Metody testování humorální imunity

Transkript

1 Metody testování humorální imunity

2 Co je to humorální imunita? Humorální = látková Buněčné produkty Nespecifická imunita příklady:» Lysozym v slinách, slzách» Sérové proteiny (proteiny akutní fáze)» Komplementový systém» ECP Specifická imunita» Protilátky

3 Opakování - Komplementový systém (1/2) Soubor zhruba 30 sérových proteinů Hlavní složky C1-C9 Ústřední složkou fragment C3 Samovolné štěpení C3b (reaktivní skupina), C3a C3b možnost vazby na různé povrchy C3a - chemotaxe

4 Protilátky a jejich využití Užití principu vazby protilátky s antigenem Komerční výroba protilátek antigen + protilátka Imunokomplex antigen-protilátka

5 Krev je odrazem našich nemocí Funkce krve Transportní Homeostatická Obranná, imunitní Srážlivá krev Sérum Nesrážlivá krev antikoagulans (např. EDTA) Krevní plazma

6 Jaké humorální složky se testují? (1/2) Protilátky Kvantitativní testy hladiny protilátek Funkční testy afinita k danému antigenu» Exoantigen» Autoantigen Cirkulující imunokomplexy

7 Jaké humorální složky se testují? (2/2) Komplement Složky Inhibitory Proteiny akutní fáze CRP ECP

8 Imunologické vyšetřovací metody 1. Aglutinace 2. Precipitace 3. Praktické využítí precipitace: Turbidimetrie, nefelometrie 4. Enzymatická imunoanalýza (ELISA) 5. Nepřímá imunofluorescence 6. Elektroforéza 7. Western blot

9 1. Aglutinace (shlukování) Shlukování korpuskulárních částic nesoucích na svém povrchu antigen (aglutinogen) reagující s protilátkou (aglutininem) ve vyšetřovaném vzorku Princip Reakce: Antigen (aglutinogen) + protilátka (aglutinin) shluk (aglutinát)

10 Limitace nespecifičnost Zkřížená reaktivita Aglutinace v praxi Aglutinogen (antigen) Viry Bakterie Erytrocyty Latex Aglutinin Specifické protilátky Užití Průkaz protilátek» Viry, bakterie» Revmatoidní faktor

11 2. Precipitace (srážení) Aglutinace (shlukování) je reakce protilátky a korpuskulárního antigenu (krvinky, bakterie, latexové částice) x Precipitace (srážení) je reakce protilátky a koloidního antigenu

12 3. Praktické využítí precipitace: Turbidimetrie, nefelometrie Reakce antigen+protilátka = imunokomplex Princip Měření množství imunokomplexů (zákal) Koncentrace antigenu Úměrná» Rychlosti tvorby zákalu» Hustotě zákalu Kalibrační křivka Měření světla rozptýleného na imunokomplexech Měření úbytku světla, které prošlo roztokem obsahujícím imunokomplexy

13 Kalibrační křivka ax + by + c = 0 Př. 3x + 5y + 6 = 0

14 Laboratorní využití nefelometrie a turbidimetrie Imunoglobuliny Složky komplementu C3 C4 Proteiny akutní fáze CRP ECP Hladiny léků

15 ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) Enzymem značená protilátka váže analyt. Po odmytí nenavázané protilátky přeměňuje enzym dodaný substrát na barevný produkt měřitelný spektrofotometrem. Analyt Antigen Protilátka Kalibrační křivka

16 Jak detekovat antigen ELISou? Přímá ELISA Vazba značené protilátky přímo na antigen Nepřímá ELISA Vazba protilátky např. ze séra na antigen Detekce nepřímo pomocí sekundární značené protilátky Sandwichová ELISA Antigen je pomocí protilátky navázané na destičku připoután k pevné fázi detekce:» Přímo» Nepřímo

17 ELISA v praxi Měření Protilátkové třídy Protilátková odpověď» Autoantigen» Alergen» EBV» HIV» Onemocnění - Borelióza - Toxoplazmóza - Hepatitidy Přítomnost antigenu» Hormony př. tyroxin» Léků digoxin» Proteinů - CEA

18 5. Nepřímá fluorescenční analýza Fluorescence je emise záření fluorescenční látkou, která byla předtím excitována

19 Imunologická fluorescenční analýza Vazba protilátek ze séra na známý substrát detekce autoprotilátek Nepřímá detekce Substrát např.: Tkáňové řezy např. opičí Prvok - Crithidia luciliae Lidské granulocyty Tkáňové kultury HEp-2 buňky

20 Mikroskopická fluorescenční analýza Obr.1 Opičí jícen - IgA protilátky proti endomyziu Obr.2 Crithidia luciliae -protilátky proti dsdna A B C < cytoplazmatic staining Obr.3 Lidské granulocyty - různá specifita protilátek proti granulocytům Obr.4 Hep-2 buňky- protilátky proti a) jaderným strukturám b) mitochodriím c) aktinu

21 6. Elektroforéza Elektroforéza je pohyb nabitých částic v elektrickém poli SDS page elektroforéza Denaturace proteinů za přítomnosti» Merkaptoetanolu zrušení S-S můstků» SDS vazba na denaturovaný protein záporný náboj je úměrný velikosti proteinu Možnost použití gelu rozdělení proteinů dle velkosti SDS +

22 SDS page elektroforéza Ultrastruktura gelu

23 7. Western blot

24 7. Western blot Navazuje na elektroforézu Přenesení proteinů z gelu na membránu za pomocí elektrického pole Značení detekovaného proteinu protilátkou Přímá detekce antigenu Nepřímá detekce přidání séra pacienta Zviditelnění vazby (reakce enzym-substrát) Fluorescence Luminiscence detekce pomocí filmu negativ Nerozpustné barvivo

25 Western blot v klinické diagnostice Testování reakce jednotlivých sérových protilátek se specifickým antigenem Konfirmační testování pro ELISA Testování protilátek př.: Chlamydie Borelie HIV

26 Děkuji za pozornost