OBSAH. PP Master Mixy PPP Master Mix 12 Plain PP Master Mix 13 Combi PPP Master Mix 14

Transkript

1 OBSAH DNA polymerázy pro PCR a pufry Taq DNA polymeráza 4 Taq DNA polymeráza Unis 5 TaqPurple DNA polymeráza 6 Taq DNA polymeráza Combi Taq DNA polymeráza 8 LA DNA Polymerases Mix 9 10x koncentrovaný PCR Blue Buffer 10 PP Master Mixy PPP Master Mix 12 Plain PP Master Mix 13 Combi PPP Master Mix 14 qpcr Master Mixy new qpcr 2x Master Mix 16 new qpcr 2x Blue Master Mix 17 new qpcr 2x SYBR Master Mix 18 Další enzymy RNáza bez DNáz 19 MMLV reverzní transkriptáza 20 Izolace DNA a RNA DNA Lego kit 22 RNA Blue RTPCR kit 23 RNA Blue 24 RNA nosič TB 25 DNA markery DNA marker new DNA marker coloured 27 new DNA marker ( po 50 pb) 28 new DNA marker ( po 50 pb) coloured 28 DNA marker DNA marker coloured 29 Další materiály pro PCR PCR dntp mix 30 PCR EtOH 30 PCR Enhancer TB 31 PCR H 2O 32 PCR Ultra H 2 O 32 PCR olej 33 Micro Check (kalibrační špička) 33 Materiály pro elektroforézu PCR agaróza TB 35 PCR ethidium bromid TB 36 PCR vkládací pufr TB 36 PCR vkládací pufr Edge 36 PCR vkládací pufr Red load a Yellow load 37 Technické specifikace 38 Technické informace, objednávky a obchodní podmínky 40 1

2 Vážení zákazníci, firma TopBio, s.r.o. založena 1. listopadu 1995 se specializuje na výrobu vybraných látek, důležitých pro široké využití molekulárně genetických metod v řadě oblastí základního i aplikovaného výzkumu a výrobní praxe. Konkrétně se jedná o enzymy a další látky nezbytné pro amplifikaci DNA pomocí tzv. polymerázové řetězové reakce (PCR). TopBio, s.r.o. vznikla jako spinoff firma Ústavu molekulární genetiky AVČR. V počátečním období byla fi rma součástí tzv. Inkubátoru Technologického centra AVČR, který byl lokalizován v areálu biologických ústavů AVČR v Praze 4 Krči. V roce 2002 se část firmy přestěhovala do nových prostor ve Vestci u Prahy a rozšířila výrobnu. Mezi charakteristické rysy firmy patří (firemní desatero): 1. výroba reagens nejvyšší dosažitelné kvality, 2. náročná výstupní kontrola, 3. zajištění optimálních podmínek pro skladování a přepravu výrobků a vyznačení expirační doby u všech výrobků, 4. rychlé a kompetentní vyřizování technických dotazů v pracovní dny obvykle do 4 hod. po obdržení dotazu, 5. rychlé vyřizování objednávek v celé ČR v pracovní dny obvykle do 24 hod. po obdržení objednávky, 6. vzhledem ke kvalitě výrobků bezkonkurenční ceny, 7. výrazné slevy při odběrech většího množství výrobků, 8. široké uspokojování požadavků na platby (volba termínu platby), 9. rychlé a vstřícné vyřizování reklamací, 10. důraz na inovace odrážející aktuální vědecké poznatky. 2

3 DNA polymerázy pro PCR a pufry Taq DNA polymeráza Taq DNA polymeráza Unis TaqPurple DNA polymeráza Taq DNA polymeráza 1.1 Combi Taq DNA polymeráza LA DNA Polymerases Mix 10x koncentrovaný PCR Blue Buffer PCR je jednou z nejvýznamnějších molekulárněgenetických technik. Tato technika slouží k rychlé produkci velkého počtu kopií fragmentů DNA. Pořadí nukleotidů v DNA fragmentech vytvořených v PCR odpovídá pořadí nukleotidů v templátové DNA (například genomová DNA nebo cdna). Velikost amplifikovaných úseků je vymezena oligonukleotidovými primery (očka), které nasedají na templátovou DNA. Reakční směs pro PCR obsahuje: 1. teplotněrezistentní DNA polymerázu 2. pufr 3. dntp (stavebni kameny DNA) 4. templátovou DNA 5. dvojici oligonukleotidových primerů V průběhu PCR dochází k denaturaci templátové DNA, nasednutí primerů a extenzi DNA od primeru ve směru 5 > 3. Tyto kroky PCR, které mají odlišná teplotní optima se mnohokrát opakují (obvykle 20 40x). Provedení PCR v přístrojích (cyklerech) umožňujících automatické změny teploty zásadním způsobem zjednodušuje proces amplifikace DNA fragmentů. Z hlediska provádění PCR mají rozhodující význam DNA polymerázy, které jsou rezistentní k teplotám, při kterých dochází k denaturaci DNA (94 o C). Firma TopBio dodává 6 preparátů polymeráz, které mají různou využitelnost (viz. Tabulka). Tyto polymerázy se kombinují s dalšími komponentami PCR reakčních směsí. Tabulka Využitelnost teplotně rezistentních polymeráz TopBio provenience pro různé typy PCR. Polymerázy Taq DNA pol. Taq DNA pol. Unis TaqPurple DNA pol. Taq DNA Pol. 1.1 Combi Taq DNA pol. LA DNA pol. Mix Rutinní diagnost. PCR PCR dlouhých fr. + Přesná PCR na klonace DNA fr. + Hot start PCR + PCR s vysokým výtěžkem DNA fr. + + Speciální aplikace + + a pufry Preparát, který je označen Combi, obsahuje teplotněsensitivní protilátku specifickou pro DNA polymerázy. Tato protilátka blokuje enzymovou aktivitu, která je následně zrušena v prvním denaturačním kroku PCR. Teplotní citlivost protilátky umožňuje její efektivní využití v tzv. hot start PCR, kdy amplifikace DNA fragmentů nastává až po dosažení denaturační teploty. Technické specifikace polymeráz jsou uvedeny v části technické specifikace (str. 38). 3DNA polymerázy

4 4DNA polymerázy a pufry Taq DNA polymeráza KLÍČOVÉ REAGENS PRO AMPLIFIKACI FRAGMENTŮ DNA V PCR Taq DNA polymeráza je termostabilní enzym izolovaný z Thermus aquaticus. Tento nemodifikovaný enzym replikuje DNA při 74 o C a má poloviční účinnost 40 min. při 95 o C (Chien, A. et al., J. Bacteriol., 127: , 1976; Kaledin A.S. et al., Biokhimiia, 45: , 1980). Tento enzym katalyzuje polymerizaci nukleotidů na základě templátu a oligonukleotidového očka ve směru 5 >3 v přítomnosti hořčíku a má rovněž 5 >3 exonukleázovou aktivitu. Definice jednotky: jedna jednotka Taq DNA polymerázy je definována jako množství enzymu, které katalyzuje inkorporaci 10 nmol dttp do materiálu precipitovatelného trichloroctovou kyselinou (TCA za 30 min. při 72 o C). Reakční podmínky jsou: 10 mm TrisHCl (ph 8,8 při 25 o C), 50 mm KCl, 0,1% Triton X100, 1,5 mm MgCl 2, 200 μm datp, dctp, dgtp a [α 32 P]dTTP, 50 μg/ml denaturované cdna, 0,5 μm odpovídajícího primeru a 0,2 0,5 U enzymu v objemu 50 μl. Balení: 1 zkumavka s Taq DNA polymerázou v objemu 20 μl (100 U) nebo 100 μl (500 U), 1 zkumavka s 10x koncentrovaným reakčním pufrem (1,5 ml). Při požadavku na změnu v koncentraci MgCl 2 je možno namísto 10x konc. reakčního pufru dodat set obsahující 1 zkumavku s 10x konc. reakčním pufrem bez MgCl 2 (1,5 ml) a 1 zkumavku s 25 mm MgCl 2 (0,5 ml). Skladovací pufr: 20 mm HEPES, ph 7,9, 100 mm KCl, 0,1 mm EDTA, 1 mm DTT, 0,5 mm PMSF, stabilizátor, 50% glycerol. Doporučený protokol pro přípravu vzorků pro PCR Smíchat: 41,5 μl PCR H 2 O 5 μl 10x koncentrovaného reakčního pufru (dodávaného s enzymem) 1 μl 10 mm dntp mix (10 mm datp, 10 mm dctp, 10 mm dgtp a 10 mm dttp) 0,5 μl 50 μm 5 primeru 0,5 μl 50 μm 3 primeru 0,5 μl Taq DNA polymerázy (2,5 U) 1 μl testované DNA Při testování více vzorků DNA je vhodné připravit tzv. Master Mix, ve kterém jsou objemy jednotlivých komponent násobkem počtu vzorků DNA. Master Mix je rozdělen po 49 μl do zkumavek a do každé z nich je přidán 1 μl studované DNA. Koncentrace: 5 U/μl. Skladování: při teplotě 20 o C společně s 10x konc. reakčním pufrem. Materiál snáší opakované rozmrazování. Čistota: preparát je prostý nukleáz. Enzym migruje při SDS PAGE jako jediný proužek o molekulové hmotnosti 94 kd. 10x reakční pufr s MgCl2: 100 mm TrisHCl, ph 8,8 (při 25 o C), 500 mm KCl, 1% Triton X100, 15 mm MgCl 2. Kontrola kvality: při použití doporučeného protokolu pro přípravu vzorků (viz níže) a vhodné kombinace DNA a primerů je výsledkem PCR DNA, která po elektroforetické analýze dává jediný proužek barvitelný ethidium bromidem a má odpovídající velikost. Kontrola kvality zahrnuje atest dokumentující závislost množství výsledného produktu na množství přidané Taq DNA polymerázy. Typický výsledek atestu je uveden na obr. 1. Obr. 1. Elektroforetická separace fragmentů DNA generovaných v PCR (Fr.) s použitím různých koncentrací Taq DNA polymerázy. Vzniklá DNA byla analyzována v 1% agarozovém gelu a barvena ethidium bromidem (0,5 μg/ml). PCR byla provedena v objemu 50 μl/zkumavku a obsahovala následující množství Taq DNA polymerázy: 2,5 U (B), 1U (C), 0,5U (D). Poloha fragmentů DNA markeru je rovněž uvedena (A). Amplifikovaný materiál: plasmidová DNA (1ng) A B C D T 031 Taq DNA polymeráza 100 U 700, Kč T 032 Taq DNA polymeráza 500 U 2.900, Kč T 033 Taq DNA polymeráza 5 x 500 U , Kč T 034 Taq DNA polymeráza 10 x 500 U , Kč T x konc. Taq pufr bez MgCl 2+MgCl 2 1,5 ml + 0,5 ml 60, Kč Fr

5 Taq DNA polymeráza Unis KLÍČOVÉ REAGENS PRO AMPLIFIKACI ZVÝŠENÉHO MNOŽSTVÍ FRAGMENTŮ DNA V PCR Jedná se o DNA polymerázu izolovanou z Thermus Aquaticus v univerzálním skladovacím pufru. Definice jednotky: jedna jednotka Taq DNA polymerázy Unis je definována jako množství enzymu, které katalyzuje inkorporaci 10 nmol dttp do materiálu precipitovatelného TCA za 30 min. při 72 o C. Reakční podmínky jsou: 10 mm TrisHCl (ph 8,8 při 25 o C), 50 mm KCl, 0,1% Triton X100, 1,5 mm MgCl 2, 200 μm datp, dctp, dgtp a [α 32 P]dTTP, 50 μg/ml denaturované cdna, 0,5 μm odpovídajícího primeru a 0,2 0,5 U enzymu v objemu 50 μl. Balení: 1 zkumavka s Taq DNA polymerázou Unis v objemu 20 μl (100 U) nebo 100 μl (500 U), 1 zkumavka s 10x koncentrovaným reakčním pufrem (1,5 ml). Při požadavku na změnu v koncentraci MgCl 2 je možno namísto 10x konc. reakčního pufru dodat set obsahující 1 zkumavku s 10x konc. reakčním pufrem bez MgCl 2 (1,5 ml) a 1 zkumavku s 25 mm MgCl 2 (0,5 ml). Skladovací pufr: 20 mm TrisHCl, ph 8,0 (25 o C), 100 mm KCl, 0,1 mm EDTA, 1 mm DTT, 0,5% Nonidet P40, 0,5% Tween 20, 50% glycerol. Koncentrace:5 U/μl. Skladování: při teplotě 20 o C společně s 10x konc. reakčním pufrem. Materiál snáší opakované rozmrazování. Čistota: preparát je prostý nukleáz. Enzym migruje při SDS PAGE jako jediný proužek o molekulové hmotnosti 94 kd. 10x reakční pufr s MgCl2: 100 mm TrisHCl, ph 8,8 (25 o C), 500 mm KCl, 1% Triton X100, 15 mm MgCl 2. Kontrola kvality: při použití doporučeného protokolu pro přípravu vzorků a vhodné kombinace DNA a primerů je výsledkem PCR DNA fragment, který po elektroforetické separaci a barvení pomocí ethidium bromidu dává proužek odpovídající velikosti. Doporučený protokol: viz. Taq DNA polymeráza (str. 4). Odlišný skladovací pufr umožňuje využít tuto polymerázu v kombinaci s pufry, které se využívají pro speciální aplikace, včetně amplifikace dlouhých fragmentů DNA. Taq DNA polymeráza Unis vykazuje v některých kombinacích primerů a DNA templátů podstatně vyšší účinnost než původní Taq DNA polymeráza. To umožňuje redukovat její množství na polovinu: 1,25 U/50 μl reakční směsi. a pufry T 036 Taq DNA polymeráza Unis 100 U 700, Kč T 037 Taq DNA polymeráza Unis 500 U 3.000, Kč T 038 Taq DNA polymeráza Unis 5 x 500 U , Kč T 039 Taq DNA polymeráza Unis 10 x 500 U , Kč 5DNA polymerázy

6 TaqPurple DNA polymeráza DNA POLYMERÁZA Z THERMUS AQUATICUS S PŘÍDAVKEM INERTNÍHO BARVIVA Ve srovnání s běžně používanými polymerázami má TaqPurple DNA polymeráza několik výhod: barvivo stabilizuje enzym a prodlužuje jeho životnost, koncentrace enzymu (1 U/μl) usnadňuje přesnější dávkování enzymu, barvivo a glycerol zvyšují hustotu PCR reakční směsi, kterou lze přímo nanášet na gel (bez požadavku na přidání vkládacího pufru), barvivo usnadňuje manipulaci s enzymem a umožňuje vizuání kontrolu jeho promíchání, barvivo neovlivňuje reakční podmínky PCR (včetně koncentrace Mg 2+ ), barvivo má vyšší pohyblivost než nukleotidy a tedy neinterferuje s kvantifikací DNA fragmentů. Definice jednotky: jedna jednotka TaqPurple DNA polymerázy je definována jako množství enzymu, které katalyzuje inkorporaci 10 nmol dttp do materiálu precipitovatelného TCA za 30 min. při 72 o C. Reakční podmínky jsou: 10 mm TrisHCl (ph 8,8 při 25 o C), 50 mm KCl, 0,1% Triton X100, 1,5 mm MgCl 2, 200 μm datp, dctp, dgtp a [α 32 P]dTTP, 50 μg/ml denaturované cdna, 0,5 μm odpovídajícího primeru a 0,2 0,5 U enzymu v objemu 50 μl. Balení: 1 zkumavka s TaqPurple DNA polymerázou v objemu 100 μl (100 U) nebo 500 μl (500 U) 1 zkumavka s 10x koncentrovaným reakčním pufrem (1,5 ml). Při požadavku na změnu v koncentraci MgCl 2 je možno namísto 10x konc. reakčního pufru dodat set obsahující 1 zkumavku s 10x konc. reakčním pufrem bez MgCl 2 (1,5 ml) a 1 zkumavku s 25 mm MgCl 2 (0,5 ml). Skladovací pufr: 20 mm TrisHCl, ph 8,0 (25 o C), 100 mm KCl, 0,1 mm EDTA, 1 mm DTT, 0,5% Nonidet P40, 0,5% Tween 20, inertní barvivo, 50% glycerol. Koncentrace: 1 U/μl. Skladování: při teplotě 20 o C společně s 10x konc. reakčním pufrem. Materiál snáší opakované rozmrazování. Čistota: preparát je prostý nukleáz. Enzym migruje při SDS PAGE jako jediný proužek o molekulové hmotnosti 94 kd. 10x reakční pufr s MgCl 2 : 100 mm TrisHCl, ph 8,8 (při 25 o C), 500 mm KCl, 1% Triton X100, 15 mm MgCl 2. Kontrola kvality: při použití doporučeného protokolu pro přípravu vzorků a vhodné kombinace DNA a primerů je výsledkem PCR DNA fragment, který po elektroforetické separaci a barvení pomocí ethidium bromidu dává proužek odpovídající velikosti. 6DNA polymerázy a pufry Doporučený protokol pro přípravu vzorků pro PCR Smíchat: 39,5 μl PCR H 2 O 5 μl 10x koncentrovaného reakčního pufru (dodávaného s enzymem) 1 μl 10 mm dntp mix (10 mm datp, 10 mm dctp, 10 mm dgtp a 10 mm dttp) 0,5 μl 50 μm 5 primeru 0,5 μl 50 μm 3 primeru 2,5 μl TaqPurple DNA polymerázy (2,5 U) 1 μl testované DNA Při testování více vzorků DNA je vhodné připravit tzv. Master Mix, ve kterém jsou objemy jednotlivých komponent násobkem počtu vzorků DNA. Master Mix je rozdělen po 49 μl do zkumavek a do každé z nich je přidán 1 μl studované DNA. T 106 TaqPurple DNA polymeráza 100 U 700, Kč T 107 TaqPurple DNA polymeráza 500 U 3.000, Kč T 108 TaqPurple DNA polymeráza 5 x 500 U , Kč

7 Taq DNA polymeráza 1.1 KLÍČOVÉ REAGENS PRO AMPLIFIKACI FRAGMENTŮ DNA V PCR Jedná se o DNA polymerázu izolovanou z Thermus aquaticus o koncentraci 1 U/μl. Snížená koncentrace enzymu usnadňuje přesnější dávkování. Enzym se dodává s 10x koncentrovaným reakčním Blue Bufferem (1,5 ml). Definice jednotky: jedna jednotka Taq DNA polymerázy 1.1 je definována jako množství enzymu, které katalyzuje inkorporaci 10 nmol dttp do materiálu precipitovatelného TCA za 30 min. při 72 o C. Reakční podmínky jsou: 10 mm TrisHCl (ph 8,8 při 25 o C), 50 mm KCl, 0,1% Triton X100, 1,5 mm MgCl 2, 200 μm datp, dctp, dgtp a [α 32 P]dTTP, 50 μg/ml denaturované cdna, 0,5 μm odpovídajícího primeru a 0,2 0,5 U enzymu v objemu 50 μl. Balení: 1 zkumavka s Taq DNA polymerázou 1.1 v objemu 100 μl (100 U) nebo 500 μl (500 U) 1 zkumavka s 10x koncentrovaným reakčním Blue Bufferem (1,5 ml). Při požadavku na změnu v koncentraci MgCl 2 je možno namísto 10x konc. reakčního Blue Buffru dodat set obsahující 1 zkumavku s 10x konc. reakčním Blue Bufferem bez MgCl 2 (1,5 ml) a 1 zkumavku s 25 mm MgCl 2 (0,5 ml). Skladovací pufr: 20 mm TrisHCl, ph 8,0 (25 o C), 100 mm KCl, 0,1 mm EDTA, 1 mm DTT, 0,5% Nonidet P40, 0,5% Tween 20, 50% glycerol. Koncentrace: 1 U/μl. Skladování: při teplotě 20 o C společně s 10x konc. reakčním pufrem. Materiál snáší opakované rozmrazování. Čistota: preparát je prostý nukleáz. Enzym migruje při SDS PAGE jako jediný proužek o molekulové hmotnosti 94 kd. 10x reakční PCR Blue Buffer s MgCl 2 : 750 mm TrisHCl, ph 8,8 (25 o C), 200 mm (NH 4 ) 2 SO 4, 0,1% Tween 20, 25 mm MgCl 2. Kontrola kvality: při použití doporučeného protokolu pro přípravu vzorků a vhodné kombinace DNA a primerů je výsledkem PCR DNA fragment, který po elektroforetické separaci a barvení pomocí ethidium bromidu dává proužek odpovídající velikosti. Doporučený protokol: odlišný skladovací pufr umožňuje využít tuto polymerázu v kombinaci s pufry, které se využívají pro speciální aplikace, včetně amplifikace dlouhých fragmentů DNA. Taq DNA polymeráza 1.1 vykazuje v některých kombinacích primerů a DNA templátů podstatně vyšší účinnost než původní Taq DNA polymeráza. To umožňuje redukovat její množství na polovinu (1,25 U/50 μl reakční směsi). a pufry T 111 TaqPurple DNA polymeráza U 700, Kč T 112 TaqPurple DNA polymeráza U 3.000, Kč T 113 TaqPurple DNA polymeráza x 500 U , Kč T 114 TaqPurple DNA polymeráza x 500 U , Kč T x PCR Blue Buffer bez MgCl 2 +MgCl 2 1,5 ml + 0,5 ml 60, Kč 7DNA polymerázy

8 Combi Taq DNA polymeráza TAQ DNA POLYMERÁZA S MONOKLONÁLNÍ PROTILÁTKOU ANTITAQ Protilátka blokuje enzymovou aktivitu Taq DNA polymerázy a tím znemožňuje zahájení polymerázové reakce před vlastní PCR. Při denaturaci DNA v prvním cyklu PCR dochází k irreverzibilní teplotní inaktivaci protilátky a tím k odblokování enzymatické aktivity Taq DNA polymerázy. Tato tzv. hot start PCR je zvláště vhodná všude tam, kde dochází k nežádoucí amplifikaci nespecifických fragmentů DNA, k nízké amplifikaci DNA fragmentů, popřípadě k tvorbě artefaktů vznikajících amplifikací kombinovaných primerů. Oblast využití Combi Taq DNA polymerázy zahrnuje amplifikace komplexních genomických nebo cdna templátů, nízkých počtů templátů ve velkém počtu termálních cyklů (>35) anebo použití mnohočetných párů primerů v téže reakční směsi. Definice jednotky: jedna jednotka Combi Taq DNA polymerázy je definována jako množství enzymu, které katalyzuje inkorporaci 10 nmol dttp do materiálu precipitovatelného TCA za 30 min. při 72 o C. Reakční podmínky jsou: 10 mm TrisHCl (ph 8,8 při 25 o C), 50 mm KCl, 0,1% Triton X100, 1,5 mm MgCl 2, 200 μm datp, dctp, dgtp a [α 32 P]dTTP, 50 μg/ml denaturované cdna, 0,5 μm odpovídajícího primeru a 0,2 0,5 U enzymu v objemu 50 μl. Balení: 1 zkumavka s Combi Taq DNA polymerázou v objemu 100 μl (100 U) nebo 500 μl (500 U), 1 zkumavka s 10x koncentrovaným reakčním pufrem (1,5 ml). Při požadavku na změnu v koncentraci MgCl 2 je možno namísto 10x konc. reakčního pufru dodat set obsahující 1 zkumavku s 10x konc. reakčním pufrem bez MgCl 2 (1,5 ml) a 1 zkumavku s 25 mm MgCl 2 (0,5 ml). Skladovací pufr: 20 mm TrisHCl, ph 8,0 (25 o C),100 mm KCl, 0,1 mm EDTA, 1 mm DTT, 0,5% Nonidet P40, 0,5% Tween 20, 50% glycerol. Koncentrace: 1 U/μl Skladování: při teplotě 20 o C společně s 10x konc. reakčním pufrem. Materiál snáší opakované rozmrazování. Čistota: preparát je prostý nukleáz. Enzym migruje při SDS PAGE jako jediný proužek o relativní molekulové hmotnosti 94 kd. Protilátka v neredukujícím prostředí putuje jako jediný proužek o relativní hmotnosti 155 kda. 10x reakční PCR s MgCl 2: 100 mm TrisHCl, ph 8,8 (25 o C), 500 mm KCl, 1% Triton X100, 15 mm MgCl 2. Kontrola kvality: při použití doporučeného protokolu pro přípravu vzorků a vhodné kombinace DNA a primerů je výsledkem PCR DNA fragment, který po elektroforetické separaci a barvení pomocí ethidium bromidu dává proužek odpovídající velikosti. 8DNA polymerázy a pufry C 204 Combi Taq DNA polymeráza 100 U 1.000, Kč C 205 Combi Taq DNA polymeráza 500 U 4.000, Kč C 206 Combi Taq DNA polymeráza 5 x 500 U , Kč T x konc. Taq pufr bez MgCl 2+MgCl 2 1,5 ml + 0,5 ml 60, Kč

9 LA DNA Polymerases Mix KLÍČOVÉ REAGENS PRO AMPLIFIKACI DLOUHÝCH FRAGMENTŮ DNA (AŽ 40 KB) Jedná se o unikátní směs DNA polymerázy Unis a další polymerázy s 3 >5 exonukleázovou aktivitou, která umožňuje provádět amplifikaci genomové DNA až do velikosti 20 kb a plasmidové (fágové) DNA až do velikosti 40 kb tzv. LA (Long a Accurate) PCR. Mimořádná amplifikační účinnost uvedeného systému jej předurčuje i k běžné PCR, kde jiné systémy selhávají, nebo kde je požadavek na snížený výskyt chyb (pro klonování). Systém lze doporučit i pro RTPCR. Definice jednotky: jedna jednotka LA DNA Polymerases Mix je definována jako množství enzymu, které katalyzuje inkorporaci 10 nmol dttp do materiálu precipitovatelného TCA za 30 min. při 72 o C. Reakční podmínky jsou: 10 mm TrisHCl (ph 8,8 při 25 o C), 50 mm KCl, 0,1% Triton X100, 1,5 mm MgCl 2, 200 μm datp, dctp, dgtp a [α 32 P]dTTP, 50 μg/ml denaturované cdna, 0,5 μm odpovídajícího primeru a 0,2 0,5 U enzymu v objemu 50 μl. Balení: 1 zkumavka s LA DNA Polymerases Mix v objemu 20 μl (100 U) nebo 100 μl (500 U), 1 zkumavka obsahující 1,5 ml 10x koncentrovaného LA PCR reakčního pufru, 1 zkumavka DMSO, podrobný návod na provádění LA PCR. Při požadavku na změnu v koncentraci MgCl 2 je možno namísto 10x konc. reakčního LA PCR pufru dodat set obsahující 1 zkumavku s 10x konc. reakčním LA PCR pufrem bez MgCl 2 (1,5 ml) a 1 zkumavku s 25 mm MgCl 2 (0,5 ml). Skladovací pufr: 20 mm TrisHCl, ph 8,0 (25 o C), 100 mm KCl, 0,1 mm EDTA, 1 mm DTT, 0,5% Nonidet P40, 0,5% Tween 20, 50% glycerol. Koncentrace: 5 U/μl. Skladování: enzymová směs, pufr a DMSO při teplotě 20 o C. Materiál snáší opakované rozmrazování. Čistota: preparát je prostý RNáz a DNáz. 10x reakční pufr s MgCl 2 : 500 mm TrisHCl, ph 9,3 (25 o C), 150 mm (NH 4 ) 2 SO 4, 1% Tween 20, 22,5 mm MgCl 2. Kontrola kvality: při použití doporučeného protokolu pro přípravu vzorků a vhodné kombinace DNA a primerů je výsledkem PCR DNA fragment, který po elektroforetické separaci a barvení pomocí ethidium bromidu dává proužek odpovídající velikosti. a pufry L 071 LA DNA Polymerases Mix 100 U 1.000, Kč L 072 LA DNA Polymerases Mix 500 U 3.500, Kč L 073 LA DNA Polymerases Mix 5 x 500 U , Kč L x konc. LA PCR pufr bez MgCl 2 +MgCl 2 1,5 ml + 0,5 ml 60, Kč 9DNA polymerázy

10 10x koncentrovaný PCR Blue Buffer Jedná se o reakční pufr pro PCR, jehož základem je síran amonný, který je v řadě případů výhodnější než dříve používané pufry s KCl. Optimální konečná koncentrace MgCl 2 bývá vyšší (obvykle 2,5 mm) než při použití klasického reakčního pufru s KCl, který má optimum obvykle při 1,5 mm MgCl 2. Navíc PCR Blue Buffer má širší rozmezí optimálních koncentrací MgCl 2. Složení: PCR Blue Buffer se dodává 10x koncentrovaný: 750 mm TrisHCl, ph 8,8 (při 25 o C), 200 mm (NH 4 ) 2 SO 4, 0,1% Tween 20, 25 mm MgCl 2. Balení: 1 zkumavka 10x koncentrovného PCR Blue Bufferu, 10x konc. PCR Blue Buffer se dodává i bez MgCl 2 a 25mM MgCl 2 je dodáván zvlášť. Tato varianta usnadňuje optimalizaci reakčních podmínek. Skladování: při teplotě 20 o C. Materiál snáší opakované rozmrazování. PCR Blue Buffer lze použít pro Taq DNA polymerázu, Taq DNA polymerázu Unis, TaqPurple DNA polymerázu, Taq DNA polymerázu 1.1 i Combi Taq DNA polymerázu. DNA polymerázy a pufry 10 T x konc. PCR Blue Buffer Complete 1,5 ml 50, Kč T x konc. PCR Blue Buffer bez MgCl 2 +MgCl 2 1,5 ml + 0,5 ml 60, Kč

11 PP Master Mixy PPP Master Mix Plain PP Master Mix Combi PPP Master Mix PP Master Mixy představují novou generaci produktů pro přípravu rychlé a spolehlivé PCR. Obsahují všechny komponenty PCR s výjimkou primerů a DNA. Jejich hlavní předností je, že 1) nevyžadují smíchávání malých množství jednotlivých component PCR, 2) obsahují všechny komponenty optimalizované z hlediska vzájemné kompatibility a 3) obsahují aditiva, která zjednodušují skladování, přepravu i účinnost PCR. Všechny tyto parametry zvyšují reproducibilitu výsledků PCR testů. V současné době jsou k dispozici 3 typy PCR Master Mixů, které se liší svým složením a využitelností (viz. tabulka). Tabulka Využitelnost reakčních směsí TopBio provenience pro různé typy PCR. Rutinní diagnost. PCR PCR dlouhých fr. Přesná PCR na klonace DNA fr. Hot start PCR PCR s vysokým výtěžkem DNA fr. Speciální aplikace PCR reakční směs bez DNA a primerů PP Master Mix Plain PP Master Mix Combi PPP Master Mix Preparát, který je označen Combi, obsahuje teplotněsensitivní protilátku specifickou pro DNA polymerázy. Tato protilátka blokuje enzymovou aktivitu, která je následně zrušena v prvním denaturačním kroku PCR. Teplotní citlivost protilátky umožňuje její efektivní využití v tzv. hot start PCR, kdy amplifikace DNA fragmentů nastává až po dosažení denaturační teploty. Technické specifikace jsou uvedeny v části technické specifikace (str. 39). PP Master Mixy 11

12 PPP Master Mix TAQPURPLE DNA POLYMERÁZA PCR MASTER MIX Umožňuje po všech stránkách optimalizované a standartní provádění PCR, umožňuje rychlou přípravu reakční směsi bez nutnosti rozmrazování jednotlivých komponent; stačí dodat primery, DNA a doplnit H 2 O (součástí dodávky), obsahuje reakční pufr, který zvyšuje účinnost i specificitu PCR a zajišťuje širší rozmezí optimálních koncentrací MgCl 2, obsahuje stabilizátory, které umožňují kratkodobé skladování při 4 o C, obsahuje aditiva, která umožňují přímou elektroforézu amplifikovaného produktu, bez nutnosti přidávat vkládací pufr, obsahuje barvivo, které usnadňuje manipulaci se vzorky a vizuální kontrolu homogenity; barvivo má vyšší pohyblivost než nukleotidy a tedy neinterferuje s kvantifikovatelností PCR produktů, vzorky mohou být snadno reamplifikovány ( nested PCR), protože barvivo nemá vliv na průběh amplifikace, PPP Master Mix je mimořádně vhodný pro rutinní vyšetřování větších počtů vzorků. K PPP Master Mixu v originální zkumavce (0,5 ml) je možné přidat požadované primery (např. 2 x 40 μl) a PCR H 2 O (380 μl). Vlastní přípravu PCR lze pak omezit pouze na smíchání částí této reakční směsi (např. 24 μl) s analyzovanou DNA (1 μl). Složení: PPP Master Mix se dodává 2x koncentrovaný: 150 mm TrisHCl, ph 8,8 (25 o C), 40 mm (NH 4 ) 2 SO 4, 0,02% Tween 20, 5 mm MgCl 2, 400 μm datp, 400 μm dctp, 400 μm dgtp, 400 μm dttp, 100 U/ml TaqPurple DNA polymerázy, stabilizátory a aditiva. Součástí dodávky je PCR H 2 O. Balení: 1 zkumavka s 500 μl PPP Master mixu (na 40 reakcí po 25 μl), 1 zkumavka s 1,5 ml H 2 O. Skladování: při teplotě 20 o C, krátkodobě při teplotě 4 o C. Materiál snáší opakované rozmrazování. Čistota: preparát je prostý nukleáz. Enzym migruje při SDS PAGE jako jediný proužek o molekulové hmotnosti 94 kd. PP Master Mixy 12 Kontrola kvality: každá šarže PPP Master mixu je testována na amplifikaci genu o jedné kopii v genomové DNA. P 124 PPP Master Mix (1 zk.) 40 reakcí 690, Kč P 125 PPP Master Mix (5 zk.) 200 reakcí 2.490, Kč P 126 PPP Master Mix (25 zk.) 1000 reakcí 9.990, Kč V případě požadavku na změny v koncentraci Mg 2+ lze dodat PPP Master Mix bez MgCl 2 a MgCl 2 separátně. P 134 PPP Master Mix bez MgCl 2 +MgCl 2 (1 zk.) 40 reakcí 690, Kč P 135 PPP Master Mix bez MgCl 2 +MgCl 2 (5 zk.) 200 reakcí 2.490, Kč P 136 PPP Master Mix bez MgCl 2 +MgCl 2 (25 zk.) 1000 reakcí 9.990, Kč

13 Plain PP Master Mix TAQ DNA POLYMERÁZA PCR MASTER MIX BEZ BARVIVA Plain PP Master Mix je obdobou PPP Master Mixu, ale neobsahuje barvivo. Umožňuje po všech stránkách optimalizované a standartní provádění PCR, obsahuje reakční pufr, který zvyšuje účinnost i specificitu PCR a zajišťuje širší rozmezí optimálních koncetrací MgCl 2, umožňuje rychlejší přípravu reakční směsi bez nutnosti rozmrazování jednotlivých komponent; stačí dodat primery, DNA a doplnit H 2 O (součástí dodávky), obsahuje stabilizátory, které umožňují krátkodobé skladování při 4 o C, obsahuje aditiva, která umožňují přímou elektroforézu amplifikovaného produktu, bez nutnosti přidávat vkládací pufr, vzorky mohou být snadno reamplifikovány ( nested PCR), neboť aditiva nemají vliv na průběh amplifikace, je mimořádně vhodný pro rutinní analýzu produktů PCR reakcí pomocí automatických detektorů (kapilární chromatografie, realtime PCR a další). K Plain PP Master Mixu v originální zkumavce (0,5 ml) je možné přidat požadované primery (např. 2 x 40 μl) a PCR H 2 O (380 μl). Vlastní přípravu PCR lze pak omezit pouze na smíchání části této reakční směsi (např. 24 μl) s analyzovanou DNA (1 μl). Složení: Plain PP Master Mix se dodává 2x koncentrovaný: 150 mm TrisHCl, ph 8,8 (25 o C), 40 mm (NH 4 ) 2 SO 4, 0,02% Tween 20, 5 mm MgCl 2, 400 μm datp, 400 μm dctp, 400 μm dgtp, 400 μm dttp, 100 U/ml Taq DNA polymerázy, stabilizátory a aditiva. Balení: 1 zkumavka s 500 μl Plain PP Master mixu (na 40 reakcí po 25 μl), 1 zkumavka s 1,5 ml H 2 O. Skladování: při teplotě 20 o C, krátkodobě při teplotě 4 o C. Materiál snáší opakované rozmrazování. Čistota: preparát je prostý nukleáz. Enzym migruje při SDS PAGE jako jediný proužek o molekulové hmotnosti 94 kd. Kontrola kvality: každá šarže Plain PP Master Mixu je testována na amplifikaci genu o jedné kopii v genomové DNA. PP Master Mixy P 201 Plain PP Master Mix (1 zk.) 40 reakcí 690, Kč P 202 Plain PP Master Mix (5 zk.) 200 reakcí 2.490, Kč P 203 Plain PP Master Mix (25 zk.) 1000 reakcí 9.990, Kč 13

14 Combi PPP Master Mix TAQPURPLE DNA POLYMERÁZA PCR MASTER MIX S NOVOU MONOKLONÁLNÍ PRO TILÁTKOU ANTITAQ Umožňuje po všech stránkách optimalizované a standartní provádění PCR, obsahuje reakční pufr, který zvyšuje účinnost i specificitu PCR a zajišťuje širší rozmezí optimálních koncentrací MgCl 2, umožňuje rychlejší přípravu reakční směsi bez nutnosti rozmrazování jednotlivých komponent; stačí dodat primery, DNA a doplnit H 2 O (součástí dodávky), obsahuje aditiva, která umožňují přímou elektroforézu amplifikovaného produktu, bez nutnosti přidávat vkládací pufr, obsahuje antitaq monoklonální protilátku specifickou pro Taq DNA polymerázu, která umožňuje tzv. hot start PCR, obsahuje barvivo, které usnadňuje manipulaci a vizuální kontrolu homogenity vzorků; při elektroforéze má barvivo vyšší pohyblivost než nukleotidy a tedy neinterferuje s kvantifikovatelností PCR produktů, vzorky mohou být snadno reamplifikovány ( nested PCR), neboť aditiva nemají vliv na průběh amplifikace, má široké využití při amplifikaci komplexních genomických nebo cdna templátů, nízkých počtů templátů a při použití mnohočetných párů primerů v téže reakční směsi. Protilátka blokuje enzymatickou aktivitu Taq DNA polymerázy a tím znemožňuje zahájení polymerázové reakce před vlastní PCR. Při denaturaci DNA dochází současně k irreverzibilní teplotní inaktivaci protilátky a tím k odblokování enzymatické aktivity DNA polymerázy. Tato tzv. hot start PCR je zvláště vhodná všude tam, kde dochází k nežádoucí amplifikaci nespecifických fragmentů DNA, k nízké amplifikaci DNA fragmentů, popřípadě k tvorbě artefaktů vznikajících amplifikací kombinovaných primerů. (viz obr. 2). PP Master Mixy 14 Skladování: při teplotě 20 o C. Materiál snáší opakované rozmrazování Složení: Combi PPP Master Mix se dodává 2x koncentrovaný: 150 mm TrisHCl, ph 8,8 (25 o C), 40 mm (NH 4 ) 2 SO 4, 0,02% Tween 20, 5 mm MgCl 2, 400 μm datp, 400 μm dctp, 400 μm dgtp, 400 μm dttp, 100 U/ml TaqPurple DNA polymerázy, monoklonální antitaq DNA polymeráza (38 nm), stabilizátory a aditiva. Balení: 1 zkumavka s 500 μl Combi PPP Master mixu (na 40 reakcí po 25 μl), 1 zkumavka s 1,5 ml H 2 O. + Taq mab +Control mab sp frag. Obr. 2. Vliv monoklonální protilátky antitaq na amplifikaci cdna fragmentů pomocí RTPCR. Buněčná mrna byla izolována pomocí reagens RNA Blue (Kat. č. R 011) a převedena na cdna pomocí MMLV reverzní transkriptázy (Kat. č. M 023). Získaná cdna byla následně amplifikována pomocí Combi PPP Master Mixu, obsahující antitaq monoklonální protilátku (+αtaq mab), nebo kontrolního PPP Master Mixu s kontrolní monoklonální protilátkou (+ control mab). Testované vzorky byly z buněk divokého typu (1,4), heterozygotů (2,5) nebo homozygotů defektních v expresi studované mrna (3,6). Amplifikované vzorky byly frakcionovány elektroforézou na agarózovém gelu (Kat. č. P 045) s přídavkem ethidium bromidu (Kat. č. P 046). Pouze vzorky obsahující cílovou mrna vykazovaly očekávaný DNA fragment. V PCR s antitaq protilátkou byl specifický fragment (950 bp) výraznější na úkor fragmentů nespecifických. Ve snaze zachytit co nejširší spektrum DNA fragmentů byl gel přeexponován. Čísla vlevo ukazují pozice velikostních standartů. Získané výsledky ukázaly, že přidání antitaq protilátky do PPP Master Mixu zvyšuje amplifikaci specifického fragmentu DNA na úkor nespecifických fragmentů. Čistota: preparát je prostý nukleáz. Enzym migruje při SDS PAGE jako jediný proužek o molekulové hmotnosti 94 kd. Kontrola kvality: každá šarže Combi PPP Master Mixu je testována na amplifikaci genu o jedné kopii v genomové DNA. C 208 Combi PPP Master Mix (1 zk.) 40 reakcí 790, Kč C 209 Combi PPP Master Mix (5 zk.) 200 reakcí 2.990, Kč C 210 Combi PPP Master Mix (25 zk.) 1000 reakcí , Kč

15 qpcr Master Mixy NOVÁ GENERACE PŘÍPRAVKŮ PRO KVANTITATIVNÍ PCR new qpcr 2x Master Mix new qpcr 2x Blue Master Mix new qpcr 2x SYBR Master Mix Kvantitativní PCR (qpcr), nazývaná PCR v reálném čase, je v současnosti nejpoužívanější metoda pro analýzu genové exprese. qpcr vyžaduje termální cyklery, které jsou vybavené zařízením pro monitorování fluorescence v jednotlivých cyklech PCR. Intenzita fluorescence koreluje s množstvím DNA fragmentů produkovaných v průběhu PCR. Výhodou qpcr je, že (1) tvorba fragmentů DNA je monitorována v průběhu PCR a tedy nevyžaduje gelovou analýzu PCR produktů, (2) umožňuje kvantifikaci tvorby DNA fragmentů v exponenciální fázi PCR a (3) nevyžaduje manipulaci s PCR produkty a tím snižuje riziko kontaminace. Základem pro provádění qpcr jsou kvalitní reagens. qpcr Master Mixy TopBio provenience splňují požadavky na reagens, která jsou vhodná pro provádění PCR. Všechny qpcr Master mixy: umožňují po všech stránkách optimalizované a standartní provádění qpcr, obsahují reakční pufr s MgCl 2 v optimální koncentraci pro většinu PCR, umožňují rychlejší přípravu PCR reakčních směsí bez nutnosti rozmražování jednotlivých komponent; stačí dodat primery, DNA a doplnit H 2 O (součástí dodávky), obsahují afinitně purifikovanou monoklonální protilátku specifickou pro Taq DNA polymerázu. Tato protilátka blokuje enzymatickou aktivitu Taq DNA polymerázy a tím znemožňuje zahájení polymerázové reakce před vlastní PCR. Při denaturaci DNA v prvním cyklu PCR dochází k irreverzibilní teplotní inaktivaci protilátky a tím k odblokování enzymatické aktivity Taq DNA polymerázy. Tato tzv. hot start PCR je zvláště vhodná všude tam, kde dochází k nežádoucí amplifikaci nespecifických fragmentů DNA, k nízké amplifikaci DNA fragmentů, popřípadě k tvorbě artefaktů vznikajících amplifikací kombinovaných primerů. Protilátka je inaktivována rychle při prvním cyklu denaturace DNA během PCR (~1 min. při 94 o C); není třeba prodlužovat denaturační krok. Tabulka Využitelnost qpcr Master Mixů TopBio provenience pro různé typy PCR. PCR reakční směsi Použití Hot Start qpcr 2x Master Mix qpcr 2x Blue Master Mix qpcr 2x SYBR Master Mix Technické specifikace jsou uvedeny v části technické specifikace (str. 38). qpcr Fluorescence Rutinní amplifikace s využitím fluorescenčních sond Náročnější amplifikace s využitím fluorescenčních sond Amplifikace v přítomnosti SYBR Green Doba (min.) qpcr Master Mixy Číslo cyklu 15

16 qpcr 2x Master Mix SMĚS OBSAHUJÍCÍ TAQ DNA POLYMERÁZU, PUFR S MgCl2, NUKLEOTIDY, NOVOU MONOKLONÁLNÍ PROTILÁTKOU ANTITAQ A NOVÁ ADITIVA Umožňuje po všech stránkách optimalizované a standartní provádění PCR a realtime PCR, obsahuje reakční pufr s MgCl 2 v optimální koncentraci pro většinu PCR, umožňuje rychlejší přípravu reakční směsi bez nutnosti rozmrazování jednotlivých komponent; stačí dodat primery, sondu, DNA a doplnit H 2 O (součástí dodávky), obsahuje afinitně purifikovanou monoklonální protilátku specifickou pro Taq DNA polymerázu, která umožňuje tzv. hot start ; tato protilátka blokuje enzymatickou aktivitu Taq DNA polymerázy a tím znemožňuje zahájení PCR. Při denaturaci DNA v prvním cyklu PCR dochází k irreverzibilní teplotní inaktivaci protilátky a tím k odblokování enzymatické aktivity Taq DNA polymerázy. Protilátka je inaktivována rychle při prvním cyklu denaturace DNA během PCR (~1 min. při 94 o C) a není třeba prodlužovat denaturační krok, má široké využití při amplifikaci komplexních genomických nebo cdna templátů, nízkých počtů templátů a při použití mnohočetných párů primerů v téže reakční směsi, je vhodný pro použití v kombinaci se všemi běžnými detekčními sondami typu TaqMan, molecular beacons, FRET. Složení: qpcr 2x Master Mix se dodává 2x koncentrovaný: 20 mm TrisHCl, ph 8,8, 100 mm KCl, 0,2% Triton X100, 3 mm MgCl 2, 400 μm datp, 400 μm dctp, 400 μm dgtp, 400 μm dttp, 50 U/ml Taq DNA polymerázy, monoklonální antitaq DNA polymeráza (38 nm), stabilizátory a aditiva. Balení: 1 zkumavka s qpcr 2x Master Mix (na 40 reakcí po 25 μl) 1 zkumavka s 1,5 ml PCR H 2 0. Skladování: při teplotě 20 o C. Materiál snáší opakované rozmrazování. Čistota: preparát je prostý nukleáz. Enzym migruje při SDS PAGE jako jediný proužek o molekulové hmotnosti 94 kd. Kontrola kvality: každá šarže qpcr 2x Master Mixu je testována na amplifikaci genu o jedné kopii v genomové DNA pomocí přístroje pro realtime PCR. qpcr Master Mixy 16 P 501 qpcr 2x Master Mix 40 reakcí 790, Kč P 502 qpcr 2x Master Mix 200 reakcí 2.990, Kč P 503 qpcr 2x Master Mix 1000 reakcí , Kč

17 qpcr 2x Blue Master Mix SMĚS OBSAHUJÍCÍ TAQ DNA POLYMERÁZU, BLUE BUFFER S MgCl2, NUKLEOTI DY, NOVOU MONOKLONÁLNÍ PROTILÁTKOU ANTITAQ A NOVÁ ADITIVA. Umožňuje po všech stránkách optimalizované a standardní provádění PCR a realtime PCR, obsahuje reakční pufr se síranem amonným a s MgCl 2 v optimální koncentraci pro většinu PCR, umožňuje rychlejší přípravu reakční směsi bez nutnosti rozmrazování jednotlivých komponent; stačí dodat primery, detekční sondu, studovanou DNA (cdna) a doplnit H 2O (součástí dodávky), obsahuje afinitně purifikovanou monoklonální protilátku specifickou pro Taq DNA polymerázu. Tato protilátka blokuje enzymatickou aktivitu DNA polymerázy a tím znemožňuje zahájení polymerázové reakce před vlastní PCR. Při denaturaci DNA v prvním cyklu PCR dochází k irreverzibilní teplotní inaktivaci protilátky a tím k odblokování enzymatické aktivity DNA polymerázy. Tato tzv. hot start PCR je zvláště vhodná všude tam, kde dochází k nežádoucí amplifikaci nespecifických fragmentů DNA, k nízké amplifikaci DNA fragmentů, popřípadě k tvorbě artefaktů vznikajících amplifikací kombinovaných primerů. Protilátka je inaktivována rychle při prvním denaturačním cyklu PCR (obvykle 1 min. při 94 o C) a není nutné prodlužovat denaturační krok, má široké využití při amplifikaci komplexních genomických nebo cdna templátů, nízkých počtů templátů a při použití mnohočetných párů primerů v téže reakční směsi, je vhodná pro použití všech běžných detekčních sond (TaqMan, molecular beacons, FRET). Složení: qpcr 2x Blue Master Mix se dodává 2x koncentrovaný: 150 mm TrisHCl, ph 8,8 (při 25 o C), 40 mm (NH 4) 2SO 4, 0,02% Tween 20, 5 mm MgCl 2, 400 μm datp, 400 μm dctp, 400 μm dgtp, 400 μm dttp, 50 U/ml Taq DNA polymerázy, monoklonální antitaq DNA polymeráza (38 nm), stabilizátory a aditiva. Balení: 1 zkumavku qpcr 2x Blue Master Mix na 40 reakcí po 25 μl 1 zkumavku PCR H 2 0 (1,5 ml). Skladování: při teplotě 20 o C. Materiál snáší opakované rozmrazování. Čistota: preparát je prostý nukleáz. Enzym migruje při SDS PAGE jako jediný proužek o molekulové hmotnosti 94 kd. Kontrola kvality: každá šarže qpcr 2x Blue Master Mixu je testována na amplifikaci genu o jedné kopii v genomové DNA pomocí přístroje pro realtime PCR. qpcr Fluorescence Doba (min.) Číslo cyklu P 521 qpcr 2x Blue Master Mix 40 reakcí 790, Kč P 522 qpcr 2x Blue Master Mix 200 reakcí 2.990, Kč P 523 qpcr 2x Blue Master Mix 1000 reakcí , Kč qpcr Master Mixy 17

18 qpcr 2x SYBR Master Mix SMĚS OBSAHUJÍCÍ TAQ DNA POLYMERÁZU, PUFR S MgCl2, NUKLEOTIDY, NOVOU MONOKLONÁLNÍ PROTILÁTKOU ANTITAQ, SYBR GREEN A NOVÁ ADITIVA. Umožňuje po všech stránkách optimalizované a standartní provádění realtime qpcr, obsahuje reakční pufr s MgCl 2 v optimální koncentraci pro většinu qpcr, obsahuje fluorescenční barvivo SYBR Green, interkalující mezi báze DNA v optimální koncentraci bez negativního působení na amplifikaci DNA, umožňuje rychlejší přípravu reakční směsi bez nutnosti rozmrazování jednotlivých komponent; stačí dodat primery, DNA a doplnit H 2 O (součástí dodávky), obsahuje afinitně purifikovanou monoklonální protilátku specifickou pro Taq DNA polymerázu, která umožňuje tzv. hot start ; tato protilátka blokuje enzymatickou aktivitu Taq DNA polymerázy a tím znemožňuje zahájení PCR. Při denaturaci DNA v prvním cyklu PCR dochází k irreverzibilní teplotní inaktivaci protilátky a tím k odblokování enzymatické aktivity Taq DNA polymerázy. Protilátka je inaktivována rychle při prvním cyklu denaturace DNA během PCR (~1 min. při 94 o C) a není třeba prodlužovat denaturační krok, má široké využití při amplifikaci komplexních genomických nebo cdna templátů, nízkých počtů templátů a při použití mnohočetných párů primerů v téže reakční směsi. Složení: qpcr 2x SYBR Master Mix se dodává 2x koncentrovaný: 20 mm TrisHCl, ph 8,8, 100 mm KCl, 0,2% Triton X100, 3 mm MgCl 2, 400 μm datp, 400 μm dctp, 400 μm dgtp, 400 μm dttp, 50 U/ml Taq DNA polymerázy, monoklonální antitaq DNA polymeráza (38 nm), SYBR Green, stabilizátory a aditiva. Balení: 1 zkumavka s qpcr 2x SYBR Master Mix (na 40 reakcí po 25 μl) 1 zkumavka s 1,5 ml PCR H 2 0 Skladování: při teplotě 20 o C. Materiál snáší opakované rozmrazování. Čistota: preparát je prostý nukleáz. Enzym migruje při SDS PAGE jako jediný proužek o molekulové hmotnosti 94 kd. Kontrola kvality: každá šarže qpcr 2x SYBR Master Mixu je testována na amplifikaci genu o jedné kopii v genomové DNA pomocí přístroje pro realtime PCR. qpcr Master Mixy 18 P 551 qpcr 2x SYBR Master Mix 40 reakcí 790, Kč P 552 qpcr 2x SYBR Master Mix 200 reakcí 2.990, Kč P 553 qpcr 2x SYBR Master Mix 1000 reakcí , Kč

19 Další enzymy TATO SKUPINA ZAHRNUJE ENZYMY, KTERÉ NACHÁZEJÍ UPLATNĚNÍ PŘI PCR NEBO PŘI PŘÍPRAVĚ DNA RNáza bez DNáz slouží ke štěpení RNA, bez vlivu na DNA MMLV reverzní transkriptáza umožňujě převádět mrna na cdna RNáza bez DNáz Jedná se o RNázu z bovinního pankreatu, která je vhodná pro přípravu plasmidů pomocí DNA Lego kitu. Definice jednotky: jedna jednotka je defi nována jako množství enzymu, které hydrolyzuje RNA při rychlostní konstantě 1, 25 o C (M. Kunitz, J. Biol. Chem., 164:563, 1946). Balení: 1 zkumavka RNázy bez DNáz, 0,5 ml. Koncentrace: 10 mg/ml, ~ 900 U/ml. Skladování: při teplotě 20 o C. Materiál snáší opakované rozmrazování. Skladovací pufr: 20 mm Tris HCl (ph 7,5), 30 mm NaCl, 50% glycerol. Kontrola kvality: za podmínek, kdy enzym kompletně degraduje RNA nemá vliv na plasmidovou DNA (elektroforetická intaktnost). Další enzymy D 106 RNáza bez DNáz (10 mg/ml) 0,5 ml 700, Kč 19

20 MMLV reverzní transkriptáza KLÍČOVÉ REAGENS PRO REVERZNÍ TRANSKRIPCI mrna NA cdna Jedná se o rekombinantní reverzní transkriptázu (RT) myšího leukemického viru Moloney. Reverzní transkriptázy jsou enzymy, které mají schopnost syntetizovat DNA na základě templátu RNA a oligonukleotidového očka. Definice jednotky: jedna jednotka MMLV RT je definována jako množství enzymu, které inkorporuje 1 nmol dttp do materiálu precipitovatelného TCA za 10 min. při 37 o C; jako templát je použit poly(a)oligo (dt)1218. Balení: 1 zkumavka s MMLV RT, 2000 U, 200 U/μl, 1 zkumavka 5x koncentrovaného MMLV reakčního pufru, objem 200 μl, 1 zkumavka 100 mm DTT, objem 100 μl. Skladovací pufr: 20 mm TrisHCl (ph 7,5), 100 mm NaCl, 0,1 mm EDTA, 1 mm DTT, 0,01% Nonidet P40, 50% (vol/vol) glycerol. Skladování: při teplotě 20 o C společně s 5x reakčním pufrem a 100 mm DTT. Materiál snáší opakované rozmrazování. Čistota: preparát je prostý nukleáz a má odpovídající parametry z hlediska čistoty a výtěžnosti cdna produktu. 5x reakční pufr (1. řetězec): 250 mm TrisHCl (ph 8,3), 375 mm KCl, 15 mm MgCl 2, stabilizátor. Doporučený protokol pro přípravu cdna (první řetězec) Smíchat: 4 μl PCR H 2 0, 1 μl RNA (1 mg/ml); izolovaná pomocí RNA Blue reagens (Kat. č. R011). Při odchylné koncentraci RNA upravit odpovídajícím způsobem množství vody a RNA tak, aby konečný objem byl 5 μl, 2 μl 5 x koncentrovaného MMLV reakčního pufru, 1 μl 100 mm DTT, 0,5 μl 10 mm PCR dntp Mix (každý z nukleotidů v koncentraci 10 mm) (Kat. č. P041), 0,5 μl Oligo dt1218 primer, nebo jiný primer (50 μm), 1 μl (25 U) MMLV RT (po naředění v 1x MMLV reakčním pufru). Reakční komponenty promíchat, krátce stočit a reakční směs inkubovat 1 hod. při 37 o C. Finální koncentrace jsou: 50 mm TrisHCl (ph 8,3), 75 mm KCl, 3 mm MgCl 2, 10 mm DTT, 0,5 mm dgtp, 0,5 mm datp, 0,5 mm dttp, 0,5 mm dctp, 2,5 μm oligo dt1218 (nebo jiný) primer, 100 μg RNA/ml, 2500 U MMLV RT/ml. Další enzymy 20 M 023 MMLV reverzní transkriptáza U 1.500, Kč

21 Izolace DNA a RNA TATO SKUPINA ZAHRNUJE PRODUKTY URČENÉ PRO IZOLACI DNA A RNA: DNA Lego kit souprava pro izolaci DNA z různých zdrojů RNA Blue RTPCR kit umožňuje provedení RTPCR RNA Blue reagens pro izolaci RNA z různých zdrojů RNA Nosič TB doplněk vhodný pro izolaci malých množství RNA Stavebnicový charakter a dostupnost individuálních komponent umožňuje maximálně efektivní využití izolačních souprav. Produkty na izolaci DNA a RNA 21

22 DNA Lego kit SOUPRAVA PRO RYCHLOU IZOLACI ČISTÉ DNA Moderní metody izolace DNA využívají poznatku o kapacitě křemičitých mikropartikulí vázat DNA v přítomnosti chaotropních látek (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: , 1979). Řada firem připravila v současnosti soupravy pro izolaci DNA, které vycházejí z těchto poznatků. Ve srovnání s klasickými metodami je izolace DNA pomocí komerčních kitů rychlejší (nevyžaduje etanolovou precipitaci), bezpečnější (nevyžaduje fenolovou extrakci) a izolované preparáty DNA jsou podstatně čistější (nekontaminované RNA v sekvenační kvalitě). Masivnímu využívání moderních metod izolace DNA však brání ceny těchto souprav, které při srovnatelném počtu izolací několikanásobně přesahují ceny nákladů na izolaci DNA klasickým způsobem. Komerční soupravy jsou navíc značně specializované a pro různé izolace DNA (plasmidová, genomová DNA z leukocytů krve a jiných buněk, PCR fragmenty, fragmenty DNA po gelové separaci) je nezbytné zakupovat speciální soupravy. DNA Lego kit je stavebnicovou soupravou pro izolace DNA. Tento kit v sobě integruje nejen moderní poznatky o vlastnostech DNA, ale i ekonomicky atraktivní domácí surovinovou základnu. DNA Lego kit umožňuje izolovat DNA kvalitně a rychle, přičemž cena za izolaci je srovnatelná s cenou klasických izolačních postupů. Použití speciálně připravených křemičitých mikropartikulí a podtlakového odsávání umožňuje rychlé zpracování velkého počtu vzorků při minimalizaci nároků na špičky mikropipetátorů a mikrozkumavky. DNA izolovaná pomocí DNA Lego kitu je použitelná pro řadu molekulárně biologických technik, včetně PCR, restrikčního štěpení, sekvenování, mutageneze, transkripce in vitro, transformace, transfekce a další. Komponenty kitu lze využít pro koncentraci DNA a izolaci fragmentů genomové DNA z buněk i neseparované krve. Definice jednotky: DNA Lego kit umožňuje 250 izolací DNA (např. plasmidů z bakteriálních kultur o objemu 1,5 ml). Komponenty kitu: křemičité mikropartikule (DNA bind, 25 ml), DNA vazebný pufr (150 ml), promývací pufr (500 ml), centrifugační minikolonky/nástavce (25/250 ks), podrobný návod na izolaci plasmidové DNA z bakterií, fragmentů genomové DNA z malých množství buněk a neseparované krve a DNA fragmentů z komplexních reakčních směsí a gelů. Návod zahrnuje i podrobné informace o přípravě roztoků a jejich skladování. Skladování: při pokojové teplotě Produkty na izolaci DNA a RNA 22 D 100 DNA Lego kit, 250 izolací 1 kit 2.950, Kč D 102 DNA bind 25 ml 980, Kč D 103 DNA vazebný pufr 150 ml 850, Kč D 104 Promývací pufr 500 ml 550, Kč D 105 Minikolonky / nástavce 25/250 ks 750, Kč

23 RNA Blue RTPCR kit SOUPRAVA PRO RYCHLOU ANALÝZU PŘÍTOMNOSTI SPECIFICKÉ RNA Analýza exprese genů na úrovni RNA má velký význam v obecně biologicky orientovaném základním i aplikovaném výzkumu, zvláště lékařském a farmaceutickém. Určování přítomnosti RNA některých diferenciálně exprimovaných genů a patogenů má vysokou vypovídací hodnotu diagnostickou. V současné době jsou časově náročné tradiční metody identifikace přítomnosti studované mrna nahrazovány metodou RTPCR, která spočívá v reverzní transkripci RNA na cdna, amplifikaci cdna fragmentu v PCR a detekci amplifikovaného fragmentu. Výhody této metody spočívají v rychlosti, snadnosti provedení a nezávislosti na použití radioaktivních látek. RNA Blue RT PCR kit obsahuje všechny klíčové komponenty pro izolaci RNA, přípravu cdna a její amplifikaci v PCR. Souprava nalezne uplatnění i při přípravě cdna fragmentů vhodných pro klonování v expresních vektorech a následnou produkci rekombinantních proteinů. Součástí soupravy je podrobný pracovní protokol, který popisuje jednotlivé kroky RTPCR od přípravy RNA z buněk až po elektroforetickou charakterizaci PCR produktů. RNA Blue RTPCR kit umožňuje stanovit přítomnost studované RNA v buňkách v průběhu méně než 8 hod. Výhody RNA Blue RTPCR kitu 1. Souprava obsahuje všechny rozhodující komponenty (s výjimkou primerů a RNA) pro úspěšné provedení RTPCR. Souprava obsahuje komponenty nejvyšší dosažitelné kvality, které byly extenzivně testovány na vzájemnou kompatibilitu, vysokou performanci a optimální průběh reverzní transkripce i PCR. 2. Souprava obsahuje podrobný návod na provedení RTPCR, včetně popisu 90ti min. izolace nedegradované RNA, reverzní transkripce a následné PCR. Reverzní transkripci a PCR lze provést v jediné zkumavce. 3. Využitelnost soupravy je zvýšena možnostmi získat jednotlivé komponenty soupravy samostatně. Komponenty kitu: RNA Blue, 100 ml, PCR H 2 0, 15 ml, MMLV reverzní transkriptáza, U, 200 U/μl, 5x koncentrovaný MMLV reakční pufr, 200 μl, 100 mm DTT, 100μl, PCR dntp Mix (datp, dgtp, dctp a dttp), 10 mm roztok každého z nukleotidů, 100 μl, Taq DNA polymeráza, 500 U, 5U/μl; 10x koncentrovaný pufr pro PCR, podrobný návod na izolaci RNA a provedení RTPCR. Skladování: RNA Blue reagens při teplotě 4 o C, PCR H 2 O při pokojové teplotě, MMLV reverzní transkriptáza, PCR dntp mix a Taq DNA polymeráza a pufry při teplotě 20 o C. Materiál snáší opakované rozmrazování. Kontrola kvality: při použití doporučeného protokolu, komponent RNA Blue RTPCR kitu a vhodné kombinace RNA a primerů je výsledkem RTPCR produkt, který po elektroforetické separaci a barvení ethidium bromidem má odpovídající velikost. Produkty na izolaci DNA a RNA Objednávky R 001 RNA Blue RTPCR kit 1 kit 6.900, Kč 23