Masarykova univerzita v Brně Lékařská fakulta

Transkript

1 Masarykova univerzita v Brně Lékařská fakulta DIAGNOSTIKA DYSPLÁZIÍ A KARCINOMU DĚLOŽNÍHO HRDLA Bakalářská práce v oboru zdravotní laborant Vedoucí bakalářské práce: MUDr. Pavla Rotterová, Ph.D. Autor: Ivana KOMÁRKOVÁ Brno, duben 2009

2 Jméno a příjmení: Ivana Komárková Název bakalářské práce: Diagnostika dysplázií a karcinomu děložního hrdla Pracoviště: Sanatorium Helios, s.r.o. Brno Vedoucí bakalářské práce: MUDr. Pavla Rotterová, Ph.D. Rok obhajoby bakalářské práce: 2009 Souhrn: Nádorové onemocnění děložního hrdla je druhé nejčastější onemocnění žen na světě s vysokou incidencí a mortalitou. Nejdůležitější etiologický faktor podílející se na vzniku dysplázií a karcinomu děložního hrdla je Human Papilloma Virus (HPV), který se přenáší pohlavním stykem. V případě včasného záchytu dysplastických změn a karcinomu děložního hrdla pomocí diagnostických metod může být okamžitě zahájena správná a účinná léčba. Diagnostické metody sloužící k záchytu tohoto onemocnění lze rozdělit na prebioptické a bioptické metody. V praktické části bakalářské práce chci zjistit percentuální zastoupení High Grade léze v testovaném souboru pacientek. Dále zjistit věkovou hranici pacientek, v níž je největší promořenost High Grade léze, a také zjistit, zda-li diagnostické metody použité ke stanovení dysplázií a karcinomů děložního hrdla pracovaly správně a korespondovaly s histologickým vyšetřením. Klíčová slova: Bethesda systém, dysplázie, HPV, karcinom děložního hrdla, vakcinace Souhlasím, aby práce byla půjčována ke studijním účelům a byla citována dle platných norem.

3 PROHLÁŠENÍ AUTORA Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci vypracovala samostatně pod vedením MUDr. Pavly Rotterové, Ph.D. a uvedla v seznamu literatury všechny použité literární a odborné zdroje. V Brně dne

4 PODĚKOVÁNÍ AUTORA Chtěla bych tímto poděkovat vedoucí bakalářské práce MUDr. Pavle Rotterové, Ph.D. za odborné vedení, teoretické rady a připomínky, které mi při vypracování práce vždy ochotně poskytla. Dále také děkuji sanatoriu Helios, s.r.o Brno, zejména vedoucí cytologické laboratoře Mgr. Ireně Večerkové za ochotu a vstřícnost při poskytnutí interních záznamů. V Brně dne

5 OBSAH ABECEDNÍ SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK ÚVOD CHARAKTERISTIKA PROBLÉMU HISTOLOGICKÁ STAVBA DĚLOŽNÍHO HRDLA DYSPLÁZIE DĚLOŽNÍHO HRDLA NÁDORY DĚLOŽNÍHO HRDLA RIZIKOVÉ FAKTORY PODÍLEJÍCÍ SE NA VZNIKU DYSPLÁZIÍ A KARCINOMU DĚLOŽNÍHO HRDLA HUMAN PAPILLOMA VIRUS (HPV) TYPY HPV MOŽNÉ ZPŮSOBY NÁKAZY HPV INFEKCE PREVENCE PRIMÁRNÍ PREVENCE SEKUNDÁRNÍ PREVENCE TERCIÁRNÍ PREVENCE PROGRAM PREVENTIVNÍCH PROHLÍDEK V ČESKÉ REPUBLICE VAKCINACE Rizikovost vakcín Rozdíly mezi vakcínou Silgard a Cervarix LABORATORNÍ DIAGNOSTIKA MIMOLABORATORNÍ FÁZE Příprava pacienta před odběrem Odběr vzorku Identifikace vzorku Transport vzorku PREANALYTICKÁ FÁZE ANALYTICKÁ FÁZE POSTANALYTICKÁ FÁZE DIAGNOSTICKÉ METODY KOLPOSKOPIE Rozdělení kolposkopie Kolposkopická nomenklatura CERVIKOGRAFIE CYTOLOGICKÉ VYŠETŘENÍ Funkční cytologie Onkologická cytologie Klasifikace cytologických a patologických nálezů TESTY URČENÉ PRO DIAGNOSTIKU HR HPV LÉZE BIOPTICKÉ VYŠETŘENÍ TERAPIE IMUNOHISTOLOGICKÉ METODY CÍLE BAKALÁŘSKÉ PRÁCE METODIKA

6 8. 1. PŘEHLED VŠECH ZKOUMANÝCH PACIENTEK PŘEHLED POUŽITÝCH DIAGNOSTICKÝCH METOD A JEJICH VÝSLEDKY PŘEHLED PACIENTEK, U KTERÝCH BYLA PROKÁZÁNA DIAGNÓZA HSIL PACIENTKY, U KTERÝCH SELHALY PREBIOPTICKÉ METODY (KOLPOSKOPICKÉ VYŠETŘENÍ A ONKOLOGICKÁ CYTOLOGIE) STATISTICKÉ HODNOCENÍ VYHODNOCENÍ ZÁVĚR...46 PŘEHLED POUŽITÉ LITERATURY...47 SEZNAM PŘÍLOH

7 ABECEDNÍ SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK AG Antigen AGC Atypické glandulární buňky AGC NEO Atypické glandulární buňky spíše maligní AGC NOS Atypické glandulární buňky blíže nespecifické AIS Endocervikální karcinom in situ ASC Atypické dlaždicové buňky ASC H Atypical Squamous Cell (nelze vyloučit HSIL) ASC US Atypical Squamous Cell of Undertermined Significience (atypické dlaždicové buňky nejasného významu) ATZ Atypická transformační zóna cdk Cyklin dependentní kináza CIN Cervikální intraepiteliální neoplázie COP Centrum onkologické prevence ČR Česká republika DNA Deoxyribonukleová kyselina E Ektopie nebo ektropium EC/TZ Epitel cylindrický/transformační zóna EI Index eozinofilní EIA Enzym Imunno Assay ELISA Enzym Linked Imumuno Sorbent Assay FIA Fluorescent Imunno Assay FIGO International Federation of Gynecology and Obstetrics HE Hematoxylin eozin HG High Grade HPV Human Papilloma Virus HR High Risk HSIL Střední a těžká dlaždicobuněčná intraepiteliální neoplázie IFCPC International Federation Cervical Pathology and Colposcopy (mezinárodní organizace pro cervikální patologii a kolposkopii) IUD Nitroděložní tělísko KI Index karyopyknotický LEEP Loop Electro Excision Procedure ( metoda excize elektrickou kličkou)

8 LEETZ LG LIS LR LSIL MI N/C PAP PCR PE RIA PL p16 Rb RNA SIL TZ VIN WHO Large Loop of Transformation Zone Low Grade Laboratorní informační systém Low Risk Lehká dlaždicobuněčná intraepiteliální neoplázie Index maturační Nuklecytoplazmatický poměr Peroxidase Anti Peroxidase Polymerase chain reaction Původní epitel Radio Imunno Assay Protilátka Protein p16 Retinoblastomový gen Ribonukleová kyselina Skvamózní intraepiteliální léze Transformační zóna Vulvární intraepiteliální léze World Health Organization (světová zdravotnická organizace)

9 1. ÚVOD Maligní nádorová onemocnění v mnohých z nás neustále vzbuzují velké obavy, strach a respekt. Není se čemu divit, vždyť právě maligní nádory patří mezi nejobávanější smrtelná onemocnění (hned po srdečních a cévních chorobách) na celém světě. Dříve převládal názor, že nádorovému onemocnění nelze žádným způsobem předejít. Tento předpoklad však v dnešní době můžeme považovat za scestný a nepravdivý. Ba naopak, dnešní moderní společnost nás neustále vybízí a nutí nejen k ochraně přírody a ovzduší, ale také k ochraně nás samotných. Již od narození se učíme, co je povoleno zakázáno, co se smí nesmí nebo co je pro nás bezpečné škodlivé. Můžeme tedy říci, že jsme plně informováni o věcech, které nám mohou ublížit, poškodit naše zdraví, zabít nás. I přes veškeré tyto informace mnoho z nás tato pravidla nedodržuje a vědomě své zdraví poškozuje. Preventivní opatření patří mezi zásadní kroky, kterými lze předejít vzniku rakoviny, a je okamžik, kdy záleží jen a jen na nás, jak se svým zdravím naložíme. K odhalení prekancerózních stavů či maligních nádorů nám pomáhá stanovení včasné a správné diagnózy, která je zjištěna na základě správně zvolených a použitých diagnostických metod. V případě pozitivního průkazu dysplázie či karcinomu musí být zvolena správná a hlavně účinná léčba. Nádorové onemocnění děložního hrdla je v dnešní době hodně diskutované téma. Mohou nás o tom přesvědčit letáky v ordinacích praktických a gynekologických lékařů, dále média jako rozhlas, televize a noviny. Zde všude jsou vyzývány mladé ženy a matky k tomu, aby nechaly sebe i své dcery naočkovat a ochránily se tak před vznikem dysplázií a karcinomu děložního hrdla. Téma své bakalářské práce Diagnostika dysplázií a karcinomu děložního hrdla jsem si zvolila z několika důvodů. Jedním z nich je fakt, že problematika karcinomu děložního hrdla se týká všech žen na celém světě, a tedy i mne, nevyjímaje. Dále je to má čtyřletá praxe v oboru gynekologické cytologie v cytologické laboratoři sanatoria Helios, s.r.o v Brně, která se zabývá cytologickou diagnostikou stěrů z vulvy, pochvy, děložního hrdla, dělohy, dále punktáty z cyst a lavážemi. A v neposlední řadě je to skutečnost, že karcinom děložního hrdla je druhý nejčastější nádor žen s vysokou mortalitou nejen v České republice (ČR), ale na celém světě.

10 Cílem mé bakalářské práce je zkoumání problematiky vzniku dysplázií a karcinomů děložního hrdla, faktorů, jež mohou ke vzniku dysplázií a karcinomů přispět, a dále diagnostických postupů a metod sloužících k záchytu tohoto onemocnění.

11 2. CHARAKTERISTIKA PROBLÉMU Základy cytologické diagnostiky položil americký gynekolog řeckého původu pan Papanicolaou, který se jako první začal zabývat problematikou vzniku dysplázií a karcinomu děložního hrdla (Eliášová A. aj., 2008). Zhoubná gynekologická onemocnění děložního hrdla se řadí k nejčastějším nádorům žen, v celosvětovém měřítku zaujímají druhé místo (první příčku stále drží karcinom prsu). Za rok se na celém světě počet nově diagnostikovaných karcinomů děložního hrdla vyšplhá na číslo a z tohoto velkého počtu žen tomuto onemocnění podléhá (Yim E. K., Park J. S., 2006). V ČR se incidence (což je počet nových onemocnění na žen za 1 rok) karcinomu děložního hrdla pohybuje zhruba okolo nových případů na žen, tj až 1200 nových případů ročně, z toho přibližně 400 žen umírá (Dvořák V. aj., 2006). Obrázek č.1: Incidence a mortalita nádoru děložního hrdla v České republice (Převzato z

12 2. 1. Histologická stavba děložního hrdla Děložní hrdlo je složeno ze složky EXOCERVIKÁLNÍ, která je pokryta mnohovrstevným dlaždicovým epitelem, jenž je tvořen čtyřmi vrstvami buněk: bazální, parabazální, intermediální a superficiální. Pro cytologickou klasifikaci se hodnotí jen buňky parabazální, intermediální a superficiální, protože bazální buňky při cytologickém stěru nelze odebrat. ENDOCERVIKÁLNÍ složka je vystlána jednovrstevným cylindrickým epitelem s řasinkami, který je citlivý na hormonální změny (Roztočil A., 1998). Přechod mezi těmito dvěma částmi děložního hrdla tvoří TRANSFORMAČNÍ ZÓNA (TZ), která je místem největšího výskytu dysplastických změn a karcinomů děložního hrdla (Rob L. aj., 2008). V místě TZ dochází k dlaždicové metaplázii buněk, což je přeměna diferencovaného cylindrického epitelu v diferencovaný typ epitelu dlaždicového. Dlaždicová metaplázie epitelu se rozvíjí ve třech stádiích: hyperplázie rezervních buněk, nezralá dlaždicová metaplázie a zralá dlaždicová metaplázie (Kubálek V., 2001) Dysplázie děložního hrdla Přednádorový stav se dříve označoval pojmem prekanceróza, v dnešní době se tento termín nedoporučuje používat, protože vyvolává mylné informace o tom, že každé takové onemocnění se musí zvrhnout v maligní proces. Z tohoto důvodu se začalo užívat termínu dysplázie děložního hrdla (Mačák J. aj., 2004). Vznik dysplastických změn je spojen s přítomností Human Papilloma Viru (HPV) a dalších rizikových faktorů. Dysplastické léze vznikají na úrovni bazální membrány a rostou směrem k povrchu (Kobilková J. aj., 2003). Dysplázie dlaždicových buněk se označují dle histologické nomenklatury jako cervikální intraepiteliální neoplázie (CIN) nebo také jako skvamózní intraepiteliální léze (SIL) (Tavassoli F.A., Devilee P., 2003). Na základě histologického obrazu se dysplastické změny člení do 3 stupňů: CIN I lehká dysplázie epitel nevyzrává do 1/3 šíře epitelu CIN II střední dysplázie nevyzrává do 2/3 epitelu CIN III těžká dysplázie nevyzrává v celé šíři epitelu (Tavassoli F.A., Devilee P., 2003).

13 Histologická a cytologická korelace (Bethesda systém 1988, 1981, 2001) CIN I odpovídá Low Grade Squamous Intraepithelial Lesion (LSIL) CIN II a CIN III odpovídá High Grade Squamous Intraepithelial Lesion (HSIL) (Kobilková J. aj., 2003). Dysplázie žlázových buněk se člení na: atypické žlázové buňky bez bližší specifikace (AGC NOS) atypické glandulární buňky spíše neoplastického původu (AGC NEO) (Kobilková J. aj., 2003) Nádory děložního hrdla Obecně je maligní nádorová buňka definována jako buňka s porušeným geonomem, která se vymyká svým regulačním mechanizmům, což vede k nekontrolovatelnému růstu buňky (Rob L. aj., 2008). Nádory podle histogeneze můžeme rozdělit na mezenchymové, epitelové, z nervové tkáně, smíšené, teratom a nádory trofoblastu (Mačák J. aj., 2004). Nádory děložního hrdla mohou být maligní nebo benigní, k maligním nádorům řadíme: Dlaždicobuněčný karcinom představuje zhruba 90 % všech karcinomů děložního hrdla (Vernerová Z., 2004). Člení se na Velkobuněčný karcinom keratinizující nebo nekeratinizující a Malobuněčný karcinom. Karcinom může růst exofyticky, tj. ve formě bělavého květákovitého útvaru, na dotyk krvácejícího, anebo endofyticky, kdy dochází k infiltraci spodiny (Kobilková J. aj., 2005). Karcinom se šíří jednak intraepiteliálně, tzn. nepřekročí bazální membránu, a označujeme jej těžká dysplázie (CIN III). Dalším typem dlaždicobuněčného karcinomu je invazivní karcinom, který naopak roste přes bazální membránu (Kubálek V., 2001). Zbylých 10 % připadá na Adenokarcinom vycházející ze žlázových buněk děložního hrdla (Kobilková J. aj., 2005) Rizikové faktory podílející se na vzniku dysplázií a karcinomu děložního hrdla Na vzniku dysplázií a karcinomu děložního hrdla se podílí mnoho rizikových faktorů. Za hlavní považujeme HPV. Existuje zřejmě mnoho příčin, které vedou ke vzniku maligních nádorů, ale ty nejsou buď objeveny nebo zcela objasněny.

14 U karcinomu děložního hrdla považujeme za nejčastější rizikové faktory následující: brzká sexuální aktivita časté střídání sexuálních partnerů promiskuita nadměrné pití alkoholu kouření cigaret dehet a cigaretový kouř jsou považovány za vysoce karcinogenní látky stresové situace nesprávná úprava pokrmů nedodržování pravidelných gynekologických prohlídek každá dívka starší 15 let by měla pravidelně jednou za rok navštívit svého gynekologa oslabený imunitní systém čím více je imunitní systém oslaben, tím je větší riziko nákazy viry, bakteriemi a plísněmi výskyt jiných pohlavních onemocnění s četnou opakovatelností např. chlamydiové infekce genetická predispozice (Kalábová R., 2003).

15 3. HUMAN PAPILLOMA VIRUS (HPV) Jedná se o nejvýznamnější etiologický faktor podílející se na vzniku dysplázií a karcinomu ženského genitálu. Přítomnost dalších rizikových faktorů napomáhá HPV k napadení organismu a k vyvolání karcinomu děložního hrdla (Chovanec J. aj., 2008). HPV jsou malé deoxyribonukleové (DNA) viry s onkogenním potenciálem. Tvoří samostatnou skupinu zvanou papillomaviridae. V dnešní době je objeveno na 130 různých typů tohoto viru. HPV je považován za nejčastější sexuálně přenosný vir, který vyvolává nádorové onemocnění. Průměrná inkubační doba HPV je okolo 4 měsíců (Sláma J. aj., 2007a). Místem vstupu HPV jsou mikrotraumata kůže a sliznic. Virové partikule vstupují do zárodečných buněk bazálních vrstev epitelu a v jejich jádrech se replikují. Ke kompletizaci virionů dochází až v diferencovaných buňkách superficiální vrstvy epitelu (Sláma J. aj., 2007a). HPV se v dnešní době řadí k nejčastějším sexuálně přenosným virům. Během života se HPV infekcí nakazí okolo 80 % lidí, nejvyšší prevalence u žen podle celosvětového měřítka je okolo 20. roku života. HPV infekce většinou probíhá bezpříznakově a 90 % infekcí HPV během života vymizí (Rotterová P., 2008). Obrázek č.2: Model kapsidy HPV (Převzato z Typy HPV Papillomaviry jsou typické tím, že jsou druhově i orgánově specifické. Díky této vlastnosti je dělíme na kožní a slizniční. Dále se podle stupně rizikovosti (onkologenní schopnosti) člení

16 na nízce rizikové typy Low Risk (LR) a vysoce rizikové typy High Risk (HR) (Mykišková I. aj., 2003). První HPV byl objeven v roce 1933, již v roce 1979 se vědělo o 5 typech HPV a v současné době je známo na 130 různých druhů HPV infekce. S velkou pravděpodobností lze odhadnout, že toto číslo není konečné. Za zdroj HPV infekce jsou považováni muži, nejvyšší prevalence HPV je zjištěna na glans penis a preputiu (Tachezy R., 2006). Tabulka č. 1: Typy HPV HR HPV 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73, 82 HL HPV 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 72, 81 (Převzato z Sláma J. aj., 2007). Obrázek č. 3: Genom Lidského Papillomaviru (Převzato z

17 3. 2. Možné způsoby nákazy HPV infekce Lidské papillomaviry se přenáší nejrůznějšími sexuálními praktikami, nejčastěji však pohlavním stykem. HPV způsobují karcinom děložního hrdla, ale mohou vyvolat i další maligní onemocnění, a to karcinom anogenitální oblasti, karcinom kůže, karcinom hlavy a karcinom krku. K dalším možnostem nákazy patří přenos HPV z matky na dítě při porodu (perinatální přenos), transplacentární přenos a přenos kontaktem kůže (Tachezy R., 2006).

18 4. PREVENCE Nejúčinnější a nejlevnější prevencí proti všem onkologickým chorobám je informování veřejnosti o rizicích jejich vzniku a možnostech změn životního stylu (Holubová A., 2007) Primární prevence Je namířena na zdraví jedinců. Jejím smyslem je zajistit lepší životní styl a tím předejít nemocem, tzn., že člověk se má vyhnout rizikovým faktorům, které by mohly nějakým způsobem ohrozit nebo narušit jeho zdraví. K nejvíce ohrožujícím faktorům řadíme tučná jídla, kouření cigaret, pití alkoholu, stres aj. (Holubová A., 2007) Sekundární prevence Má za úkol včas zachytit již propuklé onemocnění v jeho časném stádiu a zajistit, aby nemoc dále neprobíhala. Toho se dá dosáhnout pravidelnými kontrolami u lékaře (Holubová A., 2007) Terciární prevence Zabývá se skupinou lidí, u kterých již nemoc propukla. Tito nemocní jsou již v rukou specializovaných lékařů (onkologů), kteří sledují jejich zdravotní stav. I v případě vyléčení jsou pacienti nadále sledováni pro případ, že by se onemocnění vrátilo. Jsou vedeni v tzv. dispenzáři (Holubová A., 2007) Program preventivních prohlídek v České republice Na preventivní onkologické vyšetření má nárok každý občan České republiky. Vyšetření slouží k včasnému záchytu nádorových onemocnění a jsou v plné výši hrazena zdravotními pojišťovnami. ženy od 15 let mají nárok každý rok na pravidelnou gynekologickou prohlídku od 18 let věku se každý jednou za rok může zúčastnit stomatologické prohlídky od 18 let každé dva roky preventivní prohlídka u praktického lékaře

19 ženy od 45 do 69 let se mohou podrobit mamografickému vyšetření mléčné žlázy jednou za dva roky od 50 let věku jednou za 2 roky provést standardizovaný test na krvácení ve stolici muži nad 50 let by měli absolvovat vyšetření prostaty muži a ženy nad 50 let by se měli účastnit koloskopického vyšetření na rakovinu tlustého střeva dívky mezi lety by měly být očkovány proti karcinomu děložního hrdla (Převzato z Vakcinace Podle World Health Organization (WHO) je očkování druhým nejvýznamnějším krokem ke zlepšení zdraví populace. Prvním krokem je zajistit nezávadnost pitné vody (Fait T., 2008). Profylaktické vakcíny proti HPV jsou první vakcíny, které jsou namířeny proti dyspláziím a karcinomu děložního hrdla, ale i proti vulvárním dyspláziím. V ČR se začalo očkovat proti karcinomu děložního hrdla , i když ve světě s očkováním začali o pár let dříve. Na našem trhu nyní působí dvě komerční firmy, které nabízí očkování proti karcinomu děložního hrdla. Jedná se o profylaktické vakcíny SILGARD (ve světě známou pod názvem Garsild) firmy Merk Co a CERVARIX firmy GlaxoSmithKline. Vakcíny se vpichují do svalu paže a aplikují se ve třech dávkách. Odstup od jednotlivých dávek je u obou typů vakcín stejný. Doporučený věk pro očkování se uvádí přibližně od 9 26 let. Jelikož se jedná o preventivní očkování, doporučuje se očkovat dívky před začátkem jejich pohlavního života, tedy v době, kdy se ještě nesetkaly s HPV infekcí. Výsledky dokazují, že vzniklý titr protilátek namířený proti použitým antigenům je mnohonásobně vyšší než u naočkovaných sexuálně aktivních dívek či žen (Tachezy R., 2006, Rizikovost vakcín Oba dva typy očkovací látky, SILGARD i CERVARIX, neobsahují virovou DNA, z toho plyne, že vakcíny nemohou žádným způsobem vyvolat nebo přispět ke vzniku dysplázie či karcinomu děložního hrdla. Považují se tedy za naprosto bezpečné a neškodné. Při aplikaci vakcín se mohou vyskytnout jisté nežádoucí účinky, které jsou však dočasné a pacientky by na ně měly být předem upozorněny svým lékařem. K nejčastěji se vyskytujícím účinkům patří

20 např. bolest, zarudnutí v místě vpichu, otok, únava, horečka, vyrážka, bolest hlavy aj. (Tachezy R., 2006, Rozdíly mezi vakcínou Silgard a Cervarix SILGARD je profylaktická kvadrivalentní vakcína namířená proti lidským papillomavirům typu 6, 11, 16, 18 a zároveň je první registrovanou vakcínou proti nádorovému onemocnění. Chrání organismus proti vysokému stupni cervikální dysplázie (CIN 2 a 3), cervikálnímu karcinomu, vysokému stupni vulvárních dysplastických lézí (VIN 2 a 3) a genitálním bradavicím (condylomata acuminata) v souvislosti s HPV typy 6, 11, 16, 18 (Fait T., 2007). CERVARIX je profylaktická bivalentní vakcína určená proti vysokému stupni cervikální dysplázie (CIN 2 a 3) a cervikálnímu karcinomu asociovaného s typy HPV 16, 18. Vakcína obsahuje adjuvantní systém 04, díky kterému se dosahuje dlouhodobého přetrvávání vysokých hladin protilátek (Sláma J., 2007b).

21 5. LABORATORNÍ DIAGNOSTIKA Kompletní proces laboratorní diagnostiky zahajuje ošetřující lékař, který odebere biologický materiál. Tento materiál je dopraven do laboratoře a následně zpracován. Na základě správných výsledků, které jsou interpretovány vyšetřujícímu lékaři, je v případě nefyziologických nálezů zahájena léčba. Laboratorní diagnostika se člení na čtyři na sebe navazující fáze: mimolaboratorní, preanalytickou, analytickou a postanalytickou (Dastych M., 2007) Mimolaboratorní fáze Příprava pacienta před odběrem Pacientka by měla být dostatečně poučena o pravidlech, která musí dodržovat před odběrem. Na pacientku před gynekologickým vyšetřením nejsou kladeny žádné výrazné nároky. Jen se doporučuje několikadenní sexuální absence. V případě nedodržení zmíněného doporučení je možno vzorek zpracovat, ale vyskytuje se riziko zkreslení výsledku ve smyslu zánětlivého a reaktivního charakteru. Před bioptickým vyšetřením také nejsou vyžadovány speciální požadavky Odběr vzorku Gynekolog provede odběr vzorku z děložního hrdla. K odběru se používá sterilní odběrový kartáček Cytobrush Plus, kterým odebere buňky z endocervixu (endocervix je kryt jednovrstevným cylindrickým epitelem), a Ayerova vatová špachtle, která slouží k získání buněk z exocervixu (exocervix je tvořen vícevrstevným dlaždicovým epitelem). Materiál se nanese na podložní sklíčko a následně je fixován směsí alkoholu a éteru, izopropylalkoholem nebo je nátěr postříkán fixačním sprejem. Fixační preparáty nám umožňují zachovat morfologické struktury buněk a zabrání případné lýze buněk (Rob L. aj., 2008).

22 Obrázek č. 4: Anatomie ženského pohlavního ústrojí (Převzato z Materiál na histopatologické vyšetření se odebírá pomocí speciálních nůžek. Vzorek odebrané tkáně spolu se štítkem, na kterém jsou základní informace o vzorku, je okamžitě ponořen do fixační tekutiny (většinou 10 % formaldehydu), která zabrání autolýze (samonatrávení) a hnilobě a se správně vyplněnou žádankou je zaslán do laboratoře. (Jirkovská M., 2006) Identifikace vzorku Vzorek musí být čitelně označen a lékař vystaví průvodku k požadovanému vyšetření, kde musí být zaznamenány všechny povinné údaje o pacientovi a o odebraném biologickém materiálu (Kobilková J. aj., 2003). Průvodka pro cytologické vyšetření obsahuje jméno a příjmení pacientky, rodné číslo, kód diagnózy a zdravotní pojišťovny, datum a čas odběru, místo odběru, kolposkopický nález, datum poslední menstruace, záznam o hormonální léčbě a kojení, rok očkování proti HPV a název vakcíny, laktaci, prodělané gynekologické zákroky aj. (Kobilková J., Dušková J., 2003). Průvodka pro histologické vyšetření obsahuje jméno a příjmení pacienta, rodné číslo, kód diagnózy a zdravotní pojišťovny, datum a čas odběru, místo odběru, použitý fixační roztok aj. (Jirkovská M., 2006).

23 Transport vzorku Zafixovaný vzorek se žádankou je dopraven do laboratoře. Pokud označení skla souhlasí se žádankou k vyšetření a je-li žádanka správně vyplněna, laboratoř vzorek příjme a následně zpracuje (Kobilková J. aj., 2003) Preanalytická fáze Cytologická zahrnuje příjem a identifikaci biologického materiálu, obarvení preparátu podle Papanicolaoua (hematoxylin obarví jádra buněk a oranž G obarví cytoplazmu buněk), zakápnutí preparátu montovacím médiem a přiložení krycího sklíčka, dále sušení preparátu, číslování vzorků a žádanek, poté zápis do laboratorního informačního systému (LIS) (Kobilková J. aj., 2003). Histologická zahrnuje příjem a identifikaci biologického materiálu, zápis do LIS, zalévání do parafinu, krájení na mikrotomu, pokládání řezů na vodní hladinu, zachycení řezů na podložní sklo, barvení hematoxylin eozin (HE) a montování řezů pomocí montovacího média (Jirkovská M., 2006) Analytická fáze Cytologická hodnotí se morfologické projevy jádra a cytoplazmy pomocí světelného mikroskopu. Jádro pozorují se změny ve velikosti, tvaru a rozměrech jádra, dále změny v barvitelnosti a rozmístění chromatinu Cytoplazma pro diagnostiku nemají zásadní význam změny cytoplazmy Rozměry buňky (anizocytóza) různá velikost buněk (Rob L. aj., 2008). Histologická hodnotí se změny cytologické (anizokaryóza, hyperchromázie jader, zvýšený nukleocytoplazmatický poměr (N/C), počty a charakter mitóz), a také změny architektonické (poruchy vyzrávání epitelu se setřením původní stratifikace), histologický obraz imponuje jako rozšiřovaní parabazálních vrstev (Rotterová P., 2008).

24 5. 4. Postanalytická fáze V této poslední fázi laboratorní diagnostiky laboratoř vydává výsledky (jak v papírové, tak i v digitální formě), které jsou zasílány lékaři, který si o vyšetření zažádal. Lékař výsledný nález zhodnotí a doporučí datum příští návštěvy či další vyšetřovací nebo léčebné postupy (Dastych M., 2007).

25 6. DIAGNOSTICKÉ METODY Kolposkopie Za zakladatele kolposkopie považujeme německého gynekologa pana Hanse Hinselmanna, který roku 1925 sestrojil první kolposkop a sestavil první kolposkopickou nomenklaturu. Kolposkopie je základní prebioptická metoda, která nám umožňuje pozorovat patologické změny na děložním hrdle, na sliznici pochvy a na vulvě. Vyšetření se provádí pomocí speciálního přístroje kolposkopu, kterým musí byt vybavena každá gynekologická ambulance (Staroňová L., 2008). Kolposkop je binokulární optický systém se silným zdrojem světla, který při 8 40 násobném zvětšení umožňuje přímé prohlížení děložního hrdla (Rob L. aj., 2008) Rozdělení kolposkopie Nativní kolposkopie umožňuje sledování kvality a zánětlivých změn epitelu, dále pozorujeme přítomnost cév nebo případné maligní procesy. V takovém případě je vyšetření prováděno bez použití jakýchkoliv roztoků. Rozšířená kolposkopie využívá speciálních roztoků, které se nanesou na děložní hrdlo, následuje pozorování v kolposkopu. Používané speciální roztoky: 3 5% roztok kyseliny octové, který způsobí koagulaci cytoplazmatických proteinů v dlaždicovém epitelu a odplavení cervikálního hlenu. Dojde k diferenciaci dlaždicového a cylindrického epitelu a ke změně barvy i transparence, zejména u patologických stavů Schillerova zkouška Lugolovým roztokem obsahujícím jod se používá k průkazu glykogenu v intermediální vrstvě dlaždicového epitelu. Normální epitel se barví mahagonově hnědě. Změněný epitel je jodsvětlejší nebo jodnegativní (atypický epitel, karcinom). Ale jodem se nebarví ani cylindrický epitel a obnažené vazivo pravé eroze Collinsova zkouška s toluidinovou modří je založena na zvýšené barvitelnosti jader buněk atypického a maligního epitelu Lokální aplikace hydrokortizonu se doporučuje k diferenciaci zánětlivých změn K pozorovaní cév na děložním hrdle se používá zelený filtr (Roztočil A. aj., 1998).

26 Kolposkopická nomenklatura První klasifikaci kolposkopických nálezů navrhl pan Hinselmann. Klasifikace se pak postupně doplňovala. Na základě doporučení WHO a International Federation of Gynecology and Obstetrics (FIGO) byla v roce 1976 vypracovaná jednotná klasifikace, která byla doplněna v r závěry mezinárodní organizace pro cervikální patologii a kolposkopii (IFCPC) (Roztočil A. aj., 1998). Kolposkopické vyšetření je velmi cenná metoda umožňující brzké odhalení nepravidelnosti epitelu na děložním hrdle. Spolehlivost této metody se odhaduje mezi 60 až 80 % (Staroňová L., 2008). Kolposkopická nomenklatura (International Federation Cervical Pathology and Colposcopy IFCPC 2002) Normální kolposkopické nálezy původní epitel (PE), ektopie nebo ektropium (E), transformační zóna (TZ) Abnormální kolposkopické nálezy svědčící pro Low Grade (LG) nebo High Grade (HG) lézi, případně pro invazivní karcinom, např. atypická transformační zóna (ATZ), keratóza, bílý epitel, mozaika, puntíčkování Neadekvátní kolposkopické nálezy nehodnotitelné např. pro anatomické odchylky, synechie Různé kolposkopické nálezy zánětlivé změny, atrofie, eroze (Roztočil A. aj., 2008) Cervikografie Byla vyvinuta v r jako přirozené pokračování kolposkopie. Nahrazuje subjektivní kolposkopické vyšetření objektivním cervikografickým hodnocením a je možno ji trvale dokumentovat (Stafl A., 2002). Cervikografie byla později nahrazena modernější digitální cervikografií. Celý systém digitálního cervikografu je tvořen: digitálním fotoaparátem, digitální kamerou, prodlužovacím tubusem a makrokonvertem. Snímky pořízené digitálním cervikografem jsou mnohem přesnější než z kolposkopu. Obrovskou výhodou je to, že pořízený snímek se nemusí vyvolávat, pouze je přeposlán do počítače a odtud se může pomocí internetu zaslat do jakéhokoliv zdravotnického zařízení u nás i ve světě se žádostí o následnou konzultaci s jiným lékařem. Digitální cervikografie se používá jako doplňující

27 metoda ke gynekologicko cytologickému vyšetření a je obrovským přínosem v medicíně v záchytu cervikálního karcinomu (Havránková A. aj., 2004). Výhody: rychlost, snadná dostupnost, možnost rychlé konzultace s jiným lékařem přes internet, dlouhodobá dokumentace Nevýhody: snad jen finanční náklady digitálního cervikografu, částka se odhaduje přibližně na Kč (Havránková A. aj., 2004) Cytologické vyšetření Gynekologická cytologie se řadí spolu s kolposkopií k nepostradatelným prebioptickým diagnostickým metodám, podílí se na odhalení cyklických hormonálních změn na sliznici (funkční cytologie) a dysplastických změn na děložním hrdle (onkologická cytologie) (Kobilková J. aj., 2000) Funkční cytologie Na základě této metody se dají rozpoznat poruchy menstruačního cyklu, následky hormonální terapie a zjistit termín porodu. Odběr se provádí z horní třetiny pochvy pomocí kartáčku, dřevěné špachtle nebo vatové štětičky. Odebraný vzorek se fixuje a barví polychromatickým barvením dle Papanicolaoua a následně hodnotí ve světelném mikroskopu (Roztoči A. aj., 1998). Funkční cytologie informuje gynekologa o hormonálním stavu ženy. Ke zjištění zralosti epitelu se používají indexy karyopyknotický, eozinofilní, maturační, svinutí a shlukování (Kobilková J. aj., 2000). Index karyopyknotický (KI) je poměr počtu buněk s pyknotickým jádrem (superficiálních buněk) k intermediálním buňkám bez ohledu na barvu cytoplazmy Index eozinofilní (EI) je poměr eozinofilních buněk k buňkám cyanofilním bez ohledu na vzhled jádra Index maturační (MI) poměr mezi parabazálními, intermediálními a superficiálními buňkami Index svinutí ( folded index) ukazuje poměr počtu buněk s hladkými okraji k počtu buněk se svinutými okraji bez ohledu na tvar a barvení buněk

28 Index shlukování ( crowded index) určuje poměr počtu odloučených epitelií ve shlucích (víc jak 4 buňky) ku buňkám uložených jednotlivě nebo ve shlucích do 3 buněk (Kobilková J. aj., 2000) Onkologická cytologie Pro onkologickou cytologii se provádí odběr z míst, jež se zdají gynekologovi nějakým způsobem podezřelá, a to z vulvy, pochvy, exocervixu a endocervixu. Odebraný materiál se fixuje, polychromaticky barví a hodnotí ve světelném mikroskopu (Roztočil A. aj., 1998). Cytologie je screeningová metoda, pro kterou je typická nízká reprodukovatelnost, falešná negativita (15 50 %) a falešná pozitivita (10 %). Odhaduje se, že citlivost cytologické diagnostiky v záchytu HG léze je okolo 60 % (Tachezy R., 2006) Klasifikace cytologických a patologických nálezů Dle Papanicolaoua se užívala od 50. let 20. století a v dnešní době se již neužívá PAP I. Negativní PAP II. Negativní PAP III. Suspektní PAP IV. Pozitivní PAP V. Pozitivní Bethesda systém 1988 Bethesda systém 1989 Bethesda systém 2001, standardní klasifikace nyní užívaná Přijetí Bethesda systému pro stanovení cervikovaginální cytologické diagnózy se uskutečnilo v r Název je odvozen od města Bethesdy ve státě Maryland, kde tento systém vznikl a posléze byl schválen. Na základě faktů, které svědčily pro velké nepřesnosti ohledně neoplastických změn děložního hrdla a terminologie, jež neměla vzájemnou souvztažnost s histopatologickou klasifikací, bylo nutné provést v Bethesdě reformy, na základě kterých vznikla nová Bethesda Ta je dnes považována za standardní klasifikaci. Mnichovská nomenklatura II z r. 1990, jedná se evropskou modifikaci Bethesdy, podle této klasifikace se řídí jen malé procento laboratoří

29 Stupeň I. Negativní Stupeň II. Negativní Stupeň III. Nejasný nález s degenerativními či zánětlivými změnami Stupeň IV. Střední a těžké změny intraepiteliální až karcinom Stupeň V. Maligní nádor (Roztočil A. aj., 1998) Aktuální verze systému Bethesda 2001 Níže popsané hodnocení se týká konvenčních cytologických stěrů. I. Kvalita stěru Je jedním z nejdůležitějších kriterií pro správnou interpretaci nálezu. Stěr má obsahovat buňky z exocervixu i endocervixu, a také buňky z transformační zóny. Popis: dostatečný pro hodnocení popisuje přítomnost, resp. nepřítomnost endocervikální komponenty a buněk z transformační zóny, popř. jiné faktory ovlivňující kvalitu: krev, zánět, cytolýza. Stačí 10 endocervikalních nebo metaplastických buněk pro indikaci transformační zóny. nedostatečný pro hodnocení uvedení důvodu: poškození preparátu, nevhodná fixace nebo těžký zánět či nekróza, atd. II. Interpretace cytologického nálezu a) Mikroorganismy: Trichomonas vaginalis, Candida, Bakterialní vaginóza, Actinomyces, Herpes simplex. b) Jiné nálezy: reaktivní buněčné změny spojené se zánětem, radiací, nitroděložní tělísko (IUD), žlázové buňky po hysterektomii, atrofie. c) Endometriální buňky u žen nad 40 let do 40 let se neuvádějí. Dlaždicové buňky: normální negativní pro lézi atypické dlaždicové buňky ASC neurčitého významu ASC US: jde o změny naznačující SIL, ale nesplňující kritéria určující interpretace. Tato množina zahrnuje menšinu případů dříve označovaných jako ASCUS/R

30 (spíše reaktivní), většinu případů dříve označovaných jako ASCUS spíše SIL. Vylučuje případy HSIL. nevylučující HSIL ASC H: cytologické změny naznačující HSIL, ale nesplňující kritéria pro definitivní interpretaci. Jsou indikací k biopsii. Nález ASC by měl byt méně než 10 % všech cytologických nálezů za rok v cytologické laboratoři! LSIL: zahrnující HPV,CIN I HSIL: zahrnující CIN II, CIN III, charakteristiky suspektní invaze Dlaždicobuněčný karcinom Žlázové buňky: normální negativní pro lézi atypické endocervikální buňky AGC NOS endometriální buňky AGC NOS glandulární buňky AGC NOS atypické endocervikální buňky spíše neoplastického původu AGC NEO glandulární buňky spíše neoplastického původu AGC NEO endocervikální karcinom in situ AIS adenokarcinom endocervikální endometriální extrauterinní, blíže nespecifikovaný jiné maligní elementy III. Závěr Negativní pro intraepiteliální lézi nebo malignitu (zahrnuje i mikroorganismy a reaktivní buněčné změny) Epiteliální buněčné abnormality (dlaždicové, žlázové) Jiné bez neoplázie (endometriální buňky u ženy nad 40 let, atd.) IV. Doporučení laboratoře Ad I. Kvalita stěru: Dostatečný pro hodnocení, ale postrádající komponentu epitel cylindrický/transformační zóna (EC/TZ) nebo s částečným překrytím: kontrola ve 12 měsíčním intervalu, u těhotných kontrola po šestinedělí.

31 Nedostatečný pro hodnocení: opakování cytologického vyšetření za 3 měsíce, event. léčba zánětu, v případě překrytí zánětem. Ad II.: Dlaždicové buňky ASC US: do 35 let věku kontrola cytologie za 6 měsíců nad 35 let a) HPV HR negativní, kontrola za rok HPV HR pozitivní, kontrola cytologie za 3 měsíce b) bez HPV kontrola za 6 měsíců ASC H: do 35 let věku biopsie k vyloučení High Grade (HG) léze nad 35 let a) HPV HR negativní, kontrola za rok b) HPV HR pozitivní, konizace, cylindrická dissekce c) opakovat za 3 měsíce LSIL: kontrola cytologie za 3 6 měsíců, při opakovaném stejném nálezu expertní kolposkopie HSIL: expertní kolposkopie, dle kolposkopického nálezu indikace k bioptické verifikaci Dlaždicobuněčný karcinom susp.: histologická verifikace Žlázové buňky AGC NOS (atypické žlázové buňky bez bližší specifikace): kontrola cytologie za 3 měsíce, při stejném nálezu expertní kolposkopie k vyloučení HG léze. AGC NEO (atypické glandulární buňky spíše neoplastického původu): u žen do 30 let expertní kolposkopie k vyloučení HG léze; při vyloučení HG léze protizánětlivá léčba a opakovaní cytologie za 3 měsíce. U žen nad 30 let expertní kolposkopie k vyloučení HG léze, při vyloučení HG léze je další postup na zvážení klinika. Při použití HPV testace: HPV HR negativní, kontrola cytologie za rok HPV HR pozitivní, cylindrická dissekce, event. konizace Bez HPV testu: a) cylindrická dissekce nebo konizace b) opakovat cytologii za 3 měsíce, event. s endocervikální abrazí

32 AIS (adenocarcinoma in situ): diagnostikovat AIS v laboratoři je velmi obtížné, jsou to velmi vzácné případy a VŽDY vyžadují provedení adekvátní biopsie cylindrická dissekce, event. konizace a kyretáž zbytku hrdla. Adenokarcinom: histologická verifikace. (Rotterová P., 2008).

33 Obrázek č. 5: Cytologický obraz HPV LSIL Popis obrázku č. 5: Typický nález při infekci HPV kdy buňky, odpovídají Low Grade lézi. Obrázek č. 6: Histologický obraz HPV CIN Popis obrázku č. 6: Vrstevnatý dlaždicový epitel s koilocytózou a poruchou vyzrávání do 1/3 tloušťky epitelu, odpovídající CIN I HPV

34 Obrázek č. 7: Cytologický obraz HSIL Popis obrázku č. 7: Nezralé elementy s vysokým N/C poměrem, hyperchromázií jader a anizokaryózou. Obrázek č. 8: Histologický obraz CIN III Popis obrázku č. 8: Vrstevnatý dlaždicový epitel s cytonukleárními atypiemi a se ztrátou maturace v celé šíři epitelu.

35 6. 4. Testy určené pro diagnostiku HR HPV léze Jsou molekulárně biologické metody s dostatečnou citlivostí a reprodukovatelností, které jsou vhodné pro rutinní stanovení HPV infekce. Jedná se o sekundární testy určené pro diagnostiku HR HPV lézí. Diagnostika nachází své uplatnění u žen se suspektním či nejasným nálezem, dále po léčbě prekancerózních lézí a při sledování perzistence LG HPV léze (Tachezy R., 2006). Ke stanovení HG léze na děložním hrdle se nyní používají dvě diagnostické metody: metody založené na přímé hybridizaci od firmy Digene v testovaném vzorku dochází k hybridizaci HPV DNA pomocí specifických HPV RNA prób (sond), na které je navázána značka, např. biotin nebo digoxigenin Metody založené na polymerázové řetězové reakci (PCR) s obrácenou hybridizací, např. Amplicor firmy Roche, INNO Lipa firmy Innogenetics (Tachezy R., 2006) Bioptické vyšetření Cílem bioptického vyšetření je stanovit, resp. potvrdit či zamítnout diagnózu klinického lékaře (Jirkovská M., 2006). Minibiopsie (punch biopsie, knipsbiopsie) zákrok je proveden pod kolposkopickou kontrolou pomocí speciálních kleští. Vzorek tkáně se získává z oblasti exocervixu i transformační zóny (TZ). Cílená excize podezřelá léze se odstraní pomocí skalpelu pod kolposkopickou kontrolou. Kyretáž se provádí v místě endocervikálního kanálu. Konizace radiofrekvenční kličkou (LEEP) nebo konizace radiofrekvenční jehlou z uvedených metod jsou nejspolehlivější, nelze jimi nahradit prebioptické metody a není vhodné ji užít v případech, kdy již prebioptické hodnoty odhalí jasný invazivní karcinom (Rob L. aj., 2008).

36 6. 6. Terapie Jejím hlavním cílem je odstranit patologickou lézi v celém rozsahu do přiměřené hloubky a šířky takovým způsobem, aby u mladých dívek a žen po zákroku nehrozilo riziko sterility (Rob L. aj., 2008). Terapii můžeme rozdělit: Destrukční metody destrukce patologické tkáně se provede po cílené biopsii. V dnešní době se již moc nepoužívají a zastupují je metody ablační. Kryoterapie touto metodou se zmrazí postižená tkáň pomocí speciální sondy, tkáň následně podlehne nekróze Výhody metody: zákrok je možné provádět ambulantně, nízká pořizovací cena Nevýhoda metody: hloubku destrukce nelze jasně určit, hojení ran má dlouhé trvání a je doprovázeno výtokem Laserová vaporizace k odpaření patologické tkáně se využívá CO 2 laseru. Pomocí tohoto tenkého laserového paprsku se tkáň odstraní do požadované hloubky (tj mm) Výhody metody: hojení je snadnější než u kryoterapie a provádí se pod kolposkopickou kontrolou Nevýhody metody: pořizovací cena (Rob L. aj., 2008). Ablační (excizní) metody Klasická (studená) konizace se provádí skalpelem nebo nůžkami Excize vysokofrekvenční kličkou (LEETZ, LEEP) vysokofrekvenční kličky slouží k odstranění podezřelé léze, která je umístěna v oblasti exocervixu. Typ kličky se volí podle velikosti léze a hrdla. Ze všech dostupných metod je dnes nejvíce používána Jehlová konizace (needle cone) využívá vysokofrekvenční rigidní jehlu Výhody metody: dají se jí operovat i patologické změny v endocervixu Hysterektomie (Rob L. aj., 2008).

37 6. 7. Imunohistologické metody Imunohistochemie Je cenná a nepostradatelná metoda bioptické diagnostiky. Principem je reakce antigenu (AG) s protilátkou (PL) a s následnou vizualizací vzniklého komplexu pomocí speciálních značek různé povahy: enzym ELISA, fluorochrom FIA, radionuklid RIA, avidin biotin. Metoda může probíhat přímo nebo nepřímo. Přímá metoda probíhá tak, že se na řez aplikuje PL se značidlem, která je namířena proti AG. Nepřímá metoda je složena z více kroků, kdy se na sebe váží PL v několika vrstvách (Jirkovská M., 2006). K průkazu AG lze použít 2 typy PL: Monoklonální PL se získávají tzv. hybridomovou technologií, jsou produktem jednoho klonu B buněk a vykazují jedinečnou specifitu, tj. jsou namířeny proti jednomu epitopu na molekule AG (Litzman J., 2007). Polyklonální PL se získávají z imunizovaných zvířat pravidelným podáváním AG, jedná se o směs imunoglobulinů, jejichž vazebná místa jsou specifická proti různým epitopům na antigenní molekule (Litzman J., 2007). Imunofluorescence Tato metoda je taktéž založena na reakci antigenu s protilátkou, probíhá buď přímo nebo nepřímo. Jako značidlo se používá fluorochrom, což je látka schopná pohltit světelnou energii, čímž dojde k excitaci fluorochromu na vyšší energetickou hladinu. Při návratu této molekuly do původního stavu je vyzářena energie ve formě světla. Preparát se prohlíží ve fluorescenčním mikroskopu a komplexy, na nichž je navázána barvička, fluoreskují (světélkují) (Litzman J., 2007). Polymerázová řetězová reakce (PCR) Metoda slouží k průkazu HPV infekce u žen nad 35 let, pokud se u nich opakovaně na děložním hrdle vyskytuje suspektní cytologický nález (ASC US, ASC H) a kolposkopické vyšetření vychází negativní. U žen mladších 35 let není metoda doporučena z důvodu velké promořenosti HPV infekce v populaci (Rotterová P., 2008). PCR je in vitro enzymatická syntéza a amplifikace (rozmnožování) specifických sekvencí nukleových kyselin, v níž se užívá opakovaných cyklů syntézy DNA (Lukáš Z. aj., 1997). Výchozí dvouvláknová DNA je označována jako matricová (templátová), úsek DNA, který má být amplifikován, je charakterizován párem oligonukleotidových sekvencí označovaných jako primery. Primery se připravují synteticky a jsou odvozené z koncových sekvencí DNA určených k amplifikaci. V první fázi dochází k denaturaci vláken DNA a k následnému ochlazení za přítomnosti nadbytku primeru a teplotně stabilní DNA polymerázy. Při

38 ochlazení jsou vytvořeny první hybridní komplexy matricové DNA primer, které se v poslední fázi cyklu doplní, takže po jednom cyklu jsou vyprodukovány dvě molekuly identické dvoupramenové DNA a počet molekul DNA se po každém cyklu zdvojnásobí (Lukáš Z. aj., 1997). Počet se tedy zvyšuje geometrickou řadou. Kroky denaturace, vazba primeru a syntéza DNA se opakují, což je zajištěno změnami teploty v přístrojích nazývaných termocyklery. Produkty PCR lze stanovovat různými způsoby: Southernovou hybridizací se značenou próbou komplementární k části sekvence amplifikovaného úseku, stanovením jejich velikosti elektroforézou v polyakrylamidovém nebo agarózovém gelu nebo sekvenční analýzou DNA (Lukáš Z. aj., 1997). Stanovení proteinu p16 Retinoblastomový gen (Rb) je antionkogen, jehož produktem je protein Rb (prb), což je jaderný fosfoprotein, který se podle fáze buněčného cyklu nachází v různě fosforylované formě. Pokud je prb v aktivní (nefosforylované) formě, inhibuje transkripci proteinu p16. Protein p16 (p16ink4a) je taktéž antionkogen, k jehož inaktivaci dochází mutacemi, nebo delecemi u maligních onemocnění. Protein p16 je inhibitorem pro cyklin dependentní kinázy, zvláště pro cyklin dependentní kinázu 4 (CDK 4), a dále odbourává komplexy cyklin D/CDK4, které inaktivují prb protein fosforylací (Roterrová P. aj., 2003). Při infekci HPV virem dochází ke změnám v buněčném cyklu. Po vstupu papillomavirové DNA do genomu hostitelské buňky dochází k interakci virových onkoproteinů E6 a E7, vysoce rizikových HPV typů, které zapříčiní maligní transformaci tím, že inaktivují funkci antionkogenů p53 a prb. E7 uvolňuje transkripční faktor E2F z vazby na protein prb a urychluje degradaci proteinu prb a jemu příbuzných proteinů (Helt A. M. aj., 2003, O Neill C. J.,McCluggage W. G., 2006, Rotterová P., 2008). U dysplázií a karcinomu děložního hrdla vyvolaných HPV můžeme stanovit zvýšenou expresi proteinu p16 (Keating J. T. aj., 2001, Kalof A. N., Cooper K., 2006, Focchi G. R. aj., 2007, Rotterová P., 2008). 7. CÍLE BAKALÁŘSKÉ PRÁCE

39 Cílem mé bakalářské práce je poukázat na závažnost problematiky dysplázií a karcinomu děložního hrdla. Dále popsat rutinní i nerutinní diagnostické metody a postupy, které v současnosti slouží k záchytu dysplastických lézí a karcinomu děložního hrdla. Předložit fakt, že návaznost jednotlivých diagnostických metod je nezbytná. Zjistit percentuální zastoupení diagnózy HSIL v testovaném souboru pacientek Zjistit věkovou hranici pacientek, v níž je největší promořenost diagnózy HSIL v testovaném souboru Zjistit, zda-li použité diagnostické metody stanovily správnou diagnózu 8. METODIKA

40 Na základě těchto vytyčených cílů jsem si vybrala 59 žen různých věkových skupin (jedná se o pacientky sanatoria Helios, s.r.o Brno). U všech vybraných pacientek bylo v roce 2008 provedeno a je známo kolposkopické vyšetření, onkologická cytologie a bioptické vyšetření. Pro snadnější a rychlejší orientaci v souboru jsem každé pacientce přidělila její osobní číslo (pacientky jsou tedy očíslovány od čísla 1 po číslo 59). Použité diagnostické metody jsou následující: Kolposkopické vyšetření provedli gynekologové sanatoria Helios, s.r.o Brno v rámci preventivních nebo kontrolních gynekologických prohlídek. Vyšetření se provádí pomocí speciálních roztoků a speciálního mikroskopu, tzv. kolposkopu Onkologická cytologie byla vyhodnocena cytologickými screenerkami a lékaři cytology, taktéž v sanatoriu Helios, s.r.o Brno pomocí světelného mikroskopu Odběr na bioptické vyšetření byl proveden v centru onkologické prevence (COP) sanatoria Helios, s.r.o Brno, zhodnocení rutinně zpracovaného tkáňového vzorku bylo provedeno v I. Patologicko anatomickém ústavu FN u sv. Anny v Brně. Hodnotící lékař (patolog) stanovil diagnózu pomocí světelného mikroskopu v hematoxylin eozinovém (HE) preparátu Přehled všech zkoumaných pacientek

41 V následující tabulce je prezentováno všech 59 žen podle data narození a každé pacientce je přiděleno její osobní číslo. V dalším sloupci je uveden věk z důvodu snadnějšího zařazení pacientky do určité věkové kategorie a jsou zde uvedeny i tři diagnostické metody, které byly u pacientek provedeny. Jedná se o kolposkopické vyšetření, onkologickou cytologii a bioptické vyšetření. Tabulka č. 2: Přehled diagnostikovaných pacientek Osobní číslo pacientky Rok narození Věk Kolposkopické vyšetření Onkologická cytologie Bioptické vyšetření negativní negativní negativní negativní negativní negativní HSIL HSIL HSIL HSIL HSIL HSIL negativní negativní negativní negativní negativní negativní HPV LSIL HPV LSIL HPV LSIL negativní negativní negativní HSIL HSIL HSIL HPV LSIL HPV LSIL HPV LSIL HPV LSIL HPV LSIL HPV LSIL HPV LSIL HPV LSIL HPV LSIL HPV LSIL HPV LSIL HSIL HSIL HSIL HSIL HSIL HSIL HSIL HSIL HSIL HSIL negativní negativní negativní HPV LSIL HPV LSIL HPV LSIL HPV LSIL HPV LSIL HPV LSIL negativní negativní negativní HPV LSIL HPV LSIL HPV LSIL negativní negativní negativní negativní negativní HSIL HSIL HSIL HSIL HSIL HSIL HSIL negativní negativní Negativní HPV LSIL HPV LSIL HPV LSIL HPV LSIL HPV LSIL HPV LSIL HSIL HSIL HSIL HSIL HSIL HSIL HSIL HSIL HSIL HSIL HSIL HSIL

42 negativní negativní HSIL negativní negativní Negativní negativní negativní Negativní HPV LSIL HPV LSIL HSIL negativní negativní Negativní HPV LSIL HPV LSIL HSIL HSIL HSIL HSIL HPV LSIL HPV LSIL HPV LSIL HPV LSIL HPV LSIL HPV LSIL HPV LSIL HPV LSIL HPV LSIL HPV LSIL HPV LSIL HPV LSIL HPV LSIL HPV LSIL HPV LSIL negativní negativní HSIL negativní negativní HSIL negativní negativní Negativní HPV LSIL HPV LSIL HSIL negativní negativní Negativní HPV LSIL HPV LSIL HSIL HSIL HSIL HSIL HPV LSIL HPV LSIL HPV LSIL HPV LSIL HPV LSIL HSIL HPV LSIL HPV LSIL HPV LSIL HPV LSIL HPV LSIL HPV LSIL negativní negativní Negativní HPV LSIL HPV LSIL HPV LSIL HPV LSIL HPV LSIL HPV LSIL HSIL HSIL HSIL Převzato z interních záznamů sanatoria Helios, s.r.o Brno Graf č. 1: Percentuální záchyt celého souboru diagnostikovaných pacientek, dle věku