Infekce drůbeže méně častými sérovary Salmonella enterica

Transkript

1 MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE Infekce drůbeže méně častými sérovary Salmonella enterica Dizertační práce Karolína Varmužová ŠKOLITEL: doc. RNDr. Ivan Rychlík, Ph.D. BRNO

2 BIBLIOGRAFICKÝ ZÁZNAM Autorka: Název práce: Studijní program: Studijní obor: Školitel: Mgr. Karolína Varmužová Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav experimentální biologie Infekce drůbeže méně častými sérovary Salmonella enterica Biologie Mikrobiologie doc. RNDr. Ivan Rychlík, Ph.D. Výzkumný ústav veterinárního lékařství, v. v. i. Oddělení imunologie Akademický rok: 2015/2016 Počet stran: Klíčová slova: kuře, exprese genů, Salmonella, Enteritidis, Typhimurium, Infantis, Agona, Dublin, Hadar, slepé střevo, zánět, mikroflóra, kompetitivní exkluze, vakcinace 2

3 BIBLIOGRAPHIC ENTRY Author: Title of Dissertation: Degree Programme: Field of Study: Supervisor: Mgr. Karolína Varmužová Faculty of Science, Masaryk University Department of Experimental Biology Infection of poultry with less frequent Salmonella enterica serovars Biology Microbiology doc. RNDr. Ivan Rychlík, Ph.D. Veterinary Research Institute Department of Immunology Academic Year: 2015/2016 Number of Pages: Keywords: chicken, gene expression, Salmonella, Enteritidis, Typhimurium, Infantis, Agona, Dublin, Hadar, cecum, inflammation, microbiota, competitive exclusion, vaccination 3

4 ABSTRAKT Drůbež je pro člověka častým zdrojem netyfoidních salmonel. Proto se přistupuje k opatřením, která mají za úkol snížit prevalenci salmonel u kuřat a potažmo snížit incidenci humánních salmonelóz. Jedním z možných opatření je použití probiotik nebo produktů kompetitivní exkluze. Dalším stupněm ochrany kuřat proti infekci je vakcinace. V první části práce jsme se proto zabývali srovnáním imunitní odpovědi vylíhlých kuřat na infekci různými kmeny S. Enteritidis, Typhimurium a Infantis a funkcí O-antigenu při této interakci. Nejdříve byla vylíhlá kuřata infikována sedmi různými divokými kmeny S. Enteritidis, Typhimurium a Infantis a jejich rfal mutanty a následně byla určena imunitní reakce kuřat na infekci. Všechny divoké kmeny vyvolaly větší zánětlivou odpověď než kterýkoli rfal mutant. Imunitní odpověď kuřat na infekci salmonelami byla závislá na přítomnosti O-antigenu a značně se lišila bez ohledu na příslušnost k sérovaru. V další části práce jsme zjišťovali, zda mikroflóra získaná od různě starých donorových slepic ochrání kuřata stejnou měrou proti infekci S. Enteritidis 147. Vylíhlá kuřata byla proto kolonizována směsí bakterií ze slepého střeva 1, 3, 16, 28 nebo 42týdenních donorů. Po sedmi dnech byla kuřata infikována S. Enteritidis 147. Dále byl sledován profylaktický či terapeutický účinek mikroflóry získané od 35týdenních donorů na infekci S. Enteritidis 147. Jak kultivace salmonel, tak exprese genů ve slepém střevě kuřat potvrdily, že mikroflóra získaná od 3týdenních a starších slepic chránila kuřata proti infekci S. Enteritidis 147. Mikroflóra získaná od 35týdenních slepic byla schopna ochránit kuřata již 24 h po kolonizaci. V poslední části práce jsme testovali účinnost vakcíny sestávající z oslabených kmenů S. Enteritidis 147, Typhimurium 2002 a Infantis 1516 proti infekci divokými kmeny sérovarů obsažených ve vakcíně a proti infekci S. Agona, Dublin a Hadar FA2033 (heterologní sérovary). Také byl zjišťován účinek střevní mikroflóry podané současně s vakcínou. Kuřata byla první den života vakcinována a po 20 dnech byla infikována homologními a heterologními sérovary. Ochranný účinek vakcíny byl určen na základě počtu salmonel v játrech pokusných kuřat. Pokusy prokázaly účinnost připravené vakcíny proti divokým kmenům sérovarů obsažených ve vakcíně a proti izolátům naležícím k sérovaru Dublin a Hadar FA2033. Mikroflóra podaná současně při vakcinaci chránila kuřata ještě před indukcí specifické imunity. 4

5 ABSTRACT Poultry is common source of non-typhoid Salmonella for humans. Therefore different interventions are designed to reduce the prevalence of Salmonella in chickens and thereby the incidence of human salmonellosis is decreasing. One such intervention is the use of probiotic, competitive exclusion products or vaccination. In the first part of the dissertation, we were interested in the comparison of chicken immune response to infection with different strains of S. Enteritidis, Typhimurium and Infantis, and a role of O-antigen in these interactions. Newly hatched chickens were infected with seven wild type strains of S. Enteritidis, Typhimurium and Infantis as well as their rfal mutants. All wild type strains stimulated greater inflammatory response than any of the rfal mutants. Chicken immune response to Salmonella infection was found to be dependent on the presence of O-antigen and greatly differed regardless serovar classification. In the next part of the dissertation, we tested whether microbiota from donor hens of different age will equally protect chickens against S. Enteritidis 147 infection. Newly hatched chickens were inoculated with cecal extracts from 1-, 3-, 16-, 28-, and 42-week-old donors, and 7 days later chickens were infected with S. Enteritidis 147. Furthermore, we tested the prophylactic or therapeutic effect of microbiota obtained from 35-week-old donors to infection with S. Enteritidis 147. Microbiota obtained from 3-week-old or older donors protected newly hatched chickens against S. Enteritidis 147 challenge. Microbiota from 35-week-old hens protected chickens even 24 h after administration. In the last part of the dissertation, we tested the efficacy of a vaccine consisting of attenuated strains of S. Enteritidis 147, Typhimurium 2002 and Infantis 1516 against the challenge with the same serovars and with S. Agona, Dublin and Hadar FA2033. The protective potential of intestinal microbiota administered simultaneously with the vaccine was also investigated. Chickens were vaccinated on the first day of life and after 20 days were challenged with homologous and heterologous serovars. The protective effect was determinated by bacterial enumeration in liver of experimental chickens. We showed that the vaccine consisting of attenuated Salmonella strains protected chickens against challenge with the wild type strains of the same serovars and may protect also against isolates belonging to other serovars. Co-administration of cecal microbiota and vaccine protects chickens before induction of specific immunity. 5

6 Karolína Varmužová, Masarykova univerzita,

7 PODĚKOVÁNÍ Ráda bych poděkovala vedoucímu mojí dizertační práce doc. RNDr. Ivanu Rychlíkovi, Ph.D. za možnost stát se součástí jeho výzkumné skupiny, za podněty a připomínky. Dále mé díky patří kolegům ze skupiny salmonelových infekcí, kteří se podíleli na vzniku práce a těm, kteří vytvářeli příjemné pracovní prostředí. Jsem vděčná také mým blízkým za podporu a trpělivost. 7

8 OBSAH BIBLIOGRAFICKÝ ZÁZNAM... 2 BIBLIOGRAPHIC ENTRY... 3 ABSTRAKT... 4 ABSTRACT... 5 PODĚKOVÁNÍ... 7 SEZNAM ZKRATEK ÚVOD Charakteristika rodu Salmonella Obecné vlastnosti a taxonomické zařazení Hostitelská specifita Onemocnění drůbeže Sérovary Klasifikace sérovarů Výskyt sérovarů Faktory virulence Ostrovy patogenity Plazmidy virulence Toxiny Fimbrie Bičíky Interakce salmonel s hostitelem Kolonizace hostitele Invaze hostitelských buněk Cytokinová odpověď na infekci Interakce salmonel se střevní mikroflórou

9 1.7. Střevní mikroflóra a kompetitivní exkluze Oslabené kmeny Salmonella enterica Salmonella enterica a Gallus gallus CÍLE DIZERTAČNÍ PRÁCE MATERIÁL A METODY Bakteriální kmeny Pokusy na kuřatech Bakteriologická kultivace salmonel Izolace RNA Kvantitativní real time PCR Sekvenování Denaturační polyakrylamidová gelová elektroforéza Statistická analýza Autorský podíl na použitých metodách VÝSLEDKY Infekce kuřat různými sérovary salmonel Bakteriální kmeny a kvantitativní real time PCR Proteiny secernované salmonelami Vztahy mezi pokusnými skupinami založené na analýze hlavních komponent Vztah mezi počtem salmonel a genovou expresí Mikroflóra a její vliv na ochranu kuřat při infekci S. Enteritidis Ochranný efekt mikroflóry různého složení při infekci S. Enteritidis Imunitní odpověď kolonizovaných kuřat po infekci S. Enteritidis Složení střevní mikroflóry u kolonizovaných kuřat Identifikace protektivních bakterií Terapeutické podání mikroflóry Ochrana kuřat trivalentní vakcínou

10 Ochrana proti infekci homologními sérovary Ochrana proti infekci heterologními sérovary Podání vakcíny ve směsi se střevní mikroflórou DISKUZE ZÁVĚR LITERATURA PŘÍLOHY

11 SEZNAM ZKRATEK ADH1B alkoholdehydrogenáza 1B AH221 chemokin AH221 ANOVA analýza rozptylu ALDOB aldoláza B, fruktóza-bisfosfát AQP8 akvaporin8 ASL2 argininosukcinát lyáza 2 AVD avidin C3 komplementový protein C3 CALB1 calbindin 1 CSF3 granulocytární růstový faktor 3 Ct prahový cyklus DAMP vzory spojené s potencionálním nebezpečím DNA deoxyribonukleová kyselina cdna komplementární deoxyribonukleová kyselina dt deoxythymin EPSTI1 gen epiteliální a stromální interakce 1 ES1 ES1 protein ExFABP protein vázající extracelulární mastné kyseliny FABP1 protein vázající mastné kyseliny 1 GAPDH glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenáza HCLS1 substrát Lyn 1 pro hematopoetické buňky HPGD hydroxyprostaglandin dehydrogenáza HPX hemopexin IFIT5 protein indukovaný interferonem 5 IFN interferon gamma IgA imunoglobulin A IgY imunoglobulin Y IL1β interleukin 1 beta IL8 interleukin 8 IL16 interleukin 16 IL17 interleukin 17 IL18 interleukin 18 IL22 interleukin 22 inos inducibilní NO syntáza IRG1 imunoreaktivní gen 1 ITGLB2 integrin B2 KTJ kolonie tvořící jednotky LB Luria-Bertani LITAF tumor nekrotizující faktor alfa indukovaný lipopolysacharidem LOC76960 necharakterizovaná oxidoreduktáza LPS lipopolysacharid LYG2 lysozym G2 MID mnohonásobný identifikátor M-MLV virus Moloneyho myší leukemie MLST multilokusová sekvenční typizace MLVA multilokusová analýza VNTR 11

12 MMP7 matrix metaloproteináza 7 MPA masopeptonový agar MPEG1 gen exprimovaný makrofágy 1 mrna mediátorová ribonukleová kyselina MRP126 protein MRP126 MUC2L protein podobný mucinu 2 NKL NK lyzin NLR receptory podobné NOD NOD oligomerizační doména vázající nukleotidy OTU taxonomická operační jednotka PAMP patogeny asociované vzory PBS fosfátový pufr PCA analýza hlavních komponent PCoA analýza hlavních koordinát PCR polymerázová řetězová reakce PFGE pulzní gelová elektroforéza PTGDS prostaglandin D2 syntáza RALDH1 aldehyddehydrogenáza 1 RDP projekt ribozomální databáze RNA ribonukleová kyselina rrna ribozomální ribonukleová kyselina ROS reaktivní formy kyslíku RSFR leukocytární ribonukleáza A2 SAA sérový amyloid A SCV vakuola nesoucí salmonelu SDS-PAGE denaturační polyakrylamidová gelová elektroforéza SERPINB10 ovalbumin, inhibitor serpin peptidázy B10 SPI ostrov patogenity u salmonel STAT1 přenašeč signálů a transkripčních faktorů 1 STAT3 přenašeč signálů a transkripčních faktorů 3 SULT1C3 cytozolová sulfotransferáza 1C, 3 T3SS sekreční systém typu III TGF transformující růstový faktor beta TGM4 transglutamináza 4 TBP TATA box vazebný protein TLR Toll-like receptory TRAP6 trappin 6 UB ubikvitin VNTR variabilní počet tandemových repetic XLD xylóta-lyzin-deoxycholát 12

13 1. ÚVOD 1.1. Charakteristika rodu Salmonella Salmonella enterica subsp. enterica (S. enterica) je jedním z nejčastějších původců lidských gastroenteritid (Ao a kol., 2015). Infekce různými sérovary salmonel se také mohou projevovat jako tyfus či bakteriémie. Onemocnění se ovšem nemusí vždy plně rozvinout se všemi klinickými příznaky a může probíhat asymptomaticky. Nakažený jedinec se pak stává nosičem (Andrews-Polymenis a kol., 2010). Hlavním zdrojem salmonel bývají hospodářská zvířata, a to především prasata a drůbež. Alimentární nákazy způsobené salmonelami jsou úzce spjaty s konzumací kontaminovaných potravin, hlavně vajec a nedostatečně tepelně zpracovaného drůbežího masa. Průmyslově chovaná drůbež představuje rezervoár bakterie S. enterica sérovar Enteritidis (S. Enteritidis), jejíž výskyt se v lidské populaci od 90. let 20. století zvyšoval. Proto byla zavedena ochranná opatření snižující prevalenci S. Enteritidis v chovech drůbeže, což mělo přímý dopad na vstup salmonel do potravního řetězce. Konkrétně se jedná o opatření zlepšující hygienické standardy v chovech, zvýšenou kontrolu chovů a vakcinační programy drůbeže (Doyle a kol., 2009). V České republice klesl v průběhu deseti let počet hlášených případů salmonelóz o více než polovinu (EPIDAT, Státní zdravotní ústav) Obecné vlastnosti a taxonomické zařazení Rod Salmonella představuje jednoho z mnoha zástupců čeledi Enterobacteriaceae. Tato gramnegativní, nesporulující tyčka je schopna pohybu pomocí peritrichálních bičíků, s výjimkou S. enterica sérovar Gallinarum (S. Gallinarum) biovar Gallinarum a Pullorum, které jsou nepohyblivé. Navíc je schopna intracelulárního přežívání, což ji chrání před imunitním systémem hostitele a má také celkový dopad na průběh patogeneze. Salmonely jsou schopny přežívat i mimo hostitele, ve vnějším prostředí a v potravinách. Energii získávají zkvašováním glukózy za vzniku plynu a zdrojem uhlíku salmonel vyskytujících se volně v prostředí je většinou citrát. Typickým znakem většiny kmenů je respirace sulfátů za vzniku H 2 S (Coburn a kol., 2007). Rod Salmonella se dělí pouze do dvou druhů, Salmonella enterica (Le Minor a Popoff, 1987) a Salmonella bongori (Reeves a kol., 1989). Druh S. enterica se dále dělí do šesti 13

14 poddruhů. Jmenovitě se jedná o poddruh I (enterica), II (salamae), IIIa (arizonae), IIIb (diarizonae), IV(houtenae) a VI (indica) (Obr. 1), v jejichž rámci bylo popsáno více než 2500 sérovarů. Jednotlivé sérovary jsou klasifikovány dle schématu, dříve známého jako schéma Kauffman-White, na základě antigenů vyskytujících se na povrchu bakterií. Jedná se o antigen somatický (O-antigen), bičíkový (H-antigen) a kapsulární (Vi-antigen) (Grimont a Weil, 2007). V dnešní době se k typizaci a subtypizaci salmonel používají i metody molekulární biologie jako pulzní gelová elektroforéza (PFGE) (Heir a kol., 2002), multilokusová analýza VNTR (MLVA) (Lindstedt a kol., 2004), multilokusová sekvenční typizace (MLST) (Achtman a kol., 2012) či metody založené na multiplex PCR (Alvarez a kol., 2004). Obrázek 1: Klasifikace rodu Salmonella a zastoupení sérovarů (upraveno dle Hurley a kol., 2014; Grimont a Weil 2007). V závorkách jsou uvedeny počty sérovarů Hostitelská specifita Jednotlivé sérovary salmonel jsou hostitelsky specifické a míra adaptace k hostiteli se mezi sérovary salmonel liší. Obvykle se sérovary dělí do tří skupin - hostitelsky specifické, hostitelsky adaptované a hostitelsky nespecifické. S. enterica sérovar Typhi (S. Typhi) 14

15 a Paratyphi (S. Paratyphi) jsou čistě humánní patogeny a způsobují u lidí břišní tyfus. Ze specializovaných druhů lze dále jmenovat S. Gallinarum biovar Pullorum a Gallinarum, které jsou silně adaptované k infekci drůbeže. S. enterica sérovar Abortusequi (S. Abortusequi) kolonizuje výhradně koně, S. enterica sérovar Typhisuis (S. Typhisuis) prasata a S. enterica sérovar Abortusovis (S. Abortusovis) ovce. S. enterica sérovar Cholerasuis (S. Cholerasuis) či Dublin (S. Dublin) dokáží infikovat jak lidi, tak zvířata, u každého druhu se však rozvine odlišné onemocnění. Primárním hostitelem S. Cholerasius je prase, u něhož způsobuje systémové onemocnění. Podobně se chová S. Dublin, jejímž přirozeným hostitelem je skot. Humánní infekce S. Cholerasius a S. Dublin vedou obyčejně k bakteriémii. S. Enteritidis a S. enterica sérovar Typhimurium (S. Typhimurium) jsou hostitelsky nespecifické a u lidí běžně způsobují gastroenteritidy, u zvířat vyvolávají rozličná onemocnění (Uzzau a kol., 2000) Onemocnění drůbeže Salmonely vyskytující se u drůbeže lze rozdělit do dvou skupin. První skupinou je S. Gallinarum biovar Pullorum a Gallinarum. Střevo kolonizují jen omezeně a nevyvolávají zde výraznější zánětlivou odpověď. Velmi rychle se však rozšíří do systémových orgánů, kde se množí (Wigley a kol., 2005; de Freitas Neto a kol., 2013). Biovar Gallinarum je původcem tyfu u drůbeže, kdežto biovar Pullorum způsobuje pulorovou nákazu. Obě onemocnění vykazují vysokou úmrtnost (Batista a kol., 2015). Druhou skupinou jsou netyfoidní sérovary se širokou škálou hostitelů. Průběh infekce těmito sérovary je charakterizován pomnožením salmonel ve střevě, indukcí imunitní odpovědi a omezenou kolonizací systémových orgánů (játra, slezina). Tyto sérovary vyvolávají u mladých kuřat onemocnění, jelikož jsou k nim kuřata v prvních dnech života velmi citlivá. U dospělých jedinců probíhá infekce bez klinických příznaků, což je rizikem při vzniku alimentárních nákaz u lidí (Beal a kol., 2004; Rychlik a kol., 2014). 15

16 1.2. Sérovary Klasifikace sérovarů Sérologická klasifikace salmonel je založena na povrchových antigenech vyskytujících se na bakteriální buňce, a to somatického O-antigenu, bičíkového H-antigenu a kapsulárního Vi-antigenu (Tab. 1). Somatický O-antigen sestává z opakujících se oligoacharidových struktur, které jsou tvořeny dvěma až šesti různými monosacharidy (Reeves a kol., 2013). Společně s dřeňovým polysacharidem a lipidem A tvoří lipopolysacharid (LPS), jenž je významnou komponentou stimulující imunitní systém hostitele (Raetz a Whitfield, 2002). Bičíkový H-antigen je kódován geny flic a fljb lokalizovanými na chromozomu nebo je kódován plazmidově lokalizovaným genem flpa (Smith a Selander, 1991; Grimont a Weil, 2007). Dle počtu těchto genů rozlišujeme sérovary monofázické, bifázické (produkují dva různé bičíkové antigeny) a trifázické, které jsou však minoritní. Kapsulární Vi-antigen je polysacharidové povahy a vyskytuje se pouze u sérovarů S. Typhi, S. Paratyphi C a S. Dublin (Grimont a Weil, 2007; Wilson a kol., 2008). Regulace, biosyntéza a export Vi-antigenu je zajišťována geny nesenými na SPI7. Vi-antigen zabraňuje aktivaci komplementu a snižuje oxidativní vzplanutí neutrofilů (Wilson a kol., 2011; Wetter a kol., 2012). Tabulka 1: Antigenní vzorec vybraných sérovarů (Grimont a Weil, 2007). sérovar skupina O-antigen H-antigen Vi-antigen fáze 1 fáze 2 Agona O:4 (B) 1, 4, 5, 12 f, g, s 1, 2 - Dublin O:9 (D 1 ) 1, 9, 12 g, p - * Enteritidis O:9 (D 1 ) 1, 9, 12 g, m - - Gallinarum O:9 (D 1 ) 1, 9, Hadar O:8 (C 2 -C 3 ) 6, 8 z 10 e, n, x - Infantis O:7 (C 1 ) 6, 7, 14 r 1, 5 - Paratyphi C O:7 (C 1 ) 6, 7 c 1, 5 * Typhi O:9 (D 1 ) 9, 12 d - * Typhimurium O:4 (B) 1, 4, 5, 12 i 1, 2-16

17 Výskyt sérovarů V letech 2001 až 2007 byly sledovány nejčastěji se vyskytující sérovary salmonel u lidí (Hendriksen a kol., 2011). S. Enteritidis se celosvětově vyskytuje v lidské populaci velmi často, jelikož na začátku 90. let 20. století byla po eradikaci S. Gallinarum z chovů drůbeže uvolněna ekologická nika, kterou obsadila právě S. Enteritidis a stala se vysoce invazivním sérovarem (Uzzau a kol., 2000). V Severní Americe, Austrálii a na Novém Zélandu je však nejhojnější S. Typhimurium. S. enterica sérovar Newport (S. Newport) byl nejčastěji pozorován v Jižní i Severní Americe a některých evropských státech. S. enterica sérovar Virchow (S. Virchow) byl izolován především v Asii, Evropě a Austrálii. S. enterica sérovar Hadar (S. Hadar) je významným patogenem hlavně v Evropě. S. enterica sérovar Heidelberg (S. Heidelberg) se často vyskytuje v rozvojových zemích, v Severní Americe se vyskytuje jako čtvrtý nejčastější sérovar, v Evropě je ještě méně častý. Změny ve výskytu specifických kmenů a sérovarů v lidské populaci a mezi zvířaty souvisí s cestováním, migrací lidí a s mezinárodním obchodem Faktory virulence Imunitní systém živočichů rozpoznává patogeny díky molekulám přítomným na jejich povrchu, které jsou pro hostitelský organizmus cizorodé. Molekuly na povrchu bakterií (LPS, bičíky), označované jako PAMP (patogeny asociované vzory), jsou rozpoznávány Toll-like receptory (TLR) vyskytujícími se na povrchu epiteliálních a fagocytujících buněk (dendritické buňky, neutrofily, makrofágy). Navíc jsou v cytozolu buněk přítomny NLR receptory (receptory podobné NOD), které sledují například přítomnost bakteriálních proteinů injikovaných do cytozolu pomocí sekrečních systémů. Alternativně se tyto bakteriální proteiny označují jako vzory spojené s potencionálním nebezpečím pro organismus (DAMP). NLR receptory a TLR receptory tak představují složku imunitního systému, která je schopna zavčas detekovat salmonely (Hurley a kol., 2014; Man a kol., 2014). K rozpoznávání salmonel slouží především TLR4, který váže LPS a TLR5, jež rozpoznává flagelin (Higgs a kol., 2006). 17

18 Ostrovy patogenity Ostrovy patogenity (SPI) kódují hlavní virulenčními faktory salmonel. Dnes je známo již 21 ostrovů patogenity. SPI1 až SPI5 se vyskytují u většiny sérovarů, zbylé ostrovy patogenity jsou méně časté nebo jsou součástí genomu jen některých sérovarů (Marcus a kol., 2000). Nejlépe prostudované jsou SPI1 a SPI2, které mají hlavní podíl na průběhu infekce u drůbeže (Dieye a kol., 2009; de Jong a kol., 2012). SPI1 nese geny kódující proteinový komplex tvořící sekreční systém typu III (T3SS), který je aktivován u extracelulárně se vyskytujících bakterií po kontaktu s hostitelskou buňkou. T3SS funguje jako spoj (molekulární jehla) a napomáhá jejich vniknutí do nefagocytujících buněk injikováním bakteriálních efektorových proteinů a toxinů přes cytoplazmatickou membránu. Efektorové proteiny poté přetvářejí cytoskelet hostitelských buněk (Marlovits a kol., 2004; Schlumberger a Hardt, 2006). SPI2 kóduje druhý sekreční systém typu III (T3SS-2). Geny ze SPI2 jsou aktivovány po invazi salmonel do buněk hostitele. T3SS-2 zprostředkovává translokaci dalších bakteriálních proteinů do cytozolu hostitelských buněk přes membránu fagozomu (Kuhle a Hensel, 2004). Bylo prokázáno, že SPI1 je důležitý pro kolonizaci střeva, avšak při osidlování organismu je zapotřebí propojení funkcí SPI1 a SPI2 (Dieye a kol., 2009) Plazmidy virulence Buňky salmonel nesou také sérově specifické plazmidy virulence. Plazmidy se v buňkách vyskytují v nízkém počtu kopií a dosahují velikosti 50 až 100 kb (van Asten a van Dijk, 2005). Plazmidy obsahují lokus spv (Salmonella plazmid virulence), jehož exprese zajišťuje množení salmonel v orgánech retikuloendoteliálního systému, tedy v játrech a slezině (Ahmer a kol., 1999). Cestou horizontálního přenosu získávají salmonely geny, ostrovy patogenity či plazmidy a tím se rozšiřuje jejich hostitelská specifita (Amavisit a kol., 2003). 18

19 Toxiny Virulence salmonel je podpořena tvorbou endotoxinů a exotoxinů. Endotoxin je komplexní lipopolysacharid, který je součástí buněčné stěny bakterií. V napadených buňkách spouští zánětlivou reakci a aktivuje komplement (Mergenhagen a kol., 1973; Rosenfeld a Shai 2006). Polysacharid LPS napomáhá salmonelám perzistovat v trávicím traktu. Kmeny salmonel s mutacemi v procesu biosyntézy LPS buď nejsou schopny kolonizovat střevo, nebo je jejich virulence oslabena (Turner a kol., 1998; Morgan a kol., 2004). Délka O-antigenu je důležitá pro správnou funkci T3SS kódovaného SPI1 a pro invazi bakterií do buněk (Hölzer a kol., 2009). Ale funkce T3SS kódovaného SPI2 není ovlivněna délkou O-antigenu. Exotoxiny mohou působit cytotoxicky či enterotoxicky a tím poškozovat buňky (Ashkenazi a kol., 1988). Příkladem exotoxinu u sérovarů Enteritidis a Typhimurium může být salmolyzin (cytolyzin), kódovaný slya genem, nebo Salmonella enterotoxin kódovaný stn genem (Libby a kol., 1994; Chopra a kol., 1999). Pomocí genových manipulací je možné vytvořit oslabené kmeny salmonel, které jsou mutantní v genech pro syntézu LPS nebo pro syntézu exotoxinů a použít je k vakcinaci drůbeže (Haneda a kol., 2011; Huang a kol., 2016) Fimbrie Adhezi salmonel ke střevním buňkám zprostředkovávají nejrůznější fimbriální či nefimbriální adheziny. V genomu S. Enteritidis se nachází až 13 funkčně odlišných fimbiálních operonů pro adhezi k abiotickým povrchům nebo k epiteliálním buňkám (Clayton a kol., 2008). U S. Typhimurium bylo identifikováno 12 fimbriálních operonů (Chaudhuri a kol., 2013). Adheziny určují hostitelskou specifitu salmonel. Jednotlivé sérovary salmonel exprimují odlišné adheziny, které se specificky váží k různým typům buněk (Kuźmińska-Bajor a kol., 2012). 19

20 Bičíky Většina salmonel je pohyblivá díky 5 až 10 bičíkům. Některé sérovary jsou schopny pomocí genomových přestaveb exprimovat geny bičíkové fáze 1, nebo fáze 2 a náhodně tak měnit své fenotypové projevy v závislosti na podmínkách prostředí. Tato schopnost napomáhá vytvářet heterogenitu antigenů, což může mít za následek nižší imunitní odpověď organismu (Henderson a kol., 1999; van Asten a van Dijk, 2005) Interakce salmonel s hostitelem Infekce a přežívání v hostiteli jsou ovlivněny řadou faktorů. Patří mezi ně vnitřní prostředí hostitele (ph, teplota nebo receptory), imunitní systém hostitele a jeho reakce na odlišné sérovary, mikroflóra hostitele a genetická výbava bakterie (Foley a kol., 2011). Jen část salmonel, které jsou pozřeny, napadne epiteliální buňky (Santos a kol., 2009). Kuřata obvykle reagují na orální infekci netyfoidními sérovary S. enterica s klinickými příznaky. Avšak ve slepém střevě probíhá zánět charakterizovaný infiltrací heterofilů a monocytů/makrofágů do střevní mukózy. Epidemiologicky nejvýznamnější jsou infekce kuřat v prvních dnech života, kdy jsou k salmonele nejcitlivější (Beal a kol., 2004). Salmonely jsou schopny napadat nejrůznější typy buněk. Ve výjimečných případech se množí i uvnitř makrofágů. V dendritických buňkách, které se vyskytují v lymfoidních i nelymfoidních tkáních po celém těle, salmonely pouze přežívají, avšak pomocí buněk dochází k šíření salmonel do jiných orgánů a způsobují tak závažné systémové infekce (Foley a kol., 2013) Kolonizace hostitele Nejčastějším způsobem infekce lidí a zvířat je cesta fekálně-orální. Výjimkou ovšem není ani infekce prostřednictvím dýchací soustavy. Při průchodu kontaminované potravy trávicí soustavou je salmonela vystavena první překážce, kterou je kyselé prostředí žaludku. Salmonely se však adaptovaly syntézou acid shock proteinů jako je například RpoS σ-faktor, PhoPQ, Ada nebo Fur (Bearson a kol., 1998). Salmonely přeživší nízké hodnoty ph pokračují do tenkého střeva, tlustého střeva a slepého střeva. Salmonela interaguje s konkurenční mikroflórou hostitele, aby mohla adherovat na enterocyty a M-buňky 20

21 prostřednictvím fimbrií (Darwin a Miller, 1999; Ruby a kol., 2012). Salmonela může být pohlcena fagocyty přítomnými ve střevním epitelu, což jí usnadňuje přestup přes mukózní bariéru (Obr. 2). Salmonela může také indukovat v epiteliálních buňkách pohlcení vlastních buněk nebo může vstoupit do makrofágů makropinocytózou bez přispění SPI1 (Alpuche- Aranda a kol., 1994). Nejčastěji však prochází salmonely přes M-buňky, které se nacházejí nad lymfoidní tkání (Jones a kol., 1994). Obrázek 2: Přestup Salmonella enterica přes epitel střeva prostřednictvím M-buněk, enterocytů nebo dendritických buněk (upraveno dle Rosselin a kol., 2012) Invaze hostitelských buněk Po adhezi na epiteliální buňky začne salmonela exprimovat proteiny kódované na SPI1 a zahájí syntézu T3SS. Protein SopB hraje důležitou úlohu při aktivaci sekrečních drah a zabraňuje splynutí vakuoly obsahující salmonely s lysozomem (Bakowski a kol., 2010). Na průběhu zánětu ve střevě se podílejí proteiny SopA, SopB, SopD, SopE, SopE2, SipA a SipC, které stimulují produkci prozánětlivých cytokinů, narušují strukturu těsných spojení a podporují tak přestup neutrofilů a tekutin do lumen střeva (Boyle a kol., 2006; LaRock a kol., 2015). Proteiny SipA, SipC a SopB interagují s aktinovými vlákny cytoskeletu a podílejí se tak na zřasení buněčné membrány (Lostroh a Lee, 2001). Salmonela po vstupu do buňky 21

22 vytvoří vakuolu, která prochází procesem zrání, jehož výsledkem je struktura nazývaná Salmonella-containing vacuole (SCV) (Knodler a kol., 2010). V rámci vakuoly salmonely přežívají uvnitř intestinálních buněk a makrofágů a množí se zde. Morfologické změny probíhající po spuštění exprese genů nesených na SPI2 jsou řízeny proteinem SifA a SseJ a projevují se vznikem vakuolárních výběžků, tubulů (Foley a kol., 2008; Ohlson a kol., 2008). Vzniklé tubuly napomáhají přemístění SCV do perinukleární oblasti do těsné blízkosti Golgiho aparátu. Putování SCV po tubulech Golgiho aparátu zajišťuje zisk živin a vytvoření prostředí vhodného pro množení a přežívání salmonel (Salcedo a Holden, 2003; Deiwick a kol., 2006) Cytokinová odpověď na infekci Po prvotním rozpoznání salmonel epiteliálními buňkami a rezidentními lymfocyty, řídí proces zabraňující proniknutí salmonel do hlubších vrstev tkání zejména makrofágy a heterofily. Imunitní systém produkuje IL1β, IL6, IL8, IL12, IL17, IL18, IL22, IL23, IFNγ (interferon gamma), LITAF (tumor nekrotizující faktor alfa indukovaný lipopolysacharidem) a inos (inducibilní NO syntáza) (Berndt a kol., 2007; Crhanova a kol., 2011). Hlavní funkcí těchto signálních molekul je atrahování dalších leukocytů do místa zánětu, zvýšení odolnosti epiteliálních buněk k infekci, stimulace makrofágů k produkci NO radikálů a inaktivace salmonel. IFNγ, IL17 a IL22 jsou cytokiny produkované Th1 a Th17 lymfocyty. IL1β, IL6, IL8 a IL18 jsou charakteristickými produkty pro kuřecí makrofágy. LITAF a inos jsou u kuřat exprimovány všemi leukocytárními subpopulacemi (Rychlík a kol., 2014). IFNγ ovlivňuje dobu, po kterou se makrofágy nacházejí v aktivovaném stavu. Sekrece IFNγ je závislá na IL18, známém aktivačním faktoru IFNγ, a je důležitá pro navození brzké odolnosti hostitele k infekci salmonelami (Mastroeni a kol., 1999; Monack a kol., 2004). Makrofágy jsou součástí vrozené i získané imunity a pod vlivem uvolňovaných cytokinů spouští imunitní odpověď. Bakteriální LPS nebo IFNγ spouští klasickou aktivaci makrofágů, kdy jsou sysntetizovány NO radikály. Alternativní aktivace makrofágů IL4, IL10 nebo IL13 vede k syntéze polyaminů a prolinu, které podporují proliferaci a syntézu kolagenu (Rosenberger a kol., 2001; Svensson a kol., 2001). Cytokiny regulují jak vrozenou, tak získanou imunitní odpověď. Rovnováha mezi prozánětlivými a protizánětlivými cytokiny je důležitá při ochraně organismu před sebepoškozováním při dlouhotrvajících infekcích (Svensson a kol., 2001). 22

23 1.6. Interakce salmonel se střevní mikroflórou U zdravých jedinců brání přirozená mikroflóra přestupu patogenů do buněk střeva a nežádoucí imunitní odpovědi. Narušení mikrobiální rovnováhy například antibiotickou léčbou umožňuje napadení epiteliálních buněk i neinvazivními mutanty S. Typhimurium (Diehl a kol., 2013). Buněčné receptory (enterocyty, pohárkové buňky, Panethovy buňky) ve střevě přijímají průběžně signály od komenzálních bakterií, což napomáhá imunitnímu systému rozeznat mezi prospěšnou bakterií a patogenním agens a případně vyvolat zánětlivou odpověď (Chu a Mazmanian, 2013). Pohárkové buňky zajišťují homeostázi produkcí velkého množství mucinu, kdežto Panethovy buňky produkují antimikrobiální peptidy (Kurashima a kol., 2013). Salmonela má k dispozici řadu mechanismů, jejichž pomocí je schopna soutěžit se střevní mikroflórou. V průběhu zánětu se pod vlivem IL17 a IL22 uvolňuje z epiteliálních buněk do střeva antimikrobiální peptid lipocalin-2 (Raffatellu a kol., 2009). Lipocalin-2 se váže na enterobaktin, siderofor střevních bakterií, a zabraňuje jim tak v získávání železa. Ovšem salmonely syntetizují další typ sideroforu, salmochelin, který se s lipocalinem-2 neváže. Salmonela dále v zaníceném střevě uvolňuje kolicin Ib, který negativně působí na jiné zástupce čeledi Enterobacteriaceae (Nedialkova a kol., 2014). Růst salmonel je inhibován kalproteinem, který je uvolňován neutrofily a vyvazuje zinek. Salmonela se vyhýbá tomuto ochrannému mechanismu expresí transportéru ZnuABC (Santos a kol., 2009). Reaktivní formy kyslíku (ROS) produkované v průběhu zánětu způsobí oxidaci thiosulfátu (meziprodukt dýchacího řetězce bakterií střevní mikroflóry) na tetrathionát, který mohou salmonely využívat jako konečný akceptor elektronů při anaerobní respiraci (Winter a kol., 2010). Salmonela je dále schopna (pomocí SopE) indukovat produkci dusičnanů hostitelskými buňkami, ty jsou využívány salmonelou a jinými enterobakteriemi při anaerobní respiraci dusičnanů (Santos a kol., 2009) Střevní mikroflóra a kompetitivní exkluze Slepé střevo kuřat je nejdříve osídleno zástupci čeledě Enterobacteriaceae, kteří jsou v druhém týdnu života nahrazeni zástupci čeledě Lachnospiraceae a Ruminococcaceae. Přibližně v pátém týdnu života kuřat je možno v obsahu slepého střeva identifikovat zástupce kmene Bacteroidetes. Relativně stabilní složení mikroflóry se objevuje kolem 18. týdne 23

24 života, kdy dochází současně k pohlavní dospělosti (Videnska a kol., 2014). V komerčních chovech drůbeže nedochází ke kontaktu mezi slepicemi a kuřaty a tím pádem nedochází k přirozené kolonizaci střeva kuřat bakteriemi. Vejce jsou po odebrání od rodičovských slepic vyčistěna, případně dezinfikována a kuřata se líhnou v čistých líhních, i když je již dlouho známo, že kolonizace střeva vylíhlých kuřat mikroflórou dospělých slepic slouží jako ochrana proti infekci patogeny. V komerčních chovech jsou kuřata v nepřítomnosti slepic náhodně kolonizována bakteriemi, které jsou přítomny v prostředí (Rantala a Nurmi, 1973; Kerr a kol., 2013; Milbradt a kol., 2014; Stanley a kol., 2014). Možnou ochranou kuřat proti infekci patogenními bakteriemi v prvních dnech života je například podání produktů kompetitivní exkluze nebo probiotik. Metoda kompetitivní exkluze byla popsána již v roce 1973 jako prostředek ke snížení počtu salmonel u vylíhlých kuřat. Ke kompetitivní exkluzi se využívá mikroflóra získaná z trávicího traktu salmonela prostých jedinců, která se salmonelou nepřímo soutěží v přísunu živin a obsazení receptorů, nebo může dojít k přímé kompetici či chemickému napadení potenciálních patogenů (Rantala a Nurmi, 1973). Probiotika jsou definována jako doplněk stravy ve formě živých mikroorganismů s prokázaným pozitivním účinkem na zdraví jedince. Základem probiotického účinku je zvýšení poměru prospěšných bakterií k patogenním bakteriím, obsazení vazebných míst na epiteliálních buňkách, modulace imunitního systému, stimulace epiteliálních buněk a inhibice exprese tumor nekrotizujícího faktoru v epiteliálních buňkách střeva. Nejčastěji používanými probiotickými kmeny jsou zástupci rodu Lactobacillus (Stanley a kol., 2014) Oslabené kmeny Salmonella enterica Oslabené neboli atenuované kmeny, které jsou vhodné jako vakcinační kmeny, je možno vytvořit delecemi genů nezbytných pro růst a průběh patogeneze. aroa a phop mutanti jsou jedním z mnoha příkladů takovýchto kmenů používaných u drůbeže. aroa mutanti jsou deficientní v biosyntéze aromatických sloučenin jako je fenylalanin, tyrozin a tryptofan. Ke svému růstu vyžadují p-aminobenzoovou kyselinu nebo 2,3-dihydroxybenzoovou kyselinu, jakožto prekurzory aromatických aminokyselin. phop mutanti mají sníženou virulenci a schopnost přežívat v hostiteli, jelikož PhoP aktivuje 24

25 transkripci řady genů podílejících se na stresové odpovědi salmonel (Cooper a kol., 1990; Methner a kol., 2004). Jiným příkladem kmene s mutací v genu pro patogenezi je rfal (waal) mutant, který není schopen syntetizovat O-antigen, čímž je omezena jeho schopnost kolonizace eukaryotických buněk (Guard-Petter a kol., 1996; Coward a kol., 2013). Dále je možno zkonstruovat kmeny s mutacemi v jednotlivých genech ostrova patogenity SPI1 či SPI2, nebo také s delecí celého ostrovu patogenity. Oba typy mutantů mají zbytkovou viruleci, avšak sníženou schopnost kolonizovat systémové orgány (Dieye a kol., 2009). Oslabený kmen s mutací v genu flic, a fljb v případě bifázických sérovarů, netvoří bičíky, na které imunitní systém obyčejně silně reaguje (Frye a kol., 2006; Methner a kol., 2011). Gen lon je evolučně konzervativní a produkuje Lon proteázu, která patří ke stresovým proteinům indukovaným nejrůznějšími stresovými faktory. Napomáhá odstraňovat poškozené a abnormální proteiny vzniklé za stresové situace, podílí se na regulaci buněčného dělení, morfologii buňky a údržbě DNA (Langklotz a Narberhaus 2011; Leyman a kol., 2012). Obrázek 3: Schematická struktura LPS s vyznačenou rfal mutací (upraveno dle Leyman a kol., 2011). 25

26 1.9. Salmonella enterica a Gallus gallus Kolonizace drůbeže různými sérovary Salmonella enterica subsp. enterica představuje celosvětově závažný problém, protože kuřata a slepice jsou zdrojem netyfoidních salmonel pro člověka. Buňky salmonel jsou vybaveny řadou virulenčních faktorů, které jim umožňují infikovat různé kuřecí buňky. Ostrovy patogenity, plazmidy virulence, toxiny nebo fimbrie však salmonelám nezaručují úspěšnou kolonizaci hostitele. Plně vyzrálá střevní mikroflóra zdravé drůbeže početně konkuruje patogenním salmonelám a brání jim tak kolonizovat střevní buňky. Pokud však dojde k narušení kompaktnosti mikroflóry například vlivem stresu nebo antibiotické terapie, přichází na řadu imunitní systém hostitele. Buňky imunitního systému se vypořádají se salmonelami v závislosti na celkovém zdravotním stavu hostitele, infekční dávce salmonel, konkrétním sérovaru a na rozpoznání antigenů různých sérovarů salmonel z dřívějších infekcí. V této dizertační práci jsem využila možnost sledovat imunitní reakci kuřat na infekci různými sérovary salmonel a mutantními kmeny salmonel zbavených O-antigenu. Dále jsem využila znalost jak ochranného účinku mikroflóry dospělých jedinců, známého jako kompetitivní exkluze, tak stimulaci imunitního systému kuřat oslabenými kmeny salmonel. 26

27 2. CÍLE DIZERTAČNÍ PRÁCE V první části dizertační práce jsem porovnávala reakci imunitního systému kuřat na infekci různými sérovary S. enterica. Současně mě zajímala role O-antigenu v průběhu infekce. O-antigen je součástí lipopolysacharidu, silného imunologického stimulantu. Nejdříve bylo tedy cílem: porovnat míru zánětlivé odpovědi kuřat po infekci různými sérovary S. enterica na základě exprese vybraných genů, jejichž tvorba po infekci roste, nebo klesá vyzkoušet schopnost rfal mutantů (bez O-antigenu) vyvolat imunitní odpověď u infikovaných kuřat V další části dizertační práce jsme zkoušeli dostupné možnosti ochrany kuřat proti infekci S. Enteritidis. Cílem ochranných metod je předejít samotné infekci a negativním dopadům z toho plynoucích. Některé preparáty nejen, že zamezí kolonizaci střeva salmonelou, mohou dokonce zlepšit celkový stav kuřat. Dále bylo cílem: zjistit zda a která mikroflóra získaná od různě starých donorových kuřat a slepic chrání vylíhlá kuřata proti infekci salmonelou kdy je vzhledem k možnému nástupu infekce nejvhodnější podat mikroflóru ověřit účinnost trivalentní vakcíny připravené v naší laboratoři proti divokým kmenům sérovarů S. Enteritidis 147, Typhimurium 2002 a Infantis 1516 a ověřit také zkříženou protektivitu proti sérovarům S. Agona, Dublin a Hadar FA2033 vyzkoušet účinnost vakcíny v kombinaci s mikroflórou dospělých jedinců 27

28 3. MATERIÁL A METODY 3.1. Bakteriální kmeny Použité bakteriální kmeny, které pocházely z interní sbírky mikroorganismů, byly uchovávány při -80 C v Luria-Bertani (LB) bujonu obohaceném 10% glycerolem (Tab. 2). Kultivace probíhala na masopeptonovém agaru (MPA) s přídavkem odpovídajícího antibiotika po dobu 18 h při 37 C. Druhého dne byla přenesena izolovaná kolonie do LB bujonu a kultivována 18 h při 37 C. Tato suspenze pak sloužila k experimentální infekci kuřat. Všichni deleční mutanti byli připraveni metodou red rekombinace PCR produktů (Datsenko a Wanner, 2000), která byla již dříve popsána (Karasova a kol., 2009). Po vytvoření rfal mutantů (chybí gen pro O-antigen ligázu) kmene S. Enteritidis 147 a S. Typhimurium LT2 byly příslušné mutace přeneseny transdukcí fágem P22 do nového hostitele. Fág P22 se ale nemnoží v buňkách S. Infantis, jelikož jeho receptory rozpoznávají jen strukturu O-antigenu sérovarů náležících do skupiny A, B a D 1 (Baxa a kol., 1996). Proto byly z kmene S. Infantis 1516 vytvořeny tři klony mutantů v genu rfal. Tabulka 2: Seznam použitých sérovarů bakterie Salmonella enterica a jejich rfal mutantů. sérovar ID číslo mutant O-antigen fágový typ Enteritidis 147 Nal 7F4 wt 1, 9, 12 PT4 Enteritidis G1481 2I2 wt 1, 9, 12 PT4 Typhimurium LT2 Nal 11F4 wt 1, 4, 5, 12 ND Typhimurium E5 wt 1, 4, 5, 12 DT104 Typhimurium B4 wt 1, 4, 5, 12 DT2 Infantis G6 wt 6, 7, 14 ND Infantis F10 wt 6, 7, 14 ND Enteritidis 147 Cm, Nal 14E5 Δ rfal::cm - ND Typhimurium LT2 Cm 7F10 Δ rfal::cm - ND Infantis 1516 (I) Cm 21A2 Δ rfal::cm - ND Infantis 1516 (II) Cm 22C9 Δ rfal::cm - ND Infantis 1516 (III) Cm 22C10 Δ rfal::cm - ND Nal, rezistence ke kyselině nalidixové; Cm, rezistence k chloramfenikolu; ND, nedefinováno 28

29 Oslabené kmeny S. Enteritidis 147, S. Typhimurium 2002 a S. Infantis 1516 byly připraveny vynětím celého ostrova patogenity SPI1, genů lon, flic a v případě S. Typhimurium 2002 a S. Infantis 1516 i genu fljb z důvodu produkce dvou bičíkových antigenů (viz Tab. 1). Mutace v genu flic a fljb sloužila k rozlišení vakcinačních a divokých kmenů (Methner a kol., 2011). Další mutace vytvořená odstraněním genu pro Lon proteázu se fenotypově projevovala tvorbou mukoidních kolonií a byla zařazena z důvodu možného zvyšování virulence mutantních kmenů neschopných tvořit bičíky (Iqbal a kol., 2005; Gottesman a kol., 1985). Po konstrukci všech kmenů byla přítomnost vzniklých mutací a absence jakýchkoli náhodných modifikací ověřena stanovením kompletní sekvence chromozomální DNA všech výchozích divokých i konečných atenuovaných kmenů. K čelenži vakcinovaných kuřat byly použity divoké kmeny jak homologních sérovarů (Enteritidis 147, Typhimurium 2002, Infantis 1516), tedy přítomných ve vakcíně, tak heterologních sérovarů S. Agona, Dublin a Hadar FA2033 (Tab. 3). Tabulka 3: Seznam kmenů Salmonella enterica použitých při testování účinnosti trivalentní vakcíny. oslabený kmen obsažený ve vakcíně ID číslo kmen použitý k infekci ID číslo S. Enteritidis 147 ΔSPI1-lon-fliC 22F4 S. Enteritidis 147 Nal 7F4 S. Typhimurium 2002 ΔSPI1-lon-fliC-fljB 22H7 S. Typhimurium E5 S. Infantis 1516 ΔSPI1-lon-fliC-fljB 22H10 S. Infantis G6 S. Agona Nal 12H5 S. Dublin Spec 21H8 S. Hadar FA2033 Nal 22J5 Nal, rezistence ke kyselině nalidixové; Spec, rezistence ke spektinomycinu 3.2. Pokusy na kuřatech Jako pokusná zvířata byli používáni kohouti plemene ISA Brown (Hendrix Genetics, Boxmeer, Nizozemí) z místních líhní. Kohouty jsme získávali v den vylíhnutí a v experimentálních stájích byli drženi v klecích s neomezeným přísunem vody a patogenů prostého krmiva. Pokusná a kontrolní skupina byla vždy umístěna v různých místnostech. Donoři mikroflóry pocházeli z komerčních chovů nosnic. Suspenze bakterií určená ke kolonizaci kuřat byla připravena resuspendováním 0,5 g obsahu slepého střeva donorů v 5 ml fosfátového pufru (PBS) s 0,05% L-cysteinem. Po pěti minutách byly smíchány 29

30 suspenze získané od donorů stejného věku (3 kusy) a z vytvořené směsi bylo použito 0,1 ml k orální inokulaci čerstvě vylíhlých kuřat. Experimentální infekce byly vždy provedeny orálně s použitím 10 7 KTJ salmonel. Pokusy na zvířatech byly schváleny etickou komisí a byly prováděny dle platné legislativy. V prvním pokusu jsme sledovali reakci imunitního systému kuřat na infekci různými kmeny S. Enteritidis, S. Typhimurium a S. Infantis v raných fázích jeho vývoje a roli O-antigenu v průběhu infekce. Čtyři čerstvě vylíhlá kuřata byla infikována jednotlivými kmeny a mutanty salmonel uvedenými v Tab. 2. Čtyři dny po infekci byla kuřata utracena. Následující pokus sledoval vliv podané mikroflóry na průběh infekce S. Enteritidis 147. Vylíhlá kuřata byla kolonizována mikroflórou získanou ze slepého střeva 1, 3, 16, 28 nebo 42týdenních donorových kuřat či slepic (Obr. 4). Po sedmi dnech byla tři kuřata z každé skupiny utracena ke kontrole bakteriálního složení mikroflóry. Kuřata, která v každé skupině zbyla, byla rozdělena do dvou skupin, přičemž jedna byla infikována a druhá sloužila jako kontrola. Čtyři dny poté byl pokus ukončen. Obrázek 4: Schéma pokusu, ve kterém byl sledován vliv podané mikroflóry různého stáří na imunitní odpověď po infekci Salmonella Enteritidis

31 V navazujícím pokusu bylo ověřováno terapeutické použití mikroflóry. Kuřata byla první den života a) kolonizována mikroflórou 35týdenních slepic a druhého dne infikována S. Enteritidis 147, nebo b) infikována S. Enteritidis 147 a o den později kolonizována mikroflórou, nebo c) infikována S. Enteritidis 147 a současně kolonizována mikroflórou. Experiment byl ukončen, jakmile dosáhla kuřata věku pěti dní. V dalším pokusu byl zkoumán ochranný potenciál vlastní vakcíny proti infekci homologními sérovary S. enterica (Enteritidis 147, Typhimurium 2002, Infantis 1516). Kuřata byla první den života orálně vakcinována směsí obsahující 10 6 KTJ oslabených kmenů S. Enteritidis 147, S. Typhimurium 2002 a S. Infantis Za 20 dní bylo utraceno šest kuřat ke kontrole přítomnosti vakcinačních kmenů. Zbylá kuřata byla rozdělena do tří skupin a čelenžována divokými kmeny S. Enteritidis 147, S. Typhimurium 2002, nebo S. Infantis Polovina kuřat byla utracena 4 dny po infekci, zbylá kuřata byla utracena 14 dní po infekci. V následujícím pokusu byl testován ochranný efekt vlastní vakcíny proti infekci heterologními sérovary (Agona, Dublin, Hadar FA2033). Uspořádání tohoto pokusu bylo stejné jako v předchozím, jen byla zařazena další kontrolní skupina, která byla čelenžována S. Enteritidis 147 a sloužila pro porovnání výsledků z předchozího pokusu. Obrázek 5: Schéma pokusu, ve kterém byl sledován účinek mikroflóry podané současně s vakcinací kuřat. 31

32 Poslední pokus sloužil ke zkoumání významu kolonizace donorovou mikroflórou současně při vakcinaci oslabenými kmeny. První skupina kuřat byla první den života vakcinována vlastní vakcínou. Druhá skupina kuřat byla první den života vakcinována oslabenými kmeny S. Enteritidis 147, S. Typhimurium 2002 a S. Infantis 1516 ve směsi s mikroflórou slepého střeva 34týdenních slepic. Kuřata z obou skupin byla revakcinována 3. a/nebo 12. týden života a infikována S. Enteritidis týden života, nebo 18. týden života. Kuřata byla utracena 4 dny po infekci (Obr. 5). Každý pokus obsahoval také kontrolní skupiny (nekolonizované, neinfikované nebo nevakcinované) pro porovnání získaných výsledků. Po utracení kuřat byla, dle záměru pokusu, odebrána tkáň slepého střeva a jater nebo obsah slepého střeva. Ze střední části slepého střeva bylo odebíráno přibližně 25 mg tkáně a uloženo při -80 C v roztoku RNALater (Qiagen) k izolaci RNA. Obsah slepého střeva byl neprodleně po vyjmutí střeva uložen na led pro účely izolace bakteriální DNA k sekvenování. Tyto vzorky byly skladovány při -20 C. Tkáň jater a obsah střeva infikovaných kuřat sloužily ke kvantifikaci salmonel Bakteriologická kultivace salmonel Tkáň jater o hmotnosti 0,5 g nebo obsah slepého střeva byly homogenizovány v peptonové vodě, suspenze byla ředěna desítkovým ředěním a vyseta na půdu s xylózou, lyzinem a deoxycholátem (XLD agar) a s kyselinou nalidixovou o koncentraci 20 μg/ml. Kultivace probíhala při 37 C po dobu 22 h. Vzorky negativní po přímém výsevu na XLD agaru byly pomnoženy v neselektivní pufrované peptonové vodě a dále pomnoženy v modifikovaném polotuhém selektivním médiu Rappaport Vassiliadis ke kvalitativnímu stanovení salmonel. Vzorky pozitivní na přítomnost salmonel pouze po pomnožení byly označeny hodnotou 1, negativní vzorky hodnotou 0. U vzorků, u kterých bylo možno určit počet kolonií salmonel, byl počet salmonel vyjádřen logaritmem KTJ/ml. 32

33 3.4. Izolace RNA Přibližně 25 mg stěny slepého střeva bylo homogenizováno v 1 ml TRI Reagent (Molecular Research Centre) pomocí zirkoniových kuliček (BioSpec Products) v přístroji MagNALyser (Roche). V dalším kroku bylo přidáno 50 μl 4-bromoanisolu (Molecular Research Centre) a po centrifugaci, která trvala 15 min při x g a 4 C, byla odebrána svrchní vodní fáze obsahující RNA. Roztok s RNA byl smíchán s 70% etanolem v poměru jedna ku jedné. Směs byla pipetována na přečišťovací kolonky RNeasy Mini kitu (Qiagen) a celková RNA byla získána dle návodu výrobce. Koncentrace a čistota získané RNA byla stanovena spektrofotometricky (Nanodrop, Thermo Fisher Scientific) Kvantitativní real time PCR K přepisu mrna do cdna byl použit 1 μg celkové RNA, M-MLV reverzní transkriptáza (Invitrogen) a oligo(dt) primery. Po reverzní transkripci (30 min při 37 C) byla cdna desetkrát naředěna sterilní vodou a uložena při -20 C. Primery a cdna byla pro kvantifikaci exprese vybraných genů pipetována do 384 jamkových mikrotitračních destiček pomocí automatické pipetovací stanice (Inovadyne). Celkový objem PCR reakce byl 3 μl. Nárůst množství vzniklých PCR produktů byl detekován pomocí interkalačního barviva SYBR Green I obsaženého v QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix (Qiagen). Amplifikační reakce probíhaly v přístroji LightCycler II (Roche). Počáteční denaturační teplota činila 95 C s dobou trvání 15 min, poté následovalo 40 cyklů PCR reakce, kdy se v každém cyklu střídaly teploty 95 C po dobu 20 s, 60 C po dobu 30 s a 72 C po dobu 30 s. Každý vzorek byl kvantifikován v duplikátech a průměrná hodnota jejich prahových cyklů (Ct) sloužila k dalším výpočtům. Hodnota Ct genů, které byly analyzovány, byla normalizována (Δ Ct) pomocí Ct hodnot tří referenčních genů ( housekeeping genů), a to glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenázy (GAPDH; De Boever a kol., 2008), TATA box vazebného proteinu (TBP; Li a kol., 2005) a ubikvitinu (UB; De Boever a kol., 2008). Relativní exprese genů byla vypočítána podle vztahu 2 - Δ Ct. Prvotní charakterizace imunitní odpovědi kuřat na infekci sérovary S. Enteritidis 147, S. Typhimurium LT2, S. Infantis 1516 a jejich rfal mutanty byla stanovena na základě určení míry exprese genů pro IL1β, IL8, IL17, IL22, IFNγ a inos. Celkový obraz reakce imunitního systému na infekci divokými kmeny a mutanty (Tab. 2) byl pak určen stanovením 33

34 exprese 43 různých genů, jejichž exprese se po infekci salmonelou zvyšuje (inducibilní geny), nebo snižuje (suprimované geny). K určení míry zánětu po kolonizaci mikroflórou získanou od různě starých donorů a infekci S. Enteritidis 147 bylo použito 24 genů, jejichž exprese po infekci salmonelou vzrůstá. Všechny použité primery včetně jejich sekvencí jsou uvedeny v Příloze Sekvenování K určení bakteriálního zastoupení ve střevě kuřat ve věku osmi dní, která byla kolonizována mikroflórou od různě starých kuřat a slepic v den vylíhnutí, a kuřat 12 dní starých, která byla kolonizována a později infikována S. Enteritidis 147, bylo použito sekvenování V3/V4 variabilní oblasti genu pro 16S rrna nové generace. Obsah slepého střeva byl homogenizován v přístroji MagNALyser (Roche) a bakteriální DNA byla izolována pomocí QIAamp DNA Stool Mini kitu (Qiagen). Koncentrace DNA byla určena spektrofotometricky a poté uložena při -20 C. Při přípravě knihovny 16S rrna pro Illumina Miseq sekvenování byly jednotlivé vzorky DNA jednotně naředěny na koncentraci 5 ng/μl a použity jako templát v PCR reakci, ve které byl použit forward primer 5 TCGTCGGCAGCGTCAGATGTTGTATAAGAGACAG-MID-GT-CCTACGGGNGGCWGCAG 3 a reverse primer 5 GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-MID-GT- GACTACHVGGGTATCTAATCC 3. Sekvence vyznačená kurzívou sloužila jako adaptor pro ligaci indexů, kdežto podtržená sekvence umožňovala amplifikaci přes V3/V4 variabilní úsek genu pro 16S rrna. K odlišení skupin vzorků byly použity různé identifikační sekvence, tzv. MIDy, o délce 5, 6, 9 nebo 12 párů bazí. Pro PCR amplifikaci a přečistění PCR produktů byl použit KAPA Taq HotStart PCR kit (Kapa Biosystems). Dále byla fluorimetricky měřena koncentrace DNA a vzorky byly naředěny individuálně na stejnou koncentraci. Skupiny vzorků s různými MIDy byly smíchány a opatřeny indexy (Nextera XT Index Kit, Illumina). Před sekvenací byla určena koncentrace vzorků s různými indexy pomocí KAPA Library Quantification Complete kitu (Kapa Biosystems). Samotné sekvenování proběhlo s použitím MiSeq Reagents Kit v3 v přístroji MiSEQ 2000 (Illumina). Výstupní data ze sekvenátoru, která obsahovala získané sekvence i informace o jejich kvalitě zapsána ve formátu FASTQ, byla nahrána do softwaru Qiime. Reverzní sekvence získané po čtení z obou konců byly zkráceny 34

35 na 250 párů bazí a následně byly konce spojeny. Kvalita ořezávání byla nastavena na hodnotu 19 bez neshod v sekvencích MIDů. V dalším kroku byly předpovězeny chimerické sekvence algoritmem Chimera Slayer a vyloučeny z dalších analýz. Získané sekvence byly rozřazeny do taxonomických operačních jednotek (OTUs) pomocí databáze RDP Seqmatch s hraniční hodnotou podobnosti 97 % Denaturační polyakrylamidová gelová elektroforéza Proteiny secernované různými kmeny sérovarů S. Enteritidis, S. Typhimurium a S. Infantis a jejich rfal mutanty byly precipitovány trichloroctovou kyselinou a rozděleny pomocí denaturační polyakrylamidové gelové elektroforézy (SDS-PAGE). Bakterie byly kultivovány v LB mediu při 37 C po dobu 16 h. Bakteriální suspenze (25 ml) byla centrifugována 15 min při x g a 4 C. Supernatant byl filtrován přes filtr s velikostí pórů 0,22 μm (Millipore) a secernované proteiny byly sráženy trichloroctovou kyselinou o konečné koncentraci 13 %. Sražené proteiny byly po 60 min centrifugovány 10 min při x g a 4 C a dvakrát promyty acetonem. Proteiny byly rozděleny elektroforeticky dle velikosti v 12% denaturačním polyakrylamidovém gelu a následně obarveny Coomassie Brilliant Blue. Jako hmotnostní standard byl použit značený proteinový marker SDS7B2 (Sigma Aldrich) Statistická analýza Počty salmonel byly porovnány metodou ANOVA a Tukey post hoc testem. Analýza hlavních komponent (PCA) byla použita ke zhodnocení imunitní odpovědi kuřat infikovaných různými kmeny sérovarů S. Enteritidis, S. Typhimurium a S. Infantis a jejich rfal mutantů na základě exprese 43 genů. Pro statistické analýzy byl použit software Statistica v. 9.1 (StatSoft Inc., Tulsa, USA). Heat mapy charakterizující imunitní odpověď kuřat kolonizovaných mikroflórou získanou od různě starých donorů a infikovaných S. Enteritidis 147 byly vytvořeny v programovacím jazyce R (R Development Core Team, 2008). Příbuznost bakteriálních společenstev ve střevě kolonizovaných a infikovaných kuřat byla určena pomocí UniFrac analýzy a analýzy hlavních koordinát (PCoA) ve software Qiime 35

36 (Caporaso a kol., 2010). χ 2 test byl použit k porovnání skupiny nevakcinovaných a vakcinovaných kuřat na přítomnost či nepřítomnost salmonel ve slepém střevě Autorský podíl na použitých metodách Kultivace salmonel použitých k infekci pokusných kuřat byla provedena mnou nebo MVDr. Marcelou Faldynovou, Ph.D. Mutantní kmeny salmonel byly připraveny Mgr. Alenou Šebkovou. Infekce a pitvy kuřat byly zajišťovány MVDr. Františkem Šišákem, CSc. nebo MVDr. Marcelou Faldynovou, Ph.D. Vzorky byly sbírány mnou. Salmonely z tkání kuřat byly kultivovány Ing. Hanou Havlíčkovou. Izolace RNA, reverzní transkripce a real time PCR byla provedena mnou. Mgr. Zuzana Sekelová stanovila secernované proteiny pomocí SDS-PAGE. RNDr. Vladimír Babák vyhodnotil PCA analýzu. Mgr. Tereza Kubasová a Mgr. Lenka Davidová Geržová určily složení střevní mikroflóry pomocí sekvenování nové generace. 36

37 4. VÝSLEDKY 4.1. Infekce kuřat různými sérovary salmonel V první části dizertační práce jsem se zabývala imunitní odpovědí kuřat, která byla infikována první den života S. Enteritidis 147, S. Typhimurium LT2, nebo S. Infantis 1516 a jejich rfal mutanty, tedy mutanty neschopnými exprimovat O-antigen, který se u jednotlivých sérovarů liší. Očekávali jsme podobnou imunitní odpověď kuřat na infekci rfal mutanty, kteří netvoří O-antigen. Míra zánětlivé odpovědi infikovaných kuřat byla sledována ve slepém střevě 4 dny po infekci prostřednictvím exprese šesti vybraných genů (IL1β, IL8, IL17, IL22, IFNγ a inos). Následně byly k infekcím pokusných kuřat zařazeny divoké kmeny S. Enteritidis G1481, S. Typhimurium 2002, S. Typhimurium 2454 a S. Infantis 514, a zkonstruovány další dva klony rfal mutanta S. Infantis U kuřat infikovaných jednotlivými kmeny salmonel uvedenými v Tab. 2 byla zkoumána celková imunitní odpověď ve slepém střevě prostřednictvím exprese 43 různých genů, jejichž exprese je po infekci salmonelou zvýšena, nebo snížena Bakteriální kmeny a kvantitativní real time PCR Imunitní odpověď kuřat na infekci sérovary S. Enteritidis 147, S. Typhimurium LT2 a S. Infantis 1516 a jejich rfal mutanty byla nejprve posouzena na základě kvantifikace exprese genů pro interleukin 1 beta (IL1β), interleukin 8 (IL8), interleukin 17 (IL17), interleukin 22 (IL22), interferon gamma (IFNγ) a inducibilní NO syntázu (inos). Exprese genů ve slepém střevě kuřat infikovaných divokými kmeny salmonel významně vzrostla v porovnání s kontrolní skupinou kuřat bez infekce. S. Enteritidis 147 a S. Infantis 1516 vyvolaly podobnou zánětlivou odpověď, zatímco odpověď kuřat na infekci S. Typhimurium LT2 byla nižší oproti zbylým divokým kmenům. S výjimkou exprese IL8 vyvolali rfal mutanti ve slepém střevě kuřat významně nižší zánět než divoké kmeny salmonel. Mutanti v genu rfal, na rozdíl od divokých kmenů, nestimulovali zánětlivou odpověď a exprese sledovaných genů indukována těmito mutanty byla srovnatelná s expresí sledovaných genů u neinfikovaných kuřat (Obr. 6). 37

38 Obrázek 6: Exprese IL1β, IL8, IL17, IL22, IFNγ a inos ve slepém střevě orálně infikovaných kuřat. Sloupce představují geometrický průměr relativních expresí jednotlivých genů. Vertikální úsečky zobrazují 95% intervaly spolehlivosti geometrických průměrů. Písmena nad sloupci značí statisticky významné rozdíly mezi skupinami. Sloupce, které nesdílí stejné písmeno, reprezentují statisticky významně rozdílné odpovědi kuřat na infekci různými kmeny salmonel. NI exprese u neinfikovaných kuřat; SE exprese u kuřat infikovaných S. Enteritidis 147; STM exprese u kuřat infikovaných S. Typhimurium LT2; SI exprese u kuřat infikovaných S. Infantis 1516; SE rfal exprese u kuřat infikovaných rfal mutantem S. Enteritidis 147; STM rfal exprese u kuřat infikovaných rfal mutantem S. Typhimurium LT2; SI rfal exprese u kuřat infikovaných klonem I rfal mutanta S. Infantis Osa Y je vyjádřena v logaritmickém měřítku Proteiny secernované salmonelami Vznik zánětu ve slepém střevě kuřat je podmíněn přítomností sekrečního systému typu III, který je u salmonel kódován geny na ostrově patogenity SPI1 (Zhang a kol., 2003). Vzhledem k tomu, že S. Typhimurium LT2 vyvolala u kuřat nízkou zánětlivou odpověď, byla in vitro ověřena sekrece proteinů u všech pokusných kmenů. Proteiny secernované S. Enteritidis 147, S. Infantis 1516 a rfal mutanty S. Enteritidis 147 a S. Typhimurium LT2 byly podobné těm, jaké secernují jiné kmeny salmonel (Komoriya a kol., 1999). Avšak mutanti secernovali obecně méně proteinů. Proteinový profil jak S. Typhimurium LT2 tak rfal mutanta S. Infantis 1516 se vyznačoval silným pozadím, které naznačovalo, že došlo k lyzi bakteriálních buněk (Obr. 7A, dráha 3 a 6). Proto jsme se rozhodli rozšířit seznam kmenů salmonel k infekci kuřat a provést další pokus. Byl tedy navýšen počet divokých kmenů rfal 38

39 salmonel k infekci kuřat o S. Enteritidis G1481, S. Typhimurium 2002, S. Typhimurium 2454 a S. Infantis 514. Dále byl vytvořen klon II a klon III rfal mutanta S. Infantis Byl ověřen in vitro sekreční potenciál nově zařazených kmenů salmonel a nově vytvořených klonů rfal mutantů. Jako poslední byl proveden pokus, při kterém byla kuřata infikována všemi uvedenými kmeny salmonel a rfal mutanty (Tab. 2) a byla popsána imunitní odpověď na základě exprese 43 různých genů (Příloha 5A). Následující elektroforéza (SDS-PAGE) prokázala, že nově zařazené divoké kmeny, jmenovitě S. Enteritidis G1481, S. Typhimurium 2002, S. Typhimurium 2454 a S. Infantis 514, secernovaly standardní proteiny salmonel. U nově zkonstruovaných rfal mutantů S. Infantis 1516 (klon II a klon III) bylo opět patrné silné pozadí, což značí, že se jedná o společnou vlastnost rfal mutantů S. Infantis 1516 (Obr. 7B, dráha 5 a 6). Obrázek 7: Proteiny secernované salmonelami. A) kmeny zařazené v první části studie. 1 S. Enteritidis 147; 2 S. Enteritidis 147 rfal mutant; 3 S. Typhimurium LT2; 4 S. Typhimurium LT2 rfal mutant; 5 S. Infantis 1516; 6 S. Infantis 1516 rfal mutant klon I; M standard molekulové hmotnosti. Tato analýza byla provedena třikrát pro každý kmen nebo mutanta s podobnými výsledky v každém z opakování. B) kmeny zařazené v druhé části studie. 1 S. Enteritidis G1481; 2 S. Typhimurium 2002; 3 S. Typhimurium 2454; 4 S. Infantis 514; 5 S. Infantis 1516 rfal mutant klon II; 6 S. Infantis 1516 rfal mutant klon III; M standard molekulové hmotnosti. Tato analýza byla provedena třikrát pro každý kmen nebo mutanta s podobnými výsledky v každém z opakování. 39

40 Vztahy mezi pokusnými skupinami založené na analýze hlavních komponent K analýze hlavních komponent (PCA) byly použity hodnoty relativní exprese 43 různých genů, jejichž exprese je ve slepém střevě po infekci salmonelou zvýšena, nebo snížena a byly již dříve identifikovány (Berndt a kol., 2007; Crhanova a kol., 2011; Matulova a kol., 2012; Matulova a kol., 2013). Pokusné skupiny kuřat byly infikovány jednotlivými kmeny salmonel uvedenými v Tab. 2, tedy sedmi divokými kmeny a pěti rfal mutanty. Relativní exprese testovaných genů byla měřena u osmi kuřat v každé skupině, včetně kontrolní skupiny kuřat. Neinfikovaná kuřata tvořila samostatný shluk a oddělovala se od kuřat, která byla infikována divokými kmeny salmonel. Inaktivací genu rfal se natolik snížil infekční potenciál modifikovaných kmenů, že došlo k překryvu skupin kuřat infikovaných rfal mutanty s kontrolní neinfikovanou skupinou. Výjimkou byl rfal mutant S. Enteritidis 147, který vyvolal zánětlivou odpověď ve stejné míře jako nejméně virulentní divoké kmeny. Kmeny náležící k sérovarům Enteritidis, Typhimurium či Infantis překvapivě netvořily společné shluky (Obr. 8) Vztah mezi počtem salmonel a genovou expresí Zánět ve slepém střevě může souviset s počty salmonel v infikovaném organismu. Proto jsme porovnali hodnoty relativních expresí 43 testovaných genů a počty salmonel v játrech u jednotlivých kuřat. Z testovaných 43 genů 34 odpovídalo na infekci zvýšením exprese a 9 genů snížením exprese. Pro každé pokusné kuře byla pak vypočtena průměrná hodnota z expresí 34 inducibilních genů a průměrná hodnota z expresí 9 suprimovaných genů. Tyto vypočítané hodnoty byly použity jako index, který byl srovnáván s počtem salmonel v játrech. Zánět způsobený divokými kmeny salmonel nebyl závislý na počtu salmonel v játrech. Ačkoli byly počty salmonel v játrech kuřat v jednotlivých pokusných skupinách vyrovnané, index vybraných inducibilních či suprimovaných genů byl ve slepém střevě odlišný (Obr. 9A a 9B). Na závěr jsme pozorovali expresi inducibilních a suprimovaných genů mezi sebou. Geny se sníženou expresí po infekci salmonelou jsou spojovány se základními funkcemi střeva, jako je například transport živin. Tyto funkce nejsou při mírném zánětu ovlivněny. Míra exprese suprimovaných genů zůstala zachována i při částečném zvýšení exprese 40

41 inducibilních genů. Až když se zvýšila exprese zánětlivých znaků 10x až 100x, došlo ke snížení exprese suprimovaných genů a snížení normálních funkcí střeva (Obr. 9C). Obrázek 8: PCA graf popisující vzájemné vztahy pokusných kuřat na základě exprese genů ve slepém střevě. Heat mapa představuje korelační koeficient mezi faktorem 1 (osa X) a individuální genovou expresí. - S. Enteritidis 147; - S. Enteritidis G1481; - S. Typhimurium LT2; - S. Typhimurium 2002; - S. Typhimurium 2454; - S. Infantis 1516; - S. Infantis 514; - S. Enteritidis 147 rfal mutant; - S. Typhimurium LT2 rfal mutant; - S. Infantis 1516 rfal mutant klon I; - S. Infantis 1516 rfal mutant klon II; - S. Infantis 1516 rfal mutant klon III; + - neinfikovaná kuřata. PCA graf ukazuje, že faktor 1 vyjadřuje téměř 80 % variací v imunitní odpovědi kuřat. Tento faktor sám o sobě popisoval míru zánětu, významné korelace byly pozorovány mezi expresemi jednotlivých genů a pozicí pokusných kuřat podél osy X. Geny jsou seřazeny od nejvíce pozitivně korelujících po nejvíce negativně korelující. 41

42 Obrázek 9: Vztah mezi expresí genů a počty salmonel v játrech. A) každý bod představuje kuře, které je charakterizováno počtem salmonel v játrech a průměrnou expresí vypočítanou z expresí genů, které reagují na infekci salmonelou zvýšením exprese. B) každý bod představuje kuře, které je charakterizováno počtem salmonel v játrech a průměrnou expresí vypočítanou z expresí genů, které reagují na infekci salmonelou snížením exprese. C) každý bod představuje kuře, které je charakterizováno průměrnou expresí vypočítanou z expresí genů, které reagují na infekci salmonelou zvýšením exprese a průměrnou expresí vypočítanou z expresí genů, které reagují na infekci salmonelou snížením exprese. 42

43 4.2. Mikroflóra a její vliv na ochranu kuřat při infekci S. Enteritidis V další části dizertační práce jsem se zabývala možností ochrany kuřat před kolonizací salmonelou podáním střevní mikroflóry. Využila jsem předchozích poznatků, že mikroflóra různě starých slepic se liší (Videnska a kol., 2014) a proto jsme kolonizovali vylíhlá kuřata mikroflórou získanou od 1, 3, 16, 28 nebo 42týdenních kuřat a slepic. Nejdříve jsme zkontrolovali složení střevní mikroflóry u 8denních kuřat, která byla kolonizována. Dále byly stanoveny počty salmonel ve slepém střevě a játrech 12denních kuřat kolonizovaných mikroflórou a infikovaných S. Enteritidis 147 a na závěr byla stanovena exprese zánětlivých genů u všech 12denních kuřat pomocí real time PCR (seznam primerů v Příloze 5B). Nakonec bylo u 12denních kuřat opět stanoveno složení střevní mikroflóry. V dalším pokusu byl sledován preventivní či terapeutický efekt mikroflóry získané od 35týdenních slepic při infekci S. Enteritidis 147. Tento pokus jsme chápali jako pilotní a v současnosti již kolonizujeme kuřata čistými kulturami anaerobních bakterií izolovaných ze střevního traktu drůbeže Ochranný efekt mikroflóry různého složení při infekci S. Enteritidis Kontrolním vyšetřením nebyla identifikována salmonela v žádném z obsahů slepých střev kuřat, která byla kolonizována mikroflórou od různě starých donorů v den vylíhnutí a utracena 12. den života. U kuřat infikovaných S. Enteritidis 147 byly zaznamenány statisticky významně vyšší počty salmonel ve skupině nekolonizovaných kuřat (NK) a kuřat kolonizovaných mikroflórou získanou od 1týdenních donorů (T1) oproti kuřatům kolonizovaným mikroflórou 3týdenních (T3) a starších donorů (T16, T28, T42) (Obr. 10). Podobné výsledky byly získány po kultivaci z jater, ale bez významných rozdílů mezi skupinami. Výrazný ochranný účinek podané mikroflóry nebyl v játrech zaznamenán kvůli nízkým počtům S. Enteritidis 147 a absenci salmonel v tomto orgánu u některých pokusných kuřat. 43

44 Obrázek 10: Počty salmonel ve slepém střevě a játrech kuřat. Kuřata byla kolonizována mikroflórou získanou od slepic různého stáří v den vylíhnutí, infikována S. Enteritidis den života a utracena 12. den života. Sloupce představují průměrné počty S. Enteritidis 147 v orgánech kuřat 4 dny po infekci. NK skupina kuřat, která nebyla kolonizována mikroflórou; T je zkratkou pro určení týdne a číslo za ním představuje stáří donorových kuřat a slepic v týdnech. Hvězdičky označují statisticky významné rozdíly (P 0,05) vzhledem ke skupině NK Imunitní odpověď kolonizovaných kuřat po infekci S. Enteritidis U 12denních kuřat byla srovnána odpověď imunitního systému na kolonizaci mikroflórou získanou od 1, 3, 16, 28 a 42týdenních donorů a na infekci S. Enteritidis 147 po kolonizaci mikroflórou. Testovali jsme, zda kolonizace mikroflórou vyvolá zánětlivou odpověď a v jaké míře se rozvine imunitní odpověď kuřat na infeki S. Enteritidis 147 po kolonizaci mikroflórou. Mikroflóra od 1, 16 a 28týdenních donorů nevyvolala ve slepém střevě kolonizovaných kuřat žádnou imunitní odpověď. Tyto skupiny kuřat se shlukovaly se skupinou kuřat, která nebyla ani kolonizována, ani infikována (Obr. 11). Naopak mikroflóra od 3 a 42týdenních donorů stimulovala imunitní systém slepého střeva k zánětlivé odpovědi. Kolonizace mikroflórou 3týdenních donorů zvýšila expresi interleukinu 8 (IL8), interleukinu 17 (IL17), interleukinu 22 (IL22), interleukinu 18 (IL18) a interleukinu 1 beta (IL1β), transglutaminázy 4 (TGM4), inhibitoru serpin peptidázy B10 (SERPINB10), proteinu MRP126 (MRP126), matrix metaloproteinázy 7 (MMP7), ES1 proteinu (ES1) a lysozymu G2 (LYG2). Mikroflóra 42týdenních donorů stimulovala zvýšenou expresi chemokinu AH221 (AH221), interleukinu 16 (IL16), imunoglobulinu A (IgA) a Y (IgY) a NK lyzinu (NKL). 44

45 Kolonizace mikroflórou získanou od 3týdenních a starších donorů chránila kuřata proti infekci S. Enteritidis 147, jelikož po infekci nebyla vyvolána zánětlivá odpověď. Kuřata, která nebyla kolonizována, reagovala na infekci S. Enteritidis 147 mírným zvýšením exprese genů kódujících převážně proteiny akutní fáze, jako avidin (AVD), sérový amyloid A (SAA), imunoreaktivní gen 1 (IRG1), trappin 6 (TRAP6), protein vázající extracelulární mastné kyseliny (ExFABP) a matrix metaloproteináza 7 (MMP7). Nejcitlivější k infekci S. Enteritidis 147 byla kuřata kolonizována mikroflórou od 1týdenních donorů, která kromě genů pro IgA, IgY a NKL vysoce exprimovala všechny zbylé testované geny. Zatímco počty S. Enteritidis 147 ve slepém střevě infikovaných kuřat ze skupin NK a T1 (Obr. 10) dosáhly podobných hodnot, míra zánětlivé odpovědi u těchto skupin se zcela lišila (Obr. 11). Mikroflóra dospělých slepic tedy snižovala kolonizaci střeva S. Enteritidis 147 u infikovaných kuřat. Záleželo ale na složení podávané mikroflóry, protože po podání mikroflóry určitého složení mohou být kuřata dokonce citlivější k infekci S. Enteritidis 147. Obrázek 11: Exprese genů ve slepém střevě 12denních kuřat. Míra exprese je vyjádřena teplotní mapou, kde oranžová barva značí nejnižší míru exprese a modrá značí nejvyšší míru exprese. NK skupina nekolonizovaných a neinfikovaných kuřat; T je zkratkou pro určení týdne a číslo za ním představuje stáří donorových kuřat a slepic v týdnech; INF infekce kuřat S. Enteritidis 147 osmý den života. 45

46 Složení střevní mikroflóry u kolonizovaných kuřat Kolonizace mikroflórou ovlivnila odolnost kuřat k infekci S. Enteritidis 147, proto jsme v dalším kroku stanovili složení střevní mikroflóry recipientních kuřat před infekcí a po infekci. Inokulum použité ke kolonizaci kuřat bylo hlavním rozhodujícím faktorem pro složení střevní mikroflóry recipientních kuřat (Obr. 12). Ani věk, ve kterém byla kolonizovaná kuřata utracena, ani přítomnost či nepřítomnost infekčního agens neměly vliv na složení mikroflóry pokusných kuřat. Kuřata kolonizována mikroflórou od různě starých donorů tvořila samostatné shluky bez ohledu na to, zda byla infikována či nikoli (Obr. 12). Jedinou výjimku tvořila 8denní kuřata nekolonizována a kolonizována mikroflórou 1týdenních kuřat (jedno kuře z této skupiny nebylo možno analyzovat), která tvořila oddělené shluky (Obr. 12B). V době infekce S. Enteritidis 147 byla skladba mikroflóry těchto kuřat odlišná, což by mohlo vysvětlit rozdílnou zánětlivou odpověď na infekci S. Enteritidis 147 znázorněnou v Obr. 11. Obrázek 12: Analýza hlavních koordinát (PCoA) charakterizující složení střevní mikroflóry u 8 a 12denních kuřat, která byla kolonizována v den vylíhnutí mikroflórou získanou od donorových kuřat a slepic různého stáří, a 12denních kuřat, která byla v den vylíhnutí kolonizována, osmý den života infikována S. Enteritidis 147. A) vážená analýza hlavních koordinát. B) nevážená analýza hlavních koordinát. NK skupina nekolonizovaných a neinfikovaných kuřat; T je zkratkou pro určení týdne a číslo za ním představuje stáří donorových kuřat a slepic v týdnech. 46

47 Identifikace protektivních bakterií V mikroflóře 8denních nekolonizovaných kuřat a kuřat kolonizovaných mikroflórou získanou od 1týdenních donorů byly konstantně mezi skupinami zastoupeny taxonomické operační jednotky (OTUs) zařazené do rodu Escherichia, Anaerotruncus, Flavonifractor, Clostridium XIVa, Blautia, Anaerostipes a do čeledě Lachnospiraceae (Obr. 13). Mikroflóra 8denních nekolonizovaných kuřat a kuřat kolonizovaných mikroflórou 1týdenních kuřat však obsahovala různé taxonomické operační jednotky (Obr. 12B), což by mohlo vysvětlit rozdílnou zánětlivou odpověď na následnou infekci salmonelou (Obr. 11). Obrázek 13: Skladba mikroflóry slepého střeva kuřat ve stáří 8 dní a 12 dní s infekcí a bez infekce, která nebyla kolonizována a byla kolonizována mikroflórou od 1týdenních donorů. 1 rod Escherichia; 2 rod Flavonifractor; 3 čeleď Lachnospiraceae; 4 rod Clostridium XIVa; 5 rod Blautia; 6 rod Anaerostipes. 47

48 Proto jsme se pokusili najít bakteriální druhy, které mohly způsobit rozdíl v zánětlivé odpovědi. Mikroflóra 8denních nekolonizovaných kuřat obsahovala 72 taxonomických operačních jednotek, které nebyly přítomny v mikroflóře kuřat kolonizovaných mikroflórou získanou od 1týdenních kuřat. Jen tři z těchto taxonomických operačních jednotek tvořily více než 0,05 % všech bakterií a byly zařazeny do rodu Alistipes, Clostridium XIVa a Blautia. V mikroflóře 8denních kuřat kolonizovaných mikroflórou od 1týdenních kuřat bylo přítomno 130 specifických taxonomických operačních jednotek, které se nevyskytovaly u nekolonizovaných kuřat a 11 z nich tvořilo více než 0,05 % mikroflóry. Tyto taxonomické operační jednotky byly zařazeny do rodu Pediococcus (dvě odlišné OTUs), Bacteroides (dvě odlišné OTUs), Clostridium IV, Clostridium XVIII, Faecalibacterium, Streptophyla a nezařazené druhy čeledi Ruminococcaceae, Lachnospiraceae a Prevotelaceae. Nejvíce zastoupeny byly dvě taxonomické operační jednotky zařazené do rodu Pediococcus, které spolu tvořily 1,7 % všech bakterií identifikovaných ve střevě 8denních kuřat kolonizovaných mikroflórou od 1týdenních kuřat Terapeutické podání mikroflóry V předchozím pokusu byla pokusná kuřata infikována S. Enteritidis 147 až týden po podání mikroflóry. V dalším pokusu nás zajímalo, zda je možné dosáhnout ochranného účinku mikroflóry dříve než za sedm dní po kolonizaci a proto jsme interval mezi kolonizací a infekcí zkrátili. Dále jsme modifikovali pořadí kolonizace a infekce a tak byla čerstvě vylíhlá kuřata a) kolonizována mikroflórou od 35týdenních donorů a po 24 h infikována S. Enteritidis 147, nebo b) kolonizována mikroflórou a současně infikována S. Enteritidis 147, nebo c) infikována S. Enteritidis 147 a druhého dne byla terapeuticky kolonizována mikroflórou. V játrech kuřat kolonizovaných v den vylíhnutí a infikovaných o den později nebyla kultivací prokázána S. Enteritidis 147 (Obr. 14A). U všech ostatních skupin, tedy u skupiny kuřat infikovaných v den vylíhnutí, infikovaných a současně kolonizovaných v den vylíhnutí a infikovaných v den vylíhnutí s kolonizací střevního traktu o 24 h později, byla z tkáně jater kultivována S. Enteritidis 147. Částečně chráněna byla kuřata, která byla infikována a zároveň kolonizována (Obr. 14A). 48

49 Výsledky bakteriologické kultivace jaterní tkáně byly potvrzeny kvantitativní real time PCR, která byla provedena s cdna získanou z tkáně slepého střeva. Kolonizace mikroflórou měla zanedbatelný vliv na zánětlivou odpověď ve slepém střevě a ani následná infekce S. Enteritidis 147 nestimulovala zánět. Naopak kuřata infikovaná S. Enteritidis 147 současně nebo před kolonizací mikroflórou reagovala na infekci stejně jako kuřata, která byla infikována bez jakékoli předchozí kolonizace (Obr. 14B). Podaná mikroflóra tedy neměla terapeutický efekt. Obrázek 14: Preventivní a terapeutické použití střevní mikroflóry ke snížení kolonizace střeva bakterií S. Enteritidis 147. A) počty salmonel v játrech 4 dny po infekci. INF kuřata infikována první den života; KOL-INF kuřata kolonizována první den života a infikována druhý den života; INFaKOL kuřata infikována a kolonizována první den života; INF-KOL kuřata infikována první den života a kolonizována druhý den života. B) Heat mapa charakterizující imunitní odpověď pomocí genové exprese ve slepém střevě kuřat 5. den života. KOL-INF kuřata kolonizována první den života a infikována druhý den života; KOL kuřata kolonizována 35týdenní mikroflórou; NK-NI kuřata, která nebyla infikována ani kolonizována; INFaKOL kuřata současně infikována a kolonizována první den života; INF kuřata infikována první den života; INF-KOL kuřata infikována první den života a kolonizována druhý den života. 49

50 4.3. Ochrana kuřat trivalentní vakcínou Kromě produktů kompetitivní exkluze, tedy mikroflóry donorových jedinců, se k ochraně kuřat proti infekci salmonelami používají vakcíny. V poslední části dizertační práce jsme testovali trivalentní vakcínu připravenou k ochraně kuřat proti sérovaru Enteritidis, Typhimurium a Infantis a potenciálně také k ochraně proti heterologním sérovarům Agona, Dublin a Hadar. Na závěr jsme také vyzkoušeli zkombinovat vakcinaci kuřat s kolonizací střevní mikroflórou donorových slepic Ochrana proti infekci homologními sérovary Vakcinovaná kuřata byla 21. den života, tedy před čelenží, testována na přítomnost vakcinačních kmenů. Slepá střeva všech šesti utracených kuřat byla pozitivní a u čtyř kuřat byly vakcinační kmeny zjištěny v játrech. Z 56 náhodně odebraných kolonií byly 2 určeny jako sérovar Enteritidis, 11 jako Typhimurium a 43 jako Infantis. Obrázek 15: Ochranný efekt trivalentní vakcíny (S. Enteritidis 147, Typhimurium 2002 a Infantis 1516) proti infekci homologními sérovary. Počty salmonel v játrech pokusných kuřat 4 dny po infekci (DPI) a 14 dní po infekci. NV nevakcinovaná kuřata; V vakcinovaná kuřata; SE čelenž S. Enteritidis 147; STM čelenž S. Typhimurium 2002; SI čelenž S. Infantis Hvězdičky označují statisticky významné rozdíly (P 0,05) vzhledem k příslušné nevakcinované kontrole. 50

51 Po čelenži vakcinovaných kuřat byla po kvalitativním vyšetření salmonel všechna kuřata pozitivní na S. Enteritidis 147, Typhimurium 2002 nebo Infantis 1516 ve slepém střevě. Kvantitativní průkaz salmonel ve slepém střevě však nebyl možný v důsledku přerůstání bakteriemi rezistentními ke kyselině nalidixové, ale odlišnými od S. enterica. V játrech byly počty salmonel po čelenži vždy nižší u vakcinovaných než u nevakcinovaných kuřat, a to jak 4 tak 14 dní po čelenži, přestože tyto rozdíly dosáhly statistické významnosti pouze po čelenži S. Enteritidis 147 (Obr. 15) Ochrana proti infekci heterologními sérovary Vakcinace oslabenými kmeny S. Enteritidis 147, Typhimurium 2002 a Infantis 1516 nechránila kuřata před čelenží S. Agona. Vakcinace však vedla ke snížení počtů S. Dublin ve slepém střevě a téměř úplně chránila kuřata před infekcí S. Hadar FA2033. Čelenž kuřat S. Enteritidis 147 sloužila jako kontrola (Tab. 4). Kolonizace jater S. Agona, S. Dublin a S. Hadar FA2033 byla nízká i u nevakcinovaných kuřat a mezi nevakcinovanými a vakcinovanými kuřaty nebyl pozorován žádný významný rozdíl (Obr. 16). Stejně jako v předchozím pokusu (Obr. 15) chránila vakcinace kuřata před kolonizací jater S. Enteritidis 147 (Obr. 16). Tabulka 4: Počet nevakcinovaných a vakcinovaných kuřat pozitivních na salmonelu ve slepém střevě. NV VAK NV VAK infekce 4 dny po infekci 14 dní po infekci S. Enteritidis 147 6/6 6/6 6/6 5/6 S. Agona 6/6 6/6 6/6 6/6 S. Dublin 3/6 5/6 6/6 2/6 S. Hadar FA2033 4/6 1/6 6/6 0/6 NV, nevakcinovaná kuřata; VAK, vakcinovaná kuřata;, statisticky významně odlišné skupiny od příslušných nevakcinovaných kontrol s využitím χ 2 testu a P < 0,05 51

52 Obrázek 16: Ochranný efekt trivalentní vakcíny (S. Enteritidis 147, Typhimurium 2002 a Infantis 1516) proti infekci heterologními sérovary. Počty salmonel v játrech pokusných kuřat 4 dny po infekci (DPI) a 14 dní po infekci. NV nevakcinovaná kuřata; V vakcinovaná kuřata; SE čelenž S. Enteritidis 147; SA čelenž S. Agona; SD čelenž S. Dublin; SH čelenž S. Hadar FA Podání vakcíny ve směsi se střevní mikroflórou V posledním pokusu byla sledována dlouhodobá chráněnost kuřat dle dvou odlišných vakcinačních schémat. Na rozdíl od předchozích experimentů byla čelenž prováděna pouze s divokým kmenem S. Enteritidis 147. Kvantitativní průkaz salmonel ve slepém střevě opět komplikovalo přerůstání jiné mikroflóry rezistentní ke kyselině nalidixové. Po kvalitativním průkazu salmonel však byla 4 dny po čelenži všechna kuřata pozitivní na S. Enteritidis 147, a to bez ohledu na věk. V játrech nebyly po kvantitativním průkazu S. Enteritidis 147 zjištěny žádné rozdíly mezi 6týdenními a 18týdenními kuřaty a proto byla data z těchto dvou věkových kategorií spojena (Obr. 17). Játra kuřat, která byla vakcinovaná, byla prostá S. Enteritidis 147. Podání střevní mikroflóry od 34týdenních slepic současně s vakcinací numericky snížilo účinnost vakcinace, avšak toto snížení nedosáhlo statistické významnosti. 52

53 Obrázek 17: Počty S. Enteritidis 147 v játrech kuřat 4 dny po čelenži. NV nevakcinovaná skupina kuřat; VAK skupina kuřat vakcinovaných oslabenými kmeny S. Enteritidis 147, S. Typhimurium 2002 a S. Infantis 1516; VAK+KOL kuřata, kterým byla společně s vakcinací podána mikroflóra získaná od 34týdenních donorových slepic. 53

54 5. DISKUZE V první části dizertační práce byla porovnávána imunitní odpověď ve střevě kuřat, která byla infikována sedmi kmeny tří různých sérovarů Salmonella enterica a jejich mutanty defektními v genu pro O-antigen. V dřívějších pracích byla zaznamenána snížující se invaze anebo zánětlivá odpověď kuřat nebo kuřecích buněčných subpopulací na infekci S. Enteritidis, S. Typhimurium a S. Infantis (Berndt a kol., 2007; Setta a kol., 2012a; Setta a kol., 2012b; Aabo a kol., 2002), avšak v pokusech provedených v naší laboratoři nebyl tento trend závislý na konkrétním sérovaru pozorován. Z našich pokusů vyplývá, že reakce kuřat na salmonelu byla závislá spíše na konkrétním kmeni, který byl k infekci použit. Jako příklad může sloužit izolát S. Typhimurium 2454 (fágový typ DT2) (Andrews-Polymenis a kol., 2004) získaný od holubů, tedy kmen hostitelsky specifický pro ptáky, který vyvolal u kuřat nižší zánětlivou odpověď než humánní izolát S. Typhimurium 2002 (fágový typ DT104). Některé z těchto nepředpokládaných reakcí na infekci salmonelami lze vysvětlit nižší virulencí kmenů, která je například u S. Typhimurium LT2 způsobena mutací ve start kodonu genu rpos, který pod vlivem stresových podmínek exprimuje alternativní sigma faktor, podjednotku RNA-polymerázy (Swords a kol., 1997; Wilmes-Riesenberg a kol., 1997), nebo nižší stabilitou ve stacionární fázi růstu (Spector 1998) a uvolňováním cytoplazmatických proteinů do media (Obr. 7). Obecně lze říci, že první interakce nevyzrálého imunitního systému vylíhlých kuřat se salmonelou nebyla ovlivněna typem sérovaru, ale spíše vlastnostmi konkrétního kmene. Pokusy provedené v rámci studia sérovarů salmonel byly jednotně ukončeny v čase, kdy kuřata dosáhla věku 5 dní. Z čehož plyne, že by se mohla v pozdějším věku kuřat objevit odlišná systémová reakce na jednotlivé sérovary, například v játrech, slezině nebo i ve slepém střevě. Odstraněním O-antigenu došlo k významnému snížení schopnosti salmonel vyvolat zánět ve slepém střevě kuřat, pravděpodobně kvůli jejich zvýšené citlivosti k antimikrobiálním peptidům nebo séru (Karasova a kol., 2009). Kmeni S. Enteritidis 147 s odstraněným O-antigenem zůstala nejvyšší zbytková virulenci, zatímco rfal mutant S. Typhimurium LT2 a S. Infantis 1516 téměř nebyl schopen vyvolat zánět v infikovaných kuřatech a kuřata infikována těmito kmeny vykazovala podobnou imunitní odpověď jako neinfikovaná kontrolní kuřata (Obr. 8). Dalším možným pokusem by mohlo být použití rfal mutantů, zvláště rfal mutanta S. Enteritidis 147, k vyvolání mírného zánětu a tudíž 54

55 stimulaci imunitního systému, který se pak lépe vypořádá s infekcí divokými kmeny salmonel. Podobný pokus byl již proveden u gnotobiotických selat (Trebichavsky a kol., 1997). Nakonec jsme testovali, zda může být ovlivněna odlišná zánětlivá odpověď počtem salmonel v játrech. K tomu účelu jsme samostatně analyzovali geny, jejichž exprese se ve slepém střevě kuřat po infekci salmonelou zvyšuje, a geny, jejichž exprese se snižuje (Matulova a kol., 2013). Inducibilní geny jsou spojovány s vrozenou imunitní odpovědí a zánětem, kdežto suprimované geny souvisí s normálními funkcemi střeva, jako je transport vápníku nebo vody (např. calbindin 1 a akvaporin 8). Srovnání počtu salmonel ať už proti průměrné expresi všech inducibilních genů, nebo proti průměrné expresi všech suprimovaných genů neukázalo jasné závěry, a tak není vhodné porovnávat rozdíly mezi jednotlivými kmeny salmonel na základě jejich počtů v játrech. Zajímavé bylo porovnání průměrné exprese genů inducibilních po infekci salmonelou oproti průměrné expresi genů suprimovaných po infekci salmonelou. Pozorovali jsme, že exprese suprimovaných genů zůstala neměnná, pokud se exprese inducibilních genů nezvýšila více než 10x. Až po desetinásobném až stonásobném zvýšení exprese inducibilních genů došlo k postupnému snižování exprese suprimovaných genů. Z těchto výsledků vyplývá, že produkty genů se sníženou expresí po infekci salmonelou udržují ve slepém střevě stabilní a konstantní prostředí a zachovávají normální funkce střeva i při mírném zánětu. V další části dizertační práce byl sledován vliv podané mikroflóry získané ze slepého střeva různě starých donorových kuřat a slepic na průběh infekce S. Enteritidis 147. Opakovaně bylo publikováno, že se odolnost kuřat proti infekcím způsobeným netyfoidními sérovary salmonel zvyšuje s věkem (Beal a kol., 2004, 2005; Withanage a kol., 2004). Přibližně čtvrtý den života lze zaznamenat mírný zánět (Crhanova a kol., 2011), který slouží jako signál k infiltraci leukocytů do sliznice střeva (Van Immerseel a kol., 2002; Bar-Shira a kol., 2003) a zvýšení odolnosti kuřat proti infekci salmonelou. I přesto je jako důležitější považována přítomnost přirozené mikroflóry ve střevě (Rantala a Nurmi, 1973). Mikroflóra podaná před infekcí S. Enteritidis 147 přímo bránila množení S. Enteritidis 147 ve slepém střevě. Střevo nejevilo známky zánětu v důsledku nepřítomnosti S. Enteritidis 147 schopných infikovat buňky slepého střeva. 55

56 Bylo zajímavé, že mikroflóra získaná od 1týdenních donorů nechránila recipientní kuřata před infekcí S. Enteritidis 147. Předpokládali jsme, že skupina kuřat kolonizovaných mikroflórou od 1týdenních donorů bude mít podobné složení mikroflóry jako skupina nekolonizovaných kuřat a bude podobně reagovat na infekci S. Enteritidis 147. Přestože počty salmonel u kuřat kolonizovaných mikroflórou od 1týdenních donorů nedosáhly statistické významnosti, byly početně vyšší v porovnání s nekolonizovanými kuřaty (Obr. 10). Odlišnost v počtu identifikovaných salmonel se pak významně projevila v rozdílné zánětlivé odpovědi na infekci u těchto dvou skupin kuřat (Obr. 11). Kuřata kolonizována mikroflórou získanou od 1týdenních donorů byla citlivější k infekci S. Enteritidis 147, což se projevilo vysokou expresí sledovaných genů. Analýza skladby mikrobiálního společenstva ve slepém střevě ukázala, že před infekcí byla mikroflóra nekolonizovaných kuřat odlišná od mikroflóry kuřat kolonizovaných mikroflórou od 1týdenních donorů. Mikroflóra velmi mladých kuřat se poměrně rychle vyvíjí (Videnska a kol., 2014) a v závislosti na podmínkách chovu se v tomto období života mohou objevit prospěšné bakterie buď dříve, nebo později. Proto je obtížné určit, které konkrétní bakterie vyskytující se ve významně vyšším počtu u kolonizovaných kuřat byly zodpovědné za zvýšenou citlivost k infekci S. Enteritidis 147. Na rozdíl od nekolonizovaných kontrolních kuřat se v mikroflóře kolonizovaných kuřat častěji vyskytovaly grampozitivní bakterie Pediococcus nebo Faecalibacterium, avšak tyto bakterie jsou používány jako probiotické kmeny a je znám jejich protizánětlivý účinek (Sokol a kol., 2008; Biloni a kol., 2013; Qiu a kol., 2013). Tyto dva bakteriální rody proto pravděpodobně nebyly zodpovědné za vyšší citlivost k infekci S. Enteritidis 147. Nepublikované výsledky naší laboratoře ukazují, že kolonizace vylíhlých kuřat čistými kulturami některých klonů náležících do rodu Bacteroides sp. a Alistipes sp. zhoršila průběh následné infekce S. Enteritidis 147 v porovnání s kontrolní nekolonizovanou skupinou kuřat. Dva rozdílné klony rodu Bacteroides sp. přítomné v mikroflóře kuřat kolonizovaných mikroflórou od 1týdenních donorů mohou být vysvětlením zvýšené citlivosti k infekci S. Enteritidis 147, ale nemohou být základem pro dostatečné a konečné vysvětlení. Podobné výsledky prozatím nebyly publikovány, jelikož všechny studie se zabývaly testováním kompetitivní exkluze s využitím mikroflóry získané od dospělých slepic (Kerr a kol., 2013; Milbradt a kol., 2014) a žádná ze studií nesledovala vliv mikroflóry získané od 1týdenních donorů na recipientní jedince. Navíc se může charakter 56

57 ochranného či negativního efektu mikroflóry mezi experimenty značně lišit vzhledem k variabilitě mikroflóry 1týdenních kuřat. Výsledky ukazují, že je třeba dbát na složení mikroflóry používané ke kompetitivní exkluzi. Složení některých typů mikroflóry nemá potenciál poskytnout očekávaný ochranný účinek nebo může dokonce umožnit přemnožení oportunních patogenů nebo zoonotických agens ve slepém střevě kolonizovaných kuřat (Polansky a kol., 2016). Ochranného účinku kolonizace mikroflórou je možné dosáhnout již během 24 h. Tato informace podporuje domněnku, že účinek mikroflóry není závislý na imunitním systému kuřat. Bohužel ani terapeutické podání mikroflóry ani současné podání mikroflóry s infekcí S. Enteritidis 147 nebylo úspěšné v ochraně střeva recipientních kuřat před kolonizací S. Enteritidis 147 (Obr. 14). Ale je třeba podotknout, že infekční dávka S. Enteritidis 147 byla v prováděných pokusech záměrně vyšší než za normálních podmínek. Podání mikroflóry v praxi proto může zvýšit odolnost kuřat k infekci S. Enteritidis, dokonce i v případě již probíhající salmonelové infekce. Mikroflóra může navíc v přirozených podmínkách chránit neinfikovaná kuřata, a tak snižovat promořenost hejn S. Enteritidis. Zánětlivá reakce ve slepém střevě po současném podání střevní mikroflóry a S. Enteritidis 147 ukázala, že kuřecí imunitní systém dokáže reagovat na salmonely i za přítomnosti mikroflóry získané od donorových jedinců. Imunitní systém může tedy stejně rozpoznávat a reagovat na vakcinaci oslabenými kmeny salmonel a podanou mikroflóru (Methner a kol., 1999). To také znamená, že by bylo možné připravit vakcínu, která by se skádala z oslabených kmenů salmonel a mikroflóry vybraného složení. Mikroflóra by chránila kuřata během prvních dnů života a později by byla kuřata dlouhodobě chráněna specifickou imunitou vzniklou na základě vakcinace. V poslední části dizertační práce jsme proto srovnávali vakcinační potenciál oslabených kmenů S. Enteritidis 147, S. Typhimurium 2002 a S. Infantis 1516 s čelenží divokými kmeny sérovarů obsažených ve vakcíně a sérovarů, které nejsou ve vakcíně zastoupeny. Připravená vakcína opakovaně chránila kuřata proti čelenži sérovary přítomnými ve vakcíně. Vakcinační potenciál se projevil také ochranou kuřat proti infekci S. Hadar FA2033 a částečně proti S. Dublin. Trivalentní vakcína však nechránila kuřata proti infekci S. Agona. Takové zjištění bylo překvapivé, protože byla očekávána částečná ochrana proti infekci S. Agona a S. Dublin kvůli přítomnosti společných O-antigenů u S. Agona 57

58 a S. Typhimurium, a S. Dublin a S. Enteritidis (Tab. 1). V současnosti jsou komerčně dostupné vakcíny, které obsahují atenuované kmeny sérovarů Enteritidis a Typhimurium. Publikovaná data poukazují na poměrně nízkou zkříženou ochranu. Kuřata vakcinovaná vakcínou obsahující oslabené kmeny S. Enteritidis nebo S. Typhimurium jsou jen slabě chráněna před infekcí jinými sérovary (Gantois a kol., 2006; Dueger a kol., 2001). Výsledky našich pokusů ukazují, že trivalentní vakcína S. Enteritidis 147-S.Typhimurium 2002-S. Infantis 1516 vykazuje jistou míru zkřížené ochrany vůči heterologním sérovarům. Celková chráněnost je závislá nejen na sérologické klasifikaci infekčních kmenů, ale i na virulenci jednotlivých izolátu použitých k čelenži. Alternativou k orálnímu podání živých salmonelových vakcín je jejich podání současně s probiotickými kmeny nebo produkty kompetitivní exkluze (Methner a kol., 1999; Braukmann a kol., 2016). Tento pokus jen potvrdil dřívější domněnku, že současné podání střevní mikroflóry ze zdravých slepic zvyšuje okamžitou odolnost kuřat proti infekci salmonelami prostřednictvím interakce a kompetice mikroflóry se salmonelami. Mikroflóra chrání kuřata ještě před indukcí specifické imunity stimulované oslabenými kmeny salmonel. V průběhu této dizertační práce jsme zjistili, že nezáleží zcela výhradně na sérologické klasifikaci kmene, kterým jsou kuřata infikována. Důležitý je druh a vlastnosti konkrétního kmene a přítomnost O-antigenu. Jen rfal mutant S. Enteritidis 147 by se mohl zařadit do skupiny oslabených kmenů potenciálně vhodných k využití při vakcinaci. Jako ochrana kuřat proti infekci salmonelami je možné kromě vakcinace využít kompetitivní exkluzi. Ke kolonizaci kuřat jsme použili mikroflóru získanou od donorů různého stáří. Zjistili jsme, že mikroflóra mladých kuřat, která se velmi dynamicky vyvíjí, není vhodná ke kolonizaci recipientů. Mikroflóra 1týdenních kuřat je tvořena převážně enterobakteriemi (Videnska a kol., 2014). Některé z těchto gramnegativních druhů pravděpodobně po kolonizaci zvyšují citlivost recipientních jedinců k infekci S. Enteritidis 147. Na rozdíl od mikroflóry mladých kuřat obsahuje mikroflóra starších jedinců vyšší podíl grampozitivních zástupců kmene Firmicutes, což je dle výsledků důvodem ochranného účinku této mikroflóry. Proto se momentálně v naší laboratoři provádí kolonizce kuřat čistými kulturami anaerobních bakterií izolovaných ze střevního traktu drůbeže. Dále budou testovány nejvhodnější kombinace anaerobních bakterií identifikovaných jako probiotické kmeny. U vakcíny připravené v naší laboratoři bude dále testována aerosolová forma vakcinace. 58

59 6. ZÁVĚR V rámci této dizertační práce jsem v souladu s cíli dospěla k následujícím poznatkům: při infekcích kuřat různými kmeny sérovarů S. Enteritidis, S. Typhimurium a S. Infantis nebylo rozhodující zařazení kmene do sérovaru, ale reakce imunitního systému kuřat byla závislá na konkrétním kmeni, který byl k infekci použit rfal mutant S. Typhimurium LT2 a S. Infantis 1516 téměř nebyl schopen vyvolat zánět v infikovaných kuřatech rfal mutant S. Enteritidis 147 vyvolal mírný zánět a stimuloval imunitní systém, čímž by mohl snížit zánětlivou odpověď po infekci divokými kmeny salmonel mikroflóra získaná od 3týdenních a starších donorů chránila kuřata proti infekci S. Enteritidis 147 mikroflóra podaná před infekcí S. Enteritidis 147 chránila kuřata již po uplynutí 24 h trivalentní vakcína připravená v naší laboratoři z oslabených kmenů S. Enteritidis 147, S. Typhimurium 2002 a S. Infantis 1516 chránila kuřata proti infekci divokými kmeny zmíněných sérovarů trivalentní vakcína částečně chránila kuřata proti infekci heterologními sérovary S. Dublin a S. Hadar FA2033, vakcína nechránila kuřata proti infekci S. Agona současné podání střevní mikroflóry zdravých donorů při vakcinaci kuřat zvyšuje odolnost kuřat proti infekci salmonelami 59

60 LITERATURA Aabo S, Christensen JP, Chadfield MS, Carstensen B, Olsen JE, Bisgaard M. Quantitative comparison of intestinal invasion of zoonotic serotypes of Salmonella enterica in poultry. Avian Pathol. 2002;31(1):41-7. Achtman M, Wain J, Weill FX, Nair S, Zhou Z, Sangal V, et al. Multilocus sequence typing as a replacement for serotyping in Salmonella enterica. PLoS Pathog. 2012;8(6):e Ahmer BM, Tran M, Heffron F. The virulence plasmid of Salmonella Typhimurium is selftransmissible. J Bacteriol. 1999;181(4): Alpuche-Aranda CM, Racoosin EL, Swanson JA, Miller SI. Salmonella stimulate macrophage macropinocytosis and persist within spacious phagosomes. J Exp Med. 1994;179(2): Alvarez J, Sota M, Vivanco AB, Perales I, Cisterna R, Rementeria A, et al. Development of a multiplex PCR technique for detection and epidemiological typing of Salmonella in human clinical samples. J Clin Microbiol. 2004;42(4): Amavisit P, Lightfoot D, Browning GF, Markham PF. Variation between pathogenic serovars within Salmonella pathogenicity islands. J Bacteriol. 2003;185(12): Andrews-Polymenis HL, Bäumler AJ, McCormick BA, Fang FC. Taming the elephant: Salmonella biology, pathogenesis, and prevention. Infect Immun. 2010;78(6): Andrews-Polymenis HL, Rabsch W, Porwollik S, McClelland M, Rosetti C, Adams LG, et al. Host restriction of Salmonella enterica serotype Typhimurium pigeon isolates does not correlate with loss of discrete genes. J Bacteriol. 2004;186(9): Ao TT, Feasey NA, Gordon MA, Keddy KH, Angulo FJ, Crump JA. Global burden of invasive nontyphoidal Salmonella disease, 2010(1). Emerg Infect Dis. 2015;21(6). Ashkenazi S, Cleary TG, Murray BE, Wanger A, Pickering LK. Quantitative analysis and partial characterization of cytotoxin production by Salmonella strains. Infect Immun. 1988;56(12): Bakowski MA, Braun V, Lam GY, Yeung T, Heo WD, Meyer T, et al. The phosphoinositide phosphatase SopB manipulates membrane surface charge and trafficking of the Salmonella-containing vacuole. Cell Host Microbe. 2010;7(6): Bar-Shira E, Sklan D, Friedman A. Establishment of immune competence in the avian GALT during the immediate post-hatch period. Dev Comp Immunol. 2003;27(2):

61 Batista DF, Freitas Neto OC, Barrow PA, Oliveira MT, Almeida AM, Ferraudo AS, et al. Identification and characterization of regions of difference between the Salmonella Gallinarum biovar Gallinarum and the Salmonella Gallinarum biovar Pullorum genomes. Infect Genet Evol. 2015;30: Baxa U, Steinbacher S, Miller S, Weintraub A, Huber R, Seckler R. Interactions of phage P22 tails with their cellular receptor, Salmonella O-antigen polysaccharide. Biophys J. 1996;71(4): Beal RK, Powers C, Wigley P, Barrow PA, Kaiser P, Smith AL. A strong antigen-specific T-cell response is associated with age and genetically dependent resistance to avian enteric salmonellosis. Infect Immun. 2005;73(11): Beal RK, Wigley P, Powers C, Hulme SD, Barrow PA, Smith AL. Age at primary infection with Salmonella enterica serovar Typhimurium in the chicken influences persistence of infection and subsequent immunity to re-challenge. Vet Immunol Immunopathol. 2004;100(3-4): Bearson BL, Wilson L, Foster JW. A low ph-inducible, PhoPQ-dependent acid tolerance response protects Salmonella Typhimurium against inorganic acid stress. J Bacteriol. 1998;180(9): Berndt A, Wilhelm A, Jugert C, Pieper J, Sachse K, Methner U. Chicken cecum immune response to Salmonella enterica serovars of different levels of invasiveness. Infect Immun. 2007;75(12): Biloni A, Quintana CF, Menconi A, Kallapura G, Latorre J, Pixley C, et al. Evaluation of effects of EarlyBird associated with FloraMax-B11 on Salmonella Enteritidis, intestinal morphology, and performance of broiler chickens. Poult Sci. 2013;92(9): Boyle EC, Brown NF, Finlay BB. Salmonella enterica serovar Typhimurium effectors SopB, SopE, SopE2 and SipA disrupt tight junction structure and function. Cell Microbiol. 2006;8(12): Braukmann M, Barrow PA, Berndt A, Methner U. Combination of competitive exclusion and immunisation with a live Salmonella vaccine in newly hatched chickens: Immunological and microbiological effects. Res Vet Sci. 2016;107: Caporaso JG, Kuczynski J, Stombaugh J, Bittinger K, Bushman FD, Costello EK, et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nat Methods. 2010;7(5):

62 Chaudhuri RR, Morgan E, Peters SE, Pleasance SJ, Hudson DL, Davies HM, et al. Comprehensive assignment of roles for Salmonella Typhimurium genes in intestinal colonization of food-producing animals. PLoS Genet. 2013;9(4):e Chopra AK, Huang JH, Xu X, Burden K, Niesel DW, Rosenbaum MW, et al. Role of Salmonella enterotoxin in overall virulence of the organism. Microb Pathog. 1999;27(3): Chu H, Mazmanian SK. Innate immune recognition of the microbiota promotes hostmicrobial symbiosis. Nat Immunol. 2013;14(7): Clayton DJ, Bowen AJ, Hulme SD, Buckley AM, Deacon VL, Thomson NR, et al. Analysis of the role of 13 major fimbrial subunits in colonisation of the chicken intestines by Salmonella enterica serovar Enteritidis reveals a role for a novel locus. BMC Microbiol. 2008;8:228. Coburn B, Grassl GA, Finlay BB. Salmonella, the host and disease: a brief review. Immunol Cell Biol. 2007;85(2): Cooper GL, Nicholas RA, Cullen GA, Hormaeche CE. Vaccination of chickens with a Salmonella Enteritidis aroa live oral Salmonella vaccine. Microb Pathog. 1990;9(4): Coward C, Sait L, Cogan T, Humphrey TJ, Maskell DJ. O-antigen repeat number in Salmonella enterica serovar Enteritidis is important for egg contamination, colonisation of the chicken reproductive tract and survival in egg albumen. FEMS Microbiol Lett. 2013;343(2): Crhanova M, Hradecka H, Faldynova M, Matulova M, Havlickova H, Sisak F, et al. Immune response of chicken gut to natural colonization by gut microflora and to Salmonella enterica serovar Enteritidis infection. Infect Immun. 2011;79(7): Darwin KH, Miller VL. Molecular basis of the interaction of Salmonella with the intestinal mucosa. Clin Microbiol Rev. 1999;12(3): Datsenko KA, Wanner BL. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000;97(12): de Freitas Neto OC, Setta A, Imre A, Bukovinski A, Elazomi A, Kaiser P, et al. A flagellated motile Salmonella Gallinarum mutant (SG Fla+) elicits a pro-inflammatory response from avian epithelial cells and macrophages and is less virulent to chickens. Vet Microbiol. 2013;165(3-4): de Jong HK, Parry CM, van der Poll T, Wiersinga WJ. Host-pathogen interaction in invasive Salmonellosis. PLoS Pathog. 2012;8(10):e

63 Deiwick J, Salcedo SP, Boucrot E, Gilliland SM, Henry T, Petermann N, et al. The translocated Salmonella effector proteins SseF and SseG interact and are required to establish an intracellular replication niche. Infect Immun. 2006;74(12): Diehl GE, Longman RS, Zhang JX, Breart B, Galan C, Cuesta A, et al. Microbiota restricts trafficking of bacteria to mesenteric lymph nodes by CX(3)CR1(hi) cells. Nature. 2013;494(7435): Dieye Y, Ameiss K, Mellata M, Curtiss R. The Salmonella Pathogenicity Island (SPI) 1 contributes more than SPI2 to the colonization of the chicken by Salmonella enterica serovar Typhimurium. BMC Microbiol. 2009;9:3. Doyle ME, Kaspar C, Archer J, Klos R. White paper on human illness by Salmonella from all fodd and non-food vectors, in Salmonella human illness from food and non-food sources, Madison, WI (USA), Dueger EL, House JK, Heithoff DM, Mahan MJ. Salmonella DNA adenine methylase mutants elicit protective immune responses to homologous and heterologous serovars in chickens. Infect Immun. 2001;69(12): Foley SL, Johnson TJ, Ricke SC, Nayak R, Danzeisen J. Salmonella pathogenicity and host adaptation in chicken-associated serovars. Microbiol Mol Biol Rev. 2013;77(4): Foley SL, Lynne AM, Nayak R. Salmonella challenges: prevalence in swine and poultry and potential pathogenicity of such isolates. J Anim Sci. 2008;86(14 Suppl):E Foley SL, Nayak R, Hanning IB, Johnson TJ, Han J, Ricke SC. Population dynamics of Salmonella enterica serotypes in commercial egg and poultry production. Appl Environ Microbiol. 2011;77(13): Frye J, Karlinsey JE, Felise HR, Marzolf B, Dowidar N, McClelland M, et al. Identification of new flagellar genes of Salmonella enterica serovar Typhimurium. J Bacteriol. 2006;188(6): Gantois I, Ducatelle R, Timbermont L, Boyen F, Bohez L, Haesebrouck F, et al. Oral immunisation of laying hens with the live vaccine strains of TAD Salmonella vac E and TAD Salmonella vac T reduces internal egg contamination with Salmonella Enteritidis Vaccine. 2006;24(37-39): Gottesman S, Trisler P, Torres-Cabassa A. Regulation of capsular polysaccharide synthesis in Escherichia coli K-12: characterization of three regulatory genes. J Bacteriol. 1985;162(3): Grimont PAD, Weil FX. Antigenic formulae of the Salmonella serovars, WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Salmonella. Institut Pasteur. Paris,

64 Guard-Petter J, Keller LH, Rahman MM, Carlson RW, Silvers S. A novel relationship between O-antigen variation, matrix formation, and invasiveness of Salmonella Enteritidis. Epidemiol Infect. 1996;117(2): Haneda T, Okada N, Kikuchi Y, Takagi M, Kurotaki T, Miki T, et al. Evaluation of Salmonella enterica serovar Typhimurium and Choleraesuis slya mutant strains for use in live attenuated oral vaccines. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 2011;34(5): Heir E, Lindstedt BA, Nygård I, Vardund T, Hasseltvedt V, Kapperud G. Molecular epidemiology of Salmonella Typhimurium isolates from human sporadic and outbreak cases. Epidemiol Infect. 2002;128(3): Henderson IR, Owen P, Nataro JP. Molecular switches--the ON and OFF of bacterial phase variation. Mol Microbiol. 1999;33(5): Hendriksen RS, Vieira AR, Karlsmose S, Lo Fo Wong DM, Jensen AB, Wegener HC, et al. Global monitoring of Salmonella serovar distribution from the World Health Organization Global Foodborne Infections Network Country Data Bank: results of quality assured laboratories from 2001 to Foodborne Pathog Dis. 2011;8(8): Higgs R, Cormican P, Cahalane S, Allan B, Lloyd AT, Meade K, et al. Induction of a novel chicken Toll-like receptor following Salmonella enterica serovar Typhimurium infection. Infect Immun. 2006;74(3): Hölzer SU, Schlumberger MC, Jäckel D, Hensel M. Effect of the O-antigen length of lipopolysaccharide on the functions of Type III secretion systems in Salmonella enterica. Infect Immun. 2009;77(12): Huang C, Liu Q, Luo Y, Li P, Kong Q. Regulated delayed synthesis of lipopolysaccharide and enterobacterial common antigen of Salmonella Typhimurium enhances immunogenicity and cross-protective efficacy against heterologous Salmonella challenge. Vaccine. 2016;34(36): Hurley D, McCusker MP, Fanning S, Martins M. Salmonella-host interactions - modulation of the host innate immune system. Front Immunol. 2014;5:481. Iqbal M, Philbin VJ, Withanage GS, Wigley P, Beal RK, Goodchild MJ, et al. Identification and functional characterization of chicken toll-like receptor 5 reveals a fundamental role in the biology of infection with Salmonella enterica serovar Typhimurium. Infect Immun. 2005;73(4): Jones BD, Ghori N, Falkow S. Salmonella Typhimurium initiates murine infection by penetrating and destroying the specialized epithelial M cells of the Peyer's patches. J Exp Med. 1994;180(1):

65 Karasova D, Sebkova A, Vrbas V, Havlickova H, Sisak F, Rychlik I. Comparative analysis of Salmonella enterica serovar Enteritidis mutants with a vaccine potential. Vaccine. 2009;27(38): Kerr AK, Farrar AM, Waddell LA, Wilkins W, Wilhelm BJ, Bucher O, et al. A systematic review-meta-analysis and meta-regression on the effect of selected competitive exclusion products on Salmonella spp. prevalence and concentration in broiler chickens. Prev Vet Med. 2013;111(1-2): Knodler LA, Vallance BA, Celli J, Winfree S, Hansen B, Montero M, et al. Dissemination of invasive Salmonella via bacterial-induced extrusion of mucosal epithelia. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010;107(41): Komoriya K, Shibano N, Higano T, Azuma N, Yamaguchi S, Aizawa SI. Flagellar proteins and type III-exported virulence factors are the predominant proteins secreted into the culture media of Salmonella Typhimurium. Mol Microbiol. 1999;34(4): Kuhle V, Hensel M. Cellular microbiology of intracellular Salmonella enterica: functions of the type III secretion system encoded by Salmonella pathogenicity island 2. Cell Mol Life Sci. 2004;61(22): Kurashima Y, Goto Y, Kiyono H. Mucosal innate immune cells regulate both gut homeostasis and intestinal inflammation. Eur J Immunol. 2013;43(12): Kuźmińska-Bajor M, Kuczkowski M, Grzymajło K, Wojciech Ł, Sabat M, Kisiela D, et al. Decreased colonization of chicks by Salmonella enterica serovar Gallinarum expressing mannose-sensitive FimH adhesin from Salmonella enterica serovar Enteritidis. Vet Microbiol. 2012;158(1-2): LaRock DL, Chaudhary A, Miller SI. Salmonellae interactions with host processes. Nat Rev Microbiol. 2015;13(4): Le Minor L, Popoff MY. Designation of Salmonella enterica sp. nov., nom. rev., as the type and only species of the genus Salmonella. Int J Syst Bacteriol. 1987;37: Leyman B, Boyen F, Van Parys A, Verbrugghe E, Haesebrouck F, Pasmans F. Salmonella Typhimurium LPS mutations for use in vaccines allowing differentiation of infected and vaccinated pigs. Vaccine. 2011;29(20): Leyman B, Boyen F, Van Parys A, Verbrugghe E, Haesebrouck F, Pasmans F. Tackling the issue of environmental survival of live Salmonella Typhimurium vaccines: deletion of the lon gene. Res Vet Sci. 2012;93(3):

66 Libby SJ, Goebel W, Ludwig A, Buchmeier N, Bowe F, Fang FC, et al. A cytolysin encoded by Salmonella is required for survival within macrophages. Proc Natl Acad Sci U S A. 1994;91(2): Lindstedt BA, Vardund T, Aas L, Kapperud G. Multiple-locus variable-number tandemrepeats analysis of Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium using PCR multiplexing and multicolor capillary electrophoresis. J Microbiol Methods. 2004;59(2): Lostroh CP, Lee CA. The Salmonella pathogenicity island-1 type III secretion system. Microbes Infect. 2001;3(14-15): Man SM, Hopkins LJ, Nugent E, Cox S, Glück IM, Tourlomousis P, et al. Inflammasome activation causes dual recruitment of NLRC4 and NLRP3 to the same macromolecular complex. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014;111(20): Marcus SL, Brumell JH, Pfeifer CG, Finlay BB. Salmonella pathogenicity islands: big virulence in small packages. Microbes Infect. 2000;2(2): Marlovits TC, Kubori T, Sukhan A, Thomas DR, Galán JE, Unger VM. Structural insights into the assembly of the type III secretion needle complex. Science. 2004;306(5698): Mastroeni P, Clare S, Khan S, Harrison JA, Hormaeche CE, Okamura H, et al. Interleukin 18 contributes to host resistance and gamma interferon production in mice infected with virulent Salmonella Typhimurium. Infect Immun. 1999;67(2): Matulova M, Rajova J, Vlasatikova L, Volf J, Stepanova H, Havlickova H, et al. Characterization of chicken spleen transcriptome after infection with Salmonella enterica serovar Enteritidis. PLoS One. 2012;7(10):e Matulova M, Varmuzova K, Sisak F, Havlickova H, Babak V, Stejskal K, et al. Chicken innate immune response to oral infection with Salmonella enterica serovar Enteritidis. Vet Res. 2013;44:37. Mergenhagen SE, Snyderman R, Phillips JK. Activation of complement by endotoxin. J Infect Dis. 1973;128:Suppl: Methner U, Barrow PA, Berndt A, Rychlik I. Salmonella Enteritidis with double deletion in phop flic- a potential live Salmonella vaccine candidate with novel characteristics for use in chickens. Vaccine. 2011;29(17): Methner U, Barrow PA, Berndt A, Steinbach G. Combination of vaccination and competitive exclusion to prevent Salmonella colonization in chickens: experimental studies. Int J Food Microbiol. 1999;49(1-2):

67 Methner U, Barrow PA, Gregorova D, Rychlik I. Intestinal colonisation-inhibition and virulence of Salmonella phop, rpos and ompc deletion mutants in chickens. Vet Microbiol. 2004;98(1): Milbradt EL, Zamae JR, Araújo Júnior JP, Mazza P, Padovani CR, Carvalho VR, et al. Control of Salmonella Enteritidis in turkeys using organic acids and competitive exclusion product. J Appl Microbiol. 2014;117(2): Monack DM, Bouley DM, Falkow S. Salmonella Typhimurium persists within macrophages in the mesenteric lymph nodes of chronically infected Nramp1+/+ mice and can be reactivated by IFNgamma neutralization. J Exp Med. 2004;199(2): Morgan E, Campbell JD, Rowe SC, Bispham J, Stevens MP, Bowen AJ, et al. Identification of host-specific colonization factors of Salmonella enterica serovar Typhimurium. Mol Microbiol. 2004;54(4): Nedialkova LP, Denzler R, Koeppel MB, Diehl M, Ring D, Wille T, et al. Inflammation fuels colicin Ib-dependent competition of Salmonella serovar Typhimurium and E. coli in enterobacterial blooms. PLoS Pathog. 2014;10(1):e Ohlson MB, Huang Z, Alto NM, Blanc MP, Dixon JE, Chai J, et al. Structure and function of Salmonella SifA indicate that its interactions with SKIP, SseJ, and RhoA family GTPases induce endosomal tubulation. Cell Host Microbe. 2008;4(5): Polansky O, Sekelova Z, Faldynova M, Sebkova A, Sisak F, Rychlik I. Important Metabolic Pathways and Biological Processes Expressed by Chicken Cecal Microbiota. Appl Environ Microbiol. 2016;82(5): Qiu X, Zhang M, Yang X, Hong N, Yu C. Faecalibacterium prausnitzii upregulates regulatory T cells and anti-inflammatory cytokines in treating TNBS-induced colitis. J Crohns Colitis. 2013;7(11):e Raetz CR, Whitfield C. Lipopolysaccharide endotoxins. Annu Rev Biochem. 2002;71: Raffatellu M, George MD, Akiyama Y, Hornsby MJ, Nuccio SP, Paixao TA, et al. Lipocalin-2 resistance confers an advantage to Salmonella enterica serotype Typhimurium for growth and survival in the inflamed intestine. Cell Host Microbe. 2009;5(5): Rantala M, Nurmi E. Prevention of the growth of Salmonella Infantis in chicks by the flora of the alimentary tract of chickens. Br Poult Sci. 1973;14(6): Reeves MW, Evins GM, Heiba AA, Plikaytis BD, Farmer JJ. Clonal nature of Salmonella Typhi and its genetic relatedness to other Salmonellae as shown by multilocus enzyme electrophoresis, and proposal of Salmonella bongori comb. nov. J Clin Microbiol. 1989;27(2):

68 Reeves PR, Cunneen MM, Liu B, Wang L. Genetics and evolution of the Salmonella galactose-initiated set of o antigens. PLoS One. 2013;8(7):e Rosenberger CM, Pollard AJ, Finlay BB. Gene array technology to determine host responses to Salmonella. Microbes Infect. 2001;3(14-15): Rosselin M, Abed N, Namdari F, Virlogeux-Payant I, Velge P, Wiedermann A. The different strategies used by Salmonella to invade host cells. In Salmonella distribution, adaption, control measures and molecular technologies. Rijeka, In Tech, pp. ISBN Chapter 17, pp Rosenfeld Y, Shai Y. Lipopolysaccharide (Endotoxin)-host defense antibacterial peptides interactions: role in bacterial resistance and prevention of sepsis. Biochim Biophys Acta. 2006;1758(9): Ruby T, McLaughlin L, Gopinath S, Monack D. Salmonella's long-term relationship with its host. FEMS Microbiol Rev. 2012;36(3): Rychlik I, Elsheimer-Matulova M, Kyrova K. Gene expression in the chicken caecum in response to infections with non-typhoid Salmonella. Vet Res. 2014;45:119. Rychlik I, Karasova D, Sebkova A, Volf J, Sisak F, Havlickova H, et al. Virulence potential of five major pathogenicity islands (SPI-1 to SPI-5) of Salmonella enterica serovar Enteritidis for chickens. BMC Microbiol. 2009;9:268. Salcedo SP, Holden DW. SseG, a virulence protein that targets Salmonella to the Golgi network. EMBO J. 2003;22(19): Santos RL, Raffatellu M, Bevins CL, Adams LG, Tükel C, Tsolis RM, et al. Life in the inflamed intestine, Salmonella style. Trends Microbiol. 2009;17(11): Schlumberger MC, Hardt WD. Salmonella type III secretion effectors: pulling the host cell's strings. Curr Opin Microbiol. 2006;9(1): Setta A, Barrow PA, Kaiser P, Jones MA. Immune dynamics following infection of avian macrophages and epithelial cells with typhoidal and non-typhoidal Salmonella enterica serovars; bacterial invasion and persistence, nitric oxide and oxygen production, differential host gene expression, NF-κB signalling and cell cytotoxicity. Vet Immunol Immunopathol. 2012a;146(3-4): Setta AM, Barrow PA, Kaiser P, Jones MA. Early immune dynamics following infection with Salmonella enterica serovars Enteritidis, Infantis, Pullorum and Gallinarum: cytokine and chemokine gene expression profile and cellular changes of chicken cecal tonsils. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 2012b;35(5):

69 Smith NH, Selander RK. Molecular genetic basis for complex flagellar antigen expression in a triphasic serovar of Salmonella. Proc Natl Acad Sci U S A. 1991;88(3): Sokol H, Pigneur B, Watterlot L, Lakhdari O, Bermúdez-Humarán LG, Gratadoux JJ, et al. Faecalibacterium prausnitzii is an anti-inflammatory commensal bacterium identified by gut microbiota analysis of Crohn disease patients. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008;105(43): Spector MP. The starvation-stress response (SSR) of Salmonella. Adv Microb Physiol. 1998;40: Stanley D, Hughes RJ, Moore RJ. Microbiota of the chicken gastrointestinal tract: influence on health, productivity and disease. Appl Microbiol Biotechnol. 2014;98(10): Svensson M, Johansson C, Wick MJ. Salmonella Typhimurium-induced cytokine production and surface molecule expression by murine macrophages. Microb Pathog. 2001;31(2): Swords WE, Cannon BM, Benjamin WH. Avirulence of LT2 strains of Salmonella Typhimurium results from a defective rpos gene. Infect Immun. 1997;65(6): Szmolka A, Wiener Z, Matulova ME, Varmuzova K, Rychlik I. Gene Expression Profiles of Chicken Embryo Fibroblasts in Response to Salmonella Enteritidis Infection. PLoS One. 2015;10(6):e Trebichavsky I, Dlabac V, Rehakova Z, Zahradnickova M, Splichal I. Cellular changes and cytokine expression in the ilea of gnotobiotic piglets resulting from peroral Salmonella Typhimurium challenge. Infect Immun. 1997;65(12): Turner AK, Lovell MA, Hulme SD, Zhang-Barber L, Barrow PA. Identification of Salmonella Typhimurium genes required for colonization of the chicken alimentary tract and for virulence in newly hatched chicks. Infect Immun. 1998;66(5): Uzzau S, Brown DJ, Wallis T, Rubino S, Leori G, Bernard S, et al. Host adapted serotypes of Salmonella enterica. Epidemiol Infect. 2000;125(2): van Asten AJ, van Dijk JE. Distribution of "classic" virulence factors among Salmonella spp. FEMS Immunol Med Microbiol. 2005;44(3): Van Immerseel F, De Buck J, De Smet I, Mast J, Haesebrouck F, Ducatelle R. Dynamics of immune cell infiltration in the caecal lamina propria of chickens after neonatal infection with a Salmonella Enteritidis strain. Dev Comp Immunol. 2002;26(4):

70 Videnska P, Sedlar K, Lukac M, Faldynova M, Gerzova L, Cejkova D, et al. Succession and replacement of bacterial populations in the caecum of egg laying hens over their whole life. PLoS One. 2014;9(12):e Wetter M, Goulding D, Pickard D, Kowarik M, Waechter CJ, Dougan G, et al. Molecular characterization of the viab locus encoding the biosynthetic machinery for Vi capsule formation in Salmonella Typhi. PLoS One. 2012;7(9):e Wigley P, Hulme SD, Powers C, Beal RK, Berchieri A, Smith A, et al. Infection of the reproductive tract and eggs with Salmonella enterica serovar Pullorum in the chicken is associated with suppression of cellular immunity at sexual maturity. Infect Immun. 2005;73(5): Wilmes-Riesenberg MR, Foster JW, Curtiss R. An altered rpos allele contributes to the avirulence of Salmonella Typhimurium LT2. Infect Immun. 1997;65(1): Wilson RP, Raffatellu M, Chessa D, Winter SE, Tükel C, Bäumler AJ. The Vi-capsule prevents Toll-like receptor 4 recognition of Salmonella. Cell Microbiol. 2008;10(4): Wilson RP, Winter SE, Spees AM, Winter MG, Nishimori JH, Sanchez JF, et al. The Vi capsular polysaccharide prevents complement receptor 3-mediated clearance of Salmonella enterica serotype Typhi. Infect Immun. 2011;79(2): Winter SE, Thiennimitr P, Winter MG, Butler BP, Huseby DL, Crawford RW, et al. Gut inflammation provides a respiratory electron acceptor for Salmonella. Nature. 2010;467(7314): Withanage GS, Kaiser P, Wigley P, Powers C, Mastroeni P, Brooks H, et al. Rapid expression of chemokines and proinflammatory cytokines in newly hatched chickens infected with Salmonella enterica serovar Typhimurium. Infect Immun. 2004;72(4): Zhang S, Adams LG, Nunes J, Khare S, Tsolis RM, Bäumler AJ. Secreted effector proteins of Salmonella enterica serotype Typhimurium elicit host-specific chemokine profiles in animal models of typhoid fever and enterocolitis. Infect Immun. 2003;71(8): EPIDAT, SZÚ. Vybrané infekční nemoci v ČR v letech relativně. Státní zdravotní ústav [online]. Praha: Státní zdravotní ústav [vid ]. Dostupné z: relativne R Development Core Team. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria, ISBN , URL 70

71 PŘÍLOHY Příloha 1 Chicken innate immune response to oral infection with Salmonella enterica serovar Enteritidis. Matulova M., Varmuzova K., Sisak F., Havlickova H., Babak V., Stejskal K., Zdrahal Z., Rychlik I. (Veterinary Research, 2013) Příloha 2 The early innate response of chickens to Salmonella enterica is dependent on the presence of O-antigen but not on serovar classification. Varmuzova K., Elsheimer Matulova M., Sebkova A., Sekelova Z., Havlickova H., Sisak F., Babak V., Rychlik I. (PLoS ONE, 2014) Příloha 3 phop, SPI1, SPI2 and aroa mutants of Salmonella Enteritidis induce a different immune response in chickens. Elsheimer-Matulova M., Varmuzova K., Kyrova K., Havlickova H., Sisak F., Rahman M., Rychlik I. (Veterinary Research, 2015) Příloha 4 Composition of gut microbiota influences resistance of newly hatched chickens to Salmonella Enteritidis infection. Varmuzova K., Kubasova T., Davidova Gerzova L., Sisak F., Havlickova H., Sebkova A., Faldynova M., Rychlik I. (Frontiers in Microbiology, 2016) 71

72 Příloha 5 A) Seznam a sekvence 43 primerů použitých při určení míry imunitní odpovědi po infeci kuřat různými sérovary Salmonella enterica a jejich rfal mutantů B) Seznam a sekvence 24 primerů, jejichž exprese byla měřena po kolonizaci kuřat mikroflórou a infekci Salmonella Enteritidis

73 Příloha 1 Chicken innate immune response to oral infection with Salmonella enterica serovar Enteritidis Matulova M., Varmuzova K., Sisak F., Havlickova H., Babak V., Stejskal K., Zdrahal Z., Rychlik I. (Veterinary Research, 2013)

74 Matulova et al. Veterinary Research 2013, 44:37 VETERINARY RESEARCH RESEARCH Open Access Chicken innate immune response to oral infection with Salmonella enterica serovar Enteritidis Marta Matulova 1, Karolina Varmuzova 1, Frantisek Sisak 1, Hana Havlickova 1, Vladimir Babak 1, Karel Stejskal 2, Zbynek Zdrahal 2 and Ivan Rychlik 1* Abstract The characterization of the immune response of chickens to Salmonella infection is usually limited to the quantification of expression of genes coding for cytokines, chemokines or antimicrobial peptides. However, processes occurring in the cecum of infected chickens are likely to be much more diverse. In this study we have therefore characterized the transcriptome and proteome in the chicken cecum after infection with Salmonella Enteritidis. Using a combination of 454 pyrosequencing, protein mass spectrometry and quantitative real-time PCR, we identified 48 down- and 56 up-regulated chicken genes after Salmonella Enteritidis infection. The most inducible gene was that coding for MMP7, exhibiting a 5952 fold induction 9 days post-infection. An induction of greater than 100 fold was observed for IgG, IRG1, SAA, ExFABP, IL-22, TRAP6, MRP126, IFNγ, inos, ES1, IL-1β, LYG2, IFIT5, IL-17, AVD, AH221 and SERPIN B. Since prostaglandin D2 synthase was upregulated and degrading hydroxyprostaglandin dehydrogenase was downregulated after the infection, prostaglandin must accumulate in the cecum of chickens infected with Salmonella Enteritidis. Finally, above mentioned signaling was dependent on the presence of a SPI1-encoded type III secretion system in Salmonella Enteritidis. The inflammation lasted for 2 weeks after which time the expression of the inflammatory genes returned back to basal levels and, instead, the expression of IgA and IgG increased. This points to an important role for immunoglobulins in the restoration of homeostasis in the cecum after infection. Introduction Salmonella enterica is one of the most frequent causative agents of human gastrointestinal disorders with the major sources of S. enterica isolates for the human population originating from farm animal production, pigs and poultry in particular. Poultry flocks are reservoirs of S. enterica serovar Enteritidis (Salmonella Enteritidis), the serovar whose incidence in the human population has increased considerably since the beginning of the 1990s [1,2]. As poultry is a major source of Salmonella Enteritidis for humans, it is believed that the measures applied in chicken egg production, which will lead to a decrease of Salmonella Enteritidis prevalence, will also affect the incidence of salmonellosis in the human population. This is why a program aimed at decreasing the prevalence of Salmonella in poultry flocks is currently implemented in the EU [1,2]. * Correspondence: rychlik@vri.cz 1 Veterinary Research Institute, Hudcova 70, Brno , Czech Republic Full list of author information is available at the end of the article Despite the absence of gross clinical signs, chickens respond to oral infection with non-typhoid serovars of S. enterica by moderate inflammation in the cecum associated with heterophil and monocyte/macrophage infiltration into the cecal mucosa. In agreement with this, the expression of proinflammatory cytokines such as IL- 1β, IL-6, IL-17, IL-22 and IFNγ together with inos is increased in the cecum of infected chickens [3-5]. The production of the above cytokines is either induced in epithelial cells and resident phagocytes, or is affected by infiltrating phagocytes or lymphocytes [6]. However, this is clearly a simplified and an incomplete view of the chicken s response to Salmonella infection as, for example, in mice genes not involved in cytokine signaling, e.g., Lcn2, are induced in the small intestine upon infection with Salmonella enterica serovar Typhimurium [7]. Moreover, by using pyrosequencing of RNA transcripts in the spleen of chickens intravenously infected with Salmonella Enteritidis, we have identified many new genes which have not been associated with Salmonella 2013 Matulova et al.; licensee BioMed Central Ltd. This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License ( which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

75 Matulova et al. Veterinary Research 2013, 44:37 Page 2 of 11 infection in chickens so far [6]. When we tested whether these genes were also induced in the cecum, 14 of them were indeed upregulated in the cecum of orally infected chickens, one of them being a functional homologue of murine Lcn2 [6]. This prompted us to perform a genome-wide characterization of the chicken response in the cecum to oral infection with Salmonella Enteritidis. Unlike our previous paper on expression in the spleen [6], we characterized both the transcriptome and proteome by pyrosequencing and protein mass spectrometry, respectively, and the initial results were verified by real time RT-PCR. The combination of both experimental procedures allowed us to characterize the events occurring in the chicken cecum at quite a detailed level and define the individual steps in the chicken s innate immune response to oral infection with Salmonella Enteritidis. Material and methods Ethics statement The handling of animals in the study was performed in accordance with current Czech legislation (Animal protection and welfare Act No. 246/1992 Coll. of the Government oftheczechrepublic).thespecificexperimentswere approved by the Ethics Committee of the Veterinary Research Institute (permit number 48/2010) followed by the Committee for Animal Welfare of the Ministry of Agriculture of the Czech Republic (permit number MZe 1226). Experimental animals, sample collection and pyrosequencing The ceca of 6 ISA Brown chickens were used for simultaneous RNA and protein isolation. Three of these chickens were infected orally with 10 7 CFU of Salmonella Enteritidis on the day of hatching and sacrificed 4 days later while the other 3 represented non-inoculated 5-day-old control chickens. Approximately 30 mg of cecum was collected from each chicken during necropsy and immediately placed into RNALater (Qiagen). The samples were then mixed with TRI Reagent and processed according to the manufacturer s recommendations (MRC). In brief, after centrifugation for 15 min at g, the upper phase containing RNA was purified with an RNeasy Mini Kit (Qiagen) followed by an mrna Isolation Kit (Roche) to enrich the RNA preparation for mrna species. Proteins captured in the lower phase were precipitated from the TRI Reagent with 3 volumes of acetone, washed with guanidine hydrochloride (0.3 M)/ethanol (95%)/glycerol (2.5%) wash solution and dried in a SpeedVac. Because of the cost of pyrosequencing (see below), only pooled RNA/cDNA samples of 3 infected and 3 noninfected chickens were processed, respectively. For protein mass spectrometry, the samples from the 3 infected and 3 non-infected chickens were randomly grouped into 3 pairs and analyzed. To verify the results from mrna pyrosequencing and protein mass spectrometry, cdna samples kept at 20 C from our previous experiments were used in real-time PCR quantification [6]. These samples originated from the cecum of orally infected 5-day-old chickens and included samples from 2 independent experiments, each performed with 4 infected and 4 non-infected chickens. Time-dependent gene expression in chicken cecum after Salmonella Enteritidis infection A time-dependent characterization of gene expression in the cecum was performed with 64 chickens which were orally infected with 10 7 CFU of Salmonella Enteritidis on the day of hatching and sacrificed on days 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 18, 22, 25 and 29 of life, 4 chickens on each day. On day 1 and at all additional sampling times, 4 non-infected control chickens were sacrificed as well. From each of the chickens, mrna from cecum was purified, reverse transcribed into cdna and subjected to real time PCR as described below. To verify the infection, Salmonella Enteritidis counts in the liver, spleen and cecum were determined by serial dilutions of tissue homogenates in peptone water and plating on XLD agar, as described previously [8]. Influence of Salmonella Enteritidis SPI1 on the inflammation in chicken cecum In the last experiment, we infected 8 newly hatched chickens with the wild-type Salmonella Enteritidis or an isogenic SPI1 mutant of Salmonella Enteritidis [9], and sacrificed them 4 days later. Four non-infected control chickens sacrificed on day 5 of life were included as well. During necropsy, cecal wall samples were placed in RNALater followed by RNA purification using an RNeasy Mini Kit (Qiagen). 454 pyrosequencing cdna libraries from the cecal samples were prepared with the GS Rapid Library Preparation Kit (Roche) and approx. 2 molecules of cdna per bead were used in emulsion PCR. All steps of the cdna library preparation were performed with the GS Junior Titanium series kits according to the manufacturer s instructions (Roche). The pyrosequencing was performed with the GS Junior 454 sequencer (Roche) and each sample was sequenced in a separate sequencing run. Data analysis after pyrosequencing was performed exactly as described previously except for the fact that the total chicken transcriptome was generated using the sequences from the previous pyrosequencing of the spleen samples enriched for the two new sequencing runs from

76 Matulova et al. Veterinary Research 2013, 44:37 Page 3 of 11 the cecum [6]. Transcripts predicted as differentially expressed after Salmonella Enteritidis infection included those for which we identified at least a 12-fold up- or down-regulation regardless of the number of reads available, or a 6-fold up- or down-regulation with 25 independent reads available, or a 3-fold up- or down-regulation with at least 50 independent reads. Protein identification and quantification Protein pellets from 3 infected and 3 non-infected chickens were processed by the filter-aided sample preparation (FASP) method [10]. Pellets were diluted in 100 μl of 4% SDS, 0.1M DTT, 0.1M Tris HCl ph 7.6, incubated for 5 min at 95 C, cooled to room temperature and centrifuged at g for 15 min at 20 C. The supernatant was collected and mixed with 8 M UA buffer (8 M urea in 100 mm Tris HCl, ph 8.5) at a ratio of 1:13, loaded onto the Vivacon 500 device with MWCO 10 kda (Sartorius Stedim Biotech) and centrifuged at g for 30 min at 20 C. The retained proteins were washed with 400 μl UA buffer. The final protein concentrates kept in the Vivacon 500 device were mixed with 100 μl of UA buffer containing 50 mm iodoacetamide and incubated in the dark for 30 min. After an additional centrifugation, the samples were washed three times with 400 μl UA buffer and three times with 200 μl of50mmnahco 3.Trypsin (sequencing grade, Promega) was added onto the filter and the mixture was incubated for 2 h at 40 C. The tryptic peptides were finally eluted by centrifugation followed by two additional elutions with 50 μl of50mmnahco 3. The concentration of the eluted tryptic peptides was determined by UV-spectrometry using an extinction coefficient of 1.1 for 0.1% (g/l) solution at 280 nm [11]. Tryptic peptides prepared by FASP were labeled as described elsewhere [12]. The concentration of each sample was adjusted with 50 mm NaHCO 3 to a final concentration of 1.5 μg/μl and10μl of peptide solution was mixed with 90 μl 0.1M sodium acetate buffer ph 6.0 followed by the addition of 20 μl 4% formaldehyde-d 0 (samples from the non-infected chickens) or formaldehyde-d 2 (samples from the infected chickens) and 20 μl 1MNaBCNH 3. After 10 min, the reactions were stopped by adding 20 μl 4% NH 3 and the samples were randomly grouped into three pairs, each consisting of a sample from the infected and non-infected chicken. LC-MS/MS analyses of dimethylated peptide mixture were done using RSLCnano system connected to Orbitrap Elite hybrid spectrometer (Thermo Fisher Scientific). Prior to LC separation, tryptic digests were concentrated and desalted using a trapping column (100 μm 30 mm) filled with 3.5-μm X-BridgeBEH 130 C18 sorbent (Waters). After trapping the column was washed with 0.1% FA, the peptides were eluted (flow 300 nl/min) onto an Acclaim Pepmap100 C18 column (2 μm particles, 75 μm 250 mm; Thermo Fisher Scientific) using the following gradient program (mobile phase A: 0.1% FA in water; mobile phase B: ACN:methanol:2,2,2-trifluoroethanol (6:3:1; v/v/v) containing 0.1% FA). The gradient elution started at 2% of mobile phase B and increased from 2% to 45% during the first 90 min, then increased linearly to 95% of mobile phase B in the next 5 min and remained at this state for the next 15 min. The analytical column outlet was directly connected to the Nanospray Flex Ion Source (Thermo Fisher Scientific). MS data were acquired in a data-dependent strategy selecting the top 20 precursors based on the precursor abundance in the survey scan ( m/z). The resolution of the survey scan was (at 400 m/z) with a target value of ions, one microscan and maximum injection time of 200 ms. Low resolution CID MS/MS spectra were acquired with a target value of ions in rapid CID scan mode with the m/z range adjusted according to the actual precursor mass and charge. MS/ MS acquisition in the linear ion trap was carried out in parallel with the survey scan in the Orbitrap analyzer by using the preview mode. Dynamic exclusion was enabled for 45 s after one MS/MS spectra acquisition and early expiration was disabled. The isolation window for MS/MS fragmentation was set to 2 m/z. The analysis of the mass spectrometric RAW data files was carried out using the Proteome Discoverer software (version 1.3) with an in-house Mascot and Sequest search engine utilization. Mascot and Sequest MS/MS ion searches were performed against the NCBI protein database (taxonomy Gallus gallus). Mass tolerance for peptides and MS/MS fragments were 5 ppm and 0.5 Da, respectively. Carbamidomethylation (C), dimethylation (N-term and K) as fixed modification, oxidation (M) as optional modification and none enzyme miss cleavage were set for all searches. Percolator was used for postprocessing of Mascot search results. Peptides with a false discovery rate (FDR; q-value) < 1% and at least 3 significant peptides were considered. Real-time PCR verification of the pyrosequencing data Real-time PCR was used for the verification of both pyrosequencing and proteomic data. Primers for the quantification of expression real-time PCR were designed using Primer3 software [13] (for primer sequences see Additional file 1). First we used the same cdnas as in the pyrosequencing reactions followed by an additional 2 4 samples from our previous study [6]. After such a screening we reduced the number of tested genes to those in which the real-time PCR confirmed the results from the pyrosequencing or proteomics and exhibited fold up- or downregulation greater than 4. Using the reduced set of real-time PCRs, we finally determined the gene expression

77 Matulova et al. Veterinary Research 2013, 44:37 Page 4 of 11 in i) the time-dependent study and ii) after the infection with the SPI1 mutant. Real-time PCR was performed in 3 μl volumes in 384- well microplates using QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix (Qiagen) and a Nanodrop II Stage pipetting station (Innovadyne) for PCR mix dispensing. Real-time PCR was performed using a LightCycler II (Roche) with an initial denaturation at 95 C for 15 min followed by 40 cycles of 95 C for 20 s, 60 C for 30 s and 72 C for 30 s. Each sample was subjected to real-time PCR in duplicate and the mean Ct value of the duplicates was used for subsequent analysis. The Ct values of the genes of interest were normalized (ΔCt) to an average Ct value of three house-keeping genes (GAPDH, TBP and UB) and the relative expression of each gene of interest was calculated as 2 -ΔCt. These expression levels were used for data analysis and are presented in the tables and figures as average ± SD. As an alternative, the fold upregulation (i.e. 2 -ΔΔCt ) calculated as the ratio of averages of infected to non-infected samples is presented. However, also in this case, the significance of such upregulations was calculated by comparing the expressions, i.e. the 2 -ΔCt values of the individual samples. Northern blot analysis The expression of selected genes (MMP7, ExFABP, AQP8 and ADH1) was confirmed also by northern blotting. The same mrnas of 6 ISA Brown chickens which was used for pyrosequencing was electrophoretically separated in formaldehyde denaturing agarose gel and vacuum blotted onto a nylon membrane as described previously [14]. Probes for the northern hybridization were prepared by PCR followed by purification using a PCR Purification kit from Qiagen according to the manufacturer s instructions. Probe labeling, hybridization, posthybridization washes and signal development were performed with an AlkPhos labelling kit according to the manufacturer s instructions (GE Healthcare). A GAPDH specific probe was used as a control of loading the same amount of RNA. Statistics Heat maps were generated using software available elsewhere [15]. The statistical significance of the gene expression 4 days post infection were determined by a t-test. PCA have been calculated in logarithmically transformed data ignoring the absolute transcription levels and following the transcriptional profiles only. All the statistical calculations have been done using Statistica 9.1 software (StatSoft, Inc., Tulsa, OK, USA) and differences with p < 0.05 were considered as significant. Results Pyrosequencing Pyrosequencing resulted in reads ( nt of RNA sequence) when pooled cdna from the cecum of the non-infected chicken was sequenced and reads ( nt of RNA sequence) when pooled cdna from the cecum of the chicken after Salmonella Enteritidis infection was sequenced. Combining these 2 samples together with the data sets from our previous study on the expression in chicken spleen [6], the de novo assembly resulted in the identification of different chicken transcripts. After applying all the quality selective criteria, reads from the cecum of the non-infected chicken and reads from the cecum of the infected chicken were finally included in the quantification of gene expression and we predicted that 54 genes might be downregulated and 78 genes upregulated in the cecum after Salmonella Enteritidis infection (Additional file 1). Mass spectrometry Using LC-MS/MS analysis, 4062 protein groups containing at least 1 peptide with a significant score were identified in an experimental set of 3 infected and 3 non-infected chicken samples. There were 806 protein groups which were quantified as having at least 3 peptides with a significant score and these were selected for further evaluation. At least a twofold down- or up-regulation was observed for 21 and 57 proteins, respectively (Additional file 1). Real-time PCR In the next experiment we verified the expression of 195 genes predicted by either 454 pyrosequencing or mass spectrometry as responsive to Salmonella Enteritidis infection by real-time PCR. The predicted expression profiles were confirmed for 104 of them, with 48 genes confirmed as significantly downregulated and 56 as significantly upregulated (Additional file 1). Northern blot analysis Since all the above mentioned protocols can be considered as indirect, northern blot analysis was performed for 2 genes (AQP8, ADH1B) that were downregulated after infection and 2 genes (ExFABP, MMP7) that were upregulated after infection using samples originating from those used for pyrosequencing and mass spectrometry. The northern blot analysis confirmed the results of real-time PCR in all 4 cases (Figure 1). Time-dependent expression in the cecum of Salmonella Enteritidis infected chickens In previous experiments, gene expression was determined only at a single time point when the expression of some of the genes could have been already in decline whilst the expression of the others could still have been on the increase. In the next experiment we therefore characterized the chicken s response to Salmonella Enteritidis infection in a time-dependent study. Salmonella Enteritidis counts

78 Matulova et al. Veterinary Research 2013, 44:37 Page 5 of 11 in the cecum reached a maximum as early as 24 h after oral infection and then gradually decreased. The liver and spleen became highly colonized 48 h after oral infection. Salmonella Enteritidis counts in the liver and spleen then remained relatively constant until day 12, from which point on, a gradual decrease in Salmonella Enteritidis counts was observed (Figure 2). For monitoring time-dependent gene expression in the ceca we selected only 43 different genes. These included 32 genes identified in this study which were up- or down-regulated more than 4-fold. In addition, we also included 7 genes (avidin, trappin-6, chemokine AH221, IRG1, serum amyloid A, IgG, IgA) which we identified previously as responding to Salmonella Enteritidis infection [6] and 4 genes (IL-1β, IL-17, IL-22, IFNγ) which are commonly used as markers of inflammation [3-5]. There were 3 groups among the genes that showed induction after Salmonella Enteritidis infection which differed in the times of their maximal expression. The first group of genes was characterized by peak expression 2, 3 or 4 days after infection. This group included genes coding for lysozyme G2, IL-8, IL-17, serum amyloid A, trappin-6, ExFABP, ES1, IL-1β and prostaglandin synthase (Figure 2). The second group of genes exhibited a prolonged, high level expression and these included genes coding for STAT1, STAT3, epithelial stromal factor, arginine-succinate lyase, hematopoietic lineage protein, CD18, C3 complement protein and IFNγ. The last group of genes upregulated after Salmonella Enteritidis infection was formed by those coding for the constant part of the IgG and IgA heavy chains. Their expression increased above background levels for the first time on day 7 (IgG) and day 15 (IgA), respectively, and reached their maximal expression on day 22. Except for the immunoglobulin encoding genes, the expression of all the upregulated genes decreased between days 12 and 15 nearly to the levels observed in the non-infected chickens (Figure 3). The genes which were downregulated in response to Salmonella Enteritidis infection exhibited such a profile from 48 h after the infection and their suppression lasted until day 15, from which time their expression began to recover (Figure 3). Contribution of individual genes to total expression in chicken cecum Since the heat map in Figure 3 was normalized for each individual gene according to its minimal and maximal expression, it did not provide a realistic view of how individual genes contribute to the total gene expression in the cecum. Gene expression in the cecum of the non-infected chickens was dominated by aquaporin 8, alcoholdehydrogenase, fatty acid binding protein 1, retinal dehydrogenase, uncharacterized oxidoreductase and calbindin 1 (Table 1), i.e., the genes which were suppressed after Salmonella Enteritidis infection. Two days after infection, the above mentioned genes therefore formed a clear expression minority and they reached their minimal expression on day 5 when the transcription in the cecum was Figure 1 Northern blot analysis for 4 selected genes responding to Salmonella Enteritidis infection in the cecum. MMP7 and ExFABP were identified by real-time PCR as upregulated after the infection and AQP8 and ADH1 were identified as downregulated after the infection. GAPDH was used as a loading control. NI1, NI2 and NI3, mrna purified from the cecum of non-infected chickens. INF1, INF2 and INF3, mrna purified from the cecum of infected chickens. Figure 2 Salmonella Enteritidis colonization of the cecum, liver and spleen after oral infection at the day of hatching. The cecum (triangles) was colonized as early as at the first sampling time, 24 h after the infection. Colonization of the liver (circles) and spleen (squares) required an additional 24 h and these organs became highly colonized from 48 h after the infection. The liver and spleen remained colonized at constant counts until day 12 of life and thereafter a gradual decrease in Salmonella Enteritidis counts was observed.

79 Matulova et al. Veterinary Research 2013, 44:37 Page 6 of 11 non-infected infected Day1 Day2 Day3 Day4 Day5 Day6 Day7 Day8 Day9 Day10 Day11 Day12 Day15 Day18 Day22 Day25 Day29 Day1 Day2 Day3 Day4 Day5 Day6 Day7 Day8 Day9 Day10 Day11 Day12 Day15 Day18 Day22 Day25 Day29 LYG2 IFIT5 IL-17 IL-8 ES1 mucin-2 MRP126 TRAP6 IL-22 serpinb HPX SAA IL1β PTGDS ExFABP MMP7 AVD MEG1 IRG1 AH221 RSFR TAP1 inos IgG IgA STAT1 EPSTI1 ASL2 TGM4 C3 IFNγ STAT3 HCLS1 ITGLB2 (CD18) FABP1 RALDH1 SULT1C3 HPGD AQP8 CALB1 ADH1B unchar.oxidoreductase ALDOB Figure 3 Heat map of gene expression in the chicken cecum, with or without Salmonella Enteritidis infection. The heat map for each gene was calculated based on its minimal and maximal recorded expressions. The color coding (light green, the lowest expression, light red, the highest expression) thus characterizes each gene profile and the same shade of red or green color for two different genes does not necessarily correspond to the same fold increase. dominated by ES1 protein, avidin, AH221 chemokine, ExFABP and serum amyloid A (Table 1). In addition, high expression of IgG and IgA was recorded from day 15 reaching its maximum on day 22 and 25, respectively (Table 1). Identification of genes with the highest up- or downregulation The absolute expression of each of the 43 tested genes, however, need not correlate with their fold induction after Salmonella Enteritidis infection. The most downregulated gene was that coding for aquaporin 8 with a downregulation as low as 97 fold observed 5 days postinfection. The suppression of the remaining genes, though lower than that of aquaporin 8, were quite similar and ranged from 18 (SULT1C3) to 75 (ADH1B) fold (Table 1). The gene with the highest induction was that encoding matrix metalloproteinase MMP7 whose expression increased more than 3 logs with the highest 5952 fold upregulation observed 9 days after the infection. Upregulation of an additional 17 genes exceeded a factor of 100 and upregulation of the remaining 16 genes was below a factor of 100 (Table 1). PCA of individual chickens based on their gene expression in the cecum The time-dependent experiment was performed with 132 chickens, samples of which were subjected to 43 gene characteristics which resulted in a dataset with 5940 values. This dataset was next used for the clustering of each individual chicken according to its expression profile. PCA clustering of the expression profiles observed in individual chickens confirmed and further extended previous analyses. The gene expression gradually changed in time also in the cecum of the non-infected chickens (Figure 4). Salmonella Enteritidis infection on the day of hatching resulted in a minor response in the proceeding 24 h and the 2-day-old infected chickens still clustered close to the non-infected age-matched controls. However, from 2 days post infection, the expression in the cecum clustered the infected chickens separately from the non-infected controls. PCA also indicated a gradual re-joining of the infected chickens with the non-infected ones from day 15

80 Matulova et al. Veterinary Research 2013, 44:37 Page 7 of 11 Table 1 List of genes up- or down-regulated in the chicken cecum after infection with Salmonella Enteritidis arranged according to their maximal fold up- or down-regulation after infection with wild type Salmonella Enteritidis (column max fold SE wt) Gene Max NI # Min NI Max SE Min SE Max fold WT fold SPI1 fold SE wt $ 4 dpi & 4 dpi & MMP (12) (29) 8.98 (5) (1) 5952 (10) IgG 5.02 (25) (2) 36.7 (25) (1) 442 (10) IRG (2) (11) 0.69 (5) (1) 425 (7) SAA 0.25 (2) (9) 15.9 (5) (1) 382 (5) ExFABP 1.06 (18) (9) 75.3 (5) (1) 366 (5) IL (12) (10) 0.39 (5) (1) 355 (10) TRAP (2) (15) 5.76 (5) (25) 194 (5) MRP (2) (29) 1.96 (5) (25) 194 (11) IFNγ (18) (11) (5) (1) 183 (11) IL1β (18) (1) 0.74 (5) (1) 134 (3) inos (1) (9) 1.99 (7) (1) 151 (7) ES (2) (29) 39.6 (4) (1) 139 (11) LYG (7) (22) 5.82 (3) (25) 130 (3) IFIT (12) (1) 1.28 (3) (1) 124 (3) IL (2) (29) (3) (22) 120 (11) AVD 2.07 (2) 0.20 (29) (5) (1) 116 (9) AH (18) 0.12 (1) 23.4 (5) (1) 108 (5) serpin B (2) (29) 0.54 (5) (25) 101 (5) TGM (12) (6) 0.92 (5) (1) 68 (6) IgA 6.04 (18) (2) 23.4 (22) (3) 49 (3) EPSTI (12) (1) 0.74 (4) (1) 33 (3) IL (6) (29) 1.08 (4) (1) 31 (11) C (2) (10) 0.78 (11) (1) 29 (10) mucin (3) (9) 0.77 (4) (6) 20 (11) PTGDS 1.50 (9) 0.12 (1) 17.8 (5) (1) 19 (5) ITGLB2 (CD18) (22) (3) 0.46 (11) (18) 14 (11) HPX 0.19 (7) (12) 0.91 (5) (25) 13 (5) ASL (2) 0.15 (29) 2.26 (4) (1) 11 (10) HCLS (29) (5) 1.11 (10) (1) 10 (11) TAP (22) (3) 2.26 (7) (1) 10 (4) STAT (12) (9) 1.03 (3) (1) 9.2 (9) RSFR 0.96 (8) 0.40 (1) 7.19 (5) (1) 9.1 (5) MEG (22) (3) 1.80 (5) (1) 7.0 (5) STAT (18) 0.37 (3) 1.28 (7) (5) 2.2 (3) AQP (22) 14.9 (1) 17.6 (25) (5) 97 (5) ADH1B 9.46 (7) 3.42 (2) 4.66 (25) (5) 75 (5) FABP (22) 1.98 (11) 8.48 (22) (5) 47 (5) RALDH (22) 9.17 (2) 12.6 (1) (5) 39 (5)

81 Matulova et al. Veterinary Research 2013, 44:37 Page 8 of 11 Table 1 List of genes up- or down-regulated in the chicken cecum after infection with Salmonella Enteritidis arranged according to their maximal fold up- or down-regulation after infection with wild type Salmonella Enteritidis (column max fold SE wt) (Continued) unchar. oxidoreductase 5.84 (12) 0.80 (4) 4.25 (22) (5) 28 (5) CALB (1) 8.20 (2) 24.2 (1) (5) 19 (5) ALDOB 1.66 (22) 0.32 (2) 0.58 (22) (5) 19 (10) SULT1C (4) 7.20 (29) 16.0 (1) (5) 18 (5) HPGD 4.62 (7) 1.58 (1) 2.77 (2) (5) 10 (7) # Maximal or minimal expression levels observed in the non-infected or Salmonella Enteritidis infected chickens as determined in the time-dependent study; numbers in brackets indicate the day of life when the appropriate value was recorded. $ Maximal fold upregulation or downregulation and the day when recorded in the time-dependent study. The downregulated genes are at the bottom of the table starting with AQP8. & Fold up or downregulations 4 days post-infection of chickens with wild-type Salmonella Enteritidis and the SPI1 mutant. onwards and some of the infected chickens aged 22 days or more already merged with the non-infected controls (Figure 4). Influence of the SPI1-encoded type III secretion system of Salmonella Enteritidis on chicken gene expression in the cecum Salmonella invasion of non-professional phagocytes is mediated by a type III secretion system encoded by Salmonella Pathogenicity Island 1 (SPI1) [16]. In the final experiment we therefore addressed to what extent the response in the chicken cecum to Salmonella Enteritidis infection depends on an intact SPI1. To test this hypothesis, we infected chickens with wild type Salmonella Enteritidis and an isogenic mutant in which the entire SPI-1 region was deleted [9]. Whilst the infection with the wild-type Salmonella Enteritidis induced expression to a similar extent as in the time-dependent experiment, the SPI1 mutant essentially did not induce an immune response in the chicken cecum (Table 1). Only MMP7 was significantly induced in the cecum 4 days after the infection with the Salmonella Enteritidis SPI1 mutant. However, the fold induction (35 fold) after infection with the SPI1 mutant was 45 lower when compared with the MMP7 induction in the cecum of chickens infected with the wild-type Salmonella Enteritidis (1578 fold, see Table 1). This difference could not be caused by a mere absence of the SPI1 mutant from the chicken cecum, liver or spleen, since the Figure 4 PCA of the chickens clustered according to their gene expression in the cecum. Sixty-eight percent of variability explained by coordinate 1 is likely to be associated with the infection status. Coordinate 2 explaining an additional 8% of variability seems to be chicken age. Green and red color, clustering of the non-infected and infected chickens, respectively. Numbers indicate age of each particular chicken in days.

82 Matulova et al. Veterinary Research 2013, 44:37 Page 9 of 11 SPI1 mutant was detected in all of these tissues, though at lower counts than the wild-type Salmonella Enteritidis (Table 2). Discussion In this study we determined gene expression in the chicken cecum after Salmonella Enteritidis infection. Out of 9 genes downregulated after Salmonella Enteritidis infection expression of which we characterised in detail, 15- hydroxyprostaglandin dehydrogenase (HPGD) might be directly involved in host defense. 15-hydroxyprostaglandin dehydrogenase is an enzyme involved in the inactivation of prostaglandin D2. Interestingly, among the genes with increased expression, prostaglandin D2 synthase (PTGDS) has been identified. An increase in the expression of an enzyme required for the biosynthesis of prostaglandin D2 together with a decreased expression of the inactivating enzyme suggest that prostaglandin D2 accumulates in the cecum of infected chickens as one of the inflammatory signals. Among the genes upregulated after the infection, induction rates greater than 100 fold were observed for MMP7, IgG, IRG1, SAA, ExFABP, IL-22, TRAP6, MRP126, IFNγ, inos, ES1, IL-1β, LYG2, IFIT5, IL-17, AVD, AH221 and SERPIN B. On the other hand, genes which exhibited the highest expression levels, irrespective of their fold increase, included AVD, ExFABP, ES1, IgG, IgA, AH221, PTGDS, SAA, MMP7, RSFR, LYG2 and TRAP6. Comparison of these two sets of genes showed that highly inducible cytokine encoding genes were absent among the genes with the highest absolute level of expression. This points to one limitation of our study. Since we purified total mrna and/or protein from total cecal tissue, we could not detect changes in the gene expressions which may have occurred in the cells forming a minority in the gut tissue even if the change in expression levels within specific cells reached a factor of 100, as was the case of IL-17, IL-22 and IFNγ expressed by T-lymphocytes [17]. Although the majority of the genes identified in this study have not been associated with the chicken response to Salmonella Enteritidis infection, they have been described as inducible during different inflammatory diseases, cell differentiation or cancer. Based on the composition of genes upregulated after the infection it is also clear that the response was a coordinated action of epithelial cells (induction of MMP7, LYG2, IL-8), T-lymphocytes (IL-1β, IL-17, Table 2 Wild-type Salmonella Enteritidis and the SPI1 mutant colonization of liver, spleen and cecum 4 days after the infection Liver (CFU/g) Spleen (CFU/g) Cecum (CFU/g) Salmonella Enteritidis 4.13 ± ± ± 0.57 Salmonella Enteritidis ΔSPI ± ± ± 0.59 IL-22, IFNγ), macrophages and heterophils (IRG1, SAA, ExFABP, TRAP6, MRP126, inos, AVD, AH221, IFIT5) and B-lymphocytes (IgG, IgA). Except for MMP7, the gene expressions characterized in this study were not triggered after infection with the noninvasive SPI1 mutant of Salmonella Enteritidis. However, even in the case of MMP7, its induction 4 days postinfection with the SPI1 mutant (35 fold) was significantly lower than after infection with wild-type Salmonella Enteritidis (1578 fold). This means that the signaling was strictly dependent on Salmonella invasion into nonprofessional phagocytes encoded by SPI1 [16] and the intracellular presence of Salmonella Enteritidis. Two genes upregulated after infection exhibited quite a different pattern of expression from the inflammatory ones and these included the transcripts coding for the constant parts of IgG and IgA. As we proposed previously, the level of transcription of IgG and IgA increases in the chicken cecum with age even in the non-infected chickens [6] and infection of chickens with Salmonella Enteritidis increased the expression of IgG and IgA further. Maximal IgG and IgA expression after the infection was recorded when the expression of the remaining inflammatory genes began to decline. Interestingly, Wei et al. reported that the interaction of B-lymphocytes and CD8 T-lymphocytes was necessary for a decrease of CD4 T-lymphocyte activity at the site of epithelial inflammation and this interaction was dependent on TAP1 [18,19], another gene upregulated during the infection but declining when IgG and IgA increased in expression. TAP1 is involved in the presentation of self antigens in association with MHCI and increased expression of TAP1 was recorded in piglets in response to colonization with conventional microbiota [20], or in the lungs of Salmonella infected pigs [21]. This would point towards an important role of immunoglobulins or B-lymphocytes in the final recovery phase of infection. Another gene which was induced in the chicken cecum and may support the hypothesis on an important role of immunoglobulins or B-lymphocytes is HCLS1. HCLS1, also known as HS1, is expressed in all haematopoetic cells [22] and is involved in antigen-receptor signaling in both T- and B-lymphocytes. After crosslinking of the B-cell receptor, HCLS1 is phosphorylated [23] and associates with the B-cell receptor in lipid rafts of murine and chicken B-lymphoid tissue cultures [24]. Moreover, HCLS1 knockout mice are less responsive to T-cell independent antigens [25]. This suggests that the recovery phase is associated with B-lymphocytes and immunoglobulin production against T-cell independent antigens such as LPS. This is completely consistent with the use of LPS ELISA for the detection of anti-salmonella antibodies [8]. Moreover, two groups of Crohn s disease patients have been reported, either with increased or decreased B1-like cells producing low affinity antibodies in a

83 Matulova et al. Veterinary Research 2013, 44:37 Page 10 of 11 T-cell independent manner. Interestingly, patients with decreased B1-like cells were subjected to surgery more frequently than the patients with increased B1-like cells in the intestinal tract [26]. This further supports the hypothesis that the recovery phase is dependent on immunoglobulin production and that these antibodies might be targeted primarily against thymus independent antigens such as Salmonella LPS [8]. Based on our results we propose that the chicken immune response to Salmonella Enteritidis infection occurs in four steps. During the first step IL-8 and IL-17 signaling is triggered and the simplest defense mechanisms involving lysozyme G2 and type I interferon inducible protein IFIT5 are activated. This phase peaks at 2 days postinfection. The second phase is associated with the expression of genes characteristic of heterophils and macrophages, and acute phase proteins such as IRG1, SAA, ExFABP, TRAP6, MRP126, inos, IL-1β, AVD or AH221. The peak of the phase 2 response is around day 4 postinfection. Between phase 1 and phase 2, MMP7 is induced allowing tissue relaxation and leukocyte influx and translocation across the intestinal epithelium. During the third phase from day 5 until day 15 post-infection, transcriptional regulators STAT1 and STAT3 are highly expressed, together with IFNγ characteristic of CD4 T-lymphocyte activity. In addition, inos, ASL, C3 complement, EPSTI1, HCSL1 and ITGB2 (CD18) were also induced. Expression of these genes is characteristic of the development of Th1 type of immune response and control of Salmonella Enteritidis infection. For the last phase, the expression of immunoglobulins is the most characteristic and the immunoglobulins are likely targeted against T-cell independent antigens. This is in total agreement with the known role of IgA as a major effector in the mucosal immune system [27]. Additional file Additional file 1: List of differentially expressed genes identified in this study. This Excel file contains additional information on differentially expressed genes identified in this study by 454 pyrosequencing, LC MS and real time PCR. In addition, primers used for the real time PCR are listed in this additional file as well. Competing interests The authors declare that they have no competing interests. Authors contributions MM and IR designed experiments and wrote the manuscript. MM was responsible for pyrosequencing. KV performed real time PCRs. KS and ZZ did the mass spectrometry. HH and FS performed animal experiments. VB was responsible for statistical analysis. All authors read and approved the final manuscript. Acknowledgements MM, KV, FS, HH, VB and IR have been supported by the project MZE of the Czech Ministry of Agriculture, AdmireVet project CZ.1.05/2.1.00/ ED0006/01/01 from the Czech Ministry of Education and Czech Science Foundation project P502/12/0303. KS and ZZ have been supported the project CEITEC - Central European Institute of Technology (CZ.1.05/1.1.00/ ) from European Regional Development Fund and by Czech Grant Agency (project No. P206/12/G151). The funders had no role in the study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript. Authors also would like to thank Peter Eggenhuizen for his English language corrections. Author details 1 Veterinary Research Institute, Hudcova 70, Brno , Czech Republic. 2 Core Facility - Proteomics, Central European Institute of Technology, Masaryk University, Kamenice 5, Brno , Czech Republic. Received: 27 March 2013 Accepted: 23 April 2013 Published: 20 May 2013 References 1. Anonymous: Report of the task force on zoonoses data collection on the analysis of the baseline study on the prevalence of Salmonella in holdings of laying hen flocks of Gallus gallus. EFSA J 2007, 97: Lahuerta A, Westrell T, Takkinen J, Boelaert F, Rizzi V, Helwigh B, Borck B, Korsgaard H, Ammon A, Makela P: Zoonoses in the European Union: origin, distribution and dynamics - the EFSA-ECDC summary report Euro Surveill 2011, 16(13): Available online: ViewArticle.aspx?ArticleId= Beal RK, Powers C, Wigley P, Barrow PA, Smith AL: Temporal dynamics of the cellular, humoral and cytokine responses in chickens during primary and secondary infection with Salmonella enterica serovar Typhimurium. Avian Pathol 2004, 33: Berndt A, Wilhelm A, Jugert C, Pieper J, Sachse K, Methner U: Chicken cecum immune response to Salmonella enterica serovars of different levels of invasiveness. Infect Immun 2007, 75: Crhanova M, Hradecka H, Faldynova M, Matulova M, Havlickova H, Sisak F, Rychlik I: Immune response of chicken gut to natural colonization by gut microflora and to Salmonella enterica serovar enteritidis infection. Infect Immun 2011, 79: Matulova M, Rajova J, Vlasatikova L, Volf J, Stepanova H, Havlickova H, Sisak F, Rychlik I: Characterization of chicken spleen transcriptome after infection with Salmonella enterica serovar Enteritidis. PLoS One 2012, 7:e Raffatellu M, George MD, Akiyama Y, Hornsby MJ, Nuccio SP, Paixao TA, Butler BP, Chu H, Santos RL, Berger T, Mak TW, Tsolis RM, Bevins CL, Solnick JV, Dandekar S, Bäumler AJ: Lipocalin-2 resistance confers an advantage to Salmonella enterica serotype Typhimurium for growth and survival in the inflamed intestine. Cell Host Microbe 2009, 5: Matulova M, Havlickova H, Sisak F, Rychlik I: Vaccination of chickens with Salmonella Pathogenicity Island (SPI) 1 and SPI2 defective mutants of Salmonella enterica serovar Enteritidis. Vaccine 2012, 30: Rychlik I, Karasova D, Sebkova A, Volf J, Sisak F, Havlickova H, Kummer V, Imre A, Szmolka A, Nagy B: Virulence potential of five major pathogenicity islands (SPI-1 to SPI-5) of Salmonella enterica serovar Enteritidis for chickens. BMC Microbiol 2009, 9: Wisniewski JR, Zougman A, Nagaraj N, Mann M: Universal sample preparation method for proteome analysis. Nat Methods 2009, 6: Wisniewski JR, Nagaraj N, Zougman A, Gnad F, Mann M: Brain phosphoproteome obtained by a FASP-based method reveals plasma membrane protein topology. J Proteome Res 2010, 9: Hsu JL, Huang SY, Chen SH: Dimethyl multiplexed labeling combined with microcolumn separation and MS analysis for time course study in proteomics. Electrophoresis 2006, 27: Rozen S, Skaletsky H: Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. Methods Mol Biol 2000, 132: Pilousova L, Rychlik I: Retron Se72 utilizes a unique strategy of the self-priming initiation of reverse transcription. Cell Mol Life Sci 2011, 68: Stanford School of Medicine, Ashley Lab in the Department of Medicine. [ 16. Kaniga K, Trollinger D, Galan JE: Identification of two targets of the type III protein secretion system encoded by the inv and spa loci of Salmonella typhimurium that have homology to the Shigella IpaD and IpaA proteins. J Bacteriol 1995, 177:

84 Matulova et al. Veterinary Research 2013, 44:37 Page 11 of Matulova M, Stepanova H, Sisak F, Havlickova H, Faldynova M, Kyrova K, Volf J, Rychlik I: Cytokine signaling in splenic leukocytes from vaccinated and nonvaccinated chickens after intravenous infection with Salmonella Enteritidis. PLoS One 2012, 7:e McPherson M, Wei B, Turovskaya O, Fujiwara D, Brewer S, Braun J: Colitis immunoregulation by CD8+ T cell requires T cell cytotoxicity and B cell peptide antigen presentation. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2008, 295:G485 G Wei B, McPherson M, Turovskaya O, Velazquez P, Fujiwara D, Brewer S, Braun J: Integration of B cells and CD8+ T in the protective regulation of systemic epithelial inflammation. Clin Immunol 2008, 127: Chowdhury SR, King DE, Willing BP, Band MR, Beever JE, Lane AB, Loor JJ, Marini JC, Rund LA, Schook LB, Van Kessel AG, Gaskins HR: Transcriptome profiling of the small intestinal epithelium in germfree versus conventional piglets. BMC Genomics 2007, 8: Zhao SH, Kuhar D, Lunney JK, Dawson H, Guidry C, Uthe JJ, Bearson SM, Recknor J, Nettleton D, Tuggle CK: Gene expression profiling in Salmonella Choleraesuis-infected porcine lung using a long oligonucleotide microarray. Mamm Genome 2006, 17: Kitamura D, Kaneko H, Miyagoe Y, Ariyasu T, Watanabe T: Isolation and characterization of a novel human gene expressed specifically in the cells of hematopoietic lineage. Nucleic Acids Res 1989, 17: Yamanashi Y, Okada M, Semba T, Yamori T, Umemori H, Tsunasawa S, Toyoshima K, Kitamura D, Watanabe T, Yamamoto T: Identification of HS1 protein as a major substrate of protein-tyrosine kinase(s) upon B-cell antigen receptor-mediated signaling. Proc Natl Acad Sci U S A 1993, 90: Hao JJ, Carey GB, Zhan X: Syk-mediated tyrosine phosphorylation is required for the association of hematopoietic lineage cell-specific protein 1 with lipid rafts and B cell antigen receptor signalosome complex. J Biol Chem 2004, 279: Taniuchi I, Kitamura D, Maekawa Y, Fukuda T, Kishi H, Watanabe T: Antigenreceptor induced clonal expansion and deletion of lymphocytes are impaired in mice lacking HS1 protein, a substrate of the antigen-receptor-coupled tyrosine kinases. EMBO J 1995, 14: Defendenti C, Sarzi-Puttini P, Grosso S, Croce A, Senesi O, Saibeni S, Bollani S, Almasio PL, Bruno S, Atzeni F: B lymphocyte intestinal homing in inflammatory bowel disease. BMC Immunol 2011, 12: Suzuki K, Meek B, Doi Y, Muramatsu M, Chiba T, Honjo T, Fagarasan S: Aberrant expansion of segmented filamentous bacteria in IgA-deficient gut. Proc Natl Acad Sci U S A 2004, 101: doi: / Cite this article as: Matulova et al.: Chicken innate immune response to oral infection with Salmonella enterica serovar Enteritidis. Veterinary Research :37. Submit your next manuscript to BioMed Central and take full advantage of: Convenient online submission Thorough peer review No space constraints or color figure charges Immediate publication on acceptance Inclusion in PubMed, CAS, Scopus and Google Scholar Research which is freely available for redistribution Submit your manuscript at

85 Příloha 2 The early innate response of chickens to Salmonella enterica is dependent on the presence of O-antigen but not on serovar classification Varmuzova K., Elsheimer Matulova M., Sebkova A., Sekelova Z., Havlickova H., Sisak F., Babak V., Rychlik I. (PLoS ONE, 2014)

86 The Early Innate Response of Chickens to Salmonella enterica Is Dependent on the Presence of O-Antigen but Not on Serovar Classification Karolina Varmuzova, Marta Elsheimer Matulova, Alena Sebkova, Zuzana Sekelova, Hana Havlickova, Frantisek Sisak, Vladimir Babak, Ivan Rychlik* Veterinary Research Institute, Brno, Czech Republic Abstract Salmonella vaccines used in poultry in the EU are based on attenuated strains of either Salmonella serovar Enteritidis or Typhimurium which results in a decrease in S. Enteritidis and S. Typhimurium but may allow other Salmonella serovars to fill an empty ecological niche. In this study we were therefore interested in the early interactions of chicken immune system with S. Infantis compared to S. Enteritidis and S. Typhimurium, and a role of O-antigen in these interactions. To reach this aim, we orally infected newly hatched chickens with 7 wild type strains of Salmonella serovars Enteritidis, Typhimurium and Infantis as well as with their rfal mutants and characterized the early Salmonella-chicken interactions. Inflammation was characterized in the cecum 4 days post-infection by measuring expression of 43 different genes. All wild type strains stimulated a greater inflammatory response than any of the rfal mutants. However, there were large differences in chicken responses to different wild type strains not reflecting their serovar classification. The initial interaction between newlyhatched chickens and Salmonella was found to be dependent on the presence of O-antigen but not on its structure, i.e. not on serovar classification. In addition, we observed that the expression of calbindin or aquaporin 8 in the cecum did not change if inflammatory gene expression remained within a 10 fold fluctuation, indicating the buffering capacity of the cecum, preserving normal gut functions even in the presence of minor inflammatory stimuli. Citation: Varmuzova K, Matulova ME, Sebkova A, Sekelova Z, Havlickova H, et al. (2014) The Early Innate Response of Chickens to Salmonella enterica Is Dependent on the Presence of O-Antigen but Not on Serovar Classification. PLoS ONE 9(4): e doi: /journal.pone Editor: Michael Hensel, University of Osnabrueck, Germany Received December 30, 2013; Accepted April 2, 2014; Published April 24, 2014 Copyright: ß 2014 Varmuzova et al. This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited. Funding: This work has been supported by projects MZE of the Czech Ministry of Agriculture, AdmireVet project CZ.1.05/2.1.00/ ED0006/01/ 01 from the Czech Ministry of Education and Czech Science Foundation project P502/12/0303. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript. Competing Interests: The authors have declared that no competing interests exist. * rychlik@vri.cz Introduction The prevalence of Salmonella enterica serovar Enteritidis (S. Enteritidis) in poultry flocks is gradually decreasing in EU member states [1]. One of the reasons is the use of vaccination in eggproducing flocks, usually with live, attenuated Salmonella vaccines based on attenuated strains of S. Enteritidis. However, there are concerns that the decrease in S. Enteritidis due to successful vaccination may allow other Salmonella serovars to fill an empty ecological niche in poultry flocks. One such serovar is serovar Infantis. Isolates of this serovar can be isolated both from pigs and poultry, and are relatively common also in humans [2,3]. However, as isolates of serovar Infantis are recovered from outbreaks at a lower frequency when compared with S. Enteritidis, S. Infantis is generally considered as less virulent for the above mentioned host species. The response of chickens to oral infection with Salmonella is characterized by a moderate inflammatory response in the cecum. This response is accompanied by leukocyte infiltration and an increase in the expression of proinflammatory cytokines or immune effectors such as inducible NO synthase [4 6]. The response in the chicken cecum, however, is not limited to cytokine gene expression and, in agreement with this, we recently described over 40 new chicken genes that respond highly to S. Enteritidis infection [7,8]. Although the biological function of most of these genes has not been experimentally proven in chickens, analyzing their expression profiles in an integrated fashion may represent a sensitive tool for the characterization of a range of inflammatory signals in the chicken cecum after Salmonella infection. Such an approach has been used in this study for characterizing in detail the interactions of chickens with altogether 7 strains belonging to Salmonella serovars Enteritidis, Typhimurium and Infantis. In addition, as O-antigen is an obvious difference among Salmonella serovars and since LPS and O-antigen influence strain virulence by affecting invasiveness in eukaryotic cells and protein secretion [9 11], rfal (waal) mutants disabled in O-antigen synthesis were constructed. Since these mutants were constructed in S. Enteritidis (O9 antigen), S. Typhimurium (O4 and O5 antigens) and S. Infantis (O6 and O7 antigens), we could compare the influence of different O-antigen structures on chicken recognition of Salmonella. Using such an approach, we found that all wild type strains stimulated a greater inflammatory response than any of the rfal mutants. However, there were great differences in chicken responses to different wild type strains independent of their serovar classification. The early interaction between chickens and PLOS ONE 1 April 2014 Volume 9 Issue 4 e96116

87 Chicken Cecum Inflammation Salmonella was therefore dependent on the presence of O-antigen but not on its structure. Results Bacterial Strains, qrt-pcr Initially the chicken response to Salmonella serovars Enteritidis, Typhimurium and Infantis and rfal mutants was characterized by real time PCR quantification of IL1b, IL8, IL17, IL22, IFN-c and inos expression in the cecum. Gene expression in the cecum of chickens infected with wild type Salmonella strains significantly increased in comparison with that in the non-infected control chickens. S. Enteritidis and S. Infantis induced the same inflammatory response whilst the chicken response to infection with S. Typhimurium LT2 was lower in comparison to the response to other wild type strains. Unlike the wild type strains and except for IL8, the rfal mutants induced a significantly lower level of inflammation which was nearly the same as in the non-infected control chickens (Fig. 1). SDS-PAGE of Secreted Proteins Since S. Typhimurium LT2 induced a lower inflammatory response and the inflammation is dependent on the SPI1 encoded type III secretion system [7,12], we verified in vitro protein secretion for all the strains. Secreted proteins of S. Enteritidis 147 and S. Infantis 1516, as well as rfal mutants of S. Enteritidis 147 and S. Typhimurium LT2 were similar to those of other Salmonella strains [10,13], though protein secretion was slightly less efficient in the rfal mutants. On the other hand, the protein profiles of both S. Typhimurium LT2 and rfal mutant of S. Infantis 1516 were characteristic by a high protein background indicating lysis of the bacterial cells (Fig. 2A). Because of this, in the next set of experiments, we i) extended the number of wild type strains, ii) constructed two additional rfal mutants in S. Infantis 1516, iii) verified protein secretion in vitro and iv) finally infected chickens with the extended set of mutants and characterized their immune response by monitoring of gene expression of 43 different genes. Control SDS-PAGE showed that all newly included wild type strains, namely S. Enteritidis G1481, S. Typhimurium 2002, S. Typhimurium 2454 and S. Infantis 514, exhibited standard profiles of Salmonella secreted proteins. However, two newly constructed rfal mutants in S. Infantis 1516 again exhibited a high protein background indicating that this was a common characteristic of rfal mutants of S. Infantis 1516 (Fig. 2B). Principal Component Analysis (PCA) of Individual Chickens based on their Gene Expression in the Cecum In the next step, the gene expression of 43 genes was characterized in the caeca of 8 non-infected controls and in the 96 chickens which were infected with all 7 wild type strains and 5 rfal mutants. This dataset was analyzed by PCA (for individual gene expression profiles see Table S1) which showed that all noninfected chickens clustered separately from those infected with any of the wild Salmonella strains. Inactivation of rfal attenuated mutants to such an extent that chickens infected with them overlapped with the non-infected controls. The only exception was the rfal mutant of S. Enteritidis which stimulated an inflammatory response similar to the least virulent wild type strains. Rather surprisingly, we did not observe any clustering of chickens based on infection with strains belonging to different serovars (Fig. 3). Figure 1. Cytokine gene expression in the cecum of orally infected chickens. Columns represent geometric means of the relative expressions of respective genes. Vertical bars represent 95% confidence intervals regarding the geometric means. Superscripts above columns denote statistically significant differences among groups (columns sharing the same superscript are not significantly different from each other, columns that have no superscript in common are significantly different from each other). NI, expression in the non-infected chickens. SE, expression in the chickens infected with S. Enteritidis 147. STM, expression in the chickens infected with S. Typhimurium LT2. SI, expression in the chickens infected with S. Infantis SE rfal, expression in the chickens infected with S. Enteritidis rfal mutant. STM rfal, expression in the chickens infected with S. Typhimurium rfal mutant. SI rfal, expression in the chickens infected with S. Infantis rfal (I) mutant. Mind logarithmic scaling of Y-axis. doi: /journal.pone g001 PLOS ONE 2 April 2014 Volume 9 Issue 4 e96116

88 Chicken Cecum Inflammation Figure 2. Salmonella secreted proteins. Panel A, strains included in the initial part of this study. 1, S. Enteritidis , S. Enteritidis 147 rfal mutant. 3, S. Typhimurium LT2. 4, S. Typhimurium LT2 rfal mutant. 5, S. Infantis , S. Infantis 1516 rfal (I) mutant. Lane M, molecular weight standard. This analysis was repeated 3 times for each strain or mutant with similar results in each of the replicates. Panel B, strains included in the second part of this study. 1, S. Enteritidis G , S. Typhimurium , S. Typhimurium , S. Infantis , S. Infantis 1516 rfal (II) mutant. 6, S. Infantis 1516 rfal (III) mutant. Lane M, molecular weight standard. This analysis was repeated 3 times for each strain or mutant with similar results in each of the replicates. doi: /journal.pone g002 Correlation between Salmonella Counts and Gene Expression Finally we were interested to what extent the inflammatory response might be influenced by total Salmonella counts present in infected chickens. To address this question we calculated an average expression of all upregulated or downregulated genes (for all up- or downregulated genes see Fig. 3 or Table S2) and used this value as an index which was plotted against Salmonella counts in the liver. Salmonella counts in the liver, instead of the cecum, were used as the cecal samples occasionally exhibited overgrowth by other microbiota even on XLD agar supplemented with nalidixic acid. Secondly, rfal mutants were excluded from this analysis as these did not grow on XLD agar. This analysis showed that inflammation induced by the wild type strains was not dependent on Salmonella counts in the liver as chickens exhibiting similar Salmonella counts in liver responded by a variable expression of marker genes in the cecum (Fig. 4A and 4B). In the last analysis we plotted the average expression values of upregulated genes against the average expression values of downregulated genes after Salmonella infection. This analysis showed that within one log in which the inducible genes changed in expression, the expression of suppressible genes remained unchanged. Only when the expression of inducible genes increased more than 10 fold, the expression of the suppressible genes began to decreases correspondingly. As the downregulated genes are associated with basal gut function such as nutrient transport in the cecum, this means that these functions remain unaffected within minor changes in inflammatory status and only if this extends over a one log fluctuation, normal gut functions become affected (Fig. 4C). Discussion In the present study, the immune response of the gut newly hatched chickens to infection with 7 strains of 3 different Salmonella serovars and their O-antigen defective mutants was compared. Unlike the previous reports concluding there was a decreasing invasion and/or inflammatory response of chickens or chicken cell lines to the infection with S. Enteritidis, S. Typhimurium and S. Infantis [4,6,14,15], we did not observe such a serovar-dependent decrease. Instead, recognition of Salmonella by newly hatched chickens was more dependent on individual strains and even the pigeon, i.e. bird-adapted, S. Typhimurium isolate of phage type DT2 [16] stimulated a lower inflammatory response than the human S. Typhimurium isolate of phage type DT104. Some of these interactions might be explained by the known lower virulence of some strains such as S. Typhimurium LT2 due to a mutation in the rpos start codon [17,18], lower stability in the stationary phase [19] and release of cytoplasmic proteins into the medium (Fig. 2). However, if taken collectively, the early interaction between naïve chickens and Salmonella was not affected by serovar but rather by particular strain characteristics. This, however, does not exclude that there is a systemic serovardependent chicken response in sites such as the liver and spleen, or in the cecum but at later stages of infection. Removal of O-antigen significantly reduced the ability of Salmonella to induce inflammation in the chicken gut, likely due to their increased sensitivity to antimicrobial peptides or serum [20]. The rfal mutant of S. Enteritidis 147 exhibited the highest residual virulence whilst the removal of O-antigen from S. Typhimurium LT2 and S. Infantis 1516 nearly abolished the ability of these mutants to induce inflammation in infected chickens as these clustered closely to the non-infected controls. It would be interesting to test whether the low level inflammation induced by the rfal mutants, that of S. Enteritidis in particular, would be able to protect chickens against systemic site colonization after subsequent challenge by wild type strains administered 24 hours later, as observed in gnotobiotic piglets [21]. Finally we analyzed whether the different inflammatory responses could be affected by Salmonella counts in liver. For such analysis we separately analyzed the genes which were induced or suppressed in the cecum of Salmonella infected chickens [7]. The former are associated with the innate immune response and inflammation and the latter are associated with normal gut function such as transport of calcium or water (e.g. calbindin1 and aquaporin 8). However, as plotting the Salmonella counts either against an average expression of all upregulated genes, or against an average expression of all downregulated genes did not show any clear profile, a simple mechanistic explanation based on Salmonella counts is not appropriate. Interestingly, when the average expression level of Salmonella upregulated genes was plotted against the average expression level of Salmonella downregulated genes in individual chickens, we noticed that the expression of suppressible genes did not change in PLOS ONE 3 April 2014 Volume 9 Issue 4 e96116

89 Chicken Cecum Inflammation Figure 3. PCA plot of the chickens clustered according to their gene expression in the cecum and heat map correlation coefficients between factor 1 and individual gene expression. Open black circles, S. Enteritidis 147; Open blue circles, S. Enteritidis G1481; open black squares, S. Typhimurium LT2; open blue squares, S. Typhimurium 2002; open red squares, S. Typhimurium 2454; open black triangles, S. Infantis 1516; open blue triangles, S. Infantis 514; closed black circles, S. Enteritidis 147 rfal mutant; closed black squares, S. Typhimurium LT2 rfal mutant; closed black triangles, S. Infantis 1516 rfal (I) mutant; closed blue triangles, S. Infantis 1516 rfal (II) mutant; closed red triangles, S. Infantis 1516 rfal (III) mutant. symbol plus, non-infected chickens. PCA also showed that a single factor explained nearly 80% of the variation in the chicken response. This factor was the scope of inflammation itself as high and significant correlations were observed between the expression of individual genes and the positioning of corresponding chickens along X axis. Genes are arranged from the most positively correlated to the most negatively correlated ones. doi: /journal.pone g003 Figure 4. Correlation between gene expression and Salmonella counts in the liver (log CFU/g), and correlation between upregulated and downregulated genes. Each dot represents a single chicken characterized by Salmonella counts in the liver, average expression calculated from expression of all genes which positively respond to Salmonella infection or average expression calculated from expression of all genes which negatively respond to Salmonella infection. A, correlation between average expression of upregulated genes and Salmonella counts in the liver. B, correlation between average expression of downregulated genes and Salmonella counts in the liver. C, correlation between average expression of upregulated and downregulated genes. doi: /journal.pone g004 PLOS ONE 4 April 2014 Volume 9 Issue 4 e96116

90 Chicken Cecum Inflammation expression as long as the expression of the inducible genes increased more than tenfold. Only when the inducible gene expression increased more than tenfold, the expression of suppressible genes began to decline, too. Since the suppressible genes represent normal functions of the chicken cecum, this shows that there is a buffering capacity in the chicken cecum preserving its normal function even in the presence of minor inflammatory fluctuations. Materials and Methods Ethical Statement The handling of animals in the study was performed in accordance with current Czech legislation (Animal protection and welfare Act No. 246/1992 Coll. of the Government of the Czech Republic). The specific experiments were approved by the Ethics Committee of the Veterinary Research Institute (permit number 48/2010) followed by the Committee for Animal Welfare of the Ministry of Agriculture of the Czech Republic (permit number MZe 1226). Bacterial Strains All bacterial strains used in this experiment were spontaneously resistant to nalidixic acid and are listed in Table 1. rfal::cm mutations were constructed by l red recombination [22] and verified by PCR using primers designed to amplify through the inserted gene cassette inactivated gene junction. Analysis of Secreted Proteins Protein secretion was tested by precipitation of Salmonella secreted proteins with trichloracetic acid and their resolution by sodium dodecylsulphate-polyacrylamide gel electrophoresis [17]. In brief, bacterial strains were grown in LB broth at 37uC for 16 hours. The bacterial culture (25 ml) was centrifuged at g for 15 min at 4uC. The supernatant was filtered through Millex GP 0.22 mm pore sized filter (Millipore) and proteins were precipitated with trichloroacetic acid at a final concentration of 13%. After 60 min, the precipitated proteins were harvested by centrifugation at g for 10 minutes at 4uC, washed twice with acetone and electrophoresed by SDS-PAGE using a 12% polyacrylamide gel followed by Coomassie blue staining. Experimental Animals Newly hatched male ISA Brown chickens (Hendrix Genetics, Boxmeer, Netherlands) were used in this study. The chickens were reared in perforated plastic boxes at 22uC with free access to water and pathogen-free feed. Each of the experimental or control groups was kept in a separate room. Four chickens per group were orally infected on day one of life with 10 7 CFU of Salmonella strains listed in Tab. 1. In addition, four non-infected chickens were included as a negative control group. Four days later, the chickens were sacrificed and approximately 25 mg of cecal wall was collected into RNALater solution (Qiagen) and stored at 280uC. In parallel, 0.5 g of liver tissue or cecal content was processed for Salmonella enumeration. These samples were homogenized in peptone water, tenfold serially diluted and plated on XLD agar plates (HiMedia) supplemented with 20 mg/ml nalidixic acid. Samples negative after direct plating were subjected to a pre-enrichment in buffered peptone water and enrichment in modified semi-solid Rappaport- Vassiliadis medium (Oxoid) for qualitative Salmonella strains and mutant determination. Salmonella counts positive after direct plating were logarithmically transformed. Samples positive only after enrichment were assigned a value of 1 and negative samples were assigned a value of 0. The chicken infections were performed twice so that we obtained data for the chicken response for each strain or mutant on two completely independent occasions. The non-infected control chickens were also processed for Salmonella enumeration always yielding negative results. RNA Purification and Quantitative Real-rime PCR Approx. 25 mg of cecal wall was transferred into 1 ml of TRI reagent (Molecular Research Centre) and homogenized using zirconia silica beads (BioSpec Products) in a MagNALyser (Roche). Fifty ml of bromanisole (Molecular Research Centre) was added to the homogenate, the samples were vigorously shaken for 10 s and centrifuged at 4uC for 15 min at g. The upper aqueous phase (500 ml) was collected and mixed with an equal volume of 70% ethanol. This mixture was added to RNeasy purification columns (Qiagen) and washing and RNA elution was performed exactly as recommended by the manufacturer. The concentration and purity of purified RNA was determined spectrophotometrically (Nanodrop, Thermo Fisher Scientific). Table 1. List of Salmonella enterica strains and their rfal mutants used in this study. Serovar Strain ID Mutant O antigen Phage type Enteritidis 147 7F4 wt 1,9,12 PT4 Enteritidis G1481 2I2 wt 1,9,12 PT4 Typhimurium LT2 11F4 wt 1,4,5,12 ND* Typhimurium E5 wt 1,4,5,12 DT104 Typhimurium B4 wt 1,4,5,12 DT2 Infantis G6 wt 6,7,14 ND Infantis F10 wt 6,7,14 ND Enteritidis E5 DrfaL::Cm none ND Typhimurium LT2 7F10 DrfaL::Cm none ND Infantis 1516 (I) 21A2 DrfaL::Cm none ND Infantis 1516 (II) 22C9 DrfaL::Cm none ND Infantis 1516 (III) 22C10 DrfaL::Cm none ND *ND, not determined. doi: /journal.pone t001 PLOS ONE 5 April 2014 Volume 9 Issue 4 e96116

91 Chicken Cecum Inflammation One mg of RNA was immediately reverse transcribed into cdna using M-MLV reverse transcriptase (Invitrogen) and oligo (dt) primers. After reverse transcription, the cdna was diluted 10 times with sterile water and stored at 220uC until real-time PCR. Real-time PCR was performed in 3 ml volumes on 384-well microplates using QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix (Qiagen) and a Nanodrop pipetting station from Inovadyne for PCR mix dispensing. The amplification of PCR products and signal detection were performed using a LightCycler II (Roche) with an initial denaturation at 95uC for 15 min followed by 40 cycles of 95uC for 20 s, 60uC for 30 s and 72uC for 30 s. Each sample was subjected to real-time PCR in duplicate and the mean values of the duplicates were used for subsequent analysis. The Ct values of the genes of interest were normalized (DCt) to an average Ct value of three house-keeping genes, GAPDH (glyceraldehyde- 3-phosphate dehydrogenase), UB (ubiquitin) and TBP (TATA box-binding protein) [23,24], and the relative expression of each gene of interest was calculated as 2 2DCt. These expression levels were used for data analysis. The initial characterization of the immune response to infection with S. Enteritidis 147, S. Typhimurium LT2, S. Infantis 1516 and their rfal mutants was based on the quantification of IL1b, IL17, IL22, IL8, IFNc and inos transcripts. In the second part of this study, the expression of 43 different genes was used for complex characterization of the chicken immune response to infection with all the Salmonella strains. All the primer sequences are listed in Table S2. Reproducibility and Statistics ANOVA followed by post-hoc Tukey s HSD test were used for the analysis of data obtained during initial infections with S. References 1. Lahuerta A, Westrell T, Takkinen J, Boelaert F, Rizzi V, et al. (2011) Zoonoses in the European Union: origin, distribution and dynamics - the EFSA-ECDC summary report Euro Surveill 16: Kohl KS, Farley TA (2000) Initially unrecognized distribution of a commercially cooked meat product contaminated over several months with Salmonella serotype Infantis. Epidemiol Infect 125: Najjar Z, Furlong C, Stephens N, Shadbolt C, Maywood P, et al. (2012) An outbreak of Salmonella Infantis gastroenteritis in a residential aged care facility associated with thickened fluids. Epidemiol Infect 140: Berndt A, Wilhelm A, Jugert C, Pieper J, Sachse K, et al. (2007) Chicken cecum immune response to Salmonella enterica serovars of different levels of invasiveness. Infect Immun 75: Matulova M, Havlickova H, Sisak F, Rychlik I (2012) Vaccination of chickens with Salmonella Pathogenicity Island (SPI) 1 and SPI2 defective mutants of Salmonella enterica serovar Enteritidis. Vaccine 30: Setta AM, Barrow PA, Kaiser P, Jones MA (2012) Early immune dynamics following infection with Salmonella enterica serovars Enteritidis, Infantis, Pullorum and Gallinarum: cytokine and chemokine gene expression profile and cellular changes of chicken cecal tonsils. Comp Immunol Microbiol Infect Dis 35: Matulova M, Varmuzova K, Sisak F, Havlickova H, Babak V, et al. (2013) Chicken innate immune response to oral infection with Salmonella enterica serovar Enteritidis. Vet Res 44: Matulova M, Rajova J, Vlasatikova L, Volf J, Stepanova H, et al. (2012) Characterization of chicken spleen transcriptome after infection with Salmonella enterica serovar Enteritidis. PLoS One 7: e Guard-Petter J, Keller LH, Rahman MM, Carlson RW, Silvers S (1996) A novel relationship between O-antigen variation, matrix formation, and invasiveness of Salmonella enteritidis. Epidemiol Infect 117: Crhanova M, Malcova M, Mazgajova M, Karasova D, Sebkova A, et al. (2011) LPS structure influences protein secretion in Salmonella enterica. Vet Microbiol 152: Coward C, Sait L, Cogan T, Humphrey TJ, Maskell DJ (2013) O-antigen repeat number in Salmonella enterica serovar Enteritidis is important for egg contamination, colonisation of the chicken reproductive tract and survival in egg albumen. FEMS Microbiol Lett 343: Zhang S, Adams LG, Nunes J, Khare S, Tsolis RM, et al. (2003) Secreted effector proteins of Salmonella enterica serotype typhimurium elicit host-specific chemokine profiles in animal models of typhoid fever and enterocolitis. Infect Immun 71: Enteritidis 147, S. Typhimurium LT2 and S. Infantis 1516 and their rfal mutants. Principal component analysis (PCA) was used later to characterize the integrated immune response of chickens based on the expression of 43 genes in 8 chickens for each of the 13 groups including the non-infected controls. The PCA was calculated using unscaled DCt values, i.e. we used covariances in an association matrix. All the statistical analyses have been performed using Statistica v. 9.1 (StatSoft) software. Supporting Information Table S1 Complete list of gene expression for each gene and chicken. (XLS) Table S2 List of primers used in SybrGreen real time reverse transcription PCR in this study. (XLS) Acknowledgments Authors also would like to thank Peter Eggenhuizen for his English language corrections. Author Contributions Conceived and designed the experiments: KV IR MM. Performed the experiments: KV MM AS ZS HH FS. Analyzed the data: IR KV VB. Wrote the paper: IR KV. 13. Komoriya K, Shibano N, Higano T, Azuma N, Yamaguchi S, et al. (1999) Flagellar proteins and type III-exported virulence factors are the predominant proteins secreted into the culture media of Salmonella typhimurium. Mol Microbiol 34: Setta A, Barrow PA, Kaiser P, Jones MA (2012) Immune dynamics following infection of avian macrophages and epithelial cells with typhoidal and nontyphoidal Salmonella enterica serovars; bacterial invasion and persistence, nitric oxide and oxygen production, differential host gene expression, NF-kappaB signalling and cell cytotoxicity. Vet Immunol Immunopathol 146: Aabo S, Christensen JP, Chadfield MS, Carstensen B, Olsen JE, et al. (2002) Quantitative comparison of intestinal invasion of zoonotic serotypes of Salmonella enterica in poultry. Avian Pathol 31: Andrews-Polymenis HL, Rabsch W, Porwollik S, McClelland M, Rosetti C, et al. (2004) Host restriction of Salmonella enterica serotype Typhimurium pigeon isolates does not correlate with loss of discrete genes. J Bacteriol 186: Swords WE, Cannon BM, Benjamin WH Jr. (1997) Avirulence of LT2 strains of Salmonella typhimurium results from a defective rpos gene. Infect Immun 65: Wilmes-Riesenberg MR, Foster JW, Curtiss R III (1997) An altered rpos allele contributes to the avirulence of Salmonella typhimurium LT2. Infect Immun 65: Spector MP (1998) The starvation-stress response (SSR) of Salmonella. Adv Microb Physiol 40: Karasova D, Sebkova A, Vrbas V, Havlickova H, Sisak F, et al. (2009) Comparative analysis of Salmonella enterica serovar Enteritidis mutants with a vaccine potential. Vaccine 27: Trebichavsky I, Dlabac V, Rehakova Z, Zahradnickova M, Splichal I (1997) Cellular changes and cytokine expression in the ilea of gnotobiotic piglets resulting from peroral Salmonella typhimurium challenge. Infect Immun 65: Datsenko KA, Wanner BL (2000) One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci U S A 97: Li YP, Bang DD, Handberg KJ, Jorgensen PH, Zhang MF (2005) Evaluation of the suitability of six host genes as internal control in real-time RT-PCR assays in chicken embryo cell cultures infected with infectious bursal disease virus. Vet Microbiol 110: De Boever S, Vangestel C, De Backer P, Croubels S, Sys SU (2008) Identification and validation of housekeeping genes as internal control for gene expression in an intravenous LPS inflammation model in chickens. Vet Immunol Immunopathol 122: PLOS ONE 6 April 2014 Volume 9 Issue 4 e96116

92 Příloha 3 phop, SPI1, SPI2 and aroa mutants of Salmonella Enteritidis induce a different immune response in chickens Elsheimer-Matulova M., Varmuzova K., Kyrova K., Havlickova H., Sisak F., Rahman M., Rychlik I. (Veterinary Research, 2015)

93 Elsheimer-Matulova et al. Veterinary Research (2015) 46:96 DOI /s x VETERINARY RESEARCH RESEARCH ARTICLE phop, SPI1, SPI2 and aroa mutants of Salmonella Enteritidis induce a different immune response in chickens Marta Elsheimer-Matulova, Karolina Varmuzova, Kamila Kyrova, Hana Havlickova, Frantisek Sisak, Masudur Rahman and Ivan Rychlik * Open Access Abstract Poultry is the most frequent reservoir of non-typhoid Salmonella enterica for humans. Understanding the interactions between chickens and S. enterica is therefore important for vaccine design and subsequent decrease in the incidence of human salmonellosis. In this study we therefore characterized the interactions between chickens and phop, aroa, SPI1 and SPI2 mutants of S. Enteritidis. First we tested the response of HD11 chicken macrophage-like cell line to S. Enteritidis infection monitoring the transcription of 36 genes related to immune response. All the mutants and the wild type strain induced inflammatory signaling in the HD11 cell line though the response to SPI1 mutant infection was different from the rest of the mutants. When newly hatched chickens were inoculated, the phop as well as the SPI1 mutant did not induce an expression of any of the tested genes in the cecum. Despite this, such chickens were protected against challenge with wild-type S. Enteritidis. On the other hand, inoculation of chickens with the aroa or SPI2 mutant induced expression of 27 and 18 genes, respectively, including genes encoding immunoglobulins. Challenge of chickens inoculated with these two mutants resulted in repeated induction of 11 and 13 tested genes, respectively, including the genes encoding immunoglobulins. In conclusion, SPI1 and phop mutants induced protective immunity without inducing an inflammatory response and antibody production. Inoculation of chickens with the SPI2 and aroa mutants also led to protective immunity but was associated with inflammation and antibody production. The differences in interaction between the mutants and chicken host can be used for a more detailed understanding of the chicken immune system. Introduction Non-typhoid Salmonella enterica serovars are among the most common causative agents of food-borne diseases worldwide [1]. Since poultry is the most frequent reservoir of salmonellosis for humans, vaccination of chickens is understood as an effective measure to decrease S. enterica incidence in humans. Currently, construction of attenuated vaccine strains of S. enterica is not an issue and many different mutants have been tested in mice, chickens and even humans [2-7]. However, the main dilemma is which mode of attenuation to choose out of the many possibilities [8]. More detailed information on host response to S. enterica infection or vaccination is therefore needed. Such information can be obtained either by generating chickens with knocked out * Correspondence: rychlik@vri.cz Veterinary Research Institute, Hudcova 70, , Brno, Czech Republic genes involved in innate or acquired immune response or by preparing S. enterica mutants with clearly defined defects in pathogenesis and analysis of chicken immune response. Since the former possibility is still an issue in chickens, the latter approach represents a feasible alternative. Mutants with clearly different defects in Salmonella pathogenesis include those with deletions in aroa, phop, SPI1 or SPI2. Reduced virulence of aroa mutants can be explained by their inability to produce aromatic compounds as well as having a high sensitivity to serum [2,9]. phop mutants belong to the most attenuated ones as they fail to survive inside phagocytic cells [10], perhaps due to their high sensitivity to acidification and host antimicrobial peptides [11]. However, phop mutants also exhibit intracellular overgrowth in fibroblasts [12]. Recently, mutants defective in virulence genes specific to 2015 Elsheimer-Matulova et al. Open Access This article is distributed under the terms of the Creative Commons Attribution 4.0 International License ( which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided you give appropriate credit to the original author(s) and the source, provide a link to the Creative Commons license, and indicate if changes were made. The Creative Commons Public Domain Dedication waiver ( applies to the data made available in this article, unless otherwise stated.

94 Elsheimer-Matulova et al. Veterinary Research (2015) 46:96 Page 2 of 12 S. enterica such as those localized on the Salmonella pathogenicity island (SPI) 1 and SPI2 have been successfully tested [5,13]. SPI1 mutants are impaired in invading non-professional phagocytes while SPI2 mutants are unable to survive intracellularly for a prolonged time [14-17]. SPI1 mutants are also defective in induction of apoptosis in macrophages [18,19]. Interestingly, when we recently used SPI1 and SPI2 mutants of S. enterica serovar Enteritidis for vaccination of chickens, higher antibody levels were observed in chickens vaccinated with the SPI2 mutant than in chickens vaccinated with the SPI1 mutant [13]. Inactivation of different branches of S. enterica virulence may therefore lead to its different recognition by the chicken immune system and induction of a different type of specific immunity. Comparison of chicken response to inoculation with different S. enterica mutants is further complicated by the fact that with increasing age, chickens become quite resistant to S. enterica infection [20]. Consequently, although there are numerically lower counts of Salmonella in the liver and spleen, and lower inflammatory responses are recorded in 6-week-old vaccinated chickens in comparison with non-vaccinated controls after challenge, such differences do not always reach statistical significance with the numbers of chickens commonly used under laboratory conditions. This was the reason why we recently initiated research activities using genomic and proteomic tools which led to the identification of tens of genes whose expressions change after S. Enteritidis infection of newly hatched chickens [21,22]. Some of them can be induced by S. Enteritidis infection even in 42-day-old chickens [21], although our subsequent study indicated that induction of these genes in 42-dayold chickens might not be as reliable as we initially expected [23]. In this study we therefore first characterized the response of chicken macrophage cell line HD11 to infection with wild-type S. Enteritidis and aroa, phop, SPI1 and SPI2 mutants, as macrophages are considered to play a key role in the immune response to Salmonella infection. In the second part of this study we performed in vivo experiments and compared the type of immunity induced by oral inoculation of newly hatched chickens with wild-type S. Enteritidis and its mutants. We found out that the SPI1 or phop mutants stimulated protective immunity without inducing inflammation and immunoglobulin production in vivo in the chicken cecum. aroa or SPI2 mutants also induced protective immunity, however, inoculation of chickens with these mutants resulted in moderate inflammation and antibody production. Materials and methods Bacterial strains and in vitro testing in HD11 cells S. Enteritidis 147 spontaneously resistant to nalidixic acid with a proven virulence in chickens and mice [6,24] was used in this study. All isogenic mutants had been constructed earlier and are listed in Table 1. Chicken macrophage-like cell line HD11 was cultured at 37 C under 5% CO 2 atmosphere in RPMI-1640 (Sigma). Bacteria were grown statically in LB broth at 37 C for 18 h. This culture was diluted 800 in LB broth and incubated for an additional 3 h at 37 C to obtain bacteria in the late logarithmic growth-phase of a highly invasive phenotype. Prior to infection of HD11, the bacteria were pelleted by centrifugation (10 min at 6500 g) and resuspended in PBS to OD = 0.3. HD11 cells were infected with S. Enteritidis or its mutants at a multiplicity of infection equal to 1 for 1 h. Free bacteria were then washed away and gentamicin was added to fresh RPMI medium (100 μg/ml) to kill any remaining extracellular bacteria. One hour later, the medium was replaced with fresh medium containing 15 μg/ml gentamicin to prevent multiplication of extracellular bacteria that were eventually released during culture from dead cells. Two and 22 h later, i.e. 4 and 24 h after the infection of HD11 cells, the appropriate number of wells were either lysed with 1% Triton X-100 to release intracellular bacteria or treated with TRI Reagent for RNA purification (see below). Serial decimal dilutions were plated on LB agar plates to count released bacteria. The whole experiment was performed in duplicates on two independent occasions. In vivo experimental design and sample collection Male ISA Brown chickens (Hendrix Genetics, the Netherlands) were obtained from a local commercial hatchery on day of hatch. Chickens were reared in perforated plastic boxes with free access to water and feed. Each experimental or control group was kept in a separate room. In the first experiment, 4 newly hatched chickens per groupwereorallyinoculated with 0.1 ml of wild-type S. Enteritidis 147 and SPI1, SPI2, aroa or phop mutants. Infectious dose was approx CFU and infected chickens were euthanized 4 days post infection (dpi). The control group consisted of 4 non-infected chickens euthanized on day 5 of life. During necropsy, approx. 30 mg of the cecum was collected from each chicken, placed into RNALater (Qiagen) and kept at 70 C prior to RNA isolation. Table 1 Salmonella Enteritidis strains used in the study Strain Resistance 1 Reference S. Enteritidis 147 Nal [6] S. Enteritidis 147 ΔSPI1 Nal [6] S. Enteritidis 147 ΔSPI2 Nal [6] S. Enteritidis 147 ΔaroA::Cm Nal, Cm [9] S. Enteritidis 147 ΔphoP::Cm Cm [46] 1 Nal, nalidixic acid; Cm, chloramphenicol.

95 Elsheimer-Matulova et al. Veterinary Research (2015) 46:96 Page 3 of 12 In the second experiment, 4 chickens were orally infected on day of hatch (day 1), on day 22 or day 43 of life with approx CFU of S. Enteritidis 147. Infected chickens were euthanized 4 dpi. Four age-matched noninfected control chickens were also included. During necropsy, cecum samples were collected into RNALater and kept at 70 C. In the third experiment, 6 chickens per group were orally inoculated with wild-type S. Enteritidis 147 and SPI1, SPI2, aroa or phop mutants on day 1 of life, orally challenged with 10 8 CFU of the wild-type S. Enteritidis on day 22, and euthanized 4 days later. Six age-matched, noninfected control chickens and 6 non-inoculated but challenged chickens were also included in this experiment. In the last experiment we verified results from the first and third experiment. Sixteen chickens per group were orally inoculated with wild-type S. Enteritidis 147 and SPI1, SPI2, aroa or phop mutants on day 1 of life. Six chickens from each group were euthanized 4 days post inoculation, another six chickens from each group were euthanized prior to challenge on day 22 of life. The remaining chickens were challenged on day 22 of life and euthanized 4 days post challenge. Non-infected control chickens sacrificed on day 5 and 26 of life (4 chickens per each time point), and 4 non-inoculated chickens challenged on day 22 of life and sacrificed 4 days later were included as well. Since the same experimental set up was used in the experiments 1, 3 and 4, data from these are combined in all figures or tables as appropriate. All animal treatment and handling was performed in accordance with the current Czech legislation (Animal protection and welfare Act No. 246/1992 Coll. of the Government of the Czech Republic) and has been approved by the Ethics Committee for Animal Welfare of the Ministry of Agriculture of the Czech Republic (permit number MZe 1226). Bacteriology Approx. 0.5 g of liver tissue and cecal content was collected from chickens during necropsy performed after all experiments. The samples were homogenized in peptone water, tenfold serially diluted and plated on XLD agar plates (HiMedia) supplemented with nalidixic acid, or Brilliant Green Agar (Oxoid) supplemented with chloramphenicol in the case of the phop mutant. Detection limit of direct plating was 500 CFU/g of sample. Samples negative after direct plating were subjected to enrichment in modified semi-solid Rappaport-Vassiliadis medium (Oxoid) for qualitative S. Enteritidis counts determination. Counts of S. Enteritidis found positive after direct plating were logarithmically transformed. Samples found positive only after enrichment were assigned a value of 1 and negative samples were assigned a value of 0. RNA purification, reverse transcription and quantitative RT-PCR Cecal samples were recovered from RNALater storage, mixed with 1 ml TRI Reagent (MRC) and homogenized with MagNALyzer (Roche). Fifty μl of bromoanisole was added to the homogenate and after centrifugation for 15 min at g, the upper phase containing RNA was collected and purified with RNeasy Mini Kit (Qiagen). The concentration and purity of RNA was determined spectrophotometrically (Nanodrop, Thermo Scientific). One μg of RNA was immediately reverse transcribed into cdna using M-MLV reverse transcriptase (Invitrogen) and oligo(dt) primers. Following the reverse transcription, the cdna was diluted 10 with sterile water and stored at 20 C prior to quantitative real-time PCR. Mucosal immune response was characterized by realtime PCR based on the expression of 36 genes identified earlier [21,22]. Primers for the quantification of gene expression by real-time PCR are listed in Additional file 1. Real-time PCR was performed in 3 μl volumes in 384- well microplates using QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix (Qiagen) and Nanodrop II Stage pipetting station (Innovadyne) for PCR mix dispensing. The amplification and signal detection were performed using a LightCycler II (Roche) with an initial denaturation at 95 C for 15 min followed by 40 cycles of 95 C for 20 s, 60 C for 30 s and 72 C for 30 s. Each sample was subjected to real-time PCR in a duplicate and the mean Ct value of duplicates was used for subsequent calculations. The Ct values of the genes of interest were normalized (ΔCt) to an average Ct value of three house-keeping genes, i.e. glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), TATA box binding protein (TBP) and ubiquitin (UB). The relative expression of each gene of interest was then calculated as 2 ΔCt. Statistical analyses Salmonella counts in HD11 cells, chicken tissues and gene expression data from real-time PCR were analyzed with ANOVA test followed by post hoc Tukey s multiple comparison test. P values 0.05 were considered as significant. Heat maps were constructed in R using gplots package with values standardized to row Z-scores. Experimental groups in heat maps were reordered according to column means. Results Infection of HD11 cells First we tested whether the mutants and wild-type S. Enteritidis will differently interact with chicken macrophage-like cell line in vitro being aware that the interaction with HD11 cell line may not directly correlate with the interaction of the strain with chicken immune system in vivo.

96 Elsheimer-Matulova et al. Veterinary Research (2015) 46:96 Page 4 of 12 SPI1, aroa and phop mutants were present at lower intracellular counts than the wild-type S. Enteritidis or the SPI2 mutant 4 h post infection (Figure 1) but none of the comparisons reached statistical significance. Twenty four hours post infection, intracellular counts of the wild-type strain and the mutants decreased 3 to 5 fold. When gene expression was determined, 14 genes out of 36 tested were considered as not expressed in HD11 cells as their relative expression was lower than 0.05, i.e. their expression did not reach 5% of the expression of the house-keeping genes (data not shown). Genes such as TRAP6, AH221, STAT3, C3, ASL2, STAT1, EPSTI1, IFIT5, RSFR, MPEG1, ITGLB2 and HCLS1 were expressed in HD11 cells but though inducible in the chicken cecum following S. Enteritidis infection [22], these were not induced HD11 macrophages in response to S. Enteritidis infection. Instead, RSFR, MPEG1, ITGLB2 and HCLS1 were suppressed in HD11 cells 24 h after infection with wild type S. Enteritidis. These genes were usually suppressed also after infection with the SPI2, phop and aroa mutants but not with the SPI1 mutant (Figure 2). The last group of genes included IL-1β, CXCLi2(IL-8), AVD, IRG1, inos, ExFABP, TGM4 and SAA whose expression in HD11 cells increased after the infection with S. Enteritidis (Figure 2). IL-1β, CXCLi2 (IL-8), AVD, IRG1 and inos were induced by all the strains and at both time points. Significant induction was less frequent for ExFABP, TGM4 and SAA due to their lower induction rate in comparison to IL-1β, CXCLi2 (IL-8), AVD, IRG1 and inos. However, the only strain which never significantly induced ExFABP, TGM4 and SAA in HD11 macrophage cell line was the SPI1 mutant (Figure 2). Chicken response to inoculation with SPI1, SPI2, phop and aroa mutants of S. Enteritidis As there were differences in the gene expression response of HD11 macrophages to the infection with different mutants, in the next experiment we tested whether chickens would also recognize and respond differently to inoculation with 4 different mutants and wild-type S. Enteritidis. Four days after the inoculation, SPI1, SPI2, phop and aroa mutants colonized the cecum similarly as wild-type S. Enteritidis and Salmonella counts in the cecum in all inoculated groups were around 10 8 CFU/g (Figure 3). However, systemic spread of all 4 mutants was limited as their counts in the liver were significantly lower than that of the wild-type strain (Figure 3). Although S. Enteritidis counts in the cecum and liver of the chickens inoculated with different mutants did not indicate any difference in their residual virulence, differences were observed in the gene expression in the cecum. Except for MUC2L, IFIT5, LYG2, Ig λ light chain, EPSTI1 and STAT1, expression of the remaining genes was always numerically the highest in chickens infected with wild-type S. Enteritidis (Figure 4). Expression of MUC2L, IFIT5, LYG2, Ig λ light chain, EPSTI1 and STAT1 was the highest in chickens inoculated with either aroa or SPI2 mutant. In addition, SPI2 and aroa mutants induced 18 and 27 genes of the 36 tested in inoculated chickens, respectively. On the other hand, not a single gene out of those tested was significantly upregulated after inoculation of the chickens with the SPI1 and phop mutants and the chickens inoculated with these mutants clustered with the non-inoculated control group (Figure 4). SPI1 and phop mutants therefore did not stimulate an inflammatory response in inoculated chickens, SPI2 and aroa mutants stimulated moderate response and the highest response was induced by the wild-type S. Enteritidis. Figure 1 Invasion and intracellular survival of the wild-type S. Enteritidis and its mutants in HD11 cells. HD11 cells were inoculated with approx CFU S. Enteritidis wild-type or the SPI1, SPI2, aroa or phop mutant (MOI = 1). Four and 24 h post infection, intracellular bacterial counts were determined. Bars represent mean and SD. Responsiveness of chickens of different ages to S. Enteritidis infection In the next experiment we determined resistance of differently aged chickens to S. Enteritidis infection. Salmonella counts in the liver of chickens infected on day 1 were significantly higher than in chickens infected on day 22 (Figure 5). On the other hand, differences in counts of S. Enteritidis in the liver and cecum of chickens infected on day 22 and 43 did not reach statistical significance. When immune response was determined in the cecum, the infection of newly hatched chickens with S. Enteritidis led to a significantly increased expression of all tested genes with matrix metalloproteinase 7 (MMP7) being upregulated nearly An additional 21 genes were induced more than 10 (Table 2). In 22-day-old chickens, 33 out of 36 tested genes were significantly upregulated.

97 Elsheimer-Matulova et al. Veterinary Research (2015) 46:96 Page 5 of 12 Figure 2 Expression of genes in HD11 cells inoculated with wild-type S. Enteritidis and its mutants. The SPI1 mutant stimulated a different response in HD11 cell line than the remaining strains or mutants. Panels in green, genes suppressed by S. Enteritidis infection 24 hours post infection (hpi). Panels in red, genes induced by S. Enteritidis infection. Bars represent expression normalized to the average expression of 3 house-keeping genes. * - statistically significant difference from the expression in the non-infected cells at P MMP7 was induced 139 (although not significantly due to a high variation among individual chickens) and 8 other genes (IL-22, ExFABP, IRG1, ES1, SAA, IL-17, MRP126 and AVD) were upregulated more than 10. Infection of 43-day-old chickens led to a significant upregulation of 22 genes (Table 2). Since 22-day-old chickens were more responsive to S. Enteritidis infection than 43-day-old chickens, 22-day-old chickens were selected for the comparison of the immune response of naive and inoculated chickens in the following experiment. Response of chickens inoculated with SPI1, SPI2, phop and aroa mutants to challenge with wild-type S. Enteritidis In the last experiment we addressed whether the inoculation of newly hatched chickens with the mutants would also result in a different interaction with the wildtype S. Enteritidis after challenge. First we checked the colonization of 22-day-old chickens by strains used for initial inoculation. Except for 2 or 3 chickens inoculated with the SPI2 and aroa mutant, respectively, all the remaining chickens were free of S. Enteritidis in the liver. However, all the chickens, irrespective of the strain used for the inoculation on day 1 of life, were still positive for S. Enteritidis in the cecum (Figure 3). Four days after the challenge, S. Enteritidis counts in the cecum of chickens originally inoculated with the SPI1, SPI2 and aroa mutant did not significantly differ from the counts in chickens which were infected with wild-type S. Enteritidis on day of hatch and re-infected on day 22, or which were infected only on day 22 of life (Figure 3). Only phop-inoculated chickens were significantly protected against wild-type S. Enteritidis challenge since S. Enteritidis counts in the vaccinated birds were significantly lower than in the non-vaccinated controls. Differences in Salmonella counts in the liver were only of numerical value which did not reach statistical significance, in this case including the group inoculated with the phop mutant (Figure 3). However, there were clear differences when chicken gene expression profiles were compared. During the challenge experiment at 22 days of age, the responses induced by challenge with S. Enteritidis in birds preexposed to the mutants or the wild type S. Enteritidis were different to those birds challenged for the first time. Except for all immunoglobulin coding genes,

98 Elsheimer-Matulova et al. Veterinary Research (2015) 46:96 Page 6 of 12 Figure 3 Salmonella counts in organs of chickens inoculated with wild-type S. Enteritidis and its mutants. Chickens were inoculated on day of hatch with SPI1, SPI2, phop and aroa S. Enteritidis mutants and challenged on day 22 of life. The data represent individual values and median CFU/g tissue. Asterisks indicate statistically significant differences from chickens inoculated with wild-type S. Enteritidis at P 0.05 (*). Non-vaccinated chickens infected on day 22 of life are designated as nv. Some values from the chicken cecum are missing due to an overgrowth of plates with non-salmonella microbiota resistant to nalidixic acid. MPEG1, TGM4, MUC2L, ITGB2, HCLS1, RSFR and C3, the naive chickens infected with the wild type S. Enteritidis for the first time expressed the majority of the tested genes at high levels (Figure 6). The second group was formed by chickens inoculated on day 1 with the wild-type S. Enteritidis and re-infected on day 22. All immunoglobulin coding genes, MPEG1, TGM4, MUC2L, ITGB2, HCLS1, RSFR, C3, STAT1, IFNγ and ASL2 were expressed the most in chickens belonging to this group (Figure 6). The third group was formed by chickens inoculated with the SPI2 or aroa mutant and challenged with the wild-type S. Enteritidis (Figure 6). Response of chickens vaccinated with the SPI2 or aroa mutant resulted in a significant upregulation of 13 or 11 genes, respectively, with IRG1, ExFABP, MRP126 (calprotectin), HCLS1, IgY, IgA and Ig λ chain being significantly induced in both groups (Figure 6). The last group consisted of chickens inoculated with the SPI1 or phop mutant and challenged with the wildtype S. Enteritidis. These were both protected against the challenge as not a single gene was significantly induced after the challenge with the wild-type and these chickens therefore clustered with non-infected controls (Figure 6). Discussion In this study we found out that 4 tested mutants and the wild-type S. Enteritidis were differently recognized and processed by HD11 macrophage cell line and the chicken immune system in general. HD11 macrophages responded to the infection with the wild type S. Enteritidis and SPI2, phop and aroa mutants by an increase in transcription of inflammatory genes such as IL-1β, CXCLi2 (IL-8), ExFABP, AVD, IRG1 or inos. Repeatedly lower induction of these genes was observed in

99 Elsheimer-Matulova et al. Veterinary Research (2015) 46:96 Page 7 of 12 Figure 4 Gene expression in chickens inoculated with wild-type S. Enteritidis and its mutants. Chickens were infected on day of hatch with wild-type S. Enteritidis or SPI1, SPI2, phop and aroa mutants, and euthanized 4 days later. Heat map shows average gene expression in groups of chickens. Asterisks indicate statistically significant difference from the expression in the non-infected chickens at P 0.05 (*), P 0.01 (**), or P (***). Maximal fold increase is shown to highlight the differences between the green and red color range for each of the genes. Minimal and maximal expression levels are shown to remind that higher fold inductions are more frequent for genes with a lower basal expression. HD11 cells infected with the SPI1 mutant. This was in contradiction with the high inflammatory signaling of porcine alveolar macrophages infected with the SPI1 mutant when compared with those infected with the wild-type S. Enteritidis [25]. The likely explanation is the different origin of the cell, primary porcine macrophages and cell line in the case of HD11 chicken macrophages. Behavior of HD11 macrophages was therefore dependent on SPI1-dependent invasion with the invasion deficient SPI1 mutant inducing the lowest inflammatory signaling. Inoculation of newly hatched chickens with the SPI1 and also phop mutant did not result in inflammation, which corresponds with our previous observations on vaccination with the SPI1 mutant [13]. Although the chickens at the time of challenge were still positive for the mutants used for inoculation on day 1 of life, we believe that this did not negatively affect results as it has been shown that inflammatory response decreases in chickens between the 2 nd and 3 rd week of life [22]. The fact that we did not record extensive differences in bacterial counts after challenge in different groups was likely due to an early time point for analysis, i.e. 4 days post infection. Moreover, since we did not discriminate between the counts of vaccine and challenge strains, especially the counts in the cecum have to be taken with a certain care since these could be a mixture of vaccine and challenge strains. Despite this, immune responses to challenge were quite different across all groups. Chickens inoculated with the SPI1 or phop mutant were resistant to the wild-type S. Enteritidis challenge as this did not trigger any inflammatory response at 4 days post challenge (Figure 6). Antibody production was stimulated in the chickens inoculated with SPI2 and aroa mutants and challenged with the wild-type, similarly, though to

100 Elsheimer-Matulova et al. Veterinary Research (2015) 46:96 Page 8 of 12 Figure 5 Salmonella counts in organs of chickens infected with wild-type S. Enteritidis at different ages. Chickens were infected with wild-type S. Enteritidis on day 1, 22 or 43 of life and euthanized 4 days later. The data represent individual values and median CFU/g tissue. Asterisks indicate statistically significant difference from Salmonella counts in 5-day-old chickens 4 days post infection at P 0.05 (*). a lesser extent, to chickens inoculated twice with the wild-type S. Enteritidis. Recently we documented that vaccination with the SPI2 mutant resulted in a higher antibody production determined by ELISA than vaccination with the SPI1 mutant [13]. However, it should be reminded that in all the experiments we used a single time point for analysis of immune response. We therefore cannot exclude a similar response to vaccination or challenge with different dynamics, i.e. we cannot exclude an earlier or delayed response of the chickens to the vaccination or challenge with different mutants or wild type S. Enteritidis. The comparative approach used in this study also allowed us to address the function of individual genes involved in the chicken response to S. Enteritidis infection. Cluster I in Figure 6 represents genes of early response that are highly inducible in response to S. Enteritidis especially in non-protected chickens. These genes include ES1, IFIT5, EPSTI1, LYG2 and MMP7 expressed in cells of non-leukocyte origin [26-31], IRG1, AVD, ExFABP, SAA, IL-1β and TRAP6 expressed in macrophages and heterophils [21,32], CXCLi2 (IL-8) produced by both intestinal epithelial cells and phagocytes [33-35], and IL-17 and IL- 22 expressed in T-lymphocytes [33]. Most of these genes were reported to be induced also after infections with other pathogens [36-39]. These genes can be therefore understood as being involved in the innate immune response and can be used as sensitive markers for gut inflammation in chickens. The second cluster of genes was formed by IFNγ and AH221, inos, ASL2, STAT1 and TAP1 (Figure 6). These genes were expressed to a similar extent in chickens infected twice with the wild-type S. Enteritidis and in chickens infected with S. Enteritidis for the first time at the age of 22 days. However, significant induction was recorded only in re-infected chickens. Except for IFNγ produced by T-lymphocytes and NK cells, all these genes are characteristic of macrophages [21], and represent common markers of Th1 immune response characterized by NO radical production and arginine/ornithine recycling by ASL2 [40]. Group III included all 4 immunoglobulin encoding genes, MUC2L, ITGB2, HCLS1, RSFR, TGM4, MPEG1 and C3 (Figure 4). Similarly to immunoglobulins, TGM4, ITGB2 (CD18) and HCLS1 are expressed by B- lymphocytes, with ITGB2 and HCLS1 being also expressed by other hematopoietic cells [21,41-43]. All these genes were significantly induced in 22-day-old chickens only after repeated Salmonella infection. Some of these genes were induced also in the chickens inoculated with the aroa and SPI2 mutants. These genes are associated with B-lymphocyte differentiation and consequently with specific immune response and antibody production [44,45]. However, the results following the inoculation with phop and SPI1 mutants were the most surprising. One would expect that if these mutants did not induce at least moderate inflammation as did the SPI2 or aroa mutant, specific immunity could not develop and challenged chickens should respond as the naive controls, which was not the case. The reason for the different development of specific immunity is not known. However, it is possible that due to a decreased ability to invade intestinal epithelial cells, S. Enteritidis SPI1 mutant should be present mainly in professional phagocytes and antigen presenting cells without being able to cause their

101 Elsheimer-Matulova et al. Veterinary Research (2015) 46:96 Page 9 of 12 Table 2 Age-dependent responsiveness of chickens to S. Enteritidis infection Function/gene Description Fold increase in chickens* day 1 day 21 day 42 Cytokines IL-1β interleukin ± 14.4 $ 2.6 ± ± 3.8 CXCLi2 (IL-8 L2) interleukin ± ± ± 4.5 IL-17 interleukin ± ± ± 10.3 IL-22 interleukin ± ± ± 9.8 IFNγ interferon gamma 20.1 ± ± ± 1.7 AH221 chemokine AH221 (CCLi9) 36.8 ± ± ± 2.5 Immunoglobulins IgM immunoglobulin M heavy chain, C-region 25.8 ± ± ± 0.9 IgY imunoglobulin Y heavy chain, C-region 44.9 ± ± ± 0.3 IgA imunoglobulin A heavy chain, C-region 19.3 ± ± ± 0.4 Ig λ immunoglobulin lambda light chain, C-region 25.1 ± ± ± 0.2 Other immune response proteins IRG1 immune responsive gene ± ± ± 20.0 inos inducible NO synthase 58.1 ± ± ± 19.7 MRP126 MRP-126 (S100A9, calprotectin, calgranulin B) 33.0 ± ± ± 11.3 PTGDS prostaglandin D2 synthase 21 kda (brain) 11.9 ± ± ± 5.5 C3 complement ± ± ± 1.0 IFIT5 interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats ± ± ± 5.1 ASL2 argininosuccinate lyase 4.5 ± ± ± 1.2 MPEG1 macrophage-expressed gene 1 protein-like 4.0 ± ± ± 0.9 ITGB2 integrin beta-2 precursor 6.6 ± ± ± 1.0 TAP1 transporter 1, ATP-binding cassette, sub-family B 5.0 ± ± ± 1.4 STAT1 signal transducer and activator of transcription ± ± ± 1.2 STAT3 signal transducer and activator of transcription ± ± ± 0.6 Acute phase response SAA serum amyloid A ± ± ± 22.8 AVD avidin 27.0 ± ± ± 5.9 HPX hemopexin 7.0 ± ± ± 1.5 Mucosal defense MMP7 matrix metallopeptidase 7 (matrilysin, uterine) ± ± ± 11.4 ExFABP extracellular fatty-acid binding protein (P20K, LCN8) ± ± ± 10.1 TRAP6 trappin ± ± ± 10.0 LYG2 lysozyme g-like ± ± ± 8.6 MUC2L mucin-2-like 3.5 ± ± ± 1.5 Hematopoiesis, angiogenesis SERPINB10 serpin peptidase inhibitor, clade B (ovalbumin), member ± ± ± 6.3 HCLS1 hematopoietic lineage cell-specific protein ± ± ± 0.8 RSFR leucocyte ribonuclease A-2, angiogenin 7.5 ± ± ± 0.9 Other TGM4 glutamine γ-glutamyltransferase ± ± ± 13.9 ES1 ES1 protein homolog 21.4 ± ± ± 13.0 EPSTI1 epithelial stromal interaction 1 (breast) 3.6 ± ± ± 0.8 *Chickens were infected on day 1, 21 or 42 with S. Enteritidis and euthanized 4 days after the infection. The table presents a fold increase in gene expression after the infection with 95% confidence interval. $ Values in bold indicate significant difference from the expression in age-matched non-infected control chickens.

102 Elsheimer-Matulova et al. Veterinary Research (2015) 46:96 Page 10 of 12 Figure 6 Gene expression in inoculated chickens 4 days after challenge with wild-type S. Enteritidis. Chickens were inoculated on day of hatch with SPI1, SPI2, phop and aroa S. Enteritidis mutants, challenged on day 22 of life and euthanized 4 days later. Heat map shows average gene expression in groups of chickens. Group I of genes represents genes belonging mainly to innate immune response, group II genes belonging to Th1 cell mediated immune response and group III is mainly associated with B-lymphocyte development and antibody production. Asterisks indicate statistically significant difference from the non-infected chickens at P 0.05 (*), P 0.01 (**) or P (***). Maximal fold increase is shown to highlight the differences between the green and red color range for each of the gene. Minimal and maximal expression levels are shown to remind that higher fold inductions are more frequent for genes with a lower basal expression. apoptosis [24,25]. Similarly, phop mutant exhibits increased intracellular replication without causing cell death [18]. It is therefore tempting to speculate that if the whole tissue is inflamed, immune response is polarized towards Th2 response and antibody production. On the other hand, if cells present in the cecal tissue are not stimulated for inflammatory signaling, the immune system is then polarized towards cell-mediated response. Although the above mentioned hypothesis will have to be proven experimentally, it can be concluded that phop, aroa, SPI1 and SPI2 mutants were recognized and processed differently by the chicken immune system which might help in developing vaccines against either systemic or gut infection. Additional file Additional file 1: List of primers used in real-time PCR. Primers used for the quantification of chicken gene expression by real time PCR are listed in this file. Competing interests The authors declare that they have no competing interests. Authors contributions IR conceived and designed the study. MEM and KV carried out sample collection and real-time PCR. KK performed cell culture infections. MMR participated in real-time PCR. HH performed bacteriology. FS carried out animal experiments. MEM coordinated experiments, analyzed and interpreted the data. IR and MEM wrote the manuscript. All authors read and approved the final version of the manuscript.

103 Elsheimer-Matulova et al. Veterinary Research (2015) 46:96 Page 11 of 12 Acknowledgements We would like to thank Lee Clayton Elsheimer for language corrections. This work has been supported by projects QJ and MZE of the Czech Ministry of Agriculture, and AdmireVet project CZ.1.05/2.1.00/ ED0006/01/01 from the Czech Ministry of Education. Received: 28 July 2014 Accepted: 20 August 2015 References 1. Majowicz SE, Musto J, Scallan E, Angulo FJ, Kirk M, O Brien SJ, Jones TF, Fayil A, Hoekstra RM (2010) The global burden of nontyphoidal Salmonella gastroenteritis. Clin Infect Dis 50: Hoiseth SK, Stocker BAD (1981) Aromatic-dependent Salmonella typhimurium are non-virulent and effective as live vaccines. Nature 291: Galan JE, Curtiss R III (1989) Virulence and vaccine potential of phop mutants of Salmonella typhimurium. Microb Pathog 6: Khan SA, Stratford R, Wu T, McKelvie N, Bellaby T, Hindle Z, Sinha KA, Eltze S, Mastroeni P, Pickard D, Dougan G, Chatfield SN, Brennan FR (2003) Salmonella typhi and S. typhimurium derivatives harbouring deletions in aromatic biosynthesis and Salmonella Pathogenicity Island-2 (SPI-2) genes as vaccines and vectors. Vaccine 21: Bohez L, Ducatelle R, Pasmans F, Haesebrouck F, Van Immerseel F (2007) Long-term colonisation-inhibition studies to protect broilers against colonisation with Salmonella Enteritidis, using Salmonella Pathogenicity Island 1 and 2 mutants. Vaccine 25: Rychlik I, Karasova D, Sebkova A, Volf J, Sisak F, Havlickova H, Kummer V, Imre A, Szmolka A, Nagy B (2009) Virulence potential of five major pathogenicity islands (SPI-1 to SPI-5) of Salmonella enterica serovar Enteritidis for chickens. BMC Microbiol 9: Hohmann EL, Oletta CA, Killeen KP, Miller SI (1996) phop/phoq-deleted Salmonella typhi (Ty800) is a safe and immunogenic single-dose typhoid fever vaccine in volunteers. J Infect Dis 173: Raupach B, Kaufmann SHE (2001) Bacterial virulence, proinflammatory cytokines and host immunity: how to choose the appropriate Salmonella vaccine strain? Microb Infect 3: Sebkova A, Karasova D, Crhanova M, Budinska E, Rychlik I (2008) aroa mutations in Salmonella enterica cause defects in cell wall and outer membrane integrity. J Bacteriol 190: Fields PI, Groisman EA, Heffron F (1989) Salmonella locus that controls resistance to microbicidal proteins from phagocytic cells. Science 243: Bader MW, Navarre WW, Shiau W, Nikaido H, Frye JG, McClelland M, Fang FC, Miller SI (2003) Regulation of Salmonella typhimurium virulence gene expression by cationic antimicrobial peptides. Mol Microbiol 50: Nunez-Hernandez C, Tierrez A, Ortega AD, Pucciarelli MG, Godoy M, Eisman B, Casadesus J, Garcia-del Portillo F (2013) Genome expression analysis of nonproliferating intracellular Salmonella enterica serovar Typhimurium unravels an acid ph-dependent PhoP-PhoQ response essential for dormancy. Infect Immun 81: Matulova M, Havlickova H, Sisak S, Rychlik I (2012) Vaccination of chickens with Salmonella Pathogenicity Island (SPI) 1 and SPI2 defective mutants of Salmonella enterica serovar Enteritidis. Vaccine 30: Galan JE (1999) Interaction of Salmonella with host cells through the centisome 63 type III secretion system. Curr Opin Microbiol 2: Ochman H, Soncini FC, Solomon F, Groisman EA (1996) Identification of a pathogenicity island required for Salmonella survival in host cells. Proc Natl Acad Sci U S A 93: Cirillo DM, Valdivia RH, Monack DM, Falkow S (1998) Macrophagedependent induction of the Salmonella pathogenicity island 2 type III secretion system and its role in intracellular survival. Mol Microbiol 30: Hensel M, Shea JE, Waterman SR, Mundy R, Nikolaus T, Banks G, Vazquez-Torres A, Gleeson C, Fang FC, Holden DW (1998) Genes encoding putative effector proteins of the type III secretion system of Salmonella pathogenicity island 2 are required for bacterial virulence and proliferation in macrophages. Mol Microbiol 30: Lundberg U, Vinatzer U, Berdnik D, von Gabain A, Baccarini M (1999) Growth phase-regulated induction of Salmonella-induced macrophage apoptosis correlates with transient expression of SPI-1 genes. J Bacteriol 181: Hersh D, Monac DM, Smith MR, Ghori N, Falkow S, Zychlinsky A (1999) The Salmonella invasin SipB induces macrophages apoptosis by binding to caspase-1. Proc Natl Acad Sci U S A 96: Beal RK, Wigley P, Powers C, Hulme SD, Barrow PA, Smith AL (2004) Age at primary infection with Salmonella enterica serovar Typhimurium in the chicken influences persistence of infection and subsequent immunity to re-challenge. Vet Immunol Immunopathol 100: Matulova M, Rajova J, Vlasatikova L, Volf J, Stepanova H, Havlickova H, Sisak F, Rychlik I (2012) Characterization of chicken spleen transcriptome after infection with Salmonella enterica serovar Enteritidis. PLoS One 7:e Matulova M, Varmuzova K, Sisak F, Havlickova H, Babak V, Stejskal K, Zdrahal Z, Rychlik I (2013) Chicken innate immune response to oral infection with Salmonella enterica serovar Enteritidis. Vet Res 44: Matulova M, Havlickova H, Sisak F, Babak V, Rychlik I (2013) SPI1 defective mutants of Salmonella enterica induce cross-protective immunity in chickens against challenge with serovars Typhimurium and Enteritidis. Vaccine 31: Karasova D, Sebkova A, Havlickova H, Sisak F, Volf J, Faldyna M, Ondrackova PV, Kummer V, Rychlik I (2010) Influence of 5 major Salmonella pathogenicity islands on NK cell depletion in mice infected with Salmonella enterica serovar Enteritidis. BMC Microbiol 10: Pavlova B, Volf J, Ondrackova P, Matiasovic J, Stepanova H, Crhanova M, Karasova D, Faldyna M, Rychlik I (2011) SPI-1-encoded type III secretion system of Salmonella enterica is required for the suppression of porcine alveolar macrophage cytokine expression. Vet Res 42: Shin JH, Weitzdoerfer R, Fountoulakis M, Lubec G (2004) Expression of cystathionine β-synthase, pyridoxal kinase, and ES1 protein homolog (mitochondrial precursor) in fetal Down syndrome brain. Neurochem Int 45: Katibah GE, Lee HJ, Huizar JP, Vogan JM, Alber T, Collins K (2013) trna Binding, structure, and localization of the human interferon-induced protein IFIT5. Mol Cell 49: Ovstebo R, Olstad OK, Brusletto B, Moller AS, Aase A, Haug KB, Brandtzaeg P, Kierulf P (2008) Identification of genes particularly sensitive to lipopolysaccharide (LPS) in human monocytes induced by wild-type versus LPS-deficient Neisseria meningitidis strains. Infect Immun 76: de Neergaard M, Kim J, Villadsen R, Fridriksdottir AJ, Rank F, Timmermans-Wielenga V, Langerod A, Borrensen-Dale AL, Petersen OW, Rønnov-Jessen L (2010) Epithelial-Stromal Interaction 1 (EPSTI1) Substitutes for peritumoral fibroblasts in the tumor microenvironment. Am J Pathol 176: Scherer RL, VanSaun MN, McIntyre JO, Matrisian LM (2008) Optical imaging of matrix metalloproteinase-7 activity in vivo using a proteolytic nanobeacon. Mol Imaging 7: Nile CJ, Townes CL, Michailidis G, Hirst BH, Hall J (2004) Identification of chicken lysozyme g2 and its expression in the intestine. Cell Mol Life Sci 61: Desin B, Descalzi F, Briata L, Hayashi M, Gentili C, Hayashi K, Quarto R, Cancedda R (1992) Expression, regulation, and tissue distribution of the Ch21 protein during chicken embryogenesis. J Biol Chem 267: Matulova M, Stepanova H, Sisak F, Havlickova H, Faldynova M, Kyrova K, Volf J, Rychlik I (2012) Cytokine signaling in splenic leukocytes from vaccinated and non-vaccinated chickens after intravenous infection with Salmonella Enteritidis. PLoS One 7:e Salisbury AM, Bronowski C, Wigley P (2011) Salmonella Virchow isolates from human and avian origins in England molecular characterization and infection of epithelial cells and poultry. J Appl Microbiol 111: Kogut MH, Genovese KJ, He H, Kaiser P (2008) Flagellin and lipopolysaccharide up-regulation of IL-6 and CXCLi2 gene expression in chicken heterophils is mediated by ERK1/2-dependent activation of AP-1 and NF-kappa B signaling pathways. Innate Immun 14: Zhang B, Liu X, Chen W, Chen L (2013) IFIT5 potentiates anti-viral response through enhancing innate immune signaling pathways. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai) 45: Lopez-Boado YS, Wilson CL, Hooper LV, Gordon JI, Hultgren SJ, Parks WC (2000) Bacterial exposure induces and activates matrilysin in mucosal epithelial cells. J Cell Biol 148:

104 Elsheimer-Matulova et al. Veterinary Research (2015) 46:96 Page 12 of Basler T, Jeckstadt S, Valentin-Weigand P, Goethe R (2006) Mycobacterium paratuberculosis, Mycobacterium smegmatis, and lipopolysaccharide induce different transcriptional and post-transcriptional regulation of the IRG1 gene in murine macrophages. J Leukoc Biol 79: Kunnas TA, Wallen MJ, Kulomaa MS (1993) Induction of chicken avidin and related messenger-rnas after bacterial-infection. Biochem Biophys Acta 1216: Wu G, Morris SM Jr (1998) Arginine metabolism: nitric oxide and beyond. Biochem J 336: Tohma S, Hirohata S, Lipsky PE (1991) The role of CD11a/CD18-CD54 interactions in human T cell-dependent B cell activation. J Immunol 46: Kitamura D, Kaneko H, Miyagoe Y, Ariyasu T, Watanabe T (1989) Isolation and characterization of a novel human gene expressed specifically in the cells of hematopoietic lineage. Nucl Acids Res 17: Yamanashi Y, Okada M, Semba T, Yamori T, Umemori H, Tsunasawa S, Toyoshima K, Kitamura D, Watanabe T, Yamamoto T (1993) Identification of HS1 protein as a major substrate of protein-tyrosine kinase(s) upon B-cell antigen receptor-mediated signaling. Proc Natl Acad Sci U S A 90: Hao J, Carey GB, Zhan X (2004) Syk-mediated tyrosine phosphorylation is required for the association of hematopoietic lineage cell-specific protein 1 with lipid rafts and B cell antigen receptor signalosome complex. J Biol Chem 279: Taniuchi I, Kitamura D, Maekawa Y, Fukuda T, Kishi H, Watanabe T (1995) Antigen-receptor induced clonal expansion and deletion of lymphocytes are impaired in mice lacking HS1 protein, a substrate of the antigenreceptor-coupled tyrosine kinases. EMBO J 14: Karasova D, Sebkova A, Vrbas V, Havlickova H, Sisak F, Rychlik I (2009) Comparative analysis of Salmonella enterica serovar Enteritidis mutants with a vaccine potential. Vaccine 27: Submit your next manuscript to BioMed Central and take full advantage of: Convenient online submission Thorough peer review No space constraints or color figure charges Immediate publication on acceptance Inclusion in PubMed, CAS, Scopus and Google Scholar Research which is freely available for redistribution Submit your manuscript at

105 Příloha 4 Composition of gut microbiota influences resistance of newly hatched chickens to Salmonella Enteritidis infection Varmuzova K., Kubasova T., Davidova Gerzova L., Sisak F., Havlickova H., Sebkova A., Faldynova M., Rychlik I. (Frontiers in Microbiology, 2016)

106 ORIGINAL RESEARCH published: 17 June 2016 doi: /fmicb Composition of Gut Microbiota Influences Resistance of Newly Hatched Chickens to Salmonella Enteritidis Infection Karolina Varmuzova, Tereza Kubasova, Lenka Davidova-Gerzova, Frantisek Sisak, Hana Havlickova, Alena Sebkova, Marcela Faldynova and Ivan Rychlik* Veterinary Research Institute, Brno, Czech Republic Edited by: Jorge Blanco, University of Santiago de Compostela, Spain Reviewed by: John Elmerdahl Olsen, University of Copenhagen, Denmark Richard Ducatelle, Ghent University, Belgium *Correspondence: Ivan Rychlik Specialty section: This article was submitted to Infectious Diseases, a section of the journal Frontiers in Microbiology Received: 22 April 2016 Accepted: 02 June 2016 Published: 17 June 2016 Citation: Varmuzova K, Kubasova T, Davidova-Gerzova L, Sisak F, Havlickova H, Sebkova A, Faldynova M and Rychlik I (2016) Composition of Gut Microbiota Influences Resistance of Newly Hatched Chickens to Salmonella Enteritidis Infection. Front. Microbiol. 7:957. doi: /fmicb Since poultry is a very common source of non-typhoid Salmonella for humans, different interventions aimed at decreasing the prevalence of Salmonella in chickens are understood as an effective measure for decreasing the incidence of human salmonellosis. One such intervention is the use of probiotic or competitive exclusion products. In this study we tested whether microbiota from donor hens of different age will equally protect chickens against Salmonella Enteritidis infection. Newly hatched chickens were therefore orally inoculated with cecal extracts from 1-, 3-, 16-, 28-, and 42-week-old donors and 7 days later, the chickens were infected with S. Enteritidis. The experiment was terminated 4 days later. In the second experiment, groups of newly hatched chickens were inoculated with cecal extracts of 35-week-old hens either on day 1 of life followed by S. Enteritidis infection on day 2 or were infected with S. Enteritidis infection on day 1 followed by therapeutic administration of the cecal extract on day 2 or were inoculated on day 1 of life with a mixture of the cecal extract and S. Enteritidis. This experiment was terminated when the chickens were 5 days old. Both Salmonella culture and chicken gene expression confirmed that inoculation of newly hatched chickens with microbiota from 3-week-old or older chickens protected them against S. Enteritidis challenge. On the other hand, microbiota from 1-week-old donors failed to protect chickens against S. Enteritidis challenge. Microbiota from 35-weekold hens protected chickens even 24 h after administration. However, simultaneous or therapeutic microbiota administration failed to protect chickens against S. Enteritidis infection. Gut microbiota can be used as a preventive measure against S. Enteritidis infection but its composition and early administration is critical for its efficacy. Keywords: chicken, microbiota, Salmonella Enteritidis, cecum, inflammation, competitive exclusion INTRODUCTION Non-typhoid Salmonella enterica serovars are among the most common causative agents of foodborne diseases worldwide. Since poultry belongs among the most frequent reservoirs of Salmonella for humans, different interventions, such as strict hygiene measures or vaccination are applied to decrease Salmonella prevalence in chickens. However, further improvements in hygiene measures are costly. Current vaccination regimes effectively protect chickens against the same serovars as Frontiers in Microbiology 1 June 2016 Volume 7 Article 957

107 Varmuzova et al. Microbiota, Salmonella and chicken present in the vaccine, however, protection against heterologous serovars is a topic for debate (Cooper et al., 1994; Dueger et al., 2003; Gantois et al., 2006b; Matulova et al., 2013a). Moreover, due to the time necessary for the induction of protective immunity and elimination of the vaccine strain from the vaccinated chickens, the vaccination is nearly impossible to use in broilers. Therefore, cost-effective alternatives with a broad protective efficacy are being sought. One such alternative is to provide newly hatched chickens with beneficial microbiota since the current commercial poultry production system has eliminated any contact between hens and chickens. Chicks are hatched in a clean hatchery environment and egg surface cleaning and disinfection further minimize microbiota transfer, despite the fact that gut colonization of newly hatched chickens protects against Salmonella infection has been known for decades (Rantala and Nurmi, 1973; Wierup et al., 1988; Schneitz et al., 1991; Hofacre et al., 2002; Kerr et al., 2013; Milbradt et al., 2014). Chickens in commercial production are therefore colonized by microbiota present in the environment. The cecum is first colonized by representatives of Enterobacteriaceae, which are replaced by representatives of Lachnospiraceae and Ruminococcaceae in week 2 of life. From approximately week 5 of life, representatives of phylum Bacteroidetes can be detected in chicken cecal microbiota and a relatively stable microbiota composition is achieved at sexual maturity around week 18 of life (Videnska et al., 2014). Despite this, the cecum of newly hatched chickens can be colonized by microbiota of nearly any composition, given this is provided to the chickens (Polansky et al., 2016). The possibility to easily colonize the cecum of newly hatched chickens by different microbiota immediately raises the question whether microbiota of different composition will similarly protect chickens against Salmonella infection since there may be considerable differences in the metabolome of microbial communities of a different composition. It is commonly accepted that the production of short chain fatty acids, particularly butyrate, are critically important for energy metabolism in host epithelial cells (Fleming et al., 1991). In addition, butyrate also suppresses the expression of the cell invasion associated type III secretion system of Salmonella (Van Immerseel et al., 2003; Gantois et al., 2006a). Butyrate producers in the gut microbiota are commonly found in different representatives of Firmicutes which are underrepresented in the microbiota of chickens in the first week of life, dominant in young chickens 2 4 weeks of age and form around 50% of total microbiota in adult hens (Videnska et al., 2014; Polansky et al., 2016). This is why in this study we tested whether the microbiota of different composition from hens of different age would similarly protect chickens against Salmonella Enteritidis (S. Enteritidis) infection. We tested not only the prophylactic efficacy of gut microbiota administration but also therapeutic administration of cecal microbiota and found that microbiota was highly protective against S. Enteritidis infection if administered prophylactically but failed to protect chickens if administered therapeutically after S. Enteritidis infection. MATERIALS AND METHODS Ethical Statement The handling of animals in the study was performed in accordance with current Czech legislation (Animal Protection and Welfare Act 246/1992). The specific experiments were approved by the Ethics Committee of the Veterinary Research Institute followed by the Committee for Animal Welfare of the Ministry of Agriculture of the Czech Republic (permit number MZe 1480). Experimental Design In the first experiment we tested the resistance of chickens of increasing age to S. Enteritidis infection. Four newly hatched male ISA Brown chickens were infected with S. Enteritidis each on days 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 12, 16, 19 and 22, and sacrificed 4 days later. S. Enteritidis counts in the liver were determined as described below. In the second experiment, 90 newly hatched male ISA Brown chickens were divided into six groups. Chickens in group W1 were inoculated with cecal microbiota from 1-week-old donor chickens, group W3 was inoculated with microbiota from 3-week-old chickens, group W16 was inoculated with microbiota from 16-week-old hens, group W28 was inoculated with microbiota from 28-week-old hens and group W42 was inoculated with microbiota from 42-week-old hens. The last group included 15 non-colonized chickens (NC). All the recipient chickens were inoculated with cecal extracts on day 1 of life. On day 8 of life, three chickens from each group were sacrificed to check for microbiota composition. Of the remaining 12 chickens in each group, six chickens were infected with S. Enteritidis. Four days later, the experiment was terminated and all chickens were sacrificed. In the last experiment, 42 newly hatched chickens were divided into six groups. Group NC-NI included non-colonized and S. Enteritidis non-infected chickens. Group COL was inoculated on day 1 of life with cecal microbiota from three 35-week-old hens and remained uninfected with S. Enteritidis. Cecal extract from 35-week-old hens was used as that containing well-established and protective microbiota. Group INF was infected on day 1 of life with S. Enteritidis. Group INF+COL was infected with S. Enteritidis and inoculated with microbiota on day 1 of life. Group INF-COL was infected on day 1 with S. Enteritidis followed by inoculation with microbiota on day 2. Chickens in the group COL-INF were inoculated with microbiota on day 1 of life followed by S. Enteritidis infection on day 2 of life. The experiment was terminated when the chickens were 5 days old. In all experiments, male newly hatched ISA Brown chickens were obtained from a local commercial hatchery on the day of hatching. Chickens and hens used for collecting cecal microbiota were obtained from a local commercial egg laying hen farm. To prepare cecal extracts from donors for the inoculation of recipient chickens, approximately 0.5 g cecal content was collected and resuspended in 5 ml of PBS with 0.05% L-cysteine. After 5 min decanting, a mix of equal volumes Frontiers in Microbiology 2 June 2016 Volume 7 Article 957

108 Varmuzova et al. Microbiota, Salmonella and chicken of the extracts from the donors of the same age was formed and 0.1 ml of this mix was orally applied to newly hatched chickens. All experimental infections were performed orally with CFU S. Enteritidis 147 spontaneously resistant to nalidixic acid (Methner et al., 2004) with proven virulence for chickens and mice (Rychlik et al., 2009; Karasova et al., 2010). Chickens were reared in perforated plastic boxes with free access to water and feed and each experimental or control group was kept in a separate room. Chickens were sacrificed under chloroform anesthesia and during necropsy, 0.5 g liver or cecum was collected to enumerate S. Enteritidis. In addition, sections of cecal tissue were collected in RNALater (Qiagen) and stored at 80 C prior RNA purification. Finally, cecal contents were collected and frozen at 20 C for microbiota characterization. Enumeration of S. Enteritidis The samples were homogenized in peptone water, 10-fold serially diluted and plated on XLD agar supplemented with 20 µg/ml nalidixic acid. The detection limit of direct plating was 500 CFU/g of sample. Samples negative after direct plating were subjected to enrichment in modified semi-solid Rappaport- Vassiliadis medium for qualitative S. Enteritidis determination. Counts of S. Enteritidis found positive after direct plating were logarithmically transformed. Samples positive only after enrichment were assigned a value of 1 and negative samples were assigned a value of 0. Quantitative Reverse-Transcriptase PCR Cecal tissue samples collected from the middle part of each cecum were recovered from RNALater, mixed with 1 ml TRI Reagent (MRC) and homogenized with a MagNALyzer (Roche). Fifty µl of 4-bromoanisole (MRC) was added to the homogenate and after centrifugation for 15 min at 14, 000 g, the upper phase containing RNA was collected and purified with RNeasy Mini Kit (Qiagen). The concentration of RNA was determined spectrophotometrically (Nanodrop, Thermo Scientific) and 1 µg of RNA was immediately reverse transcribed into cdna using M-MLV reverse transcriptase (Invitrogen) and oligo(dt) primers. Following reverse transcription, the cdna was diluted 10 with sterile water and stored at 20 C prior to quantitative real-time PCR. The chicken response to microbiota colonization and S. Enteritidis infection was characterized by determining the expression of 24 different genes. Primer sequences for the quantification of gene expression by real-time PCR have been published previously (Crhanova et al., 2011; Matulova et al., 2012, 2013b). Real-time PCR was performed in 3 µl volumes in 384- well microplates using QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix (Qiagen) and Nanodrop II Stage pipetting station (Innovadyne) for PCR mix dispensing. Amplification and signal detection were performed using a LightCycler II (Roche) with an initial denaturation at 95 C for 15 min followed by 40 cycles of 95 C for 20 s, 60 C for 30 s and 72 C for 30 s. Each sample was subjected to real-time PCR in duplicate and the mean Ct value of the duplicates was used for subsequent calculations. The Ct values of the genes of interest were normalized ( Ct) to an average Ct value of three house-keeping genes glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), TATA box binding protein (TBP), and ubiquitin (UB; Crhanova et al., 2011) and the relative expression of each gene of interest was then calculated as 2 Ct. Sequencing V3/V4 Region of 16S rrna Genes Cecal content samples were homogenized in a MagNALyzer (Roche). Following homogenization, the DNA was extracted using the QIAamp DNA Stool Mini Kit according to the manufacturer s instructions (Qiagen). The DNA concentration was determined spectrophotometrically and DNA was stored at 20 C until use. DNA samples from the cecal contents of 54 chickens were diluted to the same concentration of 5 ng/µl and were used as a template in PCR with forward primer 5 - TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG- MID-GT-CCTACGGGNGGCWGCAG-3 and reverse primer 5 -GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-MID- GT-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3. The sequences in italics served as index and adapter ligation whereas the underlined sequences allowed for the amplification over V3/V4 region of 16S rrna genes. MIDs represent different sequences of 5, 6, 9, or 12 base pairs in length which were used to differentiate samples within the sequencing groups. PCR amplification and clean up were performed using KAPA Taq HotStart PCR Kit (Kapa Biosystems) following the protocol for 16S metagenomic sequencing library preparation recommended by Illumina. In the next step the DNA concentration was determined fluorometrically and the DNA was diluted to 100 ng/µl. Groups of 14 PCR products with different MID sequences were pooled and indexed with a Nextera XT Index Kit (Illumina). Prior to sequencing, the concentration of differently indexed samples was determined using the KAPA Library Quantification Complete kit (Kapa Biosystems). All indexed samples were diluted to 7 ng/µl and 20% of phix DNA was added. Sequencing was performed using MiSeq Reagent Kit v3 and MiSEQ 2000 apparatus according to the manufacturer s instructions (Illumina). The fastq files generated as an Illumina sequencing output were uploaded into Qiime software (Caporaso et al., 2010). Reverse reads from pair end sequencing were shortened to 250 base pairs long and pair ends were joined. Quality trimming criteria were set to a value of 19 and no mismatch in the MID sequences. In the next step, chimeric sequences were predicted by slayer algorithm and excluded from the analysis. The resulting sequences were then classified with RDP Seqmatch with an operational taxonomic units (OTUs) discrimination level set to 97%. Statistics Salmonella Enteritidis counts in the liver and cecum were compared with ANOVA followed by Tukey post hoc test. Heat maps and clustering used for the characterization of the chicken inflammatory response were generated in R-studio. The similarity of microbiota populations was determined by UniFrac analysis followed by principal coordinate analysis (PCoA) implemented in Qiime software. Frontiers in Microbiology 3 June 2016 Volume 7 Article 957

109 Varmuzova et al. Microbiota, Salmonella and chicken RESULTS Resistance of Chickens of Increasing Age to S. Enteritidis Infection Chicken resistance to S. Enteritidis infection increased quickly during the first week of life and was sustained until the end of the experiment (last group of chickens was infected on day 22 of life, Figure 1). Protective Effect of Microbiota of Different Composition Against S. Enteritidis Infection Since Enterobacteriaceae are replaced with different Firmicutes representatives in the second week of life followed by the appearance of Bacteroidetes later in life (Videnska et al., 2014), we subsequently determined the protective effect of cecal microbiota from 1-, 3-, 16-, 28-, and 42-week-old hens against S. Enteritidis. Salmonella was not detected in pooled samples from cecal microbiota inoculated but S. Enteritidis non-infected chickens in any of the experiments. Following S. Enteritidis infection, Salmonella counts in the ceca were significantly higher in the non-colonized chickens and the chickens inoculated with microbiota from 1-week-old donors than in the chickens inoculated with microbiota from 3-weekold or older chickens. Similar results were recorded also for liver colonization, though in the liver, statistically significant protection against S. Enteritidis challenge was not recorded due to low S. Enteritidis counts and the appearance of S. Enteritidis negative chickens (Figure 2). Protective Effect of Microbiota of Different Composition Against the Inflammatory Response Caused by S. Enteritidis Infection Next we were interested whether inoculation with microbiota induced any inflammatory response which could explain the resistance to subsequent S. Enteritidis challenge and whether microbiota protected chickens from an inflammatory response to S. Enteritidis infection. Twelve-day-old chickens inoculated with microbiota from 1-, 16-, and 28-week-old donors did not develop any inflammation in the cecum and clustered with the non-colonized and non-infected control chickens (Figure 3). On the other hand, chickens responded to the inoculation with microbiota from 3- and 42-week-old donors. Microbiota from 3-week-old donors induced expression of cytokines such as IL8, IL1β, IL22, IL17, and IL18 and microbiota from 42-week-old donors induced expression of NK-lysin (NKL), IL16, IgY, and IgA (Figure 3). Colonization with microbiota from 3-week-old or older chickens protected chickens from an inflammatory response to infection with S. Enteritidis. Non-colonized chickens responded to S. Enteritidis infection by a mild increase in gene expression, mostly in genes coding for acute phase proteins (e.g., SAA, AVD, TRAP, IRG1, or ExFABP), despite high S. Enteritidis counts in the cecum (compare Figures 2 and 3). Chickens inoculated with microbiota from 1-week-old donors were the most sensitive to S. Enteritidis and, except for NKL, IgY and IgA, responded to S. Enteritidis challenge by a high induction of all tested genes (Figure 3). Microbiota from adult hens therefore reduced colonization of chickens after S. Enteritidis challenge, although certain microbiota compositions may even sensitize the inoculated chickens to S. Enteritidis challenge. Composition of Cecal Microbiota in the Inoculated Chickens Since the inoculation with microbiota affected resistance to S. Enteritidis challenge, next we determined the microbiota composition in the resistant and sensitive chickens, before and after the infection. The inoculum itself (and therefore the microbiota present in the donor chickens, though we did not determine this specifically in this study) was the most decisive factor for the composition of cecal microbiota in the recipient chickens since the chickens inoculated with the cecal extract FIGURE 1 Salmonella counts in the liver of chickens infected with S. Enteritidis at different ages. Four chickens were infected on the day of life shown on the axis X and sacrificed 4 days later. Resistance to S. Enteritidis rapidly increased during the first week of life but did not change from week 2 onward. significantly different from the chickens infected on day 1; # significantly different from the chickens infected on day 2 (P < 0.05, ANOVA followed by Tukey test). Frontiers in Microbiology 4 June 2016 Volume 7 Article 957

110 Varmuzova et al. Microbiota, Salmonella and chicken FIGURE 2 Salmonella counts in the cecum and liver 4 days post-infection of chickens inoculated by cecal microbiota from chickens of different age. Chickens were inoculated with microbiota on day 1, infected with S. Enteritidis on day 8 and sacrificed on day 12 of life. (A) S. Enteritidis counts in the cecum. (B) S. Enteritidis counts in the liver. Data are presented as mean ± SD. NC non-colonized but S. Enteritidis infected control group; W1 S. Enteritidis counts in the chickens inoculated with microbiota from 1-week-old chickens; W3 S. Enteritidis counts in the chickens inoculated with microbiota from 3-week-old chickens; W16 S. Enteritidis counts in the chickens inoculated with microbiota from 16-week-old chickens; W28 S. Enteritidis counts in the chickens inoculated with microbiota from 28-week-old hens; W42- S. Enteritidis counts in the chickens inoculated with microbiota from 42-week-old hens. Asterisks indicate statistically significant differences (P < 0.05, ANOVA followed by Tukey test) compared to the non-colonized but infected chickens. FIGURE 3 Heat map of gene expression in the ceca of 12-day-old chickens. Yellow, the lowest expression, blue, the highest expression. NC Non-colonized and non-infected control group; NC-INF Non-colonized group infected with S. Enteritidis; W1(-INF) Chickens inoculated with microbiota from 1-week-old chickens (and infected with S. Enteritidis on day 8 of life); W3-(INF) Chickens inoculated with microbiota from 3-week-old chickens (and infected with S. Enteritidis on day 8 of life); W16-(INF) Chickens inoculated with microbiota from 16-week-old chickens (and infected with S. Enteritidis on day 8 of life); W28-(INF) Chickens inoculated with microbiota from 28-week-old chickens (and infected with S. Enteritidis on day 8 of life); W42-(INF) Chickens inoculated with microbiota from 42-week-old chickens (and infected with S. Enteritidis on day 8 of life). from different donor chickens formed separate clusters. These clusters always comprised 8 and 12-day-old chickens irrespective of S. Enteritidis infection (Figure 4). The only exception was the clustering of 8-day-old non-colonized chickens and the chickens inoculated with microbiota from 1-week-old donors on day 8 of life, i.e., prior to infection with S. Enteritidis. These chickens formed separate clusters using unweighted PCoA analysis (Figure 4). Identification of Protective Microbiota Members Unweighted PCoA analysis indicated that there must have been different OTUs in 8-day-old non-colonized chickens and chickens inoculated with microbiota from 1-week-old donors and these differences could be responsible for the different inflammatory response after S. Enteritidis infection. There were 72 OTUs which were present in the microbiota of all three noncolonized chickens on day 8 of life and were absent in microbiota of two chickens inoculated with microbiota from 1-week-old donors (unfortunately we failed with analysis of one chicken in this group). However, only three of these OTUs formed more than 0.05% of total microbiota and these were assigned to genera Alistipes, Clostridium XIVa, and Blautia. On the other hand, there were 130 OTUs specifically present in the chickens inoculated with cecal extracts from 1-week-old donors and 11 of these formed more than 0.05% of total microbiota. These OTUs belonged to genera Pediococcus (two different OTUs), Bacteroides Frontiers in Microbiology 5 June 2016 Volume 7 Article 957

111 Varmuzova et al. Microbiota, Salmonella and chicken FIGURE 4 Principal coordinate analysis (PCoA) characterizing the microbiota composition of 8- and 12-day-old chickens colonized on day 1 of life with cecal microbiota from donor chickens of different age, as well as 12-day-old chickens inoculated with microbiota from different donors on day 1, challenged with S. Enteritidis on day 8 and sacrificed on day 12 of life. Composition of microbiota in the inoculum was the most decisive factor which dominated over age when the inoculated chickens were sacrificed and S. Enteritidis infection status, both in weighted PCoA (A) and unweighted PCoA (B). Unweighted PCoA showed that although non-colonized 12-day-old chickens exhibited similar microbiota as the chickens inoculated with microbiota from 1-week-old donors, there was different microbiota composition on day 8, i.e., at the time of S. Enteritidis infection which may explain the different inflammatory response shown in Figure 3. (two different OTUs), Clostridium IV, Clostridium XVIII, Faecalibacterium, Streptophyta, and unclassified members of families Ruminococcaceae, Lachnospiraceae, and Prevotellaceae. The most dominant were the two Pediococci OTUs which together formed 1.7% of all microbiota in the chickens inoculated with microbiota from 1-week-old donors. Therapeutic Use of Microbiota Administration In the last experiment we tested whether the protective effect can be achieved earlier than 7 days after inoculation and whether the microbiota inoculation can be used therapeutically. Newly hatched chickens were therefore inoculated with microbiota on the day of hatching and challenged with S. Enteritidis 24 h later, or microbiota and S. Enteritidis were administered simultaneously on day 1 of life, or the chickens were infected with S. Enteritidis on the day of hatching and microbiota were provided to the chickens therapeutically 24 h later. No S. Enteritidis was detected in the liver of chickens which were colonized with microbiota on the day of hatching, infected with S. Enteritidis 24 h later and sacrificed on day 5 of life (Figure 5A). In all other combinations, i.e., in the non-colonized but S. Enteritidis infected chickens, in the S. Enteritidis infected and 24 h later microbiota inoculated chickens, or in the chickens simultaneously inoculated with microbiota and infected with S. Enteritidis, S. Enteritidis could be detected in the liver on day 5 of life, though a partial protective effect of administered microbiota was recorded in the chickens in which microbiota was administered simultaneously with S. Enteritidis (Figure 5A). Quantitative real-time PCR performed with mrna/cdna purified from cecal tissue confirmed the results from liver colonization. Inoculation with microbiota had only a minimal effect on the cecal inflammatory response and also subsequent infection with S. Enteritidis did not result in an inflammatory response. On the other hand, when the chickens were infected with S. Enteritidis before or together with cecal microbiota inoculation, there was an extensive inflammatory response similar to that observed in the non-colonized but S. Enteritidis infected chickens (Figure 5B). Administration of microbiota therefore was not of any therapeutic effect. DISCUSSION Though, it has been repeatedly reported that the resistance of chickens to infection with non-typhoid serovars of Salmonella increases with age, such experiments were performed with chickens aged weeks or months (Beal et al., 2004, 2005; Withanage et al., 2004) and data on the development of resistance in the early days of life are less common (Crhanova et al., 2011). In this study we therefore first tested how resistance increases within the first days of life and observed that the increase in resistance is a matter of days. We reported earlier that around day 4 of life, a mild inflammatory signaling can be recorded (Crhanova et al., 2011) which may serve as a signal for the infiltration of leukocytes to the cecal mucosa (Van Immerseel et al., 2002; Bar-Shira et al., 2003) and increase in resistance to Salmonella infection. Though inflammation and leukocyte infiltration likely contributes to chicken resistance to Salmonella, we consider the presence of microbiota itself as a more important factor since we were not able to recover S. Enteritidis following microbiota pre-inoculation at all. Microbiota, if administered prior S. Enteritidis infection, therefore directly restricted S. Enteritidis multiplication and the absence of inflammation was only a consequence of the absence of S. Enteritidis in the cecum. Frontiers in Microbiology 6 June 2016 Volume 7 Article 957

112 Varmuzova et al. Microbiota, Salmonella and chicken FIGURE 5 Preventive and therapeutic use of chicken gut microbiota for the reduction of S. Enteritidis colonization. (A) Salmonella counts in the liver 4 days post-infection (DPI). INF Chickens infected on day 1 of life; COL-INF Chickens colonized on day 1 of life and infected on day 2 of life; INF+COL- Chickens infected and colonized on day 1 of life; INF-COL Chickens infected on day 1 of life and colonized on day 2 of life. Data are presented as mean ± SD. (B) Heat map of gene expression in the chicken cecum on day 5 of life; yellow, low expression, blue, high expression. COL-INF Chickens colonized on day 1 of life with 35-week-old microbiota and infected with S. Enteritidis on day 2 of life; COL Chickens colonized with 35-week-old microbiota; NC-NI Control group of chicken, non-colonized and non-infected; INF+COL Chickens infected and colonized on day 1 of life; INF Chickens infected with S. Enteritidis; INF-COL Chickens infected on day 1 of life and colonized on day 2 of life. Interestingly, microbiota from 1-week-old chickens did not protect chicken recipients against S. Enteritidis infection. Though not reaching statistical significance, S. Enteritidis counts were slightly higher in the chickens inoculated with microbiota from 1-week-old chickens than in the non-colonized controls (Figure 2). This minor difference was, however, enough to result in a significantly different inflammatory response in these two groups of chickens (Figure 3). In other words, chickens that received cecal microbiota from 1-week-old donors were sensitized to the inflammatory response to S. Enteritidis infection. Microbiota analysis showed that prior to the infection, the cecal microbiota differed in the non-colonized controls and chickens inoculated with microbiota from 1-week-old donors. However, it should be reminded that the microbiota of very young chickens is quickly developing (Videnska et al., 2014) and under different rearing conditions, the protective microbiota may appear slightly earlier or later during life. It is also difficult to speculate which of the microbiota members present in significantly higher abundance in the inoculated chickens was responsible for their higher sensitivity to S. Enteritidis infection. Gram positive Pediococcus or Faecalibacterium were present in the microbiota of the inoculated chickens at higher abundance than in the non-colonized controls but these bacteria are used either as probiotics or were reported as having an anti-inflammatory effect (Sokol et al., 2008; Biloni et al., 2013; Qiu et al., 2013). These two bacterial species were therefore quite unlikely to be responsible for the increased sensitivity to S. Enteritidis. On the other hand, our unpublished results show that inoculation of newly hatched chickens with pure cultures of certain clones belonging to genera Bacteroides sp. and Alistipes sp. results in a worse course of infection following S. Enteritidis challenge than in the control, non-colonized chickens. The two different clones of Bacteroides sp. present in the inoculated chickens may therefore explain their increased sensitivity to S. Enteritidis, though, of course, this cannot be considered as a definitive conclusion. It is not surprising that such results were not reported earlier since all studies testing competitive exclusion used adult hens as donors of microbiota (Kerr et al., 2013; Milbradt et al., 2014) and nobody tested microbiota from 1-weekold chickens. Moreover, microbiota in 1-week-old chickens may fluctuate and the (non)protective effect may vary from experiment to experiment. Despite this, these results show that care must be taken concerning the composition of microbiota used for competitive exclusion since some may not provide the expected protection or may allow for overgrowth of opportunistic pathogens or zoonotic agents in the ceca of inoculated chickens (Polansky et al., 2016). The protective effect of microbiota inoculation could be achieved within 24 h further supporting the hypothesis that this effect is independent of the chicken immune system. Unfortunately, therapeutic administration was not successful and even simultaneous administration of S. Enteritidis and cecal microbiota did not prevent S. Enteritidis colonization. However, we should note that the infectious dose of S. Enteritidis in these experiments was deliberately high, higher than in field conditions. The microbiota administration in field conditions may therefore increase chicken resistance to S. Enteritidis even if being administered in parallel to Salmonella natural infection. In addition, the administration of microbiota in field conditions may protect non-infected chickens thus decreasing S. Enteritidis spread on a flock level, despite the fact that competitive exclusion products work better under experimental conditions than in field trails. Interestingly, since the chicken cecal immune system responded to S. Enteritidis infection during co-administration with microbiota, it should equally respond and recognize attenuated Salmonella vaccine strains if administered together with microbiota, as reported earlier (Methner et al., 1999). This also means that it might be possible to develop a Frontiers in Microbiology 7 June 2016 Volume 7 Article 957