Určeno pro obecné laboratorní užití. Není určeno pro použití v diagnostických postupech. POUZE PRO POUŽITÍ IN VITRO.

Transkript

1 Určeno pro obecné laboratorní užití. Není určeno pro použití v diagnostických postupech. POUZE PRO POUŽITÍ IN VITRO. PCR Nucleotide Mix Předem připravený roztok ultračistých PCR deoxynukleotidů (datp, dgtp, dctp a dttp, každý o obsahu 10 mm). Cat. No Cat. No Cat. No Cat. No μl 5 x 200 μl 10 x 200 μl 200 μl, plus 250 U Taq DNA polymeráza dostupné pouze prostřednictvím zásilkového programu zmraženého materiálu z USA Verze z listopadu Skladujte při teplotách -15 C až -25 C. 1. K čemu je určen tento produkt Složení: Směs PCR Nucleotide Mix je čistý, bezbarvý roztok solí sodíku datp, dctp, dgtp a dttp, každý v koncentraci 10 mm ve vodě, pro celkový objem 200 μl (ph 8,3). Skladování a stabilita Směs PCR Nucleotide Mix je stabilní při teplotách -15 C až -25 C, a to do data spotřeby, vytištěného na označení výrobku. Vydrží až 50 cyklů zmražení a rozmražení. Směs se přepravuje na suchém ledu. Další požadované vybavení a reagencie Další vybavení a reagencie, požadované pro provádění reakcí PCR pomocí směsi PCR nukleotidů, které se v balení neposkytuje, zahrnuje: Všeobecné laboratorní vybavení - pipetové hroty prosté nukleázy, odolné vůči aerosolům - pipety s hroty s pozitivním přesunem na jedno použití - sterilní reakční zkumavky pro přípravu PCR směsí a roztoků - standardní stolní (provedení benchtop) mikrocentrifuga pro PCR - termální cyklér s blokem (např. Applied Biosystems GeneAmp PCR System 9600) - primery PCR

2 - templátová DNA - laboratorní nádobí PCR (doporučujeme tenkostěnné zkumavky nebo destičky PCR) - enzym PCR (např. Taq DNA Polymeráza ) - voda pro PCR Použití Směs nukleotidů PCR je optimalizována pro použití v amplifikačních reakcích. Tato předpřipravená směs se může přidávat přímo do všech typů amplifikačních reakcí a dalších reakcí, při nichž dochází k extenzi primerů, jako jsou např reakce.: - PCR - jednorázové RT-CR - syntéza cdna. 2. Jak tento výrobek používat 2.1 Než začnete Všeobecná doporučení k zacházení Optimální podmínky (inkubační doba a teplota, koncentrace enzymů, templátová DNA, Mg 2+ ) závisí na použitém systému a musí být určeny individuálně (2). Obzvlášť koncentrace Mg 2+ a množství enzymu použité při testování by mělo pro dosažení optimální účinnosti syntézy DNA být natitrováno. Pro začátek se řiďte následujícími směrnicemi: Roztok před započetím postupu rozmrazte, promíchejte a krátce centrifugujte. Optimální koncentrace enzymu je 0,5 2,5 U na reakci o obsahu 50 μl. Optimální koncentrace Mg 2+ může variovat od 1,5 mm do 5 mm (6,7). Použijte počáteční koncentraci 1,5 mm, když používáte 200 μm dntp (na každou reakci). Konečná koncentrace každé dntp v amplifikační reakci by měla dosahovat 50 až 500 μm. Nejběžněji používaná koncentrace je 200 μm. Zvyšte koncentraci Mg 2+, pokud zvyšujete koncentraci dntp. Vzorkový materiál Použijte jakoukoliv templátovou DNA (např. genomickou nebo plasmatickou DNA, cdna), vhodnou pro PCR s ohledem na čistotu, koncentraci a absenci inhibitorů. Pro opakovatelnou izolaci nukleových kyselin použijte: - buď přístroj MagNA Pure LC nebo přístroj MagNA Pure Compact, společně se sadou vyhrazenou pro izolaci nukleových kyselin (pro automatizovanou izolaci), - nebo sadu pro izolaci nukleových kyselin HIGH PURE (pro manuální izolaci). Podrobnosti najdete v katalogu Roche Applied Science Biochemicals nebo na domovské stránce

3 Použijte 10 až 500 ng komplexní genomické DNA nebo 0,1 až 10 ng plasmatické DNA/cDNA. Doporučované počáteční koncentrace jsou 250 ng genomické DNA nebo 1 ng plasmatické DNA. Templátovou DNA skladujte buď ve vodě pro PCR nebo v 5-10 mm Tris-HCl (ph 7-8). Zamezte rozpouštění templátu v TE pufru, protože EDTA chelatuje Mg Standardní postup PCR Příprava reakčních směsí Připravte dvě PCR master směsi: první obsahuje enzym a reakční pufr, druhá obsahuje všechny ostatní reakční součásti. Díky tomu se vyhneme potřebě začátku hot-start a vyhneme se tomu, aby enzym reagoval s primery nebo templátem během přípravné fáze reakce. Pokud připravujete několik reakcí, měl by být obsah každé master směsi 110 % objemu potřebného pro všechny vaše vzorky (např. pro přípravu Master Směsi 2, uvedené níže, na 10 reakcí, připravte 275 μl směsi). Nadbytečný objem je určen na ztráty, k nimž dochází během pipetování. Příprava Master Směsi 1 Krok Akce 1) - Rozmrazte reagencie a skladujte je na ledu - Před přípravou reakcí všechny reagencie krátce promíchejte a odstřeďte 2) 3) Připravte 10x koncentrovaný roztok PCR primerů Chcete-li pro každý primer dosáhnout např. finální koncentrace 0,5 μm, měl by 10x konc. roztok obsahovat 5 μm od každého primeru. - Pro každou reakci o obsahu 50 μl přidejte součásti v níže uvedeném pořadí do sterilní reakční zkumavky na ledu: Reagencie Objem Konečná koncentrace Voda pro PCR Přidejte až 25 μl 200 μm (každé dntp) Směs PCR Nucleotide Mix 1 μl 0,1 0,6 μm (10mM) Forward Primer 5 μl 0,1 0,6 μm Reverse Primer 5 μl 0,1 500 ng a) Templátová DNA Variabilní Celkový objem 25 μl 4) Jemně promíchejte a krátce odstřeďte. a) např. lidská genomická DNA: 10 ng 500 ng; plasmatická DNA: 0,1 ng 15 ng

4 Příprava Master Směsi 2 Krok Akce 1) - Rozmrazte reagencie a skladujte je na ledu - Před přípravou reakcí všechny reagencie krátce promíchejte a odstřeďte 2) Do sterilní reakční zkumavky na ledu přidejte součásti v níže uvedeném pořadí: Reagencie Objem Konečná koncentrace Voda pro PCR 19,75 μl Pufr pro reakci PCR, 5 μl 1x (1,5 mm MgCl) 10x Taq DNA Polymeráza, 0,25 μl 1,25 U/reakce 5 U/ml Celkový objem 25 μl 3) Jemně promíchejte a krátce odstřeďte. PCR Termální profily byly vyvinuty pro Applied Biosystems GeneAmp PCR Systém Ostatní termální cyklery mohou vyžadovat jiné profily. Krok Akce 1) - Pro každou reakci zkombinujte 25 μl Master Směsi 1 a 25 μl Master Směsi 2 v tenkostěnné PCR zkumavce na ledu. - Jemně promíchejte směs tak, abyste docílili homogenní reakce, pak krátce odstřeďte, abyste sebrali i roztok na dně zkumavky. Okamžitě započněte termální cyklus. Neskladujte celé reakční směsi na ledu. 2) - Umístěte vzorky do termálního cykleru a k provedení PCR použijte kterýkoliv z níže uvedených termálních profilů. Termální profil A: pevný čas prodloužení Program Cykly Čas Teplota Iniciální denaturace 1x 2 min C a) Denaturace Temperování Prodlužování 25-30x s s 45 s 3 min Finální prodlužování 1x 7 min 72 C C a) C b) 72 C

5 Termální profil B: postupně se prodlužující čas extenze Tento postup zajišťuje vyšší výnos produktů amplifikace Program Cykly Čas Teplota Iniciální denaturace 1 2 min C a) Denaturace Temperování Prodlužování Denaturace Temperování Prodlužování s s 45 s 3 min s s 45 s 3 min +5 s cyklu na prodlužování pro každý násl.cyklus c) Finální prodlužování 1 7 min 72 C Chlazení Neomezený 4 C C a) C b) 72 C C a) C b) 72 C a) Teplota denaturalizace může variovat mezi 92 C a 95 C. Standardní teplota denaturalizace je 94 C. b) Optimální teplota temperování závisí na teplotě tání primerů a na experimentálním systému. U PCR produktů do 1 kb by se teplota prodlužování měla pohybovat okolo 72 C, u PCR produktů větších než 1 kb by se teplota prodlužování měla pohybovat okolo 68 C. c) Například cyklus č. 11 je o 5 s delší než cyklus 10, cyklus č. 12 je o 10 s delší než cyklus č. 10, cyklus č. 13 je o 15 s delší než cyklus č. 10, atd. 3) Po cyklování, pokud se vzorky nepoužijí hned, je skladujte zmrazené pro pozdější použití. Pro nejlepší výsledky učiňte následující: - zkontrolujte produkt PCR na agarózovém gelu s ohledem na velikost a specifičnost. Použijte příslušný marker velikosti. - Purifikujte PCR produkt pomocí High Pure PCR Product Purification Kit (např. před použitím tzv. uhnízděné ( nested ) PCR. 3. Dodatečné informace o tomto výrobku 3.1 Základní informace Deoxynukleotidy jsou nepostradatelnými složkami veškerých amplifikačních reakcí. Čistota těchto reagencií může ovlivnit jak výnos, tak citlivost PCR. Kvalita vámi používaných nukleotidů proto významně ovlivňuje vaše experimentální výsledky. Roche Applied Science využívá speciální výrobní proces k syntéze deoxynukleotidů vysoké kvality ( PCR-Grade ), které jsou prakticky prosty jakýchkoliv kontaminací (včetně dntp s modifikovanými bázemi, tetra- a pyrofosfátů). Takové kontaminace by mohly inhibovat (a často inhibují) amplifikační reakce. Purifikovány na nejvyšší možnou čistotu pomocí HPLC s vysokým rozlišením (> 99 % dntp, > 0,9 % dnpd), nabízejí deoxynukleotidy s kvalitou PCR-Grade bezpečný začátek

6 úspěšné amplifikační reakce. Deoxynukleotidy kvality PCR-Grade se dodávají jako soli sodíku ve vysoce purifikované vodě při ph 8,3, bez přidání aditiv či stabilizátorů. Vzhledem k tomu, že se většina amplifikačních reakcí provádí mezi ph 8 a 9, jsou deoxynukleotidy kvality PCR-Grade ve srovnání s deoxynukleotidy skladovanými při ph 7-7,5 odolnější vůči chemickému stresu, způsobenému posuny v ph. 3.2 Kontrola kvality Funkční testování v PCR Každá šarže PCR Nucleotide Mix je testována s ohledem na funkci v PCR pomocí amplifikace 500 bp fragmentu z 10pg λ-dna, za použití Taq DNA Polymerázy. Následně po amplifikaci (25 cyklů) se produkt PCR vystaví elektroforéze na 1% agarózovém gelu a poté nabarven ethidium bromidem. Jeden produkt amplifikace z 500 bp je vizualizován. Funkční testování v RT-PCR Každý PCR Nucleotide Mix je testován s ohledem na funkci v RT-PCR pomocí amplifikace 1848 bp fragmentu lidského dystrophin genu ze 100 bp RNA lidského kosterního svalu, za použití systému Titan One Tube RT-PCR System. Po reverzní transkripci a amplifikaci (35 cyklů) se produkt PCR vystaví elektroforéze na 1% agarózovém gelu, pak se obarví ethidium bromidem. Jeden produkt amplifikace z 1849 bp je vizualizován. Nepřítomnost kontaminující deoxyribonukleázy / nicking Každá šarže směsi PCR Nucleotide Mix se testuje na nepřítomnost deoxyribonukleázy (DNáza) a nicking pomocí inkubace 1 μg EcoRI/HindIII fragmentů DNA nebo 1 μg supercoiled DNA plasmidu pbr322, v tomto pořadí, s narůstajícím množstvím směsi PCR Nucleotide Mix o celkovém objemu 50 μl pufru SURE/Cut Buffer L po dobu 16 hodin při 37 C. Vzorky se poté vystaví elektroforéze na agarózovém gelu, pak se obarví ethidium bromidem. U objemu až 20 μl směsi PCR Nucleotide Mix se nepozoruje žádná degradace nebo změna vzorce, což indikuje nepřítomnost kontaminující DNázy a nicking. Nepřítomnost kontaminující ribonukleázy Každá šarže směsi PCR Nucleotide Mix se testuje na nepřítomnost ribonukleázy (RNáza) pomocí inkubace 4 μg MS2 RNA, s narůstajícím množstvím směsi PCR Nucleotide Mix o celkovém objemu 20 μl pufru SURE/Cut Buffer L po dobu 1 hodiny při 37 C. Vzorky se poté vystaví elektroforéze na agarózovém gelu, pak se obarví ethidium bromidem. U objemu až 20 μl směsi PCR Nucleotide Mix se nepozoruje žádná degradace MS2 RNA vzorce, což indikuje nepřítomnost kontaminující RNázy.

7 Seznam literatury: 4. Dodatečné informace 4.1 Ujednání ohledně textu Abychom sjednotili a zpřehlednili informace, používáme v této příručce následující textová ujednání: Textové ujednání Očíslované pokyny označené 1, 2 atd. Hvězdička Použití Kroky v postupu, které je třeba provádět v uvedeném pořadí. Označuje výrobek dostupný od Roche Applied Science Symboly Symboly se v této příručce používají k zvýraznění důležitých informací. Symbol Popis Informační poznámka: Dodatečná informace o daném tématu nebo postupu. Důležitá poznámka: Informace důležitá pro úspěšný průběh procesu nebo pro použití výrobku. 4.2 Informace k objednání Roche Applied Science nabízí velký výběr enzymů, reagencií a systémů pro PCR a pro testy RT-PCR. Kompletní přehled našich výrobků a podrobnější informace ohledně PCR a RT-PCR najdete na našich stránkách Application Special Interest Site na

8 Produkt Velikost balení Č. kat. Taq DNA Polymerase, dntpack (5 U/μL) Taq DNA Polymeráza dntpack (1 U/μL) FastStart Taq DNA Polymeráza, dntpack 100 U (80 reakcí) 500 U (2 x 250 U; 400 reakcí) 1000 U (4 x 250 U; 800 reakcí) 2500 U (10 x 250 U; 2000 reakcí) 5000 U (20 x 250 U; 4000 reakcí) 250 U (200 reakcí) 1000 U (4 x 250 U; 800 reakcí) 100 U (pro 50 reakcí) 500 U (2 x 250 U; 250 reakcí) 1000 U (4 x 250 U; 500 reakcí) 2500 U (10 x 250 U; 1250 reakcí) 5000 U (20 x 250 U; 2500 reakcí) Titan One Tube RT-PCR Systém 25 reakcí 100 reakcí PCR Nucleotide Mix PLUS 2 x 100 μl Uracil-DNA Glycosylase, heat-labile 100 U 500 U High Pure PCR Product Purification Kit Sada pro 50 čištění Sada pro 250 čištění Voda, PCR-grade 25 ml (25 zkumavek po 1 ml) 25 ml (1 zkumavka po 25 ml) 100 ml (4 zkumavky po 25 ml) Obchodní známky FASTSTART, HIGH PURE, TITAN, SURE/CUT a GENEAMP jsou obchodní známky Roche. Kontakt a podpora Máte-li dotazy, chcete řešit problémy, navrhnout zlepšení nebo nahlásit nové aplikace, navštivte laskavě naši online poradnu technické podpory na adrese: Chcete-li nám napsat dopis, fax nebo nebo zatelefonovat, navštivte naši domovskou stránku a vyberte svoji zemi. Zobrazí se kontaktní informace specifické pro Vaši zemi. Pro nalezení příbalových letáků a bezpečnostních listů k materiálům použijte funkci Product Search.