Metody studia exprese mrna. jádro a genová exprese 2007

Transkript

1 Metody studia exprese mrna Buněčné jádro a genová exprese 2007

2 Aktivita genu je primárn ě vyjád ř ena jeho transkripcí-prvním krokem vedoucím k syntéze kódovaného proteinu.

3 Cíle metod Ur č ení mno ž ství cílové mrna ur č ení druh ů mrna v daném biologickém vzorku templátem in vivo syntetizovaná mrna ur č ení stability mrna ur č ení translatovatelnosti mrna templátem in vitro syntetizovaná a značená RNA

4 Metody zaměřené na stanovení množství individuálních mrna Northern a Dot blot RT-PCR DNA microarrays a chips ribonuclease protection assays (RPA) in situ hybridization

5 princip Dot blot, Northern blot hybridizace znač ené próby (RNA nebo ssdna komplementární k targetu) se vzorkem o neznámém slož ení (totální RNA, polya RNA), který je či není před detekcí separován a pak přenesen a fixován na nylonovou membránu + výhody tradiční robustní metoda, nezávislost na jakýchkoli in vitro enzymatických reakcích, nevyžaduje kompletní znalost sekvence próby, možnost detekce několika splicingových variant, možnost detekce transkript ů více gen ů z jedné genové rodiny, možnost využití komerčních Northern blotů - nevýhody potřeba velkého počátečního množ ství RNA (chybí amplifikační krok), časov ě náročná, menší sensitivita, použití radioaktivního značení

6 RT-PCR princip amplifikace sekvence specifické pro target, kdy templátem je reverzn ě transkribovaná RNA (ve form ě cdna) typy standardní-umo žň uje zachytit p ř ítomnost specifické mrna ve vzorku semikvantitativní-odebírání frakcí, ředění RNA, různý počet cyklů kvantitativní-kompetitivní, Real Time

7 Reverzní transkripce Templát- 10ng-1µg totální RNA, nebo výrazn ě nižší množství polya RNA Enzym- reverzní transkriptáza -virového původu, ideáln ě bez RNAzové aktivity, relativn ě termostabilní, ale tepeln ě inaktivovatelná, málo citlivá k nejrůznějším inhibitorů m, AMV (Avian Myeloblastosis Virus), MuMLV (murine Moloney Leukemia Virus) Primery oligodt, ukotvené (anchored oligodt), upravené oligodt náhodné hexamery genov ě specifické primery PCR Enzym- Hot start DNA polymeráza (blokovaná protilátkou nebo chemickým crosslinkem) Primery- specifické pro mrna (na exon-intronovém p ř echodu)

8 princip Kompetitivní RT-PCR přidání známého množství kompetitoru k zkoumanému vzorku kompetitory-ideáln ě rezistentní vůči nukleázám, RNA, DNA, stejná sekvence rozeznávaná primery specifickými pro target, jiná velikost, stejná amplifikační účinnost + výhody absolutní kvantifikace, možnost standardizace - nevýhody náročnější příprava kompetitor ů, nutnost elektroforézy

9 Real-Time RT-PCR princip detekce množství amplifikované DNA v reálném čase pomocí detekce nárůstu fluorescence Baseline ΔRn

10 Real-Time RT-PCR + - výhody rychlost, senzitivita a velké dynamické rozpě tí, možnost zpracování většího množství vzork ů najednou (při využití robota a ž 384 vzork ů), malé amplikony-možnost práce s částečn ě degradovanou RNA nevýhody relativn ě vysoká cena některých chemikálií, analýza maximáln ě několika target ů najednou, nutnost přesného pipetování, variabilita daná různou účinnosti PCR

11 Úskalí Random primers Gene-specific primers

12 Metody detekce Fluorescen č ní Interkala č ní č inidlo + - SYBR green I univerzální, senzitivní př ístup detekce veškerých (i nespecifických) dsdna nutnost (tm) analýzy Fluorescen č ní próby + - hydrolyzační =TaqMan hybridizační próby -Molecular Beacons, Scorpion probes detekce specifického amplikonu, možnost multiplexu PCR-detekce několika transkript ů najednou mírn ě nižší senzitivita, vyšší cena (genov ě specifické), komplikovanější design optimálního primer-probe setu,

13 Typy Real Time RT-PCR prób

14 Kvantifikace I Metoda standardní k ř ivky známé množství standardu (RNA, DNA) je seriáln ě ředěno-lze pak odvodit rovnici přiřazující určitou Ct k původnímu množství targetu Log10(množství targetu)=-směrnice(x)+m umožňuje i absolutní kvantifikaci, umožňuje kontrolu nad průběhem reakce a porovnání jednotlivých runů

15 Kvantifikace II Metoda ddct (komparativní) + - Porovnání Ct mezi targetem a kalibrátorem není nutné opakovat při každém experimentu nemožnost kontroly účinnosti reakce Směrnice by měla být < 0.1.

16 Affymetrix-GeneChip DNA chip syntéza a ž 1,3 miliónu oligonukleotid ů in situ N kolik olig reprezentuje jeden gen, další set olig ě obsahuje mismatch pro testování specificity hybridizace

17 Microarray Příprava microarray Komerční array Array printing PCR produkty cdna knihovna oligonukleotidy Příprava próby izolace RNA označení cdna/rna 2typy modifikovaných nukleotidů smíchání obou prób denaturace aplikace na array Hybridizace Detekce signálu Úprava dat, statistická analýza

18 Značení próby bez amplifikace: Microarrays přímé značení s Cy3, Cy5 modifikovaným dutp přímé značení s aminoallyl dutp (chemický coupling Cy3, Cy5) s amplifikací/postamplifikací: trankripce in vitro s biotin-utp (předchází cdna syntéza s oligodt-t7 primerem) TSA metoda (předchází cdna syntéza s fluorescein a biotin-dutp, protilátka s HRP navá e barvu) ž dendrimer technologie (3DNA Array 50 and 3DNA submicro )

19

20 Metody zaměřené na stanovení neznámých mrna Diferenciální display Subtraktivní hybridizace SAGE EST Nevýhoda-nutnost sekvenace

21 Diferenciální display Princip-porovnání PCR fragment ů vzniklých z cdna připravené z testovaného a kontrolního vzorku s využití anchored oligodt a náhodných dekamer ů jako primerů

22 Subtraktivní hybridizace Princip-označená cdna vzorku je zhybridizována s kontrolní mrna, pouze cdna molekuly, které nenašly hybridizačního partnera jsou izolovány na hydroxylapatitové kolon ě (nebo jinak) a identifikovány

23 SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) Anchoring enzyme-nlaiii, rozeznává sekvenci CATG, každých 256 bp Tagging enzyme- BsmFI, štěpí 14bp za rozeznávanou sekvencí

24 SAGE + Výhody Není potřeba znát předem analyzované sekvence-lze objevovat nové geny (metodou RAST-PCR) Kumulace dat-čím více kolonií otestováno, tím je analýza přesnější - Nevýhody Potřeba kolem 5μg polya RNA Časov ě a finančn ě náročné ( sekvenačních reakcí atd.) Technické problémy-gen nemusí mít NlaIII místo, dochází k sekvenačním chybám, tag nemusí být dostatečn ě specifický pro 1 gen, tagy můžou být různ ě dlouhé, 1gen může mít i dva tagy- alternativní polyadenylační místo