Reproductive Biology and Endocrinology

Transkript

1 Reproductive Biology and Endocrinology BioMed Central Research Assessment of endometrial and ovarian characteristics using three dimensional power Doppler ultrasound to predict response in frozen embryo transfer cycles Tamara Žáčková* 1,2, Ilkka Y Järvelä 1, Juha S Tapanainen 1 and Jaroslav Feyereisl 2 Open Access Address: 1 Department of Obstetrics and Gynecology, Oulu University Hospital, Oulu, Finland and 2 Institute for the Care of Mother and Child (UPMD), Department of IVF, Charles University, Prague, Czech Republic Tamara Žáčková* - tamara.zackova@centrum.cz; Ilkka Y Järvelä - ilkka.jarvela@oulu.fi; Juha S Tapanainen - juha.tapanainen@oulu.fi; Jaroslav Feyereisl - reditel@upmd.cz * Corresponding author Published: 25 December 2009 Reproductive Biology and Endocrinology 2009, 7:151 doi: / This article is available from: Received: 22 October 2009 Accepted: 25 December Žáčková et al; licensee BioMed Central Ltd. This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License ( which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Abstract Objective: To evaluate whether endometrial or ovarian parameters as measured using 3D power Doppler ultrasound would predict the outcome in frozen embryo transfer (FET) cycles. Methods: Thirty women with no known gynecological pathology undergoing FET were recruited. The FET was carried out in the natural menstrual cycle 3-4 days after the first positive LH test result. Blood samples for hormonal analysis were collected, and three-dimensional (3D) ultrasonographic examination was performed on the day of the FET and repeated with analysis of the total hcg one week later. Results: The demographic, clinical, and embryological characteristics were similar between the pregnant (15/30) and nonpregnant groups (15/30). There were no differences between the groups in endometrial/subendometrial thickness, volume, or vascularization index (VI). The endometrial triple-line pattern was more often present in the pregnant group on the day of the FET (93.3% vs. 40.0%, 95% CI %). No differences in the ovaries were observed on the day of the FET. At the second visit, the triple-line pattern was still more often present in those patients who had conceived (91.7% vs. 42.9%, 95% CI %), and their corpus luteum was more active as judged by the rise in 17-hydroxyprogesterone and estradiol levels. No differences were observed in the dominant ovarian vasculature. Conclusions: According to our results, measurement of power Doppler indices using 3D ultrasound on the day of the FET does not provide any additional information concerning the outcome of the cycle. The existence of the triple-line pattern on the day of the FET seems to be a prognostic sign of a prosperous outcome after FET. The dominant ovary in the pregnant group seems to be already activated one week after the FET. Page 1 of 8 (page number not for citation purposes)

2 Reproductive Biology and Endocrinology 2009, 7:151 Background Because of wider use of elective single embryo transfer, frozen-thawed embryo transfers (FETs) have also become more common. According to European data for artificial reproductive treatment (ART) [1], 64,147 FETs were performed during 2004 in Europe, and an approximate clinical pregnancy rate was 19.1%. The highest rates of single embryo transfers (SETs) from all transfers were found in Sweden (67%), Belgium (49%), and Finland (47%) [1]. During 2005 and 2006 in Finland, the number of FETs increased by 7% while the number of IVF and ICSI cycles remained unchanged. In 52.7% of all the FET cycles in Finland, only one embryo was transferred [2]. The overall live birth rate/cycle after FET was 16.6%, and after single embryo transfer the rate was 14.2% and 19.3% after double embryo transfer [2]. In 2006, every fourth child born after ART originated from an FET cycle [2], emphasizing the role of FET cycles in Finnish ART practice. Since less than 20% of FET cycles result in pregnancy and live birth, it is important to evaluate factors that may affect the treatment result. It seems that failure of implantation remains the main reason why most treatments fail [3]. The failure of implantation may be caused by the low quality of the embryo(s) transferred or by a nonreceptive uterine endometrium. If the nonreceptive endometrium could be detected before the transfer of the embryo, the cycle could be abandoned, and the embryo(s) could be transferred during a cycle with more favorable circumstances. The ability to identify a receptive uterus prospectively by a noninvasive method would have an invaluable clinical impact on treatment efficiency and success rates. Ultrasonographic examination offers us a noninvasive method to evaluate the uterine environment before embryo transfer. Several sonographic parameters have been proposed for assessing endometrial receptivity, including endometrial thickness, endometrial pattern, endometrial volume, and endometrial and subendometrial blood flow [4-7]. The aim of this prospective study was to evaluate whether any of the endometrial or ovarian parameters measured using 3D power Doppler ultrasound before the transfer of frozen and thawed embryos have an impact on the outcome of the cycle. The ultrasonographic parameters of the endometrium and ovaries were correlated with the systemic steroid concentrations. In addition, we wanted to evaluate whether these parameters differed one week after embryo transfer--at the time of presumed implantation-- between those who conceived and those who did not. Methods We recruited 30 women undergoing frozen-thawed embryo transfer (FET) during a natural menstrual cycle between May 2004 and February 2008 in the Assisted Reproduction Unit of the Department of Obstetrics and Gynecology, Oulu University Hospital, Finland. The study was approved by the Ethics Committee of Oulu University Hospital, Oulu, Finland. Informed written consent was obtained from all participants, after the nature of the procedures had been fully explained. Inclusion criteria were women with no known gynecological pathology (e.g., known endometriosis, fibroids, any previous operation to gynecological organs). For the study, the patients were examined on the day of the FET and 5-9 days later. Blood samples for hormonal assays were collected, and threedimensional (3D) ultrasonographic examination was performed during both visits. Indication for previous IVF or ICSI treatment included male, tubal, anovulation, endometriosis, mixed, and unexplained factors. ICSI was performed for 16 couples with severe semen abnormalities (Table 1). The details of the long protocol for ovarian stimulation have been described previously [5]. During the IVF/ICSI treatment, the excess embryos were frozen after culture for two days using a slow-freezing protocol with 1,2-propanediol as cryoprotectant [8]. In the FET cycles, ovulation occurred spontaneously, without any kind of hormonal treatment. According to the FET protocol used in our clinic, the transvaginal ultrasonographic examination was carried out during cycle days 10-12, and the side and size of the dominant follicle and endometrial thickness were recorded. Endometrial thickness was measured as the thickest part in the longitudinal section, including both endometrial layers. After the ultrasonographic examination, the women started luteinizing hormone (LH) tests on urine samples every morning to confirm ovulation (home test kit, Clearplan; Unipath, Bedford, UK). The embryo transfer was carried out 3-4 days after the first positive LH test result. A maximum of two embryos were transferred. The thawed embryos were graded using the same criteria as in the fresh cycles [9]. A top-quality embryo was defined as having four blastomeres on day 2 or 8 blastomeres on day 3, less than 20% fragmentation, and no multinuclear blastomeres. After the transfer, the patients started to use 200 mg of progesterone twice a day either per os or intravaginally, depending on their preference. In case of pregnancy, the progesterone treatment was continued up to pregnancy week 10. The 3D transvaginal ultrasound measurements (Voluson Expert 730, Kretz, Zipf, Austria) were performed on the day of the FET and repeated about one week later, at the time of the expected implantation. The results of the ultrasound examination did not affect subsequent clinical management procedures. The 3D ultrasound technique enabled the determination of endometrial, subendome- Page 2 of 8 (page number not for citation purposes)

3 Reproductive Biology and Endocrinology 2009, 7:151 Table 1: Demographic, clinical, and embryological characteristics for the pregnant and nonpregnant groups Pregnant (n = 15) Nonpregnant (n = 15) P- value Age (years) 31,3 ± 1,1 31,5 ± 1,1 0,905 BMI (kg/m2) 22,9 ± 1,1 23,0 ± 0,8 0,941 Partus 0,2 ± 0,1 0,5 ± 0, Grav 0,5 ± 0,2 0,5 ± 0, Causes of infertility; n (%) Male 8(53,3) 10 (66,7) Tubal 1(6,7) 1 (6,7) Anovulation 1(6,7) 0 (0) Endometriosis 2 (13,3) 1 (6,7) Mixed 0 (0) 1 (6,7) Unexplained 3 (20,0) 2 (13,3) Number of previous IVF 1,5 ± 0,3 1,7 ± Number previous FET 0,9 ± 0,3 0,9 ± 0, Number of transfered embryos; n (%) 1,5 ± 0,1 1,5 ± 0, Insemination Method; n (%) IVF 10 (66,7) 4(26,7) ICSI 5 (33,3) 11(73,3) LH test positive, cycle day 14,7 ± 0,5 13,8 ± 0,7 0,246 Embryotransfer, cycle day 18,0 ± 0,6 17,2 ± 0,6 0,368 Values are mean ± SEM or n (%). No statistically significant differences were observed between the pregnant and nonpregnant groups. trial, and ovarian volume, including possible changes in the vascular network. Identical preinstalled instrument settings (frequency, mid; dynamic set, 2; balance, G>170; smooth, 5/5; ensemble, 16; line density, 7; power Doppler map, 5; and the setting conditions for the power Doppler mode were gain, -5.6; quality, normal; wall motion filter, low 1; peak repetitive frequency PRF, 0.9 khz) were applied for all patients. At the second visit, the power Doppler mode was not used to examine the uterus. During the ultrasound examination, the uterus was first visualized in two-dimensional (2D) B-mode after the patient had emptied her bladder. The power Doppler mode was switched on, and the power Doppler box was positioned to cover the whole uterus. The 3D facility was engaged by switching to 'volume mode.' The volume sector angle was preset to 80, and the fast volume acquisition (low-resolution) setting was selected to avoid artifacts. Thereafter, the ovaries were examined similarly. The ultrasonographic volume data were saved on the hard drive and analyzed later using the built-in virtual organ computer-aided analysis imaging program (VOCAL, GE Healthcare, Zipf, Austria) for 3D power Doppler histogram analysis. The manual mode of the VOCAL Contour Editor was used to cover the whole 3D volume of the region of interest (ROI), with 15 rotation steps. Hence, 12 contour planes were analyzed for each ROI to cover 360. After obtaining the total volume of the ROI, the program calculated the ratio of color voxels to all the voxels; this ratio (%) was expressed as the vascularization index (VI). The vascularized volume (unit ml) in the endometrium or in the ovary was calculated by multiplying the total volume of the ROI by its VI. The VOCAL program automatically calculated the index for mean grayness (MG) in the ROI, which presents the average grayness in the gray-scale voxels [10]. The endometrial thickness, including both endometrial layers, was measured at its thickest in the longitudinal section. The endometrial pattern was assessed from the same section and described as triple-line or homogeneous. The echogenity of the endometrium in comparison with the subendometrium was evaluated with two different methods. First, a single observer (T.Z.) evaluated the endometrial echogenity subjectively and categorized it as either hyperechoic, homoechoic, or hypoechoic in comparison with the myometrial echogenity. In the second method, we used the MG values supplied by the VOCAL. The MG endom is the mean gray value in the endometrium, and the MG subendom is the mean gray value in the subendometrium. The subendometrial volume was calculated after we had defined the subendometrial region as the region 5 mm beneath the myometrial-endometrial junction. The reproducibility of the volume and color index measurements using transvaginal 3D power Doppler ultrasound has been determined [11]. The reproducibility of volume and color index measurements using transvaginal 3D power Doppler ultrasound has been determined by Järvelä et al 2003 [11]. The intraobserver correlation coefficient for volume measurements was 1.0 and for VI it was 0.898[11]. Page 3 of 8 (page number not for citation purposes)

4 Reproductive Biology and Endocrinology 2009, 7:151 Assays The blood samples for analysis of serum progesterone (P), 17-hydroxyprogesterone (17-OHP), and estradiol (E 2 ) were collected on the day of the FET and repeated about one week later with the analysis of total human chorionic gonadotrophin (hcg). Clinical pregnancy was confirmed by ultrasonography after a positive urinary pregnancy test and visible heartbeat at pregnancy week 7. Serum concentrations of P and total hcg were measured by an automated chemiluminescence system (Advia Centaur, Bayer Corporation, NY, USA), 17OHP by radioimmunoassay (Diagnostic Products Corporation, LA, USA), and E 2 by radioimmunoassay (Orion Diagnostica, Oulunsalo, Finland), following the instructions provided by the manufacturers. The intra-assay and the interassay coefficients of variation were 3.7% and 5.4% for P, 5.0% and 5.4% for 17-OHP, 2.0% and 3.5% for hcg, and 5.7% and 6.4% for E2. External quality control of the hormone assays was organized by national (Labquality Ltd., Helsinki, Finland) and international (Bio-Rad Laboratories EQAS, Irvine, CA) companies. Statistics Statistical analysis was performed using the Statistical Package for the Social Sciences (Release 16.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Departure from a normal distribution was assessed using the Kolmogorov-Smirnov test. For paired comparisons, the paired t-test for normal data or Wilcoxon's test for skewed data was used. Correlation was estimated using Pearson's correlation coefficient. Proportions were compared using the chi-square test. A p-value (two-tailed) of < 0.05 was considered significant. Results A total of 30 women undergoing FET were recruited for the study. Four patients missed the second set of measurements. The pregnancy rate was 50% (15/30). For statistical analysis, the women were divided into two groups according to whether or not they had conceived. These two groups did not differ from each other in demographic, clinical, or embryological characteristics (Table 1). There were no differences between the pregnant and nonpregnant groups in the 3D-ultrasound characteristics of the ovaries and serum steroid levels on the day of the FET (Table 2). The endometrial triple-line pattern was more often present in the pregnant group on the day of the FET (93.3% vs. 40.0%, p-value of chi-square test 0.005). In the group of triple-line patients, the pregnancy rate was 70% (14/20), while for the group with the homoechogenic endometrium, the pregnancy rate was only 10% (1/10). The patients were further divided into two groups according to an endometrial cutoff volume of 2 ml. In the group of patients whose endometrial volume was more than 2 ml, the pregnancy rate was 55% (12/22), whereas in the group whose volume was less than 2 ml, the rate was 38% (3/8) (NS). The endometrial echogenity at the time of the FET was evaluated using two methods (Table 2). First, a single observer evaluated subjectively the endometrial echogenity and categorized it as either hyperechoic, homoechoic, or hypoechoic in comparison with the subendometrial (myometrial) echogenity. In the second method, we used the mean gray (MG) values that were calculated by VOCAL for both the endometrial and subendometrial volumes. The MG endom is the mean gray value in the endometrium, and the MG subendom is the mean gray value in the subendometrium. The difference (MG endom - MG subendom) ranged from 0.37 to (mean 6.36 ± 0.91) and was above 0 in all cases. The subjective evaluation resulted exactly in the same finding as the method using VOCAL, i.e., the endometrium was more echogenic in the ultrasound than the subendometrium. The characteristics and outcomes of the treatment cycles about one week after the FET, at the time of expected implantation, are given in Table 3. Four patients (three pregnant and one nonpregnant) missed the second set of measurements for personal reasons. During the second examination, the power Doppler mode was not used to investigate the uterus, and therefore, the data concerning the endometrium/subendometrium does not include any power Doppler information. The triple-line pattern was still more often present in those patients who conceived (91.7% vs. 42.9%, 95% CI for the difference between proportions 18.5%-79.1%). The endometrium was also significantly thicker in the pregnant group at this stage. No differences were observed in the dominant or in the nondominant ovarian vasculature parameters between the pregnant and nonpregnant groups. The pregnant group had significantly higher 17-OHP (p 0,009) and estradiol levels (p 0,039) than the nonpregnant group one week after the FET. Out of those 12 patients who finally conceived and were examined twice, 6 had a positive hcg pregnancy test at the 2 nd measurement, which took place 7.2 ± 0.2 days after the FET. Another 6 patients were tested negative at their second visit (5.3 ± 0.4 days after the FET), but they showed a positive result of hcg pregnancy test later. The change of ultrasonographic and serum hormone levels between the first and second examination was also compared (Table 4). In the 12 pregnant patients, there was an increase in P- and 17-OHP levels and in endometrial thickness. In the 6 patients with a positive pregnancy Page 4 of 8 (page number not for citation purposes)

5 Reproductive Biology and Endocrinology 2009, 7:151 Table 2: Comparison of ultrasonographic and hormonal parameters on the day of FET between the pregnant and nonpregnant groups. Pregnant (n = 15) Nonpregnant (n = 15) P- value Endometrial thickness (mm) 11,1 ± 0,3 11,2 ± 0,7 0,882 Endometrial Volume (ml) 3,7 ± 0,4 3,4 ± 0,7 0,669 Endometrial pattern triple line (n, %) Homoechogenic 1 (6,7) 9 (60,0) Tripple line 14 (93,3) 6 (40,0) Endometrial vascularization index (VI) % 0,9 ± 0,3 1,1 ± 0,4 0,661 Endometrial vascularization** 0,04 ± 0,02 0,04 ± 0,02 0,887 (ml) Subendometrial Volume (ml) 11,2 ± 0,9 11,3 ± 1, Subendometrial vascularization index(vi) % 4,1 ± 1,7 1,2 ± 0,4 0,110 Subendometrial vascularization** 0,5 ± 0,1 0,2 ± 0,1 0,075 (ml) Endometrial echogenity* Subjective evaluation (n,%) Hyperechogenic 15 (100) 15 (100) Hypoechogenic 0 (0) 0 (0) MG endsubend 1,24 ± ,25 ± 0,06 0,917 MG subend 29,25 ± 1,60 26,95 ± 2,56 0,453 Dominant -ovary Volume (ml) 17,0 ± 2,9 15,1 ± 1,8 0,562 Dominant ovary vascularization index (VI) % 9,2 ± 1,5 7,6 ± 1,1 0,382 Dominant ovary vascularization** (ml) 1,4 ± 0,2 1,0 ± 0, Nondominant ovary Volume (ml) 9,0 ± 1,1 7,8 ± 0,7 0,376 Nondominant-ovary vascularization index(vi) % 3,7 ± 0,7 5,2 ± 1,2 0,287 Nondominant ovary vascularization** (ml) 0,4 ± 0,1 0,4 ± 0,1 0,725 Progesterone on the day of FET (nmol/l) 25,4 ± 3,2 45,9 ± 12,7 0, OHP on the day of FET (nmol/l) 8,6 ± 0,4 9,6 ± 0,8 0,263 Estradiol on the day of FET (nmol/l) 0,31 ± 0,02 0,33 ± 0,03 0,695 Values are mean ± SEM or n (%). *The echogenity of the endometrium in comparison with subendometrium was evaluated by two different methods, which were subjective analysis and mean gray (MG) -value supplied by VOCAL. MG endom, mean gray value in the endometrium; MG subendom mean gray value in the subendometrium. **Vascularization, volume multiplied with VI. test at the second visit, a similar rise in P- and 17-OHP levels and in endometrial thickness was also observed (Table 4). Another 6 patients were tested negative at their second visit, but they showed a positive result of hcg pregnancy test later, only their P levels rose between the day of FET and the day of the second visit (Table 4). In the group of 14 nonpregnant women, the P levels rose, after the FET and the dominant ovarian volume decreased from 15,9 ml ± 1.9 to 12.5 ml ± 1.8 (p 0,034). In the patients who became pregnant after FET (n = 12), no changes were observed in the dominant ovarian volume or vascularization. Discussion The aim of the study was to evaluate whether some of the endometrial or ovarian characteristics before the transfer of frozen and thawed embryo(s) during a spontaneous menstrual cycle predicted the outcome of the FET cycle. At the time of embryo transfer, the only and the most prominent feature in patients who finally conceived was the presence of a triple-line pattern in the endometrium. Otherwise, the patients did not differ in terms of endometrial/ subendometrial thickness, volume, or vascularization. Neither the ultrasonographic characteristics in the dominant ovary nor the serum hormonal levels differed between pregnant and nonpregnant subjects at the time of embryo transfer. One week after the transfer, we observed opposite changes in the corpus luteal activity between the successful and unsuccessful cycles. The presence of a triple-line pattern in the endometrium at FET was strongly associated with the outcome of the cycle. A triple-line pattern reflects endometrial proliferation, and the absence may be a sign of premature secretory changes in the endometrium, suggesting that the time of maximal endometrial receptivity has already passed [12]. Several earlier studies have also observed that a triple-line pattern in the endometrium before embryo transfer is a favorable sign, although in these studies the endometrial pattern was assessed after fresh embryo transfers following controlled ovarian stimulation (COH) [10,13-15]. Page 5 of 8 (page number not for citation purposes)

6 Reproductive Biology and Endocrinology 2009, 7:151 Table 3: Comparison of ultrasonographic and hormonal parameters one week after FET between the pregnant and nonpregnant groups. Pregnant (n = 12) Nonpregnant (n = 14) P- value Days after FET 6,3 ± 0,4 5,9 ± 0,4 0,539 Endometrial thickness (mm) 12,5 ± 0,6 10,6 ± 0,6 0,049 Endometrial Volume (ml) 4,3 ± 0,7 4,1 ± 0,9 0,925 Endometrial pattern triple line (n, %) Homoechogenic 1(8,3) 8(57,1) Tripple line 11(91,7) 6(42,9) Dominant ovary Volume (ml) 15,3 ± 1,5 12,5 ± 1,8 0,255 Dominant ovary vascularization index (VI) % 10,5 ± 1,8 8,6 ± 1,63 0,446 Dominant ovary vascularization **(ml) 1,4 ± 0,2 0,9 ± 0, Nondominant ovary Volume (ml) 9,4 ± 1,5 8,2 ± 0,8 0,454 Nondominant ovary vascularization index(vi) % 3,3 ± 0,7 6,1 ± 1,3 0,072 Nondominant ovary vascularization ** 0,3 ± 0,1 0.5 ± 0,1 0,118 (ml) Progesterone one week after FET(nmol/l) 174,5 ± 68,0 92,3 ± 18,3 0, OHP one week after FET(nmol/l) 15,1 ± 2,1 8,3 ± 1,3 0,009 Estradiol one week after FET(nmol/l) 0,40 ± 0,06 0,25 ± 0,04 0,039 Four patients missed the second set of measurements. The power Doppler mode was not applied at any time during the visit to investigate the pregnancy itself (the fetus or the trophoblastic tissue). Therefore, data concerning the fetus, gestational sac, or placenta do not include any power Doppler information. **Vascularization, volume multiplied with VI. Values are mean ± SEM or n (%). 17-OHP = 17 hydroxyprogesterone The only earlier study in which the endometrial pattern was assessed before FET did not find an association between triple-line pattern and cycle outcome [16]. In most of our patients, the triple-line pattern was still visible one week after the FET, about 10 days after the positive LH test. At that time at the midluteal phase, the corpus luteum should be actively secrete progesterone. In addition, all the patients had progesterone supplementation, which is supposed to ensure that in case of corpus luteal deficiency the progesterone concentrations would be high enough. According to earlier findings, a triple-line pattern usually should disappear during the secretory phase under the influence of progesterone secretion[17]. It is possible that, if the second examination in our study had taken place later during the secretory phase, the incidence of triple-line pattern would have been lower. Interestingly, the triple-line pattern was still at the time of implantation more common in patients who eventually conceived. It was in our interest to evaluate if 3D power Doppler ultrasonography offered us a tool to predict the chances of patients to get pregnant after FET. Since this technique enables the accurate assessment of the volume of the organ and the vasculature supplying the organ, we measured endometrial, subendometrial, and dominant ovarian volumes and their vasculature before FET. The results show however that this technique did not distinguish between successful and unsuccessful cycles and may not be useful for this purpose. This is in accordance with earlier observation after fresh embryo transfer following COH [5,14,18]. There was no difference in endometrial Table 4: Subanalysis of serum hormone concentrations and endometrial thickness one week after FET. Pregnant (n = 12) P Pregnant, hcg positive (n = 6) P Pregnant, hcg negative (n = 6) P Nonpregnant (n = 14) P P1 25,1 ± 3, ,2 ± 6, ,0 ± 2, ,7 ± 13, P2 174,5 ± 8,0 121,2 ± 23,9 227,8 ± 136,5 92,3 ± 18,3 17-OHP1 9,0 ± 0, ,2 ± 0, ,8 ± 10, ,9 ± 0, OHP2 15,1 ± 2,1 16,9 ± 2,6 13,2 ± 3,3 8,3 ± 1,3 Endometrial 11,2 ± 0, ,4 ± 0, ,9 ± 0, ,2 ± 0, thickness 1 (mm) Endometrial thickness 2 (mm) 12,5 ± 0,6 12,3 ± 1,0 12,7 ± 0,9 10,5 ± 0,6 P, progesterone; 17-OHP, 17-hydroxyprogesterone; Values are mean ± SEM or n (%). Index 1 = measurements on the day of FET, Index 2 = one week later, at the time of second visit. P-values of the longitudinal comparison confront the characteristics on the day of FET and on the day of the second visit. Page 6 of 8 (page number not for citation purposes)

7 Reproductive Biology and Endocrinology 2009, 7:151 thickness between those who conceived and those who did not, supporting the common opinion that measurement of endometrial thickness cannot be used to predict the likelihood of subsequent conception [19]. There were clear signs of changes in corpus luteal activity with respect to whether the patients conceived or not. In patients who became pregnant, the 17-OHP and E 2 levels increased, most probably reflecting the rescue of the corpus luteum by hcg secreted from the trophoblastic tissue [20]. On the contrary, in patients who failed, the dominant ovarian volume decreased by the second set of measurements and 17-OHP levels were lower than in pregnant women, reflecting the continuing regression of the corpus luteum without hcg stimulation. The P levels rose in both groups, which probably was due to the exogenous P substitution. It is also very unlikely that the failure of the FET cycle was a consequence of low P levels, since no difference between the groups was observed. The software in the 3D ultrasonographic equipment provided the determination of echogenity of the tissue by assessing the mean gray value in the region of interest. The use of this modality has been very rare in previous studies [10]. Since the echogenity of the secretory endometrium is usually higher than in the surrounding myometrium, we assessed the echogenity in these two areas subjectively and used software to provide the MG values. A strong correlation between these two methods was observed. Future studies will show whether this index has clinical value. Conclusion The triple-line pattern of the endometrium at the time of FET was the only sign that predisposed pregnancy. Serum steroid levels or the endometrial or ovarian characteristics assessed using 3D power Doppler ultrasonography did not reveal any additional benefit. Nevertheless, more studies with a larger number of women are needed to confirm and extend these findings and establish a more precise cutoff value for endometrial volume, thickness, and vascularization indices. List of abbreviations FET: frozen embryo transfer; IVF: fertilization in vitro; COH: control ovarian hyperstimulation; 17-OHP: 17- hydroxyprogesterone; T: testosterone; hcg: human chorionic gonadotrophin; P: progesterone; E 2 : estradiol; CL: corpus luteum; MG: mean grayness; VI: vascularization index. Competing interests The authors declare that they have no competing interests. Authors' contributions TZ carried out the software analysis of the measurements and wrote the manuscript. IYJ participated in the design of the study, performed the all the 3D-ultrasound examinations, performed the statistical analysis, and participated in writing the manuscript. JST and JF participated in designing the study and writing the manuscript. IYJ was supported by a grant from the Finnish Academy and JST was supported by a grant from the Sigrid Juselius Foundation. All authors read and approved the final manuscript. Acknowledgements The study is part of TZ's PhD research thesis submitted to the senate of the Institute of Physiology of the 1st Medical Faculty, Charles University, for the doctoral program in biomedicine. We would like to thank Ladislav Krofta, MD from the Institute for the Care of Mother and Child, Prague, Czech Republic for providing perspectives, insight, and valuable feedback throughout this project. References 1. Andersen AN, Goossens V, Ferraretti AP, Bhattacharya S, Felberbaum R, de Mouzon J, Nygren KG: Assisted reproductive technology in Europe, 2004: results generated from European registers by ESHRE. Hum Reprod 2008, 23(4): Finnish IVF Statistics 2005 and preliminary data for 2006 Official Statistics of Finland, Health 2006 STAKES. Statistical Summary 7/ [ IVFtreatments.htm]. 3. Killick SR: Ultrasound and the receptivity of the endometrium. Reprod Biomed Online 2007, 15(1): Alcazar JL: Three-dimensional ultrasound assessment of endometrial receptivity: a review. Reprod Biol Endocrinol 2006, 4: Jarvela IY, Sladkevicius P, Kelly S, Ojha K, Campbell S, Nargund G: Evaluation of endometrial receptivity during in-vitro fertilization using three-dimensional power Doppler ultrasound. Ultrasound Obstet Gynecol 2005, 26(7): Jokubkiene L, Sladkevicius P, Rovas L, Valentin L: Assessment of changes in endometrial and subendometrial volume and vascularity during the normal menstrual cycle using threedimensional power Doppler ultrasound. Ultrasound Obstet Gynecol 2006, 27(6): Martins WDe P, Ferriani RA, Nastri CO, Dos Reis RM, Mauad Filho F: Measurement of endometrial volume increase during the first week after embryo transfer by three-dimensional ultrasound to detect pregnancy: a preliminary study. Fertil Steril 2008, 90(3): Hyden-Granskog C, Unkila-Kallio L, Halttunen M, Tiitinen A: Single embryo transfer is an option in frozen embryo transfer. Hum Reprod 2005, 20(10): Van Royen E, Mangelschots K, De Neubourg D, Valkenburg M, Meerssche M Van de, Ryckaert G, Eestermans W, Gerris J: Characterization of a top quality embryo, a step towards singleembryo transfer. Hum Reprod 1999, 14(9): Jarvela IY, Mason HD, Sladkevicius P, Kelly S, Ojha K, Campbell S, Nargund G: Characterization of normal and polycystic ovaries using three-dimensional power Doppler ultrasonography. J Assist Reprod Genet 2002, 19(12): Jarvela IY, Sladkevicius P, Tekay AH, Campbell S, Nargund G: Intraobserver and interobserver variability of ovarian volume, gray-scale and color flow indices obtained using transvaginal three-dimensional power Doppler ultrasonography. Ultrasound Obstet Gynecol 2003, 21(3): Bourgain C, Devroey P: The endometrium in stimulated cycles for IVF. Hum Reprod Update 2003, 9(6): Coulam CB, Bustillo M, Soenksen DM, Britten S: Ultrasonographic predictors of implantation after assisted reproduction. Fertil Steril 1994, 62(5): Kupesic S, Bekavac I, Bjelos D, Kurjak A: Assessment of endometrial receptivity by transvaginal color Doppler and threedimensional power Doppler ultrasonography in patients undergoing in vitro fertilization procedures. J Ultrasound Med 2001, 20(2): Serafini P, Batzofin J, Nelson J, Olive D: Sonographic uterine predictors of pregnancy in women undergoing ovulation induc- Page 7 of 8 (page number not for citation purposes)

8 Reproductive Biology and Endocrinology 2009, 7:151 tion for assisted reproductive treatments. Fertil Steril 1994, 62(4): Ng EH, Chan CC, Tang OS, Yeung WS, Ho PC: The role of endometrial and subendometrial vascularity measured by three-dimensional power Doppler ultrasound in the prediction of pregnancy during frozen-thawed embryo transfer cycles. Hum Reprod 2006, 21(6): Forrest TS, Elyaderani MK, Muilenburg MI, Bewtra C, Kable WT, Sullivan P: Cyclic endometrial changes: US assessment with histologic correlation. Radiology 1988, 167(1): Schild RL, Indefrei D, Eschweiler S, Ven H Van der, Fimmers R, Hansmann M: Three-dimensional endometrial volume calculation and pregnancy rate in an in-vitro fertilization programme. Hum Reprod 1999, 14(5): Friedler S, Schenker JG, Herman A, Lewin A: The role of ultrasonography in the evaluation of endometrial receptivity following assisted reproductive treatments: a critical review. Hum Reprod Update 1996, 2(4): Jarvela IY, Niinimaki M, Martikainen H, Ruokonen A, Tapanainen JS: Ovarian response to the human chorionic gonadotrophin stimulation test in normal ovulatory women: the impact of regressing corpus luteum. Fertil Steril 2007, 87(5): Publish with BioMed Central and every scientist can read your work free of charge "BioMed Central will be the most significant development for disseminating the results of biomedical research in our lifetime." Sir Paul Nurse, Cancer Research UK Your research papers will be: available free of charge to the entire biomedical community peer reviewed and published immediately upon acceptance cited in PubMed and archived on PubMed Central yours you keep the copyright BioMedcentral Submit your manuscript here: Page 8 of 8 (page number not for citation purposes)

9 Prenatal Diagnosis Effect of parity and fetal sex on placental and luteal hormones during early first trimester For Peer Review Journal: Prenatal Diagnosis Manuscript ID: PD R2 Wiley - Manuscript type: Original Article Date Submitted by the Author: 01-Nov-2011 Complete List of Authors: Järvelä, Ilkka; Oulu University Hospital, Obstetrics and Gynecology Žáčková, Tamara; Charles University, Institute for the Care of Mother and Child Department of IVF Laitinen, Päivi; Central Ostrobothnia Hospital, Laboratory Ryynanen, Markku; Oulu University Hospital, Obstetrics & Gynecology Tekay, Aydin; Oulu University Hospital, Obstetrics and Gynecology KeyWords: MATERNAL SERUM SCREENING, Fetal 3D/4D ultrasound < FETAL IMAGING, FETAL & PLACENTAL PATHOLOGY, corpus luteum, early pregnancy, 3d power doppler ultrasonography

10 Page 1 of 23 Prenatal Diagnosis 120 Primigravid Multigravid 3,0 2,8 Primigravid Multigravid 110 2,6 Progesterone (nmol/) Testosterone (nmol/l) 2,4 2,2 2,0 1,8 60 1, Pregnancy week 1, Pregnancy week 24 Primigravid 22 Multigravid 17-OH progesterone (nmol/l) Primigravid Multigravid For Peer Review Estradiol (nmol/l) Pregnancy week 0 Pregnancy week Figure 1. Mean values (boxes) and standard errors (error bars) for progesterone, 17-OH progesterone, testosterone and estradiol are presented for both primigravid and multigravid women. The shaded areas present statistically significant differences in AUCs (after log10 transformation) between the groups (for details, see Results).

11 Prenatal Diagnosis Page 2 of 23 hcg (IU/ml) Primigravid Multigravid Dominant ovarian volume (ml) Primigravid Multigravid Pregnancy week Pregnancy week 2000 Primigravid Multigravid PAPP-A (miu/l) Dominant ovarian vasculature (ml) 2,5 2,0 1,5 0 For Peer Review Pregnancy week 3,5 3,0 1,0 0,5 Primigravid Multigravid Pregnancy week Figure 2. Mean values (boxes) and standard errors (error bars) for human chorionic gonadotrophin (hcg), pregnancy-associated plasma protein A (PAPP-A), dominant ovarian volume and dominant ovarian vasculature are presented for both primigravid and multigravid women. The shaded areas present statistically significant differences in AUCs (after log10 transformation) between the groups (for details, see Results).

12 Page 3 of 23 Prenatal Diagnosis 3,0 2,8 Girls Boys Girls Boys 2,6 Testosterone (nmol/l) 2,4 2,2 2,0 1,8 Estradiol (nmo/l) ,6 2 1, Pregnancy week Pregnancy week For Peer Review Figure 3. Mean values (boxes) and standard errors (error bars) for testosterone and estradiol are presented for pregnancies with either female (girls) of male (boys) foetuses. The shaded areas present statistically significant differences in AUCs (after log10 transformation) between the groups. For details, see Results.

13 Prenatal Diagnosis Page 4 of Effect of parity and fetal sex on placental and luteal hormones during early first trimester Running title: Parity, fetal sex and early pregnancy hormones Manuscript word count: 2860; tables 2; figures 3 Ilkka Y. Järvelä, M.D., Tamara Žáčková, M.D., Päivi Laitinen, Ph.D., Markku 6 Ryynänen, M.D. and Aydin Tekay, M.D For Peer Review Departments of Obstetrics and Gynecology, Oulu University Hospital, Finland (I.Y.J., M.R. and A.T.), Laboratory, Oulu University Hospital, Oulu and Clinical Laboratory, Central Ostrobothnia Hospital, Kokkola (PL), Finland; Institute for the Care of Mother and Child Department of IVF, Charles University, Prague, Czech Republic (T. Ž.) Please address all correspondence to Dr. Ilkka Y. Järvelä, Department of Obstetrics and Gynecology, Oulu University Hospital, P.O. Box 5000, FIN Oulu, Finland. Telephone number: ilkka.jarvela@oulu.fi Funding sources: Ilkka Y. Järvelä was supported by a grant from The Finnish Academy. Authors disclosure: no conflict of interest What's already known about this topic? Earlier studies have shown that maternal hormone secretion during pregnancy may be affected by the number of previous pregnancies and also by fetal gender. Most of the earlier studies are cross-sectional and performed during late 1 st trimester or 2 nd trimester. What does this study add? This is a longitudinal study from pregnancy week 5 to week 11. The study adds the information of the luteoplacental hormone secretion taking place before those published ealier.

14 Page 5 of 23 Prenatal Diagnosis 25 Abstract OBJECTIVE Earlier studies have shown that maternal hormone secretion during late 1 st or 2 nd trimester may be affected by gravidity. We examined the luteoplacental hormone secretion during 5-11 weeks of gestation in relation to gravidity. METHOD 31 Forty-one naturally conceived pregnancies underwent weekly assessment of serum For Peer Review human chorionic gonadotropin (hcg), progesterone (P) and 17-OH progesterone (17- OHP), E2, testosterone, and PAPP-A levels. In addition, the volume and the vasculature of the dominant ovary with corpus luteum was assessed using 3- dimensional power Doppler ultrasonography. Areas under curve (AUCs) for hormonal and ultrasonographic parameters were calculated. RESULTS Twenty-two out of the 41 women were pregnant for the first time. All the pregnancies were uncomplicated and resulted in term deliveries of appropriately grown newborns. During pregnancy weeks 5-11 the secretion (AUC) of hcg (6.54±0.03 vs. 6.39±0.05, p=0.010), P (3.49±0.02 vs. 3.36±0.03, p=0.003), and 17-OHP (2.73±0.03 vs. 2.62±0.03, p=0.013) were higher in primigravid than in multigravid women. No other differences were detected between primigravid and multigravid women. CONCLUSION The placental function already differs between primigravid and multigravid women during the first weeks of pregnancy, which reflects the corpus luteal function. 47

15 Prenatal Diagnosis Page 6 of Introduction In early pregnancy, the most significant hormone secreted by placental trophoblast is human chorionic gonadotropin (hcg), which rescues the corpus luteum in order to maintain the synthesis and secretion of progesterone (P) (Csapo et al., 1973). The hcg production increases until the placenta becomes the major source of progesterone synthesis after the luteoplacental shift at 7-8 weeks of gestation (Csapo 54 et al., 1973, Csapo and Pulkkinen 1978, Järvelä et al., 2008). Thereafter, the hcg For Peer Review levels start to decline, which is considered as a sign of a morphologic change in the placenta (Hay 1988). From the twentieth gestational week onwards, the hcg production gradually increases again until term (Hay 1988). Earlier studies have suggested that a history of previous pregnancies and deliveries may have an effect on the maternal hcg levels during the ongoing pregnancy. Primigravid women seem to have higher hcg levels especially during the second trimester (Wald and Watt 1996, Barkai et al., 1996, Tislaric et al., 2002, Arslan et al., 2006), whereas during the late first trimester (9-14 weeks) the results have been contradictory (Spencer et al., 2000a, de Graaf et al., 2000, Chen et al., 2010). Not only hcg secretion but also placental production of pregnancy-associated plasma protein A (PAPP-A) and estradiol (E2) seem to differ between primigravid and multigravid women (Arslan et al., 2006, Bernstein et al., 1995, Wuu et al., 2002, Kagan et al., 2008, Sahota et al., 2009). In addition, fetal gender may affect placental hormone secretion. Some studies (de Graaf et al., 2000, Yaron et al., 2001), but not all (Chen et al., 2010), indicated that women carrying female fetuses have higher hcg levels at 9-14 weeks of gestation than those carrying male fetuses. Also, the PAPP-A levels were reportedly higher in women expecting girls (Larsen et al., 2002) than in

16 Page 7 of 23 Prenatal Diagnosis women carrying male fetuses. This was questioned by others (de Graaf et al., 2000, Yaron et al., 2001, Spencer et al., 2000b). However, no differences related to the fetal sex were observed in E2 or P levels during the first trimester (Lutterodt et al., 2009). The literature does not provide much information concerning the effect of gravidity and fetal sex on these hormones during earlier gestation. In addition, most of the observations come from cross-sectional studies. Our objectives, therefore, were the following: Firstly, we investigated longitudinally 79 the maternal hormone levels in primigravid and multigravid women during early For Peer Review gestation. Secondly, we assessed the relationship between gravidity and the function of corpus luteum, which may be affected by the alterations in hcg levels as the luteal rescue is dependent on the hcg secretion. Thirdly, we compared the maternal hormone secretion with respect to the fetal gender

17 Prenatal Diagnosis Page 8 of Methods Patients Pregnant women following spontaneous conception attending antenatal clinics provided by local health authorities were offered participation in the study. A written informed consent was obtained. Women with a history of gynecologic pathology (e.g., endometriosis, fibroids, pelvic surgery) or currently smoking were excluded. The 92 study was approved by the Ethics Committee of Oulu University Hospital, Oulu, For Peer Review Finland. After recruitment at 4-8 weeks of gestation, the patients were followed up weekly until week 11. At each visit, blood samples were collected for hormonal assays and an ultrasound examination was performed. The estimated date of delivery (EDD) was assessed according to the beginning of the last menstrual period. At gestational week 11 the EDD was confirmed by measuring the crown-rump length (CRL) using ultrasonograhy. Assays Serum concentrations of testosterone, progesterone and total hcg were analysed using an automated chemiluminescence system (Advia Centaur; Siemens Healthcare Diagnostics, Tarrytown, NY, USA). Serum placental pregnancy-associated plasma protein-a (PAPP-A) concentrations were determined by time-resolved fluoroimmunoassay (PerkinElmer Life Sciences Wallac Finland Ltd, Turku, Finland). Radioimmunoassays were used for 17-OH progesterone (17-OHP) and estradiol (E 2 ) (Orion Diagnostica, Oulunsalo, Finland), according to the manufacturers instructions. The respective intra-assay and inter-assay coefficients of variation were 5.0 and 5.4% for 17-OHP, 4.0 and 5.6% for testosterone, 5.7 and 6.4% for E 2, 3.7 and 5.4% for

18 Page 9 of 23 Prenatal Diagnosis progesterone, 2.0 and 3.5% for hcg and 3.5 and 4.9% for PAPP-A. External quality control of the hormone assays was organised by a national company (Labquality Ltd., Helsinki, Finland) and an international company (Bio-Rad Laboratories EQAS, Irvine, CA, USA). Ultrasonography The details of ultrasonographic examination including volume acquisition, storage and analysis have been described in detail elsewhere (Järvelä et al., 2003, Järvelä et 117 al., 2007). We used 3D ultrasonography (Voluson Expert 730; Kretz, Zipf, Austria) For Peer Review equipped with a transvaginal probe to examine the ovaries and the uterus. Power Doppler ultrasound was used only to locate the blood vessels in the ovaries and to identify the corpus luteum while keeping the embryo out of the scanning field at all times. Identical, pre-installed settings were used to acquire the ultrasound and the power Doppler information. The setting conditions for this study were as follows: frequency, mid; dynamic set, 2; balance, G > 170; smooth, 5/5; ensemble, 16; line density, 7; and power Doppler map, 5. The setting conditions for the subpower Doppler mode were as follows: gain, 5.6; quality, normal; wall motion filter, low 1; and velocity range, 0.9 khz. A computer-aided analysis imaging program (VOCAL, GE Healthcare, Zipf, Austria) for 3D power Doppler histogram analysis was used to determine the volume and vascularization in the ovary containing the corpus luteum. The manual mode of the VOCAL Contour Editor was used to cover the entire 3D volume of the ovary, with 30 rotation steps (Järvelä et al., 2003, Järvelä et al., 2007). Hence, six contour planes were analysed for each ovary to cover 180. After obtaining the total ovarian volume, the program calculated the ratio of colored voxels to all voxels, and this fraction of the total volume (%) was expressed as the vascularization index (VI). Vascularized

19 Prenatal Diagnosis Page 10 of volume (ml) in the ovary was calculated by multiplying the total ovarian volume by the VI. The intraobserver ICC for the volume, VI and vascularity measurements in the ovary containing the corpus luteum have been assessed earlier (0.99, 0.85 and 0.94, respectively)(järvelä et al., 2008). Statistics The Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) for Mac (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) was used for statistical analysis. The general linear model (GLM) 142 for repeated measures was used to measure significance within a group and to For Peer Review determine whether the patterns differed between the groups. Instead of performing a series of paired t-tests in a longitudinal setting like this for each pregnancy week, we calculated the area under the curve (AUC) for hormone secretion and ovarian ultrasound parameters and compared the AUCs with each other. AUCs for the hormone, vascularization and volume responses were calculated to cover pregnancy (amenorrhea) period days (pregnancy weeks 6, 7, 8, 9 and 10). AUCs could not be calculated for pregnancy days (pregnancy week 11) since we did not examine the patients at pregnancy week 12. In addition, there were only few patients examined during days 28-34, and therefore we did not calculate AUCs for the days (week 5). Prior to analysis, original AUCs were log10 transformed. To compare serum hormone levels and ovarian responses (AUCs) between different groups, the independent samples t test was used as a post hoc test for normally distributed variables, and the Mann-Whitney U test was used for variables with skewed distribution. Departure from a normal distribution was assessed using the Kolmogorov Smirnov test. To explore the independent effect of maternal characteristics on hormones, a univariate regression model, including maternal age, number of pregnancies and weight, was evaluated. Addition of the child s gender to

20 Page 11 of 23 Prenatal Diagnosis the adjusted model was also explored. A value of P < 0.05 was considered statistically significant. All values are given as mean ± SE Results Forty-one pregnant women were recruited, of which 22 were primigravid (Table 1). The primigravid women were younger than the multigravid women. The groups did 166 not differ with regard to maternal weight or body mass index (BMI). Each pregnancy For Peer Review ended in the term delivery of a newborn with normal weight. There were no differences in newborn gender or weight between primigravid and multigravid women (Table 1). Progesterone (P) The serum P levels during first trimester of pregnancy in primigravid and multigravid women are presented in Figure 1. According to the GLM test the P secretion (log10 transformed AUC) in the primigravid women was higher than in multigravid women (3.49±0.02 vs. 3.36±0.03, p=0.003) during gestational weeks 6-10 (i.e. from 42 to 76 days of gestation). Univariate analysis of the effect of maternal age, weight and gravidity on the P levels indicated that only the gravidity was significant (Table 2). Fetal gender did not affect the P levels OH progesterone GLM analysis showed that the 17-OHP (Fig. 1.) secretion during gestational weeks 6-10 in the primigravid women was increased compared with that of the multigravid women (2.73±0.03 vs. 2.62±0.03, P=0.013). According to the univariate analysis of

21 Prenatal Diagnosis Page 12 of the variance, the 17-OHP secretion depended only on gravidity and not on maternal weight, the age or fetal gender (Table 2). Testosterone GLM analysis of testosterone showed no changes within or between the primigravid and multigravid groups during the follow-up (Fig. 1). In the univariate analysis of variance, no maternal variable (age, weight or number of pregnancies) affected the T secretion. Only fetal gender was an independent factor affecting the T secretion 190 (Table 2). GLM analysis comparing pregnancies with male and female fetuses (Fig ) showed that T secretion (log10 AUC) was higher in pregnancies with female fetuses between pregnancy weeks 6-10 (1.96±0.04 vs. 1.77±0.06, P=0.018) For Peer Review Estradiol Analysis of repeated measurements of E2 showed changes, but the patterns did not differ between the primigravid and multigravid groups (Fig. 1). The univariate analysis of the variance indicated that only the gravidity and fetal sex affected the E2 secretion (Table 2). The GLM analysis between pregnancies with male and female foetuses (Fig. 3.) showed that E2 secretions were higher in pregnancies with female foetuses between pregnancy weeks 6-10 (2.30±0.04 vs. 2.10±0.03, P=0.002) Human chorionic gonadotrophin (hcg) The total serum hcg levels determined during weeks 5-11 are presented in Figure 2. In primigravid women, the hcg secretion was higher than in multigravid women (6.54±0.03 vs. 6.39±0.05, p=0.010). In the univariate analysis, only the gravidity affected log10 hcg AUCs (Table 2)

22 Page 13 of 23 Prenatal Diagnosis Pregnancy-associated plasma protein A The PAPP-A levels increased during the study period and the analysis of repeated measures did not show any difference between the groups (Fig 2). In the univariate analysis, only the number of pregnancies but not maternal weight was a significant factor affecting the PAPP-A levels (Table 2) Dominant ovarian volume 215 The analysis for repeated measurements showed that the dominant ovarian volumes changed during weeks 5-11, but no difference was observed between the primigravid and the multigravid women (Fig. 2). The ovarian volumes were not affected by maternal age, weight or number of pregnancies or fetal gender in the univariate analysis of the variance (Table 2) For Peer Review Dominant ovarian vasculature The analysis for repeated measurements showed changes in the dominant ovarian vasculature during the follow-ups, but the change did not differ between the primigravid and the multigravid women (Fig. 2). According to the univariate analysis of the variance, the vascularised volumes were not affected by any maternal characteristics other than by the gravidity (Table 2)

23 Prenatal Diagnosis Page 14 of Discussion Our observations indicate the following: Firstly, the gravidity affects the function of placenta and corpus luteum during weeks 5-11 of gestation. Secondly, the fetal gender has an impact on the maternal E and T levels The higher total hcg secretion observed in the primigravid women during weeks of gestation has not been reported previously. Earlier studies investigated the free β For Peer Review hcg levels during the late first trimester and the results were contradictory (Spencer et al., 2000a, de Graaf et al., 2000, Chen et al., 2010). Spencer et al. (2000) performed Down syndrome screening during weeks and observed that gravidity and parity were associated with a small but progressive increase in serum free β-hcg levels. De Graaf et al. (2000) found no change in serum free β-hcg levels in respect to parity during weeks In agreement with us were Chen et al. (2010), who examined patients between weeks 6-15 and observed that during this wide period multiparous women had significantly lower hcg levels Several studies in which women attended screenings for Down syndrome showed a negative correlation between multiparity and free β-hcg levels during the second trimester of pregnancy (Wald and Watt 1996, Daniel et al., 1994, Haddow et al., 1995, Mooney et al., 1995). Since the difference between hcg levels in the primigravid and multigravid or the nulliparous and multiparous women was < 10% after weight correction, its effect on the performance of Down syndrome screening has been considered negligible. Since in the present study the absolute difference in the hcg secretion between the groups was also only minor and no difference was observed in PAPP-A secretion, we do not believe that the finding would affect Down

24 Page 15 of 23 Prenatal Diagnosis syndrome screening performance. Despite several earlier studies, no theory to explain such decline in hcg secretion during subsequent pregnancies has been presented and the conundrum remains to be resolved In both the primigravid and the multigravid women, the hcg secretion rapidly rose from week 5 up to week 8-9, after which it gradually decreased towards the end of the first trimester. According to Hay et al. (1988), hcg secretion is related directly to the 264 mass of hcg-producing syncytiotrophoblastic tissue. The decline in hcg secretion reflects the morphologic change of the placenta from an organ of invasion to an organ of transfer (Hay 1988) For Peer Review No difference was observed in the E2 and PAPP-A secretion during 5-11 pregnancy weeks between primigravid and multigravid women. Increased E2 and PAPP-A concentrations in the nulliparous women have been observed in previous studies but later during pregnancy (Arslan et al., 2006, Bernstein et al., 1995, Wuu et al., 2002, Kagan et al., 2008, Sahota et al., 2009). It has been speculated that in the multiparous women earlier pregnancies have induced a rise in 16a-hydroxylase activity in the maternal liver, which leads to increased maternal metabolism of E2 and lower systemic E2 concentrations (Musey et al., 1987) The higher hcg secretion in the primigravid women resulted in increased corpus luteal activity compared to the multigravid women. Both P and 17-OHP secretion were higher in the primigravid women. The P levels in the primigravid women were higher already at week 7, suggesting increased corpus luteal activity rather than increased placental secretion, since the luteoplacental shift occurs at weeks 7-8 weeks.

25 Prenatal Diagnosis Page 16 of Even stronger evidence about increased corpus luteal activity is based on the finding that the 17-OHP production was higher in the primigravid women during the followup period (weeks 6-10). This hormone is believed to be produced only in the corpus luteum during the early pregnancy (Tulchinsky and Simmer 1972), reflecting only corpus luteal activity. Accordingly, it appears that increased hcg secretion from the placenta in the primigravid women results in higher corpus luteal activity during the first trimester of pregnancy. The statistical analysis did not however reveal any 289 difference in the corpus luteal blood supply, which is in close connection with the corpus luteal hormone secretion (Järvelä et al., 2008, Järvelä et al., 2007, Niswender et al., 1976, Miyazaki et al., 1998, Niswender et al., 2000) For Peer Review Pregnancies with female fetuses showed higher maternal estradiol and testosterone levels than those with male fetuses. This finding is surprising, since at this stage of pregnancy, only the testes of male fetuses and not the ovaries of the female fetuses are assumed to be hormonally active. The fetal testes start to produce testosterone after week 7, and the production reaches the maximum levels at weeks and decreases thereafter (Tapanainen et al., 1981). Female sex differentiation is not dependent on ovarian hormones, unlike male sex differentiation. The testes induce male sex differentiation through the production of anti-mullerian hormone, insulin-like factor(s) and androgens (Hughes 2001). Accordingly, it would be expected that pregnancies with male rather than female fetuses had higher steroid concentrations. It is therefore likely that the fetal gonads do not produce significant amounts of steroids into the maternal circulation and the difference we observed most likely originates from the placenta and the corpus luteum. Earlier studies have found gender-related differences, especially in hcg secretion, during the first trimester of pregnancy (de

26 Page 17 of 23 Prenatal Diagnosis Graaf et al., 2000, Yaron et al., 2001, Larsen et al., 2002), but not in E2 or testosterone secretion (Lutterodt et al., 2009, Skjoldebrand Sparre et al., 1995). We did not find any differences in P secretion between the genders, unlike Wuu et al. (2002) who measured lower P levels in pregnancies with female fetuses at weeks 16 and 27 (Wuu et al., 2002). No gender-related difference in PAPP-A levels was found, which is in agreement with several earlier studies (de Graaf et al., 2000, Yaron et al., 2001, Spencer et al., 2000b) but not all studies (Larsen et al., 2002) For Peer Review Conclusion Our longitudinal follow-ups of pregnancies between weeks 5 and 11 revealed that even in the beginning of the pregnancy the maternal hormone secretion maybe affected by both the number of previous pregnancies and by the fetal gender of the ongoing pregnancy. Not only the placental hormone secretion but also the corpus luteal function seems to be affected Authors' contributions IYJ has participated in designing the study, acquisition, analysis and interpretation of data, drafting and revising the article. TŽ, PL, MR and AT have participated in interpretation of data and revising the article. All the authors read and approved the final manuscript Acknowledgements Ilkka Y. Järvelä was supported by a grant from The Finnish Academy. The authors wish to thank the staff of Hormone laboratory of Oulu University Hospital for the analysis of the samples.

27 Prenatal Diagnosis Page 18 of References Arslan AA, Zeleniuch-Jacquotte A, Lukanova A, Afanasyeva Y, Katz J, Levitz M, Del Priore G, Toniolo P Effects of parity on pregnancy hormonal profiles across ethnic groups with a diverse incidence of breast cancer. Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev., 15 : Barkai G, Goldman B, Ries L, Chaki R, Cuckle H Effect of gravidity on 338 maternal serum markers for Down's syndrome. Prenat.Diagn., 16 : For Peer Review Bernstein L, Lipworth L, Ross RK, Trichopoulos D Correlation of estrogen levels between successive pregnancies. Am.J.Epidemiol., 142 : Chen T, Lundin E, Grankvist K, Zeleniuch-Jacquotte A, Wulff M, Afanasyeva Y, Schock H, Johansson R, Lenner P, Hallmans G, Wadell G, Toniolo P, Lukanova A Maternal hormones during early pregnancy: a cross-sectional study. Cancer Causes Control, 21 : Csapo AI, Pulkkinen M Indispensability of the human corpus luteum in the maintenance of early pregnancy. Luteectomy evidence. Obstet Gynecol Surv, 33 : Csapo AI, Pulkkinen MO, Wiest WG Effects of luteectomy and progesterone replacement therapy in early pregnant patients. Am J Obstet Gynecol, 115 : Daniel DG, Reynolds T, Penney MD Calculation of Down's syndrome risk. Lancet, 343 : 490. de Graaf IM, Cuckle HS, Pajkrt E, Leschot NJ, Bleker OP, van Lith JM Covariables in first trimester maternal serum screening. Prenat.Diagn., 20 :

28 Page 19 of 23 Prenatal Diagnosis Haddow JE, Palomaki GE, Knight GJ Effect of parity on human chorionic gonadotrophin levels and Down's syndrome screening. J.Med.Screen., 2 : Hay DL Placental histology and the production of human choriogonadotrophin and its subunits in pregnancy. Br J Obstet Gynaecol, 95 : Hughes IA Minireview: sex differentiation. Endocrinology, 142 : Järvelä IY, Niinimäki M, Martikainen H, Ruokonen A, Tapanainen JS Ovarian response to the human chorionic gonadotrophin stimulation test in normal 363 ovulatory women: the impact of regressing corpus luteum. Fertil Steril, 87 : For Peer Review Järvelä IY, Ruokonen A, Tekay A Effect of rising hcg levels on the human corpus luteum during early pregnancy. Hum.Reprod., 23 : Järvelä IY, Sladkevicius P, Kelly S, Ojha K, Campbell S, Nargund G Quantification of ovarian power doppler signal with Three-Dimensional ultrasonography to predict response during in vitro fertilization. Obstet Gynecol, 102 : Kagan KO, Wright D, Spencer K, Molina FS, Nicolaides KH First-trimester screening for trisomy 21 by free beta-human chorionic gonadotropin and pregnancy-associated plasma protein-a: impact of maternal and pregnancy characteristics. Ultrasound Obstet.Gynecol., 31 : Larsen SO, Wojdemann KR, Shalmi AC, Sundberg K, Christiansen M, Tabor A Gender impact on first trimester markers in Down syndrome screening. Prenat.Diagn., 22 : Lutterodt M, Byskov AG, Skouby SO, Tabor A, Yding Andersen C Anti- Mullerian hormone in pregnant women in relation to other hormones, fetal sex

29 Prenatal Diagnosis Page 20 of and in circulation of second trimester fetuses. Reprod.Biomed.Online, 18 : Miyazaki T, Tanaka M, Miyakoshi K, Minegishi K, Kasai K, Yoshimura Y Power and colour Doppler ultrasonography for the evaluation of the vasculature of the human corpus luteum. Hum Reprod, 13 : Mooney RA, Arvan DA, Saller DN,Jr, French CA, Peterson CJ Decreased maternal serum hcg levels with increasing gravidity and parity. Obstet.Gynecol., : For Peer Review Musey VC, Collins DC, Brogan DR, Santos VR, Musey PI, Martino-Saltzman D, Preedy JR Long term effects of a first pregnancy on the hormonal environment: estrogens and androgens. J.Clin.Endocrinol.Metab., 64 : Niswender GD, Juengel JL, Silva PJ, Rollyson MK, McIntush EW Mechanisms controlling the function and life span of the corpus luteum. Physiol Rev, 80 : Niswender GD, Reimers TJ, Diekman MA, Nett TM Blood flow: a mediator of ovarian function. Biol.Reprod., 14 : Sahota DS, Leung TY, Fung TY, Chan LW, Law LW, Lau TK Medians and correction factors for biochemical and ultrasound markers in Chinese women undergoing first-trimester screening for trisomy 21. Ultrasound Obstet.Gynecol., 33 : Skjoldebrand Sparre L, Carlstrom A, von Schoultz B, Carlstrom K Serum levels of androgens and estrogens and 'steroid-sensitive' liver proteins in early human pregnancy: influence on the gender of the offspring. Gynecol.Obstet.Invest., 40 :

30 Page 21 of 23 Prenatal Diagnosis Spencer K, Ong CY, Liao AW, Nicolaides KH. 2000a. The influence of parity and gravidity on first trimester markers of chromosomal abnormality. Prenat.Diagn., 20 : Spencer K, Ong CY, Liao AW, Papademetriou D, Nicolaides KH. 2000b. The influence of fetal sex in screening for trisomy 21 by fetal nuchal translucency, maternal serum free beta-hcg and PAPP-A at weeks of gestation. Prenat.Diagn., 20 : Tapanainen J, Kellokumpu-Lehtinen P, Pelliniemi L, Huhtaniemi I Age-related For Peer Review changes in endogenous steroids of human fetal testis during early and midpregnancy. J.Clin.Endocrinol.Metab., 52 : Tislaric D, Brajenovic-Milic B, Ristic S, Latin V, Zuvic-Butorac M, Bacic J, Petek M, Kapovic M The influence of smoking and parity on serum markers for Down's syndrome screening. Fetal.Diagn.Ther., 17 : Tulchinsky D, Simmer HH Sources of plasma 17alpha-hydroxyprogesterone in human pregnancy. J Clin Endocrinol Metab, 35 : Wald NJ, Watt HC Serum markers for Down's syndrome in relation to number of previous births and maternal age. Prenat.Diagn., 16 : Wuu J, Hellerstein S, Lipworth L, Wide L, Xu B, Yu GP, Kuper H, Lagiou P, Hankinson SE, Ekbom A, Carlstrom K, Trichopoulos D, Adami HO, Hsieh CC Correlates of pregnancy oestrogen, progesterone and sex hormone-binding globulin in the USA and China. Eur.J.Cancer Prev., 11 : Yaron Y, Wolman I, Kupferminc MJ, Ochshorn Y, Many A, Orr-Urtreger A Effect of fetal gender on first trimester markers and on Down syndrome screening. Prenat.Diagn., 21 :

31 Prenatal Diagnosis Page 22 of Primigravid women (1 st pregnancy) Multigravid women (2 nd or later pregnancy) For Peer Review P-value No. of women Age, years 24.5 (0.8) 27.6 (1.1) Weight, kg 59.6 (1.6) 64.4 (2.7) NS Body Mass Index No. of women with 22.3 (0.5) 23.3 (0.8) NS 1 pregnancy* 22 0 < pregnancies* pregnancies* pregnancies* pregnancies* pregnancies* 0 2 No. of women no delivery 22 2 <0.001 with 1 delivery deliveries deliveries 0 2 No. of women, 3 weeks 0 1 NS followed for 4 weeks weeks weeks weeks weeks 3 3 Gender Female 10 (45.5%) 12 (63.2%) NS Male 12 (54.5%) 7 (36.8%) Birth weight Female 3539 (170) 3583 (108) NS in grams Male 3824 (194) 3863 (195) NS All 3695 (132) 3686 (101) NS Table 1. Demographic data for primigravid and multigravid women. Values inside the parenthesis present standard error (SE) or percentage (%). *Number of pregnancies including the current one.

32 Page 23 of 23 Prenatal Diagnosis 434 Independent variable Dependent variables P 17- hcg PAPP OHP -A E2 T Vasculature in the dominant ovary No of pregnancies (1 vs. >1) Maternal weight F P F P Maternal age F Fetal gender (female vs. male) For Peer Review P F P Table 2. Univariate analysis of variance to detect the effect of maternal characteristics and foetal gender on the hormone levels and ovarian vasculature (F and P-value). P-value <0.05 was considered statistically significant.

33 The Role of 3D Ultrasound in Assessment of Endometrial Receptivity and Follicular Vascularity to Predict the Quality Oocyte T. Žáčková 1,2, I.Y. Järvelä 1 and T. Marděšič 1 Department of Obstetrics and Gynecology, Oulu University Hospital, Oulu 2 Institute for the Care of Mother and Child (UPMD), Department of IVF Charles University, Prague 3 Sanatorium Pronatal, Praha 1 Finland 2,3 Czech Republic 5 1. Introduction The success of human and embryo implantation depends on maternal and embryonic factors and their interactions. To asses uterine receptivity one must take various factors into account. Current advances in transvaginal 3D ultrasonography have allowed us to examine in detail and visualize pelvic organ structures to analyse their volumes with great accuracy (Alcazar et al., 2006 ),(Raga et al., 1999 ). It is reasonable to believe that an analysis of power Doppler signals in a volume better reflects the overall vascularization in an organ than analysis of a two-dimensional (2D) ultrasound image or measurement of blood flow velocity in a single or a few vessels. Using 3D Power Doppler Angiography we can assess both arterial and venous circulation also the whole architecture of the vascular net into a volumetric image with the posibility of an overall evaluation of blood flows, and computer analysis makes this assessment objective (Jokubkiene et al., 2006). The VOCAL (Virtual Organ Computer aided Analysis) and volume calculation is semi-authomatic type of calculating volumes starting from the rotation of the organ target of study. Allows to calculate partial volumes and at the same time the of vascular system and flows into the region of interest. Two dimensional Doppler sonography provides a subjective estimation of uterine and ovarian vascularity. Is it limited, however, by providing flow depiction in a single plane as opposed to the sample volume as obtained by free dimensional imaging. Therefore, three dimensional ultrasound and power Doppler angiography (3D US-PDA) have advantage of assessing simultaneously both the endometrial blood flow and endometrial volume (EV) (Merce et al., 2008 ) and improves better traditional ultrasound scanning imaging with the posibility of storing information for further analysis or share datasets through telemedicine. The follicular blood flow seems to play a major role during the growth and development of the follicle containing the oocyte (Chui et al.,1997 ),(Coulam et al.,1999). The surge in perifolicullar angiogenesis during selection of dominant follicles and following the LH surge or HCG can be detected by measurment of perifolicular flow/velocities. This allows identification of those follicles likely to produce high quality eggs and embryos. 3D surface

34 74 Ultrasound Imaging Medical Applications rendering at 4xmagnification can show the blood vessels in the follicular wall and can identify features incompatible with successfull oocyte retrieval (Cambell,2010). 2. Evaluation of endometrial receptivity Failure of implantation remains the main reason why most IVF treatment fails to result in pregnancy. Angiogenesis plays a critical role in various female reproductive processes such as development of dominant follicle, formation of a corpus luteum, growth of endometrium and implantation. A good blood supply towards the endometrium is usually considered as an essentials requirement for implantation. The ability to identify a receptive uterus prospectively by a noninvasive method would have an invaluable clinical impact on treatment efficiency and succes rates. This chapter explores the role of transvaginal three dimensional ultrasound (3d US) and 3D power Doppler ultrasound (3D-PDA) in evaluation of endometrial receptivity. 2.1 Technical aspects and three dimensional data analysis 3D US images can be obtained by two methods: freehand and automated. The freehand method requires manual movement of the transducer through the ROI. The automated method acquires the images using dedicated 3D transducers. When these probes are activated, the transducer elements automatically sweep through the ROI selected by the operator (the socalled "volume box") while the probe is held stationary. This provides more accuracy to this method as compared with the freehand systems, in which speed of sweep is more difficult to maintain constant manually by the operator. The digitally stored volume data can be manipulated and presented in various displays: multiplanar display, "niche" mode or surface rendering mode. Probably, the most used and useful display is multiplanar display, which simultaneously shows three perpendicular planes (axial, sagital and coronal), allowing navigation through these three planes with the possibility of switch over any desired plane (Alcazar et al, 2006). There are two basic methods employed to calculate volume from a three dimensional dataset :the convencional,,full planar,, or,,contour,, method and the more recently introduced,rotational,, method possible through the VOCAL imaging program (Virtuala Organ Computer aided analysis).this rotational method based on rotations in given steps (6, 9, 15, 30 ) on a given orthogonal plane (A, B or C).Vascularization of tissues within the ROI can be also assessed using 3D Power Doppler ultrasound (3D PDA) and the VOCAL program. Three Indices of vascularity are calculated: the Vascularization Index (VI) reflects the ratio of power Dopler information within the total dataset relative to both colour and grey information, the Flow Index (FI) represents the mean power Doppler signal intensity and the Vascularisation Flow index represents a combination of the two (Pairleitner et al., 1999). Using the,,shell,, function it is possible to calculate a volume at different thickness around the predetermined endometrium and estimate the vascularization in this,,shell,,.this allows the assessment of the so-called,,subendometrial region,, (Alcazar et al, 2006). 2.2 Results and authors studies The pregnancy outcome of frozen embryo transfer is known to be dependent on multiple clinical and embryological factors, including the age of the woman at IVF/ICSI treatment; (Salumets et.al, 2006 ),(Wang et. al, 2001), the method of oocyte fertilization used (Van Steirteghem et. Al, 1994 ),(Salumets et al., 2006 ), the developmental stage of embryos at freezing (Salumets et al., 2003 ), the embryo quality before freezing (Schalkoff et al., 1993 ), the extent of embryo damage after thawing (Edgar et al., 2000 ) and the resumption of post-thaw

35 The Role of 3D Ultrasound in Assessment of Endometrial Receptivity and Follicular Vascularity to Predict the Quality Oocyte 75 blastomere divisions (Van der Elst et al., 1997 ). On the other hand the risk of pregnancy loss is similar after cryopreservation and fresh IVF or ICSI (Aytoz et al., 1999) and embryo morphology is not related to the miscarriage rates in any of the treatment modalities studied (Veleva et al., 2008 ). Several ultrasound parameters of the endometrium and the evaluation of uterine and endometrial blood flow have been proposed for assessing endometrial receptivity, including endometrial thickness, endometrial pattern and endometrial and subendometrial blood floow and considered as implantation markers in vitro fertilization (IVF) and embryo transfer cycles. These parameters may identify patients with low implantation potential. However, their positive predictive value is low. No differences were find in endometrial thickness, endometrial volume, endometrial pattern, uterine PI, uterine RI, endometrial and subendometrial 3D power Doppler flow indeces between the nonpregnant and pregnant groups on LH+1(1 day after the LH surge) during frozen thawed embryo transfer cycles (Ng et al., 2006 ). Nevertheless another studies suggested any corelations between the thickness of endometrium and pregnancy rate during the treatment with assisted reproductive technology. There was the endometrial thickness decreases as function of the patients age on the day of HCG administration during an IVF cycle. (Amir et.al., 2007 ). In our study at the time of embryo transfer only the structure of endometrium seems to be of significance and 3D power Doppler ultrasound and steroids levels does not provide us any additional information at this point. The 3D transvaginal ultrasound measurements (Voluson Expert 730, Kretz, Zipf, Austria) were performed on the day of the FET and repeated about one week later, at the time of the expected implantation. The 3D ultrasound technique enabled the determination of endometrial, subendometrial, and ovarian volume, including possible changes in the vascular network. Identical preinstalled instrument settings (frequency, mid; dynamic set, 2; balance, G>170; smooth, 5/5; ensemble, 16; line density, 7; power Doppler map, 5; and the setting conditions for the power Doppler mode were gain, -5.6; quality, normal; wall motion filter, low 1; peak repetitive frequency PRF, 0.9 khz) were applied for all patients. At the second visit, the power Doppler mode was not used to examine the uterus. During the ultrasound examination, the uterus was first visualized in two-dimensional (2D) B-mode after the patient had emptied her bladder. The power Doppler mode was switched on, and the power Doppler box was positioned to cover the whole uterus. The 3D facility was engaged by switching to 'volume mode. The volume sector angle was preset to 80, and the fast volume acquisition (low-resolution) setting was selected to avoid artifacts. Thereafter, the ovaries were examined similarly. The ultrasonographic volume data were saved on the hard drive and analyzed later using the built-in virtual organ computer-aided analysis imaging program (VOCAL, GE Healthcare, Zipf, Austria) for 3D power Doppler histogram analysis. The manual mode of the VOCAL Contour Editor was used to cover the whole 3D volume of the region of interest (ROI), with 15 rotation steps. Hence, 12 contour planes were analyzed for each ROI to cover 360. After obtaining the total volume of the ROI, the program calculated the ratio of color voxels to all the voxels; this ratio (%) was expressed as the vascularization index (VI). The vascularized volume (unit ml) in the endometrium or in the ovary was calculated by multiplying the total volume of the ROI by its VI. The VOCAL program automatically calculated the index for mean grayness (MG) in the ROI, which presents the average grayness in the gray-scale voxels. We have reported only vascularization index and vascularized volume(vi x volume),since only the last one has been shown to reflex corpus luteal function in several studies(järvelä et al., 2007; Järvelä et al.,2008; Niinimäki et al 2009).We have not analysed any data concerning VI or VFI, neither do we have any intention to analyse them,because we are unaware what kind of physiological phenomena they reflect (Zackova et al., 2009).

36 76 Ultrasound Imaging Medical Applications Fig. 1. Three dimensional multiplanar depicting multiplanar display of the uterus. All three ortogonal planes can be displayed using this technique. Endometrium thickness meassurment. Fig. 2. Endometrial volume calculation by using VOCAL software after three dimensional ultrasound. Determination of the subendometrial area volume by using the,,shell,, facility. In this case 5 mm has been chosen.

37 The Role of 3D Ultrasound in Assessment of Endometrial Receptivity and Follicular Vascularity to Predict the Quality Oocyte 77 Fig. 3. The endometrial echo patterns in the pregnant group (93.3% vs. 40.0%, 95% CI %) on the day of FET and one week after (91.7% vs. 42.9%, 95% CI %).No differences were observed in the dominant ovarian vasculature. Fig. 4. Vascularization of the subendometrial area by 3D Power Doppler. 3D power doppler indexes VI,FI, and VFI refers to the shell area- subendometrium. Determination of the subendometrial area volume by using the,,shell,, facility. I n this case 5 mm has been chosen

38 78 Ultrasound Imaging Medical Applications 2.3 Assessment of endometrial echogenicity In the recent literature there has been interest in the possible relationship between the degree of endometrial echogenicity an IVF-ET outcome and the cycles sorted into six groups according to the extent of the upward hyperechogenic transformation of the endometrium. In contrast to the similiraty in individual, control ovarian hyperstimulation /COH / and embryology data among groups, they observed a dramatic decrease in clinical and ongoing pregnancy as well as in implantation rates from the lowest to the highest endometrial Fig. 5. The endometrial pattern,which was assessed in the longitudinal section and described as triple line or homoechogenic.

39 The Role of 3D Ultrasound in Assessment of Endometrial Receptivity and Follicular Vascularity to Predict the Quality Oocyte 79 echogenicity groups. Conversely, no relationship between endometrial thickness on the day of hcg administration and IVF-ET outcome was observed (Fanchin et al., 2001). This ultrasonographic aspect may be reflection of glandular straightness, reduced glandular secretion, and reduced stromal edema that characterize the proliferative endometrium, with a decreased number of interfaces to ultrasound. Since the echogenity of the secretory endometrium is usually higher than in the surrounding myometrium, we assessed the echogenity in these two areas subjectively and used software to provide the MG values. A strong correlation between these two methods was observed. Future studies will show whether this index has clinical value (Zackova et al., 2009). 3. Color Doppler sonography for the the optimization of follicular vascularity The 2D color Doppler studies have show that perifolicular blood flow of individual follicles during IVF treatment correlates with oocyte recovery (Nargund et al., 1996),oocyte developmental potential (Van Blerkom et al., 1997), embryo quality (Nargund et al., 1996), (Chui et al., 1997 ) and pregnancy rate (Coulam et al.,1999). We analysed relationship between kind of stimulated protokol and cause of sterility to determine ovarian and dominant follicle blood flow characteristics using three dimensional power Doppler ultrasound, grading system of perifollicular vascularity (Chui et al,,1997 ) and power doppler index PI and RI of dominant follicle artery in the prospective pilot study of 17 women in IVF/ICSI stimulation. Materials and methods. 17 the patients were stimulated in a long protocol (GnRh agonist- Zoladex, Decapeptyl) on 22-th day of their period and subsequently with rekombinant FSH (puregon /gonal pen) 15 days after downregulation / no follicles more than 10 mm, endometrium thickness less than 5 mm and level of Estradiol /E2/ less than 50 pg/ml. We exluded the women, who didn ' t agree with the examination on the day of ovum pick up futher such as women, whose stimulation was stopped for the risk of OHSS, women with the operation of right or left ovary, women with ovarectomy, women with uterine malformation, women with FSH level more than 10 miu/l in early follicular period or women with ovarian cysts. On the basis of male factor infertility exclusion we provided always ICSI Method. The 3D ultrasound examinations and power doppler sonography of the ovary and dominant follicle we provided on the day HCG (pregnyl) before ovum pick up. All the 3D ultrasound and PDA examinations were carried out by a single observer (T.Z) and all the patients were explored in a gynaecological position using Voluson Expert 760, Kretz, Zipf, Austria equipped with vaginal multifrequency ( from 3 to 9 mhz) volume transducer, which has a 146 field of view. The volume of the ovary and dominant follicle, vascularization index /VI/, flow index /FI/, vascularization flow index / VFI /, mean grayness, perifolicular vascularity and PI a RI of the dominant follicle was determined for each ovary separately. The dominant follicle is presented by maximal mean diameter (MD). Follicular volume (FV) was etermined for each follicle according to the sphere formula : FV (ml) = 4,1888 x (MD/2 (cm)) 3. The power dopler Windows was placed on the maximum longitudinal plane of both ovaries,including the whole ovarian surface. The following Doppler predetermined characteristics were applied in every patient (colour gain from -3 to -7,normal colour quality, wall motion filter,low 1, peak repetitive frequency PRF,0.9 KHz). When an adequate power Doppler signal was achieved, we placed the 3D box to aquire the volume from the region of interest (ROI). The VOCAL imaging program was used tu calculate the ovarian volume and 3D power Dopler indices. Using the manual mode, the contour of the different ovarain slices was traced by taking 15 rotational steps by using the longitudinal plane as the work plane. 3D power Dopller indices were calculated using the histogram

40 80 Ultrasound Imaging Medical Applications facility. Vascularization Index (VI ) is the number of colour voxels in the volume studied, symbolizing in this way the number of vessels arriving to the organ, expressed as a percentage.the Flow Index (FI) is the metan colour value of the colour voxels,thus representing the average blood flow intensity, expressed as a whole number rating from 0 to 100. VFI integrates both vascularization and blood flow (tisues perfusion). It si also expressed as a whole number rating from 0 to 100, and represents color value of grey and colour voxels in the studied ROI (Pairleitner et al., 1999). The Grading system (Chui, et al ) was used to assess perifollicular vascularity. (a) shows 25% circumferential flow (Grade1); (b) 26 50% flow (Grade 2); (c) 51 75% flow (Grade 3) and (d)75% flow (Grade 4), where follicles of high grade follicular vascularity are associated with grade 3 and 4. The oocyte of the dominant follicle from both ovaries was fertilized by ICSI and observed his embryogeny. The embryos were classified into four morphological grades in accordance with our conventional criteria (Kondo et al., 1996) consisting of blastomere size and the amount of anucleate fragmentation (conventional method): grade 1 (g1), blastomere uniform in size and shape and little or no fragmentation; grade 2 (g2), blastomeres uneven in size and shape and/or fragmentation <10% of the embryonic surface; grade 3 (g3), fragmentation of 10 30% of the embryonic surface; and grade 4 (g4), fragments >30% of the embryonic surface. On the day of ovum pick up we have collected the samples of follicular fluid of dominanat follicle without of blood contamination. After the collecting of samples of follicular fluid of dominant follicle and serum we provided their centrifugate and stored at -40 C until their planned biochemical analysis after the completed collection of the samples at all intended 80 patients. Results.The IVF/ICSI cycle was evaluated in 17 women, among which 5 were pregnant (29.4 %) and 12 non-pregnant (70.6 %). The median age of the women was 32 (range 26-36). The causes of the infertility were male in 12 cases (70.6 %), tubal in 2 cases (11.8 %) and mixed in 3 cases (17.6 %). There were 11 cases (64.7 %) of primary and 6 cases (35.3 %) of secondary infertility.statistical analysis of the data was performed with R programming language ( version We have computed descriptive statistics and p-values of hypothesis tests for comparing the group of pregnant and non-pregnant patients. For continuous data the normality is not assumed because of small sample sizes and asymmetry of the data distribution. The following tables give the median and range (minimum and maximum) of each continuous variable together with the p-value of the twosample Wilcoxon test. For categorical data we list the tables of counts with percentages of cases. To compare the two groups, the p-value of Fisher s exact test is computed (also for tables larger 2 by 2). Ultrasonography and Doppler angiography parameters measured on both ovaries are analyzed for each ovary separately.there is no significant difference between groups in the age of patients, type and causes of infertility and other general and clinical characteristics. In the group of pregnant women, there is a significantly larger number of grade 1 embryos on transfer day, a significantly larger flow index dx and there is a significant difference in the degree of morphological preimplantation quality of the 1. and 2. transferred embryos and in the degree of perifollicular vascularity of the right follicle dx. Other variables yield a non-significant difference between the pregnant and non-pregnant group because of small sizes of the data samples; however the p-values are near the 5%-level for the vascularization index and vascularization flow index, for which the observed values have the tendency to be larger for pregnant women and a future research with a larger number of patients is intended to attain significant results. Implications. The follicular vascularity assesment with 3D ultrasonography and PDA of ovaries may represent a possible predictors of the the outcome of assisted conception therapy. Future research with a larger number of patients is intended to attain significant results ant to confirm these findings.

41 The Role of 3D Ultrasound in Assessment of Endometrial Receptivity and Follicular Vascularity to Predict the Quality Oocyte 81 Fig. 6. Assessment of the ovarian volume by the virtual organ computer-aided analysis (VOCAL). Using the manual mode, the contour of different ovarian slices was traced by rotational steps every 15 taking the longitudinal plane as the work pattern. Fig. 7. Evaluation of the ovarian vascularity by three-dimensional power Doppler indices: vascualrization index (VI), flow index (FI) and vascularization flow index (VFI).These indices were calculated using the histogram facility provided by the virtual organ computer aided analysis (VOCAL) program.

42 82 Ultrasound Imaging Medical Applications Parametrs Pregnant (n=5) Non pregnant (n=12) P-value Age (years) 32 (26-34) 32 (29-36) Total dosage of FSH (IU) 2250 ( ) 2250 ( ) Days of FSH treatment 14 (10-15) 13 (10-19) Number of follicles > 16 mm on day of OPU 10 (6-28) 10 (5-17) Number of retrieved oocytes 6 (4-21) 7.5 (3-14) Number of fertilized oocytes 6 (3-16) 4.5 (3-10) Number of grade 1 embryos on transfer day 3 (2-4) 0 (0-2) Day of embryo transfer 3 (2-5) 3 (0-5) Type of infertility Primary 4 (36.3) 7 (63.6) Secondary 1 (16.7) 5 (83.3) Cause of infertility Male factor 4 (33.3) 8 (66.7) Tubal factor 1 (50.0) 1 (50.0) Mixed 0 (0.0) 3 (100.0) Number of transferred embryos (0.0) 1 (100.0) 2 5 (31.2) 11 (68.8) Table 1. General and clinical parameters in relation to IVF/ICSI outcome

43 The Role of 3D Ultrasound in Assessment of Endometrial Receptivity and Follicular Vascularity to Predict the Quality Oocyte 83 Parameters Pregnant (n=5) Non pregnant (n=12) P-value Degree of morphological preimplantation quality of transferred embryos (55.6) 4 (44.4) 2 0 (0.0) 8 (100.0) Degree of morphological preimplantation quality of transferred embryos (80.0) 1 (20.0) 2 1(14.3) 6 (85.7) 3 0 (0.0) 4 (100.0) Not obtained 0 (0.0) 1 (100.0) Grade of morphological reimplantationquality of selected oocytes from 3D measures dominant follicles dx (100.0) 0 (0.0) 2 3 (33.3) 6 (66.7) 3 0 (0.0) 4 (100.0) 4 0 (0.0) 1 (100.0) Not obtained 0 (0.0) 1 (100.0) Grade of morphological preimplantation quality of selected oocytes from 3D measuresdominant follicles sin (66.7) 1 (33.3) 2 1 (33.3) 2 (66.7) 3 2 (28.6) 5 (71.4) Not obtained 0 (0.0) 4 (100.0) Table 2. Embryological parameters in relation to IVF/ICSI outcome

44 84 Ultrasound Imaging Medical Applications Parameters Pregnant(n=5) Nonpregnant (n=12) p-value Total ovarian volume OV (ml) dx Total ovarian volume OV (ml) sin Volume of the dominant follicle FV (ml) l.dx Volume of the dominant follicle FV (ml) l.sin Vascularization index VI l.dx Vascularization index VI l.sin ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) 5.38 ( ) ( ) 4.98 ( ) ( ) 8.22 ( ) ( ) 8.54 ( ) Flow index FI l.dx ( ) ( ) Flow index FI l.sin ( ) ( ) Vascularization flow index VFI l.dx Vascularization flow index VFI l.sin Resistence index Doppler of the dominant follicle l.dx Resistence index Doppler of the dominant follicle l.sin Pulsatility index Doppler of the dominant follicle l.dx 4.95 ( ) 4.00 ( ) ( ) 3.91 ( ) ( ) 0.53 ( ) ( ) 0.55 ( ) ( ) 0.82 ( ) Table 3. Three - dimensional ultrasonography, Power doppler angiography parametrs on the HCG day in relation to IVF/ICSI outcome. Date are presented as mean +/- standart deviation.

45 The Role of 3D Ultrasound in Assessment of Endometrial Receptivity and Follicular Vascularity to Predict the Quality Oocyte 85 Parameters Pregnant(n=5) Nonpregnant (n=12) p-value Degree of perifollicular vascularity of the dominant follicle l.dx (11.1) 8 (88.9) 2. 1 (20.0) 4 (80.0) 3. 3 (100.0) 0 (0.0) Degree of perifollicular vascularity of the dominant follicle l.sin (12.5) 7 (87.5) 2. 2 (33.3) 4 (66.7) 3. 2 (100.0) 0 (0.0) Table 4. Perifollicular vascularity grading score on the HCG day in relation to IVF/ICSI outcome. Date are presented as mean +/- standart deviation. Grading system (Chui, et al ) used to assess perifollicular vascularity. Fig. 8. Dominant follicle volume calculation by using the VOCAL software after threedimensional ultrasound. The dominant follicle is presented by maximal mean diameter (MD). Follicular volume (FV) was determined for each follicle according to the sphere formula : FV (ml) = 4,1888 x ( MD/2 (cm))3.

46 86 Ultrasound Imaging Medical Applications 4. Conclusions Developments in infertility treatment assisted reproduction methods are directed to transfer a single high quality embryo, while maintaining a high standard of treatment success. In this context, in recent years recede into the background, the standard stimulation protocols using higher doses of FSH, often with a higher number of oocytes. The importance of more and more become soft stimulation protocols aimed at, although a smaller number of growing follicles, which are a source of high-quality oocytes. The Natural / Mild IVF managment / ISMAAR / requires greater understanding of medical physiology, follicular growth and endometrial receptivity, which can be investigated using high-quality 2D and 3D ultrasound Dopler ultrasound and ultrasound, as evidenced by the results of our work. In this context, early identification of high-quality follicles might serve as one means of enabling a timely selection of oocytes and embryos with high developmental competence and the hope of a successful implantation. The follicular vascularity assessment with 3D ultrasonography and PDA of ovaries may represent a possible predictors of the the ooutcome of assisted conception therapy. Future research with a larger number of patients is intended to attain significant results and to confirm these findings. Definition of new applications of 3D ultrasound in the diagnosis of women enrolled in the program of assisted reproduction and the definition of predictive factors in the evaluation of the oocyte quality would have a significant contribution to our everyday clinical practice. 5. References Alcazar,JL.(2006). Three-dimensional ultrasound assessment of endometrial receptivity: a review. Reprod Biol Endocrinol. Vo.4, November 9,pp.56, ISSN Amir,W.; Micha, B.; Ariel,H.; Liat, LG.; Jehoshua,D. &Adrian, S. (2007) Predicting factors for endometrial thickness during treatment with assisted reproductive technology. Fertil Steril Apr; Vol. 87, No. 4, pp Epub 2007 Jan 4. Aytoz, A.; Van den Abbeel, E.; Bonduelle. M.; Camus, M.; Joris, H.; Van Steirteghem, A. & Devroey, P.(1999).Obstetric outcome of pregnancies after the transfer of cryopreserved and fresh embryos obtained by conventional in-vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection. Hum Reprod Oct;Vol. 14, No. 10, pp Campbell, S. (2010)The role of advanced ultrasound in the managment of natural/mild ART, Proceedings of The Third Word congress on Mild Approaches in assisted Reproduction embracing Mild IVF and IVM, venue: Pacifik Yokohama, Japan, July 30 and 31, Coulam, CB.; Goodman, C. & Rinehart JS.(1999) Colour Doppler indices of follicular blood flow as predictors of pregnancy after in-vitro fertilization and embryo transfer. Hum Reprod Aug; Vol.14, No.8, pp Chui, DK.; Pugh,ND.; Walker,SM.; Gregory L.& Shaw, RW. (1997). Follicular vascularity-- the predictive value of transvaginal power Doppler ultrasonography in an in-vitro fertilization programme: a preliminary study. Hum Reprod Jan; vol.12 No.1, pp : Edgar,DH.; Bourne, H.; Jericho, H. & McBain, JC.(2000). The developmental potential of cryopreserved human embryos. Mol Cell Endocrinol Nov 27; Vol. 169, No.1-2), pp

47 The Role of 3D Ultrasound in Assessment of Endometrial Receptivity and Follicular Vascularity to Predict the Quality Oocyte 87 Fanchin R. (2001).Assessing uterine receptivity in 2001: ultrasonographic glances at the new millennium. Ann N Y Acad Sci Sep; Vol.943, pp Järvelä,IY.; Niinimäki, M.; Martikainen, H.; Ruokonen, A. & Tapanainen,JS.(2007). Ovarian response to the human chorionic gonadotrophin stimulation test in normal ovulatory women: the impact of regressing corpus luteum. Fertil Steril May; Vol. 87, No.5, pp Epub 2007 Jan 22. Järvelä, IY.; Ruokonen,A. & Tekay, A.(2008). Effect of rising hcg levels on the human corpus luteum during early pregnancy. Hum Reprod Dec;Vol. 23,No.12, pp Epub 2008,Aug 10 Jokubkiene L.; Sladkevicius,P.; Rovas, L. &Valentin L.(2006). Assessment of changes in endometrial and subendometrial volume and vascularity during the normal menstrual cycle using three-dimensional power Doppler ultrasound. Ultrasound Obstet Gynecol Jun; Vol 27 No. 6, pp Kondo, I.; Suganuma, N.; Ando, T.; Asada,Y.; Furuhashi,M. & Tomoda, Y.(1996). Clinical factors for successful cryopreserved-thawed embryo transfer. J Assist Reprod Genet Mar;Vol.13, No. 3, pp Mercé, LT.; Barco,MJ.; Bau,S. &Troyano, J. Are endometrial parameters by threedimensional ultrasound and power Doppler angiography related to in vitro fertilization/embryo transfer outcome?fertil Steril Jan;89(1) pp Epub 2007 Jun 6. Nargund, G.; Bourne, T.; Doyle, P.; Parsons, J.; Cheng, W.; Campbell, S & Collins, W.(1996).Associations between ultrasound indices of follicular blood flow, oocyte recovery and preimplantation embryo quality. Hum Reprod Jan; Vol. 11,No.1, pp Ng, EH.; Chan,CC.; Tang,OS.; Yeung, WS. & Ho,PC.(2006). The role of endometrial and subendometrial vascularity measured by three- dimensional power Doppler ultrasound in the prediction of pregnancy during frozen-thawed embryo transfer cycles. Hum Reprod Jun; Vol.21, No.6, pp Epub 2006 Jan 31. Niinimäki, M.; Ruokonen, A.; Tapanainen, JS & Järvelä,IY.(2009). Effect of mifepristone on the corpus luteum in early pregnancy. Ultrasound Obstet Gynecol Oct; Vol.34, no.4,pp Pairleitner, H.; Steiner, H.; Hasenoehrl,G. & Staudach A.(1999). Three-dimensional power Doppler sonography: imaging and quantifying blood flow and vascularization.ultrasound Obstet Gynecol Aug; vol. 14, No.2, pp Raga, F.; Bonilla-Musoles, F.;Casan, E. M.;Klein, O. &Bonilla, F.(1999). Assessment of endometrial volume by three-dimensional ultrasound prior to embryo transfer: clues to endometrial receptivity. Hum Reprod.Vol 14,No11, pp , Salumets, A. ;Suikkari,AM.; Mäkinen, S.; Karro, H.; Roos, A. & Tuuri,T.(2006). Frozen embryo transfers: implications of clinical and embryological factors on the pregnancy outcome. Hum Reprod Sep; Vol.21, no. 9, pp Epub 2006 May 9. Salumets, A.; Tuuri,T.; Mäkinen, S.; Vilska, S.; Husu,L.; Tainio,R. & Suikarri Am (2003). Effect of developmental stage of embryo at freezing on pregnancy outcome of frozen-thawed embryo transfer.hum Reprod Sep; Vol. 18, No. 9, pp

48 88 Ultrasound Imaging Medical Applications Schalkoff, ME. ; Oskowitz,SP. & Powers,RD.(1993). A multifactorial analysis of the pregnancy outcome in a successful embryo cryopreservation program. Fertil Steril May; Vol. 59, No. 5, pp : Van Blerkom, J.; Antczak, M. & Schrader, R.(1997). The developmental potential of the human oocyte is related to the dissolved oxygen content of follicular fluid: association with vascular endothelial growth factor levels and perifollicular blood flow characteristics. Hum Reprod May; Vol. 12, No. 5, pp Van Steirteghem, AC.; Van der Elst, J.; Van den Abbeel, E.; Joris, H.;Camus,M.& Devroey P(1994). Cryopreservation of supernumerary multicellular human embryos obtained after intracytoplasmic sperm injection. Fertil Steril Oct;Vol. 62, No. 4, pp Van der Elst, J.; Van den Abbeel,E.; Vitrier, S.; Camus, M.; Devroey, P. & Van Steirteghem,AC.(1997) Selective transfer of cryopreserved human embryos with further cleavage after thawing increases delivery and implantation rates. Hum Reprod Jul;Vol. 12, No. 7, pp Veleva, Z. ;Tiitinen, A.; Vilska,S.; Hydén-Granskog, C.; Tomás, C.; Martikainen, H & Tapanainen, JS. (2005) High and low BMI increase the risk of miscarriage after IVF/ICSI and FET. Hum Reprod Apr;Vol.23, No.4,pp Epub 2008 Feb 15. Wang, JX.; Yap,YY. & Matthews,CD.(2001). Frozen-thawed embryo transfer: influence of clinical factors on implantation rate and risk of multiple conception. Hum Reprod Nov; Vol. 16, No. 11, pp Zackova, T.; Järvelä,IY.; Tapanainen, JS.. & Feyereisl, J. (2009).Assessment of endometrial and ovarian characteristics using three dimensional power Doppler ultrasound to predict response in frozen embryo transfer cycles. Reprod Biol Endocrinol Dec 25; Vol. 7, pp.151.

49 stazeno: login: zackova Využití a význam 3D ultrasonografického vyšetření v asistované reprodukci Čes. Gynek. 2011, 76, č. 2 s The role of three-dimensional ultrasonography in assisted reproduction Žáčková T.1, Mardešič T.2, Krofta L.1, Řezáčová J.1, Feyereisl J.1 pro péči o matku a dítě, Praha, přednosta doc. MUDr. J. Feyereisl, CSc. 2Sanatorium Pronatal, Praha, vedoucí lékař doc. MUDr. T. Mardešič, CSc. 1Ústav ABSTRACT Objective: Clarifying the role of three-dimensional transvaginal sonography in diagnosis sterility and assisted reproduction treatment. Design: Review. Setting: Institute for the Care of Mother and Child, Department of IVF, Charles University, Prague. Methods: Study of current literature. Summary: With arrised frequency of ovarian, uterus and another pelvic patologies remains the threedimensional transvaginal sonography in diagnosis of sterility wommen very actuall in the fields of reproductive medicine. Actually the assesment of ovarian reserve belong to the essentials investigations in the diagnosis of primary and secondary sterility at this time. The advance in the three-dimensional transvaginal sonography allows to assess the endometrial volume, echogenity, endometrial vascularity and endometrial receptivity. There is a significant importace of 3D power dopler angiography by meassurment of folicular and ovarian vascularity with three indices (VI, FI, VFI) and provides the calculation of ovarian vascularity from the volume. New Sono-Automatic Volume Calculation (SonoAVC) software that identifies and quantifies hypoechoic regions within a three-dimensional dataset and provides automatic estimation of their absolute dimensions, mean diameter and volume. An unlimited number of volumes can theoretically be quantified, which makes it an ideal tool for assessment of the ovarian volume and the antral follicle count (AFC) in women undergoing controlled ovarian stimulation. Key words: transvaginal ultrasonography (TVUS), folliculometry, ovarian reserve, endometrial receptivity, 3D UZ power doppler angiography, ultrasound hysterosalpingography (HSG UZ), uterus endometrial contractility. SOUHRN Cíl práce: Zhodnocení významu a možnosti využití 3D ultrazvukového vyšetření v diagnostice a léčbě neplodnosti. Typ studie: Souhrnný článek. Název a sídlo pracoviště: Ústav pro péči o matku a dítě, Praha. Metodika: Studium dostupné literatury. Souhrn: Stoupající frekvence výskytu ovariálních, děložních a jiných pánevních patologií mezi ženami plánujícími koncepci činí problematiku ultrazvukového vyšetření u reprodukčních poruch vysoce aktuálním tématem. Zhodnocení ovariální rezervy se stává v současnosti nepostradatelnou součástí vstupního vyšetření pacientek s dg. primární i sekundární sterility. Současný pokrok v 3D TVUS umožňuje měřením endometriálního objemu, echogenicity a endometriálního prokrvení posoudit endometriální receptivitu. Na významu nabývá při vyšetřování folikulární a ovariální vaskularity tzv. 3D power doppler angiografie, zavádějící indexy (VI, FI, VFI), a umožňuje tak kvantifikovat ovariální vaskularitu v cílovém objemu. AVC (Automatic Volume Calculation), nový softwarový program identifikující a kvantifikující hypoechogenní oblasti v 3D souboru dat umožnuje automatické zhodnocení jejich absolutní velikosti, středního průměru a objemu. Neomezený počet objemů může být takto kvantifikován a může být ideálním nástrojem pro zhodnocení ovariálního objemu a počtu antrálních folikulů (AFC) u žen podstupujících kontrolovanou ovariální stimulaci. Klíčová slova: transvaginal ultrasonography (TVUS), folikulometrie, ovariální rezerva, endometriální receptivita, 3D UZ power doppler angiografie, ultrazvuková hysterosalpingografie (UZ HSG), uterinní endometriální kontraktilita. 128 Tento clanek podleha autorskemu zakonu a jeho vyuziti je mozne v souladu s pravnim prohlasenim:

50 stazeno: login: zackova ÚVOD Využití tří- (3D) a čtyřdimenzionální (4D) ultrasonografie v diagnostickém algoritmu u párů s poruchou plodnosti předcházel rozvoj těchto technologií v rámci gynekologie a porodnictví. Základním předpokladem pro běžné zavedení této zobrazovací techniky byl fenomenální rozvoj počítačových technologií. První pokusy s prostorovým ultrazvukovým zobrazením lze zaznamenat v 70. letech minulého století. Tehdy získání jediného prostorového obrázku analýzou jediného volumu dat vyžadovalo počítačové zpracování v délce 24 h a počítačový hardware vyplnil celou místnost [4]. Pro rozvoj 3D ultrasonografie a její zavedení do běžné klinické praxe sehrály stěžejní úlohu dvě řešení elektroingeneeringu. Prvním je externí elektromagnetický senzor polohy, který vylučuje nepřesnost pohybu sondy vyšetřujícím v případě, že je využívána tzv. freehand 3D. Jedná se o nejjednodušší a zároveň i nejstarší způsob 3D zobrazení, kdy ultrazvukovou sondou pohybuje sonografista a přístroj ukládá do paměti jednotlivé snímky z 2D řezů. Druhým základním technickým zdokonalením bylo motorizované snímání (akvizice) speciální 3D sondou. U těchto systémů sonda obsahuje vlastní mechanismus, který automaticky pohybuje zdrojem ultrazvukového vlnění a systém následně ukládá jednotlivé 2D obrazy. První typ motorizované sondy byl vyvinut v roce 1974 a poprvé byly zavedeny do klinické praxe v roce 1987 [1]. Tyto konstrukce se za poslední roky zdokonalily tak, že mohou pohyb vykonávat velice přesně a rychle. Výsledkem 3D snímání je prostorový objem dat (dataset), který je uložen v paměti přístroje a který je schopen procesem označovaným jako rendering zobrazit prostřednictvím stínování na plošném stínítku prostorový model. Moderní 3D sondy, a zvláště pak sondy matrixové dokážou sejmout až několik desítek objemů za sekundu a ve spojení s výkonnou počítačovou částí počítače jsou schopny vygenerovat prostorový model a sledovat jeho pohyb v reálném čase (live 3D/4D). 3D TVUS (three dimensional transvaginal sonography) zaujímá v oboru gynekologie a reprodukční medicíny relativně novou zobrazovací metodu. Umožňuje vyšetření ve všech 3 rovinách, a tedy nejpřesněji hodnotí objemové parametry. Dovoluje simultánní zhodnocení individuálních sekčních rovin závisejících částečně na poli našeho zájmu měření. Unikátně zobrazuje koronální rovinu kolmou k ose snímače napomáhající identifikaci povrchových nerovností, které mohou být zavzaty při měření objemu. Další výhodou 3D ultrazvukového zobrazení je autory zmiňovaná možnost pomocí digitálních technologií shromaždovat velká množství dat bez jakékoliv ztráty informací, která mohou být následně analyzována a přehodnocena. To umožňuje redukci času potřebného k vyšetření. Hovoříme o tzv. telemedicíně a virtuall real time consultation [18]. Využití 3D TVUS na poli AR ve folikulometrii je všeobecně považováno za přesnější v predikci zralých folikulů. 3D ultrasonografie se dále uplatňuje v diagnostice děložních anomálií, zhodnocení intrauterinních patologií, průchodnosti vej- covodů a hodnocení polycystických ovarií. Současný pokrok v 3D TVUS umožňuje měřením endometriálního objemu, echogenicity a endometriálního prokrvení posoudit receptivitu endometria. Zastánci 3D TVUS zdůrazňují ve srovnání s 2D UZ především větší přesnost měření, lepší informace o krevním průtoku a anatomii daného objektu měření, zlepšení zhodnocení komplexnosti anatomických odchylek, vyšší specifitu týkající se potvrzení normality a standardizaci sonografického vyšetřování. Nicméně mnoho autorů zůstává nepřesvědčeno o údajných výhodách 3D ultrazvukového zobrazení v oblasti gynekologické diagnostiky, což souvisí jednak s vysokými pořizovacími náklady přístroje a dále s potřebnými zkušenostmi sonografisty. VYSVĚTLENÍ PRINCIPU KALKULACE OBJEMU POMOCÍ 3D ULTRAZVUKOVÉHO ZOBRAZENÍ A 3D POWER DOPPLER ANGIOGRAFIE Existují dvě základní metody pro kalkulaci objemu ze záznamu prostorového objemu dat 3D ultrasonografického měření: konvenční,,ful planar, obrysová metoda a rotační, v současnosti více používaná metoda programu VOCAL (virtual organ computer aided analysis) (obr. 2, 3, 5, 6, 7). Obr. 1. Použijeme-li tzv. multiplanární zobrazení, získáme 3 roviny: A (vlevo nahoře) sagitální, B příčnou (vpravo nahoře) a C (vlevo dole) frontální v anglosaské literatuře jsou tyto roviny zvané longitudinální, transverzální a koronální. Čistě mediální a frontální rovinu získáme natočením ve všech třech osových pohledech. Pohled z frontální roviny (C) jasně dokumentuje normální konturu dutiny děložní a trojúhelníkovitý tvar dutiny děložní. Obě techniky zahrnují manuální náčrt objektu v tzv. multiplanárním zobrazení ukazující tři na sebe kolmé roviny měření (obr. 1). Obrysová metoda kalkulace objemu je založena na zobrazení série řezů jak v transverzální, tak koronální rovině, přičemž obrysová kontura je vedena v jiné rovině. Vzdálenosti jednotlivých řezů odráží stupeň změn v obrysu daného povrchu objektu měření. Rotační technika kalkulace objemu zobrazuje daný objekt při rotaci o 180 st. okolo centrální osy definované 129 Tento clanek podleha autorskemu zakonu a jeho vyuziti je mozne v souladu s pravnim prohlasenim:

51 stazeno: login: zackova Obr. 2. Zhodnocení ovariální vaskularity pomocí 3D power doppler: pro výpočet VI, FI, VFI bylo využito zobrazovacího programu VOCAL, hodnotícího jak objemové parametry, tak krevní tok skrze cílový objem za užití barevného histogramu. Všechny hodnoty jsou udávány jako průměr ze tří standardně prováděných měření. Dominantní folikul byl stanoven jako folikul s maximální střední hodnotou folikulárního průměru (MD). Folikulární objem byl určen podle vzorce: FV(ml) = 4,1888 x (MD/2 (cm))3. Obr. 3. Počítačová rekonstrukce pro výpočet celkového ovariálního objemu při využití manuálního modu v programu VOCAL, obrysy rozdílných ovariálních řezů byly zhodnoceny při rotačních krocích každých 15 st. v longitudinální rovině.výsledný 3D model je zobrazen vpravo dole. Obr. 4. 3D ultrasonografický,,drátkový model endometria. Pokud je použito VOCAL programu ke kalkulaci objemu, 3D model endometria je tvořen při užití rotace a prohlížen v jeho přirozené orientační rovině. V tomto modelu pohled z koronální roviny, zřetelně patrný nalevo, demonstruje fundální defekt arcuátní dělohy, zatímco skutečná anteflexe dělohy může být lépe zhodnocena z bočního pohledu vpravo. Obr. 5. Vymezení objemu subendometriální oblasti při užití počítačové 3D rekonstrukce,,pláštového zobrazení. V tomto případě byla oblast subendometria zvolena na hranici 5 mm. Zobrazení vaskularizace subendometria pomocí 3D power doppler angiografie. VI, FI, VFI. Převzato z [24]. Obr. 6. Zobrazení subendometriálního objemu pomocí rotační metody programu VOCAL ve 3 na sebe kolmých rovinách. Horní vlevo reprezentuje zobrazení v longitudiální rovině, horní vpravo zobrazení v transverzální rovině a dolní vlevo zobrazení v rovině koronální. Obr. 7. Objem dominantního ovaria s funkčním žlutým tělískem při zobrazení pomocí program VOCAL 130 Tento clanek podleha autorskemu zakonu a jeho vyuziti je mozne v souladu s pravnim prohlasenim:

52 stazeno: login: zackova dvěma kalipery. Počet rovin potřebný ke kalkulaci objemu je určen počtem rotačních kroků, např. při rotačních krocích každých 15 st. či 30 st. v longitudiální či koronální rovině. Výhodou rotační techniky VOCAL je usnadnění zhodnocení krevního toku pomocí kvantifikace power Doppler signálu jak v definovaném objemu zájmu měření, tak v okolní tkáni díky aplikaci paralelních vrstev k původní definované povrchové kontuře. Objekt měření může být vyšetřen v jedné z několika rozdílných zobrazujících se možností za účelem maximalizace dostupné informace a zlepšení prostorového vidění. Těchto výhod využívá i tzv. 3D power doppler angiografie (PDA), která zavádí indexy vypočtené při využití histogramu VI, FI, VFI a umožňuje rozšířené hodnocení děložní, endometriální a ovariální vaskularity. Při výpočtu indexů v zobrazovacím programu VOCAL v 3D UZ, který hodnotí krevní tok skrz celý orgán, představuje vascularization index (VI) stupeň prokrvení vyjádřený množstvím barevných voxelů v definovaném objemu. Prezentuje počet cév zásobujících orgán a bývá vyjádřený procentuálně. Flow index (FI) udává průměrnou intenzitu krevního toku v definovaném objemu a je vyjádřený v celých číslech od 0 do 100. Vascularizationflow index (VFI) reprezentuje kombinaci předešlých dvou indexů a je vyjádřen rovněž v celých číslech od 0 do 100. Byl stanoven exaktní vztah těchto indexů ke skutečnému průtoku a vaskularitě in vivo. Nicméně byly shledány jisté individuální rozdílnosti naznačující subjektivní roli tohoto měření při kategorizaci rozdílností určitých skupin pacientů (variabilita při měření jedním a více sonografisty) [6]. KLINICKÉ APLIKACE 3D SONOGRAFIE V ASISTOVANÉ REPRODUKCI Ultrazvukové vyšetření folikulární vaskularity V 90. letech byla pozornost soustředěna na vlastní vyšetření prokrvení dominantního folikulu. Popisují se regionální změny prokrvení folikulu během ovulace a tyto změny jsou dávány do souvislosti s jeho zráním. Bourne udává nejvyšší index rezistence (RI) první den menstruačního cyklu a nejnižší naopak v den LH (luteinizační hormon) peaku. Hodnoty RI začínají klesat 2 dny před ovulací a nejnižších hodnot dosahují v době ovulace (0,44±0,04) [2]. Změny perifolikulární vaskularity využívající power doppler analýzu na úrovni jednoho folikulu popisují někteří autoři dle procenta kolaterálního prokrvení a rozdělují do 4 stupňů [3]. V nativním cyklu v pozdní folikulární fázi stoupá ovariální průtok krve ve vaječníku obsahujícím dominantní folikul. Po ovulaci se postupně zvyšuje průtok corpus luteum. Již od počátku 90. let je snahou objektivizovat význam cévního zásobení ovarií a následně folikulu na kvalitu intrafolikulárního prostředí a získaných vajíček. Někteří autoři zaznamenali, že z oocytů vysoce vaskularizovaných folikulů byla získána kvalitní embrya, která následně úspěšně implantovala a vedla k pokračujícímu těhotenství [13, 19, 25]. Nicméně jiní autoři tento závěr nepotvrdili a role power dopplerovského měření perifolikulární vaskularity v selekci oocytů v IVF cyklech zůstává nadále otevřená pro další výzkum. Je důležité poznamenat, že u převážné většiny folikulů (>65 %) v IVF cyklech je popisována dobrá vaskularizace a rovněž dobře vaskularizované folikuly jsou obecně větší. Je tedy nejasné, zda samotné určení velikosti folikulu nebo více času zabírající měření prokrvení folikulu budou lepšími a dostačující prediktory úspěšnosti cyklu [25]. Relativní novinkou při vyšetřování folikulární a ovariální vaskularity je vyšetření tzv. 3D power doppler angiografie, která zavádí indexy vypočtené při využití barevného histogramu VI, FI, VFI, a umožňuje tak kvantifikovat ovariální vaskularitu v cílovém objemu (obr. 2). Využívá počítačové rekonstrukce pro výpočet celkového ovariálního objemu v zobrazení v již zmiňovaném 3D UZ programu VOCAL (Virtual Organ Computer Aided analysis program) za užití manuálního modu (obr. 3). Obrysy rozdílných ovariálních řezů jsou pak zhotoveny při různých rotačních krocích (např. každých 15 stupňů v longitudiální rovině), které umožňují výpočet indexů v zobrazovacím programu VOCAL, hodnotícím krevní tok skrz celý orgán. Vyšší hodnoty VI, VFI, FI byly naměřeny např. u pacientů s PCO, kde naznačují excesivní odpověď na stimulaci gonadotropiny. 3D UZ zobrazení intrauterinních patologií Nález endometriálního polypu není při hodnocení endometria nikterak ojedinělým nálezem. Nejlépe se zobrazuje během pozdní folikulární fáze, kdy jej můžeme dobře odlišit oproti rostoucímu heterogennímu endometriu s charakteristickou strukturou,,tří linií. Při využití zobrazení v koronální rovině můžeme přesně určit lokalizaci polypu často zaměňovaného s menším fibroidem. Zobrazení v 3D UZ zdůrazňuje vyšší specifitu 88 % v diagnostice přítomnosti polypu oproti konvenčnímu 2D UZ zobrazení s následným užitím solného roztoku [22]. Jejich prevalence v populaci sterilních pacientek se pohybuje mezi %, mírně převažuje u pacientek nad 35 let oproti mladší populaci. Na diagnózu endometriálního polypu myslíme při vyšetření TVUS při nálezu určitých nepravidelností v endometriálním echu, zvláště pokud na konci cyklu přetrvává místně silnější obraz endometria odvíjející se podle úhlu řezu. Někdy mohou např. krevní sraženiny v děložní dutině při ultrasonografickém vyšetření být zdrojem falešně pozitivního nálezu. Ačkoliv větší senzitivitu pro detekci endometriálních polypů má hysteroskopie, v primárním screeningu si sonografické vyšetření udržuje svou roli. Některé studie naznačují pozitivní výsledky v léčbě sterility po hysteroskopickém odstranění polypů, zejména ve vztahu k implantaci blastocysty. Naopak jiní autoři terapeutický efekt na otěhotnění při odstranění menších polypů pod 2 cm nepotvrzují [16]. 131 Tento clanek podleha autorskemu zakonu a jeho vyuziti je mozne v souladu s pravnim prohlasenim:

53 stazeno: login: zackova Zhodnocení tubární průchodnosti Kombinací kontrastního média a 3D ultrasonografie může být využíváno rovněž ke zhodnocení průchodnosti vejcovodů při tzv. 3D saline sonohysterosalpigografii (3D UZ HSG). Tato metoda umožňuje díky své neinvazivnosti eliminovat četná množství konvenčních hysterosalpingografií (RTG) a laparoskopických chromopertubací, nicméně vyžaduje jistou zkušenost a čas k provádění tohoto vyšetření. Přesto je třeba zdůraznit, že většina diagnostických laparoskopií prováděných z indikace idiopatická sterilita potvrdí v 60 % přítomnost endometriózy a ta může být vyloučena pouze laparoskopicky. Výsledky 3D UZ HSG jsou srovnatelné s RTG, navíc je odstraněna zátěž radiací a riziko alergické reakce. Je možné ji využít i při orientačním zjištění patologie v dutině děložní (myom, polyp), nemůže ale zjistit patologii v oblasti adnex (adheze) a rovněž nemůže být hodnocena pohyblivost abdominálního konce vejcovodu. Tato metoda využívá poznatku, že vejcovody je možné zobrazit, pokud je uvnitř tekutina (hydrosalpinx). Nejprve se používal fyziologický roztok, který mohl poskytnout jen negativní kontrast. Později byly vyvinuty nové ultrazvukově kontrastní látky např. Echovist. Sladkevicius et al. demonstrovali při užití 3D power doppler zobrazení dvakrát častější volnou průchodnost než při konvenčním 2D zobrazení (114 versus 58 tub), když používali hysterosalpingo-kontrastní sonografie [21]. Ultrazvuk v diagnostice syndromu polycystických ovarií K ultrazvukovému obrazu spojovanému s diagnózou syndromu polycystických ovarií - PCOS řadíme počet 12 a více folikulů rozměrů mezi 2 až 9 mm v jedné rovině na jednom ovariu, uspořádaného do tvaru náhrdelníku neboli tzv. obraz,,necklace sign, dále přítomnost zvětšeného ovariálního objemu nad 10 cm3 a ztluštělou tuniku albugineu. Nález na jednom ovariu je dostačující k potvrzení diagnózy spolu s dalšími kritérii, mezi která řadíme oligo-/anovulaci či klinické / biochemické známky hyperandrogenismu. Bývá obtížné odlišit diagnózu PCOS od mladých žen s nálezem většího počtu folikulů vzhledem k jejich věku. Dalšími ultrazvukovými nálezy spojovanými s diagnózou PCOS mohou být zvětšená oblast ovariálního stromatu či echogenicita stromatu zvýšená nebo rovna echogenicitě v oblasti myometria. Často bývá při diagnóze PCO naměřen vyšší krevní průtok zvětšeným ovariem nad 30 cm/s a snížená cévní rezistence. Byly naměřeny vyšší hodnoty VI, VFI, FI u pacientek s PCO syndromem, kde naznačují excesivní odpověď na stimulaci gonadotropiny [25]. Ultrazvukové zobrazení endometria Ultrazvukové zhodnocení endometria v diagnóze sterility zasluhuje pozornost zejména z hlediska určení faktorů ovlivňujících implantaci, tedy zhodnocení děložní receptivity. Nesmírnou výhodou je jeho neinvazivnost, nenáročnost a relativně dobrá dostupnost oproti jiným bioptickým metodám hodnotícím jak histologickou, tak molekulární úroveň, které nemohou být prováděny během cyklu, ve kterém chce žena otěhotnět. O endometriální receptivitě mluvíme jako o časovém úseku, kdy endometriální epitel nabývá funkčních, přechodných změn závislých na produkci steroidů umožňujících implantaci blastocyty. K tomu dochází v době mezi dnem cyklu (5. 9. den po ovulaci), kdy mluvíme o tzv.,,implantation window [11]. Během proliferační fáze cyklu se endometrium zobrazuje jako hypoechogenní, vícevrstevného vzhledu (triple-line) o výšce mezi 6 až 10 mm. Po ovulaci nabývá pod vlivem progesteronu izoaž hyperechogenního vzhledu o výšce 7 až 14 mm. Sledujeme-li výšku endometria, ve stimulovaných cyklech gonadotropiny může endometrium dosahovat mírně větší výšky oproti nativnímu cyklu, která koreluje s hladinou sérového estradiolu. Falešně mohou zvyšovat tloušťku endometria nálezy submukózních myomů či polypů, naopak nižší endometrium můžeme naměřit při diagnóze intrauterinních adhezí (Ashermanova syndromu), po expozici diethylstilbestrolu (DES), ale i po stimulaci antiestrogeny. Mezi faktory negativně ovlivňující implantaci embrya tedy řadíme jak výskyt submukózních myomů, větších endometriálních polypů, adenomyózy, vaskulárních abnormalit, intrakavitárních adhezí, endometriálních kalcifikací, přítomnost jizvy po císařském řezu, výskyt hydrosalpingu či vrozených vývojových děložních vad, přítomnost intrakavitární tekutiny včetně příliš malého chudě prokrveného žlutého tělíska ovarií [7]. Selhání implantace embrya zůstává v léčbě sterility stálým problémem [10, 11]. Studie hodnotící endometriální receptivitu a ultrasonograficky vyšetřitelné prediktivní parametry úspěšné implantace embryí zaměřují pozornost zejména na výšku, strukturu a charakter endometria, endometriální echogenicitu, objem a endometriální a subendometriální cévní prokrvení [5, 8]. Ve shodě s výsledky naší prospektivní studie nebyly prokázány rozdíly ve skupině těhotných a netěhotných žen první den po nástupu peaku LH v cyklech s přenosem rozmražených embryí (FET) při měření těchto parametrů: výška endometria, endometriální objem, charakter endometria, uterinní indexy pulzatility (PI) a indexy rezistence (RI), endometriální a subendometriální power doppler indexy, tedy VI (vascularisation index), FI (flow index) a VFI (kombinace obou indexů) [15, 24]. Výška, objem endometria a index pulzatility uterinních arterií jsou nyní považovány za méně důležité parametry v hodnocení endometriální receptivity než morfologie endometria (tripple line) a prokrvení subendometria. Současný pokrok v 3D TVUS umožňuje s mnohem větší přesností detailně vyšetřit a vizualizovat pánevní orgánové struktury pro analýzu jejich objemu. 3D power doppler ultrasonografie může zhodnotit jak arteriální, tak venózní cirkulaci a následně ji objektivizovat pomocí počítačové analýzy (obr. 4). Tyto výhody umožnují 3D power doppler angiografii simultánně hodnotit jak endometriální objem, tak prokrvení [12] (obr. 5, 6). 132 Tento clanek podleha autorskemu zakonu a jeho vyuziti je mozne v souladu s pravnim prohlasenim:

54 stazeno: login: zackova Role ultrazvuku v diagnóze vrozených děložních malformací Kongenitální malformace dělohy bývají spíše spojovány s diagnózou opakovaných potratů (26 36 %) a předčasných porodů (15 18 %) než se sterilitou, tedy neschopností otěhotnět. Prevalence vrozených vývojových vad je udávána přibližně 6,7 % v normální populaci respektive 7,3 % v infertilní populaci a 16,7 % v populaci s opakovanými potraty [20]. Mnoho kongenitálních anomálií dělohy bývá často bez klinických příznaků a mnohé z nich zůstávají nerozpoznány. Jednou z mála operací přinášejících benefit v léčbě sterility je hysteroskopická resekce septa při diagnóze uterus septus či subseptus. Zlatým standardem v zobrazení kongenitálních anomálií dělohy zůstává pro svou neinvazivitu, excelentní přesnost a cenovou příznivost 3D ultrazvuk. Díky své vysoké senzitivitě a specifitě týkající se schopnosti zobrazení v koronální rovině kolmé k ose snímače napomáhá 3D UZ vizualizaci kontury fundu mezi oběma rohy děložními a srovnává vztah endometria k myometriu (např. zobrazení uterus arcuatus, uterus subseptus, uterus septus). 3D ultrazvuk tak může být dobře využit k posouzení délky a charakteru septa dutiny děložní. Ultrazvukový nález či podezření na vrozenou malformaci dělohy lze dále objektivizovat pomocí hysterografie nebo MRI. Laparoskopie a hysteroskopie jsou nákladnější, invazivní, oproti UZ vyšetření rizikovější a vyžadují více času, nicméně umožňují zcela přesné potvrzení či vyloučení plášťové vady dělohy. objemem za lepší prediktor reakce na kontrolovanou ovariální hyperstimulaci [9, 17]. Objem ovaria můžeme pomocí TVUS změřit velmi snadno a je obvykle vypočítán podle vzorce pro elipsoid (0,52 x délka, výška a šířka ovaria v cm). V současnosti je stále více využíváno 3D UZ zobrazení, umožňující vyšetření ve všech 3 rovinách, a tedy nejpřesněji hodnotící objemové parametry (obr. 7). Jeho užití ve folikulometrii, měření objemů ovarií a AFC je tak všeobecně považováno za přesnější v predikci zralých folikulů. Automatické měření objemu vyžadující sběr dat z 3D souboru a následná automatická analýza těchto údajů může značně ušetřit čas potřebný k měření jednotlivých objemů folikulů při zachování standardní validity a spolehlivosti měření 2D ultrazvukem. Poslední novinkou je sono AVC (Automatic Volume Calculation : GE Medical systems, ZipF, Austria), nový softwarový program identifikující a kvantifikující hypoechogenní oblasti v 3D souboru dat a provádějící automatické zhodnocení jejich absolutní velikosti, středního průměru a objemu [17]. Pro každý individuální objem je přiřazena specifická barva a provedeno automatizované měření středního průměru koule, jeho maximálních rozměrů (x, y, z průměru). Jeho objem je zobrazen těmito barvami v sestupném pořadí velikosti. Neomezený počet objemů může být teoreticky kvantifikován a může být ideálním nástrojem pro zhodnocení ovarií, respektive ovariálního objemu a počtu antrálních folikulů u žen podstupujících kontrolovanou ovariální stimulaci. Děložní endometriální kontraktilita NEJNOVĚJŠÍ POZNATKY Z PROBLEMATIKY 3D ULTRAZVUKOVÉHO ZOBRAZENÍ V REPRODUKČNÍ MEDICÍNĚ Ultrazvukové zhodnocení ovariální rezervy Cílem testování tzv. ovariální rezervy je zhodnotit počet vajíček v ovariu a identifikovat ženy s tzv. sníženou ovariální rezervou (AFC 3-10) pro následnou stimulaci [9]. Toto vyšetření může pomoci identifikovat ženy s příznivou prognózou i sníženou pravděpodobností na početí. V současné době máme k dispozici kromě věku ženy další ukazatele a testy hodnotící ovariální rezervu a pravděpodobnou odpověď ovarií na případnou stimulaci. Mezi tyto testy patří stanovení sérové hladiny FSH (folikulostimulační hormon 3. den menstruačního cyklu) v kombinaci s estradiolem, dále inhibinu B a v neposlední řadě i hladiny AMH (antimüllerian hormone). Všechny tyto testy odrážejí přímo či nepřímo produkci hormonů buňkami granulózy a měly by korelovat s počtem folikulů přítomných v ovariu. Poslední studie však ukazují, že měření počtu antrálních folikulů (AFC), tedy folikulů mezi 2 6 mm pomocí transvaginálního ultrazvuku (TVUS), lépe koreluje s počtem než kvalitou získaných vajíček. Zároveň je AFC považován ve srovnání s věkem, bazální hladinou FSH a ovariálním TVUS prováděná v čase ve spojení s audiovizuální a počítačovou technologií může systematicky hodnotit možnou kontraktilní aktivitu endometria. Obrázky jsou zaznamenávány po dobu několika minut a následně digitalizovány on-line. Frekvence děložní endometriální kontraktility je zhodnocena v časovém modu pomocí grafu vytvořeného elektronicky s následnou 3D-rekonstrukcí. V časovém grafu frekvence děložních kontrakcí může být určena jako řada počtu vertikálních posunů endometrio-myometriálních rozhraní a děložní dutiny za čas. Při porovnání využití 2D a 3D UZ během ET nebyly shledány zásadní rozdíly co do úspěšnosti v následném početí, některé prameny naznačují výhodu využití 3D UZ v pozorování ohybu katétru při embryotransferu ve třech rovinách během tohoto výkonu. ZÁVĚR V souvislosti s asistovanou reprodukcí ultrazvukové vyšetření zásadně zjednodušilo celou léčbu. Přineslo zvýšení efektivnosti, snadnější a bezpečnější provádění těchto metod a v neposlední řadě podstatně rozšířilo naše poznatky o reprodukčních procesech. Stoupající frekvence výskytu ovariálních, děložních a jiných pánevních patologií mezi ženami plánujícími koncepci činí problematiku ultrazvukového vyšetření u repro133 Tento clanek podleha autorskemu zakonu a jeho vyuziti je mozne v souladu s pravnim prohlasenim:

55 stazeno: login: zackova dukčních poruch vysoce aktuálním tématem, kterým se v současné literatuře zabývá množství prací. Zhodnocení ovariální rezervy se dnes stává nepostradatelnou součástí vstupního vyšetření pacientek s diagnózou primární i sekundární sterility. Mimo 3D ultrazvukové zhodnocení děložních abnormalit máme k dispozici značná množství omezených dat týkajících se jeho dalšího klinického využití, aniž by byl prokázán konkrétní benefit oproti 2D UZ vyšetření. Vývoj v léčbě sterility metodami asistované reprodukce směřuje k přenosu jediného vysoce kvalitního embrya při zachování standardně vysoké úspěšnosti léčby. V této souvislosti v posledních letech ustupují do pozadí,,standardní stimulační protokoly využívající vysokých dávek FSH často s vyšším počtem získaných oocytů. Na významu stále více nabývají tzv. měkké stimulační protokoly, jejichž cílem je sice menší počet rostoucích folikulů, které jsou však zdrojem vysoce kvalitních oocytů. Tento Natural / Mild IVF managment (ISMAAR) vyžaduje větší porozumění lékařů fyziologii folikulárního růstu a endometriální receptivitě, která může být vyšetřována s vysokou kvalitou pomocí 2D UZ a 3D UZ a doplerovského ultrazvuku, jak dokládají i výsledky naší práce [24, 25]. V této souvislosti včasná identifikace vysoce kvalitních folikulů by mohla sloužit jako jedna z cest umožňujících velmi včasnou selekci oocytů a embryí s nejvyšší vývojovou kompetencí a nadějí na úspěšnou implantaci. Vymezení nových aplikací 3D ultrasonografie v diagnostice žen zařazených do programu asistované reprodukce a definice prediktivních faktorů v hodnocení kvality oocytu by tak mohla mít významný přínos do naší každodenní klinické praxe LITERATURA Timor-Tritsch, IE., Platt, LD. Three-dimensional ultrasound experience in obstetrics. Curr Opin Obstet Gynecol, 2002(14), p Bourne, TH., Jurkovic, D., Waterstone, J., et al. Intrafollicular blood flow during human ovulation. Ultrasound Obstet Gynecol, 1991, 1(1), p Chui, DK., Pugh, ND., Walker, SM., et al. Follicular vascularity the predictive value of transvaginal power Doppler ultrasonography in an in-vitro fertilization programme: a preliminary study. Hum Reprod, 1997, 12(1), p Gritzky, A., Brandl, H. The Voluson (Kretz) technique. In 3D ultrasound in obstetrics and gynecology, Mertz, E. (ed.). Philadelphia, Lippincort Williams & Wilkins Healthcare, 1998, p Jarvela, IY., Sladkevicius, P., Kelly S., et al. Evaluation of endometrial receptivity during in-vitro fertilization using threedimensional power Doppler ultrasound. Ultrasound Obstet Gynecol, 2008, 26(7), p Jarvela, IY., Sladkevicius, P., Tekay, AH., et al. Intraobserver and interobserver variability of ovarian volume, gray-scale and color flow indices obtained using transvaginal three-dimensional power Doppler ultrasonography. Ultrasound Obstet Gynecol, 2003, 21(3), p Järvelä, IY., Ruokonen, A., Tekay, A. Effect of rising hcg levels on the human corpus luteum during early pregnancy. Hum Reprod, 2008, 23(12), p Jokubkiene, L., Sladkevicius, P., Rovas, L., et al. Assessment of changes in endometrial and subendometrial volume and vascularity during the normal menstrual cycle using three dimensional power Doppler ultrasound. Ultrasound Obstet Gynecol, 2009, 27(6), p Jayaprakasan, K., Hilwah, N., Kendall, NR., et al. Does 3D ultrasound offer any advantage in the pretreatment assessment of ovarian reserve and prediction of outcome after assisted reproduction treatment? Hum Reprod, 2007, 22(7), p Killick, SR. Ultrasound and the receptivity of the endometrium. Reprod Biomed Online, 2008, 15(1), p Makker, A., Singh, MM. Endometrial receptivity: clinical assessment in relation to fertility, infertility, and antifertility. Med Res Rev, 2006, 26(6), p Merce, LT., Barco, MJ., Bau, S., et al. Are endometrial parameters by three-imensional ultrasound and power Doppler angiography related to in vitro fertilization/embryo transfer outcome. Fertil Steril, 2007, 89(1), p Nargund, G., Doyle, PE., Bourne, TH., et al. Ultrasound derived indices of follicular blood flow before HCG administration and the prediction of oocyte recovery and preimplantation embryo quality. Hum Reprod, 1996, 11(11), p Nargund, G., Fauser, BC., Macklon, NS., et al.: Rotterdam ISMAAR Consensus Group on Terminology for Ovarian Stimulation for IVF. The ISMAAR proposal on terminology for ovarian stimulation for IVF. Hum Reprod, 2007, 22(11), p Ng, EH., Chan, CC., Tang, OS., et al. The role of endometrial and subendometrial vascularity measured by three-dimensional power Doppler ultrasoundin the prediction of pregnancy during frozen-thawed embryo transfer cycles. Hum Reprod, 2006, 21(6), p Pérez-Medina, T., Bajo-Arenas, J., Salazar, F., et al. Endometrial polyps and their implication in the pregnancy rates of patients undergoing intrauterine insemination: a prospective, randomized study. Hum Reprod, 2005, 20(6), p Raine-Fenning, N., Jayaprakasan, K., Clewes, J. Automated follicle tracking facilitates standardization and may improve work flow. Ultrasound Obstet Gynecol, 2009, 30(7), p Raine-Fenning, N., Fleischer, AC. Clarifying the role of threedimensional transvaginal sonography inreproductive medicine: an evidenced-based appraisal. J Experimental & Clinical Assisted Reprod, 2005, 2(10), p Robson, SJ., Barry, M., Norman, RJ. Power Doppler assessment of follicle vascularity at the time of oocyte retrieval in in vitro fertilization cycles. Fertil Steril, 2008, 90(6), p Saravelos, SH., Cocksedge, KA., Li, TC. Prevalence and diagnosis of congenital uterine anomalies in women with reproductive failure: a critical appraisal. Hum Reprod Update, 2008, 14(5), p Sladkevicius, P., Ojha, K., Campbell, S., Nargund, G. Threedimensional power Doppler imaging in the assessment of Fallopian tube patency. Ultrasound Obstet Gynecol 2000, 16(7), p La Torre, R., De Felice, C., De Angelis, C., et al. Transvaginal sonographic evaluation of endometrial polyps: a comparison with two dimensional and three dimensional contrast sonography. Clin Exp Obstet Gynecol, 1999, 26(3 4), p Woelfer, B., Salim, R., Banerjee, S., et al. Reproductive outcomes in women with congenital uterine anomalies detected by three-dimensional ultrasound screening. Obstet Gynecol, 2001, 98(6), p Žáčková, T., Järvelä, IY., Tapanainen, JS., Feyereisl, J. Assessment of endometrial and ovarian characteristics using free dimensional power Doppler ultrasound to predict response in frozen embryo transfer cycles. Reprod Biol Endocrinol, 2009, 51(7), p Žáčková, T., Šafář, P., Krofta, L., et al. Ultrazvuk v diagnostice primární a sekundární sterility /současné trendy utrazvukového vyšetření v reprodukční medicíně. Postgrad Med, 2009, 5, s MUDr. Tamara Žáčková Ústav pro péči o matku a dítě Podolské nábřeží Praha 4-Podolí 134 Tento clanek podleha autorskemu zakonu a jeho vyuziti je mozne v souladu s pravnim prohlasenim:

56 focus Ultrazvuk v diagnostice primární a sekundární sterility (současné trendy utrazvukového vyšetření v reprodukční medicíně) 1 MUDr. Tamara Žáčková, 1 MUDr. Petr Šafář, CSc., 1 MUDr. Ladislav Krofta, CSc., 1 MUDr. Jitka Řezáčová, 2 doc. MUDr. Tonko Mardešić, CSc., 1 doc. MUDr. Jaroslav Feyereisl, CSc. 1 Ústav pro péči o matku a dítě, Praha 2 Sanatorium Pronatal, Praha Souhrn Užití ultrazvuku v managementu infertility je dnes rutinní praxí, mající za cíl nejen monitorovat spontánní a stimulovaný cyklus, diagnostikovat ovulaci, hodnotit celkovou ovariální rezervu, ale i příčiny sterility dané některou z pánevních patologií. Pro některé diagnózy týkající se ženské sterility, jako jsou např. syndrom polycystických ovarií (PCO), endometriální polypy, kongenitální uterinní abnormality, závažné postižení vejcovodů (hydrosalpinx) nebo traumatická amenorea (Ashermannův syndrom), zůstává ultrazvukové vyšetření zásadní metodou. Bez ultrazvukem kontrolované aspirace folikulů si již dnes nejde představit mimotělní oplodnění, stejně tak embryotransfer prováděný pod UZ kontrolou zvyšuje šance pro úspěšnou implantaci embrya. Klíčová slova transvaginální ultrasonografie folikulometrie ovariální rezerva endometriální receptivita 3D UZ power doppler angiografie ultrazvuková hysterosalpingografie UZ guidance ET uterinní endometriální kontraktilita transvaginal ultrasound guided oocyte retrievals (TVORs) Summary Key words transvaginal ultrasonography follicle tracking Folikulometrie Ultrazvuková folikulometrie (v anglosaské literatuře tzv. follicle tracking), tedy měření počtu a průměru Graafových folikulů v ovariích (Obr. 1), prováděná vaginální UZ sondou, patří mezi zlatý standard při stanovení ovulace a růstu folikulu. Je to neinvazívní, rychlá metoda, jejíž výsledek je okamžitě k dispozici a přímé náklady jsou nepatrné. Poskytuje informaci o počtu folikulu nezávisle na jejich velikosti. Již v roce 1970 Hackeloer et al. popsal lineární vztah mezi velikostí folikulů a hladinou estradiolu (E 2 ). (1) Přítomnost zralého oocytu očekáváme, pakliže folikul přesáhne 16 mm v průměru a E 2 dosahuje hladiny pg/ml na každý (ko)dominantní folikul. Vaginální sondou zobrazíme folikuly v ovariích od velikosti 2 mm. Vzhledem k tomu, že folikul roste rychlostí 2 3 mm za den a puká při velikosti 22 ± 2 mm, můžeme poměrně dobře předpovídat jeho vývoj na několik dní dopředu. Folikul je elipsoid měřený ve 3 rovinách a jeho objem je odhadován podle následující formule: (π/6)x A x B x C, kde A, B, C jsou rozměry měřené ve třech různých rovinách. Nejjednodušší při zhodnocení folikulární maturity v ambulantní praxi je užití 2 největších rozměrů folikulu. Nezkušený lékař může folikuly zaměnit s jinou strukturou pánve, hlavně s velkými pánevními cévami. Tehdy mohou být odlišeny při rotaci sondy 90 stupňů v kolmé rovině. Pokud se jedná o cévu, její průřez se na obrazovce při snímání protáhne a objeví se tubulární obraz. Hypogastrická artérie může být snadno identifikována díky její arteriální pulsaci. Podobně hydrosalpinx může být někdy zaměňován s folikuly, je-li snímán v rovině příčného řezu. Střeva mají relativně větší echogenitu a snadno se rozliší díky přítomnosti peristaltických pohybů. Taktéž cervikalní kanál vyplněný hlenem můžeme považovat chybně za větší folikul. Jiné cystické struktury, např. parovariální cysta, mohou v některých případech napodobit ovarium s folikulem Postgraduální medicína, 2009, 11, č. 5

57 focus Obr. 1 UZ monitorování růstu folikulů při COH (kontrolované ovariální hyperstimulaci) Obr. 3 Příklad normálního krevního průtoku v okolí corpus luteum s masivním perifolikulárním prokrvením Obr. 4 Objem dominantního ovaria s funkčním žlutým tělískem při zobrazení pomocí program VOCAL Obr. 2 Příklad abnormálního krevního průtoku v okolí corpus luteum, kde můžeme vidět velmi nízké perifolikulární prokrvení. Tento nález může být podle některých autorů spojován s neúspěšností stimulovaného cyklu, habitualními potraty a defektem luteální fáze Ultrazvukové vyšetření folikulární vaskularity V 90. letech byla pozornost soustředěna na vlastní vyšetření prokrvení dominantního folikulu. Popisují se regionální změny prokrvení folikulu během ovulace a tyto změny jsou dávány do souvislosti s jeho zráním. Bourne udává nejvyšší index rezistence (RI) první den menstruačního cyklu a nejnižší naopak v den LH (luteinizační hormon) peaku. Hodnoty RI začínají klesat 2 dny před ovulací a nejnižších hodnot dosahují v době ovulace (0,44 ± 0,04).(2) Změny perifolikulární vaskularity využívající power doppler analýzu na úrovni jednoho folikulu popisují někteří autoři podle procenta kolaterálního prokrvení a rozdělují do 4 stupňů.(3) V nativním cyklu v pozdní folikulární fázi stoupá ovariální průtok krve ve vaječníku obsahujícím dominantní folikul. Postgraduální medicína, 2009, 11, č. 5 Po ovulaci se postupně zvyšuje průtok corpus luteum (Obr. 2, 3). Již od počátku 90. let je snahou objektivizovat význam cévního zásobení ovarií a následně folikulu na kvalitu intrafolikulárního prostředí a získaných vajíček. Někteří autoři zaznamenali, že z oocytů vysoce vaskularizovaných folikulů byla získána kvalitní embrya, která následně úspěšně implantovala a vedla k pokračujícímu těhotenství.(4, 5) Nicméně jiní autoři tento závěr nepotvrdili a role power dopplerovského měření perifolikulární vaskularity v selekci oocytů v IVF cyklech zůstává nadále otevřená pro další výzkum.(6) Je důležité poznamenat, že u převážné většiny folikulů (> 65 %) v IVF cyklech je popisována dobrá vaskularizace a rovněž dobře vaskularizované folikuly jsou obecně větší. Je tedy nejasné, zda samotné určení velikosti folikulu nebo více času zabírající měření prokrvení folikulu budou lepšími a dostačujícími prediktory úspěšnosti cyklu. Relativní novinkou je vyšetření tzv. 3D power doppler angiografie, která zavádí indexy vypočtené při využití barevného histogramu VI, FI, VFI, a umožňuje tak kvantifikovat ovariální vaskularitu v cílovém objemu. Využívá počítačové rekonstrukce pro výpočet celkového ovariálního objemu v zobrazení 3D UZ programu VOCAL (Virtual Organ Computer Aided analysis program) za užití manuálního n 424

58 focus modu. Obrysy rozdílných ovariálních řezů jsou pak zhotoveny při různých rotačních krocích (např. každých 15 stupňů v longitudiální rovině). Při výpočtu indexů v zobrazovacím programu VOCAL, který hodnotí krevní tok skrz celý orgán, představuje index vaskularity (VI) stupeň prokrvení, které je vyjádřené množstvím barevných voxelů v definovaném objemu, prezentující počet cév zásobujících orgán (udáváno v procentech). Index toku (FI) znamená průměrnou intenzitu krevního toku v definovaném objemu, vyjádřený v celých číslech od 0 do 100 a index VFI vyjadřuje součin předchozích veličin vyjádřený celými čísly od 0 do 100. Vyšší hodnoty VI, VFI, FI byly naměřeny např. u pacientů s PCO, kde naznačují excesivní odpověď na stimulaci gonadotropiny. Ultrazvukové zhodnocení ovariální rezervy Cílem testování tzv. ovariální rezervy je zhodnotit počet vajíček v ovariu a identifikovat ženy s tzv. sníženou ovariální rezervou (AFC 3 10) pro následnou stimulaci.(7) Toto vyšetření může pomoci identifikovat ženy s příznivou prognózou i sníženou pravděpodobností na početí. V současné době máme k dispozici kromě věku ženy další ukazatele a testy hodnotící ovariální rezervu a pravděpodobnou odpověď ovarií na případnou stimulaci. Mezi tyto testy patří stanovení sérové hladiny FSH (folikulostimulační hormon) 3. den menstruačního cyklu) v kombinaci s estradiolem, inhibinu B a v neposlední řadě i hladiny AMH (antimüllerian hormone). Všechny tyto testy odráží přímo či nepřímo produkci hormonů buňkami granulózy a měly by korelovat s počtem folikulů přítomných v ovariu. Poslední studie však ukazují, že měření počtu antrálních folikulů (AFC), tedy folikulů mezi 2 5 mm, pomocí transvaginálního ultrazvuku (transvaginal ultrasonography TVUS), koreluje lépe s počtem než kvalitou získaných vajíček. Zároveň je AFC považován ve srovnání s věkem, bazální hladinou FSH a ovariálním objemem za lepší prediktor reakce na kontrolovanou ovariální hyperstimulaci.(7, 8) Objem ovaria můžeme pomocí TVUS změřit velmi snadno a je obvykle vypočítán podle vzorce pro elipsoid (0,52krát délka, výška a šířka ovaria v cm). V současnosti je stále více využíváno 3D UZ zobrazení, umožňující vyšetření ve všech 3 rovinách a tedy nejpřesněji hodnotící objemové parametry (Obr. 4). Jeho užití ve folikulometrii, měření objemů ovarií a AFC je tak všeobecně považováno za přesnější v predikci zralých folikulů. Automatické měření objemu vyžadující sběr dat z 3D souboru a následná automatická analýza těchto údajů může značně ušetřit čas potřebný k měření jednotlivých objemů folikulů při zachování standardní validity a spo- Obr. 5 Polycystická ovaria (B mode, transvaginal route). Na pravém i levém ovariu, délka a šířka, stejně jako plocha ovaria jsou zvětšeny. Počet folikulů, s rozměry 2 5 mm je více než 12 s převážně periferním rozmístěním. 425 n Obr. 6 Ultrazvukový obraz floating uterus v příčném řezu jako známka ascitu při OHSS II. III. stupně lehlivosti měření 2D ultrazvukem. Poslední novinkou je sono AVC (Automatic Volume Calculation: GE Medical systems, ZipF, Austria), nový softwarový program identifikující a kvantifikující hypoechogenní oblasti v 3D souboru dat a provádějící automatické zhodnocení jejich absolutní velikosti, středního půměru a objemu.(8) Pro každý individuální objem je přiřazena specifická barva a provedeno automatizované měření středního průměru koule, jeho maximálních rozměrů (x, y, z průměru). Jeho objem je zobrazen těmito barvami v sestupném pořadí velikosti. Neomezený počet objemů může být teoreticky kvantifikován a může být ideálním nástrojem pro zhodnocení ovarií, respektive ovariálního objemu a počtu antrálních folikulů (AFC) u žen podstupujících kontrolovanou ovariální stimulaci. Ultrazvuk v diagnostice syndromu polycystických ovarií Podle současných guidelines (Rotterdam ESHRE/ASRM consensus 2003) ultrazvukový nález patří mezi jedno ze 3 kritérií potřebných pro stanovení diagnózy syndromu polycystických ovarií PCOS (dvě ze tří musí být přítomna). K ultrazvukovému obrazu spojovanému s diagnózou PCO řadíme počet 12 a více folikulů rozměrů mezi 2 až 9 mm v jedné rovině na jednom ovariu, neboli tzv. obraz necklace sign, přítomnost zvětšeného ovariálního objemu nad 10 cm3 a ztluštělou tunica albuginea (Obr. 5). Nález na jednom ovariu je dostačující k potvrzení diagnózy spolu s dalšími kritérii, mezi která řadíme oligo/anovulaci či klinické/biochemické známky hyperandrogenismu. Bývá obtížné odlišit diagnózu PCOS od mladých žen s nálezem většího počtu folikulů vzhledem k jejich věku. Dalšími ultrazvukovými nálezy spojovanými s diagnózou PCOS mohou být zvětšená oblast ovariálního stromatu či echogenita stromatu zvýšená nebo rovná echogenitě v oblasti myometria.(9) Často bývá při dg. PCO naměřen vyšší krevní průtok ovariem a snížená cévní rezistence. Jednou z komplikací kontrolované ovariální hyperstimulace (COH), kterou můžeme dobře diagnostikovat pomocí TVUS právě u pacientek s dg. PCO, je ovariální hyperstimulační syndrom (OHSS). Vidíme zvětšená ovaria nad 10 cm s velkým množstvím cystických corpora lutea, ascites (typický obraz tzv. floating uterus ), v těžkých případech i pleurální výpotek (Obr. 6). Postgraduální medicína, 2009, 11, č. 5

59 focus Ovariální endometriomy Při vyšetření ovarií subfertilních žen můžeme objevit celou řadu ovariálních novotvarů zahrnujících jak dermoidy, tak i benigní, bordeline či maligní epiteliální tumory. Nicméně nejčastěji se u žen s diagnózou sterility setkáváme s nálezem endometriomu. Mezi ultrazvukové znaky typické pro endometriomy patří přetrvávající často jednokomorová masa s disperzním nehomogenním vnitřním echem popisovaným jako tzv. obraz matného skla grand glass, odpovídající hemoragickému obsahu cysty. (9) Stěna cysty bývá neostře ohraničená, spíše silnější, nehomogenní, s hyperechogenními fokusy a typickým periferním průtokem krve měřeným pomocí barevného power doppleru. Vnitřní struktura pak s unilokulárnímí i multilokulárními nepravidelnými septy suspektního vzhledu různé šířky. Ovarium může adherovat k druhému ovariu a tento příznak bývá popisován jako tzv. kissing ovaries. Hemoragická korpusluteální cysta může z části tyto nálezy napodobovat, na rozdíl od perzistujících endometriomů však při vyšetření po menses mizí. Přítomnost endometriomů bývá spojována se sníženou fertilitou. Ženy s diagnózou endometriomu a sterility, které podstoupily následnou chirurgickou léčbu, obecně dosahují i uspokojivých reprodukčních výsledků. Metaanalytické studie potvrdily, že při IVF je v přítomnosti endometriomu průměrně získáno o 1,7 méně oocytů a tato redukce je připisována té straně ovaria, kde je přítomen endometriom. Nicméně počet těhotenství z IVF cyklů neodráží signifikantně rozdíly ve skupině pacientek s přítomností endometriomu či nikoliv. (10) Ultrazvukové hodnocení dělohy a vejcovodů při diagnóze primární či sekundární sterility Ultrazvukové zobrazení myometria Mnohé studie poukazují na vyšší prevalenci děložních patologií u žen, které nemohou otěhotnět. Ženy s abnormálním děložním průtokem mívají vyšší výskyt polypů a děložních myomů a potvrzení těchto nálezů vyžaduje další studie. V určení lokalizace myomů můžeme využít 2D nebo 3D TVUS. Myomy mohou být TVUS detekovány s vysokou senzitivitou, ačkoliv pouhá 2 3 % příčin infertility bývá spojována s jejich výskytem. (11) Leiomyomy mohou být při TVUS zaměňovány za adenomyózu. Adenomyóza je definována ektopickou lokalizací endometriálních žláz a stromatu hluboce uložených v hladkém svalu děložním. Často bývá přítomna hypertrofie hladkého svalu v okolí ektopického endometria. Obecnými ultrazvukovými známkami adenomyózy je zvětšená děloha, nejasná endomyometriální junkce a přítomnost myometriálních cyst. Ve srovnání s leiomyomy je adenomyóza charakterizována větší variabilitou echogenicity a špatně definovanou hranicí oproti zdravému myometriu. V kontrastu s periferním cévním zásobením u fibroidů mívá adenomyóza penetrující cévy skrze strukturu, které mohou být detekovány barevným dopplerem. Vztah leiomyomů a reprodukčních výsledků, stejně jako význam různých léčebných postupů zůstává přes četné nové poznatky kontroverzní. Zatímco spojitost submukózních myomů s opakovaným potrácením a sterilitou byla prokázána, příčinný vztah jinak lokalizovaných myomů a potrácení, resp. sterility, bývá zpochybňován. Pokud přítomnost myomů ovlivňuje fertilitu, jedná se zejména o narušení implantace embrya, a to zejména při jejich intrakavitární či submukózní lokalizaci, kdy mohou deformovat dutinu děložní s přilehlým endometriem. Za významnou ve vztahu k neplodnosti je rovněž považována velikost myomu nad 5 cm anebo lokalizace v blízkosti cervixu či tubárního ústí, tedy možná interference s transportem gamet, nidací a implantací. Dalšími potenciálními mechanismy negativně ovlivňujícími fertilitu žen s většími myomy jsou fokální endometriální vaskulární poruchy, sekrece vazoaktivních látek či zvýšené androgenní, hostilní prostředí v endometriu. (12) Z dostupných literárních dat lze doporučit u neplodných žen s diagnostikovaným leiomyomem nad 4 cm jeho odstranění. U žen s multifaktoriální příčinou neplodnosti je myomektomie vhodná u myomů nad 7 cm a myomů symptomatických (menometroragie). Pokud je zvažována myomektomie u asymptomatické nulipary, je vhodné operaci doporučit v době, kdy graviditu již plánují, nikoli s dlouhým předstihem. (13) Ultrazvukové zobrazení endometria Ultrazvukové zhodnocení endometria v diagnóze sterility zasluhuje pozornost zejména z hlediska určení faktorů ovlivňujících implantaci, tedy zhodnocení děložní receptivity. Nesmírnou výhodou je jeho neinvazívnost, nenáročnost a relativně dobrá dostupnost oproti jiným bioptickým metodám hodnotícím jak histologickou, tak molekulární úroveň, které nemohou být prováděny během cyklu, ve kterém chce žena otěhotnět. O endometriální receptivitě mluvíme jako o časovém úseku, kdy endometriální epitel nabývá funkčních, přechodných změn závislých na produkci steroidů umožňujících implantaci blastocyty. K tomu dochází v době mezi dnem cyklu (5. 9. den po ovulaci), kdy mluvíme o tzv. implantation window. (14) Během proliferační fáze cyklu se endometrium vyvíjí jako hypoechogenní, vícevrstevného vzhledu (triple-line), o výšce mezi 4 až 10 mm a po ovulaci nabývá pod vlivem progesteronu izo- až hyperechogenního vzhledu o výšce 7 až 14 mm (Obr. 7, 8). Sledujeme-li výšku endometria, v cyklech stimulovaných gonadotropiny může endometrium oproti nativnímu cyklu dosahovat mírně větší výšky, která koreluje s hladinou sérového estradiolu. Falešně mohou zvyšovat tloušťku endometria nálezy submukózních myomů či polypů, naopak nižší endometrium můžeme naměřit při diagnóze intrauterinních adhezí (Ashermanova syndromu) po expozici dietylstilbestrolu (DES), ale i po stimulaci antiestrogeny. Selhání implantace embrya zůstává v léčbě sterility stálým problémem. (15) V mnoha studiích hodnotících endometriální receptivitu byla pozornost zaměřena zejména na tloušťku, strukturu a charakter endometria, endometriální echogenicitu, objem a endometriální a subendometriální prokrvení (Obr. 9). (16, 17) Současný pokrok v 3D TVUS umožňuje s mnohem větší přesností detailně vyšetřit a vizualizovat pánevní orgánové strukury pro analýzu jejich objemu. 3D power doppler ultrasonografie může zhodnotit jak arteriální, tak venózní cirkulaci a tyto objektivizovat pomocí počítačové analýzy. Tyto výhody umožňují 3D power doppler angiografii simultánně hodnotit jak endometriální objem, tak prokrvení. (18) Nebyly prokázány rozdíly ve skupině těhotných a netěhotných žen první den po nástupu peaku LH v cyklech s přenosem rozmražených embryí (FET) při měření výšky endometria, endometriálního objemu, charakteru endometria, uterinních indexů pulsatility (PI) a indexů rezistence (RI), endometriálních a subendometriálních power doplerr indexů h VI, FI a VFI. (19) Endometriální polypy Nález endometriálního polypu není při hodnocení endometria nikterak ojedinělým nálezem. Jejich prevalence v populaci sterilních pacientek se pohybuje mezi %, mírně převažuje u pacientek nad 35 let oproti mladší populaci. Na diagnózu endometriálního polypu myslíme při vyšetření TVUS při nálezu určitých nepravidelností v endometriálním echu, zvláště pokud na konci cyklu přetrvává místně silnější obraz endometria od- Postgraduální medicína, 2009, 11, č

60 focus Obr. 7 Triple-line endometrium hodnocené v longitudinálním řezu při endovaginálním vyšetření s typickými třemi hyperechogenními liniemi na konci proliferativní fáze Obr. 8 Příklad homoechogenního typu endometria víjející se podle úhlu řezu. Někdy mohou např. krevní sraženiny v děložní dutině při ultrasonografickém vyšetření být zdrojem falešně pozitivního nálezu. Ačkoliv větší senzitivitu pro detekci endometriálních polypů má hysteroskopie, v primárním screeningu si sonografické vyšetření udržuje svou roli. Některé studie naznačují pozitivní výsledky v léčbě sterility po hysteroskopickém odstranění polypů, zejména ve vztahu k implantaci blastocysty. Naopak jiní autoři terapeutický efekt na otěhotnění při odstranění menších polypů, pod 2 cm, nepotvrzují. (20) Zhodnocení vejcovodů Při TVUS vyšetření hodnotíme rovněž tubární struktury, zejména pak viditelné patologie jako jsou hydrosalpinx či saktosalpinx. Proximální část vejcovodu často zobrazujeme jako pokračování endometria. Ampulární a fimbriální část většinou splývá s řídkým vazivem, varixy a střevními kličky. Mezi charakteristické známky akutního hydrosalpingu patří podle zahraniční literatury tzv. cogwheel sign a obraz korálkovitých struktur, odrážející probíhající zánět. Chronický hydrosalpinx nalezneme často v protáhlé formě a typickými znaky jsou např. inkompletní septa, která je třeba odlišit od varixů a ovarií s více folikuly, dále ovariálních cyst a ilických cév. Přítomnost hydrosalpingu významně snižuje i úspěšnost IVF. Počet těhotenství po IVF v přítomnosti hydrosalpingu bývá ve srovnání s pacientkami s normálním nálezem na vejcovodech snížena až o polovinu. (21) Mechanismus, jakým Obr. 9 Zobrazení subendometriálního objemu pomocí programu VOCAL dochází k redukci počtu těhotenství při přítomnosti hydrosalpingu, je dán pravděpodobně přítomností toxického efektu tekutiny na endometrium a embrya. Proto je doporučováno před IVF cyklem provést salpingektomii či alespoň ligaci tub. Otázkou zůstává, zda-li aspirovat tekutinu v hydrosalpingu při odběru vajíček v rámci IVF cyklu. Někteří autoři tento výkon spojovali s vyšší četností těhotenství, jiní naopak tento pozitivní účinek nepotvrdili. Navzdory aspiraci může tekutina někdy rychle reakumulovat a proto je z hlediska reprodukce preferována spíše chirurgická léčba s odnětím vejcovodu. TVUS rovněž využíváme při hodnocení průchodnosti vejcovodů při užití specializovaného kontrastního média při tzv. ultrazvukové hysterosalpingografii (UZ HSG), hojně prováděné např. v severských evropských zemích Finsku a Švédsku. Díky své neinvazívnosti může eliminovat četná množství diagnostických laparoskopií, nicméně vyžaduje jistou zkušenost a čas k provádění tohoto vyšetření. Výsledky jsou srovnatelné s rtg, navíc odstraňuje zátěž radiací a riziko alergické reakce. Je možné ji využít i při orientačním zjištění patologie v dutině děložní (myom, polyp), nemůže ale zjistit patologii v oblasti adnex (adheze) a rovněž nemůže být hodnocena pohyblivost abdominálního konce vejcovodu. Tato metoda využívá poznatku, že vejcovody je možné zobrazit, pokud je uvnitř tekutina (hydrosalpinx). Nejprve se používal fyziologický roztok, který mohl poskytnout jen negativní kontrast. Později byly vyvinuty nové ultrazvukově kontrastní látky, např. Echovist. Jedná se o mikrobublinkovou suspenzi v galaktóze, bublinky nepřesahují v průměru 0,5 mikronu (nezpůsobí embolii) a mají poločas 10 až 11 minut. Echovist vykazuje reprodukovatelný echogenický kontrastní efekt, značně zesiluje dopplerovský signál a je pacientkami velmi dobře tolerován. Před ultrazvukovou HSG je nutno vyloučit těhotenství, infekci v genitální oblasti, galaktosémii. Vyšetření se provádí v první polovině menstruačního cyklu. Do dutiny děložní se za sterilních kautel zavede katétr, poté do pochvy ultrazvuková vaginální sonda. Nejprve se vstřikuje 10 až 20 ml fyziologického roztoku do dutiny děložní, která je sledována v transverzní a longitudinální rovině. To umožňuje objevení děložních patologii, jako jsou polypy, submukózní myomy a některé vrozené anomálie, např. septa. Následně se podá kontrastní látka, která umožní využít pozitivní a negativní kontrast. Tuby se plní intermitentním vstřikováním 1 až 2 ml média. Vejcovod se pak sleduje v longitudinální a transverzální rovině. Je- li pozorován anterográdní tok v proximální části tuby po dobu nejméně 10 sekund, považujeme tubu za průchodnou. Poté zobrazíme celou tubu k event. odkrytí přítomného Postgraduální medicína, 2009, 11, č. 5