Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ PŘÍTOMNOSTI GMO METODOU PCR
|
|
- Miloslava Šmídová
- před 8 lety
- Počet zobrazení:
Transkript
1 Národní referenční laboratoř Strana 1 1 Rozsah a účel STANOVENÍ PŘÍTOMNOSTI GMO METODOU PCR Postup slouží k detekci přítomnosti genetických modifikací/geneticky modifikovaných organismů ve vzorcích krmiv, osiv a kompletních krmných směsí molekulárně biologickou metodou PCR (polymerázová řetězová reakce). Smyslem zkoušek je zjistit, zda zkoumaný vzorek obsahuje GMO či genetickou modifikaci, případně o kterou modifikaci či modifikovanou odrůdu se jedná. 2 Princip Základem metody je izolace DNA z homogenizovaného vzorku, amplifikace hledaného úseku DNA (je-li ve vzorku přítomen) pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) a vyhodnocení případných amplifikovaných fragmentů pomocí elektroforézy na agarózovém gelu. 3 Chemikálie Používají se chemikálie analytické čistoty nebo označené pro molekulární biologii. Kity pro izolaci DNA 3.1 NucleoSpin Food, výrobce Macherey Nagel, kit pro izolaci genomické DNA z potravin a krmiv Lysis Buffer CF Buffer C Buffer C Wash buffer CQW Wash buffer C5 (koncentrát) Elution buffer CE NucleoSpin Food Columns (plus Collection Tubes) Proteinase K (lyofilizát) Proteinase buffer PB Collection Tubes (2 ml).
2 Národní referenční laboratoř Strana GenElute Plant Genomic DNA Miniprep Kit, výrobce Sigma Aldrich, kit pro izolaci genomické DNA z rostlinného materiálu Lysis solution Part A Lysis solution Part B Precipitacion Solution Binding Solution Column Preparation Solution Wash Solution Concentrate Elution Solution GenElute Filtration Columns in Tubes GenElute Nucleic Acid Binding Columns in Tubes Collection Tubes, 2,0 ml. Kity pro amplifikaci DNA 3.3 REDTaq ReadyMix PCR Reaction Mix with MgCl 2, výrobce Sigma Aldrich, univerzální reakční směs pro PCR (dále REDTaq) REDTaq ReadyMix PCR Reaction Mix with MgCl PCR voda. 3.4 REDExtract N-Amp Plant PCR Kits, výrobce Sigma Aldrich, univerzální kit pro PCR (dále REDEx) Extraction solution Dilution solution REDExtract N Amp PCR Ready Mix. 3.5 Další potřebné chemikálie nedodávané v rámci kitů Voda vhodná pro PCR Voda (deionizovaná, demineralizovaná nebo destilovaná) Amplifikační primery.
3 Národní referenční laboratoř Strana Ribonuklease A 10 mg/ml (DNase and protease free) RNáza A Agaróza pro molekulární biologii Etanol denaturovaný 70%, pro čištění povrchů Etanol (95 100)% pro UV spektroskopii M octan sodný (ph 5,2) Trihydrát octanu sodného - CH 3 COONa.3H 2 O Ledová kyselina octová Na 2 EDTA disodná sůl kyseliny ethylendiamintetraoctové Trizma base Hydroxid sodný, NaOH, roztok, c(naoh) = 1 mol/l. Příprava: 10 g NaOH se rozpustí ve vodě (3.5.2), po vytemperování se doplní na výsledný objem 250ml v odměrné baňce Bromfenolová modř Ethidiumbromid zásobní roztok, 1% Elektroforetický marker pro amplifikáty (např. EZ LoadTM Molecular Ruler 50 bp PCR Biorad) Elektroforetický hmotnostní marker pro genomovou DNA (např. EZ LoadTM Molecular Ruler Precision Mass, Biorad) Dekontaminační roztok (např. Instruzyme, Steridine,ad.) Chlornan sodný, (0,5 1)% roztok. 4 Přístroje a pomůcky 1 Laboratorní mlýn. 2 Třecí miska s tloučkem. 3 Váhy s přesností 0,01 g. 4 Analytické váhy. 5 Vodní lázeň. 6 Centrifuga. 7 Vortex. 8 Nízkoobjemový spektrofotometr (vlnové délky 230 nm, 260 nm, 280 nm).
4 Národní referenční laboratoř Strana 4 9 Laminární box. 10 Minishaker. 11 Termální cykler. 12 ph metr. 13 Elektromagnetické míchadlo s ohřevem. 14 Elektroforetická vana, zdroj napětí, elektroforetické hřebínky. 15 Fotodokumentační zařízení se softwarem. 16 Transiluminátor. 17 Přenosná UV lampa. 18 Automatické pipety s nastavitelnými objemy (0,1 1000) µl a špičky s filtrem i bez filtru. 19 Plastové zkumavky o objemu 0,20 ml, 2 ml, 50 ml. 20 Horkovzdušná sušárna. 21 Vysavač. 22 Výrobník ledu. 23 Lednice 24 Mrazicí box 20 C, 80 C pro dlouhodobé skladování. 25 Latexové rukavice bezpudrové, laboratorní sklo, obalový materiál, svářečka fólií, stojánky na zkumavky, odpadní nádoby, parafilm, nádoba na uchování ledu. Poznámky 1 Sterilizace a dekontaminace se provádí dle charakteru materiálu buď tepelně (v sušárně 1 h při ( ) C) nebo chemicky (např. 70% etanolem, (0,5 1)% chlornanem sodným apod.). 5 Pracovní postup 5.1 Příprava amplifikačních primerů Primery se rozpustí, ředí a rozdělí do potřebných množství následujícím způsobem. 1 Zásobní roztok o koncentraci 100 µm Do zkumavky s primerem v podobě prášku na dně, který nemusí být viditelný, se přidá voda (3.5.1) v množství, které uvádí výrobce. Jemným pipetováním se promíchá. Tím se získá
5 Národní referenční laboratoř Strana 5 zásobní roztok, který se rozpipetuje po 50 µl do zkumavek o objemu (0,5 0,6) ml. Pokud se rozdělí zásobní roztok v jiných množstvích, uvede se objem na zkumavku. Zkumavky s primery se zamrazí a uchovávají při teplotě 20 C. 2 Pracovní roztok o koncentraci 20 µm Do jedné zkumavky zásobního roztoku se přidá čtyřnásobný objem vody (3.5.1). Tím se získá pracovní roztok. Rozdělí se po 15 µl a zamrazí se na 20 C. Do reakční směsi PCR se přidávají pracovní roztoky primerů. 5.2 Příprava 3M octanu sodného Naváží se 40,81 g trihydrátu octanu sodného (3.5.9) na 100 ml vody (3.5.2). Navážka se vmíchá do 80 ml vody (3.5.2). Ledovou kyselinou octovou (3.5.10) se upraví ph na 5,2. Potom se doplní vodou (3.5.2) do 100 ml. Sterilizuje se 15 min při 121 C. 5.3 Příprava zásobního roztoku 50 TAE Příprava 0,5 M zásobního roztoku EDTA Naváží se 186,1 g Na 2 EDTA (3.5.11) na 1000 ml vody (3.5.2). Navážka se vmíchá do ( ) ml vody (3.5.2). ph se upraví na 8,5 přidáním NaOH. Potom se doplní vodou (3.5.2) do objemu 1000 ml. Přefiltruje se přes filtrační papír vysoké hustoty. Roztok se skladuje do spotřebování při laboratorní teplotě. Příprava 2M Tris Naváží se 242 g Trizma base (3.5.12) a rozpustí v 650 ml vody (3.5.2). Přidá se 57,1 ml ledové kyseliny octové (3.5.10) a 100 ml předem připraveného 0,5M zásobního roztoku EDTA (viz výše). Doplní se vodou (3.5.2) do celkového objemu 1000 ml. Neautoklávuje se. Uchovává se v těsně uzavřené láhvi při laboratorní teplotě do spotřebování. Příprava pracovního roztoku 1 TAE pro elektroforézu Odměří se 20 ml zásobního roztoku 50 TAE (viz. výše), nalije do odměrného válce o objemu 1000 ml a doplní vodou (3.5.2) do objemu 1000 ml. 5.4 Příprava pracovního roztoku ethidiumbromidu Zásobní roztok ethidiumbromidu (3.5.15) se dodává komerčně. Pracovní roztok se získá zředěním zásobního roztoku 10 vodou (3.5.2). Uchovává se v chladničce.
6 Národní referenční laboratoř Strana Příprava agarózového gelu Používá se 0,8% gel pro stanovení kvality vyizolované DNA (0,64 g agarózy a 80 ml 1 TAE pufru) a 2% gel pro hodnocení amplifikačních fragmentů (1,6 g agarózy a 80 ml 1 TAE pufru). Do Erlenmayerovy baňky se naváží dané množství práškové agarózy s přesností na 0,1 g a přidá 80 ml pracovního 1 TAE pufru (viz 5.3). Vaří se při ( ) C na elektromagnetickém míchadle asi (15 20) min, až se roztok úplně vyčeří a vzduchové bubliny vymizí i po krouživém zamíchání. Zatím se připraví nalévací vana a vhodný hřebínek. Po mírném zchladnutí se přidá 10 µl pracovního roztoku ethidiumbromidu (viz 5.4) (interkalační barvivo sloužící ke zviditelnění DNA v gelu) a míchá se 1 min. Poté se vyjme míchadélko a agaróza se nalije do vany s hřebínkem. Nechá se přibližně 15 min zchladnout při laboratorní teplotě. Pro dokonalé ztuhnutí se poté gel umístí na 30 min do lednice. Asi po (20 30) min, v závislosti na teplotě prostředí, lze opatrně vyjmout hřebínek a přenést gel z nalévací vany do elektroforetické vany s pracovním roztokem TAE pufru. Je možné do nalévací vany vložit 2 hřebínky tak, aby se po rozkrojení získaly dva menší gely. 5.6 Úprava a homogenizace vzorku Veškeré úkony se vzorkem i při přípravě chemikálií se vykonávají v bezpudrových latexových rukavicích. Dbá se na průběžnou dekontaminaci pracovních ploch a prostorů UV zářením a dekontaminačním roztokem, 70% etanolem nebo (0,5 1)% roztokem chlornanu sodného. Homogenizace vzorku V případě zelených rostlin se rostlinný materiál po dodání do laboratoře zmrazí na 80 C. Poté se roztírá tloučkem v třecí misce za přítomnosti tekutého dusíku do podoby jemného prášku. Pokud se vzorek okamžitě nezpracovává, zamrazí se na 80 C. Vzorek mořeného osiva nebo sadby se před mletím promyje vlažnou vodou s přídavkem detergentu a nechá se uschnout na vzduchu nebo v sušárně při asi 40 C. Odstraní se příměsi cizích semen. Vzorek krmiva se mele, pokud není krmivo ve formě šrotu. Celý vzorek krmiva nebo osiva se mele ve vhodném typu mlýnku. Doba mletí a rychlost rotace se uzpůsobí množství a povaze vzorku. Je nutné dbát na to, aby se vzorek při mletí nezahřál nad 40 C, aby nedošlo ke znehodnocení DNA. Po ukončení mletí se nádoby a nože omyjí vodou a na 15 min ponoří do dekontaminačního roztoku. Potom se opláchnou pitnou vodou a vysuší 20 min v horkovzdušné sušárně při 100 C. Jestliže množství vzorku mnohonásobně překračuje kapacitu sběrné misky mlýnku, vzorek se v plastové misce důkladně promíchá, nakvartuje se a k mletí se odebere hmotnost nejméně 1000 semen. Před mletím prvního vzorku se omyjí dekontaminačním roztokem a 70% etanolem plochy stýkající se se vzorkem. Dále se po domletí každého vzorku všechny části mlýnku a povrchy
7 Národní referenční laboratoř Strana 7 dotýkající se vzorku opláchnou teplou vodou, roztokem chlornanu sodného a znovu pitnou vodou, případně ještě 70% etanolem a osuší čistým savým materiálem. 5.7 Navážení vzorku Zkušební vzorky se navažují s přesností na 0,01 g. Standardy a kontroly obsahující směs GM-negativního a GM-pozitivního materiálu se navažují na analytických vahách s přesností na 0,001 g. Navažuje se do předem označených zkumavek vhodných pro izolaci DNA, které byly vysterilizovány 1 h při ( ) C. Během vážení se dodržují zásady bezkontaminační manipulace. 5.8 Izolace DNA Obecné zásady pro izolaci DNA Během celého postupu je naprosto nezbytné pečlivé zacházení se vzorky, aby se zamezilo kontaminaci jednoho vzorku stopami druhého, např. mikrokapénkami DNA, které se mohou uvolnit při pipetování a otvírání zkumavek, dotekem víček zkumavek jedné po druhé apod. Proto je třeba přizpůsobit veškeré operace prevenci kontaminace. - Vyhnout se nevhodným pohybům a dotekům, všechny operace vykonávat v rukavicích a rukavice po každém kroku nebo kdykoli je třeba i uvnitř kroků vyměnit, nebo alespoň dekontaminovat opláchnutím v dekontaminačním roztoku (70% etanol nebo roztok chlornanu sodného) a vodou (3.5.2). - Používat sterilní materiál je samozřejmé. - Dojde-li k ukápnutí tekutiny, která obsahuje nebo by mohla obsahovat DNA, je nutno ji okamžitě vysát vatou a potřísněný povrch otřít vatou s dekontaminačním roztokem 70% etanolem nebo roztokem chlornanu sodného. Vata se vhodí do sáčku s DNA odpadem. - Izolace DNA se provádí ve dvou paralelních stanoveních jednoho vzorku. - Do každého běhu izolace DNA, a to vzorků i standardů, je nutno zařadit tzv. blank, kontrola izolace, tj. slepý vzorek bez rostlinného materiálu, který dále postoupí PCRdetekci příslušného vnitřního genu pro ověření čistoty reagencií a faktu, že během izolace nedošlo ke kontaminaci vzorků NucleoSpin Food, výrobce Macherey Nagel Před začátkem vlastní izolace DNA je nutno připravit tyto roztoky: Pufr C4 Do tuby s obsahem pufru C3 (3.1.3) se kvantitativně převede celý obsah tuby obsahující pufr C2 (3.1.2) a dobře promíchá. Výsledný pufr C4 je stabilní po dobu 1 roku uskladněný při laboratorní teplotě. Pro dokonalejší rozpuštění obou komponent se doporučuje 5min inkubace při 45 C. Pokud se kit používá pouze příležitostně, je možné smíchat malé množství pufru C3 a C2 v poměru (1 : 4).
8 Národní referenční laboratoř Strana 8 Pufr C5 Ke koncentrátu pufru C5 (3.1.5) se přidá etanol (3.5.7) v množství uvedeném na lahvičce pufru. Po zředění se označí přidání etanolu. Takto upravený pufr lze uchovávat při laboratorní teplotě 1 rok. Proteináza K K lyofilizované proteináze K (3.1.8) se přidá množství proteinázového pufru (3.1.9) uvedené na jejím obalu. Roztok proteinázy K je stabilní 6 měsíců při 20 C. Izolace DNA Pracovní nástroje, pomůcky i prostor se dekontaminují od jakýchkoli molekul DNA otřením povrchů dekontaminačním roztokem, 70% etanolem a UV zářením po dobu 30 min. Vodní lázeň se předehřeje na teplotu 65 C. Lyzační pufr CF (3.1.1) se předehřeje na 65 C a do dvou 2ml zkumavek se naváží 200 mg zhomogenizovaného vzorku. Buněčná lyze Ke vzorku se přidá 550 µl lyzačního pufru CF (3.1.1), dobře se promíchá na vortexu (15 s), přidá 10 µl proteinázy K a 10 µl RNázy A (3.5.4) a opět se promíchá na vortexu (2 3) s. Inkubuje se 30 min při 65 C. Poté se směs centrifuguje po dobu 10 min (> g), až se buněčné zbytky usadí. Příprava podmínek vázání DNA Převede se 300 µl čistého supernatantu z kroku Buněčná lyze do nové 2ml zkumavky. Přidá se 300 µl pufru C4 a 200 µl etanolu (3.5.7) a vortexuje se 30 s. Vázání DNA na silikagel Tuba NucleoSpin se umístí do nové 2ml centrifugační zkumavky a přidá se 750 µl směsi z předchozího kroku. Centrifuguje se 1 min při g. Proteklá tekutina se vylije. Promývání a sušení První promytí: Pipetuje se 400 µl pufru CQW (3.1.4) do NucleoSpin tuby. Centrifuguje se 1 min při g. Proteklá tekutina se vylije. Druhé promytí: Pipetuje se 700 µl pufru C5 do NucleoSpin tuby. Centrifuguje se 1 min při g. Proteklá tekutina se vylije. Třetí promytí: Pipetuje se dalších 200 µl pufru C5 do NucleoSpin tuby. Centrifuguje se 2 min při g, aby se úplně odstranil pufr C5.
9 Národní referenční laboratoř Strana 9 Vymytí DNA eluce Předehřeje se eluční pufr CE (3.1.6) na 70 C. Tuba NucleoSpin se umístí do nové centrifugační zkumavky o objemu 1,5 ml. Na membránu v NucleoSpin tubě se pipetuje 100 µl předehřátého elučního pufru CE. Inkubuje se 5 min při pokojové teplotě, a poté se centrifuguje 1 min při g, aby se uvolnila DNA. Eluát obsahuje čistou genomovou DNA. Pro krátkodobé skladování se uchovává při teplotě (2 8) C, pro dlouhodobé při 20 C GenElute Plant Genomic DNA Miniprep Kit, výrobce Sigma Aldrich Ověří se, zda v chemikáliích není sraženina. Pokud se sraženina objeví u kterékoli reagencie, zahřeje se na (55 65) C, dokud se nerozpustí. Před použitím se nechá zchladnout na laboratorní teplotu. Wash Solution: Wash Solution Concentrate (3.2.6) se zředí etanolem (3.5.7) v množství uvedeném v kitu. Po zředění se vyznačí přidání etanolu. Izolace DNA Připraví se pracovní plocha, pracovní nástroje, pomůcky i prostor se dekontaminují od molekul DNA otřením povrchů dekontaminačním roztokem, 70% etanolem a UV zářením po dobu 30 min. Vodní lázeň se předehřeje na teplotu 65 C. Naváží se 2 60 mg homogenizovaného vzorku, a to každá dávka do označené 2ml zkumavky. Lýze buněk Do zkumavky se přidá 350 µl Lysis Solution (Part A)(3.2.1) a 50 µl Lysis Solution (Part B) (3.2.2). Po přidání Part B se vytvoří bílá sraženina. Suspenze se pečlivě promíchá na vortexu asi 15 s. Štěpení RNAázou: K lyzační směsi se těsně před inkubací přidá 10 µl RNAázy (3.5.4) a vortexuje (2 3) s. Směs se inkubuje 10 min při 65 C s občasným převrácením zkumavek, aby se rozpustila sraženina. Vysrážení zbytků Ke směsi se přidá 130 µl Precipitation Solution (3.2.3), směs se dobře zamíchá převracením a vloží se na 5 min na led. Potom se směs centrifuguje 5 min při ( ) g. Buněčné zbytky, bílkoviny a polysacharidy zůstanou v peletu. Filtrace zbytků Vzniklý supernatant se pečlivě odpipetuje do filtrační kolony GenElute (modrá s 2ml sběrnou zkumavkou). Centrifuguje se 1 min při maximální rychlosti (14000 ot.). Tím se odstraní
10 Národní referenční laboratoř Strana 10 buněčné zbytky, které zůstaly po vysrážení zbytků. Potom se odstraní filtrační kolona (modrá část) a sběrná zkumavka se uchová. Příprava pro navázání K proteklé tekutině z předchozího kroku se přidá 700 µl Binding Solution (3.2.4). Uzavře se a pečlivě promíchá převracením. Příprava vázací kolony Kolona GenElute Miniprep Binding Column (s červeným kroužkem) se vloží do připravené nové mikrocentrifugační zkumavky, pokud tam již není vložena. Do každé kolony se přidá 500 µl Column Preparation Solution (3.2.5) a centrifuguje se (30 60) s při g. Proteklá tekutina se vylije. Přidání lyzátu Opatrně se pipetuje 700 µl směsi z kroku Příprava pro navázání do kolony připravené v předchozím kroku. Centrifuguje se 1 min při maximální rychlosti. Proteklá tekutina se vylije a zachová se sběrná zkumavka. Kolona se vrátí do sběrné zkumavky. Do kolony se pipetuje zbylý lyzát z kroku Příprava pro navázání a opakuje se centrifugace. Proteklá tekutina se odstraní se sběrnou zkumavkou. Kolona se vloží do nové sběrné zkumavky. Promývání První promytí kolony: Do vázací kolony v nové 2ml zkumavce se přidá 500 µl zředěného Wash Solution. Centrifuguje se 1 min při maximální rychlosti. Vylije se prošlá tekutina a uchová se sběrná zkumavka. Druhé promytí kolony: Do kolony se nepipetuje dalších 500 µl zředěného Wash Solution a centrifuguje se při maximální rychlosti 3 min, aby se kolona vysušila. Nedovolíme, aby se prošlá tekutina dotkla kolony. Eluce DNA Vázací kolona se přenese do nové 2ml sběrné zkumavky. Na membránu se pipetuje 100 µl na 65 C předehřátého Elution Solution (3.2.7) a centrifuguje se 1 min při maximální rychlosti. Eluát se sebere do sběrné zkumavky. Eluát obsahuje čistou genomovou DNA. Pro krátkodobé skladování se uchovává při teplotě (2 8) C, pro dlouhodobé při 20 C. Precipitace DNA Pokud je vyizolovaná DNA znečištěna, provádí se ze získaného eluátu etanolová precipitace DNA.
11 Národní referenční laboratoř Strana 11 Do roztoku DNA se přidá 1/10 objemu octanu sodného (3.5.8). Poklepáním na zkumavku se promísí. Etanol (3.5.7) se dá vychladit do mrazicího boxu. Do DNA s octanem sodným se přidá trojnásobné množství vychlazeného etanolu. Zkumavka se nechá v mrazicím boxu při 20 C přes noc, nebo 30 min při 80 C. Centrifuguje se 20 min při ot/min. Obsah zkumavky se vylije. K peletu se přidá 500 µl etanolu (3.5.6) na promytí, kývavým pohybem se pelet odlepí a rozpustí. Poté se centrifuguje 10 min při ot/min. Zkumavka se vylije a nechá otevřená, aby etanol vyprchal. Nesmí se přesušit. Pelet DNA, který zůstane na spodu zkumavky, se rozpustí (vortexuje se při nízkých otáčkách nebo se ručně poklepe) v 50 µl vody (3.5.1), nebo TE pufru (viz. 5.3). Měření koncentrace a kvality vyizolované DNA Důležitým krokem po vyizolování DNA je orientační spektrofotometrické stanovení její koncentrace, případně dalších příměsí a zjištění její kvality celistvosti pomocí gelové elektroforézy na 0,8% agarózovém gelu. Spektrofotometrické měření koncentrace a poměry čistoty vyextrahovaného vzorku Měření při vlnových délkách 230 nm, 260 nm a 280 nm umožní stanovení koncentrace získané DNA i hodnocení čistoty vzorku. Koncentrace nukleových kyselin se počítá na základě absorbance vzorku při 260 nm. Předpokladem pro její správné určení je čistota vzorku. Stupeň čistoty nukleových kyselin se stanovuje z poměru absorbancí naměřených při 260 nm a 280 nm a 260 nm a 230 nm. Nukleové kyseliny absorbují UV záření s maximem absorbance v oblasti vlnové délky okolo 260 nm, zatímco proteiny v oblasti okolo 280 nm. 260/280 Při poměru hodnot A260/280 ~ 1,8 se považuje vzorek vyextrahované DNA za čistý. Hodnoty poměru absorbancí 260/280 se nejčastěji pohybují v rozmezí (1,7 2,0). Nízké hodnoty tohoto poměru většinou indikují, že je vzorek kontaminovaný proteiny nebo reagenciemi, jako je např. fenol, nebo že vzorek obsahuje nízkou koncentraci DNA (< 10 ng/µl). Vysoké hodnoty problém neindikují, protože vyextrahovaná DNA může krom dvouvláknové DNA obsahovat DNA jednovláknovou, volné nukleotidy a RNA. Jedná se o látky, které absorbují při 260 nm. 260/230 Hodnoty 260/230 pro čisté nukleové kyseliny bývají většinou vyšší než hodnoty 280/260, a to v rozmezí (2,0-2,2). Hodnoty odlišující se od tohoto rozmezí indikují buď problém se vzorkem, nebo s extrakčním postupem, proto je důležité brát v úvahu jak hodnoty nižší než 2,0, tak i hodnoty nad 2,2. Nízké hodnoty uvedeného poměru mohou být způsobeny přítomností sacharidů, zbytkového fenolu z izolace DNA a zbytků guadininu, který je součástí izolačních kolonek. Vysoké hodnoty tohoto poměru mohou být způsobeny špatným postupem měření koncentrace a kvality.
12 Národní referenční laboratoř Strana 12 Vlastní měření Koncentrace DNA se měří proti slepému vzorku, kterým je roztok, v němž je DNA rozpuštěná. Ve většině případů se tedy jedná o eluční pufr použitého izolačního kitu. Použijí se 2 µl vzorku. Každý vzorek se měří dvakrát. Z naměřených hodnot se vypočítá průměr. Pro následnou PCR zpravidla vyhovuje koncentrace (5 10) ng/µl templátové DNA. Pokud je její koncentrace vyšší, je třeba ji na tuto hodnotu naředit vodou vhodnou pro PCR podle níže uvedeného vztahu. Snížením koncentrace DNA se sníží i koncentrace případných inhibitorů reakce, které mohou být ve vzorku přítomny. d = (x y) / z v = x d x y z d v požadované množství naředěné DNA (µl), požadovaná koncentrace DNA (ng), změřená koncentrace DNA (ng/ µl), množství vyextrahovaného vzorku potřebného pro přípravu x µl roztoku o koncentraci DNA z (µl), množství PCR vody potřebné pro ředění vyextrahované DNA na požadovanou koncentraci. Polymerázová řetězová reakce Připraví se laminární box: Dekontaminují se předměty i prostory od jakýchkoli molekul DNA vše se otře dekontaminačním roztokem 70% etanolem a použije se UV záření po dobu (20 30) min. Připraví se pipety, sterilní špičky a zkumavky, odpadní nádoba s vloženým sáčkem na použitý materiál, stojánky apod. Stanoví se počet reakcí (počet vzorků; kontroly: GM-pozitvní a beztemplátová, kontrola izolace; jedna reakce navíc (rezerva pro pipetovací chybu); případně další kontrolní a srovnávací vzorky). Dle tabulek reakčních směsí (tabulka 1, tabulka 2, tabulka 3) se vypočítají celkové objemy všech součástí reakce. PCR směs se připravuje na ledu. Celková reakční směs se sterilně smíchá podle pořadí, v jakém jsou její složky uvedeny v tabulce příslušné k danému amplifikačnímu kitu. Zamíchá se jemným vortexováním a rozdělí se po daném počtu µl do označených zkumavek. Je-li koncentrace vyizolované DNA vyšší než 10 ng/µl, provede se její ředění. Poté se do každé zkumavky přidá daný počet µl temlátové DNA. Pipetuje se v tomto pořadí: beztemplátová kontrola (místo templátové DNA se použije voda vhodná pro PCR), vzorky a pozitivní kontrola. Zkumavky s templátovou DNA se otvírají a s templátovou DNA se manipuluje až poté, kdy jsou všechny zkumavky s reagenciemi pro PCR uzavřeny a reakční směs je rozpipetována do PCR zkumavek. Zkumavky s templáty se otvírají pokud možno v tomto pořadí: vzorky pozitivní kontrola.
13 Národní referenční laboratoř Strana 13 Zkumavky se pečlivě zavíčkují, aby se zabránilo vypařování směsi během PCR. Zkumavky se vloží do termálního cykleru, zvolí se vhodný amplifikační program a přístroj se spustí dle návodu. Po skončení práce se opět dekontaminují laminární box i pracovní pomůcky. Amplifikační kit REDTaq (3.3) se používá pro jednoduchou PCR reakci (v případě potřeby, může být PCR reakce provedena i kitem REDEx). Pro duplexní (případně multiplexní) PCR reakci se používá amplifikační kit REDEx (3.4). REDTaq ReadyMix PCR Reaction Mix (Sigma Aldrich) Izoláty DNA získané pomocí výše uvedených kitů se použijí pro amplifikaci tímto kitem přímo bez úprav, pouze se ředí na výše uvedenou koncentraci vodou vhodnou pro PCR. Tabulka 1. Příprava PCR pomocí kitu REDTaq ReadyMix PCR Reaction Mix (jednoduchá PCR). Složka 1 reakce (µl) Voda vhodná pro PCR (3.5.1) 5,5 6,5 REDTaq 12,5 Primer F 0,5 1,0 Primer R 0,5 1,0 Bez templátu 20 Templát 5,0 Včetně templátu 25 Objem amplifikačního kitu REDTaq je neměnný. Objemy templátu, primerů a vody vhodné pro PCR se mohou měnit za účelem dosažení optimálního průběhu PCR reakce, přičemž voda pouze doplňuje reakci na požadovaný objem 20 µl. REDExtract-N-Amp Plant PCR Kits (Sigma Aldrich) Izoláty DNA získané pomocí výše uvedených izolačních kitů a naředěné na požadovanou koncentraci se musí pro amplifikaci tímto kitem upravit tak, že se smíchají v poměru 1 : 1 se směsí Extraction Buffer (3.4.1) : Dilution Buffer (3.4.2)(1:1). Požadovaný objem 4 µl roztoku templátu vkládaný do 1 PCR reakce tedy tvoří 2 µl izolátu DNA a 2 µl této směsi pufrů na 20 µl celkové reakční směsi v 1 PCR.
14 Národní referenční laboratoř Strana 14 Tabulka 2. Příprava PCR pomocí kitu REDExtract - N - Amp Plant PCR Kit jednoduchá PCR. Složka 1 reakce (µl) Voda vhodná pro PCR (3.5.1) 5,2 REDEx 10 Primer F 0,4 Primer R 0,4 Bez templátu 16 Templát 4 Včetně templátu 20 Tabulka 3. Příprava PCR pomocí kitu REDExtract-N-Amp Plant PCR Kits duplexní PCR (množství vody je sníženo o součet objemů druhého páru primerů). Složka 1 reakce (µl) Voda vhodná pro PCR (3.5.1) 4,4 REDEx pár primerů, primer F 0,4 1. pár primerů, primer R 0,4 2. pár primerů, primer F 0,4 2. pár primerů, primer F 0,4 Bez templátu 16 Templát 4 Včetně templátu 20
15 Národní referenční laboratoř Strana 15 Elektroforéza v agarózovém gelu Nanášení vzorků na gel 2% gel se vloží do elektroforetické vany a převrství pracovním TAE pufrem (viz 5.3) (1 2) mm nad jeho povrch. Vzorky se nanesou do jamek gelu v tomto pořadí: beztemplátová kontrola, elektroforetický marker, vzorky, marker a pozitivní kontrola. Nejdříve se nanesou vzorky a potom vhodné markery. Objem vzorku nanášeného do jedné jamky závisí na typu hřebínku a potřebném množství. Amplifikáty získané pomocí kitů REDTaq a REDEx se nanášejí přímo z PCR zkumavek, neboť již obsahují nanášecí barvivo pro elektroforézu. Pokud amplifikáty nanášecí barvivo neobsahují, musejí se s barvivem smíchat (např. bromfenolová modř). Po nanesení vzorků a markerů ( nebo ) do jamek v gelu se spustí elektroforéza. Spuštění a běh elektroforézy Doporučené nastavení zdroje (90 140) V, maximum ma, (60 90) min chodu. Tyto hodnoty lze měnit dle potřeby a pokynů v návodu pro použití elektroforetického zdroje. Přesná doba chodu sleduje potřebu rozdělení fragmentů v gelu. Postup čela elektroforézy se může orientačně sledovat dle nanášecího barviva. Rozdělení a uspořádání pruhů se sleduje při prosvícení na transiluminátoru, vyfotografováním a přenesením do počítače. Hodnocení testu Pozitivní kontrola PCR: Vykazuje jasně rozeznatelný pruh v gelu v místě, kde se má hledaný pruh v porovnání s markerem vyskytovat. Beztemplátová kontrola PCR: Nedává žádný pruh kromě pruhu či skvrny odpovídající svou polohou primerům, primer dimerům a pod. v oblasti (20 100) bp. V případě nejasného výsledku výše uvedených kontrol nebo výsledku, který se dokonce jeví jako chybný, je nutné daný běh amplifikace opakovat. V případě správných výsledků kontrol je možné konstatovat, že: Vzorky negativní pro daný amplikon jsou vzorky, v jejichž stopách se nevyskytují pruhy v místech, kde ve srovnání s markerem a pozitivní kontrolou má ležet hledaný pruh. Vzorky pozitivní pro daný amplikon jsou vzorky, v jejichž stopách se vyskytují pruhy v místech, kde ve srovnání s markerem a pozitivní kontrolou má ležet hledaný pruh. Vzorky nejasného výsledku pro daný amplikon jsou vzorky, v jejichž stopách v příslušném místě v porovnání s markerem a pozitivní kontrolou nelze jednoznačně určit přítomnost pruhu. V takovém případě je hodnocení vzorků ovlivněho zkušeností pracovníka a provádí se vždy v porovnání s pozitivní kontrolou, která obsahuje 0,1 % materiálu s danou genetickou modifikací. V případě nejednoznačnosti výsledku je třeba zkoušku opakovat.
16 Národní referenční laboratoř Strana 16 6 Literatura 1 Suchomelová M.: Stanovení přítomnosti GMO v rostlinném materiálu metodou PCR, JPP ÚKZÚZ, Brno, Manuál kitu Genomic DNA from Food, firmy Machery - Nagel, 2008 / Rev Manuál kitu GenEluteTM Plant Genomic DNA Miniprep Kit firmy Sigma-Aldrich pro izolaci DNA z rostlinného materiálu. 4 Manuál kitu REDExtract-N-AmpTM Plant PCR Kits firmy Sigma-Aldrich, univerzální kit pro PCR. 5 Manuál kitu REDTaq Ready Mix PCR Reaction Mix with MgCl 2, Sigma- Aldrich, univerzální kit pro PCR. 6 Uživatelský manuál k přístroji NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer.
IZOLACE DNA PRO STANOVENÍ GMO METODOU PCR (KIT NUCLEOSPIN FOOD)
1252.1 Izolace DNA pro stanovení GMO metodou Strana 1 IZOLACE DNA PRO STANOVENÍ GMO METODOU PCR (KIT NUCLEOSPIN FOOD) 1 Účel a rozsah Postup slouží k získání deoxyribonukleové kyseliny (DNA) ze vzorku
VíceIZOLACE DNA PRO STANOVENÍ GMO METODOU PCR (KIT GENELUTE)
Strana 1 IZOLACE DNA PRO STANOVENÍ GMO METODOU PCR (KIT GENELUTE) 1 Účel a rozsah Postup slouží k získání deoxyribonukleové kyseliny (DNA) ze vzorku pomocí komerčního kitu GenElute. 2 Princip Proces izolace
VíceIZOLACE DNA (KIT DNeasy Plant Mini)
17.1 Izolace DNA (kit DNeasy Plant Mini) Strana 1 IZOLACE DNA (KIT DNeasy Plant Mini) 1 Účel a rozsah Postup slouží k získání deoxyribonukleové kyseliny (DNA) ze vzorku pomocí komerčního kitu DNeasy Plant
VíceIZOLACE DNA POMOCÍ CTAB PRO STANOVENÍ GMO METODOU PCR
1253.1 Izolace DNA pomocí CTAB pro stanovení GMO Strana 1 IZOLACE DNA POMOCÍ CTAB PRO STANOVENÍ GMO METODOU PCR 1 Účel a rozsah Postup slouží k získání deoxyribonukleové kyseliny (DNA) ze vzorků krmiv
VíceJednotné pracovní postupy zkoušení krmiv
Národní referenční laboratoř Strana KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ GENETICKÝCH MODIFIKACÍ METODOU qpcr POMOCÍ ROTOR-GENE PROBE PCR KITU Účel a rozsah Postup slouží ke kvantitativnímu stanovení genetických modifikací
VíceColumn DNA Lego Kit UNIVERZÁLNÍ SOUPRAVY PRO RYCHLOU IZOLACI ČISTÉ DNA (Katalogové číslo D201 + D202)
Column DNA Lego Kit UNIVERZÁLNÍ SOUPRAVY PRO RYCHLOU IZOLACI ČISTÉ DNA (Katalogové číslo D201 + D202) Popis Column DNA Lego Kit je základ moderní stavebnicové (Lego) soupravy pro izolaci čisté DNA různého
VíceJednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU SEMDURAMICINU METODOU HPLC
Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU SEMDURAMICINU METODOU HPLC 1 Rozsah a účel Postup specifikuje podmínky pro stanovení obsahu semduramicinu v krmivech metodou vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) v koncentračním
VíceJednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU MYKOTOXINŮ METODOU LC-MS - aflatoxin B1, B2, G1 a G2
Národní referenční laboratoř Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU MYKOTOXINŮ METODOU LC-MS - aflatoxin B1, B2, G1 a G2 1 Rozsah a účel Metoda je vhodná pro stanovení aflatoxinů B1, B2, G1 a G2 v krmivech. 2 Princip
VíceJednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU PROBIOTICKÝCH BAKTERIÍ RODU ENTEROCOCCUS
Národní referenční laboratoř Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU PROBIOTICKÝCH BAKTERIÍ RODU ENTEROCOCCUS 1 Rozsah a účel Postup slouží ke stanovení počtu probiotických bakterií v doplňkových látkách, premixech
VíceJednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU DEKOCHINÁTU METODOU HPLC
Národní referenční laboratoř Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU DEKOCHINÁTU METODOU HPLC 1 Rozsah a účel Tato metoda specifikuje podmínky pro stanovení dekochinátu metodou vysokoúčinné kapalinové chromatografie
VíceJednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU MYKOTOXINŮ METODOU HPLC - OCHRATOXIN A
Národní referenční laboratoř Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU MYKOTOXINŮ METODOU HPLC - OCHRATOXIN A 1 Rozsah a účel Metoda specifikuje podmínky pro stanovení ochratoxinu A v krmivech. 1 Ochratoxin A patří mezi
VíceTkáňový homogenizátor MagNA Lyser od společnosti Roche
Izolace RNA Pracovní postup Homogenizace: Pozn. Postup homogenizace platí pouze pro izolaci RNA z nativní tkáně, v případě izolace z buněčné suspenze je tento krok vynechán a začíná se přídavkem homogenizačního
VíceJednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU KOBALTU METODOU ICP-MS
Národní referenční laboratoř Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU KOBALTU METODOU ICP-MS 1 Rozsah a účel Metoda specifikuje podmínky pro stanovení celkového obsahu kobaltu v krmivech metodou hmotnostní spektrometrie
VíceJednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU MYKOTOXINŮ METODOU LC-MS - FUMONISIN B 1 A B 2
Národní referenční laboratoř Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU MYKOTOXINŮ METODOU LC-MS - FUMONISIN B 1 A B 2 1 Rozsah a účel Metoda je vhodná pro stanovení fumonisinů B 1 a B 2 v krmivech. 2 Princip Fumonisiny
VíceJednotné pracovní postupy zkoušení krmiv Stanovení obsahu celkového a volného tryptofanu metodou HPLC
Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU CELKOVÉHO A VOLNÉHO TRYPTOFANU METODOU HPLC 1 Rozsah a účel Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu celkového a volného tryptofanu v krmivech metodou vysokoúčinné kapalinové
VíceIzolace nukleových kyselin
Izolace nukleových kyselin Požadavky na izolaci nukleových kyselin V nativním stavu z přirozeného materiálu v dostatečném množství požadované čistotě. Nukleové kyseliny je třeba zbavit všech látek, které
VíceSeminář izolačních technologií
Seminář izolačních technologií Zpracoval: Karel Bílek a Kateřina Svobodová Podpořeno FRVŠ 2385/2007 a 1305/2009 Úpravy a aktualizace: Pavla Chalupová ÚMFGZ MZLU v Brně 1 Lokalizace jaderné DNA 2 http://www.paternityexperts.com/basicgenetics.html
VíceJednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU 5-VINYL - 2-THIOOXAZOLIDONU (GOITRINU) METODOU GC
Národní referenční laboratoř Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU 5-VINYL - 2-THIOOXAZOLIDONU (GOITRINU) METODOU GC 1 Rozsah a účel Metoda specifikuje podmínky pro stanovení vinylthiooxazolidonu (dále VOT) v krmivech.
VíceJednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU MADURAMICINU A SEMDURAMICINU METODOU HPLC
Národní referenční laboratoř Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU MADURAMICINU A SEMDURAMICINU METODOU HPLC 1 Rozsah a účel Metoda specifikuje podmínky pro stanovení maduramicinu a semduramicinu v krmivech a premixech.
VíceJednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ AKTIVITY FYTÁZY
Národní referenční laboratoř Strana 1 STANOVENÍ AKTIVITY FYTÁZY 1 Rozsah a účel Postup specifikuje stanovení fytázové aktivity ve vzorcích krmiva. Tímto postupem se nestanoví rozdíl mezi fytázou přidanou
VíceJednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU MĚDI, ŽELEZA, MANGANU A ZINKU METODOU FAAS
Národní referenční laboratoř Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU MĚDI, ŽELEZA, MANGANU A ZINKU METODOU FAAS 1 Účel a rozsah Tato metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu mědi, manganu, zinku a železa ve
Víceα-globin StripAssay Kat. číslo 4-160 10 testů 2-8 C
α-globin StripAssay Kat. číslo 4-160 10 testů 2-8 C Popis stripů: Pracovní postup Izolace DNA Doporučujeme použít následující kit pro izolaci DNA z plné krve nebo jiných typů vzorků: Spin Micro DNA Extraction
VíceJednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU KVASINEK RODU SACCHAROMYCES
Národní referenční laboratoř Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU KVASINEK RODU SACCHAROMYCES 1 Rozsah a účel Metodika slouží ke stanovení počtu probiotických kvasinek v doplňkových látkách, premixech a krmivech.
VíceJednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU VITAMÍNU D METODOU LC/MS
Národní referenční laboratoř Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU VITAMÍNU D METODOU LC/MS 1 Účel a rozsah Tento postup specifikuje podmínky pro stanovení vitamínu D3 v krmivech metodou LC/MS. 2 Princip Zkušební
VíceMagPurix Blood DNA Extraction Kit 200
MagPurix Blood DNA Extraction Kit 200 Kat. č. ZP02001-48 Doba zpracování: 50-60 minut pro MagPurix 12S 50-70 minut pro MagPurix 24 Použití Souprava MagPurix Blood DNA Extraction Kit 200 je určena pro izolátor
VíceJednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU MELAMINU A KYSELINY KYANUROVÉ METODOU LC-MS
Národní referenční laboratoř Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU MELAMINU A KYSELINY KYANUROVÉ METODOU LC-MS 1 Rozsah a účel Postup je určen pro stanovení obsahu melaminu a kyseliny kyanurové v krmivech. 2 Princip
VíceBraf V600E StripAssay
Braf V600E StripAssay Kat. číslo 5-570 20 testů 2-8 C Popis stripu: Pracovní postup 1. Izolace DNA Pro izolaci čerstvých nebo mražených biopsií použijte soupravy Qiagen QIAmp DNA Mini nebo Micro. Pro izolaci
VíceJednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU KADMIA A OLOVA METODOU FAAS
Národní referenční laboratoř Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU KADMIA A OLOVA METODOU FAAS 1 Rozsah a účel Metoda specifikuje podmínky pro stanovení Cd a Pb v krmivech a minerálních premixech. Stanovení je určeno
VíceEGFR XL StripAssay. Kat. číslo 5-630. 20 testů 2-8 C
EGFR XL StripAssay Kat. číslo 5-630 20 testů 2-8 C Popis stripu Pracovní postup 1. Izolace DNA Pro izolaci DNA použijte vhodný izolační kit. Doporučené kity jsou následující: Pro izolaci čerstvých nebo
VíceMagPurix Viral Nucleic Acid Extraction Kit
MagPurix Viral Nucleic Acid Extraction Kit Kat. č. ZP02003 Doba zpracování: 40-55 minut pro MagPurix 12S 40-60 minut pro MagPurix 24 Použití Souprava MagPurix Viral Nucleic Acid Extraction Kit je určena
VíceNRAS StripAssay. Kat. číslo 5-610. 20 testů 2-8 C
NRAS StripAssay Kat. číslo 5-610 20 testů 2-8 C Popis stripu: Pracovní postup 1. Izolace DNA Pro izolaci DNA musí být použita vhodná metoda vzhledem k typu tkáně vzorku. Pro doporučení vhodné metody kontaktujte
VíceSpektrofotometrické stanovení fosforečnanů ve vodách
Spektrofotometrické stanovení fosforečnanů ve vodách Úkol: Spektrofotometricky stanovte obsah fosforečnanů ve vodě Chemikálie: 0,07165 g dihydrogenfosforečnan draselný KH 2 PO 4 75 ml kyselina sírová H
VíceIzolace RNA. doc. RNDr. Jan Vondráček, PhD..
Izolace RNA doc. RNDr. Jan Vondráček, PhD.. Metodiky izolace RNA celková buněčná RNA ( total RNA) zahrnuje řadu typů RNA, které se mohou lišit svými fyzikálněchemickými vlastnostmi a tedy i nároky na jejich
VíceRNA Blue REAGENS PRO RYCHLOU PŘÍPRAVU ČISTÉ A NEDEGRADOVANÉ RNA (katalogové číslo R011, R012, R013)
RNA Blue REAGENS PRO RYCHLOU PŘÍPRAVU ČISTÉ A NEDEGRADOVANÉ RNA (katalogové číslo R011, R012, R013) Upozornění: RNA Blue obsahuje fenol a další toxické komponenty. Při kontaktu s kůží je nutné omytí velkým
VíceJednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU HYDROXYPROLINU SPEKTROFOTOMETRICKY
Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU HYDROXYPROLINU SPEKTROFOTOMETRICKY 1 Rozsah a účel Postup specifikuje podmínky pro stanovení obsahu hydroxyprolinu v živočišných tkáních spektrofotometrickou metodou. 2 Princip
VíceSDS-PAGE elektroforéza
SDS-PAGE elektroforéza Příprava gelu... 1 Recept na 0.75 mm gel (1 gel/2 gely)... 2 Recept na 1.5 mm gel (1 gel/2 gely)... 2 Příprava vzorku... 3 Elektroforéza... 3 Barvení gelů Blue Silver... 4 Chemikálie
VíceJednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU VÁPNÍKU MANGANOMETRICKY
Národní referenční laboratoř Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU VÁPNÍKU MANGANOMETRICKY 1 Rozsah a účel Tato metoda specifikuje podmínky pro stanovení celkového obsahu vápníku v krmivech, krmných směsích a premixech.
VíceIzolace genomové DNA ze savčích buněk, stanovení koncentrace DNA pomocí absorpční spektrofotometrie
Izolace genomové DNA ze savčích buněk, stanovení koncentrace DNA pomocí absorpční spektrofotometrie IZOLACE GENOMOVÉ DNA Deoxyribonukleová kyselina (DNA) představuje základní genetický materiál většiny
Více2. Srovnání postupů izolace DNA kolonky vs. paramagnetické částice
2. Srovnání postupů izolace DNA kolonky vs. paramagnetické částice A) Izolace DNA na kolonkách Izolace DNA z jakéhokoliv materiálu je dnes základním postupem v laboratořích zabývajících se molekulárně-biologickými
Vícecdna synthesis kit First-Strand cdna Synthesis System Verze 1.2
cdna synthesis kit First-Strand cdna Synthesis System Verze 1.2 Obsah soupravy a její skladování Tato souprava pro reverzní transkripci obsahuje reagencie potřebné k provedení reverzní transkripce (RT)
VíceJednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU VITAMÍNU A A VITAMÍNU E METODOU HPLC
Národní referenční laboratoř Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU VITAMÍNU A A VITAMÍNU E METODOU HPLC 1 Účel a rozsah Postup specifikuje podmínky pro stanovení vitamínu A a vitamínu E v krmivech a premixech. 2 Princip
VíceKonečná zpráva hodnocení různých způsobů přípravy vzorků pro AMPLICOR HPV test firmy Roche
Konečná zpráva hodnocení různých způsobů přípravy vzorků pro AMPLICOR HPV test firmy Roche Charakteristika testu: Set AMPLICOR HPV vyráběný firmou Roche je určený pro detekci vysoko-rizikových typů lidských
VíceJednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU DRASLÍKU, SODÍKU, HOŘČÍKU A VÁPNÍKU METODOU FAAS/FAES
Národní referenční laboratoř Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU DRASLÍKU, SODÍKU, HOŘČÍKU A VÁPNÍKU METODOU FAAS/FAES 1 Účel a rozsah Tato metoda umožňuje stanovení draslíku, sodíku, hořčíku a vápníku v premixech
VíceMagPurix Forensic DNA Extraction Kit
MagPurix Forensic DNA Extraction Kit Kat. č. ZP02010 Doba zpracování: 40-50 minut pro MagPurix 12S 40-60 minut pro MagPurix 24 Použití Souprava MagPurix Forensic DNA Extraction Kit je určena pro izolátor
VíceCS Úřední věstník Evropské unie L 54/89
26.2.2009 CS Úřední věstník Evropské unie L 54/89 c) při vlnové délce mezi 230 a 320 nm se nesmí spektrum vzestupné části, vrcholu a sestupné části píku zkoušeného vzorku lišit od ostatních částí spektra
VícePříprava půd pro diskovou difuzní metodu EUCAST a pro vyšetření hodnot MIC bujonovou mikrodiluční metodou. Změny proti předchozí verzi (v. 4.
Version 5.0 January 2017 Příprava půd pro diskovou difuzní metodu EUCAST a pro vyšetření hodnot MIC bujonovou mikrodiluční metodou. Změny proti předchozí verzi (v. 4.0) A. Půdy pro diskovou difuzní metodu
VíceDIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIDUÁLNÍ CHOROBY U KOLOREKTÁLNÍHO KARCINOMU
Úvod IntellMed, s.r.o., Václavské náměstí 820/41, 110 00 Praha 1 DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIDUÁLNÍ CHOROBY U KOLOREKTÁLNÍHO KARCINOMU Jednou z nejvhodnějších metod pro detekci minimální
VíceHmotnostní detekce biologicky významných sloučenin pro biotechnologie část 3 - Provedení štěpení proteinů a následné analýzy,
Laboratoř Metalomiky a Nanotechnologií Hmotnostní detekce biologicky významných sloučenin pro biotechnologie část 3 - Provedení štěpení proteinů a následné analýzy, vyhodnocení výsledků, diskuse Anotace
VíceProjekt Pospolu. Stanovení jílovitých podílů podle ČSN EN A1 Zkouška s methylenovou modří
Projekt Pospolu Stanovení jílovitých podílů podle ČSN EN 933-9+A1 Zkouška s methylenovou modří Autorem materiálu a všech jeho částí, není-li uvedeno jinak, je Tomáš Táborský. Jako jedna z hlavních složek
VíceBraf 600/601 StripAssay
Braf 600/601 StripAssay Kat. číslo 5-560 20 testů 2-8 C Popis stripu: Pracovní postup Kit umožňuje detekci 9 mutací v genu BRAF (kodón 600 a 601) Další informace najdete v OMIM Online Mendelian Inheritance
VíceJednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU SELENU METODOU ICP-OES
Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU SELENU METODOU ICP-OES 1 Rozsah a účel Postup specifikuje podmínky pro stanovení celkového obsahu selenu v minerálních krmivech a premixech metodou optické emisní spektrometrie
VíceJednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU ARSENU METODOU ICP-MS
Národní referenční laboratoř Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU ARSENU METODOU ICP-MS 1 Rozsah a účel Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu arsenu v krmivech metodou hmotnostní spektrometrie s indukčně
VíceL 54/116 CS Úřední věstník Evropské unie
L 54/116 CS Úřední věstník Evropské unie 26.2.2009 8. Výsledky kruhových testů V rámci ES byly provedeny kruhové testy, při nichž až 13 laboratoří zkoušelo čtyři vzorky krmiva pro selata, včetně jednoho
VíceOptimalizace metody PCR pro její využití na vzorky KONTAMINOVANÝCH PITNÝCH VOD
Optimalizace metody PCR pro její využití na vzorky KONTAMINOVANÝCH PITNÝCH VOD Dana Vejmelková, Milan Šída, Kateřina Jarošová, Jana Říhová Ambrožová VODÁRENSKÁ BIOLOGIE, 1. 2. 2017 ÚVOD Sledované parametry,
VíceÚloha č. 1 Odměřování objemů, ředění roztoků Strana 1. Úkol 1. Ředění roztoků. Teoretický úvod - viz návod
Úloha č. 1 Odměřování objemů, ředění roztoků Strana 1 Teoretický úvod Uveďte vzorec pro: výpočet směrodatné odchylky výpočet relativní chyby měření [%] Použitý materiál, pomůcky a přístroje Úkol 1. Ředění
VíceJednotné pracovní postupy zkoušení krmiv
Národní referenční laboratoř Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU -KAROTENU METODOU HPLC 1 Účel a rozsah Postup specifikuje podmínky pro stanovení celkového -karotenu v krmivech a premixech metodou vysokoúčinné kapalinové
VíceDIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIDUÁLNÍ CHOROBY U KARCINOMU PANKREATU
Úvod IntellMed, s.r.o., Václavské náměstí 820/41, 110 00 Praha 1 DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIDUÁLNÍ CHOROBY U KARCINOMU PANKREATU Jednou z nejvhodnějších metod pro detekci minimální reziduální
VícePROTOKOL WESTERN BLOT
WESTERN BLOT 1. PŘÍPRAVA ELEKTROFORETICKÉ APARATURY Saponátem a vodou se důkladně umyjí skla, plastové vložky a hřebínek, poté se důkladně opláchnou deionizovanou/destilovanou vodou a etanolem a nechají
VíceTECHNICKÁ SPECIFIKACE Vybavení genetické laboratoře pro projekt EXTEMIT-K část B
TECHNICKÁ SPECIFIKACE Vybavení genetické laboratoře pro projekt EXTEMIT-K část B OBSAH Sestava pro vertikální elektroforézu... 2 Jednotka pro elektroforézu... 3 Termocykler... 4 Elektrický zdroj pro elektroforézu...
VíceMagPurix Viral/Pathogen Nucleic Acids Extraction Kit B
MagPurix Viral/Pathogen Nucleic Acids Extraction Kit B Kat. č. ZP02012 Doba zpracování: 45-60 minut pro MagPurix 12S 45-65 minut pro MagPurix 24 Použití Souprava MagPurix Viral/Pathogen Nucleic Acids Extraction
VícePolymorfismus délky restrikčních fragmentů (RFLP)
ÚSTAV LÉKAŘSKÉ BIOCHEMIE A LABORATORNÍ DIAGNOSTIKY 1. LF UK Polymorfismus délky restrikčních fragmentů (RFLP) Praktické cvičení z lékařské biochemie Všeobecné lékařství Martin Vejražka 2017/18 Obsah POLYMORFISMUS
VíceJednotné pracovní postupy zkoušení krmiv
Národní referenční laboratoř Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU NEUTRÁLNĚ DETERGENTNÍ VLÁKNINY (NDF) A NEUTRÁLNĚ DETERGENTNÍ VLÁKNINY PO ÚPRAVĚ VZORKU AMYLÁZOU (andf) 1 Rozsah a účel Tato metoda specifikuje podmínky
VíceL 54/76 CS Úřední věstník Evropské unie 26.2.2009
L 54/76 CS Úřední věstník Evropské unie 26.2.2009 7. Opakovatelnost Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených na stejném vzorku týmž laborantem nesmí překročit: 5 mg/kg v absolutní hodnotě
VíceMendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav biologie rostlin
Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav biologie rostlin Inovace laboratorních úloh genetických předmětů metodikami pracujícími s ribonukleovými kyselinami pšenice Metodické návody pro laboratorní
VícePolymorfismus délky restrikčních fragmentů
Polymorfismus délky restrikčních fragmentů Princip: Chemikálie: PCR produkt z předchozího praktického cvičení Endonukleáza KpnI 10 U μl -1 Pufr pro KpnI 10 koncentrovaný (Tris-HCl 100 mmol l -1 ph 7,5,
VíceMagPurix Bacterial DNA Extraction Kit
MagPurix Bacterial DNA Extraction Kit Kat. č. ZP02006 Doba zpracování: 55-65 minut pro MagPurix 12S 55-75 minut pro MagPurix 24 Použití Souprava MagPurix Bacterial DNA Extraction Kit je určena pro izolátor
VíceSure-MeDIP I. with magnetic beads and MNase. www.krd.cz
Sure-MeDIP I with magnetic beads and MNase www.krd.cz 1 Obsah soupravy a skladování MeDIP souprava obsahuje reagencie na provedení 25 reakcí. Souprava je rozdělen do dvou částí, jedna je distribuována
Více1. Metodika. Protokol č. F1-4 Metodika: Srovnávací analýza efektivity přípravy rekombinantního proteinu ve fermentoru
Protokol č.: F1-4 Datum: 20.12.2010 Metodika: analýza efektivity přípravy výběr z výsledků ze zkušebních provozů výroby antigenů. Vypracoval: Ing. Václav Filištein, Mgr. Tereza Chrudimská, Spolupracující
VíceJednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU BÍLKOVIN
Národní referenční laboratoř Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU BÍLKOVIN 1 Účel a rozsah Tato metoda specifikuje podmínky pro stanovení bílkovin v krmivech. Metoda je použitelná pro všechna krmiva organického původu.
VícePROTEINOVÁ DENATURUJÍCÍ ELEKTROFORÉZA (SDS PAGE)
PROTEINOVÁ DENATURUJÍCÍ ELEKTROFORÉZA (SDS PAGE) Denaturující proteinová elektroforéza (SDS PAGE - SDS Protein Acrylamide Gel Electrophoresis) je metoda, která se používá k separaci proteinů podle velikosti,
VíceÚloha č. 9 Stanovení hydroxidu a uhličitanu vedle sebe dle Winklera
Úloha č. 9 Stanovení hydroxidu a uhličitanu vedle sebe dle Winklera Princip Jde o klasickou metodu kvantitativní chemické analýzy. Uhličitan vedle hydroxidu se stanoví ve dvou alikvotních podílech zásobního
VíceANALYTIKA ORGANICKÝCH HNOJIV VYROBENÝCH Z BRO. Alena Žalmanová NRL RO ÚKZÚZ Plzeň, Slovanská alej 20, 326 00 Plzeň
ANALYTIKA ORGANICKÝCH HNOJIV VYROBENÝCH Z BRO Alena Žalmanová NRL RO ÚKZÚZ Plzeň, Slovanská alej 20, 326 00 Plzeň Činnost NRL RO ÚKZÚZ Plzeň Rozbor hnojiv Organická komposty, průmyslové komposty, vermikomposty,
VíceSDS polyakrylamidová gelová elektroforéza (SDS PAGE)
SDS polyakrylamidová gelová elektroforéza (SDS PAGE) Princip SDS polyakrylamidová gelová elektroforéza slouží k separaci proteinů na základě jejich velikosti (molekulové hmotnosti). Zahřátím vzorku za
VíceDIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIUDÁLNÍ CHOROBY MRD EGFR
Úvod IntellMed, s.r.o., Václavské náměstí 820/41, 110 00 Praha 1 DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIUDÁLNÍ CHOROBY MRD EGFR Jednou z nejvhodnějších metod pro detekci minimální reziduální choroby
VíceNÁVOD K POUŽITÍ PRO HER2 DNA QUANTIFICATION KIT
IČ: 80 DIČ: CZ80 sales@intellmed.eu NÁVOD K POUŽITÍ PRO HER DNA QUANTIFICATION KIT IČ: 80 DIČ: CZ80 sales@intellmed.eu OBSAH Návod k použití pro HER DNA QUANTIFICATION KIT.... Úvod.... Označení.... Rozsah
Více2) Připravte si 3 sady po šesti zkumavkách. Do všech zkumavek pipetujte 0.2 ml roztoku BAPNA o různé koncentraci podle tabulky.
CVIČENÍ Z ENZYMOLOGIE 1) Stanovení Michaelisovy konstanty trypsinu pomocí chromogenního substrátu. Aktivita trypsinu se určí změřením rychlosti hydrolýzy chromogenního substrátu BAPNA (Nα-benzoyl-L-arginin-p-nitroanilid)
VíceJednotné pracovní postupy testování odrůd STANOVENÍ OBSAHU TANINŮ V ČIROKU SPEKTROFOTOMETRICKY
5321.1 Stanovení obsahu taninů v čiroku Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU TANINŮ V ČIROKU SPEKTROFOTOMETRICKY 1 Účel a rozsah Postup je určen pro stanovení obsahu taninů v zrnech čiroku. 2 Princip Taniny se ze
VíceJednotné pracovní postupy zkoušení krmiv Vydání 1 STANOVENÍ OBSAHU KOKCIDIOSTATIK METODOU LC-MS
Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU KOKCIDIOSTATIK METODOU LC-MS 1 Účel a rozsah Postup specifikuje podmínky pro stanovení diclazurilu, halofuginonu, lasalocidu, maduramicinu, monensinu, narasinu, nikarbazinu, robenidinu,
VíceMOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE I PŘÍPRAVA TKÁNĚ K IZOLACI DNA
Cvičení 9,10,11: MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE Jméno: Skupina: Cíl: Seznámení se se základními metodami, využívanými k analýze DNA 1. izolace DNA 2. amplifikace DNA pomocí PCR a elektroforéza 3. vizualizace DNA
VíceCS Úřední věstník Evropské unie L 54/85
26.2.2009 CS Úřední věstník Evropské unie L 54/85 F. STANOVENÍ DICLAZURILU 2,6-dichlor-alfa-(4-chlorofenyl)-4-(4,5-dihydro-3,5-dioxo-1,2,4-triazin-2-(3-H)yl)benzenacetonitril 1. Účel a rozsah Tato metoda
VíceStanovení vit. A a vit. E metodou HPLC v krmivech a premixech dopl ňkových látek
STANOVENÍ VITAMINU A (RETINOLU) A VITAMINU E (a-tocopherolu) METODOU HPLC V KRMIVECH A PREMIXECH DOPLŇKOVÝCH LÁTEK. 1. Definice Účinnou formou vitaminu A obecného vzorce C 16 H 23 - R je retinol a neoretinol
VíceMendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav biologie rostlin
Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav biologie rostlin Využití techniky RACE (Rapid amplification of complementary DNA ends) pro identifikaci genů pro metalothioneiny Metodické návody pro
VícePostup ke stanovení báze metamfetaminu metodou GC-FID
Postup ke stanovení báze metamfetaminu metodou GC-FID Důvodem pro vypracování postup je nutnost přesného a striktního definování podmínek pro kvantitativní stanovení obsahu báze metamfetaminu v pevných
VíceJednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU NEPOVOLENÝCH DOPLŇKOVÝCH LÁTEK METODOU LC-MS
Národní referenční laboratoř Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU NEPOVOLENÝCH DOPLŇKOVÝCH LÁTEK METODOU LC-MS 1 Účel a rozsah Tato metoda specifikuje podmínky pro stanovení nepovolených doplňkových látek Zn-bacitracinu,
VíceSTANOVENÍ MYKOTOXINŮ V OBILOVINÁCH METODOU ELISA
Národní referenční laboratoř Strana 1 STANOVENÍ MYKOTOXINŮ V OBILOVINÁCH METODOU ELISA 1 Účel a rozsah Metoda specifikuje podmínky pro stanovení přítomnosti, případně obsahu jednotlivých mykotoxinů metodou
VíceJednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU VITAMÍNU D METODOU HPLC
Národní referenční laboratoř Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU VITAMÍNU D METODOU HPLC 1 Rozsah a účel Tato metoda specifikuje podmínky pro stanovení vitamínu D v premixech pro výrobu krmných směsí metodou HPLC.
VíceBakteriální bioluminiscenční test. Stanovení účinnosti čištění odpadních vod pomocí bakteriálního bioluminiscenčního testu
Bakteriální bioluminiscenční test Stanovení účinnosti čištění odpadních vod pomocí bakteriálního bioluminiscenčního testu BBTT Cíl: Stanovit účinek odpadních vod na bakterie Vibrio fischeri. Principem
VíceANALÝZA EXTRAKTU PODLE MEHLICHA 3 METODOU ICP-OES
30074. Analýza extraktu podle Mehlicha 3 Strana ANALÝZA EXTRAKTU PODLE MEHLICHA 3 METODOU ICP-OES Účel a rozsah Postup je určen především pro stanovení obsahu základních živin vápníku, hořčíku, draslíku,
VíceJednotné pracovní postupy zkoušení krmiv Vydání 1 STANOVENÍ OBSAHU MADURAMICINU METODOU HPLC
Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU MADURAMICINU METODOU HPLC 1 Rozsah a účel Metoda specifikuje podmínky pro stanovení maduramicinu v krmivech metodou vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC). 1 Pro účely
VíceMetodika stanovení kyselinové neutralizační kapacity v pevných odpadech
Metodika stanovení kyselinové neutralizační kapacity v pevných odpadech 1 Princip Principem zkoušky je stanovení vodného výluhu při různých přídavcích kyseliny dusičné nebo hydroxidu sodného a následné
VíceHbA1c. Axis - Shield. Společnost je zapsána v obchodním rejstříku Městského soudu v Praze, odd. C vložka 1299
Lékařská technika a speciální zdravotní materiál Společnost je zapsána v obchodním rejstříku Městského soudu v Praze, odd. C vložka 1299 Obchodní 110, 251 70 Praha Čestlice Tel. +420 296 328 300 Fax. +420
VíceJODOMETRICKÉ STANOVENÍ ROZPUŠTĚNÉHO KYSLÍKU
JODOMETRICKÉ STANOVENÍ ROZPUŠTĚNÉHO KYSLÍKU (dle Winklera v Alsterbergově modifikaci) Cílem je stanovení rozpuštěného kyslíku v pitné vodě z vodovodního řádu. Protokol musí osahovat veškeré potřebné hodnoty
Více1. Příloha 1 Návod úlohy pro Pokročilé praktikum z biochemie I
1. Příloha 1 Návod úlohy pro Pokročilé praktikum z biochemie I Vazba bromfenolové modři na sérový albumin Princip úlohy Albumin má unikátní vlastnost vázat menší molekuly mnoha typů. Díky struktuře, tvořené
VíceÚstřední kontrolní a zkušební ústav zemědělský. Národní referenční laboratoř. Bulletin Ročník XXI, číslo 2/2017
Ústřední kontrolní a zkušební ústav zemědělský Národní referenční laboratoř Bulletin 2017 Ročník XXI, číslo 2/2017 Brno 2017 Obsah 1 Zavedení metody založené na analýze mikrosatelitů (SSR markerů) pro
VíceMOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE I PŘÍPRAVA TKÁNĚ K IZOLACI DNA
Cvičení 9,10,11: MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE Jméno: Skupina: Cíl: Seznámení se se základními metodami, využívanými k analýze DNA 1. izolace DNA 2. amplifikace DNA pomocí PCR 3. restrikční štěpení PCR produktu
VíceJednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU TUKU V OLEJNATÝCH SEMENECH
Národní referenční laboratoř Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU TUKU V OLEJNATÝCH SEMENECH 1 Rozsah a účel Tento postup specifikuje podmínky pro stanovení tuku (hexanového, diethyletherového nebo petroletherového
VíceJednotné pracovní postupy zkoušení krmiv Vydání 1 STANOVENÍ OBSAHU KOKCIDIOSTATIK METODOU LC-MS
Národní referenční laboratoř Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU KOKCIDIOSTATIK METODOU LC-MS 1 Účel a rozsah Postup specifikuje podmínky pro stanovení diclazurilu, halofuginonu, lasalocidu, maduramicinu, monensinu,
VíceWestern blotting. 10% APS 20,28 µl 40,56 µl 81,12 µl 20,28 µl 40,56 µl 81,12 µl
Western blotting 1. Příprava gelu složení aparatury hustotu gelu volit podle velikosti proteinů příprava rozdělovacího gelu: 10% 12% počet gelů 1 2 4 1 2 4 objem 6 ml 12 ml 24 ml 6 ml 12 ml 24 ml 40% akrylamid
VíceJednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU MYKOTOXINŮ METODOU HPLC - ZEARALENON
Národní referenční laboratoř Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU MYKOTOXINŮ METODOU HPLC - ZEARALENON 1 Rozsah a účel Metoda specifikuje podmínky pro stanovení zearalenonu v krmivech. 1 Zearalenon (ZON) je charakterizován
VíceL 54/80 CS Úřední věstník Evropské unie
L 54/80 CS Úřední věstník Evropské unie 26.2.2009 7.1.2 Detektor diodového pole Výsledky jsou posuzovány podle následujících kritérií: a) při vlnové délce maximální absorpce vzorku i standardu musí být
Více