Brno, Martin Šlais Ph.D.

Transkript

1 Partnerské fórum č. 2 - Preklinické PREKLINICKÉ HODNOCENÍ LÉČIV hodnocení léčiv Králové, Hradec Brno, Typy preklinických studií MediTox s.r.o. - Praktické zkušenosti Martin Šlais Ph.D. RNDr. IvanaMgr. Šurová

2 Léčiva, biopreparáty, prostředky zdravotnické techniky, doplňky stravy Testovací systémy (in vitro, ex vivo, in vivo) Genotoxicita, imunotoxicita, bezpečnostní farmakologie, studie akutní, subchronické/chronické toxicity, reprodukční a vývojová toxikologie, karcinogenita, neurotoxicita, ADME, PK/TK Alternativní metody v preklinické toxikologii

3 Cíle preklinického testování Identifikace cílových orgánů a efekty testované látky v cílových orgánech Vztah mezi dávkou a odpovědí Reverzibilita nepříznivých efektů Stanovení human safe starting dose Identifikace důležitých parametrů pro monitoring v následných klinických studiích

4 Genotoxicita Akutní toxicita Sub/chronické toxicita ADME a TK Lokální tolerance Karcinogenita Reprodukční a vývojová toxicita

5 Strategie preklinického zkoušení Léčiva Biopreparáty Zdravotnické prostředky Potravní doplňky

6 Testovací systémy In silico In vitro Ex vivo In vivo

7 Testovací systémy In silico QSAR, PBKM, neuronální sítě Základní výzkum - odhad toxicity a kinetiky látek (hlavně chemické látky REACH) Neexistuje validace pro léčiva Komerční software MULTICASE DEREK PALLAS TOPKAT BIOWIN

8 Testovací systémy In vitro/ex vivo Buněčné a tkáňové kultury Progresivní obor základní výzkum (GM kvasinky, hepatocyty, linie nádor. buněk, kmenové buňky ) Preklinické testování - validované modely Lymfocyty, fibroblasty Keratinocyty Myší lymfom L5178Y/Tk+/- Savčí buňky (V79, AS52 ) Bakterie, kvasinky (Salmonella typhimurium, Escherichia coli, Saccharomyces) 3D modely lidské epidermis (Epiderm, Episkin, SkinEthics) Ex vivo cornea, epidermis Vajíčka (HET-CAM)

9 Testovací systémy In vivo Laboratorní zvířata Hlodavec Myš domácí, Mus musculus (Balb/c, DBA..) Křeček syrský, Mesocricetus auratus Potkan obecný, Rattus norvegicus (Wistar, SD ) Morče domácí, Cavia aperea (albino) Standardizace Outbrední Inbrední Transgenní SPF Ustájení Nehlodavec Králík domácí, Oryctolagus cuniculus (NZW) Fretka obecná, Mustellus putorius Kočka domácí Felis catus Pes domácícanis familiaris (Beagle) Prase domácí Sus Scrofa (minipig) Primáti (makak rhesus) + další (drosophila, pískomil,drápatky, ryby, ptáci

10 Testovací systémy Limity biologických systémů Aplikovatelnost výsledků na člověka je omezená U in vitro metody chybí zcela vliv imunitního systému Mezidruhové rozdíly v absorpci, distribuci, metabolismu a exkreci Mezidruhové rozdíly v reakci imunitního systému Rozdílné zastoupení receptorů FDA Guidance for Industry, Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers Dose translation from animal to human studies revisited (the FASEB journal LSF) Konverze výsledků toxicity mezi zvířecími druhy a člověkem

11 Testovací systémy Aplikace a aplikační formy Jak a čím dostat testované léčivo do testovacího systému? Způsoby aplikace Per os, p.o. (kapsle, tablety, sonda) Intravenózně, i.v. (bolus, infůze, ocasní žíly, v. jugularis, v. saphena) Intramuskulárně, i.m. Intraperitoneálně, i.p. Subkutánně, s.c. Intradermálně Topicky Intrathekálně, i.t. Intraduodenálně Inhalačně Rektálně

12 Testovací systémy Aplikace a aplikační formy Co je cílový orgán/tkáň/receptor? Krevní oběh CNS (hematoencefalická bariera) Specifická tkáň Jak je veliká molekula testované látky? Small molecules Protein, peptid Biologická léčiva Kmenové buňky

13 Testovací systémy Aplikace a aplikační formy Jaká je biologická dostupnost / rozpustnost testované látky? Ty nejůčinnější látky jsou nerozpustné Nízká dostupnost, nebo rozpustnost > velké aplikační objemy, toxicita Maximální aplikovatelný objem druh zvířete Potkan: p.o. 2-5ml/100g, i.v. 0,5ml/100g, i.p. 2ml/100g Vehiculum Netoxické Rozpouštědlo u roztoků Homogenita u suspenzí a emulzí VFI, fyz. roztok, PBS, glukóza, methylcelulóza, oleje, ethanol, PEG, DMSO, DMF

14 Studie genotoxicity AMES Bacterial Reverse Mutation Test (1975) Detekuje bodové mutace, které navrací zpět mutace přítomné v testovacích kmenech Salmonella typhimurium a Escherichia coli a obnovuje jejich schopnost syntetizovat esenciální aminokyseliny (histidin, tryptofan), detekovatelné růstem kultur v minimálním mediu. 4 kmeny Salmonella +1 kmen E.coli Expozice kultur 5 koncentracím testované látky (+ kontrola, + MAS) 48-72h Počty kolonií úměrné mutagennímu působení

15 Studie genotoxicity Micronucleus Test in vitro Detekuje poškození chromozómů nebo mitotického aparátu (klastogenní a aneugenní) lymfocytů indukované testovanou látkou. Mutagenní účinnek se projevuje zvýšením frekvence výskytu mikrojader v dělících se buňkách, u kterých vlivem blokátoru (cytochalasin B) nebyla dokončena cytokineze Testovací systém: lidské lymfocyty Kultivace lymfocytů 48h Expozice lymfocytů testované látce 4h Blokace cytokineze, inkubace 26h Fixace, barvení, počítání mikrojader

16 Studie genotoxicity Test Chromosomálních aberací Identifikace látek indukujících strukturální (chromosomální či chromatidové) aberace chromosomů v kultuře savčích buněk. Test systém: linie savčích buněk (lidské lymfocyty, křeččí fibroblasty aj.) Inkubace buněk ve třech koncentracích testované látky (+ poz. a neg. kontrola, +MAS) po dobu 1,5 buněčného cyklu (3-6h) Blokace metafáze (kolchicin) Fixace, barvení, mikroskopické hodnocení poškození

17 Studie genotoxicity Mouse Lymphoma Assay Detekce bodových mutací i chromozomálních mutací (delece, mitotické rekombinace, aneuploidie) v kultuře buněk myšího lymfomu. Mutagenní působení testované látky způsobí nemožnost produkce thymidinkinázy > buňky s mutací rostou v mediu s TFT Test systém: buňky myšího lymfomu L5178Y/Tk+/- Kultivace buněk 7d Expozice testovanou látkou ve 4 koncentracích (+ poz. a neg. kontrola, +MAS) 4h Inkubace s TFT 11-13d Hodnocení kolonií mutantů

18 Studie Imunotoxicity Dosud není komplexní in vivo/in vitro studie pro hodnocení imunotoxicity. Několik in vitro testů je v průběhu validace (IL18, Keratinosense, T-cell activation, h-clat) Hodnocení imunomarkerů (ATB, CD4+/CD8+, IL, KC) součástí jiných studií toxicity Hypersensitivita in vivo GPMT Buehler method LLNA

19 Studie Imunotoxicity GPMT, Buehler method Identifikace kontaktních alergenů. Testovací zvíře je vystaveno opakované expozici indukci alergenem (topické, intradermální). Po vyvinutí imunitní reakce je provedena provokace a hodnoceny dermální projevy Testovací systém: morče domácí (albino), 20 testovaných, 10 kontrolních LLNA (Local Lymph Node Assay) Identifikace kontaktních alergenů. Testovací systém: myš, ks jednorázové expozice indukce alergenem. Odběr uzlin Hodnocení proliferace lymfocytů (radioaktiv., ELISA, Luminiscence)

20 Krátkodobé toxicity Bezpečnostní farmakologie Hodnotí základní farmakodynamické vlastnosti testované látky a její vliv na základní vitální funkce (kardiovaskulární a respirační systém) Testovací systém: pes, primáti, 3 skupiny zvířat (kontrolní, nízká a vysoká dávka), 3M+3F/sk. Aplikace dle terapeutického použití, jednorázová / opakovaná Hodnocení krevního tlaku, tepové frekvence, EKG, srdečního rytmu, dechové frekvence

21 Krátkodobé toxicity Akutní toxicita Hodnotí toxicitu látky po jednorázovém podání. Podklad pro RD Toxicity LD 50 vyškrtnuta, MTD, Up and Down, Fixed dose, Acute toxic class method MTD (maximální tolerovaná dávka) Aplikace stupňujících se dávek až do projevení toxických efektů Testovací systém: myš, potkan, pes, primáti 1-5 skupin zvířat, 3M+3F/sk. Aplikace dle terapeutického použití, perioda pozorování 2 3 dny Klinické pozorování, D14 Gross necropsy Stanovení MTD

22 Sub/chronické toxicity Hodnotí komplexní toxicitní profil testované látky po x-denním opakovaném podání 28d/90d zásadní toxikologická studie, LOAEL, NOAEL, SSD, pro prekliniku 2 druhy (hlodavec, nehlodavec) Délka 7, 14, 28, 90, 180 dnů Testovací systém: myš, potkan, králík, pes, opice 4 skupiny - kontrolní, 3 dávkové, 3-20M, F/sk. Aplikace dle terapeutického použití (i.v., p.o., i.p.), denně/intervaly Hodnocení: klinický stav, BW, FC, HEM, BCH, URI, PAT, neurobehavioralní změny Recovery, TK,

23 Reprodukční a vývojová toxikologie Hodnotí vliv testované látky na reprodukční orgány a prvotní vývoj organismu Testovací systém: potkan, (králík) Vychází z výsledků RD Toxicity, design a vyšetření podobná Fertilita Před repr. > implantaci Maturace gamet Sexuální chování Fertilita Preimplantační stádia embrya Embryo-fetal toxicita Implantace > uzavření tvrdého patra Embryofetální mortalita Zvýš. tox. gravidních Růstové změny Strukturální změny Pre/postnatalní vývojová toxicita Implantace > odstav, (F1) Pre/postnatální mortalita potomků Vývojové změny Funkční změny u potomků, maturace

24 Karcinogenita Hodnotí karcinogenní potenciál testované látky v průběhu života organismu Pokud je látka podezřelá z mutagenity (genotoxicita, RD toxicita) Pokud je terapeutické použití delší než 6 měsíců Testovací systém: myš, potkan Doba trvání: myš 18M, potkan 24M Aplikace dle terapeutického použití 3 dávkové + kontrolní skupina, 50m+50F/Sk. Hodnocení jako u RD Toxicity, specifická histopatologie

25 Lokální tolerance Hodnotí lokální toleranci tkání na testovanou látku v místě aplikace Testovací systém:králík APLIKACE Oční iritace Dermální iritace Intravenózní tolerance Intramuskulární tolerance Hodnocení subjektivní erytém/edém, poškození oka Histologie

26 ADME, Toxikokinetika (TK), Biodistribuce Hodnotí kinetické parametry testované látky v krevním oběhu, její metabolismus, exkreci či distribuci v tkáních Obvykle součást AT, RD Toxicity Aplikace testované látky Odběry krve (moče) ve zvolených intrvalech (0, 15m, 30m, 1h, 2h, 4h, 8h, 24h) Odběry tkání pro biodistribuci Analýza vzorku (analytická laboratoř) Hodnocení TK parametrů (C max, T max, T ½, AUC )

27 Alternativní metody v preklinické toxikologii Reduce 3R Princip (Russell&Burch, 1959) Refine Replace ECVAM, ICCVAM, ZEBET - validace metod Zaměřeno hlavně chemické látky, v preklinice použití omezené Metody: MNT in vitro LLNA ICE, BCOP Epiderm, Episkin tests LAL Up and Down

28 Thank you for attention MediTox s.r.o. Pod Zamkem 279, Konarovice, Czech Republic Tel: