biotech/gmo organizmus? 2

3 Kukurica siata Kukurica siata Kukurica siata Kukurica siata GMO Vzľad nie GMO = GMO (bez rozdielu) Sója fazuľová Sója Sója fazuľová fazuľová GMO Pestované geneticky modifikované rastliny (GMR) 3

4 Identifikácia biotechnologicky upravených rastlín (geneticky modifikovaných rastlín GMR) Testy zisťovania GMR alebo produktov GMR sú založené na (a) ich funkčnom prejave biologické testy, (poľné, skleníkové, črepníkové a in vitro) (b) špecifickej bielkovine kódovanej transgénom imunochemické testy (ELISA, prenos bielkovín Western blot). a (c) špecifickom poradí nukleotidov transgénu v genóme rastliny, molekulárne testy. (PCR, prenos DNA Southern blot, hybridizácia nukleových kyselín, RFLP polymorfizmus dĺžky naštiepených fragmentov DNA, DNA odtlačky DNA fingerprinting). 4

5 Biologické testy identifikácie GMR Poľné, skleníkové, črepníkové a in vitro skúšky na geneticky modifikovanú vlastnosť rastlín. Skúšky na (odolnosť sóje fazuľovej voči glyfosátu) odolnosť voči herbicídom, vírusom a živočíšnym škodcom (odolnosť kukurice siatej voči vijačke kukuričnej). Hodnotenie plodov podľa kvality a skladovateľnosti. (dlhšia skladovateľnosť plodov rajčiaka jedlého). 5

6 Imunochemické metódy identifikácie transgénov Metódy založené na reakcii protilátky s antigénom. ELISA enzýmom značená reakcia protilátky s antigénom (Enzyme Linked Immunosorbent Assay). Špecifická reakcia protilátky s antigénom v jamke mikrotitračnej platne alebo v mikroskúmavke. Antigén je látka (obyčajne bielkovina) z NBS alebo mikroorganizmu a protilátka je IgG, IgA a IgM (imunoglobulíny). Imunofluorescenčná mikroskopia Špecifická reakcia séra s protilátkou značenou fluorescenčným farbivom s antigénom NBS alebo mikroorganizmu na podložnom mikroskopickom sklíčku. Prenos bielkovín (Western blot) Špecifická reakcia séra s protilátkou a antigéna na nylonovej membráne. Na nylonovej membráne sú elektroforézou rozdelené bielkoviny (antigén) s presnou pozíciou prúžku v dráhe. 6

7 Imunochemické testy identifikácie biotech/gmr Zistenie bielkoviny, ktorú kóduje transgén v rastline, protilátkou. ELISA test (Enzyme linked immunosorbent assay). Postup zistenia antigénu (bielkovina) špecifickou protilátkou. Antigén bielkovina CP4-EPSPS, funkčná za prítomnosti herbicídu Roundap (odolnosť rastlín, sója, voči herbicídom). Protilátka imunoglobín zvierat. 7

8 DAS ELISA Klasická ELISA sendvičová alebo DAS ELISA (Double Antibody Sandwich). Princíp DAS ELISA 1. Obalenie povrchu mikrotitračnej platne špecifickou protilátkou pre určitý vírus. 2. Naviazanie protilátky na antigén. Vytvorí sa stabilný komplex protilátka antigén. 3. Vytvorenie sendviča reakciou komplexu protilátky označenej alkalickou fosfatázou a antigénu. 4. Enzymatická skúška. Prítomnosť špecifického vírusového antigénu je signalizovaná pozitívnou reakciou alkalickej fosfatázy a 4-nitrofenylfosfátu, pri ktorej sa uvoľňuje 4-nitrofenol (farebný prejav). 8

9 1. Špecifická protilátka v jamke mikrotitračnej platne. 2. Pridanie vzorky s antigénom. 3. Pridanie enzýmom označennej protilátky. Premývanie. Premývanie. Premývanie. 4. Pridanie enzýmovo substrátového farbiva. Princíp ELISA Farebná reakcia. 9

10 Molekulárne metódy identifikácie biotechnologicky upravených GM rastlín Zistenie poradia nukleotidov zmnožením nukleových kyselín transgénu alebo sondou v genóme. Zmnoženie nukleových kyselín pomocou PCR Zmnoženie úsekov DNA pomocou špecifických prajmerov (presne definovaných krátkych poradí nukleotidov) v skúmavke. Sondy nukleových kyselín Sonda je definované poradie radioaktívne alebo inak značených nukleotidov. Sonda DNA alebo RNA sa špecificky naviaže na jeden reťazec nukleovej kyseliny (ssdna alebo ssrna) podľa komplementarity báz. Postup pri použití sondy: 1. Izolácia DNA alebo RNA. 2. Prenos vzorky DNA na nylonovú membránu. 3. Pridanie sondy. Hybridizácia sondy a DNA vzorky. 4. Premytie nenaviazaných sond a vyhodnotenie reakcie. Ak sa sonda naviaže, vo vzorke sú cieľové poradia nukleotidov. 10

11 Molekulárne testy identifikácie transgénov Techniky založené na polymerázovej reťazovej reakcii PCR Cieľové poradia nukleotidov v GMR pre PCR Regulačné úseky transgénov. Promótor P35S izolovaný z vírusu mozaiky karfiolu. Koncové (terminačné) poradie nukleotidov prepisu genetickej informácie Tnos syntézy nopalínu baktérie Agrobacterium tumefaciens. Gény markéry. Gény odolnosti voči antibiotikám. Transgény. Určenie poradia nukleotidov DNA. 11

12 Polymerázová reťazová reakcia (Polymerase Chain Reaction PCR) je metóda zmnoženia určitého úseku DNA z veľkej molekuly DNA opakovanými cyklami polymerizácie podľa predlohy úsekov DNA v skúmavke. Úsek zmnoženia DNA je určený prajmermi, krátkymi polynukleotidmi (oligonukleotid s veľkosťou do 50 nukleotidov). Na základe párovania báz pomocou vodíkových väzieb sa prajmer naviaže na určitý, komplementárny reťazec DNA. Dva prajmery, každý naviazaný na iný protismerný reťazec DNA, orientované oproti sebe ohraničujú oblasť zmnoženia úseku DNA. 12

13 Izolovaná dsdna s reakčnou zmesou v mikroskúmavke 1. cyklus 2. cyklus 3. cyklus 30 Denaturácia a naviazenie prajmerov Polymerizácia 8 Náčrt cyklov PCR Po 30 cykloch je miliarda kópií úseku dsdna. prajmer polymerizácia nukleotidov 13

14 Výsledok PCR Nasyntetizovaný úsek dsdna je predlohou pre novú polymerázovú reakciu. Kópie cieľového produktu sa tvoria od tretieho cyklu. Po tridsiatich cykloch sa može vytvoriť až miliarda kópií jedného úseku dsdna (prepočtom v tridsiatom cykle je to cielených kópií). Počet kópií v PCR nie je úplne zhodný s matematickým odhadom, nie všetky úseky molekuly dsdna sa zdvojujú a okrem cieľových kópií vznikajú aj iné kópie dsdna. 14

15 Analýza makromolekúl po rozdelení v géloch Makromolekuly DNA, RNA a bielkovín rozdelené elektroforézou v géloch podľa molekulovej hmotnosti sú analyzované hybridizáciou molekúl (DNA/DNA, RNA/DNA) a naviazaním protilátky (bielkovina/bielkovina). Hybridizácia nukleových kyselín a naviazanie protilátky na antigén nie je možné spoľahlivo zabezpečiť v géloch. Makromolekuly sa z gélov prenášajú na pevnú podložku, nylonovú, nitrocelulózovú alebo inú membránu. Na pevnej podložke sa pomocou sond (radioaktívne alebo neradioaktívne značené krátke úseky DNA komplementárne k analyzovanej vzorke) alebo špecifickej protilátky k antigénu (analyzovaná bielkovina) môže dokázať môže spoľahlivo zabezpečiť hybridizácia makromolekúl alebo naviazanie protilátky. 15

16 Vrstva filtračného papiera Membrána Gél Prenos vzorky z gélu na membránu prietokom tlmivého roztoku Vzorka na membráne Princíp kapilárneho prenosu molekúl z gélu na membránu 16

17 Hybridizácia nukleových kyselín Hybridizovať môžu: a) dve jednoreťazcové ssdna, b) dve jednoreťazcové ssrna, c) molekula ssdna a ssrna. Dvojreťazcová (dsdna) sa pred hybridizáciou denaturuje na ssdna. 17

18 Elektroforézou rozdelená DNA Sonda naviazaná na DNA Autoradiograf (signál sondy na filme) Sondy nukleových kyselín 18

19 PCR Elektroforéza Elektroforéza DNA Štiepenie reštrikčným enzýmom a elektroforéza Hybridizácia DNA/DNA Princíp metód hodnotenia DNA Pri PCR (polymerázová reťazová reakcia) metódach sú množené krátke úseky izolovanej DNA. Produkty PCR sú delené elektroforézou. Pred hybridizáciou DNA/DNA je izolovaná DNA štiepená reštrikčným enzýmom a získané fragmenty sú delené elektroforézou. Hybridizáciou značenej sondy sa určujú špecifické fragmenty DNA rozdelené elektroforézou. 19

20 Gélová elektroforéza Gélová elektroforéza je technika delenia fragmentov DNA podľa ich veľkosti v géle, ktorý je vystavený elektrickému prúdu. Molekula DNA s negatívnym nábojom putuje ku kladnému pólu. Najmenšie fragmenty DNA putujú rýchlejšie ako väčšie fragmenty v géle, lebo môžu ľahšie prenikať cez sieť gélu. Na delenie fragmentov DNA sa používajú dva druhy gélov, agarózový a polyakrylamidový. 20

21 Hladina tolerovania náhodnej prímesi GM produktu Tolerancia GM produktu (Tl %) 0 Čína, Rusko Krajina/únia 1 EU, Saudská Arábia 2 Čile 3 Kórea 4 Brazília 5 Japonsko, Thajsko, Indonézia Tolerance level for accidental commingling 21

22 Ďakujem za pozornosť