NÁVOD K POUŽITÍ PRO HER2 DNA QUANTIFICATION KIT

Transkript

1 IČ: 80 DIČ: CZ80 NÁVOD K POUŽITÍ PRO HER DNA QUANTIFICATION KIT

2 IČ: 80 DIČ: CZ80 OBSAH Návod k použití pro HER DNA QUANTIFICATION KIT.... Úvod.... Označení.... Rozsah použití.... Testovaná položka.... Stanovované veličiny.... Přístroje a zařízení.... Složení kitu.... Podmínky prostředí.... Postup.... Preanalýza.... Kontrola před analýzou.... Vlastní postup.... Kontrola v průběhu analýzy.... Bezpečnostní opatření.... Hodnocení Algoritmus hodnocení Kritéria zamítnutí... 0

3 IČ: 80 DIČ: CZ80 ÚVOD. OZNAČENÍ Vyšetření molekulárně genetických změn DNA metodou PCR s fluorescenčním měřením nárůstu amplikonu v reálném čase ve dvou fluorescenčních kanálech.. R OZSAH P OUŽITÍ DNA izolovaná z tkáně karcinomu prsu o dostatečné kvalitě (nedegradovaná, nemodifikovaná chemicky), u které lze očekávat amplifikaci genu HER a jejíž vyšetření má diagnostický, prognostický nebo prediktivní význam. Kit je standardizován pro použití DNA izolované z formalínem fixované a parafinu zalité (FFPE) tkáně karcinomu prsu.. TESTO VAN Á PO LO ŽKA Gen HER v lidské DNA, lokalizovaný v oblasti q-.. STANOVOV AN É V ELIČINY HER Test je určen k detekci amplifikace genu HER u karcinomu prsu pomocí tří duplexních reakcí srovnávajících gen HER s referenčními geny (GCS, DCK a EPN). Detekční limit metody je % obsah vysoce amplifikovaných buněk ( 0 kopií HER/jádro) ve vzorku.. P ŘÍSTRO JE A ZAŘÍ ZENÍ Pro řezání bloků a přípravu DNA: mikrotom, výhřevný blok, digestoř, vortex, centrifuga, spektrofotometr, nastavitelné pipety, plastový spotřební materiál Pro amplifikaci: termocyklér s měřením fluorescence v reálném čase (doporučeno použití RotorGene 000), vortex, minicentrifuga, chladící stojánky, nastavitelné pipety, pipetovací box, plastový spotřební materiál. S LO ŽENÍ KITU Kit obsahuje: 0 x PCR pufr mm MgCl 0mM dntp um FW primery ke genům HER, GCS, DCK, EPN um RW primery ke genům HER, GCS, DCK, EPN um proby ke genům HER, GCS, DCK, EPN Deionizovaná voda (DW) ThermoStar polymeráza (U/µl) o koncentraci 0 ng/µl (třeba naředit dle Tab. č. )

4 IČ: 80 DIČ: CZ80 Pozn.: Jako standard slouží vzorek prsní tkáně sfyziologickým počtem kopií genu HER a referenčních genů, naředěný do příslušných koncentrací. Do reakce je jako negativní kontrola použita voda. Pozn. : Všechny reagencie s výjimkou standardu jsou dodávány naředěné na požadované koncentrace.

5 IČ: 80 DIČ: CZ80 PO DMÍNK Y PRO ST Ř EDÍ Na pracovní prostředí nejsou kladeny žádné zvláštní podmínky odlišující se od běžných molekulárně biologických laboratorních podmínek (zavedení protikontaminačních opatření včetně fyzického oddělení prepcr a PCR/postPCR areálu). Biologický materiál zpracovávejte s použitím ochranných rukavic. Pro cycler musí být splněny podmínky teploty a vlhkosti stanovené výrobcem. Pro skladování parafinových bloků doporučujeme uchování při laboratorní teplotě, popř. v chladu. Parafinové řezy uchovávejte krátkodobě při laboratorní teplotě, dlouhodobě při -0 až -0 C Izolovanou i amplifikovanou DNA uchovávejte při -0 až -0 C.

6 IČ: 80 DIČ: CZ80 POSTUP. P R EAN ALÝ ZA Není součástí testu. Doporučujeme provést kontrolu amplifikovatelnosti DNA.. KO NTRO LA PŘED ANALÝ ZO U Kontrola dostatečného množství DNA (na základě spektrofotometrického nebo fluorescenčního odhadu koncentrace a čistoty, na základě výsledků předchozího PCR testování).. VLASTNÍ PO ST UP Používáme DNA s koncentrací 0 ng/µl (koncentrační řada standardů ředění zásobního roztoku standardu dle Tab. č.). Vyšetřovaný vzorek je třeba naředit na koncentraci 0 ng/µl. V přípravě mastermixů postupujeme dle Tab. č.. Připravíme tři mastermixy pro každou duplexní reakci (kontrolní geny GCS, DCK a EPN). Tab.č.: Složení jednotlivých mastermixů pro heteroduplexní qpcr detekce 0 x PCR pufr x mm MgCl mm 0mM dntp 00µM výsl.konc. HER GCS HER DCK HER EPN µm FW primer 0,µM 0,µl 0,µl 0,µl 0,µl 0,µl 0,µl µm RW primer 0,µM 0,µl 0,µl 0,µl 0,µl 0,µl 0,µl µm proba 0,µM 0,µl 0,µl 0,µl 0,µl 0,µl 0,µl DW ThermoStar pol. (U/µl) DNA celkový objem U (µl) REAKCE REAKCE REAKCE,µl µl 0,µl 0,µl 0,µl,0 µl,µl µl 0,µl 0,µl 0,µl,0 µl,µl µl 0,µl 0,µl 0,µl,0 µl

7 IČ: 80 DIČ: CZ80 Kit je navržen pro současné vyšetření 0 vzorků. Pro toto uspořádání je v kitu přiložené dostačující množství standardu o koncentraci 0 ng/µl. Tento standard je třeba naředit dle Tab. č. : Tab.č. : Ředění standardů Koncentrační Koncentrace po Konečná koncentrace v Počet kopií HER a řada standardů naředění [ng/µl] reakci [ng/µl] referenčních genů v reakci (neředí se, zásobní roztok standardu) Vlastní postup:. Do každé PCR zkumavky pipetujeme 0 µl příslušného mastermixu dle rozpisu uvedeného v Tab. č.. Přidáváme µl vzorku DNA (standard či vyšetřovaná DNA). V případě negativní kontroly k mastermixu pipetujeme µl DEPC vody. Zamícháme pipetováním špičkou tam a zpět. Uzavřeme zkumavky. Vložíme do cycleru (pozn.: Reakce byla standardizována pro RotorGene 000, v následujícím provedení. Pro použití jiného cycleru je nutná standardizace programu).. Zapneme HER program: C minut 0 cyklů ( C sekund, 0 C 0 sekund). Snímání v kanálu FAM a JOE/HEX při 0 C Tab č.: Rozpis vzorků

8 IČ: 80 DIČ: CZ80 Rozpis pro 0 testovaných vzorků v duplikátu, standardů o konečných koncentracích 0, 0, 0, 0, 0, 0 a 00 ng/reakci a negativní kontrolu NTC. (GCSmastermix je označen modře, DCK mastermix je označen červeně a EPN mastermix je označen zeleně): NTC GCS NTC EPN NTC DCK Vysvětlivky k Tab. č. : NTC negativní kontrola (0 µl mastermixu + µl DEPC vody) referenční DNA; konečná koncentrace 0 ng/reakci referenční DNA; konečná koncentrace 0 ng/reakci referenční DNA; konečná koncentrace 0 ng/reakci referenční DNA; konečná koncentrace 0 ng/reakci referenční DNA; konečná koncentrace 0 ng/reakci referenční DNA; konečná koncentrace 0 ng/reakci referenční DNA; konečná koncentrace 00 ng/reakci č.-0 vyšetřovaná DNA v konečné koncentraci 0 ng/reakci, pipetujeme v duplikátu 8

9 IČ: 80 DIČ: CZ80 KO NTRO LA V P R ŮBĚHU AN ALÝZY Průběžně kontrolujeme průběh vyšetření v těchto krocích: Kontrola amplifikovatelnosti DNA Je-li stanovena nízká koncentrace DNA anebo testovací PCR neprokázala amplifikovatelnost DNA, doporučujeme vyšetření neprovádět, vzorek nelze vyhodnotit. Negativní kontrola PCR reakce Do každé reakce je přidávána negativní kontrola (DEPC voda). Pokud je tato kontrola pozitivní, došlo ke kontaminaci v průběhu přípravy PCR reakce, případně jsou kontaminované PCR reagencie a je nutno analýzu provést znovu. Pozitivní kontrola DNA s fyziologickým počtem kopií genu HER (standard -). Problémy při PCR Problém Žádný amplikon po PCR, pozdní zdvih amplifikační křivky Amplifikace v negativní kontrole (voda místo DNA) Pravděpodobně způsobeno Špatná kvalita DNA, chyba při izolaci, chyba při PCR set up Kontaminace během přípravy PCR Možné řešení Opakujeme izolaci ze stejného vzorku nebo provedeme izolaci z nového vzorku. Hledání zdroje kontaminace: výměna levných reakčních komponent, vyčištění pracovní plochy přípravkem ničícím DNA, případné vyčištění pipet a opakování celého postupu PCR s přidáním no template control (voda místo DNA).. BEZPEČNOST NÍ OPATŘENÍ Rizikové látky: biologický materiál Každý biologický materiál je brán jako potenciálně infekční. Při práci je nutno používat vhodnou ochranu (jednorázové rukavice). Dále platí všeobecné zásady bezpečnosti práce v molekulárně biologické laboratoři. Reagencie chráníme před světlem, vystavujeme světlu jen na nejnutnější dobu

10 IČ: 80 DIČ: CZ80 HODNOCENÍ. ALGO RITMUS HODNOCENÍ Po skončení PCR provedeme vyhodnocení pomocí softwaru příslušného real-time cycléru. Sledujeme počet kopií HER (FAM filter comb -0) a jednotlivých referenčních genů (HEX/JOE filter comb 80). Ze standardů - o známém počtu kopií genu HER a referenčních genů (viz Tab. č.) vytvoříme kalibrační (standardizační) křivku, do níž vyneseme Ct hodnoty vyšetřovaných vzorků. Pomocí kalibrační křivky tak určíme počet kopií jednotlivých genů u vyšetřovaných vzorků. Hodnotíme míru shody u jednotlivých duplikátů. Pokud není odchylka větší než 0%, provedeme průměr výsledků duplikátů. V případě neshody duplikátů opakujeme vyšetření. Pro každý vyšetřovaný vzorek vypočítáme podíl počtu kopií HER a jednotlivých referenčních genů. Získáme tak podíly pro každý vyšetřovaný vzorek vyhodnotíme jako HER amplifikovaný v případě, že je podíl HER/referenční gen, alespoň u referenčních genů vyhodnotíme jako HER neamplifikovaný (fyziologický) v případě, že je podíl HER/referenční gen <, alespoň u referenčních genů Pokud byl hodnotitelná pouze jedna nebo žádná z duplexních PCR reakcí, není vzorek hodnotitelný a je nutné jej opakovat. Pokud je v negativní kontrole NTC Ct signál HEX/JOE nižší než, je běh kontaminován a neplatný. Pokud je hodnota Ct v kanálu HEX/JOE a/nebo FAM vyšší než nebo je nulová nebo pokud je počet kopií HER nebo referenčního genu menší než 00 kopií/reakci není vzorek analyzovatelný.. K RITÉRI A ZAMÍ TNUTÍ Pozitivní výsledky zamítáme pro celý běh, pokud se objeví pozitivní signál i u no template kontroly (voda místo DNA). Výsledek uzavíráme jako nelze, pokud u konkrétního vzorku chybí signál ve FAM nebo JOE/HEX kanálu. 0