MASARYKOVA UNIVERZITA Lékařská fakulta

Transkript

1 MASARYKOVA UNIVERZITA Lékařská fakulta STUDIUM ELEKTRICKÝCH VLASTNOSTÍ SRDEČNÍCH BUNĚK Změny vyvolané působením léčivých látek, ethanolu a vlivem mutace sodíkového kanálu (metoda patch clamp) Habilitační práce MUDr. Markéta Bébarová, Ph.D. Brno 2013

2 Za podporu a pomoc při získání a zpracování výsledků zahrnutých do této habilitační práce bych ráda poděkovala všem spoluautorům, především svým školitelům, Doc. J. Šimurdovi a Doc. M. Šimurdové, mému kolegovi Doc. M. Páskovi a v neposlední řadě panu Peterovi Matejovičovi a paní laborantce Branislavě Vyoralové, bez jejichž systematické práce v laboratoři by publikace nevznikly. Můj velký dík patří Prof. P. Bravenému, který mě k elektrofyziologii přivedl a dodnes mi poskytuje cenné rady, zejména při psaní rukopisů a přípravě prezentací. Rovněž bych ráda poděkovala bývalému i současnému vedoucímu Fyziologického ústavu Lékařské fakulty Masarykovy univerzity, Prof. B. Fišerovi (in memoriam) a Prof. N. Honzíkové, za vytvoření podmínek pro vědeckou práci, která vedla k sepsání publikací zahrnutých do této habilitační práce. Za trpělivost, pochopení a podporu děkuji celé své rodině. 2

3 OBSAH Seznam použitých zkratek... 4 I. Úvod... 5 II. Použité metody III. Nové varianty měření metodou patch clamp IV. Farmakologické ovlivnění elektrických vlastností srdeční buňky 24 IV.1. Antiarytmika (ajmalin, propafenon) IV.2. Antipsychotika (haloperidol, perfenazin) IV.3. Nově syntetizované látky (pracovní názvy 44Bu a 444) IV.4. Ethanol V. Geneticky podmíněné arytmie Brugadův syndrom VI. Závěr Abstrakt Abstract Seznam citované literatury Přehled příloh Seznam recenzovaných prací uchazeče

4 Seznam použitých zkratek A AN, AP akční napětí, action potential ATP adenosintrifosfát B BrS Brugadův syndrom C CHO Chinese Hamster Ovary D (dv/dt) max maximální rychlost změny U m (nejčastěji během depolarizace AN) E EKG elektrokardiogram H HEPES 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl ethansulfonová kyselina herg human ether a-go-go related gene (strukturální podklad I Kr ) I I c kapacitní proud IC 50 I Ca, I Ca-L I Ca-pumpa I K I Kr I Ks I K1 I K(ATP) I m I Na I NaCa I NaK I to N n H Hillův koeficient koncentrace látky působící 50%-inhibici vápníkový proud typu L proud sarkolemální Ca 2+ -pumpy zpožděný draslíkový proud z buňky rychlá složka zpožděného draslíkového proudu z buňky pomalá složka zpožděného draslíkového proudu z buňky draslíkový proud nazývaný inward rectifier draslíkový proud citlivý na ATP membránový proud sodíkový proud proud Na + /Ca 2+ -výměníku proud sarkolemální Na + /K + -pumpy přechodný draslíkový proud z buňky Q QTc interval QT korigovaný na srdeční frekvenci podle Bazetta S SCN5A gen kódující strukturu -podjednotky srdečního I Na -kanálu U U m membránové napětí 4

5 I. Úvod Předložený soubor prací s komentáři patří do oblasti experimentální buněčné elektrofyziologie. Její počátky sahají do poloviny 20. století, kdy Alan L. Hodgkin a Andrew F. Huxley publikovali výsledky své několikaleté práce, za kterou obdrželi v roce 1963 Nobelovu cenu za fyziologii nebo lékařství. Jejich měření napětí a iontových proudů na membráně obřího axonu kalmara (Loligo pealeii) pomocí podélných kovových elektrod stejně jako následně zkonstruovaný matematický model popisující přesuny iontů přes membránu nervové buňky během akčního napětí (AN; Huxley a Hodgkin 1952) se stali a dodnes zůstávají základním východiskem výzkumu v oblasti buněčné elektrofyziologie. V téže době byla rovněž poprvé popsána metoda měření membránového napětí pomocí penetrující skleněné mikroelektrody naplněné 3 M KCl a to u kosterního svalového vlákna žáby (Ling a Gerard 1949). Ve stejném roce bylo poprvé zaznamenáno i AN srdeční buňky (Corabeuef a Weidmann 1949). Měření pomocí dvou penetrujících skleněných mikroelektrod později umožnilo aplikovat metodu vnuceného napětí a tedy měřit a analyzovat průběhy iontových membránových proudů a to jak u multicelulárních preparátů (e.g. Deck et al. 1964, Noma a Irisawa 1976), tak u izolovaných buněk včetně buněk srdečních (e.g. Giles a Hume 1981). U izolovaných buněk se však tato technika potýkala se značnými potížemi a velmi nízkou úspěšností (kontrahující se buňky malých rozměrů). V těchto letech bylo mimochodem možné studovat iontové proudy u multicelulárních preparátů rovněž pomocí techniky sacharózového můstku, kterou k detailnímu studiu vápníkového proudu I Ca a proudu Na + /Ca 2+ -výměníku I NaCa ve svých prvních pracích využívali i moji školitelé (e.g. Šimurda et al. 1976, 1981). Další modifikace mikroelektrodové techniky využívající dotykové skleněné mikroelektrody pak vedla k metodě označované patch clamp (Neher et al. 1978, Sakmann et al. 1980, Hamill et al. 1981), v češtině metoda terčíkového zámku. Český 5

6 ekvivalent se ale příliš neujal. Tato metoda umožnila měření membránových proudů u izolované buňky pomocí jediné skleněné mikroelektrody, což značně usnadnilo měření a zvýšilo úspěšnost získání výsledků. Navíc je pomocí této techniky možné měřit proud i na molekulární úrovni u jednotlivého iontového kanálu. Důsledkem byl skutečný skok ve znalostech elektrických dějů probíhajících na membráně excitabilních buněk včetně buněk srdečních. Publikace zahrnuté do této habilitační práce spojuje nejen obecné zaměření na studium změn elektrických vlastností srdeční tkáně vyvolaných různými faktory, ale právě i využití metody patch clamp. Většina těchto publikací vznikla na Fyziologickém ústavu Lékařské fakulty Masarykovy univerzity (LF MU) a to konkrétně za spolupráce členů výzkumné skupiny soustředěné v Laboratoři buněčné elektrofyziologie, kterou již desítky let vede Doc. RNDr. Ing. Jiří Šimurda, CSc. ve spolupráci s Doc. MUDr. Milenou Šimurdovou, CSc. Součástí této skupiny je dále můj kolega Doc. Ing. Michal Pásek, Ph.D., který se věnuje zejména oblasti matematického modelování. Velkou podporu a pomoc nám stále poskytuje Prof. MUDr. Pavel Bravený, CSc. (žák a následovník Prof. MUDr. Vladislava Krůty, CSc.), který na Fyziologickém ústavu LF MU stál u počátků elektrofyziologických pokusů na multicelulárních srdečních preparátech (měření kontrakce a záznam AN). Manželé Šimurdovi, které Prof. P. Bravený se svými kolegy přizval ke spolupráci v roce 1969, zavedli jako jedni z prvních v Evropě techniku vnuceného napětí, kterou navíc významně vylepšili (patentováno). Jak již bylo uvedeno, metoda vnuceného napětí umožňuje analýzu jednotlivých iontových proudů. Jejím zavedením byly tedy významně obohaceny možnosti studia elektrických vlastností srdeční tkáně na zdejším pracovišti. Manželé Šimurdovi stáli rovněž u zavedení metody patch clamp na izolovaných srdečních buňkách v naší laboratoři. K jejich týmu jsem se připojila již jako pregraduální studentka, ve 3. ročníku studia oboru Všeobecné lékařství na LF MU, a setrvala tu dodnes. Během těchto let byly naše pokusy zaměřeny zejména na farmakologické ovlivnění elektrických vlastností srdečních buněk. 6

7 V počátcích mého působení v Laboratoři buněčné elektrofyziologie byl náš výzkum zaměřen především na účinky antiarytmik. Přestože v posledních letech zaznamenávají v léčbě arytmií velké úspěchy invazivní postupy vedoucí ke zničení arytmogenního substrátu, léčba antiarytmiky je stále metodou první volby u mnoha typů arytmií. Za vznikem arytmií se mohou skrývat rozdílné mechanizmy často zahrnující současný účinek na více druhů iontových kanálů. Proto je třeba znát detailně podstatu účinku léčiva na úrovni srdeční buňky. Musíme počítat s tím, že prakticky každé antiarytmikum může mít potenciální arytmogenní účinky, zejména pokud je současně přítomna dysfunkce membránových kanálů vyvolaná genetickou anomálií (mutací či polymorfismem) nebo patologickým procesem. Čistě empirická indikace antiarytmik nejednou vedla k omezení jejich užívání v důsledku zpráv o arytmogenních účincích. To je i případ ajmalinu, antiarytmika třídy Ia dle Vaughan-Williamsovy klasifikace, jehož analýzou jsme se zabývali nejvíce. Výsledky našich pokusů na toto téma jsem shrnula již ve své dizertační práci z roku 2005 (Bébarová 2005) a část z nich rovněž v našich časopiseckých publikacích (více viz Podkapitola IV.1). Elektrofyziologické vlastnosti srdečních buněk však mohou být negativně ovlivněny řadou dalších léčivých i jiných látek. Z tohoto pohledu jsou aktuální naše pokusy, v nichž jsme se zaměřili na studium vlivu dvou v klinické praxi užívaných incizivních antipsychotik haloperidolu a perfenazinu (Podkapitola IV.2). Obdobné účinky však mohou vykazovat i jiné látky jako např. ethanol, po jehož požití je opakovaně udáván výskyt některých typů arytmií včetně arytmií ohrožujících život. Ethanol je navíc používán v laboratorní praxi jako rozpouštědlo hydrofobních látek. Jelikož ho k tomuto účelu využíváme i v naší laboratoři, považovala jsem za klíčové detailně prozkoumat jeho vliv na základní iontové membránové proudy u izolovaných srdečních buněk (Podkapitola IV.4). Studium vlivu látek na elektrické vlastnosti srdečních buněk má velký význam v preklinickém testování léčiv a to z důvodu možnosti cíleného podávání léčiv a omezení jejich nežádoucích účinků. Jde nesporně o jednu z nejvýznamnějších oblastí 7

8 využívajících metodu patch clamp. Proto jsem uvítala spolupráci s Doc. RNDr. Ladislavou Bartošovou, Ph.D. z Ústavu humánní farmakologie a toxikologie Farmaceutické fakulty Veterinární a farmaceutické univerzity v Brně. Doc. Bartošová se mimo jiné zabývá analýzou vlivu látek, které jsou nově syntetizovány na této fakultě, na elektrokardiogram (EKG) u potkana in vivo. Podnětem pro navázání spolupráce a následná elektrofyziologická měření na izolovaných buňkách v naší laboratoři (Podkapitola IV.3) byly právě pozorované změny EKG v přítomnosti dvou nově syntetizovaných ultrakrátce působících β-blokátorů s pracovními názvy 44Bu a 444. V rámci své postdoktorandské zahraniční stáže, kterou jsem absolvovala v letech na Univerzitě v Maastrichtu (Holandsko) pod vedením Prof. Paula G.A. Volderse, MD, PhD, jsem měla příležitost se seznámit s další významnou aplikací metody patch clamp. Po mém příjezdu jsme začali zavádět do té doby na tomto pracovišti nepoužívanou metodiku, která díky kombinaci technik molekulární biologie a metody patch clamp umožňuje studium funkčních změn iontových kanálů vyvolaných jejich mutacemi. Po úspěšném zavedení této metodiky jsem se zaměřila na analýzu funkčních důsledků několika mutací sodíkového kanálu identifikovaných mými klinickými spolupracovníky v Maastrichtu a to konkrétně u pacientů s Brugadovým syndromem. Brugadův syndrom jako druhý nejčastější typ geneticky podmíněné arytmie je v současnosti velmi intenzivně studován. Získané experimentální výsledky u nejzajímavější z vybraných mutací, mutace F2004L, doplnili naši externí spolupracovníci z Washingtonovy univerzity v St. Louis (Missouri, USA), Prof. Yoram Rudy, Ph.D. a Thomas O Hara, Ph.D., počítačovými simulacemi, což nám umožnilo detailně analyzovat pravděpodobný mechanizmus vzniku arytmií u tohoto syndromu (Kapitola V). Podrobné poznání změn vrátkování mutovaných kanálů v kontrolních podmínkách i za přítomnosti různých léčiv v propojení s možnostmi matematického modelování by mohlo v budoucnosti umožnit rozšíření dnes velmi omezených možností léčby těchto pacientů. 8

9 Možných aplikací metody patch clamp je ovšem více než ukazují publikace zpracované v rámci této habilitační práce. Navíc jsou stále vyvíjeny nové modifikace této metody, které umožňují zefektivnit přísun nových dat či dokonce získat doposud neměřitelná data. Hlavní z nich mapuje moje nedávná přehledová práce, která by mohla pomoci tyto nové varianty měření metodou patch clamp dostat do obecného povědomí a zvýšit intenzitu jejich využití (Kapitola III). Je zřejmé, že i přes svou třicetipětiletou historii metoda patch clamp stále skýtá nové poznatky z oblasti buněčné elektrofyziologie, zvláště při současném použití dalších moderních metod. 9

10 II. Použité metody Jak již bylo uvedeno, v publikacích zahrnutých do této habilitační práce byly elektrofyziologické vlastnosti iontových membránových proudů a konfigurace AN a jejich změny za specifických situací studovány pomocí techniky patch clamp při měření z celé buňky (whole cell patch clamp). Měření byla obvykle provedena na enzymaticky izolovaných srdečních buňkách z volné stěny pravé komory potkana kmene Wistar. Výjimku tvoří práce zaměřená na změny elektrofyziologických vlastností srdeční sodíkových kanálů postižených mutací nalezenou u pacienta s Brugadovým syndromem (Kapitola V), kde jsme k měření použili iontové kanály přechodně exprimované v membráně izolovaných buněk z ovarií čínského křečka. U některých studií byla využita možnost spolupráce a pokusná data byla podrobena matematickému modelování, což poskytlo podrobnější údaje o mechanizmech pozorovaných změn. Jednotlivé aspekty použitých metodických přístupů (s výjimkou matematického modelování, které zajistili spoluautoři publikovaných prací) budou probrány podrobněji v rámci této kapitoly. Metoda patch clamp při měření z celé buňky K vytvoření kontaktu s buněčnou membránou a posléze s intracelulárním prostředím měřené buňky se používá dotyková skleněná mikroelektroda s krátkým konickým zakončením a otvorem o průměru kolem 1 µm. Lze ji vyrobit ze skleněné kapiláry jednotného průměru pomocí tahače mikrokapilár (v našem případě přístroj DMZ-Universal-Puller od Zeitz-Instruments Vertriebs GmbH; Obr. II.1). Jak ukazuje Obr. II.2, naše pracoviště k měření metodou patch clamp sestává z Faradayovy klece (Aa, B), ve které je umístěn speciální stůl uložený na vzduchovém polštáři. Zajišťuje minimalizaci přenosu vibrací z podlahy na měřicí aparaturu. Počítač s monitorem (Ab) je propojený prostřednictvím zesilovače a digitálně-analogového převodníku (Ac, detail) s měřicími elektrodami (viz dále). 10

11 A B C D Obr. II.1 Výroba skleněných mikrokapilár pro měření metodou patch clamp. A: Programovatelný tahač mikrokapilár. B: Detail skleněné kapiláry umístěné v upínacím mechanizmu přístroje připraveného k započetí programu. C: Detail v okamžiku žhavení a postupného protahování střední části kapiláry. D: Hotová mikrokapilára. Součástí měřicí aparatury umístěné ve Faradayově kleci je invertovaný mikroskop (Obr. II.2, Be), na jehož pracovní ploše je umístěna měřicí komůrka (C, D) se suspenzí izolovaných buněk. Komůrka obsahuje vedle kovové referenční elektrody (Ch, Dh) také perfúzní systém připojený k peristaltické pumpě (Ad, detail). Buňky jsou tak kontinuálně omývány různými roztoky podle experimentálního plánu. Dále je součástí měřicí aparatury systém sestávající ze stříkaček, silikonových hadiček a elektromagnetických ventilů, který slouží pro rychlou výměnu roztoku v okolí měřené buňky (Bf, Cf, Df). Mikromanipulátor (Bg, detail) pak zajišťuje nezbytné velmi jemné ovládání posunu měřicí hlavy (Ci, Di), na jejímž konci je na kovovou měřicí elektrodu (obvykle Ag/AgCl elektrodu - stříbrný drátek pokrytý vrstvou chloridu 11

12 A a B c f d b e g C D i f i h f h Obr. II.2 Pracoviště vybavené pro měření metodou patch clamp. A: Celé pracoviště zahrnující kovovou Faradayovu klec (a) se speciálním stolem postaveným na vzduchovém polštáři pro omezení přenosu vibrací z podlahy, počítač s monitorem (b) propojený se zesilovačem a digitálně-analogovým převodníkem (c, detail). Součástí pracoviště je rovněž peristaltická pumpa (d, detail) umístěná mimo klec. B: Detail klece a stolu, na kterém stojí invertovaný mikroskop (e) a mikromanipulátor (g, detail). V kleci je rovněž umístěn systém pro rychlou výměnu roztoků v okolí měřené buňky (f) sestávající z několika zkumavek a silikonových hadiček, které vedou do společného aplikátoru (viz C); průtok hadičkami je ovládán prostřednictvím elektromagnetických ventilů. C: Detail měřicí komůrky naplněné suspenzí izolovaných srdečních buněk, ve které je na okraji umístěna kovová referenční elektroda (h). Roztok v komůrce lze měnit buď pomocí peristaltické pumpy umístěné mimo vlastní klec (Ad) nebo prostřednictvím již popsaného systému (f), který umožňuje rychlou výměnu roztoku v bezprostředním okolí měřené buňky. Je zde rovněž vidět dotyková skleněná mikroelektroda (šipka) naplněná roztokem a nasazená na kovovou elektrodu umístěnou na konci měřicí hlavy (i). D: Detailní pohled na měřicí komůrku. 12

13 stříbrného, aby nedocházelo k polarizaci elektrody) nasunuta předem vyrobená a vodivým roztokem naplněná skleněná mikroelektroda (D, šipka). V případě měření metodou patch clamp při měření z celé buňky je skleněná mikroelektroda naplněna roztokem, který se svým složením blíží přirozenému intracelulárnímu prostředí. Existuje více variant tohoto roztoku podle měřeného iontového proudu (specifikováno v jednotlivých publikacích). V našich pokusech nejběžněji užíváme následující variantu (složení v mm): L-aspartát 130, KCl 25, MgCl 2 1, Na 2 ATP 5, EGTA 1, HEPES 5, GTP 0,1, Na 2 -kreatinfosfát 3 (ph = 7,25, nastaveno pomocí KOH). Jakmile je mikroelektroda (Obr. II.3A) pomocí mikromanipulátoru za mikroskopické kontroly přiložena a jemně přitlačena na buněčnou membránu vybrané buňky, prudce vzroste ohmický odpor a na záznamu se sníží velikost proudové odezvy na vnucený napěťový impuls (Obr. II.3B). Následně se okrsek buněčné membrány, který se nachází uvnitř špičky mikroelektrody, pomocí lehkého sání vpáčí a přilne ke A B C D skleněná mikroelektroda gigaseal patch clamp při měření z celé buňky dotyk sání sání buňka vnucovaný napěťový impuls zaznamenávaná proudová stopa Obr. II.3 Získání kontaktu s intracelulárním prostředím metodou patch clamp při měření z celé buňky. Popis v textu. 13

14 stěně mikroelektrody (Obr. II.3C). To vede v ideálním případě k dokonalému kontaktu membrány s mikroelektrodou, což se projeví prakticky úplným vymizením proudu protékajícího mezi elektrodou umístěnou v měřicí komůrce a elektrodou uvnitř skleněné mikroelektrody (Obr. II.3C, dole). Odpor buněčné membrány vzrůstá v tuto chvíli do hodnot až nad 10 GΩ (získání tzv. gigasealu). Poté je možné jemným rychlým sáním buněčnou membránu uvnitř mikroelektrody protrhnout a získat tak přímý elektrický kontakt s intracelulárním prostředím (Obr. II.3D). Na proudovém záznamu se pak objeví celkový membránový proud aktivovaný zvoleným stimulačním napěťovým impulsem aplikovaným z klidového napětí. V případě nízkých impulsů používaných při získávání kontaktu s buněčnou membránou (např. v našich pokusech obvykle 5 mv z klidového napětí -75 mv) jsou patrné pouze tzv. kapacitní špičky, tj. kapacitní proud I c daný nabíjením a následným vybíjením membránové kapacity na počátku a na konci vnucovaného napěťového impulsu (označené šipkami na Obr. II.3D, dole). Velikost I c je omezena sériovým odporem určeným zejména odporem mikroelektrody. Během měření metodou patch clamp je potřeba minimalizovat vliv I c a sériového odporu na měřené iontové proudy. Proto byla po dosažení gigasealu důsledně kompenzována kapacita mikroelektrody. Po protržení okrsku membrány nacházejícího se ve špičce skleněné mikroelektrody byl pak kompenzován sériový odpor (ze 70 až 80 %; minimalizován rovněž použitím mikroelektrody s odporem do 1,5 MΩ) a kapacita membrány měřené srdeční buňky. Pokud stimulační impulsy vycházejí z proudového zdroje (I m ) a jsou zaznamenávány změny membránového napětí U m, jde o metodu vnuceného proudu (current clamp; Obr. II.4, vlevo). Naopak při měření iontových proudů je měřený preparát stimulován napěťovými impulsy (nejčastěji pravoúhlými impulsy různé amplitudy a délky, méně často pilovými impulsy či přirozeným průběhem AN) a registrovány jsou příslušné proudové odezvy - metoda vnuceného napětí (voltage clamp; Obr. II.4, vpravo). V rámci publikací zahrnutých do této habilitační práce byly 14

15 využity obě tyto metody. Konkrétní stimulační protokoly jsou popsány v každé publikaci jednotlivě. V případě měření iontových proudů metodou vnuceného napětí je nezbytné od sebe oddělit jednotlivé složky celkového membránového proudu I m, který je dán součtem I c a proudů tekoucích iontovými kanály a přenašeči (Obr. II.4, vpravo dole). Jak jsem již uvedla, I c byl v našich pokusech z velké části kompenzován tak, aby nenarušoval měření iontových proudů. I m U m I c I to I K, I K1 U m I m I Ca-L I c I Na Obr. II.4 Stimulační impuls (nahoře) a zaznamenaný signál (dole) při metodě vnuceného proudu (current clamp; vlevo) a vnuceného napětí (voltage clamp; vpravo). Obrázek modifikován z publikace Šimurda (1995). Většina našich dosavadních měření byla provedena na izolovaných komorových srdečních buňkách potkana. Jednotlivé složky celkového proudu tekoucího iontovými kanály a přenašeči u těchto buněk během AN (Obr. II.5) můžeme rozdělit na proudy depolarizační a repolarizační. Depolarizační proudy typicky reprezentují sodíkový proud I Na a vápníkový proud typu L I Ca-L. Mezi repolarizační proudy řadíme zejména proudy draslíkové: přechodný proud z buňky I to, zpožděný proud z buňky I K (s jeho dvěma složkami, rychle se aktivující složkou I Kr a pomalu se 15

16 0 mv -90 mv 0 na I Na -12 na 0 na -2 na I Ca-L 1,7 na 0 na I to 0,5 na 0 na 0,5 na I K I K1 0 na 0,2 na 0 na 0,2 na 0 na I NaK I NaCa 0,2 na I Ca-pumpa 0 na ms Obr. II.5 Simulace akčního napětí a iontových proudů srdeční buňky pracovního myokardu komor u potkana na matematickém modelu (Pásek et al. 2006). 16

17 aktivující složkou I Ks zde nerozlišeno vzhledem k jejich malé velikosti u komorových srdečních buněk potkana) a proud I K1. Z proudů nesených iontovými přenašeči je vhodné zmínit alespoň proud nesený Na + /K + -pumpou (I NaK ), Na + /Ca 2+ -výměníkem (I NaCa ) a Ca 2+ -pumpou (I Ca-pumpa ). Koordinovaná a vyvážená funkce jednotlivých iontových kanálů a přenašečů je základním předpokladem fyziologicky probíhající elektrické aktivity srdeční tkáně. K rozkladu proudu tekoucího iontovými kanály a přenašeči na jednotlivé složky je možné využít již známé znalosti týkající se jejich elektrofyziologických vlastností. Využívá se selektivity iontových kanálů k průchodu iontů (pokusy postavené na změnách složení extra- či intracelulárního prostředí), odlišné napěťové závislosti jednotlivých složek a rovněž, snad nejobvykleji, specifických blokátorů iontových kanálů a přenašečů (v našich pokusech např. tetrodotoxin - blokátor I Na, Co 2+ - blokátor I Ca-L, 4-aminopyridin - blokátor I to, tetraethylamonium - blokátor I K ). Teoretický základ určení parametrů aktivace, inaktivace a deaktivace iontových proudů byl detailně popsán např. v nedávné přehledové práci Karmažínová a Lacinová (2010). Použitý biologický materiál Tradiční způsob měření elektrofyziologických vlastností iontových kanálů na izolovaných srdečních buňkách různých živočišných druhů včetně člověka je stále metodou první volby. Hlavní důvodem je snaha co nejméně se vzdálit fyziologickým podmínkám. V naší laboratoři využíváme během posledních let výhradně izolace komorových srdečních buněk potkana, přičemž k vlastnímu měření jsou určeny přednostně buňky z volné stěny pravé komory. Důvodem je značná variabilita elektrofyziologických vlastností různých částí srdeční tkáně daná odlišnou expresí iontových kanálů (Nerbonne 2000, Li et al. 2002), kterou můžeme tímto způsobem alespoň částečně omezit. Izolace srdečních buněk probíhá v několika krocích. Po intramuskulární anestezii potkana kmene Wistar (250 ± 50 g; směs 1% ketaminu - 17

18 Narkamon inj. Spofa, Česká republika - a 2% xylazinu - Rometar inj. Spofa, Česká republika; 0,8 ml/100 g) rozstřihneme hrudník a v co nejkratší době vyjmeme bijící srdce, které umístíme do chladného Krebs-Henseleitova roztoku. Následně srdce co nejrychleji napojíme přes aortu na kanylu zařízení pro perfúzi srdce podle Langendorffa (Obr. II.6a, detail). Zde pak probíhá retrográdní perfúze srdce přes koronární arterie různými roztoky. Jejich základem je Tyrodův roztok (složení v mm: NaCl 135, KCl 5,4, MgCl 2 0,9, HEPES 10, NaH 2 PO 4 0,33, glukóza 10; ph = 7,4, nastaveno pomocí NaOH). Roztoky jsou průběžně okysličovány a hnány peristaltickou pumpou (Obr. II.6b) tenkou silikonovou hadičkou přes kanylu do aorty. Před vstupem do aorty hadička prochází zásobníkem s teplou vodou (Obr. II.6c; teplota udržována termostatem, Obr. II.6d), čímž jsou roztoky zahřívány na 37 ºC. První roztok se svým složením podobá běžnému extracelulárnímu prostředí. Jde o již zmíněný Tyrodův roztok, který navíc obsahuje 0,9 mm CaCl 2 a heparin (Zentiva a.s., Česká republika). V této fázi, trvající dle potřeby 3-5 min, je ze srdce vypláchnuta zbývající krev. Rovněž je možné posoudit, zda nedošlo c a b d a Obr. II.6 Zařízení pro retrográdní perfúzi srdce; a kanyla, b peristaltická pumpa, c zásobník s teplou vodou, d termostat; vložený obrázek vpravo dole detail srdce napojeného na kanylu zařízení. Popis v textu. 18

19 k poškození srdeční tkáně ischemií. To by se projevilo nedostatečnou či nepravidelnou srdeční akcí. Vzhledem k tomu, že volné Ca 2+ značně zvyšují agresivitu enzymů, je srdce nyní propláchnuto roztokem o nulové nominální koncentraci Ca 2+ (max. 4,5 min). Dále již následuje fáze enzymatického natrávení srdeční tkáně a to ve dvou krocích. Nejprve probíhá krátká, zhruba 2,5 min trvající fáze promývání srdce Tyrodovým roztokem bez CaCl 2 obsahujícím enzymy kolagenázu (0,2 mg/ml, např. Collagenase- Yakult, Yakult Honsha Co., Ltd., Japonsko) a proteázu (0,053 mg/ml, typ XIV, Sigma- Aldrich, Co., USA). Ke snížení agresivity enzymů obsahujících i Ca 2+ přidáváme do tohoto roztoku EGTA (obvykle 44 µm, Sigma-Aldrich, Co., USA), případně i albumin (2 mg/ml, Sigma-Aldrich, Co., USA). Poté následuje perfúze srdce druhým enzymatickým roztokem, který se od prvního liší absencí proteázy a albuminu; délka perfúze je přizpůsobována aktuálnímu obrazu natrávení srdeční tkáně, obvykle trvá min. Následně je nutné ze srdce vyplavit zbytky enzymatických roztoků a postupně buňky opět adaptovat na přítomnost extracelulárních iontů Ca 2+. Proto nyní srdce postupně proplachujeme dvěma roztoky s narůstající, ale stále velmi nízkou koncentrací Ca 2+ (0,09 a 0,18 mm). Poté perfúzi srdce ukončíme a do kádinky s 30 ml Tyrodova roztoku obsahujícím 0,18 mm CaCl 2 (37 ºC) odstřihneme volnou stěnu pravé komory. Natrávenou srdeční tkáň za průběžného jemného promíchávání stříháme na drobné kousky, ze kterých se postupně uvolňují jednotlivé srdeční buňky. Suspenzi přefiltrujeme jemným sítkem a pak do ní postupně přiléváme 20 ml Tyrodova roztoku s 1,8 mm CaCl 2 (37 ºC), aby bylo dosaženo původní (a také k měření používané) koncentrace 0,9 mm CaCl 2. Získanou suspenzi izolovaných srdečních buněk uchováváme při pokojové teplotě. Pro měření vybíráme samostatné, nestahující se buňky s dobře patrným příčným pruhováním (Obr. II.7). V určitých případech není využití izolovaných srdečních buněk možné. Jde např. o analýzu vlivu změn genů kódujících strukturu iontových membránových kanálů či různých s nimi asociovaných regulačních molekul na expresi či funkci těchto kanálů u geneticky podmíněných arytmií. Při studiu změn elektrofyziologických vlastností 19

20 Obr. II.7 Mikroskopický obraz srdeční buňky enzymaticky izolované z volné stěny pravé komory potkana s přiloženou dotykovou skleněnou mikroelektrodou. I Na -kanálů postižených mutací F2004L identifikovanou u pacienta s Brugadovým syndromem (Kapitola V) jsme proto použili lidské I Na -kanály přechodně exprimované v buněčné linii pocházející z ovariálních buněk čínského křečka (Chinese Hamster Ovary, krátce CHO, buňky). Exprese iontových kanálů lidského původu může být u těchto buněk, které neobsahují vlastní iontové kanály, navozena pomocí metod genetického inženýrství. Velmi stručně řečeno, CHO buňky byly po přechodné transfekci plasmidem obsahujícím buď přirozeně se vyskytující nebo mutací modifikovaný lidský I Na -kanál pěstovány v inkubátoru při 37 ºC (v atmosféře s 5% CO 2, v živném Hamově médiu F12 obsahujícím 10% fetální telecí sérum a 0,005% antibiotikum gentamycin). Po hodinách byly buňky vyjmuty z inkubátoru a krátce enzymaticky izolovány trypsinem. I Na -kanály byly značeny fluorescenčně, současnou expresí s plasmidem obsahujícím green fluorescent protein (GFP). To umožnilo identifikovat buňky exprimující požadované kanály pomocí fluorescenčního mikroskopu před započetím vlastního měření I Na metodou patch clamp při měření z celé buňky (Obr. II.8). Obr. II.8 Mikroskopický obraz CHO buňky, která vykazuje fluorescenci a tedy exprimuje požadované iontové kanály, s přiloženou dotykovou skleněnou mikroelektrodou. 20

21 III. Nové varianty měření metodou patch clamp Jak bylo zmíněno, technika patch clamp přispívá k detailnímu poznání funkce iontových kanálů již 35 let. Její přínos je nesporný a to v mnoha oblastech od základního výzkumu funkce iontových kanálů za fyziologických i patologických podmínek, přes jejich farmakologické ovlivnění až po analýzu vlivu geneticky podložených změn na funkci iontových kanálů v rámci nejrůznějších dědičně podmíněných onemocnění. Pro další rozšíření možností je velmi významné, že jsou stále hledány nové varianty měření metodou patch clamp, jejichž zmapování jsem se věnovala ve své nedávné přehledové práci (Bébarová Příloha č. 1). Mezi nejvýznamnější z nových variant měření metodou patch clamp patří zcela jistě metoda vnuceného AN (action potential clamp, krátce AP clamp), která k vybuzení iontových proudů využívá místo pravoúhlých či pilovitých napěťových impulsů přímo přirozený průběh AN. Tímto způsobem je pak možné studovat jednotlivé iontové proudy v průběhu přirozeného AN a posoudit podíl těchto proudů na jeho tvorbě (e.g. Štengl et al. 2010). Další významnou modifikaci klasické metody patch clamp užívanou v srdeční elektrofyziologii a zejména v neurofyziologii představuje tzv. dynamický clamp (dynamic clamp). Ten umožňuje studovat např. interakce dvou současně měřených typů excitabilních buněk (např. Purkyňových buněk a buněk pracovní svaloviny srdečních komor Huelsing et al. 1998) či jedné měřené buňky a matematického modelu jiné buňky/buněk (e.g. Wang et al. 2000). Dynamická metoda vnuceného AN (dynamic action potential clamp; Berecki et al. 2005) se ukazuje jako sice technicky velmi náročná, ale na význam získaných dat výnosná metoda. Její uplatnění se alespoň prozatím soustřeďuje na studium vlivu mutovaných iontových kanálů na konfiguraci AN. Obdobná data jsou obvykle získávána prostřednictvím matematického modelování. Žádný matematický model se ale nemůže vyrovnat přímo naměřeným datům, a tak lze předpokládat, že tato modifikace metody patch clamp si najde své 21

22 místo v procesu studia dědičných chorob podmíněných mutacemi iontových kanálů, zejména geneticky podmíněných arytmií typu syndromu dlouhého intervalu QT či BrS. Další novou alternativou klasické metody patch clamp je metoda umožňující díky propojení měřené buňky s matematickým modelem buňky jiného typu měřenou buňku transformovat na buňku jiného typu, např. na srdeční buňku jiného živočišného druhu (cell-type transforming clamp). Konkrétně Ahrens-Nicklas a Christini (2009) s pomocí této metody změnili charakteristické rysy AN myší srdeční buňky tak, že vykazovala AN srdeční buňky člověka. Vzhledem k náročnosti získání lidských srdečních buněk, zejména těch zdravých, by širší využití této metody mohlo značně zjednodušit získávání takových dat, která budou lépe aplikovatelná na situaci u člověka. Úspěch však značně závisí na kvalitě použitého matematického modelu. I proto možná tato metoda prozatím nedoznala rozšíření mezi buněčnými elektrofyziology. Studovat iontové kanály ve specifickém umístění na povrchové membráně (např. v oblasti ústí T-tubulu) je možné díky kombinaci metody patch clamp se systémem skenujícím povrch srdeční buňky pomocí skleněné mikroelektrody s velmi úzkým ústím (stejná mikroelektroda po zaměření lokalizace užita i pro samotné měření; high-resolution scanning patch clamp; Gu et al. 2002). Ani tato metoda se však v buněčné elektrofyziologii doposud nerozšířila. Oproti předchozím modifikacím klasické metody patch clamp představuje metoda automatizovaného patch clampu (automated patch clamp) nikoliv možnost získání jinak nenaměřitelných dat, ale zefektivnění jejich získání. Alternativa současného měření stejného proudu u desítek buněk najednou (a stovek až tisíců buněk za den) je jistě lákavá, zvláště např. při zjišťování ovlivnění iontových proudů nově vyvíjenými látkami jako první protřídění látek, kterými se má cenu zabývat podrobněji. Bohužel se přístroje pro automatizovaný patch clamp prozatím stále potýkají s technickými omezeními a z toho vyplývající omezenou přesností měření. Je zřejmé, že metoda patch clamp je přes svou již třicetipětiletou historii stále na vzestupu a to i díky svým nově vyvíjeným modifikacím a rovněž díky propojení 22

23 s jinými technikami. Širší uplatnění nově vyvíjených modifikací metody patch clamp by v budoucnu mohlo vyústit ve značný posun znalostí z oblasti buněčné elektrofyziologie a přidružených oblastí. Ke zviditelnění nových variant metod patch clamp snad přispěje i komentovaná přehledová práce. Příloha č. 1: Bébarová M. Advances in patch clamp technique: towards higher quality and quantity. Gen Physiol Biophys 2012;31: IF (2011) = 1,192 23

24 Příloha č. 1 Bébarová M. Advances in patch clamp technique: towards higher quality and quantity. Gen Physiol Biophys 2012;31:

25 Gen. Physiol. Biophys. (2012), 31, doi: /gpb_2012_016 M i n i R e v i e w Advances in patch clamp technique: towards higher quality and quantity Markéta Bébarová Department of Physiology, Faculty of Medicine, Masaryk University, Kamenice 5, Brno Bohunice, Czech Republic Abstract. The patch clamp technique, developed in late 1970s, started a new period of experimental cardiac electrophysiology enabling measurement of ionic currents on isolated cardiomyocytes down to the level of single channels. Since that time, the technique has been substantially improved by development of several upgraded modifications providing so far unavailable data (e.g. action potential clamp, dynamic clamp, high-resolution scanning patch clamp), or facilitating the patch clamp technique by increasing its efficiency (planar patch clamp, automated patch clamp). The current review summarizes the leading new patch clamp based techniques used in cardiac cellular electrophysiology, their principles and prominent related papers. Key words: Action potential clamp Dynamic clamp Cell-type transforming clamp Highresolution scanning patch clamp Automated patch clamp Introduction Based on his experiments which considerably contributed to the formulation of theory of electrical excitation, Luigi Galvani anticipated the existence of ionic channels already at the end of 18 th century (Piccolino 1998). Nevertheless, the assumed structure of plasmalemma was supplemented with associated proteins including ionic channels as late as in the 1930s (Danielli and Davson 1935). Direct data proving their existence were still missing. In 1939, Hodgkin and Huxley began to work together. They measured both the membrane voltage and currents in the squid giant axons using longitudinal metal electrodes. Unfortunately, their work was interrupted by the World War II. In 1952, they published a series of five papers describing the results of their experiments. In the last paper (Huxley and Hodgkin 1952), they united all the acquired data and transformed them into a mathematical model which resulted in determination of the laws that govern the movement of ions in a nerve cell during action potential (AP). In the meantime, to acquire direct data proving the existence of ionic channels, a special method was sought capable to get a sufficiently tight connection with a small region of the cellular membrane providing the possibility Correspondence to: Markéta Bébarová, Department of Physiology, Faculty of Medicine, Masaryk University, Kamenice 5, Brno Bohunice, Czech Republic bebarova.lfmu@centrum.cz to record electrical processes with a low level of undesirable noise. In 1949, measurement of the membrane voltage using penetrating glass microelectrodes filled with 3 M potassium chloride was first introduced (Ling and Gerard 1949). Later modification of this technique which used apposing glass microelectrodes resulted in development of the patch clamp technique. It was first used by Neher and Sakmann (1976) to analyse ionic currents through single acetylcholineactivated membrane channels in the frog skeletal muscle. Many improvements of the patch clamp technique have been introduced since that time. In this review, a summary of the most important upgraded modifications of the patch clamp technique and their application in the cardiac cellular electrophysiology is presented. Conventional patch clamp technique The principle of the patch clamp technique has been most recently described by e.g. Ogden and Stanfield (1994); Karmažínová and Lacinová (2010). Shortly, it is based on an electrical isolation of a patch of membrane from the external solution which makes it possible to measure the current flowing into the patch. Fire-polished glass microelectrodes filled with an electrolyte solution are gently pressed against the membrane and a light suction is then applied to get the high-resistance seal (usually called gigaseal because the resistance should exceed 10 GΩ to satisfactorily reduce noise). The measurements may be done either on the

26 132 Bébarová whole-cell or single channel level (cell-attached, inside- or outside-out), depending on the final configuration of the microelectrode and cell membrane, and on composition of the solution inside the microelectrode (the pipette solution) and outside the cell (the bath solution; e.g. Ogden and Stanfield 1994). The whole-cell mode is the most often used mode of the patch clamp technique. In the current clamp mode, recorded are either spontaneous APs in spontaneously active cells (e.g. sinus node cells) or APs in spontaneously inactive cells (atrial and ventricular myocytes) stimulated by short supra-threshold current pulses. If voltage pulses (most often rectangular) are applied, ionic membrane current may be measured (the voltage clamp mode). To separate the particular ionic currents, voltage pulses are used of various duration and amplitude (based on knowledge of time- and voltage-dependent characteristics of the currents), as well as specific inhibitors. Examples of upgraded modifications of patch clamp technique AP clamp In contrast to conventional patch clamp where rectangular (or less often ramp) voltage pulses are used to elicit ionic currents, a native AP waveform is used for stimulation of the measured cell in the course of AP clamp experiment. This method, which shifts the patch clamp measurements closer to physiological conditions, was first used in isolated cardiomyocytes by Doerr et al. (1989, 1990). The key advantage of AP clamp is the possibility to analyse particular ionic currents and related subcellular processes during the course of natural AP waveform and explore their contribution to its formation. Despite providing interesting data, it is used rather exceptionally. The reason might be that the conventional voltage clamp measurements offer precise voltage and time characteristics of the ionic channel function which can be more easily compared among various laboratories and used for adjustment of mathematical models of cardiac cells. Regarding some of the recently published papers based on AP clamp data, Stengl et al. (2010) proved a linkage between the diminished L-type calcium current and AP shortening as observed in isolated ventricular cardiomyocytes and right ventricular trabeculae, respectively, of a clinically relevant porcine model of hyperdynamic septic shock. Cooper et al. (2010) found that Ca 2+ release from the sarcoplasmic reticulum is significantly decreased when the cell is stimulated with AP waveform characteristic for the cardiac failure (an absence of AP notch). This behaviour indicates an impaired excitation-contraction coupling. The currently available possibilities of use of AP clamp to test the selectivity of compounds affecting cardiac ionic channels have been recently reviewed by Szentandrássy et al. (2011). Several modifications of AP clamp technique have been introduced. Banyasz et al. (2011) developed the so-called AP clamp sequential dissection technique. It is based on recording the steady-state AP in the current clamp mode which is subsequently used to stimulate the same cell in the voltage clamp mode. If the properties of the cell did not change since the time of AP recording, no current is measured in the control conditions (baseline current; Fig. 1A). Unstable cells with non-zero baseline current were not included in the study. After adding a specific inhibitor, the compensatory current can be recorded. The inhibited current can be obtained by subtracting the compensatory current from the baseline current. If another specific inhibitor is added (Fig. 1B), the compensatory current is formed by both inhibited currents. The second current can be then separated by subtracting the second compensatory current from the first one. Other specific inhibitors can be then sequentially added to separate further currents. Thus, this technique enables to concurrently record several ionic currents in a single cardiomyocyte (Fig. 1C). These authors revealed a large variability of ionic currents among isolated guinea-pig ventricular cardiomyocytes and also observed that ionic currents in a cardiomyocyte are coordinated. Dynamic clamp The dynamic clamp technique (reviewed by Wilders 2006) is based on conventional current clamp. It is characterized by stimulation of the measured cell with the real-time recorded or simulated current which is a function of the freerunning APs. This method was first introduced by S. Scott in 1979 who electrically connected two independent groups of isolated cardiomyocytes free of physical contact. It enabled their interaction and essentially functioned as virtual gap junctions. The dynamic clamp was then further worked up and applied also in other cell types, e.g. in endocrine cells or neurons. Nowadays, it is even more often used in neurophysiology than in cardiac electrophysiology, e.g. in studies focused on the synaptic activity (Economo et al. 2010). Three basic configurations of the dynamic clamp technique are used in the cardiac cellular electrophysiology: the coupling clamp, model clamp and dynamic AP clamp (Fig. 2). Coupling clamp The coupling clamp configuration (Fig. 2A) simulates the above mentioned electrical connection (coupling) of cells. The membrane potentials of both cells (V m,1 and V m,2 ) are recorded in the current clamp mode. The recorded values of

27 Advances in patch clamp 133 V m,1 and V m,2 are sampled into a personal computer (PC) which computes, based on the difference between V m,1 and V m,2, the coupling current I c flowing from myocyte 1 to 2 (i.e. the difference of their total ionic membrane currents) in the real-time. Then, PC discharges the command potentials V cmd,1 and V cmd,2 to the respective amplifiers which generate the required current pulse contributing to the total membrane current and, thereby, affecting the membrane potential. If the appropriate I c is applied, V m,1 and V m,2 can be synchronized. The coupling clamp has been used to study e.g. electrotonic modulation of the pacemaker activity of the sinoatrial node by the atrial muscle (Watanabe et al. 1995), or the interaction between Purkinje cells and ventricular cardiomyocytes (Huelsing et al. 1998). In some of these studies (e.g. Watanabe et al. 1995), one of the cells is replaced by a model of cardiomyocyte. Model clamp In case of the model clamp configuration (Fig. 2B), the dynamic clamp measurement is performed only in one cell whose V m is continuously sampled to PC computing the V m -dependent current I x. This current is enriched by simulated additional conductance. Eventually, the corresponding command potential V cmd is amplified and injected into the myocyte. This method was used to study, among others, the impact of depolarized, inexcitable cardiomyocytes in the ischemic tissue on the neighbouring cells (the so-called injury current; Verkerk et al. 2000), or consequences of artificially implemented specific ionic current in cells where it is not naturally present (e.g. transient outward potassium current I to in guinea-pig or canine endocardial ventricular myocytes Dong et al. 2006). Even the whole model cell may be interconnected with the measured cell (as mentioned above) or the measured Figure 1. Action potential clamp sequential dissection technique. When the measured cell is stimulated with its own steady-state action potential, no current is recorded (baseline). After adding of chromanol-293b, a specific inhibitor of slow delayed rectifier potassium current I Ks, the compensatory current will appear. I Ks can be obtained by subtracting the compensatory current from the baseline (A). After adding of E4031 (inhibitor of fast delayed rectifier potassium current I Kr ), the compensatory current is formed by both I Ks and I Kr. I Kr can be then separated by subtracting the second compensatory current from the first one (B). Using additional specific inhibitors sequentially (e.g. nisoldipine to inhibit calcium current I Ca and Ba 2+ to inhibit inward rectifier potassium current I K1 ), this technique makes it possible to concurrently record several ionic currents in a single cardiomyocyte (C). V m, membrane potential; I m, membrane current. Modified with permission from Banyasz et al. (2011).

28 134 Bébarová Figure 2. Three configurations of dynamic clamp usually used in cardiac cellular electrophysiology. A. Coupling clamp. Membrane potentials of both cells (V m,1 and V m,2 ) are recorded and sampled into a personal computer (PC) which computes, based on the difference between V m,1 and V m,2, the coupling current I c (i.e. the difference of total ionic membrane currents of both myocytes) in the real-time. Then, PC discharges the command potentials V cmd,1 and V cmd,2 to the respective amplifiers which generate the required current pulse to synchronize V m,1 and V m,2. B. Model clamp. The dynamic clamp measurement is performed only in one cell whose V m is continuously sampled to PC computing the V m -dependent current I x. This current is enriched by simulated additional conductance. Eventually, the corresponding command potential V cmd is amplified and injected into the myocyte. C. Dynamic action potential clamp. The analysed cardiac ionic current is specifically inhibited and replaced by an ionic current conducted through the required ionic channels, either wild-type or mutant, expressed in a cell line, e.g. in the human embryonic kidney (HEK) 293 cells. The cell line cell is stimulated with AP waveform continuously recorded from the cardiomyocyte. Modified with permission from Wilders (2006).

29 Advances in patch clamp cell may be placed into a virtual network of myocytes (e.g. Wang et al. 2000). Dynamic AP clamp Berecki et al. (2005) described another configuration of the dynamic clamp which combines AP clamp and dynamic clamp techniques and is called the dynamic AP clamp (Fig. 2C). The analysed cardiac ionic current is specifically inhibited (or abolished if a model of cardiomyocyte is used) and replaced by an ionic current measured in a cell line, e.g. in the human embryonic kidney (HEK) 293 cells in Berecki et al. (2005). On the surface of these cells, only the required ionic channel is expressed, either wild-type or mutant. The cell line cell is stimulated with AP waveform continuously recorded from the cardiomyocyte (or generated by the model). Berecki et al. (2005) used this technique to readily and unambiguously determine the effect of herg mutation R56Q (identified in a patient with long QT syndrome) on AP configuration in particular layers of ventricular myocardium. Electrophysiological properties of R56Q-hERG mutation found out with the conventional whole-cell patch clamp technique showed controversial changes of AP duration. The observed faster deactivation was supposed to result in AP prolongation whereas the contemporary present faster activation should theoretically cause AP shortening. The dynamic AP clamp proved that this mutation leads to AP prolongation. Berecki et al. (2006) used the same technique also in the subsequent study focused on an analogical analysis of two sodium channel mutations identified in patients with long QT syndrome. Possible applications of the dynamic AP clamp in the studies analysing the consequences of cardiac ionic channel mutations related to inherited arrhythmias were resumed in 2007 (Berecki et al. 2007). Another scientific group has recently applied this method in the same way to reveal the effects of a sodium channel mutation identified in a patient with Brugada syndrome (Marangoni et al. 2011). Benefits and limitations of dynamic clamp 135 The described modifications of the dynamic clamp and their utilization in cardiac cellular electrophysiology clearly indicate that this method offers direct responses to many issues related to the basic cellular mechanisms of AP formation, propagation and synchronisation in both healthy and diseased myocardium. On the other hand, the dynamic clamp, as any other experimental technique, has its limitations. First, it is a quite challenging technique requiring simultaneous measurement from two cells (except for the model clamp). In case of the model clamp, the used mathematical description of ionic current has to be accurate indeed to provide reliable results. An important limitation is that the injected current enters the cell through the glass microelectrode rather than through the real ionic channels which makes impossible to study the signal conduction effects of the current, and may result in differences in ions carrying the current and local changes of ionic concentrations. Other limitations are related to the technical demands, e.g. keeping latency between the acquiring voltage and applying the current based on that voltage as short as possible, or scaling the current measured in the expression system before its injection to the myocyte in a proper way (dynamic AP clamp). Hence, much of expertise is required to perform experiments with the dynamic clamp technique, however, the invested effort may be rewarded by interesting and relevant data. Cell-type transforming clamp Recently, Ahrens-Nicklas and Christini (2009) have introduced a new method which, similarly to the dynamic AP clamp, is based on both AP clamp and dynamic clamp techniques. It is called the cell-type transforming clamp and should be able to suppress the interspecies differences of AP configuration in the real time. As shown in Figure 3A, the membrane voltage of the target cell (the one whose characteristics are required to be changed; here the mouse cardiomyocyte) is measured and put into to the targetcancelling model and recipient model (the model of the desired cell type, e.g. human cardiomyocyte). Each model cell current (I cancel and I recip, respectively) is calculated and the difference current (I diff ) is then obtained. The current compensating the seal leak (I seal ) and stimulus current (I s- tim) are subsequently added to I diff to produce the injected current (I inj ) which is injected into the target cell. It results in a change of AP configuration in the mouse cardiomyocyte (Fig. 3B) to that typical for the human one including identical dynamics of changes of AP waveform (Fig. 3C). Considering a notably higher availability of mouse cardiomyocytes, this technique might provide data relevant for human cardiac electrophysiology in a much easier and likely also cheaper way. However, several limitations have to be taken into account when using this technique. The eligibility of compensation of differences in particular components of the total membrane ionic current between the measured (target) and required (model) cell type notably depends on the quality of the used model. Even if the model is superior, it is, however, always created to fit the data under specific experimental conditions. Thus, running the model under conditions far from those used to make it may induce considerable inaccuracies in the cell dynamics. Errors in the circuit (caused by mismatch between the target cell and the target-cancelling model, or mismeasurement of the target cell capacitance) unwillingly modifying the obtained results may also ap-