MODERNÍ NANOTECHNOLOGIE NA POČÁTKU 21. STOLETÍ

Transkript

1 Vysoké učení technické v Brně Mendelova univerzita v Brně MODERNÍ NANOTECHNOLOGIE NA POČÁTKU 21. STOLETÍ Kolekce učebních textů projektu OPVK NANOTEAM Editor Ondřej Zítka

2

3 MODERNÍ NANOTECHNOLOGIE NA POČÁTKU 21. STOLETÍ Kolekce učebních textů projektu OPVK NANOTEAM Tato publikace vznikla v souvislosti s řešením projektu Budování výzkumných týmů a rozvoj univerzitního vzdělání výzkumných odborníků pro mikro- a nanotechnologie, CZ.1.07/2.3/.00/ Doporučená citace: René Kizek, Libuše Trnková, Vojtěch Adam, Jaromír Hubálek, Ondřej Zítka, Markéta Vaculovičová, Jindřich Mach, Miroslav Kolíbal, Jan Prášek, Jana Chomoucká, Radim Hrdý, Jana Drbohlavová, Dmitry Solovei, Pavel Kulha, Adam Bouřa : MODERNÍ NANOTECHNOLOGIE NA POČÁTKU 21. STOLETÍ, Brno: Mendelova univerzita v Brně, 2013, 240 s., ISBN: Vysoké učení technické v Brně a Mendelova univerzita v Brně ISBN:

4

5 Obsah 1 Úvod do nanotechnologie a biotechnologií Mikrotechnologie Ultra-high vacuum techniques: evaporation, leed and XPS Nanometrologie: úvod do STM a AFM technik Syntéza nanostruktur moderními metodami: magnetické nanočástice, kvantové tečky Uhlíkové nanočástice: grafen, nanotrubice, fullereny Aplikace paramagnetických nanočástic Aplikace fluorescenčních a magnetických nanočástic v in vivo zobrazování Cílený transport léčiv pomocí pokročilých nanotechnologií Speciální analytické metody materiálů: Ramanova a Mössbauerova spektroskopie Elektronová mikroskopie (SEM, TEM, příprava vzorků, EDX, WDX) Možnosti kapilární elektroforézy v nanotechnologiích Průtoková injekční analýza - metoda využitelná pro nanotechnologie Elektrochemie v nanotechnologiích Bioelektrochemie a nanotechnologie Biosenzory, základy, aplikace, nanotechnologie Advanced methods of surface nanostructuring Návrh a simulace mikrostruktur Rejstřík...221

6

7 Předmluva Vážení čtenáři se zájmem o moderní nanotechnologie, dostává se vám do rukou publikace, která tematicky pokrývá obecnou oblast stavu poznání nanověd a specifickou oblast přípravy výrobků za užití nanotechnologií a některé oblasti využití těchto výrobků pro biologické a chemické aplikace. Tyto jsou zde popsány a diskutovány celkem v osmnácti kapitolách. Publikace si v žádném případě neklade cíle shrnovat veškeré poznání na poli nanověd v době svého vzniku. Vývoj nanotechnologií pro živé vědy je jednou z oblastí s velmi silným potenciálem uplatnění výsledků základního výzkumu pro praxi. Aktuální dopady nově získaných výsledků jsou většinou v době jejich vzniku nedoceněné ve srovnání s jejich přínosem v budoucnosti. O rychlosti uplatnění nových vědeckých výsledků v praxi, a tím zvýšení jejich dopadu, rozhoduje zejména ochota samotných vědců věnovat se interdisciplinární spolupráci a také schopnost vystupovat při komunikaci s aplikační sférou jednotně. Bohužel pro konečného uživatele se jeví spolupráce biologa, chemika a elektrotechnika jako poměrně raritní a ne příliš vyhledávanou cestou k vývoji nových zařízení a aplikací. Proto na poli nanotechnologií musí v budoucnu docházet k více intenzivnímu propojování oborů, jako jsou biologie, chemie a elektrotechnika na úrovni řešení společných výzkumných projektů. Proto také vzniká tato kniha, která ukazuje, že propojování těchto oblastí možné je a má velmi jistou perspektivu. Brno, 1. prosince 2013, Ondřej Zítka

8

9 1 René 1ÚVOD DO NANOTECHNOLOGIE A BIOTECHNOLOGIÍ Kizek

10

11 1 Úvod 1.1 Historie nanotechnologie Počátek nanotechnologií je obtížné stanovit. Již ve starém Egyptě a Číně, někdy v období pátého a čtvrtého století př. n. l. bylo objeveno rozpustné zlato, které se používalo k dekoračním účelům při barvení keramiky a při výrobě rubínového skla. Bylo užíváno také k léčení srdečních a sexuálních problémů, úplavice, epilepsie, nádorů a též pro diagnózu syfilis. Je zřejmé, že v této době byly nanočástice zlata hojně používány, ale je velmi pravděpodobné, že nikdo nevěděl nic o velikosti těchto částic a ani neexistovaly žádné metody jejich měření nebo určení. V roce 1857 Faraday ukázal jak vytvořit koloidní zlato redukcí vodného roztoku tetrachlorozlatatitanu. Od této doby lze datovat vznik koloidní chemie. Koloidní roztok, který byl pojmenován Grahamem až v roce 1861, je v podstatě vodný roztok dispergovaných nanočástic v rozmezí (5 200) nm, které jsou tak lehké, že vliv gravitace je zanedbatelný oproti jejich kinetické energii, tzn. nedochází k jejich usazování na dně nádoby [1]. Skutečný počátek nanotechnologií lze datovat od známého výroku Richarda Feynmana (Obr. 1) There is plenty of room on the bottom, což znamená: Tam dole je spousta místa, který vyslovil 29. prosince 1959 na ročním setkání Americké společnosti fyziků na Kalifornském Institutu technologií (Caltech). Touto úvahou rozpoutal snahu fyziků v oblasti zkoumání materiálů na úrovni nanometrů [2]. Obrázek 1: Fotografie Richarda Feynmana v obvyklém postoji, kdy vykládá své poznatky. To, že je považován za významného vědce dokládá fakt, že byl také vyobrazen v roce 2005 na jedné ze známek v archu vedle slavných vědců, jako byli J. von Neumann a J. Gibbs. Převzato z [4]. Pozadím výroku Richarda Feynmana a podmínkou vzniku a rozvoje nanotechnologií bylo velké množství teorií a objevů umožňujících chápat a zkoumat materiální svět (materia z latiny fyzikální substance, hmota, látka, materiál). Z toho důvodu je nutné nejprve provést krátkou retrospektivu vědy a jejích objevů, které umožnily následný rozvoj nanotechnologií. Objevy lze rozdělit do dvou skupin. První skupina představuje teorie struktury látek a druhá skupina objevy umožňující experimentálně ověřit tyto teorie. Materiál začal z hlediska vědy získávat vlastnosti, které bylo možné již vysvětlit, a také umožňovaly určit chování látek. Z hlediska základní struktury látek bylo nutné zpřesňovat model atomu, objevit částice uvnitř a popsat jejich chování a vliv na vnější vlastnosti látek. Dlouhou dobu fyzikové neměli nástroje pro ověření první teorie o stavbě krystalů. Teprve až v 19. století se podařilo najít nástroje pro zkoumání struktury látek, teorie se zpřesňovaly nebo vznikaly nové. V roce 1913 vytvořil Niels Bohr na základě představ Ernesta Rutherforda, kvantové hypotézy Maxe Plancka definované v roce 1900 a Alberta Einsteina, který rozvinul Planckovu teorii v roce 1905 prací o fotoelektrickém efektu, tzv. Bohrův model atomu (první kvantový model atomu). O pár let později už Werner Heisenberg přišel (v roce 1925) s novým výkladem fyziky, naprosto odlišné od Newtona a dnes je považován za jednoho ze zakladatelů kvantové mechaniky. Mezi zakladatele kvantové mechaniky bezesporu patří také Erwin Schrödinger a Paul Dirac, kteří objevili nové formy atomové teorie ve 20 letech. V roce 1925 také Wolfgang Pauli formuloval jedno ze základních pravidel kvantové mechaniky (Pauiliho vylučovací princip), jímž je neexistence dvou stejných kvantových stavů u nerozlišitelných fermionů. O rok dříve Louis de Broglie publikuje doktorskou práci o vlnové povaze elektronů. Sir James Chadwick objevil neutron v roce 1932 a připravil cestu ke štěpení jader a vzniku atomové bomby. Carl David Anderson ve stejném 6

12 roce publikoval práci o objevu pozitronu, čímž potvrdil předpoklad Paula Diraca o existenci antičástice k elektronu. Slupkový model jádra atomu, vytvořený v roce 1949, neobjasňoval všechny do té doby známé vlastnosti, až Aage Bohr spolu Benem Mottelsonem vytvořili v letech model, který bral v úvahu chování nukleonů. Objevili vztahy mezi pohybem jádra atomu a částic uvnitř jádra a na základě nich vytvořili teorii struktury atomových jader (kolektivní model). Tyto hypotézy, teorie i objevy otevřely dveře pro skutečné poznávání hmoty, avšak veškeré souvislosti nejlépe pochopil až R. Feynman. Avšak bez potřebných nástrojů nebylo možné tyto teorie ověřit. Na tomto má zásluhu bezesporu další skupina vědců [3]. V roce 1913 vyvinuli otec a syn Braggovi první rentgenovou strukturní analýzu krystalů, později nazývanou Braggova metoda. V roce 1928 byla objevena Ramanova spektroskopie nezávisle Chandrasekharou Ramanem a dvojicí L. I. Mandelštamem a G. S. Lansbergem. Velmi přínosný pro vědu byl objev rozptylu elektronů na krystalech, který náleží Clintonu Davisson a Georgi Thomsnu a tím byl již v roce 1937 položen základ pro moderní elektronovou mikroskopii. Kai Manne Börje Siegbahn vyvinul metodu elektronové spektroskopie dnes využívané v metodě XPS (X -ray photoelectron spectroscopy) pro chemickou analýzu materiálů. Ernst Ruska předpokládal, že mikroskop využívající elektrody, jejichž vlnová délka je 1 000krát kratší než světlo, umožní pozorovat mnohem detailnější obrázky než mikroskop využívající světlo. Již v roce 1931 demonstroval, že pomocí magnetické cívky lze vytvořit čočku pro elektrony a v roce 1933 postavil první elektronový mikroskop. Aaron Klug užíval rentgenovou difrakci pro analýzu látek, mikroskopii a strukturní modelování v 60. letech minulého století. Na základě jeho poznatků vyvinul mikroskop pro elektronovou krystalografii umožňující získávat 2-dimenzionální obrázky krystalů z různých úhlů, čímž lze vytvořit 3D zobrazení. John Hall společně s německým fyzikem Theodorem Hänschem objevili ke konci 90. let spektroskopii založenou na využití elektromagnetického záření ve formě tzv. frekvenčních hřebenů k extrémně přesným měřením. Tyto frekvenční hřebeny prezentované velmi úzkými emisními čarami s pravidelným frekvenčním intervalem, byly generovány pomocí femtosekundových laserových pulsů v optických vláknech. Jejich využití bylo nasazeno pro zkoumání jemné struktury atomů, vlastností jádra atomu, v extrémně přesných atomových hodinách a ve vylepšené technologii GPS [3]. Vedle struktury látek výrazně ovlivnily pohled na hmotu její magnetické vlastnosti. Otto Stern přispěl v roce 1922 společně s Waltherem Gerlachem při Stern -Gerlachově pokusu k objevu a důkazu prostorového kvantování magnetického momentu atomu. V roce 1930 Louis Néel vyslovil domněnku existence magnetického chování zvaného antiferomagnetismus v protikladu k feromagnetismu a patři mezi pionýry v oblasti magnetických vlastností látek. Felix Bloch a Edward Purcell se zasloužili o rozvoj nových metod pro přesná měření jaderného magnetismu a objev nukleární magnetické rezonance v kapalinách a pevných látkách na počátku 50. let minulého století. Přesné určení magnetického momentu elektronu bylo objeveno Polykarpem Kuschem v 50. letech, zatímco objev magnetického momentu protonu byl učiněn Otto Sternem zhruba o 10 let dříve. Robert Hofstadter spolu s Rudolfem Mössbauerem přispěli ke studiu struktury nukleonů pomocí rozptylu elektronů na jádrech atomů. Rudolf Mössbauer se věnoval výzkumu rezonanční absorpce gama záření a v roce 1957 objevil jev, který je základem Mössbauerovy spektroskopie, sloužící ke zkoumání magnetické struktury látek. John Van Vleck postavil základy kvantově mechanické teorie magnetismu a teorie pole krystalů (chemické vazby v kovových komplexech) [3]. Další vlastností materiálu jsou elektronové jevy. Nevill Mott se zasloužil o výzkum elektrických a magnetických 7

13 vlastností amorfních polovodičů. Philip Warren Anderson přispěl na počátku 70. let svou prací k teorii antiferomagnetismu a vysokoteplotní supravodivosti. Dalším objevitelem byl Leo Esaki, japonský experimentální fyzik a elektronik, proslulý zejména studiem tunelového jevu (1958) u elektronů v pevných látkách, zejména v polovodičích. Jeho práce vedly ke konstrukci Esakiho (tunelových) diod. Brian Josephson přispěl díky své pionýrské práci k rozvoji supravodičů. Teoreticky předpověděl vlastnosti proudu procházející skrze tunelovou bariéru, dnes je tento jev znám pod jménem Josephsonův jev (1965) [3]. Asi největší rozvoj nanotechnologií prodělala elektronika. Celý boom započal objevem tranzistoru Williamem Shockleyem, Johnem Bardeenem a Valterem H. Brattainem na počátku 50. let. V roce 1958 Jack Kilby vytvořil první integrovaný obvod z germania. Robert Noyce o pár měsíců později nezávisle na Kilbym představil obdobný čip na křemíku. Rozlišení technologie pod 1 μm bylo překročeno na počátku 90. let minulého století, 100 nm až v novém tisíciletí [4]. Moderní historie nanotechnologií se počítá od prvního užitého spojení dvou slov nano a technologie. První, kdo použil pojem nanotechnologie, byl Norio Taniguchi ve své práci na téma obrábění iontovým odprašováním v roce Referoval o výrobní technologii s extrémně vysokou přesností a ultra jemnými rozměry přesnost a jemnost v řádu 1 nanometru. Tento termín se časem rozvinul do podoby zahrnující všechno od vědy manipulující atomy a molekulami po syntézu nových forem života [5, 6]. Kim Eric Drexler, označován za otce nanotechnologie, jako první formuloval v roce 1977 koncept molekulární nanotechnologie, ve kterém se zabýval výrobou a výpočty nanosystémů molekulárních strojů. Heinrich Rohrer a Gerd Binnig na základě teorie tunelování v materiálech navrhli v roce 1981 první STM (Scanning Tunneling Microscope rastrovací tunelový mikroskop), který se později (v roce 1986) vyvinul také v první AFM (Atomic Force Microscope mikroskop atomárních sil), jehož autory byli Gerd Binnig, Calvin Quate a Christoph Gerber. Tunelový mikroskop využívá přechodu elektronů mezi povrchem a hrotem (hrot na konci obsahuje pouze 1 atom) vlivem tunelovacího napětí, které jakoby vytáhne elektronový obal z obou atomů (na hrotu a povrchu vzorku), a dochází k přechodu elektronů mezi takto přiblíženými obaly (mraky), viz detail na Obr. 2. Hrot tedy není v kontaktu s povrchem, ale je udržován v určité velmi malé vzdálenosti (4 7) Å od povrchu tak, aby tunelový proud byl konstantní nebo je vzdálenost konstantní a sleduje se změna tunelového proudu [7]. Rastrování v osách x y umožňuje získat obraz atomů na povrchu. Obraz je černobílý a koloruje se podle velikosti proudu nebo výšky. Tato metoda umožňuje také manipulovat s atomy a vytvářet tak obrazce do povrchu na atomové úrovni. Pro získání představy o možnostech této mikroskopie doporučuji navštívit obrazovou galerii na webových stránkách firmy IBM [8]. Je nutné zmínit, že literatura [9] uvádí, že SPM bylo objeveno již v letech Russellem Youngem, ale tento vědec za něj nezískal Nobelovu cenu. Naproti tomu AFM využívá hrotu, který se povrchu dotýká (Obr. 3) [10]. Hrot musí být ideálně ostrý, tj. zakončen pouze 1 atomem, což se zatím technicky nepodařilo zvládnout, proto jeho rozlišení závisí mimo jiné právě na velikosti hrotu. Ten kopíruje povrch a změny jsou sledovány optickým systémem obsahující laser a 4-kvandrantový detektor. Tím je vyhodnocena změna výchylky hrotu vlivem nerovnosti povrchu. Stolem lze pohybovat ve všech osách. Získaný obraz je opět černobílý a koloruje se v závislosti na hloubce reliéfu [11]. Obrázek 4: Trojice nositelů Nobelovy ceny za objev fullerenů: zleva Harold Kroto, Richard Smalley a Robert Curl. Převzato z [13a], [13b] a [13c]. 8

14 A) B) Obrázek 2: A) Principiální schéma tunelového mikroskopu, v detailu je interakce atomů povrchu a hrotu. B) Výsledné obrázky reliéfu povrchu jsou uvedeny vpravo. Spodní obrázek demonstruje manipulaci s atomy pomocí tohoto nástroje za vzniku nápisu. Převzato a upraveno z [7] a [9]. A) B) Obrázek 3: A) Principiální schéma mikroskopu atomárních sil. V detailu je vidět mikrosnímek hrotu, který je určující pro rozlišení mikroskopu. B) Obrázky získané z povrchů materiálů, v detailu je vidět, kde se n cházejí atomy. Převzato a upraveno z [10] a [11]. 9

15 1.2 Nanotechnologie pro biotechnologie Molekulární nanosystémy mají velice perspektivní uplatnění v biotechnologiích. Vrcholem takovéto instrumentace jsou nanoroboti plnící biologické funkce v živém organismu. Předpokladem pro vytvoření nanorobotů je schopnost syntetizovat molekuly obsahující uhlíkové atomy ve striktně pravidelných tvarech na úrovni nanoměřítka tak jako jsou například fulereny a nanotrubice. Jejich objevení nastartovalo využívání nanotechnologií pro pozdější výzkumné účely biotechnologií. Profesor Sir Harold Kroto (Obr. 4) pracoval v 70. letech na výzkumu uhlíkových řetězců v mezihvězdné hmotě. Při jejich vysvětlování objevil fuleren (C60), který byl definitivně určen společně s Richardem Smalleym a Robertem Curlem (Obr. 4), za pomocí jejich laserové spektroskopie v roce 1985 [12]. Fulereny (Obr. 5) mají kulatý tvar a lze je formovat do podoby trubic (uhlíkové nanotrubice), které poprvé objevil Sumio Iijima v červnu 1991 [14]. Od této doby lze datovat směr nazývaný bottom -up, což znamená stavba nanostruktur odspodu za využití fyzikálních a chemických jevů, dnes nazývaných samouspořádání (self ordering nebo self assembly). Obrázek 5: Vlevo je model fullerenu C60, uprostřed je uhlíková jednostěnná nanotrubice (převzato z [12]) a vpravo pak její objevitel, japonský fyzik Sumio Iijima [15]). Obrázek 6: Molekulární nanosystémy spojované dohromady jako základy budoucích nanorobotů. Převzato a upraveno z [14]. Obrázek 7: Dr. Kim Eric Drexler (vpravo) [18] a Robert A. Freitas Jr. (vlevo) [19]. Výzkum v oblasti nanosystémů započal K. Eric Drexler (Obr. 7) [18] v druhé polovině 70. let a sumarizoval jej v knize Nanosystémy (1992), kde ukázal možnosti nanotechnologií. Toto snažení v oblasti molekulárních systémů vyústilo v roce 1997 v první návrh nanorobotického systému [15]. Nejde o miniaturizaci mechanického robota, ale systému na molekulárním základě tvořeném složitými molekulami vzájemně propojenými pomocí specifických vazeb (Obr. 6). Tyto vazby lze specifikovat i vzhledem k vnějšímu okolí, a tím lze zajistit pohyb robota, jeho afinitu apod. Tyto systémy tak umožňují pohybovat, na rozdíl od SPM, s velkým počtem molekul. Na tuto práci navazovalo studium využití DNA, které vyústilo v roce 1998 první prací na téma nanomechanická zařízení založená na DNA [16]. O rok později se objevuje první práce o aplikacích nanotechnologie a nanorobotů v nanomedicíně, jejímž autorem je Robert A. Freitas (Obr. 7) [19]. Od této doby se začíná rozvíjet využívání nanočástic v medicíně a farmacii. Nejznámější směr je tzv. drug delivery, jež zkoumá možnosti cíleného vyhledávání buněk a virů a léčení přímo v místě poškození. Nanočástice je vhodně modifikována tak, aby byla vytvořena specifická afinita k hledaným virům nebo buňkám většinou rakovinového původu. Po jejím nalezení nanočástice uvolňuje léčivo a ničí cizorodé biomolekuly. Jiným způsobem může být, místo uvolnění léčiva, termální zahřátí nanočástic, které tak zničí karcinom. Dalším směrem je diagnostika za pomocí kvantových částic, které obdobně jako 10

16 u dopravy léčiva vyhledají zasažené oblasti díky specifické afinitě a následným ozářením světlem o nízké vlnové délce dochází ke zviditelnění zasažených oblastí (Obr. 8). Magnetické nanočástice získávají vlastnosti superparamagnetik a lze je využít k separaci látek přímo z krve, což znamená výrazné zjednodušení a zrychlení analýz. Obrázek 8: Vizualizace kvantových teček s různou emisní vlnovou délkou, jež díky své specifické afinitě vyhledaly v organismu zasažené oblasti a zachytily se v nich. Převzato z [20]. změnila v neplanární tzv. tri-gate tranzistor, který vystupoval kolmo k povrchu [21]. 2 Závěr Nanotechnologie se uplatňují téměř ve všech oblastech lidské činnosti od stavebnictví a automobilového či leteckého průmyslu po informační technologie, ale i ve výzbroji armád. Tento text pouze stručně ukazuje na historii a počáteční vývoj v oblasti nanotechnologií. V posledních letech došlo k prudkému rozvoji nanomateriálů a velký přínos byl zaznamenán hlavně v medicíně a farmaceutickém průmyslu. Revolučním objevem je zcela určitě jejich využití při odhalování nemocí nebo jako náhrada tělních tkání. Za zmínku rozhodně stojí i tzv. cílený transport léčiv, to jest dopravování léčiva ve správný čas na správné místo v organismu. Překročení magické hranice 100 nm v elektronice nastalo s procesorem Intel Pentium 4 v roce Tento čip byl vyroben technologií s rozlišením 90 nm a oprávněně patří do světa nanotechnologií, i když samotné tranzistory byly větší než 100 nm. Tuto technologii CMOS vyvinula firma Intel a už od roku 1971 splňuje Moorův zákon o zvyšování integrace. Teprve Intel Core 2 Duo z roku 2007 lze označit za procesor obsahující nanosoučástky vyrobené technologií s rozlišením 45 nm. Už v 90 nm technologii se ukázaly problémy s materiály v nanometrickém měřítku. Tloušťka oxidu oddělující kanál tranzistoru vstupní elektrody (tzv. gate) byla 1,2 nm, což začalo způsobovat tunelování elektronů skrze ni a šířka kanálu způsobovala prosakování proudů po stranách, takže nastaly problémy se spotřebou a zahříváním celého čipu. Z těchto důvodů se začala měnit celá struktura tranzistoru. Již u 65 nm technologie se přešlo na natažený křemík v GeSi struktuře (strained silicon) a úpravu hran kanálu vhledem ke gate, High-k dielektrika u gate tranzistoru pro snížení tunelového jevu, planární struktura se 3 Reference [1] Pavel Řezanka, Kamil Záruba a Vladimír Král, Potenciál modifikovaných nanočástic v analytické chemii. Chem. Listy 101, (2007) [2] Richard P. Feynman, There s Plenty of Room at the Bottom, feynman.html [3] Nobel laureates in Physics, org/wiki/list_of_nobel_laureates_in_physics [4] Some interesting facts, Richard Feynman, [online], [cit ]. Dostupné z: < [5] Integrated circuit, wiki/integrated_circuit [6] A Short History of Nanotechnology, [7] Word of the Week: Nanotechnology [8] Scanning tunneling microscope, en.wikipedia.org/wiki/scanning_tunneling_ microscope [9] Moving Atoms, exhibition of STM images, html 11

17 [10] Scanning tunneling microscope, nist.gov/physlab/general/stm/index.cfm [11] Atomic force microscope, org/wiki/atomic_force_microscope [12] Imaging, measuring and manipulating native biomolecular systems with the atomic force microscope, Booklet/Booklet96/Chapter3/Chapter3.html [13a]Harold Kroto Science education and freethinking, [online], [cit ]. Dostupné z: < pointofinquiry.org/sir_harold_kroto_science_ education_and_freethinking/>. [13b]Bethany Halford, The World According To Rick, [online], [cit ]. Dostupné z: < coverstory/84/8441cover.html?print>. [13c]Newswise, [online], [cit ]. Dostupné z: < articles/nobel-laureate-robert-curl-lectureson-a-brief-history-of-carbon>. [14] Fullerene, Fullerene [15] Sumio Iijima, jst/iijima/eiijima.html [16] Institute for Molecular Manufacturing (IMM), [17] Breakthrough-Scale Design For a Molecular Robotic Hand, org/updates/update28/update html#anchor [18] The Nano Age, Dr Kim Eric Drexler; [online], [cit ]. Dostupné z:< htm>. [19] The Nano Age, Robert A Freitas jr.; [online], [cit ]. Dostupné z: < htm>. [20] Robert A. Freitas Jr., Nanomedicine, Volume I: Basic Capabilities, Landes Bioscience, Georgetown, TX, 1999; nanomedicine.com/nmi.htm [21] M. Bohr, 65 nm Technology for High Performance and Low Power, Intel corp. 12

18 13 POZNÁMKY

19 2MIKROTECHNOLOGIE 2Jaromír Hubálek

20

21 1 Úvod Mikrotechnologie se rozvíjejí od roku 1958, kdy Jack Kilby jako nový inženýr v Texas Instrument, viděl problémy v návrhu obvodů, kterým se říkalo tyranie množství a již na podzim téhož roku představil ve firmě první kousek germania připojeného k osciloskopu, na kterém bylo vidět neustále bez přerušení generovanou sinusovou vlnu. Robert Noyce o pár měsíců později nezávisle na Kilbym představil obdobný čip na křemíku. Rozvoj mikrotechnologií byl tedy podmíněn potřebou miniaturizovat elektroniku na dnes již tak známé čipy. Později, vedle potřeby mikroelektroniky, se rozvíjely techniky depozice materiálů pro optiku (heteropřechody), nové elektronické součástky (na bázi GaAs), materiálové inženýrství (magnetické vrstvy pro záznam dat), a podobně. Od roku 1967 se také rozvíjelo mikroobrábění, které vyvrcholilo v technologii MEMS (Mikroelektromechanické systémy). Součástky pro senzoriku tedy stojí za dalším velkým rozvojem mikrotechnologií. V současnosti rozvoj těchto technik umožňuje vyrábět nanosoučástky a techniky tak zasahují do oblasti nanotechnologií. 2 Techniky depozice materiálů Tenkovrstvou technologií jsou označovány všechny techniky, jež umožňují depozici anorganických vrstev s tloušťkou obvykle do 1 μm fyzikálními metodami. U některých technik je samozřejmě možné dosáhnout i větších tlouštěk, ale ve většině případů nejde o nízkonákladové depozice, popř. se již značně mění fyzikální vlastnosti deponované vrstvy. Tyto techniky lze rozdělit do dvou základních metod: vakuových a nevakuových. Vakuové techniky přípravy tenkých vrstev rozdělujeme na fyzikální (PVD Physical Vapour Deposition) a chemické (CVD Chemical Vapour Deposition) za pomocí plazmatu nebo bez něj. Vakuová napařování chemické jsou známá pod zkratkami LPCVD, PECVD, MOCVD, ALD, SAM), fyzikální naprašování (sputtering) a laserové depozice (laser ablation). Mezi depoziční techniky patří také nevakuové způsoby jako elektrodepozice (electrochemical deposition), sol gel techniky. Těmito metodami se získají vrstvy, ve kterých se pomocí masky vytvářejí motivy následným selektivním leptáním, popřípadě deponováním přes masku, tj. přímým vytvářením motivu. Závislost střední dráhy λ na tlaku: kde p je tlak (Pa). 0,05 λ = p, (1) Příklady: 760 Torr ~ l = 6, mm. 1 Torr ~ l = 0,05 mm. 0,2 Torr ~ l = 0,25 mm. Pozn. 1 Torr 133,32 Pa. Rozdíl mezi PVD a CVD technikami je kromě principu i v pracovní teplotě. Podle Obr. 1 je zřejmé, že CVD techniky jsou energeticky náročnější, protože je potřeba komoru vyhřívat na teploty mezi 750 C až 1100 C. PVD techniky pracují při výrazně nižší teplotě a často je tato teplota dána vlastním ohřevem v důsledku depozice, tj. depozicí částic o vysoké energii (naprašování). Pro dosažení dobrých strukturních, morfologických a adhezních vlastností deponované vrstvy je nutná vysoká energie částic, která se dosahuje teplotou nebo plazmou. CVD techniky využívající asistenci plazmy používají výrazně nižší teplotu ohřevu (PECVD), protože potřebnou energii dodá plazma. 15

22 Obrázek 1: Teplotní rozložení podle jednotlivých metod. Převzato z [1]. A) B) Obrázek 2: A) Vakuové termální napařování, B) rychlost depozice v závislosti na teplotě substrátu. Převzato z [2]. 2.1 PVD metody Jednou z prvních a nejjednodušších metod je vakuové teplotní napařování, většinou formou odpaření kovů a následná kondenzace na chladnější destičce. Toto jednoduché napařování má řadu nevýhod, hlavně ve špatné adhezi. Výhodou je možnost přímého řízení tloušťky depozice pomocí piezokrystalu. Částice (atomy, molekuly) nanášeného materiálu jsou z něj uvolňovány důsledkem jeho zahřívání v uzavřeném systému, kde se při určité teplotě ustaví rovnovážný tlak, nazývaný tenze nasycených par. Je li v tomto systému porušena rovnováha a v určitém místě je teplota nižší, dochází v tomto místě ke kondenzaci par [2]. Tím jsou vytvořeny podmínky pro přenos materiálu z místa o vyšší teplotě (z výparníku) do místa o teplotě nižší (na podložku, na níž roste tenká vrstva) viz Obr. 2. Rychlost depozice tak závisí na teplotě substrátu. Fyzikální vakuové napařování bylo používáno často k nanášení vrstev NiCr a SiO (vžilo se také označení chromniklová technologie), kdy je na podložku nanesena vrstva NiCr. Po jejím nanesení je vytvořena vrstva Ni tvořící difúzní bariéru a adhezní podklad pro vodivou vrstvu Au. Tato technika v závislosti na typu ohřevu umožňuje dále vytvářet vrstvy jako W, Ta, Ni, Fe, Mo, Ag, Pt, C, Nb, sloučeniny jako SiO 2, MgF 2, Al 2 O 3, CeO 2, ZrO 2, TiO 2, ZnS a polovodiče jako InSb, GaAs, CdS, PbSe. Mezi nejpoužívanější PVD metody patří naprašování. Princip naprašování bude vysvětlen na katodovém naprašování, jež je základem všech zařízení. Princip technologického zařízení lze názorněji vysvětlit podle Obr. 3. V pracovní komoře, obsahující inertní plyn, je za sníženého tlaku 10 1 Pa (jemné vakuum) vytvořen mezi anodou a katodou doutnavý výboj. Materiál, který chceme naprašovat, tvoří katodu. Substráty pro naprašování, na nichž chceme vytvořit vrstvu, jsou umístěny na anodě. V doutnavém výboji není potenciál mezi elektrodami rozložen rovnoměrně, nýbrž tvoří u katody tzv. katodový spád. Kladné ionty plynu vznikající ve výboji jsou unášeny směrem ke katodě a dopadají na ní téměř rychlostí, kterou získaly v prostoru katodového spádu. Bombardováním urychlenými 16

23 ionty inertního plynu se z katody uvolňují částice ve formě neutrálních atomů a částečně i iontů, které se usazují na okolních tělesech a tedy i na podložkách umístěných na anodě. Jinými slovy, je li pevný materiál katody bombardován atomy, ionty nebo molekulami inertního plynu s kinetickou energií převyšující vazebnou energií atomů odprašovaného materiálu (viz Obr. 4A.), dochází nejprve k migraci atomů v povrchových vrstvách materiálu katody a následně k vypuzení atomů z tohoto materiálu do plynné fáze (odpaření, viz Obr. 4B). A) B) Obrázek 4: Povrch terče (targetu): A) před srážkou s atomy targetu, B) po srážce s atomy targetu. Přepracováno z [2]. Obrázek 3: Vakuový systém pro katodové naprašování. Převzato z [2]. Obrázek 5: Princip směrování částic vlivem elektrického (E) a magnetického (B) pole. Převzato z [2]. Dalším vývojem byla vyvinuta technika magnetronového naprašování (magnetron sputtering), kde target s naprašovacím materiálem je během procesu umístěn v silném magnetickém poli, viz Obr. 5. Touto technikou se dociluje mnohem koncentrovanější depozice díky směrováním částic vlivem magnetického pole do středu [2]. Příklad takovéto katody a vytvořeného plazma představuje Obr. 6. Je li hlavice katody vyrobena stejně jak ukazuje obrázek, budou se částice pohybovat po kružnicích od katody k anodě. Nebude tedy docházet k neefektivnímu rozptylu částic do krajů depoziční komory. Obrázek 6: Katoda s magnetronem a vytvořené plazma. Převzato z [3 5]. Tato technika se v zahraničí nazývá DC sputtering. Katodové naprašování bylo dříve označováno jako tantalová technologie, kdy pro odporové vrstvy byly použity vrstvy TaN a pro dielektrické Ta 2 O 5. Po nanesení vrstev obsahují tyto vrstvy filmy značné množství strukturních 17

24 nehomogenit a defektů. Ve vrstvě proto mohou probíhat děje projevující se dlouhodobými změnami elektrických parametrů a směřující k dosažení termodynamické rovnováhy systému. To lze urychlit preventivním vyzráním vrstvy za zvýšené teploty. Např. vrstvy NiCr se stabilizují při teplotě 300 C po dobu 1 hodiny, popř. pro docílení vysoké stability dále při teplotě 200 C po dobu 24 hodin. Vrstvy TaN se stabilizují při teplotě 300 C po dobu 16 hodin. Stabilizované vrstvy vykazují velmi dobré elektrické vlastnosti. 2.2 CVD metody Těchto metod se dnes využívá velké množství. Liší se tlakem, použitými prekurzory, asistencí plazmy nebo laseru apod. Nejpoužívanějšími jsou: nízkotlaké LPCVD (Low Pressure CVD), za atmosférického tlaku APCVD, s palzmou PECVD (Plasma Enhanced CVD) nebo též PACVD (Plasma Assited CVD) a MWPCVD (MicroWave Plasma CVD), depozice z organických prekurzorů MOCVD (Metal Organic CVD), SAM CVD (Self Assembly monolayer CVD), depozice atomových vrstev ALD (Atomic layer deposition), Epitaxní CVD (Vapor Phase Epitaxy VPE) a Epitaxní ALD (Atomic Layer Epitaxy ALE). Tento způsob napařování vychází z chemické reakce nebo rozkladu plynu o dvou prvcích AB. Prvním typem je rozklad (např. silan SiH 4 ) přicházejícího do studené oblasti, kde pouze A (např. Si) je deponován na studenější substrát a prvek B (H 2 ) je odváděn vývěvou z aparatury. Tato technika se v polovodičové technologii využívá převážně pro epitaxi křemíku nebo germania (při využití germanu GeH 4 ). Teplotní spády jsou pro Si C/950 C, pro germanium 300 C/250 C. Pro epitaxi se užívá jodid křemíku nebo germania. Rychlost růstu je poměrně vysoká, u germania činí až 400 Å/s [6]. Další možností CVD je využití dvou a více plynů najednou, které spolu reagují, a jejich produkt je deponován na podložku. Podle druhu reakce těchto plynů (redukce, oxidace a nitridace) vznikají vrstvy kovů, oxidů nebo nitridů. Anorganické i organické polymery lze připravit z monomerní páry elektronovým svazkem, UV zářením nebo doutnavým výbojem. Nepolymerní vrstva se expozicí polymerizuje a stává se tak odolná vůči některým rozpouštědlům. Doutnavý výboj je méně využíván a to jen u monomerů jako např. styren. Tabulka 1: Porovnání vlastností některých metod. Přepracováno z [6]. CVD Proces Výhody Nevýhody Aplikace APCVD Jednoduché, rychlá depozice, nízká teplota Špatné pokrytí hran, kontaminace Nízkoteplotní oxidy (LTO) A) LPCVD Excelentní čistota a uniformita, dobré pokrytí hran, vhodný pro velké desky Vysoká teplota, pomalá depozice Vysokoteplotní oxidy (HTO), Nitrid křemíku, Poly Si, W, WSi2 PECVD Nízká teplota, dobré pokrytí hran Chemická a částicová kontaminace Nízká teplota, izolace na kovech, pasivace nitridy B) Obrázek 7: Horizontální pec (A), vertikální pec (B). Přepracováno z [7]. 18

25 Používané reaktory jsou dvojího druhu: nejběžnější je horizontální reaktor tvořený quartzovou trubkou (viz Obr. 7). Řízení a udržení konstantní teploty je u této konfigurace jednodušší. Trubkou prochází inertní plyn (dusík) do kterého se v momentě počátku depozice přimíchá prekurzor a reakční plyn. V horké zóně dochází k reakci, přičemž produkt je deponován na Si desky uložené v tzv. lodičkách, odpadní plyn je odsáván vývěvou. Druhý typ komory je vertikální. Tento typ se využívá jak pro depozice na celou vsádku většího počtu desek umístěných nad sebou nebo se může jednat o jednodeskový reaktor, které jsou běžné pro výzkum a vývoj. Prekurzory a reakční plyny pro CVD procesy, pro depozici vrstev [6]: SiO 2 : SiCl 2 H 2 /SiH 4 + N 2 O/O 2 (> 650 C). SiO 2 : TEOS + O 2 /O 3. Si 3 N 4 : SiCl 2 H 2 + NH 3 ( C), 100 Å/ min. 3SiH 4 + 4NH 3 ( C). Si X N Y O Z : SiCl 2 H 2 /SiH 4 + O 2 /N 2 O + NH 3. AlN : AlCl 3 /AlBr 3 + NH 3. TiN : TiCl 4 + NH 3 + 0,5H 2. HfO 2 : HfCl 4 + 2CO 2 + 2H 2. Poly Si, Si : SiCl 2 H 2. Difúze příměsí B, P, As Termální oxid Oxidace Si desek pro výrobu procesních masek se provádí termálním procesem. Tento proces může být suchý v přítomnosti O 2 nebo mokrý v přítomnosti vodní páry. Teploty se u těchto procesů pohybují v rozsahu ( ) C (Obr. 8). Do plynu se poté přidává např. PH 3 (PSG) nebo B 2 H 6, BCl 3 (BSG), ale může být i směs obou (BPSG) Pasivační vrstva SiO 2 Pasivace minimalizuje povrchové rekombinace tím, že sníží počet volných povrchových vazeb navázáním atomů vodíku, kyslíku nebo dusíku. Pasivační vrstva blokuje difúzi sodíku, vodní páry, oxidu uhličitého atd., zakončuje volné vazby křemíku a může vázat kladný nebo záporný náboj (pasivace n typového nebo p typového povrchu). Pasivace pomocí SiO 2 se provádí pomocí LPCVD při teplotě 850 C a tlaku 0,6 Torrů. Rychlost depozice je 20 Å/min a využití dichrosilanu v reakci [6]: N 2 O+ SiH 2 Cl 2 SiO 2 +HCl+N 2. (2) Pasivační i SiO 2 vrstvy se deponují i za pomocí TEOS (tetraethyl orthosilicate). Tento organický plyn má jednu velkou výhodu a to je přesné obsazení všech volných vazeb křemíku. Tím se dosahuje perfektní homogenity a pokrytí je stejnoměrné i na hranách (viz Obr. 9). Deponovaný SiO 2 není zcela čistý. Při LPCVD se využívá jako reakční plyn kyslík, nebo ozón, jenž je silnější oxidační činidlo a lze tedy snížit teplotu procesu [6]: SiO 2 : TEOS + O 2 (> 650 C). SiO 2 : TEOS + O 3 (> 600 C). Pasivace pomocí TEOS za pomocí PECVD při teplotě 400 C, tlaku 10 Torrů, kmitočtu RF zdroje plazmy 13,56 MHz roste SiO 2 rychlostí 7000 Å/min (v jednodeskovém reaktoru) Reakce je následující: O 2 + (C 2 H 5 O) 4 Si SiO 2 + CO + CO 2 + H 2 O. (3) Obrázek 8: Rychlost depozice v závislosti na mokré nebo suché oxidaci. Převzato z [2] Pasivační vrstva Si 3 N 4 Metodou LPCVD se provádí pasivace při 800 C, tlaku 0,2 Torrů. Rychlost depozice je v těchto podmínkách cca 30 Å/min při použití 19

26 Využívá zdroje o vlnové délce 193 nm, umožňující dosáhnout rozlišení 36 nm. Pokročilejší technikou je fázové posunutí masek (Phase shift mask) [12] viz Obr. 11. Jedná se o jednu z techdichlorsilanu v následující reakci: NH 3 +SiH 2 Cl 2 Si 3 N 4 +HCl. (4) Deponovaná vrstva je stechiometrická. Při využití PECVD bude teplota nižší, tj. 400 C při tlaku 2 Torry, frekvenci RF zdroje 450 khz. Pro reakci se užívá silan: NH 3 + SiH 4 Si 3 N 4 + H 2. (5) Poměr plynů je 3, 44 : 4. Rychlost depozice se dosahuje kolem 250 Å/min. A) využívající elektronového svazku vychylovaného soustavou speciálních čoček (založeno na principu elektronového rastrovacího mikroskopu), jímž se přímo kreslí do rezistu celý motiv. Tato litografie má velké rozlišení, ale doba na vytvoření motivu je velmi dlouhá nákladná technika, proto se používá převážně pro výrobu masek. Druhou je fotolitografie využívající zdroje světla (ultrafialového) k osvitu přes již připravenou masku, což je vhodná technika pro masovou výrobu. Rozlišení této litografie je dáno několika parametry vycházející ze vztahu: k. λ r =, (8) NA kde je NA = n.sinθ numerická apertura, n je refrakční index (bod lomu) mezi čočkou a waferem, k je index závislý na konkrétním zařízení pro fotolitografii, θ je maximální úhel dopadu světla. Čím kratší je vlnová délka použitého záření a čím vyšší je numerická apertura projekčních čoček zároveň s vyšším refrakčním indexem fotorezistu, tím vyšší může být rozlišení (Obr. 10) [10, 11]. Rozlišujeme systémy kontaktní, blízká a projekční. Každý má své výhody a nevýhody. B) Obrázek 9: Vázání molekuly TEOS na Si desku (vlevo), pokrytí struktury vyleptané do Si vrstvou SiO 2 pomocí PECVD a TEOS. Převzato z [8] a [9]. 3 Litografie Technika umožňující přenášení motivů (topografie) do vrstev. K tomuto účelu slouží fotorezisty, které se osvítí zdrojem záření a ve vývojce se odplaví nepotřebný polymer a následnou depozicí (lift off technika pouze nízkoteplotní metody) nebo leptáním se topografie přenese do anorganického materiálu. Rozlišujeme dvě litografie, které se principiálně velmi odlišují. První je elektronová litografie Obrázek 10: Porovnání dvou způsobů fotolitografie s numerickými aperturami menší a větší než 1. Upraveno podle [10]. 3.1 DUV (Deep Ultra Violet) fotolitografie 20

27 nik ke zvýšení rozlišovacích schopností DUV fotolitografie. Využívá interference a změny fáze k zlepšení kontrastu. Lze s ní tvořit extrémně malá hradla. 3.2 EUV (Extreme Ultra Violet) fotolitografie 13 nm S touto litografií využívající záření o vlnové délce 13 nm lze dosahovat rozlišení pod 22 nm, kde DUV již nelze použít. Obrázek 11: Fázově posunutá maska pro zlepšení rozlišení DUV. Převzato z [13]. Pro zajištění vyššího rozlišení než dovolovala NA, bylo možné provádět pomocí dvojitého přenosu masek, který ale byl náročný pro velký počet kroků. Proto se dnes používá spíše dvojitá expozice (Double Dipole Lithography), která skládá výsledný obraz ze dvou expozic [14]. V podstatě jde o vytvoření dvou masek, které se po sobě osvítí, aniž by byla deska s rezistem nějak zpracovávána. U velmi malých rozměrů je již význačný problém způsobený proximity efektem a obrazce jsou velmi zkreslené. Z tohoto důvodu se dnes používá např. jiný způsob potlačení proximity efektu je překreslení motivu a využití tohoto efektu k dokreslení do požadovaného tvaru (Optical Proximity Correction) viz Obr Technologie MEMS Tato technologie je pokročilá technologie postavená na polovodičové mikrotechnologii. Využívá leptacích technik pro vytváření Mikro Elektro Mechanických Systémů. Leptání rozlišujeme na suché (iontové) nebo mokré (vodné i nevhodné leptací roztoky). Běžně se materiály leptají izotropním způsobem, mluvíme o izotropním leptání, což znamená všesměrové leptání, tj. rychlost leptání materiálu probíhá ve všech rovinách přibližně stejně. Monokrystalický křemík, který se v MEMS technologii výhradně používá, přináší možnost anizotropního leptání, tzn. leptání není zcela všesněrové, protože existuje vždy nějaká rovina, kde je rychlost leptání o několik řádů pomalejší. Horní rovina křemíkové desky je vyráběna s určitou orientací, tj. rovinou z jeho kubické krystalové mřížky. Tyto roviny jsou označovány Millerovými indexy. Tyto nejpoužívanější roviny jsou znázorněny na Obr. 13. Obrázek 12: Přenos motivu za pomocí OPC (Optical Proximity Correction). Převzato z [13]. Imerzní litografie využívá výrazně vyšší NA (Obr. 10), která je díky náhradě vzduchu mezi maskou a deskou za kapalinu vyšší než 1. Díky této technice bylo možné DUV využít i v technologii 32 nm [15]. Kapalina na druhou stranu přináší problémy, jako jsou bublinky a rovnoměrné rozložení teplot a tlaků v kapalině. Obrázek 13: Používané krystalové roviny monokrystalického křemíku. Při anizotropním leptání křemíku obvykle není leptána rovina (111). Příklady ukazující jak bude leptán křemík s rovinami (100) a (110) je na dalším Obr. 14. Je zřejmé, že u křemíku (100) se odhaluje rovina (111) pod určitým úhlem, který je přibližně 54. U desky (110) je rovina 21

28 (111) kolmo k povrchu, proto v tomto případě lze provrtat křemíkovou desku jako by to bylo pomocí vrtáku. Obrázek 14: Příklady leptání dvou rozdílných monokrystalů křemíku anizotropním způsobem [2]. Je nutné si uvědomit, že rovina (111) má danou orientaci a při leptání otvorů určitého tvaru může dojít k jeho deformaci, viz Obr. 15. V technologii MEMS tyto leptací techniky nazýváme mikroobrábění, přestože nejde o mechanické obrábění. Mikroobrábění rozlišujeme dva druhy: povrchové a objemové. akcelerometry využívající piezoelektrický snímač v podobě cantileveru (Obr. 18) nebo diferenční kapacitní princip snímání (Obr. 19) podobně jako gyroskopy nebo to jsou senzory tlaku využívající tenkou membránu. Tato membrána může být využita také jako teplotně odizolovaná část např. pro polovodičové odporové senzory plynů, jejich pracovní teplota se pohybuje nad 100 C, tzv. micro hotplate. Cantilever se také používá pro biosenzory jako gravimetrický senzor [2, 16, 17]. Obrázek 17: Příklad objemového mikroobrábění při vytváření tenké membrány [2]. A) Obrázek 15: Mikrosnímek leptaných štěrbin do desky (110) [16]. Povrchové mikroobrábění znamená vytváření sendvičové struktury vrstev na povrchu desky (substrátu) a poté pomocí litografie a leptání se vytváří požadovaný mechanický díl, viz Obr. 16. B) Obrázek 18: Postup vytváření piezoelektricky ovládaného cantileveru (A), mikrosnímek vyrobeného cantileveru piezoelektricky vychýleného (B) [2]. Obrázek 16: Povrchové mikroobrábění jazýčku (Cantilever) [2]. Objemové obrábění znamená leptání do objemu desky (substrátu). Tímto procesem lze vytvářet hluboké jámy pro vrstvení uvnitř těchto jam nebo pro uvolnění na povrchu připravené mechanické části, a dále membrány (Obrázek 17). Využití těchto systémů je v senzorice popř. jako aktuátorů. Nejčastější realizace je zaměřena na Obrázek 19: Kapacitní snímač zrychlení od firmy Analog Devices obsahuje jednu pohyblivou elektrodu a dvě pevné (diferenční uspořádání) [18]. 22

29 5 Technologie pro mikroa nanoelektroniku Mikroelektronika využívá realizace na Si deskách 4", 6" a 8". Tyto desky se opatří epitaxní vrstvou. Pokud je třeba realizovat utopené oblasti (u bipolárních tranzistorů), tak ještě před epitaxí se provede difúze pro tyto oblasti včetně míst pro budoucí izolační stěny mezi prvky (Obr. 20 A). Epitaxe křemíku je vrstva monokrystalu vytvořené za pomocí CVD a v této vrstvě se realizují všechny polovodičové součástky (Obr. 20). Dalšími difúzemi a rozdifundováním vznikají přechody pn. Nakonec dojde k silné podpovrchové difúzi pro kontaktovací metalickou vrstvu k zajištění rezistivního přechodu s velmi malým odporem. Poslední vrstvou je pasivace pomocí nitridu, která chrání čip před okolními vlivy [18]. V současnosti se užívá převážně CMOS technologie, tj. technologie s páry integrovaných prvků PMOS a NMOS na deskách o velikosti 10"a 12". Při přechodu technologie na 90 nm byla poprvé překonána hranice 100 nm a lze mluvit již o nanotechnologii. A) V současnosti se užívá převážně CMOS technologie, tj. technologie s páry integrovaných prvků PMOS a NMOS na deskách o velikosti 10"a 12". Při přechodu technologie na 90 nm byla poprvé překonána hranice 100 nm a lze mluvit již o nanotechnologii. Snižování rozměrů ukázaly řadu problémů, které se objevily a postupně odstraňovaly v následujících technologiích. Šlo především o použití jiného materiálu pro metalizaci, záměna hliníku za měď (již v technologii 130 nm), problémy s velkým příkonem díky parazitním proudům, odvod tepla, atd. Nedostatečná mobilita nosičů byla vyřešené epitaxními vrstvami Strained Si předpjatého křemíku, jehož krystalová struktura byla ve vertikálním směru natažena na velikost krystalu germania (u 90 nm technologie). U 65 nm bylo integrováno na rozměr hrotu propisky 10 milionů tranzistorů, technologie obsahuje mnoho vrstev metalizace, což opět přináší komplikovaný návrh masek vzhledem k možnostem propojení. Velmi tenké vrstvy dielektrika (SiO2) gatu tranzistorů způsobovaly velký tunelový proud a tím příkon a proto byl tento materiál nahrazen tzv. high k dielektriky jako např. oxid hafnia (HfO) u technologie 45 nm. Kanál tranzistoru byl již velmi malý (větší odpor), proto se nejprve přešlo na double gate a poté na tri gate tranzistor, který měl podstatně nižší odpor kanálu a rychlejší spínání (Obr. 21) [19, 20]. B) Obrázek 20: Si substrát před epitaxí (A), řez strukturou bipolárního tranzistoru (B) [18]. Obrázek 21: Tri gate tranzistor (velvo) [19], mikrosnímek trigate tranzisotorů v paměti SRAM (vpravo) [20]. 23

30 6 Reference [1] Internetové stránky Production Machining: articles/cutting tool coating production, 2011 [2] Hubálek J. a kolektiv, Mikrosenzory a mikroelektromechanické systémy, elektronické učební texty, VUT v Brně, p. 149, 2011 [3] Internetové stránky Plasmionique: [4] Internetové stránky Milman Thin Film Systems Pvt. Ltd.: milmanthinfilms. com/index.php/products/ subsystems-/magnetron sputtering cathodes, 2010 [5] Internetové stránky Gencoa: gencoa.com/1,122-what is a plasma.htm, [6] H.O. Pierson, Handbook of Chemical Vapor Deposition, William Andrew Publishing, New York, USA, 1999 [7] Internetové stránky společnosti CRYSTEC: [8] Internetové stránky Time Domain: www. timedomaincvd.com, 2011 [9] Internetové stránky společnosti Oxford Instruments: instruments. com, 2012 [10] Matsumoto, K.; Costner, E.; Nishimura, I., Ueda, M.; Willson, C. G. High Index Resists for 193 nm Immersion Lithography, Proc. SPIE 6923, (2008) [11] Taylor, J.C.; Costner, Elizabeth A.; Goh, Sumarlin; Wojtczak, W.; Dewulf, D.; Willson, C. G. The effect of added salts on the optical properties of water for high index immersion lithography fluids, JVST, B: 26(2) (2008) [12] Lin, Qun Ying, Tan, Sia Kim, Tan, Soon Yoeng, Chong, Huey Ming, Half tone alternating phase shift masks. United States, Chartered Semiconductor Manufacturing, LTD (Singapore, SG), patent č , html [13] Internetové stránky o technologii Intel: ixbtlabs.com/articles2/intel-65 nm/ litho.html, 2011 [14] Byers, Jeffrey; Lee, Saul; Jen, Kane; Zimmerman, Paul; Turro, Nicholas J.; Willson, C. Grant. Double exposure materials: simulation study of feasibility, Journal of Photopolymer Science and Technology 20(5) (2007) [15] Costner, Elizabeth; Lin, Michael W.; Jen, Wei Lun; Willson, C. Grant. Nanoimprint Lithography Materials Development for Semiconductor Device Fabrication., Annu. Rev. Mater. Res. 39, (2009) [16] The MEMS Handbook. Edited by Gad el Hak, CRC Press 2005, Second Edition [17] Fundamentals of microfabrication: the science of miniaturization. Marc J. Madou, CRC Press, 2002 [18] Internetové stránky Analog Devices: [19] Bipolární technologie 2.2 cz, prezentace On Semiconductor [20] J. Kavalieros, et al., Tri gate transistor Architecture with High k Gate Dielectrics, Metal Gates and strain Engineering, source Intel, USA [21] R. S. Chau, Integrated CMOS Tri Gate Transistors: Paving the Way to Future Technology Generations, Technology@ Intel Magazine, 1-7 (August 2006). 24

31 POZNÁMKY 25

32

33 3 Miroslav 3ULTRA-HIGH VACUUM TECHNIQUES: EVAPORATION, LEED AND XPS Kolíbal, Jindřich Mach

34

35 1 Evaporation 1.1 Basic principles During evaporation the evaporant (solid or liquid) is heated up. The temperature increase is followed by an increase of vapor pressure and, hence, the evaporant sublimates (or evaporates if it is liquid). The evaporant atoms, now in the gas phase, can eventually condensate on a substrate, placed above the evaporant source. The schematic view of evaporation is shown in Fig. 1. Henrich Hertz experimentally found that the evaporation rate (dn/dt) is proportional to (P* P), where P* is the equilibrium vapor pressure of the evaporant at temperature T and P is the ambient hydrostatic pressure acting upon the evaporant in the condensed phase (reminder: equilibrium vapor pressure is the partial pressure of a gas in equilibrium with its condensed phase at a given temperature T). The general Hertz-Knudsen equation can be written in the form d N Adt = α 1/ 2 * ( 2π mk T ) ( P P) B, (1) where A is the evaporating surface area, α is the sticking coefficient for vapor molecules onto the surface (Knudsen postulated that the impinging molecules may be reflected back), m is the molecule s mass and k B is the Bolzmann constant. Eq. 1 is in agreement with the kinetic theory of gases in which the impingement rate is proportional to pressure. Hertz also found that the evaporation rate could not be increased by supplying more heat unless the equilibrium vapor pressure was also increased by this action. The maximum evaporation rate is set by P*, and this is only achieved in vacuum, where P = 0. Another limiting factor is α, which is usually much less than unity. In 1909 Knudsen invented a technique to force α to 1. This is called a Knudsen cell or an effusion cell, shown in Fig. 2. The orifice acts like an evaporating surface of area A at P*, but it cannot reflect incident vapor molecules, so that α = 1. Figure 2: Knudsen cell. The cell enclosure (blue) is isothermal, with a small orifice of an area A. Surface area of an evaporant (yellow) inside the crucible (black) is large compared to the area of the orifice. Inside the enclosure an equilibrium vapor pressure is maintained. Right: the geometry of the commercial evaporation tools. Figure 1: Schematic of the evaporation process. Several phase changes occur, namely sublimation or evaporation from a solid or liquid evaporant, respectively, which is followed by the condensation from a gas phase onto a substrate. 27

36 The evaporation onto a spherical surface is uniform due to a cosine law where d M d A c c M e = cosϕ cosψ,, (2) 2 π r r cosϕ = cosψ = 2r a, (3) where M c and M e are the condensate and evaporant masses, respectively, and A c is the area of condensation. Hence, this geometry allows uniform coating inside i. e. light bulbs and planetary wafer tooling in vacuum coating equipment. where Δμ is the change in chemical potential (defined as k BT ln P/P*), N is the number of particles and γ is the surface free energy. The first term in eq. 5 relates to the volume and the second is the surface term. The minus sign before the volume term refers to the fact that the addition of an atom into the nuclei decreases the Gibbs free enthalpy, while the surface term increases due to the increase of the nuclei surface. Hence, there exists a critical nucleus, which is a critical size above which the nucleus will grow, otherwise it will cease (see Fig. 3A, B). 1.2 Atomistic processes during evaporation The most important processes happening upon condensation are diffusion, desorption and nucleation (see Fig. 3A). The adatoms diffuse on the substrate and before being desobed they can eventually form a nuclei upon collision with other atom(s). The diffusion length λ is defined as Dsτ s, where D s is the diffusion coefficient and τ s is the time adatom spends on the surface before being desorbed. Both these quantities depend on temperature (D s increases and τ s decreases with temperature). The nucleation length d nucl (mean distance between the nuclei) depends on both jump distance rate ν (or diffusion length) and incoming atom flux F as d nucl 1/ 6 ν = const F (4) The probability of stable nucleus formation is treated by classical nucleation theory. Here, the positive change in the Gibbs free enthalpy ΔG after adding an atom in the nucleus means unstable and negative change stable nucleus formation: 2 / 3 G = µ N + N γ, (5) A) B) Figure 3: A) Atomistic processes during growth. A- descent from a step edge, B nucleation, C attachment to a step, D diffusion along a terrace, E desorption. B) Dependence of the Gibbs free enthalpy on number of atoms in the nucleus. Critical nuclei sizes for different Δμ are marked with dashed lines. 1.3 Growth modes Formation of thin films can be characterized by the following three principal growth modes: layer-by-layer growth (also known as Frankvan der Merve) 2D morphology; next layer starts to grow after the previous one is completely finished, island growth (Volmer-Weber) 3D morphology, layer + island growth (Stranski-Krastanov) initially 2D morphology; after reaching the critical thickness 3D-island formation takes place. 28

37 The growth modes are schematically shown in Fig. 4. Under thermodynamic equilibrium conditions, the following quantities determine which growth mode will take place: γ s, γ o and γ i surface free energy of the substrate-vacuum interface, the overlayer-vacuum interface and substrate-overlayer interface, respectively. For the layer-by-layer growth the following criterion holds: γ o +γ i γ s (in the case of equality the criterion is called Young s equation). The condition γ o > γ s results in the island growth. Since the lattice constants of the overlayer and substrate are more-or-less different, a strain is induced. In such a case the overlayer carries an elastic energy which acts as an additional component of the left side of layer-by-layer growth criterion. It is clear that when the strain reaches a certain value, layer-by-layer mode is switched over to the island mode (Stranski-Krastanov). Even in the case of the layer-by layer growth the strain relief results in the structural defects such as dislocations, which usually negatively affect the functionality of the designed device. Obviously, a great effort was made to reduce the strain during the growth of functional multilayers. This can be done by introducing a buffer layer or a superlattice. The considerations mentined above are valid under the thermodynamic equilibrium only. The conditions in real systems are far from equilibrium (low deposition temperature and high deposition rate) and the growth is ruled by kinetics rather than thermodynamics. It is obvious that the most critical parameters affecting the growth Figure 5: Poisson growth mode, also called multilayer growth. If the mobility of adatoms is negligible, they stick where they hit the target. The next layer can start to grow even if the small fraction of the previous one was built [1]. mode are the diffusion of adatoms on the surface and the ability to descent the step edges (see Fig. 3A). For example, to promote the layerby-layer growth it is necessary that every atom deposited on the top of the already grown island can travel to the edge and, additionally, descent so it can be incorporated into the growing layer. There is an indispensable energetic barrier connected to this process (Ehrlich-Schwoebel barrier). An example of an extreme case of the growth in the kinetic regime with negligible adatom mobility is shown in Fig. 5. Naturally, the mobility and the barrier heights are both elementally-dependent, which opens the ways to affect the growth mode. The growth can be controlled by changing the conditions of the growth (ν/f ratio, see above) or by adding the third species into the growth process. The former case is common in the growth of multilayer structures. While the growth of A material A on the B one can be perfectly 2D, the next layer of B on A need not grow in the 2D mode. This can be partially resolved by periodical changes of the growth conditions (deposition rate or substrate temperature). The mobility of deposited atoms is limited by the number of defects present on the surface. This can be varied by the ion bombardment during the initial phase of a layer formation. The latter case is based on the introduction of the third species, a socalled surfactant, into the growth process. The explanation of surfactants principle is still a matter of debate; it seems that it is specific for different substrate/adsorbate combinations. Although many surfactants are known (Sb, As, Pb), adsorbed gases are favored since they are much more easily removable. A) B) C) Figure 4: Principal growth modes of thin films. A) layerby-layer, B) island and C) layer+island growth mode [1]. 29

38 1.4 Experimental details A) 2 Low energy electron diffraction 2.1 Structure of Surfaces The surfaces are usually designated using Miller indices, see Fig. 7A (remainder: Miller indices (hkl) denote a plane that intercepts the three points a1/h, a2/k, and a3/l, or some multiple thereof). The atomistic structure of surfaces can be described by the Bravais lattices (5 types in 2D, see Fig. 7B). B) Figure 6: A) Effusion cell schematic. B) Commercial evaporator for ultra-low vacuum and clean depositions [2]. The evaporators have to be placed into a vacuum vessel (p < 10 6 Pa) in order to allow safe cathode heating, guarantee the long mean free path of evaporated particles and sample cleanness. Several possible geometric configurations are possible. For scientific purposes, small evaporators as the one depicted in Fig. 6 are used. The evaporant is placed inside a crucible. Cathode (tungsten filament) is heated up by the current going through it and emits electrons. The electrons are attracted to the crucible, where a high voltage (up to 1 kv) is applied. As a results of electron bombardment the crusible (and evaporant) is heated and evaporation starts. The resulting particle beam consists of both ions and neutral atoms. The presence of ions allows to measure a current through a colimator tube and, hence, to calibrate the evaporation rate. A) B) Figure 7: A) Several surface planes of cubic lattice with indicated Miller indices. B) 2D Bravais lattices. A oblique, B rectangular, C- square, D hexagonal and E - centered rectangular (rhombic). After [3]. 30

39 Primitive translation vectors are defined as a1 = a11 x + a12 y,a2 = a21x + a, (6) with x and y being the unit vectors of the cartezian coordinate system. Matrix A, defined as a A = a 11 21, (7) is used to define the relationship between the substrate and the superstructure. Note that anu point of the lattice can be denoted using combination of primitive translation vectors of the lattice as r ma + m, (8) a a = 1 a2 22 y Similar to matrix A, there exists a matrix B related to b vectors. Matrix M determines the relationship between the substrate lattice and the reconstruction lattice. Note that the same notation is also used for the adsorbate lattice (usually callaed superstructure). When all the elements of the M matrix are integer numbers, the reconstruction (or superstructure) is called simple. Then the elements are rational numbers, the two lattices are rationally related and the reconstruction is called commensurate. When at least one of the matrix elements is an irrational number, the reconstruction is called incommensurate (see Fig. 9C). where m and n are arbitrary integer numbers. At surfaces, the three-dimensional symmetry is broken. Many materials (notably metals) have a surface lattice which corresponds to the bulk crystallographic (hkl) plane. Metal surfaces usually undergo relaxation, shown schematically in Fig. 8A. During relaxation, the interatomic plane distances change, while the Bravais lattice type and, hence, the translational symmetry of the surface stays the same. Surfaces of semiconductors usually form more complex surface unit cells such a process is called reconstruction (examples in Fig. 8B). Primitive translational vectors of the reconstruction are b = m a + m a,b = m a + m, (9) which can be rewritten as where a2 b 1 b2 m M = m = a M a m m , (10), (11) A) B) Figure 8: A) Relaxation, B) reconstruction. A) B) C) Figure 9: Depending on the elements of the matrix M, the three possible reconstruction (or superlattice) types are A) simple, B) commensurate and C) incommensurate. The reconstructions and superlattices can be described in text using matrix notation (see eq ) or Woods notation: b1 b2 S( hkl) κ, (12) Rϕ a1 a2 where S is the elemental composition of the surface, (hkl) is the surface plane and κ denotes the type of Bravais lattice (p for simple, c for centered). Symbol Rφ o is used if the superlattice is rotated with respect to the substrate lattice. For example see Fig

40 A) B) C) Figure 10: Example of a superlattice. Pd(100) surface (white top surface atoms, grey second layer atoms) with adsorbed oxygen atoms (red). Using the Matrix 2 0 notation, the superstructure is denoted as ( ), in Woods 0 2 notation Pd(100)-p(2x2). Three possible adsoprtion sites for O molecules are possible A) on-top, B) bridge and C) hollow [4]. 2.2 Reciprocal lattice The diffraction image is the projection of the Fourier transformation of the real 2D surface lattice. Fourier transformation of the real lattice is a reciprocal lattice, defined by its primitive translational vectors g 1 and g 2. Similar to the real lattice, any point of the reciprocal lattice is determined by the linear combination of the translational vectors: g = hg1 + kg 2, (13) Diffraction condition can be illustrated using Ewalds construction (see Fig. 11). First, it is necessary to draw a reciprocal lattice. Since in a real 2D lattice there is an infinite distance between the atoms in the direction normal to the surface, in reciprocal space this distance is zero and the lattice is viewed as a series of rods (see Fig. 11). Next, the wave vector k is placed so that its end intersects any point at the reciprocal surface. Due to elastic nature of low energy electrons, k ' = k and, hence, all the end points of the possible wave vectors form a sphere. It follows from the diffraction condition that the end point of any diffracted wave vector must lie on any rod of the reciprocal space. With the change of the electron energy the diameter of the sphere changes, so that the new possible diffraction spots appear (energy is increased) or disappear (energy is decreased). where h and k are arbitrary integer numbers. The relationship between the primitive translational vectors of the real and reciprocal lattices can be expressed as a2 n n a1 g,, (14) 1 = 2π g 2 = 2π a a ( a a ) ( ) 1 2 where is the vector normal to the surface Diffraction condition and Ewald construction Let k and k' be the incident and diffracted electron wave vector, respectively. The necessary condition for diffraction (according to Laue, also called Laue s condition) is k = k ' k = g. (15) Figure 11: Ewald construction of the diffraction condition [4]. For details see text. Resulting diffraction image is a superposition of a diffraction images of a surface and a reconstruction or superlattice. If the symmetry of the substrate is known then the symmetry and periodicity of the reconstruction (or superlattice) can be deduced. The exact position of the primitive 32

41 cells to each other (the positions of individual atoms, Fig. 10), however, can be determined only using I-V curves (see the text below). 2.4 I-V analysis Diffraction pattern geometry can provide information about the periodicity of the substrate and the reconstruction on the surface (a new atomic lattice on the surface, different from that of the bulk material), but cannot give exact positions of the surface atoms. This can be acquired only by a so called I-V analysis. In the I-V analysis one observes intensities of individual diffraction spots against energy of the incident electron beam. Dependence of intensity of the diffraction spot on the energy is called an I-V curve. This curve itself cannot tell us anything about the structure. It needs to be compared to a theoretical I-V curve calculated from an assumed structural model (see Fig. 12). The aim of the I-V analysis is to achieve for this comparison as good agreement as possible and, therefore, indicate the theoretical model as a correct one. Agreement between the measured and calculated I-V curves is judged by so called reliability factors (better agreement - lower reliability factor.) 2.5 Instrumentation LEED technique is based on detection and analysis of diffraction images resulting from the scattering of low energy electrons ( ev) from a crystalline surface. Electrons in this energy range have the wavelength λ = h, (16) 2m E in the range of ( ) Å, which is comparable to the interatomic distance. Hence, the diffraction images are well resolved. The surface sensitivity of LEED is due to a very small inelastic mean free path in solid (Fig. 13). Since the detection system accepts only elastically scattered electrons, the detected electrons carry the information from the very top surface layers. Experimental setup of the LEED optics can be found in Fig. 14. Electrons are emitted by a heated cathode and accelerated to required energy by the corresponding voltage difference between the cathode and the anode. The electron beam is then focused by a set of electrostatic lenses and impacts on the grounded sample. Here the diffraction takes place and diffracted electrons are directed towards the system of 4 grids and a Figure 12: Idea of I-V analysis [4]. 33

42 fluorescent screen. The first grid is grounded to ensure no electrostatic field is present between the sample and the grids, the second and third grids serve as a suppressor (they suppress inelastically diffracted electrons) and the fourth grid is again grounded. The fluorescent screen is at high positive voltage and the electrons are accelerated by the electrostatic field between the fourth grid and the screen to induce fluorescence on the screen thus making the electron spots visible. The whole setup must be placed under UHV (ultra-high vacuum) conditions to ensure the cleanness of the studied sample and provide necessary conditions for creation of an electron beam (to avoid collisions of electrons with background molecules). 2.6 Examples of diffraction images A) B) C) D) Figure 15: Diffraction images of four diffreent Silicon surfaces. A) Si(111)-(7 7), B) Si(100) )-(2 1), C) Si(111) -(1 1)H, D) Si(100) -(1 1)H [1]. Figure 13: Inelastic mean free path (universal curve) for electrons in a solid [3]. Figure 16: Diffraction images of different Gallium superstructures on Si(111)-(7 7) substrate. The superstructure notation is shown in the top left corner [4]. A) B) Figure 14: A) LEED experimental setup. B) ErLEED optics [4]. Example: The Pd(100)-( 5x 5)R27o-0 surface structure. Palladium takes part in many catalytic reactions. Both the clean palladium surface and its surface oxide are catalytically active, therefore the knowledge of both structures is of significant information. For coverages lower than 1 ML (coverage of 1 ML means that there is exactly one oxygen atom belonging to one palladium atom of the layer underneath) one can 34

43 observe four different surface reconstructions : p(2 2), c(2 2), (5 5) a (5 5)R27 (see Fig. 17 for structures observed in the experiment). First two structures are formed by oxygen atoms adsorbed on the Pd(100) surface with the coverages of 0.25 ML and 0.5 ML. The other two structures are formed by PdO surface oxides for coverages 0.64 and 0.8 ML. As a substrate a Pd(100) single crystal was used.the crystal was cleaned by several cycles of Ar + ion sputtering (energy E = ev, time t = 30 min) and subsequent annealing by electron bombardment (temperature T = 620 C, time t = 30 min). The cleanness of the surface was controlled by AES (Auger Electron Spectroscopy). There was no contamination by usual impurities (C, O) visible in AES spectra after cleaning and only a sharp diffraction pattern of the (100) layer was visible on the diffraction screen. The Pd(100)-( 5x 5) R27-0 surface was prepared by oxidation of the clean Pd(100) surface under UHV conditions. The crystal was exposed to O 2 for three minutes at a pressure of Torr at elevated temperature of 290 C. A sharp Pd(100)-( 5x 5)R27-0 pattern was visible on the screen after cooling down to the room temperature. The LEED mea surements were performed at normal incidence of the electron beam. The LEED patterns starting from 20 ev up to 350 ev with the 2 ev step were recorded and stored for further analysis. A set of 136 I-V curves was extracted from these data. The symmetrically equivalent ones were averaged, smoothed out and normalized to the primary electron current giving a set of 19 symmetrically inequvalent I-V curves (5 integer and 14 fractional). A possible model of the structure a PdO(101) layer placed on the top of the Pd(100) layer was chosen according to previous studies by other methods such as density functional theory (DFT), scanning tunneling microscopy (STM) and high resolution core level spectroscopy. This model was proven to be correct with the LEED search algorithm reaching its minimum with the reliability factor R P = (R p means Pendry s reliability factor-one of the most used) and giving the final model parameters (for better understanding see Fig. 18). For visualization of the final search parameters see Fig. 19 showing comparison of the measured and calculated I-V curves of the final model. However this model can be improved up to R P = by varying in-plane coordinates of atoms in the second P d layer, but there is no clear indication if there is some physics behind or it is only a random noise. Figure 18: Sketch of the final model of the Pd(100)- ( 5x 5)R27-0 surface structure [4]. Figure 19: Comparison of the measured (black) and calculated (grey) I-V curves for the final model of the Pd(100)-( 5x 5)R27-0 surface structure (Rp = 0.162) [4]. 35

44 3 X-Ray Photoelectron Spectroscopy The X Ray Photoelectron Spectroscopy XPS (or Electron Spectroscopy for Chemical Analysis ESCA) is one of the most important methods for surfaces and thin films analysis. This method gives quantitative information about the sample chemical composition either about elements in the sample or their chemical environment (chemical bonds to atoms of different elements). Using XPS method a layer thicknesses could be estimated and even the concentration depth profiles calculated from angular resolved measurements. of those lines are reasonably low (0.7 ev and 0.85 ev). The main reason for the usage of two different energies is the existence of Auger lines which could overlay with photoelectron lines of interest. With the change in the excitation energy the Auger lines are moved by 233 ev. 3.1 Experimental Fig. 20 shows the schematic drawing of the experimental setup used in the X-ray photoelectron spectroscopy. The X-ray photons emitted from source penetrate few micrometers below the sample surface and in all this near surface volume the photons could be absorbed by atoms situated there. If a photon is absorbed its energy is given to one of inner electrons. The inner electron is subsequently emitted by the atom and its kinetic energy is equal to the difference of photon and electron binding energy. Only photoelectrons which originate very near the sample surface (few nanometers in depth) can escape from the sample and be detected. Their kinetic energy is measured by an electron spectrometer. The experimental equipment (X-ray source and the spectrometer) is connected to the vacuum chamber, because the ultra high vacuum (p < Pa) is needed for their proper function. X-Ray source. The standard twin anode source contains two different anodes - magnesium and aluminum one. Those anodes provide X-ray radiation of sufficiently high energy ( ev and ev), there is only one significant line in their spectra and the FWHMs Figure 20: The schematic drawing of the XPS experimental setup [5]. Electron energy spectrometer. The principle of photoelectron spectroscopy is the photoelectron kinetic energy distribution (the photoelectron spectrum) measurement. This is done by an electron spectrometer which consists from two main parts the electron analyzer itself and the electron optics. For XPS analysis the hemispherical analyzer is almost exceptionally used. Its schematics could be seen in Fig. 21. Figure 21: A schematic cross-sectional view of a hemispherical analyzer. Incoming electrons are focused by the electron optics into the analyzer and enter the slit S, pass through the analyzer and leave to the detector trough the exit slit F. The zoomed view of the electron optics reveals its influence on the spectrometer angular acceptance and analyzed sample area [5]. 36

45 If the electron kinetic energy E k = ev 0 is the same as the energy analyzer is set for and the electron enters the analyzer tangentially to the mean radius, it passes trough the exit slit and is detected. Together with electrons with right energy also the electrons with an energy difference of ΔE which enter the analyzer with an angular difference of Δα (according to the tangent line to the mean radius) could pass trough and are detected. Usually, one is interested in the small details in the photoelectron spectra such the line splitting and their shift due to the different chemical state. That s why the high resolution is needed. Taking into account the FWHM of X-ray line is 0.7 ev for Mg Kα and 0.85 ev for Al Kα respectively, the absolute analyzer resolution about 0.5 ev is needed. To get this resolution in all the spectrum the following arrangement is used: the electrons are slowed by retardation field to the certain energy before they enter the analyzer. The energy analyzer is set for its called pass energy (E p ev) which is kept constant during the measurement for all the electron energies. Another important part of the electron spectrometer is the electron optics, which is used for focusing and delimiting of the incident electrons. This setting influences mainly the spectrometer angular acceptance and the analyzed sample area. There are three different magnification modes low, medium, and high associated with our spectrometer. In the low magnification mode there is the smallest angular acceptance and the largest analyzed area (see Fig. 21). This mode is suitable for the angular dependent or large area measurements. On the contrary for the small area analysis the high magnification mode should be used, but besides the smallest analyzed area there is the largest angular acceptance (~ 8 o ). The analyzed area is also influenced by the width of enter and exit slit. Photoelectron spectrum. The measured photoelectron spectrum is the dependence of detected photoelectrons count on their kinetic energy. In the photoelectron spectrum together with photoelectron lines itself there are also other lines which appear due to various phenomena (see below), and inelastic background. 3.2 Photoelectron binding energy The photoelectron spectroscopy gives us information about the binding energies of the electrons in atoms of the studied sample. These binding energies aren t measured directly but calculated using measured kinetic energies of electrons emitted from the sample illuminated by monochromatic radiation of energy hυ The electron binding energy E B V referred to the vacuum level is given by E V B = hυ Ek. (17) Concerning solid samples it is usual to refer electron binding energies to the Fermi level EBF which differs from vacuum level by sample work function Φs. Regarding the metal samples we can use the common sample and spectrometer Fermi level and write the basic equation as follows [6] E F B = hυ E (18) The spectrometer work function Φ spec can be easily measured or calculated. 3.3 Photoelectron spectrum structure spec. The energy spectrum of photoelectrons emitted from the silver sample is shown in Fig. 22. A large number of different peaks could be seen in this spectrum. These peaks are related either to the photoelectron lines itself or Auger, energy loss and satellite-structure lines. The photoelectron lines related to the different energy levels have different intensity and FWHM and all non- s lines are doublets. These doublets arise due to the different energies of electrons with different quantum number j (electrons in the same sub-shell, with different spin) for l > 0. k Φ 37

46 Together with photoelectron lines there are also Auger electron lines in the spectrum. The Auger electrons are generated when there is a hole in the atom inner energy level. Such a hole appears after photoelectron emission and it is filled up by transition of another electron from higher energy level. The energy difference is given to another (Auger) electron which is emitted from the atom with kinetic energy tion of three contributions the intrinsic line shape, the characteristic X-ray line shape and broadening caused by analyzer. This shape could be furthermore influenced by intrinsic energy loss. The intrinsic losses lead to the asymmetric shape of the photoelectron peaks of some metals. E k = E E E, KL 1L3 K L1 L3 *, (19) where Ei stands for the electron binding energy of K, L 1, and L 3 levels. The energy E L3 * is signed by star, because its value could vary from E L3 due to existence of hole in L 1 level. Contrary to photoelectrons the Auger electron energy is independent on the X-ray radiation energy. For Auger lines the X-ray notation is used. If the non-monochromatic X-ray radiation is used, there are other weaker characteristic lines in the X-ray spectrum together with the principal characteristic line Kα. The second largest X-ray line has approximately one-tenth intensity of the principal line. Because all the x-ray photons cause photoemission of electrons according to eq. 16, photoelectrons excited by secondary X-ray lines form the satellite structure in the photoelectron spectrum the copy of the principal line spectrum shifted by 10 ev with one-tenth intensity. Before emitted photoelectron is detected it can lose some energy and no longer contributes to the peak intensity and is located on the higher binding energy side of the spectrum. The most frequent energy loss is caused by inelastic scattering during the electron motion though the solid. The inelastically scattered electrons form the main part of the background. If an electron loses a well-defined amount of energy, an electron loss structure such as shake-up, shake-off, and plasmon peak appears. The peak shape could be obtained by convolu- Figure 22: Photoelectron spectrum of silver obtained using non-monochromatic Al Kα radiation [5]. The peak intensity is mainly given by photoionization cross-section σ and the amount of given atoms in the analyzed sample. The photoionization cross-section describes the probability of X-ray photon absorption and electron emission from given energy level. The fact that the peak intensity is also given by the atomic concentration is important for quantitative analysis. Figure 23: Detailed spectrum of Si 2p peak after initial cleaning in Piranha solution (native oxide remains on the surface, left) and after etching the surface oxide for 15 minutes in NH 4 F solution [7]. 38

47 The photoelectron line notation is based on the quantum numbers describing the energy level electron were emitted from. Together with the total quantum number n and subsidiary quantum number l the number j is also used. This quantum number describes the total angular momentum of particular electron (j = l + s). The line notation consist of the total quantum number n, subsidiary number l = 0, 1, 2, 3, which is written as s, p, d, f and number j, which is usually written in the index. 3.4 Chemical shift The different binding energy of non-equivalent inner electrons is one of the most valuable features measured by XPS method. Measurable shifts are obtained from the atoms that are bonded to different elements atoms, have different oxidation state, have different non-equivalent matrix position or are located on the sample surface. This feature is called chemical shift. An example of chemical shift is shown in Fig. 23. If the silicon atom is bond to oxygen one in SiO 2 (the Si O bond), the Si 2p peak is shifted by 3.6 ev compared to silicon bond to another silicon (the Si Si bond). Fig. 23: Detailed spectrum of Si 2p peak after initial cleaning in Piranha solution (native oxide remains on the surface, left) and after etching the surface oxide for 15 minutes in NH 4 F solution [7]. The Auger peaks may chemically shift as well. The amplitude of this shift could vary from the shift of relevant photoelectron line and in some cases it could be almost twice as large. The chemical shift of Auger lines is important when the shift of photoelectron line is small but it is better to calculate the photoelectron and Auger line difference so called Auger parameter. Auger parameter measurement is important especially while measuring insulating samples and there is no exact binding energy reference. 4 References [1] M. Kolíbal, TOF-LEIS analysis of utlrathin films, PhD dissertation, IPE Brno University of Technology [2] Internetové stránky: [3] Luth H., Surfaces and Interfaces of Solids, Springer-Verlag, 2nd ed., Berlin-Heidelberg [4] P. Kostelník, Low energy electron diffraction, PhD dissertation, IPE Brno University of Technology [5] J. Čechal, X-Ray Photoelectron spectroscopy, PhD dissertation, IPE Brno University of Technology [6] D. Briggs, M.P. Seah (eds.): Practical Surface Analysis, vol. 1: Auger and X-ray Photoelectron Spectroscopy, sec. ed., John Wiley & Sons Ltd., Chichester [7] M. Kolíbal, J. Čechal, M. Bartošík, J. Mach. T. Šikola, Appl. Surf. Sci. 256 (2010)

48 40 POZNÁMKY

49 4NANOMETROLOGIE: ÚVOD DO STM A AFM TECHNIK 4Jana Drbohlavová

50

51 1 Úvod Nanometrologie je součástí vědní disciplíny zvané metrologie a zabývá se měřením rozměrů struktur na úrovni nanometrů a měřením nejistot a tolerancí. Obvykle se uvádí rozmezí (1 100) nm alespoň pro jeden rozměr měřené struktury a z tohoto pohledu je zde možné zahrnout i měření nanometrových odchylek od průměru metrového teleskopického zrcadla. Tato disciplína se rovněž týká větších systémů s rozsahem měření od jednotlivých atomů a molekul k submikronovým rozměrům a dále integrace výsledných nanostruktur do větších celků. Tento vědní obor má nesmírný význam v produkci nanomateriálů včetně ověření jejich potenciálních zdravotních rizik a klade důraz na vysokou přesnost a spolehlivost. Zmíněné požadavky však mnohdy přesahují možnosti dostupných měřících technik. Je zřejmé, že měřící techniky používané pro makrosystémy obvykle nelze přímo využít pro měření parametrů v nanosystémech. S rychlým rozvojem nanotechnologií je proto potřeba neustále zlepšovat možnosti využití a citlivost technik na měření a charakterizaci nanomateriálů a definovat nanometrologické standardy. V souvislosti se zajištěním kvalitní kontroly výrobních procesů v nanotechnologiích je třeba rovněž řešit metrologické problémy spojené s komplexní miniaturizací, složitostí tvarů, přístupností kontrolovaných ploch a menší tuhostí součástí, příp. nebezpečím jejich deformace při měření, zejména u mechanických pohyblivých částí s následnými problémy ve funkci mechanismu. Často navíc vyžaduje ověření funkce celého systému překlenutí minimálně 4 6 rozměrových řádů, což nelze zajistit jedním měřicím přístrojem. V současnosti existuje 11 mimoevropských a 19 evropských národních metrologických institutů, které jsou sdruženy do Evropské asociace národních metrologických institutů (EURAMET, European Association of National Metrology Institutes, Úkolem EURA MET je sdílení informací a hledání nových strategií v nanometrologii. EURAMET se rovněž podílí na největším Evropském metrologickém výzkumném programu (400M ) pod záštitou Evropské komise, který je určen pro dotaci různých výzkumných projektů v nanometrologii [1]. Nanometrologie používá klasifikaci vycházející nejen z rozměrů, ale také z prostorové 3D velikosti a geometrie (tvaru). Současná nanometrologie je tedy zaměřena na měření vzdálenosti, šířky, výšky, polohy a tvaru, textury a drsnosti povrchu, tloušťky vrstev a poměru hloubka/šířka struktury (tzv. charakteristický (průřezový) poměr). Příkladem měřených parametrů může být drsnost povrchu plechu pro karoserie automobilů, u kterého je požadována dobrá přilnavost nátěrové hmoty; okraj (hrana) optických filtrů pro telekomunikační techniku, jejíž velikost je jen několik mikrometrů; pórovitost polymerních membrán pro moderní systémy dodávání léků; vzdálenosti molekul v případech, kdy je funkce podmíněna speciální konfigurací (uspořádáním) [2]. Z technického hlediska lze zaměření nanometrologie rozdělit na několik odvětví: rozměrovou nanometrologii, chemickou nanometrologii, nanometrologii tenkých filmů a strukturovaných materiálů, mechanickou, elektrickou a biologickou nanometrologii. V nanometrologii se hojně využívají techniky měření na interferometrickém principu jako je optická či rentgenová interferometrie, případně kombinace obout těchto technik (Combined Optical and X ray Interferometry (COXI)), viz Obr. 1. Optická interferometrie je bezkontaktní metoda pro přesnou charakterizaci topografie povrchu, povrchového profilu a nerovnosti a také pro kontrolovatelné měření posunutí (dislokace) a rozměrů. Interferometry mající kapacitní a induktivní snímače mohou dosahovat až subnanometrických rozlišení v malém rozsahu. Tyto přístroje mohou pracovat v několika módech umožňující měření jak hladkých povrchů na úrovní Angströmů, tak měření drsných povrchů v krocích několik nm až µm. Významnou 42

52 předností představené měřicí techniky je vysoká rychlost a reprodukovatelnost měření [3]. Optické interferometry se často využívají v jiných přístrojích (např. metrologické SPM) pro přímou kalibraci posunutí. Obrázek 1: Schéma kombinované optické a rentgenové interferometrie. Převzato z [4]. Nejznámějším zástupcem optických interferometrů je Michelsonův interferometr, kde interferenční proužky vznikají na základě rozdělení paprsku monochromatického světla na 2 paprsky dopadající na fixní a pohyblivé zrcadlo a jejich opětovného spojení po odrazu od těchto zrcadel. Vysokého rozlišení (až 0,01 nm) ve spektrálních přístrojích lze dosáhnout použitím vícesvazkových interferometrů, jako je např. Fabryho Perotův interferometr. Laserem (He Ne) kontrolované interferometry jsou nedílnou součástí infračervených spektrometrů s Fourierovou transformací někteří výrobci používají Michelsonův interferometr (Bruker, Digilab, Spex) a jiní modifikovaný Fabryho Perotův interferometr (Perkin Elmer, Nicolet) [5]. Rentgenový interferometr je podobný jako Mach Zehnderův interferometr v klasické optice. RTG interferometr je tvořený třemi tenkými paralelními a rovnoměrně vzdálenými destičkami z monokrystalického křemíku nařezanými tak, aby rovina krystalové mřížky křemíku byla kolmá k povrchu těchto tří destiček. Dopadá li monochromatické RTG záření na první destičku (separátor) pod Braggovým úhlem, je toto záření rozděleno na dvě části: procházející a difraktovanou (tzv. Laueho difrakce). Tyto oddělené svazky dopadají na druhou destičku (zrcadlo), která je po difrakci přivede opět do společného prostoru. Poněvadž jde o koherentní svazky, nastává v tomto prostoru interference. Interferometrem lze získat tzv. moiré obrazce stočením nebo posunutím třetí destičky (analyzátoru) v ortogonálním směru k difrakčním rovinám. V oblasti rentgenové interferometrie patří k nejrozšířenějším tzv. LLL interferometr (triple Laue interferometer) [6]. Jinou skupinu metod využitelných pro nanometrologická měření tvoří metody založené na difraktometrickém principu. Jednou z variant klasické XRD je rentgenová difraktometrie pro tenké vrstvy, tzv. GAXRD (Glancing (grazing) angle X Ray Diffraction), kde dopadající rentgenový paprsek svírá s analyzovaným substrátem velmi malý úhel (je téměř rovnoběžný s povrchem vzorku), a tak minimalizuje příspěvek substrátu na difrakci vzorku oproti konvenční XRD, kde je průnik RTG paprsku příliš velký. Pro měření šířky nanovrstev lze využít jinou difraktrometrickou techniku, a to spektroskopickou elipsometrii (Spectroscopic Ellipsometry, SE). Dalšími v nanometrologii využívanými metodami jsou metody mikroskopické. Z nich pak nejčastěji mikroskopie skenovací sondou (Scanning Probe Microscopy, SPM) jako rastrovací tunelová mikroskopie (Scanning Tuneling Microscopy, STM), která charakterizuje zobrazování povrchu vodivých a polovodivých vzorků až na atomové úrovni, či mikroskopie atomárních sil (Atomic Force Microscopy, AFM) pro charakterizaci vodivých i nevodivých vzorků. Nanometrologické instituty používají pro dosažení přesnějších měření komerční SPM mikroskopy ve spojení s laserovou interferometrií. Na SPM technik lze dále zařadit mikroskopii magnetických sil (MFM), mikroskopii laterálních sil (LFM), mikroskopii elektrostatických sil (EFM) a skenovací optickou mikroskopii v blízkém poli (SNOM). U všech mikroskopů využívajících rastrovací 43

53 sondy závisí rozlišení na průměru použité sondy a její vzdálenosti od vzorku. K metodám, používaným v rozměrové nanometrologii, neodmyslitelně patří mikroskopické techniky založené na svazku částic, tedy rastrovací elektronová mikroskopie (Scanning Electron Microscopy, SEM), případně méně konvenční FESEM (Field Emission SEM, mikroskopie s autoemisní tryskou neboli studenoemisní SEM), a ESEM (Environmental SEM, vhodná pro biologické vzorky, měkké tkáně). Dalšími zástupci z této skupiny jsou transmisní elektronová mikroskopie (Transmission Electron Microscopy, TEM), TEM s vysokým rozlišením (High Resolution TEM, HRTEM) a mikroskopie s fokusovaným iontovým svazkem (Focused Ion Beam, FIB). Zařízení s fokusovaným iontovým svazkem jsou tedy součástí elektronového mikroskopu a slouží též při výrobě vzorků pro TEM. V současnosti se fokusované iontové svazky využívají v mikroelektronice pro opravu masek, obvodů a plošných spojů pro optickou litografii, nanášení tenkých vrstev atd. 2 Mikroskopie skenovací sondou Jak již bylo zmíněno v úvodu, do SPM řadíme několik mikroskopických technik, přičemž k nejvýznamnějším patří STM a AFM. Rastrovací tunelová mikroskopie byla vyvinuta v laboratořích IBM (Zürich) pracovníky G. Binnigem a H. Rohrerem (1981), kterým byla roku 1986 udělena Nobelova cena. Obrázek 2: Vědci Rohrer a Binnig se svým objevem: STM. Převzato z [7; 8]. Pilotní práci s tímto mikroskopem provedl Donald Eigler z IBM Research Division (sou část Almaden Research Center), který demonstroval s atomovou přesností STM manipulaci s atomy xenonu na povrchu niklu. Později, ve spolupráci s E. K. Schweizerem publikovali své výsledky, konkrétně světoznámý nápis IBM, v časopise Nature, viz Obr. 3 (vlevo) [9]. Dalším zajímavým výsledkem těchto autorů byla kvantová ohrada ze 48 atomů železa uspořádaných do kruhu o průměru 14,26 nm na povrchu mědi, jak ukazuje Obr. 3 (vpravo) [10]. Tato nedestruktivní metoda má dnes nezastupitelné místo ve fyzice tenkých vrstev a povrchů: umožňuje studovat jak jednotlivé atomy na povrchu, povrchové defekty a rekonstrukce, tak lokální elektronické vlastnosti povrchu (nábojové vlny, změny povrchové bariéry a zakázaného pásu). Obrázek 3: Manipulace s atomy pomocí STM. Vlevo nápis IBM z atomů Xe vytvořený při velmi nízké teplotě (4 K), převzato z [9]. Vpravo kvantová ohrada z atomů Fe, převzato z [10]. STM lze rovněž využít pro manipulaci atomů a molekul prostřednictvím interakcí mezi vzorkem a hrotem, který slouží jako manipulátor. STM může pracovat v širokém rozsahu teplot v různých prostředích vakuum, vzduch, kapaliny a vzorky není třeba speciálně upravovat. Teoretický popis STM je založen na kvantové fyzice, a to na tunelovém jevu. Atomově ostrý kovový hrot se ve vakuu přiblíží k povrchu vodivého vzorku na vzdálenost několika desetin nanometru. Hrot i povrch vzorku fungují jako elektrody a vzniká mezi nimi tunelový proud elektronů procházejících potenciálovou bariérou. Velikost tohoto proudu je úměrná tvaru a vzdálenosti elektrod (šířce potenciálové bariéry) a topografii povrchu (přesněji na prostorovém průběhu vlnové funkce elektronů v oblasti povr 44

54 chu vzorku). Střední výšku potenciálové bariéry lze určit měřením změn její šířky jako funkce proudu při pracující zpětné vazbě. Podobně lze měřit hodnotu proudu jako funkci vzdálenosti elektrod s, pokud je zpětná vazba na určitý moment odpojena. Matematicky lze velikost tunelového proudu I vyjádřit rovnicí: I U.A(U ). exp 2s = 2 2mφ, (1) kde m je hmotnost elektronu, U je napětí mezi elektrodami a hodnota A (U) představuje závislost tunelového proudu na napětí, danou elektronovou strukturou hrotu a vzorku [11]. Hrot při rastrování kopíruje povrch a změny řídícího napětí na piezoměniči jsou použity pro zobrazování. Výsledný obraz je možné získat ve dvou módech: 1) v módu konstantní výšky (constant height mode, CHM), který je vhodný pro velmi ploché povrchy a tunelový proud je zde funkcí vzdálenosti hrotu od povrchu; a 2) v módu konstantního tunelového proudu (constant current mode, CCM). Kvalitu obrazu v tomto módu, který je využíván častěji než CHM, určují vlastnosti zpětnovazební smyčky pro řízení vzdálenosti hrotu od povrchu. V obou módech se předpokládá konstantní napětí mezi hrotem a vzorkem. V módu CCM však existuje režim, kdy se napětí na tunelovém přechodu srovnává s referenční hodnotou a rozdílový signál je použit ve zpětné vazbě. Vertikální rozlišení STM dosahuje až 10 3 nm a je ovlivněno především mechanickou stabilitou mezery tunelového přechodu (tunelové bariéry), a tedy nízkou úrovní šumu u napětí na PZT elementu a dále kvalitou hrotu, zejména jeho tvarem a symetrií. Pro zajištění mechanické stability polohy hrotu a vzorku je dále potřeba účinně odtlumit rušivé vibrace a otřesy okolí pomocí různých tlumících systémů (např. nerezové desky proložené vitonem či pružinové závěsy v kombinaci s magnetickým tlumením). Jedná se především o kmity budov v rozmezí (10 100) Hz, otřesy vznikající chůzí (1 3) Hz a akustické kmity šířící se po kovových konstrukcích. STM obraz obsahuje informace nejen o topografii povrchu, ale rovněž o elektronové struktuře povrchu, a proto je možné STM využívat pro prostorově rozlišenou tunelovou spektroskopii. Spektroskopická měření elektronové struktury lze pak provádět v libovolném přesně lokalizovaném místě povrchu vzorku. Kombinací spektroskopických měření a rastrování povrchu umožňuje tzv. CITS (current imaging tunneling spectroscopy). V tomto případě se v každém bodě obrazu snímá při dané vzdálenosti hrotu a vzorku část tunelové charakteristiky. Zobrazením hodnot proudů v jednotlivých místech pro určitou hodnotu napětí lze pak získat obraz stavů odpovídající energie. Pro dosažení co nejlepšího rozlišení STM ve spektroskopickém módu je potřeba atomárně ostrý hrot s jediným atomem na vrcholu. Experimentálně získané rozlišení (< 0,2 nm) potvrzuje, že reálný hrot může mít tuto podobu. A) B) Obrázek 4: Ukázka topografie povrchů z mikroskopu atomárních sil: monovrstva Ag/TiO 2 nanočástic (A), Ag nanočástice pokrývající Si sféry (B). Převzato z [12]. Mikroskop atomárních sil byl vynalezen o pět let později než STM, v roce Na objevu se opět podílel G. Binnig spolu s C. Quatem a C. Gerberem. AFM lze stejně jako STM využít pro 45

55 charakterizaci povrchů ve vzduchu, vakuu i kapalině. Na rozdíl od STM je však s AFM možné pracovat i ve vodivém elektrolytu, a proto má tato metoda uplatnění i v elektrochemii. AFM je založena na silové interakci mezi skenujícím hrotem a povrchem vzorku. Rovněž tato metoda poskytuje rozlišení na atomární úrovni. Ostrý hrot je umístěn na konci pružného raménka s tuhostí cca 1 N/m, což představuje menší tuhost než je tuhost meziatomových vazeb. Hrot je veden po povrchu nebo nad ním osciluje v těsné blízkosti podle toho rozlišujeme 3 základní měřící módy: 1) kontaktní mód, kdy se hrot pohybuje buď při konstantní výšce, nebo s konstantní silou a charakter interakce s povrchovými atomy je silně odpudivý (10 8 až 10 9 N), pro měření výchylky raménka může sloužit STM; 2) nekontaktní mód s vibrující sondou, při kterém je interakce slabá a přitažlivá pomocí van der Waalsových sil ( N), magnetických či elektrostatických sil; 3) semikontaktní (přerušovaný, poklepový) mód, při kterém sonda opět vibruje, ale charakter interakce je silný a odpudivý jako u kontaktního módu. Je zde však menší riziko poškození měkkých vzorků třením nebo tažením ve srovnání s kontaktním módem. 2.1 Experimentální uspořádání SPM STM se skládá z mechanické a elektrické části. Všechny prvky mikroskopu ovládá počítač zajišťující rovněž sběr dat, jejich zpracování a zobrazení. Mechanickou část tvoří stolek k upevnění vzorku, polohovací zařízení umožňující pohyb ve třech rozměrech (měnič polohy) a sonda, čili nosník s hrotem. Elektrická část zahrnuje napájení, zpětnou vazbu, sběr signálu a ovládání pohybu. Rychlost a stabilita zpětnovazební smyčky je rozhodující pro studium povrchových dějů v reálném čase. Mikroskop je dále vybaven zařízením pro tlumení mechanických vibrací a dalším pomoc ným vybavením, jako je např. vakuová komora, kryostat apod. Při kryogenních měřeních je celý vychylovací systém chlazen se vzorkem. Existují rovněž VT STM (Variable Temperature STM), které umožňují pracovat od heliových teplot až do teplot vzorků K jejich konstrukce je však mnohem náročnější, protože je nutné důkladně kompenzovat teplotní drify (nežádoucí posunutí hrotu a piezokeramik vlivem rozdílných teplotních roztažností). Hrot je spojen s měničem polohy (x y, z) tvořeným obvykle piezokeramickými prvky, nejčastěji polykrystaly [Pb(Ti,Zr)O 3 ] = PZT ve formě trámečků, sloupků, disků, trubek, atd. Pro výrobu hrotů se nejčastěji používá wolfram či slitiny platiny a iridia ve formě drátků. Hrot se tvaruje elektrochemickým leptáním v roztocích. Kvalitu a přesnost měření velmi ovlivňuje kvalita hrotu: pokud je hrot nesymetrický, dochází k protažení obrazu. Další komplikace v podobě zdvojení detailů povrchu nastávají, pokud je hrot dvojitý. Kvalita piezokeramických elementů pak určuje zkreslení obrazu způsobené tečením, nelinearitou a přeslechy mezi elektrodami. Hrubý posuv hrotu ke vzorku lze zajistit několika způsoby, např. pomocí mikrometrických šroubů či různě redukovaných posuvů mechanických, magnetických, posuvů pomocí elektrostatického působení a piezo elementů, dále inerciálních posuvů a v neposlední řadě využití lineárních piezoelektrických motorů. Obrázek 5: Schéma SPM. Přepracováno podle [13]. Konstrukce AFM je velmi blízká STM, protože obsahuje systém pro tlumení vibrací, polohování vzorku a hrotu, rastrování, zpětnou vazbu 46

56 a zpracování obrazu. Odlišnou součást od STM představuje detektor atomárních sil. Jak již bylo řečeno, raménko s hrotem musí mít velmi malou tuhost, aby bylo možné zaznamenávat působení atomárních sil, ale zároveň musí mít velkou laterální tuhost, aby nedocházelo ke stranovým výchylkám vlivem třecích sil. Dalším požadavkem je co nejvyšší rezonanční kmitočet raménka (nad 10 khz), což ovlivňuje rychlost sběru dat: s delším časem měření vzrůstá vliv driftů na výsledný obraz. Splnění těchto požadavků lze dosáhnout redukcí hmotnosti raménka s hrotem a jeho optimálním tvarem nejlépe ve tvaru písmene X či V či jednoduchého obdélníkového trámečku. Z materiálů se na hroty nejčastěji využívá Si, SiO 2, Si 3 N 4, přičemž velikost se pohybuje okolo 10 nm. Tyto hroty jsou duté, velmi hladké a s poloměrem křivosti menším než 30 nm. Vytvářejí se mikroobráběním tedy nanášením tenkých vrstev, maskováním a selektivním leptáním. Pro detailnější zobrazování lze využít uhlíkové nanotrubice s průměrem (1 2) nm, umístěné na konci hrotu. Dalším důležitým systémem v konstrukci AFM je měření výchylky raménka, které lze v podstatě zabezpečit čtyřmi způsoby. Prvním z nich je měření tunelového proudu mezi hrotem a zadní vodivou stěnou raménka (pokud nepracujeme v módu konstantního tunelového proudu), což umožňuje dosáhnout rozlišení 0,1 nm ve směru z. Drsnost zadní stěny a čistota raménka při tom velmi ovlivňují stabilitu zařízení kontaminace může způsobit skoky velikosti tunelového proudu či zcela zabránit tunelování elektronů. Druhou možností je kapacitní metoda snímání výchylky raménka: výchylka mění kapacitu kondenzátoru, piezokeramický element řízený zpětnovazební elektronikou nastavuje konstantní kapacitu a řídící signál piezokeramiky je úměrný působící síle. Třetím způsobem je měření výchylky jako fázového rozdílu mezi měřícím a referenčním paprskem pomocí diferenciálního interferometru. Tento způsob je však méně citlivý na relativní vibrace mezi optickou a mechanickou částí zařízení AFM. Čtvrtým způsobem je mě ření polohy konce raménka pomocí výchylky laserového svazku. Obrázek 6: Ukázky AFM zobrazování povrchu různými hroty: (A) zobrazovaný povrch, (B) profil povrchu při použití běžného hrotu, (C) profil povrchu s použitím hrotu s uhlíkovou nanotrubicí. Převzato z [14; 15]. 2.2 Praktické využití Hlavní využití SPM metod je především ve studiu povrchových vlastností a uspořádání vrstev, a dále ke zkoumání různých povrchových chemických a fyzikálních procesů (např. difúze, adsorpce, katalýza). Neopomenutelný přínos mají metody SPM rovněž v dalších oborech, jako jsou nanometrologie (přesná rozměrová měření), nanotechnologie (tvorba nanostruktur na povrchu až na atomární úrovni) a biologie (zkoumání živých organismů jako jsou bakterie či viry a detekce biologicky významných látek, např. toxinů). Aplikace v nanometrologii Americký Národní institut standardů a technologie (NIST) využívá pro rozměrovou metrologii 3 různé formy SPM technik: molekulární měřicí přístroj (viz Obr. 7) z angl. Molecular Measuring Machine (M3), kalibrovaný mikroskop atomárních sil (C AFM) a AFM pro kritické rozměry (CD AFM). Tyto nástroje NIST optimalizuje pro přímé měření délek jak na velkou vzdálenost, tak pro trojrozměrné měření při A) B) C) 47

57 konvenčních SPM vzdálenostech a rovněž pro měření kritických rozměrů či šířky čár, vše v souladu s mezinárodním systémem jednotek (SI). Například, 10 mm vzdálenost byla naměřena s relativní standardní odchylkou (RSD) 1,5.10 5, 100 nm výška s RSD 2, a submikronové šířky čar s RSD 0,8 nm [16]. Aplikace v nanotechnologii Kontrolovaná elektrochemická depozice kovů v nanometrové škále na předem definovanou pozici je velmi žádoucí proces zejména v mikroa nanoelektronice a nano elektromechanických systémech (NEMS). Většina pokusů týkajících se tohoto elektrochemického vytváření vzorů na povrchu byla provedena pomocí STM. Nedávno se tým vědců z německého Institutu aplikované fyziky a Institutu nanotechnologií pokoušel o kontrolovanou selektivní elektrochemickou depozici kovů na povrch s pomocí AFM hrotu, který slouží jako mechanicko elektrochemické pero [17]. Z elektrolytu obsahujícího například měďna té ionty lze po vložení napětí na zlatou elektrodu s pasivační vrstvou vytvořit text z vyredukované mědi, jak ukazuje následující obrázek (Obr. 8). Pasivační vrstva může být ztenčena nebo zcela odstraněna pomocí AFM hrotu a na těchto místech lze pak selektivně deponovat kovovou měď. Aplikace v biologii Z hlediska pozorování biologických vzorků je nutné zvážit, v jakém módu AFM bude měření provedeno. U měkkých vzorků je lepší zvolit nekontaktní mód, kdy nedochází k degradaci hrotu ani vzorku. U tuhých vzorků lze použít kontaktní mód, ale pokud je na těchto vzorcích několik monovrstev zkondenzované vody, výsledný obraz bude zkreslený. V takových případech je opět lepší využít nekontaktní mód, který správně zobrazí i povrch kapalné vrstvy (viz Obr. 9). Vědci také zjistili, že je výhodné zkombinovat AFM se světelným fluorescenčním mikroskopem [19]. Příklad takového zobrazování ukazuje Obr. 10. Obrázek 7: Schéma přístroje M3 (Molecular Measuring Machine), který obsahuje SPM sondu, měřící a pohybový systém a metrologickou referenční soustavu, která zabezpečuje kontrolu a izolaci od okolí. STM sondu lze vyměnit za sondu AFM na ladičce (sensoru), což umožňuje pozorovat s atomovým rozlišením i nevodivé vzorky. Převzato z [16]. 48

58 Obrázek 8: Schéma elektrochemické depozice Cu 2+ iontů pomocí AFM hrotu (vlevo) a finální měděná nano struktura na Au elektrodě ve formě písmen INT (vpravo); skenovaná oblast (1,8 1,8 ) μm. Převzato z [17]. Obrázek 9: Zobrazování vzorků s vrstvou kapaliny v poklepovém (vlevo) a nekontaktním módu (vpravo) AFM. Převzato z [18]. Obrázek 10: Kombinace AFM a fluorescenčního mikroskopu pro biologické zobrazování: (a) optické zaostřování laseru je integrováno v piezotrubici, která umožňuje horizontální pohyb nosníku. Vertikální pohyb nosníku zajišťují skenovací čočky, které jsou umístěny uvnitř této části. AFM je umístěn v části na obráceném mikroskopu; (b) snímek liposomů ze světelného mikroskopu; (c) snímek liposomů z fluorescenčního mikroskopu; (d, e) buňky v různých časových intervalech po inkubaci cisplatiny v liposomech zobrazeny v poklepovém módu AFM: (d) výškový signál, (e) chybový signál. Chybový signál ukazuje lepší kontrast a strukturální detaily. Poloha liposomů vůči buněčné membráně byla určena z výškového signálu. Při 1 h inkubaci cisplatiny bylo zaznamenáno mnoho velkých liposomů, jak ukazují červené šipky na obrázcích b, e. Malé liposomy s cisplatinou byly uloženy uvnitř buněčné cytoplazmy (černé šipky na obrázcích d, e). Bílé šipky na vloženém obrázku (e) ukazují zvětšenou zakroužkovanou plochu s internalizovanými malými liposomy. Převzato z [19]. 49

59 2.3 Závěr SPM je velmi užitečnou metodou umožňující zobrazování povrchu či dokonce manipulaci s materiálem s atomovou přesností. Z nanometrologického pohledu lze SPM metody, konkrétně AFM, klasifikovat jako nejpoužívanější metodu pro rozměrová měření, po níž následuje optická interferometrie. Nelze však opomíjet i jinou výhodnou aplikaci SPM, a tou je určení chemického složení povrchu. SPM spektra tunelových elektronů naměřená při kryogenních teplotách lze totiž využít pro charakterizaci vibračních vlastností adsorbovaných molekul a elektronických vlastností magnetických atomů (příměsí), tedy pro chemickou identifikaci. U nevodivých systémů je však přesné určení chemického složení povrchů či nanostruktur velmi obtížné. Jednou z možností je využít systému dynamických sil (Dynamic Force Microscopy), který umožňuje zobrazit povrchy jak polovodivých a kovových, tak i nevodivých materiálů s atomovou přesností na základě detekce a přesného měření sil krátkého dosahu, které pochází z chemických vazeb mezi hrotem a povrchovými atomy. Tyto síly jsou velmi citlivé k danému chemickému složení a jsou měřitelné i při pokojových teplotách [20]. 3 Reference [1] LEACH, R. K. et al. The European nanometrology landscape. Nanotechnology, 2011, sv. 22, s [2] NOVÁK, Z. Nanometrologie - aspekty měření v praxi. MM Průmyslové spektrum, 2010, sv. 14, č. 7-8, s [3] NOVÁK, Z. Interferometrická měření v nanometrologii. MM Průmyslové spektrum, 2010, sv. 10, s [4] INRIM. Atomic scale metrology for x ray interferometry. [online] [cit ]. Dostupné z: < it/ar2008/ar/m focus1.html>. [5] MILATA, V. et al. Aplikovaná molekulová spektroskopia. Slovenská technická univerzita v Bratislave, s. ISBN [6] YACOOT, A. Metrological applications of X ray interferometry. In WILKENING, G. a KOENDERS, L. Nanoscale Calibration Standards and Methods Dimensional and Related Measurements in the Micro- and Nanometer Range. Wiley VCH, [7] STM techniques. [online] [cit ]. Dostupné z: < com/spm principles/view/stm techniques>. [8] The Scanning Tunneling Microscope. [online] [cit ]. Dostupné z: < physics/microscopes/scanning/>. [9] EIGLER, D. M. a SCHWEIZER, E. K. POSITIONING SINGLE ATOMS WITH A SCANNING TUNNELING MICROSCOPE. Nature, Apr 1990, sv. 344, č. 6266, s ISSN [10] CROMMIE, M. F. et al. CONFINEMENT OF ELECTRONS TO QUANTUM CORRALS ON A METAL SURFACE. Science, Oct 1993, sv. 262, č. 5131, s ISSN [11] FRANK, L. a KRÁL, J. Metody analýzy povrchů - iontové, sondové a speciální metody 1. Praha: Academia, s. ISBN [12] Colloid Group Picture Gallery. [online] [cit ]. Dostupné z: < AFM%20pictures/index.html>. [13] ATMILAB. Mikroskopie skenující sondou. [online] [cit ]. Dostupné z: < html>. [14] XINTEK. Carbon Nanotube AFM Tip. [online] [cit ]. Dostupné z: < afm/index.htm>. [15] STRUS, M. C. et al. Imaging artefacts in atomic force microscopy with carbon nanotube tips. Nanotechnology, Nov 2005, sv. 16, č. 11, s ISSN [16] KRAMAR, J. A. et al. Scanning probe microscope dimensional metrology at NIST. Measurement Science & Technology, Feb 2011, sv. 22, č. 2, s ISSN [17] OBERMAIR, C. et al. The atomic force microscope as a mechano electrochemical pen. Beilstein Journal of Nanotechnology, 2011, sv. 2, s [18] True Non Contact AFM for Soft Biological Samples. [online] [cit. 50

60 ]. Dostupné z: < parkafm.com/resources/02mode_view. php?code=tutorial & category=true%20non Contact%20Mode & id=170>. [19] RAMACHANDRAN, S. et al. Potential role of atomic force microscopy in systems biology. Wiley Interdisciplinary Reviews Systems Biology and Medicine, Nov Dec 2011, sv. 3, č. 6, s ISSN [20] SUGIMOTO, Y. et al. Chemical identification of individual surface atoms by atomic force microscopy. Nature, Mar 2007, sv. 446, č. 7131, s ISSN

61 POZNÁMKY 52

62

63 55SYNTÉZA NANOSTRUKTUR MODERNÍMI METODAMI: MAGNETICKÉ NANOČÁSTICE, KVANTOVÉ TEČKY Jana Chomoucká

64

65 1 Úvod Současné nanotechnologické metody dovolují sestavování a charakterizaci různých objektů a struktur řádově nanometrové velikosti (nanovrstvy, nanovlákna a nanočástice). V posledních letech došlo k prudkému rozvoji nanomateriálů a velký přínos byl zaznamenán hlavně v medicíně a farmaceutickém průmyslu. Revolučním objevem je zcela určitě jejich využití při odhalování nemocí nebo jako náhrada tělních tkání. Za zmínku rozhodně stojí i cílená distribuce léčiv, případně diagnostických látek nebo peptidických fragmentů v organismu. Využívají se i možnosti povrchové modifikace nanostruktur tak, aby se mohly vázat výhradně na buňky cílového orgánu, dokázaly selektivně prostupovat buněčnou membránou, byly netečné k nepoškozeným buňkám nebo uvolňovaly léčivo podle přesně stanoveného harmonogramu [1]. Mezi nově používané materiály patří magnetické nanočástice představující další typ nanostruktur, které se hojně využívají zejména pro detekci různých biomolekul, jako jsou nukleové kyseliny či bílkoviny [2 4]. Jelikož mají magnetické nanočástice vysokou reaktivitu a výhodné fyzikální vlastnosti, předčily svou citlivostí a selektivitou dosud běžně používané metody detekce. Samotné magnetické nanočástice se skládají z kovového jádra, na které se poté navážou další důležité látky tak, aby vytvořily speciální biokompatibilní slupku, která bude reagovat pouze s hledanými biomolekulami. Dalším nově využívaným materiálem jsou kvantové tečky (QDs). Jedná se o shluky atomů o velikosti v rozmezí (2 20) nm, v nichž se uplatňují kvantové jevy. Vzhledem ke své malé velikosti si bílkovina nebo DNA s připojenou kvantovou tečkou zachovají svou přirozenou funkci a účastní se běžných biochemických pochodů v buňce. Po osvícení tkání je na základě emitovaného světla z polovodičového jádra možné přesně detekovat pohyb a okamžitý stav biomolekul. QDs mohou být použity i jako aktivátory selektivních léčiv nasměrovaných na určitý orgán nebo jako alternativa organických barviv a fluorescenčních proteinů. 2 Magnetické nanočástice Z hlediska potenciálního využití v rozličných praktických aplikacích jsou významným typem nanomateriálů magnetické nanočástice (MNPs). Jedná se o krystalické nanočástice, které se od ostatních liší zejména svou vlastností označovanou jako superparamagnetismus. Superparamagnetické látky se vyznačují tím, že v nepřítomnosti magnetického pole je střední hodnota jejich magnetizace nulová, avšak po vložení do tohoto pole se tyto látky chovají jako paramagnetické. Navíc jejich sukceptibilita (koeficient úměrnosti mezi magnetizací a intenzitou magnetického pole) je větší než v případě látek paramagnetických. Díky svým magnetickým vlastnostem MNPs interagují s magnetickým polem. Z hlediska chemického složení jsou nejčastěji připravované MNPs tvořeny oxidy železa. Do této skupiny patří oxid železnato železitý (Fe 3 O 4 ) známý jako magnetit anebo oxid železitý (Fe 2 O 3 ), který se vyskytuje v několika krystalových modifikacích, jako je α Fe 2 O 3, γ Fe 2 O 3 (maghemit), nebo ε Fe 2 O 3. MNPs na bázi oxidů železa se dostaly do popředí zájmu, protože jsou netoxické na rozdíl jiných kovů, jako jsou nikl nebo kobalt. V současné době existuje celá řada metod přípravy MNPs založených na bázi oxidů železa. Mezi nejpoužívanější procesy patří chemická koprecipitace solí železa, syntéza MNPs v reverzních micelách, tepelný rozklad organických prekurzorů obsahujících železo, laserová pyrolýza plynné směsi anebo metoda plazmochemické depozice nanočástic z plynné fáze (PECVD). 2.1 Syntéza MNPs Příprava MNPS koprecipitací solí železa Tato metoda je založena na společném vylučování málo rozpustných látek z roztoku 54

66 spolusrážením s mnohonásobně vyšším množstvím jiné, velmi dobře rozpustné, látky. Pomalým přikapáváním zásady k roztoku solí železa za intenzivního míchání dojde ke vzniku sraženiny, kterou je nutné přefiltrovat a následně vypálit při určité teplotě za vzniku magnetických oxidů železa, zejména Fe 3 O 4 a γ Fe 2 O 3 [5] (Obr. 1). Jako prekurzory oxidů železa jsou nejčastěji používány, chloridy, dusičnany, sírany, ke kterým je pomalu přikapáván roztok zásady (NaOH, NH 4 OH). Vzniknou tak částice maghemitu nebo magnetitu, které se obvykle dále stabilizují např. poly(vinylalkoholem), polyethylenglykolem či kyselinou olejovou. Koprecipitační reakci popisuje následující rovnice: Fe Fe OH - Fe 3 O 4 + 4H 2 O. (1) Velikost i tvar nanočástic může být ovlivňován řadou parametrů reakce, jako ph, iontová síla nebo koncentrační poměr Fe 2+ /Fe 3+. Nevýhodou této metody je však to, že nelze připravit MNPs s přesně definovanými rozměry. Obrázek 1: Schéma přípravy magnetických nanočástic koprecipitací Sonochemická syntéza MNPs Při sonochemické syntéze procházejí periodicky se opakující tlakové vlny kapalinou, kde nastává lokální zřeďování a zhušťování. V místech s poklesem tlaku dojde na částečkách tuhých látek nebo plynů k vytvoření parní bubliny, která se následným zvýšením tlaku smrští. Při opakované tlakové vlně dojde ke zvětšení smrštěné bublinky, která se při kom presi opět stlačí. Po dosažení kritické velikosti dojde ke kavitačnímu zhroucení, vznik, růst a kolaps bublin se nazývá kavitace a umožňuje přenos energie pro následné chemické reakce. Touto metodou se dají připravit oxidy železa, Fe 3 O 4 i γ Fe 2 O 3. Jako prekurzor se nejčastěji používají pentakarbonyl železa (Fe(CO) 5 ) [6], chlorid železitý [7] nebo octan železitý [8] Syntéza v reverzních micelách Účinnou metodou přípravy MNPs je mikroemulzní technika, při které termodynamicky stálá disperze dvou nemísitelných fází (např. voda v oleji) vytvoří micely obklopující magnetické nanočástice. Reverzní micely umožňují proběhnout chemické reakce jen v omezené oblasti a vytvořit tak částice požadovaných rozměrů. Využívají se micelární struktury tvořené surfaktantem (např. AOT bis (2 ethyl hexyl) sulfosukcinát sodný) v prostředí nepolárního rozpouštědla (hexan), kdy molekuly surfaktantu po dosažení kritické micelární koncentrace vytvářejí objekty podobné kapslím, v nichž hydrofilní části molekul jsou uvnitř a hydrofobní části jsou na povrchu (reverzní micela). K přípravě MNPs se obvykle využívají dva roztoky reverzních micel, jeden obsahuje micely, které mají ve svém jádře vodný roztok soli železa (např. FeCl 2 ), druhý obsahuje micely mající v jádře vodný roztok redukčního činidla. Po smíchání těchto dvou roztoků dochází ke srážkám jednotlivých micel a výměně jejich obsahu. V micelách začne probíhat redukce kovu. Kovové nanočástice začnou růst v jednotlivých micelách, dokud nebude zhruba stejně velké, jako micely (Obr. 2). MNPs jsou z micely odstraněny vysrážením pomocí alkalického roztoku [9]. Velikost částic může být řízena koncentrací surfaktantu a teplotou Termický rozklad Další možností může být příprava MNPs termickým rozkladem různých prekurzorů obsahujících železo (např. octan železitý (Fe(acac) 3 ), (Fe(CO) 5 )) [10]. Různou volbou organických 55

67 rozpouštědel můžeme měnit bod varu systému a tím i složení získaných MNPs Modifikace MNPs A) B) C) Obrázek 2: Příprava MNPs v roztoku reverzních micel. Nejprve A) se smíchají dva roztoky, jeden obsahuje roztok soli kovu, druhý redukční činidlo. Pak B) dojde při srážkách micel k výměně jejich obsahu. V micelách začnou růst nanočástice C), jejich růst se zastaví, když jsou přibližně stejně veliké, jako micely. Jedním z problémů pro potenciální biomedicínské aplikace MNPs jsou jejich hydrofobní vlastnosti, díky nimž nejsou tyto nanočástice dostatečně stabilní ve vodných roztocích. Jednou z možností zvýšení smáčivosti MNPs je úprava jejich povrchu navázáním surfaktantu. Mezi nejčastěji používané surfaktanty patří polymerní látky (např. SiO 2 ). Na takto upravený povrch nanočástice je poté možno navázat specifický ligand, vázající se k dané biomolekule, popř. léčivu. Pro navázání biologicky aktivních látek na povrch MNPs je třeba povrch MMPs modifikovat vhodnými přírodními nebo syntetickými látkami. K tomu se používají zejména přírodní a syntetické polymery, ale je možné využít i některé organické sloučeniny nebo anorganické materiály. Využívají se i biopolymery jako chitosan nebo dextran. Funkcionalizovaná částice s vhodně modifikovaným povrchem musí splňovat řadu specifických kritérií, jako jsou biokompatibilita, musí být potlačeny mezičásticové interakce a musí být umožněna chemická modifikace nezbytná pro následnou imobilizaci biomolekul [11]. Pro funkcionalizaci povrchu magnetických částic stabilizátory se používá např. kyselina citronová nebo alkansulfonáty [12]. Povrch magnetických nosičů může být rovněž upraven silanizací a jako silanizační činidla se často používají (3-aminopropyl)triethoxysilan nebo glycidyloxypropyltriethoxysilan. Silanizace se provádí na povrchu částic, který je zbaven organických látek. Funkční skupiny silanizovaných magnetických částic (např. NH 2 pro aktivaci glutaraldehydem) je následně možné využít pro imobilizaci různých biomolekul [13]. Další metody modifikace povrchu MNPs zahrnují navázání specifické skupiny umožňující vázat konkrétní biomolekuly. Aktivní chemické skupiny (karboxyl a aminoskupiny) se mohou kovalentně vázat na biomolekuly v přítomnosti specifických Cross linking činidel (EDAC), Streptavidin/Avidin ligandy se zase mohou specificky vázat na biotinylované biomolekuly. Tyto metody jsou obvykle používány k imobilizaci specifických receptorů pro zachycení cílových molekul jako třeba DNA sonda k cílové DNA a protilátka k antigenu. 2.2 Biomedicínské aplikace Vzhledem k tomu, že MNPs jsou přibližně 1000krát menší než běžné buňky, mohou MNPs interagovat s organismy na buněčné úrovni. Pokud ještě vezmeme v úvahu, že MNPs jsme schopni usměrňovat magnetickým polem podobně, jako když přesunujeme po stole nějaký železný předmět magnetkou umístěnou pod stolem, jsou potenciální aplikace těchto nanočástic nasnadě. MNPs se mohou využívat pro cílený transport léčiv. Pro tyto účely byla vyvinuta řada různých postupů. Navržené postupy v medicíně umožňuje snížit dávky podávaných léků a tím výrazně zmírnit i jejich škodlivé vedlejší účinky. Jako nosiče slouží MNPs, které nesou cíleně k ložisku onemocnění léčivo. Dochází ke specifické interakci s nádorovými buňkami, kde výsledkem může být ověření diagnostiky, cílené terapie a cílené zabíjení nádorových buněk. Stále častěji jsou MNPs využívány v magnetických separačních procesech, kde se využívají specifické ligandy vázající se na konkrétní sloučeniny, nebo buňky, 56

68 které jsou následně z roztoku odděleny pomocí magnetického pole. Vhodně funkcionalizované MNPs slouží jako nosiče enzymů, protilátek, lektinů, ostatních biologicky významných proteinů a peptidů, oligonukleotidů a nukleových kyselin, hormonů, léčiv, buněk, diagnostických látek, afinitních ligandů. Jako výhodné se jeví využití MNPs při léčbě rakoviny tzv. hypertermií [14]. Využívá se zde vlastnosti nanočástic produkovat teplo, když jsou umístěny ve střídavém magnetickém poli. Terapie hypertermií je založena vystavení tkáně vysokým teplotám. Výzkum ukázal, že vysoké teploty mohou poškodit a zabít rakovinné buňky, přičemž ostatní tkáň je poškozena minimálně. Jednou z možností, jak dosáhnout lokální hypetermie je nahromadění MNPs v místě zasaženém rakovinou a následné umístění pacienta do proměnného magnetického pole s vysokou frekvencí. Díky tomu dojde v rozkmitání přítomných nanočástic, čímž se v místě nádoru výrazně zvýší teplota. Tato metoda je již ve fázi klinického testování na lidech, ale je téměř vždy kombinována s jinou, konvenční formou léčby, jako je ozařování nebo chemoterapie. Díky využití hypertermie je však nádorová tkáň daleko citlivější, a proto nejsou nutné tak vysoké dávky ozáření popř. cytostatik aplikovaných při chemoterapii. Ve fázi klinického testování je již použití magnetických nanočástic na bázi oxidů železa obalenými krátkými řetězci dextranu jako kontrastního materiálu ke zvýšení citlivosti magnetické rezonance (MRI). Zobrazování pomocí magnetické rezonance je velmi výhodné pro zobrazování měkkých tkání. Hojně se využívá např. při diagnostikách nádorů vnitřních orgánů nebo kardiovaskulárních onemocněních [15]. 3 Kvantové tečky QDs jsou nanokrystaly založené většinou na polovodičových materiálech o velikosti několika nanometrů, existují buď samostatně, nebo mohou být uspořádány do klastrů. QDs vyka zují fotoluminiscenční vlastnosti, jsou tvořeny atomy II. VI. skupiny periodické tabulky prvků (např. Cd, Zn, S, Se, Te). Jejich výhodou oproti konvenčním fluoroforům je zejména jejich fotostabilita, relativně vysoký kvantový výtěžek, široké excitační pásy, úzké emisní pásy a snadná laditelnost emisního maxima během přípravy. Asi nejčastější uspořádání QDs je takové, kdy jeden typ polovodiče vytváří jádro QDs (core) a kolem něho několik vrstev atomů druhého typu polovodiče vytváří obal kolem tohoto jádra (shell, např. ZnS). QDs tohoto typu se označují jako core/shell struktury. 3.1 Princip fluorescence Po absorpci světelného kvanta budícího záření přechází elektrony ze singletového stavu S 0 do excitovaných singletních nebo tripletových stavů. Molekula obvykle přejde z rovnovážné vibrační hladiny stavu S 0 do některé z vibračních hladin excitovaných stavů (Obr. 3). K deexcitaci molekuly dochází buď zářivými přechody (luminiscence; viz zelené a červené šipky) nebo nezářivými přechody (vnitřní konverze, mezisystémová konverze, vibrační relaxace; viz černé tečkované šipky). Elektrony QD excitované elektromagnetickým zářením přejdou na energeticky vyšší hladinu. Po určité době může dojít k uvolnění této energie a emisi elektromagnetického záření o delší vlnové délce než při excitaci. Na rozdíl od fluoroforů na bázi organických molekul není podoba excitačních a emisních spekter dána jen chemickým složením QD, ale také jejich rozměry. 3.2 Syntéza QDs Jedním z cílů v oblasti syntézy QDs je najít vysoce svítící polovodičové nanokrystaly, které mohou být jednoduše připraveny a přitom splňují všechny podmínky pro použití v biologických aplikacích (biokompatibilita, stabilita, rozpustnost ve vodném prostředí atd.). Podstatné je rovněž to, aby polovodičový materiál tvořící jádro QDs byl chráněn před degradací a oxidací. 57

69 Další potenciální obtíží bývá vysoká reaktivita jader QDs, jež mohou nespecificky interagovat s makromolekulami, což vede k agregaci částic v biologickém prostředí. Tento problém může být snížen nebo dokonce odstraněn přidáním slupky na QDs. Také za účelem zlepšení stability a zvýšení fotoluminiscence jádra QDs byly vyvinuty postupy modifikace jejich povrchu [17]. Existuje několik metod syntézy QDs, které mají zásadní vliv i na jejich výsledné vlastnosti, tudíž způsob výroby QDs může ovlivnit rozsah jejich následné aplikace. Metody tzv. shora dolů ( top down ) jsou využívány pro přípravu QDs z velkého objemu materiálu. Jedna z takových možných příprav je syntéza založená na litografii. Tyto metody však mají jistou nevýhodu v tom, že jimi připravené QDs vykazují zhoršené optické vlastnosti. Metody tzv. zespodu nahoru ( bottom up ) jsou založeny na chemickém principu, přitom je možné jimi připravit koloidní QDs s konzistentními vlastnostmi [18]. Obrázek 3: Schéma zářivých a nezářivých přechodů mezi elektronově vibračními stavy složité molekuly (Jablonského diagram). Převzato z [16] Syntéza hydrofobních QDs Existují dva typy koloidních QDs, ve vodě rozpustné a nerozpustné. Nejkvalitnější QDs jsou připravovány v nevodných rozpouštědlech. Tento typ syntézy je však poměrně náročný, vyžaduje práci při vysokých teplotách a obvykle využívá nestabilní a toxické prekurzory. Z těchto důvodů se více prosazuje příprava QD ve vodném prostředí. Oba přístupy jsou založeny na vytvoření nanokrystalů v přítomnosti stabilizujících ligandů, které zajistí jejich solvataci v reakčním prostředí. Jako prekurzory QDs se využívají práškové chalkogeny, organometalické prekurzory, kovové oxidy atd. Příprava spočívá v rychlém přidání prekurzoru do organického rozpouštědla při vysoké teplotě, pro stabilizaci často používá trioktylfosfin (TOP) nebo trioktylfosfinoxid (TOPO). Při zahřívání dochází k přesunu atomů z menších krystalů na větší, což vede k posunu emise k delším vlnovým délkám. Na povrch takto připravených nanočástic je možné nanést obalovou vrstvu a vytvořit tak core/shell strukturu Metody solubilizace QDs Jelikož většina metod snímání za pomoci QDs se v biologických systémech uplatňuje v roztoku, pro využití koloidních hydrofobních QDs v bioaplikacích musí po jejich syntéze následovat procedura umožňující jejich solubilizaci. Existuje několik způsobů takových modifikací QDs. Na povrchu nanokrystalu se vytvoří vnější obal, který zajistí solvataci jinak hydrofóbních nanokrystalů ve vodném prostředí a současně nese funkční skupiny vhodné pro konjugační reakce. Podle struktury a chemické povahy existují tři následující možnosti (Obr. 4). Výměna ligandů Tato metoda zavádí na povrch QDs bifunkční ligandy. Jedna část jejich molekuly je tvořená funkční skupinou, která vytváří donor akceptorovou vazbu s povrchovými atomy nanokrystalu (nejčastěji thiolová skupina) a druhá část nese vhodnou reaktivní skupinu a umožňuje solvataci. Hydrofobní interakce Touto metodou modifikace je možné na povrchu QDs vázat ligandy a polymery prostřednictvím hydrofobních interakcí. Tato metoda se používá převážně pro převedení hydrofobních QDs do 58

70 vodného prostředí. Podstatou je zavedení amfifilních molekul na jejich povrch. Jedna část těchto molekul zajišťuje hydrofobní interakci s povrchem QDs a TOP, TOPO ligandy, druhá část zajišťuje rozpustnost a chemickou reaktivitu. Pro tento typ úpravy povrchu QDs byly úspěšně použity triblokové kopolymery, fosfolipidy a amfifilní sacharidové deriváty. Zachycení polymeru Další metodou stabilizace je zachycení jedné nebo několika QD v polymerním obalu. Robustní a biokompatibilní obal lze vytvořit pomocí silanizace. V průběhu silanizace je na povrch QD nanesena několik jednotek až desítek nm silná vrstva oxidu křemičitého. Tato vrstva dodává QD stabilitu, snižuje jejich cytotoxicitu a umožňuje zavedení vhodných reaktivních skupin [19]. Obrázek 4: Schematické znázornění solubilizace QDs. Převzato z [20] Přímá syntéza koloidních QDs Přímou syntézou můžeme vytvořit koloidní QDs určité velikosti, s lepšími luminiscenčními vlastnosti a s vynikající biologickou kompatibilitou a stabilitou. Na rozdíl od hydrofobních QDs s následným krokem umožňující jejich rozpouštění ve vodě vykazují lepší reprodukovatelnost, nižší toxicitu a navíc je celý proces výroby levnější. Syntéza se provádí v tři hrdlové baňce spojené se zpětným chladičem, ve které reagují prekurzory těžkého kovu (Cd, Zn, Pb, Sn, ) s prekurzorem chalkogenu. Chalkogen potřebný pro syntézu může být ve formě komerčně dostupných prášků nebo se v laboratoři připraví před použitím v procesu syntézy. Pro syntézu ve vodě rozpustných CdTe QDs může být jako prekurzor chalkogenu použit teluričitan sodný (Na 2 TeO 3 ) v komerční práškové formě nebo čerstvě připravený hydrogen telurid sodný (NaHTe), jenž je však, na rozdíl od Na 2 TeO 3, za normálních podmínek nestabilní, a proto je nutné syntézu QDs s jeho pomocí provádět v inertním prostředí. NaHTe může být připraven ve dvouhrdlé baňce při teplotě 35 C, za intenzivního míchání teluridového prášku s roztokem borohydridu sodného (NaBH 4 ). Během prvních 15 min ohřívání suspenze změní svou barvu z fialové do bezbarvé [21]. Jako stabilizátory se využívají různé thioly (např. glutathion, merkaptopropionová kyselina, thioglykolová kyselina). Tyto stabilizátory zajišťují chemickou a fyzikální stabilitu a možnost modifikace povrchu QDs navázáním funkčních skupin (aminoskupina a karboxylová skupina). Nanokrystaly vznikají smísením vhodných prekurzorů a následným zahříváním (90 100) C po dobu několika hodin). Při syntéze ve vodných roztocích je velikost a tedy i vlnová délka emise QDs dána složením reakční směsi a délkou zahřívání. Takto připravené QDs mohou mít početné defekty a slabší fotoluminescenci, proto se využívá mikrovlnné syntézy. Mikrovlnná syntéza je založena na homogenním zahřívání, eliminují se defekty, částice jsou uniformnější, mají vyšší kvantový výtěžek a v neposlední řadě dochází k výraznému zkrácení reakční doby [22] Biokonjnugace QDs Pro použití QDs v bioaplikacích je nutné je nejprve biofunkcionalizovat, tj. různými metodami vytvořit spojení QDs s biomolekulou (tzv. biokonjnugace). Při biokonjnugaci je zásadní, aby celý proces, resp. jeho výsledný produkt, splňoval několik požadavků, kterými jsou: aktivita biomolekuly jím nesmí být kompromitovaná, 59

71 signál QD by neměl být omezen, umožnění kontroly počtu spojení na povrchu QDs, ke kterým se mohou biomolekuly navázat, kombinace QD biomolekula musí být stabilní, tloušťka slupky QD má být co nejmenší ve srovnání s velikostí QD. Úspěšná a vhodná biofunkcionalizace QDs musí navíc splnit požadavky na koloidní stabilitu, bioinertnost, nízkou toxicitu a vysokou specificitu k zájmovým biomolekulám. Přestože QDs mají relativně malou velikost, disponují dostatečně velkým povrchem pro vytvoření velkého množství spojení s biomolekulami. Tato spojení je možné připravit několika způsoby, přičemž jedním z nich je přímá vazba mezi QD a biomolekulou. Tento typ vazby může být kovalentní nebo nekovalentní. Další možností je vytvoření vazby prostřednictvím jiné molekuly (tzv. crosslinker ) [23]. Přímá nekovalentní vazba mezi QD a biomolekulou je založena na navázání biomolekul na povrch QD pomocí elektrostatických nebo hydrofobních sil, přičemž tato procedura je nejméně náročná. Elektrostatické síly můžeme využít ke spojení záporně nabitých QDs CdTe a pozitivně nabitých enzymů nebo spojení pozitivně nabitých částí proteinu s negativně nabitým komplexem alkyl COOH QD. Proteiny navázané na QDs mohou zvýšit stabilitu jejich povrchu a zlepšit tak i jejich optické vlastnosti. Tento efekt je možné pozorovat při navázání deseti až patnácti pozitivně nabitých částic (pentahistidinový segment) maltózového proteinu na povrch QD. Nevýhodou nekovalentního způsobu spojení je, že aktivita biomolekul může být ovlivněna reaktivním povrchem QD a je obtížné kontrolovat počet navázaných biomolekul na jednu QD. Kovalentní způsob biokonjnugace QDs je nejčastěji uskutečňován pomocí thiolových vazeb. Thiolové kyseliny přítomné na povrchu QDs jsou přitom nahrazeny thiolovými biomolekulami. Takto můžeme na povrch QDs navázat například oligonukleotidy, DNA či hovězí sérový albumin (BSA). Biokonjnugace QDs může být založena i na reakci karboxylové skupiny nacházející se na povrchu QDs a amino skupiny proteinu. Tento způsob biokonjnugace je používán pro navázání imunoglobulinu G (IgG) na povrch QD, přičemž tento komplex se užívá jako ukazatel přítomnosti rakoviny. Stejným způsobem lze na povrch QDs navázat i streptavidin, kdy výsledný komplex je možno použít ke značkování aktinu, mikrotubul a buněčného jádra. Jak již bylo uvedeno výše, biomolekuly se na povrch kvantové tečky mohou navázat prostřednictvím jiné molekuly, jež mezi nimi působí jako spojka (tzv. mediátor). Tento způsob biofunkcionalizace je založen na navázání mediátoru na povrch kvantové tečky (kovalentní nebo nekovalentní vazbou) z jedné strany a reakcí mediátoru s reaktivními skupinami biomolekuly (thiolová nebo amino skupina) na druhé straně mediátoru. Mediátor přitom zajišťuje velmi specifické spojení s biomolekulou. Existují dva typy mediátorů, a sice heterobifunkcionalizační a homobifunkcionalizační mediátor. U prvního typu jsou obě reaktivní skupiny neblokované a u druhého typu je jedna reaktivní skupina blokována, přičemž je nutné tuto blokaci před použitím mediátoru odstranit. Nevýhodou tohoto přístupu je, že homobifunkcionalizační mediátory s neblokováními reaktivními skupinami mohou způsobit shlukování QDs. Další nevýhodou biokonjnugace pomocí mediátoru je, že lze jen velmi těžko kontrolovat počet biomolekul, které se mají navázat na jednu kvantovou tečku, a proto je nutné je separovat. Separaci je možné provést za pomoci gelové elektroforézy. 3.3 Aplikace QDs QDs nachází své uplatnění v analytických metodách při detekci iontů, bakterií, virů, nukleotidových sekvencí, proteinů a jiných analytů. Široké uplatnění existuje samozřejmě ve fluorescenční mikroskopii při zobrazování specificky zvýrazněných biologických objektů a struktur. Pomocí QDs emitujících při různých vlnových délkách 60

72 lze barevně odlišit různé buněčné struktury. Lze jich využít i při vyhledávání a označování specifické tkáně, monitorování pohybu léčiv. 4 Závěr Současné nanotechnologické metody dovolují sestavování a charakterizaci různých objektů a struktur řádově nanometrové velikosti. Mezi nově uplatňující se materiály v medicínských a farmaceutických aplikacích patří magnetické nanočástice a kvantové tečky. Revolučním objevem je zcela určitě jejich využití při odhalování nemocí. Za zmínku stojí cílená distribuce léčiv, případně diagnostických látek nebo peptidických fragmentů v organismu. Využívají se i možnosti povrchové modifikace nanostruktur tak, aby se mohly vázat výhradně na buňky cílového orgánu, dokázaly selektivně prostupovat buněčnou membránou, byly netečné k nepoškozeným buňkám nebo uvolňovaly léčivo přesně podle stanoveného harmonogramu. 5 Reference [1] P. Kluson, M. Drobek, H. Bartkova and I. Budil, Welcome in the Nanoworld, Chemicke Listy, 2007, pp [2] D. Huska, J. Hubalek, V. Adam, D. Vajtr, A. Horna, L. Trnkova, L. Havel and R. Kizek, Automated nucleic acids isolation using paramagnetic microparticles coupled with electrochemical detection, Talanta, 2009, pp [3] V. Adam, D. Huska, J. Hubalek and R. Kizek, Easy to use and rapid isolation and detection of a viral nucleic acid by using paramagnetic microparticles and carbon nanotubes based screen printed electrodes, Microfluidics and Nanofluidics, 2010, pp [4] J. Chomoucka, J. Drbohlavova, D. Huska, V. Adam, R. Kizek and J. Hubalek, Magnetic nanoparticles and targeted drug delivering, Pharmacological Research, 2010, pp [5] J. Chomoucka, J. Drbohlavova, V. Adam, R. Kizek, J. Hubalek and Ieee Synthesis of Glutathione coated Quantum Dots, [6] R. Abu Mukh Qasem and A. Gedanken, Sonochemical synthesis of stable hydrosol of Fe 3 O 4 nanoparticles, Journal of Colloid and Interface Science, 2005, pp [7] A. Hassanjani Roshan, M.R. Vaezi, A. Shokuhfar and Z. Rajabali, Synthesis of iron oxide nanoparticles via sonochemical method and their characterization, Particuology, 2011, pp [8] R. Vijayakumar, Y. Koltypin, I. Felner and A. Gedanken, Sonochemical synthesis and characterization of pure nanometer sized Fe 3 O 4 particles, Materials Science and Engineering: A, 2000, pp [9] A.K. Gupta and M. Gupta, Synthesis and surface engineering of iron oxide nanoparticles for biomedical applications, Biomaterials, 2005, pp [10] K. Kluchova, R. Zboril, J. Tucek, M. Pecova, L. Zajoncova, I. Safarik, M. Mashlan, I. Markova, D. Jancik, M. Sebela, H. Bartonkova, V. Bellesi, P. Novak and D. Petridis, Superparamagnetic maghemite nanoparticles from solid state synthesis Their functionalization towards peroral MRI contrast agent and magnetic carrier for trypsin immobilization, Biomaterials, 2009, pp [11] M. Pecova, L. Zajoncova, K. Polakova, J. Cuda, M. Safarikova, M. Sebela and I. Safarik, Biologically Active Compounds Immobilized on Magnetic Carriers and Their Utilization in Biochemistry and Biotechnology, Chemicke Listy, 2011, pp [12] S. Laurent, D. Forge, M. Port, A. Roch, C. Robic, L.V. Elst and R. N. Muller, Magnetic iron oxide nanoparticles: Synthesis, stabilization, vectorization, physicochemical characterizations, and biological applications, Chemical Reviews, 2008, pp [13] M. Yamaura, R. L. Camilo, L.C. Sampaio, M.A. Macedo, M. Nakamura and H.E. Toma, Preparation and characterization of (3-aminopropyl) triethoxysilane coated magnetite nanoparticles, Journal of Magnetism and Magnetic Materials, 2004, pp [14] A.A.M. Elsherbini, M. Saber, M. Aggag, A. El Shahawy and H.A.A. Shokier, Magnetic nanoparticle induced hyperthermia treatment under magnetic resonance imaging, Magnetic Resonance Imaging, 2011, pp [15] R. Y. Hong, B. Feng, L.L. Chen, G.H. Liu, H.Z. Li, Y. Zheng and D.G. Wei, Synthesis, characterization and MRI application 61

73 of dextran coated Fe3O4 magnetic nanoparticles, Biochemical Engineering Journal, 2008, pp [16] Z. Fišar Fluorescenční spektroskopie v neurovědách, Praha, [17] J. Chomoucka, J. Drbohlavova, P. Businova, M. Ryvolova, V. Adam, R. Kizek and J. Hubalek Synthesis of Glutathione Coated Quantum Dots, in: A. Al Ahmadi (Ed.), State of the Art of Quantum Dot System Fabrications, InTech, 2012, pp [18] J. Drbohlavova, V. Adam, R. Kizek and J. Hubalek, Quantum Dots - Characterization, Preparation and Usage in Biological Systems, International Journal of Molecular Sciences, 2009, pp [19] A. Hlavacek and P. Skladal, The Application of Quantum Dots in Bioanalytical Chemistry, Chemicke Listy, 2011, pp [20] J. Chomoucka, J. Drbohlavova, M. Ryvolova, P. Sobrova, L. Janu, V. Adam, J. Hubalek and R. Kizek Quantum Dots: Biological and Biomedical Applications, in: O. Ciftja (Ed.), Quantum Dots, Nova Science Publisher, Inc., 2012, pp [21] M. Xue, X. Wang, H. Wang and B. Tang, The preparation of glutathione capped CdTe quantum dots and their use in imaging of cells, Talanta, 2011, pp [22] J.L. Duan, L.X. Song and J.H. Zhan, One Pot Synthesis of Highly Luminescent CdTe Quantum Dots by Microwave Irradiation Reduction and Their Hg(2+)-Sensitive Properties, Nano Research, 2009, pp [23] J. Wang and H.Y. Han, Hydrothermal synthesis of high quality type II CdTe/ CdSe quantum dots with near infrared fluorescence, Journal of Colloid and Interface Science, 2010, pp

74 63 POZNÁMKY

75 6UHLÍKOVÉ NANOČÁSTICE: GRAFEN, NANOTRUBICE, FULLERENY 6Jan Prášek

76

77 1 Úvod Uhlík je chemický prvek, který tvoří základní stavební kámen všech organických sloučenin. Je patnáctým nejvíce zastoupeným prvkem zemské kůry a zároveň čtvrtým nejrozšířenějším prvkem ve vesmíru po vodíku, heliu a kyslíku. Je základem všech živých organismů. Uhlík je stabilní v několika víceatomových molekulových strukturách zvaných alotropy. Mezi nejznámější alotropy uhlíku, které se navíc běžně vyskytují v přírodě, patří grafit (Obr. 1A) a amorfní uhlík (Obr. 1B). Vzácnými alotropy uhlíku jsou pak diamant (Obr. 1C) a ještě tvrdší, řídce se vyskytující, lonsdaleit (Obr. 1D) známý s meteoritických kráterů a zbytků meteoritů. 0D částice o všech rozměrech v oblasti jednotek nm (nanokuličky), 1D částice s jedním rozměrem větším než 100 nm (nanovlákna, nanotyčinky, nanotrubičky), 2D částice se dvěma rozměry většími než 100 nm (plošné nanoútvary), 3D částice se všemi rozměry v oblasti 100 nm nebo kombinace předchozích (nanokrystaly). Mezi známé uhlíkové nanočástice lze zařadit například saze o rozměru (10 500) vznikající nedokonalým spalováním organických látek. Z novodobého pohledu lze podle doby objevu uhlíkových nanočástic rozlišit další uhlíkové nano alotropy: 1985 fullereny 0D, 1991 uhlíkové nanotrubice 1D, 1994 (ultra) nanokrystalický diamant 3D, 2004 grafen 2D. A) B) C) D) Obrázek 1: Vybrané alotropy uhlíku: A) grafit;b) amorfní uhlík; C) diamant; D) lonsdaleit. Převzato z [1]. Masivní výzkum uhlíku v submikronové oblasti začal s rozvojem nanotechnologií v polovině 80. let a převážně pak na začátku 90. let s objevem dalších forem uhlíku v podobě uhlíkových nanočástic, tedy částic s jedním rozměrem minimálně pod 100 nm. Právě tento rozměr jim dává nějaké speciální vlastnosti, kterými se odlišují od běžných mikročástic. Z geometrického hlediska lze uhlíkové nanočástice rozdělit na: Jednotlivé uhlíkové nanomateriály se od sebe liší nejen svou strukturou, ale hlavně svými jedinečnými elektrickými, mechanickými, optickými, chemickými a dalšími vlastnostmi, které je předurčují pro použití ve speciálních aplikacích. Na základě vlastností uhlíkových nanomateriálů vzniká široké spektrum aplikací v elektronice (odvod tepla, paměťová média, displeje, palivové články, atd.), stavebnictví (nanokompozitní materiály), strojírenství (maziva, mechanicky odolné povrchy, snižování tření, atd.), zdravotnictví (cílená doprava léčiv), senzorice (senzory plynů, elektrochemické, biosenzory, atd.), chemický, automobilový, vojenský průmysl, atp. 2 Grafen Grafen je alotropem uhlíku, jehož struktura představuje jednu vrstvu grafitu, která byla popsána již v roce 1962 německým vědcem Hansem Peterem Boehmem [2]. Tvoří 2D nanodestičku skládající se z jediné vrstvy sp 2 vázaných atomů uhlíku složených do šestiúhelníkové krystalové 65

78 struktury podobné včelím plástvím (Obr. 2) o tloušťce jednoho atomu uhlíku s meziatomovou vzdáleností 0,142 nm. Grafen byl jako materiál studován již delší dobu s předpokladem, že v praxi bude vzhledem ke své jediné atomární vrstvě nestabilní s tendencí vytvářet jiné uhlíkové útvary. Poprvé se jej podařilo vyrobit až v roce 2004 ve spolupráci vědců Novoselova a Geima z Manchesterské university (Velká Británie) a ruské Akademie věd, kteří tento objev publikovali v časopisu Science [3] a v roce 2010 získali v rámci tohoto objevu Nobelovu cenu za fyziku. teriálem na světě [5]. Mimo to propouští světlo a je výborným vodičem tepla, jak bylo potvrzeno vědeckou studií týmu profesora Shi [6], kde bylo zjištěno, že tepelná vodivost samotného grafenu je W/m/K, což představuje 2,5krát hodnoty získané u diamantu, který měl dosud prvenství v kategorii přírodních materiálů. Pro praktické využití se počítá s kontaktem grafenu s jiným materiálem. Vědecky bylo zjištěno, že hodnota tepelné vodivosti vrstvy grafenu položené na SiO 2 je při pokojové teplotě 600 W/m/K, což představuje téměř dvakrát lepší hodnotu než je u mědi a padesátkrát než u křemíku. Obrázek 2: Grafenová nanodestička tvořící jedno atomární vrstvu atomů uhlíku s šestiúhelníkovou strukturou. Délka vazby mezi dvěma uhlíkovými atomy v grafenové vrstvě je kolem 0,142 nm [4]. Pokud vezmeme několik vrstev grafenu se vzdáleností vrstev 0,335 nm vznikne grafit s 3D strukturou. Například pro vytvoření grafitu o tloušťce 1 mm je tak třeba poskládat na sebe téměř tři miliony vrstev grafenu. Grafen představuje základní stavební prvek některých uhlíkových alotropů jako je již zmíněný grafit, uhlíkové nanotrubice a fullereny. 2.1 Vlastnosti Vědeckými experimenty bylo zjištěno, že grafen přenáší elektrony pozoruhodnou rychlostí a vede tak elektrický proud lépe než křemík. Další experimenty provedené týmem Kysara a Honea potvrdily, že je grafen v současnosti díky silným vazbám mezi atomy uhlíku nejpevnějším ma 2.2 Syntéza Masivní výroba grafenu je doposud poměrně komplikovaná. Pravděpodobně nejstarší metoda přípravy je příprava z filmů oxidu grafitu (použitá Boehmem [2]), jako je např. hydrazin, kdy je oxid grafenu smáčen v hydrazinu, který redukuje vrstvu oxidu grafenu na grafen. První izolace grafenové vrstvy implementované v grafitu byla provedena v roce 2004 jejím oddělením pomocí lepicí pásky [3], kdy byly světlopropustné vrstvy na pásce rozpuštěny v acetonu a po několika dalších krocích byly vrstvy, ve kterých se nacházely i jednoatomární vrstvy grafenu, usazeny na křemíkovém waferu a pozorovány pod mikroskopem. Rok na to byla depozice zjednodušena na suchou cestu přípravy, která byla nazvána jako kreslící metoda, protože se podobala kreslení pomocí grafitu. Další metodou výroby grafenu je epitaxní růst z karbidu křemíku. Tato metoda byla použita pro výrobu grafenových vrstev, na kterých byla zjišťována většina vlastností grafenu. Metoda spočívá v růstu grafenu na karbidu křemíku (SiC), kdy je SiC zahřát na vysokou teplotu (> C) a redukován na grafen. Tímto procesem je vytvořen epitaxní grafen o rozměrech závisejících na velikosti SiC substrátu. Grafenová vrstva lze připravit i epitaxním růstem na kovových substrátech, jejichž atomová 66

79 struktura slouží jako základ pro růst grafenu. Jako kovový podklad bylo úspěšně použito ruthenium, iridium, nikl a měď. Právě měď se ukázala jako velmi vhodný materiál, protože na ní dojde při velmi nízkém tlaku k automatickému zastavení růstu po vytvoření jediné grafenové vrstvy. V poslední době některé práce uvádí možnost vytváření grafenu z vícestěnných uhlíkových nanotrubic, pyrolýzou z ethoxidu sodného, ultrazvukováním grafitu, redukcí z oxidu uhličitého, atd. tranzistorů jít ještě dále až do oblasti frekvencí kolem 1 THz [9]. Pracovníci IBM šli se studiem grafenu ještě dále a letos představili první monolitický integrovaný obvod s tranzistory řízenými polem (FET tranzistory) a indukčnostmi realizovanými z grafenu na waferu z karbidu křemíku [10]. Tímto obvodem byl frekvenční směšovač pracující až do kmitočtu 10 GHz, který je zobrazen na Obr Aplikace Uvedené vlastnosti předurčují grafen jako velmi slibný materiál pro mnohé aplikace. Teoreticky může být grafen díky své 2D struktuře výborným senzorem plynů. Vzhledem k tomu, že celý jeho objem je vystaven svému okolí, může velmi efektivně adsorbovat okolní molekuly. Problém je ale v tom, že podobně jako uhlíkové nanotrubice, nemá grafen na svém povrchu žádné volné vazby, a proto na sebe nemůže snadno molekuly plynů adsorbovat. Grafen je tak ve svém intrinsickém stavu vůči okolním molekulám plynů necitlivý. Citlivost grafenu na molekuly plynů lze výrazně zvýšit jeho funkcionalizací, jako je například vytvoření tenké polymerní vrstvy, která se chová jako koncentrátor absorbující molekuly plynů. Vzhledem ke své výborné elektrické vodivosti je pak takovýto senzor schopen s minimálním šumem detekovat velmi malé množství molekul plynu zachycených na povrchu, které tak způsobí lokální změnu odporu grafenové vrstvy senzoru. Protože grafen vede elektrony neobvykle velkou rychlostí, očekává se (i přes nepřítomnost zakázaného pásu v intrinsickém stavu) jeho nasazení pro realizaci vysokorychlostních nízkošumových grafenových tranzistorů. V porovnání s klasickými křemíkovými tranzistory, kde bylo dosaženo s nejpokročilejší technologií hranice 40 GHz, dosahují první vzorky grafenových tranzistorů od pracovníků IBM vyráběných 240 nm technologií pracovní frekvence 100 GHz [7, 8]. Podle dalších experimentů a studií lze však s využitím grafenových A) B) Obrázek 3: První integrovaný obvod založený na grafenu firmy IBM. A) schéma obvodu, B) realizovaný vzorek. Převzato z [10]. Linovi a jeho spolupracovníkům z IBM se tak podařilo prolomit problémy jiných firem s tím, jak propojit grafen s dalšími kovy v obvodu a s jeho ochranou během leptání, které vyřešily pokrytím grafenu acetonem odstranitelnou vrstvičkou polymeru. Takto se jim podařilo vytvořit tranzistor s délkou hradla 550 nm. Do budoucna uvažují o využití materiálů, které by neomezovaly výbornou elektrickou vodivost grafenu. Tyto obvody by pak v budoucnu mohly úplně vytlačit klasické křemíkové integrované obvody (na zvážení pak bude i přejmenování Silicon Valley 67

80 na Graphen Valley). Hlavní roli zde bude hrát reprodukovatelnost výrobního procesu a spolehlivost takto vyrobených součástek. Otázkou však stále zůstává možnost využití monovrstvy molybdenitu s podobnými vlastnostmi, jako má grafen, který se pro využití v elektronice hlavně díky svým přirozeným polovodivým vlastnostem (šířka zakázaného pásma 1,8 ev) hodí ještě lépe. Obrázek 4: Schéma organické světlo emitující diody (OLED) s průhlednou vodivou grafenovou. Převzato z [12]. S aplikací v elektronice souvisí i výborná teplená vodivost grafenu, které by mohlo být využito pro lepší odvod ztrátového tepla z integrovaných obvodů. Mezioborový tým vedený profesorem Shi potvrdil, jak výrazně grafen dokáže předčit křemík i měděné nanostruktury v současných počítačových obvodech, pokud je integrován na substrátu obvodu [6]. To grafen kvalifikuje na prvního kandidáta pro vyřešení odvodu ztrátového tepla z integrovaných obvodů. Právě odvod tepla z integrovaných obvodů, které se již pomalu přibližuje teplu generovanému jadernými reaktory, je jedním z hlavním limitujících faktorů pro další rozvoj nanoelektroniky. Proto probíhají další experimenty, které by ještě více tuto možnost přiblížili světu. V letošním roce se podařilo vytvořit i třírozměrnou vertikálně uspořádanou vícevrstvou grafenovou strukturu, která si zachovala výbornou tepelnou vodivost grafenu, ale navíc vykazovala i výborný přenos tepla mezi kovem a grafenem [11]. Vědci také zjistili, že přidáním grafenu do epoxidových nanokompozitů lze zvýšit jejich pevnost a tuhost než vykazují podobné nanokompozity realizované s uhlíkovými nanotrubicemi, protože grafen má schopnost vytvářet s epoxidem pevnější vazbu. Takto lze vyrobit součástky s vysokým poměrem pevnosti k hmotnosti, čehož by mohlo být využito pro výrobu listů větrných elektráren nebo leteckých součástek. Vzhledem k světelné propustnosti grafenu je možné jej využít například i pro výrobu elektrod levných displejů pro mobilní zařízení. Bylo zjištěno, že grafen může nahradit elektrody organických světlo emitujících diod (OLED) založených na indiu, které jsou využívány pro displeje elektronických zařízení s nízkým příkonem [12]. Použití grafenu, jak je schematicky znázorněno na Obr. 4, by tak snížilo cenu těchto displejů a zároveň vyloučilo použití jakýchkoli kovů, což by vedlo velkému zjednodušení následné recyklace. Podobně lze grafen využít pro dotykové displeje, LCD displeje, fotovoltaické články. Ukazuje se, že další možnou aplikací grafenu je oblast superkondenzátorů (Obr. 5) a palivových článků. Očekává se, že s využitím grafenu bude pravděpodobně dosaženo ještě větší hustoty pro uchování náboje, než je tomu možné v současnosti [13, 14]. Další možnosti využití grafenu jsou například v oblasti bioaplikací, například jako senzory nemocí v podobě detekce specificky poškozené DNA [15, 16], v cílené likvidaci bakterií obalovými materiály potravin [17], apod. 3 Uhlíkové nanotrubice Uhlíkové nanotrubice (CNTs) patří k relativně novým nanomateriálům, které jsou veřejností známé již 20 let, ale jejich historie sahá poněkud dále do minulosti. První pozorování a popis uhlíkových nanotrubic bylo provedeno v roce 1952 Radushkevichem a Lukyanovichem [18] a později v roce 1976 byly jednostěnné (nebo dvoustěnné) CNTs pozorovány Oberlinem a jeho spolupracovníky [19]. V novodobé historii je objev uhlíkových nanotrubic připisován Iijimovi, 68

81 jako prvnímu vědci, který v roce 1991 popsal výrobní proces vícestěnných uhlíkových nanotrubic (MWNTs), jako výsledek náhodného procesu během testu nového procesu přípravy fullerenů C 60 [20]. Ačkoliv byl Iijima první, kdo světu v časopisu Nature představil tento novodobý fenomén, existovala již firma v USA, která byla schopná vyrábět defektní uhlíkové nanotrubice nazvané uhlíková nanovlákna pomocí chemické depozice z plynné fáze (CVD). V roce 1993 pak Iijima s Ichihashi a na nich nezávisle Bethune s jeho spolupracovníky popsali proces růstu jednostěnných uhlíkových nanotrubic (SWNTs) [21, 22]. A) B) C) Orázek 5: Modifikace povrchu grafenu MnO 2 nanokvětinami. A) schéma grafenové elektrody a grafenové elektrody modifikované MnO 2, B) schéma asymetrického superkondenzátoru s grafenovou anodou a MnO 2 modifikovanou grafenovou katodou, C) snímek MnO 2 modifikované grafenové elektrody z rastrovacího elektronového mikroskopu (šipky ukazují grafenové nanovrstvy).převzato z [14]. CNTs, kterou lze charakterizovat rovnicí, kde n > m > 0, se nazývá chirální. Chiralita CNTs určuje elektrické, mechanické, optické, chemické a další vlastnosti CNTs. Tím, jak ovlivňuje chirální vektor s odpovídajícími čísly n a m elektrické vlastnosti CNTs, se například ve své práci zabývá Dresselhaus se svými spolupracovníky [23]. CNTs mohou být konstruovány ve dvou základních formách, jako jednostěnné nebo vícestěnné CNTs. SWNTs se skládají z jedné grafenové nanotrubice (Obr. 6), naopak MWNTs jsou složeny z několika soustředných grafenových nanotrubic vložených do sebe. Průměr CNTs se mění od několika nanometrů v případě SWNTs až po několik desítek nanometrů v případě MWNTs. Délka CNTs se obvykle pohybuje v řádu mikrometrů [24]. Nejjednodušším příkladem MWNTs jsou dvoustěnné uhlíkové nanotrubice (DWNTs), jak je ukázáno na Obr. 8A. DWNTs vykazují kombinaci mimořádných vlastností SWNTs a tím mají několik výhod oproti samotným SWNTs (například vyšší stabilitu a tuhost) [25]. Obrázek MWNT vytvořené pomocí plasmou aktivované CVD (PECVD) za atmosférického tlaku pořízený transmisním elektronovým mikroskopem (TEM) je zobrazen na Obr. 8B. 3.1 Konstrukce a vlastnosti CNTs Strukturou lze SWNTs přirovnat ke srolovanému listu grafenu (Obr. 6). Směr, kterým je grafen srolován podél své šestiúhelníkové struktury podobné včelím plástvím, je dán chirálním vektorem C, který je výsledkem páru celých čísel (n, m), které odpovídají grafenovým vektorům a 1 a a 2. Princip konstrukce SWNT z listu grafenu podél chirálního vektoru C je zobrazen na Obr. 7. Podle hodnoty čísel (n, m) existují dva základní typy konstrukce SWNTs. Struktura (n, 0) se nazývá zigzag a struktura, kde n = m (n, n) armachair. Třetím, nestandardním, typem konstrukce Obrázek 6: Srolování grafenu do SWNT. Obrázek 7: Princip konstrukce SWNT srolováním listu grafenu podél chorálního vektoru C. 69

82 A) B) Obrázek 8: A) DWNT jako nejjednodušší příklad MWNT, B) TEM snímek MWNT realizované pomocí PECVD. CNTs vykazují velmi dobré mechanické vlastnosti. Youngův modul/modul pevnosti v tahu pro SWNTs i MWNTs je větší než 1 TPa/100 GPa, maximální vratná deformace dosahuje hodnoty (10 30) % a hustota 1,35 g/cm 3. Co se týká elektrických vlastností, CNTs vykazují elektrický odpor 10 4 Ω/cm. Maximální proudová hustota dosahuje hodnoty až 1013 A/m 2. Pro SWNTs obecně platí, že nanotrubice typu armchair mají vodivý charakter. U zigzag a chirální struktury platí, že CNTs mají vodivý charakter, pokud je rozdíl n m dělitelný třemi. V ostatních případech mají CNTs polovodivý charakter. U MWNTs se předpokládá, že alespoň jedna vrstva má vodivý charakter. Tepelná vodivost SWNTs dosahuje hodnoty ( ) W/ mk a více než W/mK pro MWNTs. CNTs rovněž vykazují výborné autoemisní vlastnosti s nízkým prahovým napětím v řádu několika V/mm. 3.2 Syntéza Uhlíkové nanotrubice lze v dostatečném množství vyrábět s použitím několika metod, které jsou shrnuty na Obr. 9. Každá z nich má nějaké výhody a nevýhody, které vedou k různým výsledkům. Výběr specifické metody předurčuje přípravu CNTs s požadovanými vlastnostmi. Skutečnost, že SWNT a MWNT o stejné délce nemají stejnou hmotnost, bylo donedávna opomíjeno. Proto je nutné stanovit vztah mezi hmotností, hustotou CNTs a jejich geometrickými vlastnostmi (vnitřní průměr, vnější průměr a počet stěn) [26]. Rozdíly v průměru také ovlivňují rozpustnost CNTs v super kyselinách a dispergovatelnost v povrchově aktivních látkách (surfaktantech). Následné zpracování, jako je čištění, také ovlivňuje rozpustnost CNTs a proto je nutné ho řídit. Například Duque se svými spolupracovníky zjistil, že SWNTs s malým průměrem jsou lépe rozpustné než velké. To může pomoci k dosažení většího výtěžku při separaci (n, m) SWNTs. Navíc zjistili, že rozpustnost a dispergovatelnost hrají klíčovou roli při makroskopických technikách zpracování SWNTs jako je vytváření vláken, zesilování materiálů a výroba tenkých vrstev [27]. Obrázek 9: V současnosti používané metody pro výrobu CNTs. Prvními metodami pro přípravu CNTs byly elektrický obloukový výboj a laserová ablace, ale v současnosti byly tyto techniky nahrazeny nízkoteplotní chemickou depozicí z plynné fáze (< 800 C), kde je velmi dobře možné kontrolovat orientaci, uspořádání, délku, průměr, čistotu a hustotu [28]. Mimo tyto metody přípravy CNTs existují i další speciální techniky, jako je pyrolýza nebo techniky pro selektivní růst CNTs za pomoci CVD. Většina technik pro přípravu CNTs vyžaduje podpůrné plyny a vakuum, ale jsou již známé techniky přípravy za atmosférického tlaku [29 32]. Metody z plynné fáze mají velký výtěžek a proto jsou vhodné pro výrobu kompozitních materiálů, které vyžadují velké množství CNTs, a tím pádem stejně tak i pro levnou průmyslovou výrobu. Na druhou stranu je nevýhodou to, že 70

83 jen z malého procenta katalyzátoru vzniknou nanotrubice a krátká životnost katalyzátorů [33]. Nezávisle na použité metodě vždy během přípravy CNTs vznikají nějaké nečistoty, jejichž typ a množství závisí na použité technice. Většina ze zmíněných technik vytváří prášek, který obsahuje pouze malé množství CNTs. Mimo CNTs jsou další součástí prášku jiné uhlíkové částice jako je nanokrystalický grafit, amorfní uhlík, fullereny a různé kovy (obvykle Fe, Co, Mo nebo Ni), které se používají jako katalyzátor během syntézy. Tyto nečistoty pak ovlivňují požadované vlastnosti CNTs a způsobující tak vážné problémy při aplikaci. Proto je jedním ze základních problémů v oblasti CNTs vyvinutí efektivních a jednoduchých čisticích metod [34]. Většina ze základních čisticích metod je založena na čištění vyrobených CNTs pomocí kyselin [35]. 3.3 Funkcionalizace I přesto, že uhlíkové nanotrubice mají sami o sobě jedinečné vlastnosti, je nutné je pro většinu aplikací funkcionalizovat. Funkcionalizací se rozumí modifikace povrchu uhlíkových nanotrubic tak, aby byly schopné na sebe vázat další organické nebo anorganické molekuly a tím měnit své vlastnosti a povrchovou aktivitu. Jedná se obvykle o zvýšení rozpustnosti a biokompatibility CNTs nebo dosažení požadovaných fyzikálních a chemických vlastností. Možnosti funkcionalizace SWNTs jsou uvedeny na Obr. 10. Funkcionalizaci lze rozdělit na dvě hlavní skupiny: 1. funkcionalizace uvnitř (endohedrální) nanotrubice jsou funkcionalizovány jejich spontánním nebo chemickým vyplněním nanočásticemi (Obr. 10E), 2. vnější chemická funkcionalizace (exohedrální) zde jsou funkcionalizovány stěny nanotrubic (Obr. 10A D). Tuto skupinu lze ještě dále rozdělit podle mechanismu vazby různých skupin a látek na povrch stěn do tří podskupin: a. kovalentní funkcionalizace navázáním funkčních skupin na konce nanotrubic nebo v místě defektů (Obr. 10A), b. kovalentní funkcionalizace bočních stěn (Obr. 10B), c. nekovalentní funkcionalizace, např. obalením polymery (Obr. 10B), surfaktanty nebo biomolekulami. B) A) C) D) E) Obrázek 10: Možnosti funkcionalizace SWNTs. A) funkcionalizace v místě defektu, B) kovalentní funkcionalizace bočních stěn, C) nekovalentní funkcionalizace surfaktanty, D) nekovalentní exohedrální funkcionalizace polymery, E) endohedrální funkcionalizace, zde např. fullerenem C 60. Převzato z [36]. 3.4 Aplikace Od publikace Iijimova objevu [20] se CNTs začaly v širokém měřítku používat v mnoha aplikacích díky svým jedinečným elektrickým, mechanickým, optickým, tepelným a dalším vlastnostem. Aplikace je obvykle dána právě strukturou CNTs (počet stěn, průměr, délka, chirální úhel, atd.), která jim dává specifické vlastnosti. Možné aplikace CNTs zahrnují vodivé vrstvičky, solární články, palivové články, superkondenzátory, tranzistory, paměti, displeje, separační membrány a filtry, akumulátory, čisticí systémy, senzory, oblečení, hroty pro AFM, atd. V oblasti nanokompozitních materiálů se objevuje například NASA se svou vizí o výrobě lehkých raketoplánů nebo vesmírných výtahů z nanokompozitů s obsahem CNTs, které mají výborný poměr mezi pevností a hmotností. stejně 71

84 tak, jako je tomu u grafenu, je snahou využít CNTs jako plnivo do epoxydových nanokompozitů pro výrobu listů větrných elektráren nebo v leteckém průmyslu pro zesílení trupů letadel. Bylo také zjištěno, že CNTs přidané do betonu vymezí prázdné vzduchové kapsy, do kterých by mohla zatékat voda. Tím dojde k zamezení vzniku prasklin vlivem povětrnostních podmínek. Výzkum se ubírá i možností vetkání CNTs do speciálních tkanin, ze kterých by bylo možné vyrobit oblečení odolné vůči průniku střel do těla, kde by tak mohlo dojít pouze ke zlomeninám a vnitřnímu krvácení [37]. CNTs lze využít i pro membrány reverzibilních osmóz, kde dochází ke snížení energie potřebné pro průchod molekul vody, které oproti jiným typům nanopórů, protékají CNTs mnohem snadněji díky jejich hladkému vnitřnímu povrchu. Velké možnosti využití CNTs se nachází i v elektronice. Již v roce 2001 Postma se svými spolupracovníky publikoval práci o funkčním CNTs tranzistoru řízeným polem (CNFET) realizovaným z jednostěnné CNT pracujícím při pokojové teplotě schopný digitálního spínání pomocí pouze jediného elektronu [38]. Již o dva roky později firma NEC oznámila výrobní technologii pro reprodukovatelnou výrobu CNFET tranzistorů. Snímek z rastrovacího elektronového mikroskopu (SEM) CNFET tranzistoru je zobrazen na Obr. 11. nost vést teplo lze v elektronice s výhodou oproti mědi využít CNTs i jako speciální materiál pro výrobu chladičů [39]. CNTs nacházejí uplatnění i v oblasti vodičů, které vykazují lepší vodivost než hliník a měď [40], jak je například využito pro nanovodiče na křemíkovém čipu (Obr. 13). Obrázek 12: RAM paměť realizovaná pomocí CNTs na čipu. Vpravo je uveden rozdíl mezi stavem logické 1 a 0. Převzato z [40]. Obrázek 13: Využití CNTs pro nanovodiče na křemíkovém čipu. Převzato z [40]. CNTs byly využity pro výrobu flexibilních papírových baterií a superkondenzátorů, které se skládají z tenkého listu celulózy, ve kterém jsou vrstvy CNTs tvořící elektrody (Obr. 13) [42]. Autoemisních schopností CNTs pak bylo využito i při realizaci autoemisního displeje, kde se využívá studené emise elektronů z pole CNTs, jak je znázorněno na Obr. 14 [40]. Obrázek 11: SEM snímek CNFET tranzistoru na vysoce p dotovaném Si substrátu. Převzato z [41]. V roce 2004 byla představena první paměť s CNTs v integrovaném obvodu. Příklad RAM paměti realizované pomocí CNTs je zobrazen na Obr. 12. Vzhledem k nízké hmotnosti a schop Obrázek 14: Schéma tří vývodového hybridního nanokompozitního papíru jako superkondenzátor a baterie. Převzato z [42]. 72

85 Velmi slibnou aplikací CNTs je oblast medicíny, kde je na povrch CNTs možné navázat další molekuly například v podobě léčiv a ty pak cíleně dopravovat k rakovinou zasaženým buňkám [43]. V medicíně by CNTs mohly díky své schopnosti pronikat do membrán, jako jsou stěny buněk, posloužit i jako nanojehly pro vpravování kvantových teček a proteinů do rakovinových buněk. Schopnost molekul z okolního prostředí dobře se vázat na atomy uhlíku má za následek výraznou změnu elektrické vodivosti CNTs. Této vlastnosti je využíváno při detekci plynů, jako je například CO, O 2 (Obr. 16) [44], nebo biologických molekul [45] (Obr. 17), toxických látek, výbušnin, atp. roskopů. Na Obr. 18A je zobrazen AFM hrot s CNT. Porovnání zobrazení morfologie povrchu dosažené pomocí standardního hrotu (Obr. 18B) a hrotu modifikovaného CNT (Obr. 18C). Obrázek 17: SWNTs biosenzor pracující ve spojení s CN FET tranzistorem, kde interakce s biomolekulami mění propustnost kanálu. Převzato z [45]. A) B) C) Obrázek 18: Využití CNTs jako hrotu pro AFM. A) hrot AFM s CNT, B) zobrazení povrchu pomocí standardního křemíkového hrotu, C) zobrazení povrchu pomocí hrotu s CNT. Převzato z [46]. Obrázek 15: Schéma autoemisního displeje se SEM snímkem povrchu kovové elektrody s trčícími CNTs (vlevo) a vlastní elektronickou realizací (vpravo). Převzato z [40]. Obrázek 16: SWNTs senzor O 2 pracující pod UV při pokojové teplotě. Převzato z [44]. Dalším uplatněním CNTs v podobě nanohrotů se ukazuje v oblasti rastrovací mikroskopie atomárních sil (AFM), kde se běžně využívá leptaných křemíkových hrotů ke zjištění morfologie povrchu. CNTs zde představují možnost, jak minimalizovat velikost hrotu do řádu jednotek nanometrů a tím zlepšit rozlišení AFM mik 4 Fullereny Podobně jako uhlíkové nanotrubice patří fullereny mezi alotropy uhlíku spadajících do oblasti nano, ale svou 0D velikostí pohybující se rozměrově v oblasti do jednotek nanometrů je lze řadit téměř až do oblasti sub nano materiálů. Historie fullerenů sahá až do roku 1965, kdy byla Schulzem popsána jejich možná struktura [47]. V roce 1970 pak Osawa předpověděl existenci fullerenu C 60 [48] a v roce 1973 skupina sovětských vědců v čele s prof. Bochvarem provedli kvantově chemickou analýzu stability fullerenu C 60 a vypočítali elektronickou strukturu molekuly [49]. V roce 1985 vědecký tým na Sussexské univerzitě pod vedením Krota provedl objev buckminster fullerenu C 60 (Obr. 19A) [50], který za něj v roce 1996 společně s Curlem a Smayleyem dostal Nobelovu cenu. Název fulleren 73

86 jen odvozen geodetických kopulí navržených americkým architektem, matematikem, vynálezcem a spisovatelem Richardem Buckminster Fullerem (Obr. 19B). A) strukturou je právě buckminster fulleren C 60, jehož krystalická forma je tvrdší než diamant, ale předpokládá se, že ještě stabilnější by mohl být buckyball fulleren C 80. Mimo sférické a eliptické fullereny, mezi které patří i nejmenší C 20, C 70 (Obr. 20A), C 540, atd., se mezi fullereny řadí i uhlíkové nanotrubice, popsané v jiné kapitole, polymerní řetězce dvou a třídimenzionálních polymerů utvářených pod vysokým tlakem a teplotou, nanocibule (Obr. 20 B), což jsou vícevrstvé sférické fullereny, dimery (dva buckyball fullereny spojené uhlíkovým řetězcem Obr. 20C) a fullerenové prstence. A) B) B) Obrázek 19: A) buckminster fulleren C 60, B) expozice USA navržená Buckminster Fullerem na EXPO 1967 v Montrealu. Převzato z [51] 4.1 Struktura a vlastnosti Strukturou se jedná o molekuly z atomů uhlíku s meziatomární vzdáleností ~ 0,142 nm, které jsou uspořádány do jediné grafenové vrstvy tvořené pěti a šestiúhelníky, která je prostorově sbalena do uzavřeného, obvykle sférického nebo elipsoidního, tvaru. Příkladem může být fulleren C 60 zobrazený na Obr. 19A, který se skládá s šedesáti atomů uhlíku. Protože jsou sférické fullereny velmi podobné fotbalovému míči, často se jim říká i buckyball fullereny, které jsou vzhledem ke své struktuře mimořádně odolné vůči vnějším fyzikálním vlivům. Stabilita fullerenů závisí na jejich struktuře, přičemž platí pravidlo o izolovaných pětiúhelnících, kdy stabilní jsou takové fullereny, v nichž se nenachází dva pětiúhelníky vedle sebe. Zatím nejstabilnější C) Obrázek 20: A) eliptický fulleren C70, B) nanocibule C540(C240(C60)), C) dimer fullerenu C60. Mezi základní vlastnosti fullerenů patří velmi malá velikost (C 60 průměr 1,1 nm), odolnost vůči vnějším fyzikálním vlivům, jako je teplota a tlak, v některých případech magnetické vlastnosti, supravodivost i při teplotách relativně vysoko nad absolutní nulou (19 40) K, možnost optimalizovat jejich vlastnosti vložením atomů jiných prvků do jejich struktury pro optimalizaci vlastností, možnost navazovat různé funkční skupiny a vytvářet tak deriváty, katalytické, antioxidační a antibakteriální vlastnosti. 4.2 Syntéza a funkcionalizace Fullereny lze připravit několika metodami. Základní metodou je Hufmann Krätschmerova metoda, která je založena na odpařování grafitu vzniklého v elektrickém oblouku mezi grafito 74

87 vými elektrodami v He atmosféře za sníženého tlaku (100 torr) a následnou extrakcí, což je obdoba elektrického oblouku pro výrobu CNTs. Další metoda je založena na spalování benzenu bez přítomnosti kyslíku. Třetí používanou metodou je pyrolytická dehydrogenace i dehydrohalogenace uhlovodíkových sloučenin pomocí laseru, což je opět obdoba laserová ablace pro výrobu CNTs. Podobně jako u CNTs se fullereny pro získání specifických vlastností vhodných ro různé aplikace funkcionalizují. Dosažení požadovaných fyzikálních a chemických vlastností fullerenů pro různé aplikace lze dosáhnout pomocní redoxních reakcí, jako je chemická nebo elektrochemická redukce v roztoku, nebo pomocí adičních reakcí prováděných obvykle v místech s nejslabší dvojnou 6-6 vazbou pomocí cykloadice a nukleofilní a radikálové adice. 4.3 Aplikace Z aplikačního hlediska nenacházejí fullereny tak široké uplatnění, jako je tomu v případě CNTs nebo grafenu. Jednou z jejich možných aplikací, jsou fotovoltaické články, kde jsou využity buď čisté fullereny, nebo jejich deriváty zlepšující jejich rozpustnost a elektrické vlastnosti. Ve fotovoltaických článcích jsou fullereny, jako polovodiče typu N (elektronové akceptory), použity ve spojení s polymerním polovodičem typu P, jako je polythiofen. Tato směs zde pak funguje jako aktivní vrstva vytvářející heterogenní přechod, jak je ukázáno na obrázku 20. I když prozatím byla zlepšena účinnost solárních článků o přibližně 8,5 % předpokládá se, že by mělo být možné se s touto strukturou dostat až na 20 % [51]. Polovodivých vlastností fullerenů nachází uplatnění i v oblasti organických polymerů, kde se podobně jako CNTs využívají pro konstrukci organických tranzistorů řízených polem (OFET). Nejlepší z OFETů využívají polovodivost typu N fullerenů C 60, C 70 a C 84, přičemž fullereny C 84 vykazují vyšší mobilitu náboje a stabilitu než fullereny C 60 a C 70. Fullereny nachází uplatnění i jako polymerní aditiva, kde mohou být začleněny do jiné polymerní struktury a vytvářet tak kopolymery se specifickými fyzikálními a mechanickými vlastnostmi. Uplatnění pak nalézají ve speciálních lubrikantech a mazivech. Velké pole uplatnění fullereny nalézají i v oblasti medicíny. Fullereny jsou dobrými antioxidanty velmi dobře reagujícími s volnými radikály, které jsou často příčinou poškození buněk následně způsobující smrt. Jsou schopny pohltit 20 i více volných radikálů na jeden fulleren, čímž až stokrát převyšují současně používané antioxidanty, jako je vitamín E. Velké farmaceutické společnosti proto zkoumají možnost využití fullerenů pro nemoci způsobené volnými radikály, jako je Alzheimerova choroba nebo amyotrofická laterální skleróza (ALS) a Parkinsonova choroba. Své uplatnění by mohly najít i jako inhibitory HIV proteázy. Obrázek 21: Fullereny v nanokompozitním heterogenním přechodu fotovoltaického článku. Převzato z [53]. 5 Závěr Uhlíkové nanočástice patří do skupiny velmi slibných materiálů pro využití v blízké budoucnosti v širokém spektru aplikací díky svým jedinečným elektrickým, mechanickým, optických, chemickým a dalším vlastnostem. Své uplatnění již nalézají hlavně v elektronice v oblasti tranzistory, pamětí, autoemisních displejů, vodivých propojů, atd., ale i mimo ni v mnoha dalších aplikacích, jako jsou multifunkční nanokompozitní materiály, senzory mechanických veličin, chemických, biochemických látek a plynů, chladiče, baterie, úložiště 75

88 vodíku pro palivové články, elektrody superkondenzátorů, hroty mikroskopů atomárních sil, antioxidanty, fotovoltaické články, atd. Nevýhodou je, že zatím nelze průmyslově tyto částice vyrobit s naprostou čistotou a bez defektů a proto je potřeba provádět následné čištění. Pro některé aplikace se však defektů s výhodou využívá nebo jsou naopak vytvářeny uměle pro snadnější modifikaci povrchu částic. Vzhledem k velikosti částic, které díky svým rozměrům mohou pronikat do tkání, se stále více hovoří i možné toxicitě uhlíkových nanočástic. V některých studiích se uvádí, že například uhlíkové nanotrubice způsobily v žaludku zvířat podobné patologické změny jako např. vlákna azbestu a při vdechování plicní zánět a fibrózu [53 55]. Byly zjištěny i genotoxické účinky uhlíkových nanotrubic. Existují však i studie, které toxicitu uhlíkových nanotrubic zmírňují. Naopak fullereny se ukazují jako výborné antioxidanty. 6 Reference [1] Wikipedia Allotropes of carbon --- Wikipedia, The Free Encyclopedia, [2] H.P. Boehm, A. Clauss, G.O. Fischer and U. Hofmann, Das Adsorptionsverhalten sehr dünner Kohlenstoff Folien, Zeitschrift Fur Anorganische Und Allgemeine Chemie, 1962, pp [3] K.S. Novoselov, A.K. Geim, S.V. Morozov, D. Jiang, Y. Zhang, S.V. Dubonos, I.V. Grigorieva and A.A. Firsov, Electric field effect in atomically thin carbon films, Science, 2004, pp [4] R. Heyrovska Atomic Structures of Graphene, Benzene and Methane with Bond Lengths as Sums of the Single, Double and Resonance Bond Radii of Carbon, 2008, pp. 4. [5] C. Lee, X.D. Wei, J.W. Kysar and J. Hone, Measurement of the elastic properties and intrinsic strength of monolayer graphene, Science, 2008, pp [6] J.H. Seol, I. Jo, A.L. Moore, L. Lindsay, Z.H. Aitken, M.T. Pettes, X.S. Li, Z. Yao, R. Huang, D. Broido, N. Mingo, R. S. Ruoff and L. Shi, Two Dimensional Phonon Transport in Supported Graphene, Science, 2010, pp [7] Y.M. Lin, C. Dimitrakopoulos, K.A. Jenkins, D.B. Farmer, H.Y. Chiu, A. Grill and P. Avouris, 100-GHz Transistors from Wafer Scale Epitaxial Graphene, Science, 2010, pp [8] C. Dimitrakopoulos, Y.M. Lin, A. Grill, D.B. Farmer, M. Freitag, Y.N. Sun, S.J. Han, Z.H. Chen, K.A. Jenkins, Y. Zhu, Z.H. Liu, T.J. McArdle, J.A. Ott, R. Wisnieff and P. Avouris, Wafer scale epitaxial graphene growth on the Si face of hexagonal SiC (0001) for high frequency transistors, Journal of Vacuum Science & Technology B, 2010, pp [9] L. Liao, J.W. Bai, R. Cheng, Y.C. Lin, S. Jiang, Y.Q. Qu, Y. Huang and X.F. Duan, Sub-100 nm Channel Length Graphene Transistors, Nano Letters, 2010, pp [10] Y.M. Lin, A. Valdes Garcia, S.J. Han, D.B. Farmer, I. Meric, Y.N. Sun, Y.Q. Wu, C. Dimitrakopoulos, A. Grill, P. Avouris and K.A. Jenkins, Wafer Scale Graphene Integrated Circuit, Science, 2011, pp [11] Q.Z. Liang, X.X. Yao, W. Wang, Y. Liu and C.P. Wong, A Three Dimensional Vertically Aligned Functionalized Multilayer Graphene Architecture: An Approach for Graphene Based Thermal Interfacial Materials, Acs Nano, 2011, pp [12] J.B. Wu, M. Agrawal, H.A. Becerril, Z.N. Bao, Z.F. Liu, Y.S. Chen and P. Peumans, Organic Light Emitting Diodes on Solution Processed Graphene Transparent Electrodes, Acs Nano, 2010, pp [13] M.D. Stoller, S.J. Park, Y.W. Zhu, J.H. An and R. S. Ruoff, Graphene Based Ultracapacitors, Nano Letters, 2008, pp [14] Q. Cheng, J. Tang, J. Ma, H. Zhang, N. Shinya and L.-C. Qin, Graphene and nanostructured MnO2 composite electrodes for supercapacitors, Carbon, 2011, pp [15] N. Mohanty and V. Berry, Graphene Based Single Bacterium Resolution Biodevice and DNA Transistor: Interfacing Graphene Derivatives with Nanoscale and Microscale Biocomponents, Nano Letters, 2008, pp [16] M.S. Xu, D. Fujita and N. Hanagata, Perspectives and Challenges of Emerging 76

89 Single Molecule DNA Sequencing Technologies, Small, 2009, pp [17] W.B. Hu, C. Peng, W.J. Luo, M. Lv, X.M. Li, D. Li, Q. Huang and C.H. Fan, Graphene Based Antibacterial Paper, Acs Nano, 2010, pp [18] L.V. Radushkevich and V.M. Lukyanovich, O strukture ugleroda, obrazujucegosja pri termiceskom razlozenii okisi ugleroda na zeleznom kontakte, Zh. Fizich. Khimii, 1952, pp [19] A. Oberlin, M. Endo and T. Koyama, Filamentous growth of carbon through benzene decomposition, J. Cryst. Growth, 1976, pp [20] S. Iijima, Helical microtubules of graphitic carbon, Nature, 1991, pp [21] D.S. Bethune, C.H. Kiang, M.S. Devries, G. Gorman, R. Savoy, J. Vazquez and R. Beyers, Cobalt catalyzed growth of carbon nanotubes with single atomic layerwalls, Nature, 1993, pp [22] S. Iijima and T. Ichihashi, Single shell carbon nanotubes of 1-nm diameter, Nature, 1993, pp [23] M.S. Dresselhaus, G. Dresselhaus and R. Saito, Physics of carbon nanotubes, Carbon, 1995, pp [24] A. Merkoci (Ed.) Biosensing using nanomaterials, Wiley, New Jersey, [25] A. Jorio, G. Dresselhaus and M.S. Dresselhaus (Eds.) Carbon nanotubes, Springer Verlag, Berlin, [26] C. Laurent, E. Flahaut and A. Peigney, The weight and density of carbon nanotubes versus the number of walls and diameter, Carbon, 2010, pp [27] J.G. Duque, A.N.G. Parra Vasquez, N. Behabtu, M.J. Green, A.L. Higginbotham, B.K. Price, A.D. Leonard, H.K. Schmidt, B. Lounis, J.M. Tour, S.K. Doorn, L. Cognet and M. Pasquali, Diameter Dependent Solubility of Single Walled Carbon Nanotubes, ACS Nano, 2010, pp [28] Z.B. He, J.L. Maurice, C.S. Lee, C.S. Cojocaru and D. Pribat, Nickel catalyst faceting in plasma enhanced direct current chemical vapor deposition of carbon nano fibers, Arab. J. Sci. Eng., 2010, pp [29] H. Barankova and L. Bardos, Atmospheric pressure plasma for carbon nanotube synthesis, Polym. Int., 2008, pp. A1-A1. [30] L. Zajickova, M. Elias, O. Jasek, V. Kudrle, Z. Frgala, J. Matejkova, J. Bursik and M. Kadlecikova, Atmospheric pressure microwave torch for synthesis of carbon nanotubes, Plasma Phys. Control. Fusion, 2005, pp. B655-B666. [31] J.H. Ting, J.Y. Lyu, F.Y. Huang, T.L. Li, C.L. Hsu, C.W. Liu and Ieee Synthesis of Single Wall Carbon Nanotubes by Atmospheric Thermal CVD, in: th Biennial University/Government/Industry Micro Nano Symposium, Proceedings, Ieee, New York, 2008, pp [32] S. Wei, W.P. Kang, J.L. Davidson, B.K. Choi and J.H. Huang, Vertically aligned carbon nanotube field emission devices fabricated by furnace thermal chemical vapor deposition at atmospheric pressure, J. Vac. Sci. Technol. B, 2006, pp [33] C.J. Unrau, R. L. Axelbaum and C.S. Lo, High Yield Growth of Carbon Nanotubes on Composite Fe/Si/O Nanoparticle Catalysts: A Car Parrinello Molecular Dynamics and Experimental Study, J. Phys. Chem. C, 2010, pp [34] I. Kruusenberg, N. Alexeyeva, K. Tammeveski, J. Kozlova, L. Matisen, V. Sammelselg, J. Solla Gullón and J.M. Feliu, Effect of purification of carbon nanotubes on their electrocatalytic properties for oxygen reduction in acid solution, Carbon, 2011, pp [35] N.M. Mubarak, F. Yusof and M.F. Alkhatib, The production of carbon nanotubes using two stage chemical vapor deposition and their potential use in protein purification, Chemical Engineering Journal, 2011, pp [36] A. Hirsch, Functionalization of single walled carbon nanotubes, Angewandte Chemie International Edition, 2002, pp [37] T. Yildirim, O. Gulseren, C. Kilic and S. Ciraci, Pressure induced interlinking of carbon nanotubes, Physical Review B, 2000, pp [38] H.W.C. Postma, T. Teepen, Z. Yao, M. Grifoni and C. Dekker, Carbon nanotube single electron transistors at room temperature, Science, 2001, pp [39] K. Kordas, G. Toth, P. Moilanen, M. Kumpumaki, J. Vahakangas, A. Uusimaki, R. Vajtai and P.M. Ajayan, Chip cooling with integrated carbon nanotube microfin 77

90 architectures, Applied Physics Letters, [40] M.P. Anantram and F. Leonard, Physics of carbon nanotube electronic devices, Reports on Progress in Physics, 2006, pp [41] Z.H. Chen, D. Farmer, S. Xu, R. Gordon, P. Avouris and J. Appenzeller, Externally assembled gate all around carbon nanotube field effect transistor, Ieee Electron Device Letters, 2008, pp [42] V.L. Pushparaj, M.M. Shaijumon, A. Kumar, S. Murugesan, L. Ci, R. Vajtai, R. J. Linhardt, O. Nalamasu and P.M. Ajayan, Flexible energy storage devices based on nanocomposite paper, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2007, pp [43] Y. Xiao, X.G. Gao, O. Taratula, S. Treado, A. Urbas, R. D. Holbrook, R. E. Cavicchi, C.T. Avedisian, S. Mitra, R. Savla, P.D. Wagner, S. Srivastava and H.X. He, Anti HER2 IgY antibody functionalized single walled carbon nanotubes for detection and selective destruction of breast cancer cells, Bmc Cancer, 2009, pp. [44] D.R. Kauffman, C.M. Shade, H. Uh, S. Petoud and A. Star, Decorated carbon nanotubes with unique oxygen sensitivity, Nature Chemistry, 2009, pp [45] D.R. Kauffman and A. Star, Electronically monitoring biological interactions with carbon nanotube field effect transistors, Chemical Society Reviews, 2008, pp [46] M.C. Strus, A. Raman, C.S. Han and C.V. Nguyen, Imaging artefacts in atomic force microscopy with carbon nanotube tips, Nanotechnology, 2005, pp [47] H.P. Schultz, Topological organic chemistry - polyhedranes and prismanes, Journal of Organic Chemistry, 1965, pp &. [48] E. Osawa, Kagaku, 1970, pp. [49] D.A. Bochvar and E.G. Galpern, Hypothetical systems - carbododecahedron, s icosahedrone and carbo s-icosahedron, Doklady Akademii Nauk Sssr, 1973, pp [50] H.W. Kroto, J.R. Heath, S.C. Obrien, R. F. Curl and R. E. Smalley, C-60 - Buckminsterfullerene, Nature, 1985, pp [51] LiVEJOURNAL (2011) Expo 67 in Montreal, burning sphere. [52] G. Dennler, M.C. Scharber and C.J. Brabec, Polymer Fullerene Bulk Heterojunction Solar Cells, Advanced Materials, 2009, pp [53] R. A.J. Janssen, J.C. Hummelen and N.S. Saricifti, Polymer fullerene bulk heterojunction solar cells, Mrs Bulletin, 2005, pp [54] R. Zumwalde and L. Hodson Approaches to Safe Nanotechnology: Managing the Health and Safety Concerns Associated with Engineered Nanomaterials, National Institute for Occupational Safety and Health, [55] C.A. Poland, R. Duffin, I. Kinloch, A. Maynard, W.A.H. Wallace, A. Seaton, V. Stone, S. Brown, W. MacNee and K. Donaldson, Carbon nanotubes introduced into the abdominal cavity of mice show asbestos like pathogenicity in a pilot study, Nature Nanotechnology, 2008, pp [56] C.W. Lam, J.T. James, R. McCluskey, S. Arepalli and R. L. Hunter, A review of carbon nanotube toxicity and assessment of potential occupational and environmental health risks, Critical Reviews in Toxicology, 2006, pp

91 POZNÁMKY 79

92

93 7APLIKACE PARAMAGNETICKÝCH NANOČÁSTIC 7René Kizek

94

95 1 Úvod 1.1 Magnetizovatelné částice Magnetizovatelné částice (MPs magnetic particles) pronikají do všech vědeckých odvětví. Nalézají využití hlavně v izolaci, separaci a transportu od nukleových kyselin, proteinů až po celé buňky. Široké uplatnění nacházejí v biomedicínských a biotechnologických oborech, které využívají produkty od laboratoří (chemických, fyzikálních, biofyzikálních, fyzikálněchemických až po laboratoře zaměřené na studium materiálů) zabývající se synthesou a různých modifikací povrchu MPs. Tímto MPs propojují jednotlivé vědecké disciplíny. První práce popisující aplikaci magnetických částic pocházejí z počátku 60.let 20.století, kdy H.A. Lowenstam použil biochemicky precipitovaný magnetit, sloužící jako radula zubů chitonů. V roce 1975 R. Blakemore objevil bakterii Magnetospirillum gryphiswaldense, která je schopna vytvářet sférické krystaly magnetitu (Fe 3 O 4 ) o velikosti 50 nm [2]. Bakterie vytváří řetízky magnetických částic, které ji slouží k tomu, aby byla vyrovnaná souběžně se zemským magnetickým pólem. Bylo zjištěno, že tyto bakterie plavou na severní polokouli vždy k severu zatímco na jižní polokouli je tomu naopak. V současnosti jsou tyto bakterie velkým středem zájmu. Od poloviny 70. let se pak MPs naplno začaly rozšiřovat hlavně v biologických a medicínských oborech [3 6]. Možné využití paramagnetických částic shrnuje Obr. 1. MPs jsou využívány i v metodách, které jsou založené na optické detekci (fluorescence), ale elektrochemické biosenzory mají oproti těmto metodám značnou výhodu v tom, že je lze miniaturizovat [7]. Typický elektrochemický bisenzor měří elektrochemické signály (proud, napětí, celkový odpor) a je navržen většinou velmi jednoduše. Na fyzikálně chemický převodník je zapojena měřící elektroda, která je modifikována biologicky aktivní látkou [8]. Fyzikálně chemické vlastnosti MPs (velikost částic, úroveň magnetizace a topologie povrchu) jsou důležité pro definování jejich využití v biologii. Nejčastější používané MPs v biosenzorech jsou superparamegnetické nanočástice, které jsou složeny především z oxidu železitého nebo oxidu železičitého (magnetit) [9]. Je známo, že malé ionty oxidu částice (1 10) nm vyvolávají paramagnetismus, zatímco větší (mm) feromagnetismus. Tyto nanočástice mají mnoho výhod. Například, mohou být mnohem snadněji syntetizovány než jiné magnetické mate Obrázek 1: Schéma využití paramagnetických částic, jejichž povrch je modifikován různými biomolekulami. Převzato z [6]. 81

96 riály s požadovanými fyzikálně chemickými vlastnostmi. Navíc jejich velikost může být uzpůsobena velikosti biologickému materiálu, ze kterého chcema cílové biomolekuly izolovat (např. proteinů (5 50) nm, virů (20 450) nm, buněk (10 100) µm [10]. Nanočástice oxidu železitého také poskytují velmi značně specifický povrch pro navázání biomolekul. Metody syntézy magnetických částic jsou ve velké míře dostupné v literatuře [11]. Existují dva způsoby jak využít MPs pro magnetickou separaci, a které vychází z modifikace povrchu MPs. První způsob je založen na použití nabité obalové vrstvy pro elektrostatickou adsorpci biomolekul. Tato metoda se na rozdíl od konvenčních metod vyhne použití organických rozpouštědel a tím i vyloučí vliv těchto látek na následnou detekci. Matsunaga a kol. modifikovali povrch MPs kladně nabitými amino skupinami. Takto upravené NH 2 -MPs byly přidány ke vzorku. Extrakce pak byla založená na vzájemném elektrostatickém působení mezi negativně nabitou DNA a pozitivně nabitými NH 2 -MP [12]. Druhý způsob modifikace povrchu paramagnetických částic je založen na molekulách, ukotvených na částicích, které specificky váží cílové biomolekuly [13]. Například: aktivní chemické skupiny, jako je (karboxyl a aminoskupina), které mohou kovalentně vázat biomolekuly za přítomnosti zvláštní vazby mezi řetězci činidla (EDAC). Na této metodě modifikace povrchu MPs, je založena i izolace mrna, kterou se v naší práci zabýváme. K izolaci mrna jsme použili komerční superparamagnetické částice oligo(dt) 25 (DBT), které mají na svém povrchu ukotveny řetězce složených z 25 thyminů, které na sebe váží sekvence po sobě opakujících se adeninů, jenž vlastní každá molekula mrna [14]. Velikost DBT se pohybuje mezi (1 10) µm, přičemž velikost jednotlivých částic bývá uniformní. Některé další komerčně dostupné MPs jsou uvedeny v (Tabulce 1). Tabulka 1: Přehled vybraných magnetických částic, které jsou dnes dostupné na trhu. ALP alkalická fosfatáza, CNT uhlíkové nanotrubky, DBT dynabeads oligo (dt)25, MPs magnetické částice, NP nanočástice. Tabulka je upravena podle [1]. Druh MPs a (velikost) Komerční superparamagnetické částice DBT Detekovaný signál DNA-Os, bipy Purinové báze Purinové báze Purinové báze, DNA-Os, bipy Komerční streptavidinem potažené částice Rozpouštění zlatao z Au NP konec Rozpouštění stříbra ze stříbra navázaného na Au NP konec Ag-vázané na Au NP konec CdS OD konec Rozpouštění india z vázaného koncového pevného india Rozpouštění kovů z, ZnS, PbS QD konce (0,83 µm) Rozpouštění zlata z Au -vázaného na polystyrenové kuličky Nafton s CNT-ALP koncem Rozpouštění kovů z ZnS, PbS QD konce Chycené molekuly Poly(A), ODN, PCR produkt Citace [1] Poly(A), [3] ODN, DNA Polyribonukleotidy, [5] mrna, ODN, PCR produkty ODN [6] Guanin ODN [10] ODN [12] ODN [13] ODN [14] ODN [15] ODN [17] [18] ODN [21] IgG, ODN [22] Mikroglobulin, BSA, IgG [24] 82

97 1.2 Syntéza a modifikace povrchu magnetických částic Nejčastějším materiálem používaným na výrobu MPs pro biologické aplikace patří oxidy železa magnetit (Fe 3 O 4 ) nebo jeho oxidovaná forma maghemit (γ Fe 2 O 3 ) [15]. MPs z oxidu kovu se dostaly do popředí zájmu, protože nejsou toxické na rozdíl od jiných kovů (kobalt či nikl), které na druhou stranu zase mají lepší magnetické vlastnosti. Základní metody syntézy zahrnují postupy, které jsou založené na i) usazování částic v plynné fázi, ii) litografii, iii) mikroemulsi, iv) sonochemické syntézy a v) hydrolytické reakce [16, 17, 18, 19]. Základní postup chemické syntézy MPs z magnetitu je založen na hydrolytické reakci. Příprava těchto částic se skládá z následujících kroků nejdříve proběhne koprecipitace magnetitu při 80 C ve vodném roztoku Fe 2+ a Fe 3+ iontů v prostředí 25% NH 4 OH. Vzniknou tak částečky magnetitu. Ty se dál prostorově stabilizují pomocí LA (kyselina laourová, MA (kyselina myristová nebo pomocí OA (kyselina olejová). Dál se musí jednotlivé částice oddělit od zbylého roztoku, to se provádí dekantací tj. volným usazováním. Roztok nad částicemi se pak odsaje, přidá se promývací roztok a postup se opakuje. Tento postup je často využíván v mnoha laboratořích a umožňuje připravit magnetické částice pro bioaplikace. Dalším krokem, jestliže jsou magnetické částice syntetizovány a stabilizovány, je modifikace jejich povrchu, což výrazně zasahuje do jejich biokompatibility. Teprve tento krok dělá z částic pravý nástroj pro jejich využití. Například modifikace proteinem laktoferinem nebo ceruloplasmidem připevněného na povrch superparamagnetických nanočástic (Fe 2 O 3, o průměru 13,5 nm) poskytují částicím stabilizaci v pokojové teplotě a snižují nespecifickou endocytózu in vivo [15]. Pokrytím tenkou vrstvou zlata na komerční částice (Fe 2 O 3 o průměru 4,5 mm) se zlepšuje přichycení protilátek na povrch částic a účinně se tak redukuje nespecifická adsorpce [20]. Pro další modifikace povrchu se využívají hlavně polymery, organické látky a nejrůznější pokovování [15]. 1.3 Separace látek založená na magnetizovatelných částicích Pro aplikaci MPs v separačních metodách se nejčastěji využívají dva způsoby modifikace. První z nich vyžaduje použití nabitého kovového povrchu pro elektrostatickou adsorpci biomolekul. Matsunaga et. al. použil aminosilan 3-[2-2-aminoethy(amino)-ethylamino-propyetrimethoxysilan] k modifikaci MPs v roztoku toulenu vyvolávající hustý amino povlak na povrchu částic [21]. Takto vzniklé NH 2 -MPs jsou přidány k extraktu DNA a na základě elektrostatické interakce mezi negativně nabitou DNA a pozitivně nabitou skupinou NH 2 navázanou MPs. Tato metoda na rozdíl od jiných konvenčních extrakčních metod, nepoužívá k promývání a uvolnění DNA organických roztoků. Tím eliminuje vliv organických roztoků na následnou detekci signálu. Podobné metody elektrostatické adsorpce založené na DNA extrakci používají polyamidamin dendrimermodifikovaný MPs [22 24]. Další metody modifikace povrchu MPs zahrnují navázání specifické skupiny umožňující vázat konkrétní biomolekuly. Například: i) aktivní chemické skupiny (karboxyl a aminoskupiny), které se mohou kovalentně vázat na biomolekuly v přítomnosti specifických Cross-linking činidel (EDAC), ii) Streptavidin / Avidin ligandy, které se mohou specificky vázat na biotinylizované biomolekuly. Tyto metody jsou obvykle používány k imobilizaci specifických receptorů pro zachycení cílových molekul jako třeba DNA sonda k cílové DNA a protilátka k antigenu. Komerční MPs použité v magnetické separaci jsou typické paramagnetické částice s velikostí v mikrometrech (1 10) mm a jsou vybaveny polymerním obalem na vnější straně magnetického nanočásticového jádra. Tyto na zakázku dělané magnetické částice jsou modifikovány pomocí různých vazebných skupin pro specifické chemic 83

98 ké vazby. Porovnání fyzikálních a chemických znaků některých komerčně dostupných MPs bylo zhodnoceno [25]. Chemicky syntetizovaný oxid železa pro MPs může být vytvářen pomocí magnetických bakterií bakteriální magnetické nanočástice (BMPs) [26, 27]. BMPs jsou feromagnetické částice, které mají uniformní tvar a velikost od (50 100) nm. Zjevně přirozená lipidová dvojvrstva membrány fosfatidylethanolamin, na vnější straně částice jí poskytuje velmi dobrou disperzi ve vodním roztoku a umožňuje tak BMPs sloužit jako substrát pro kovalentní vazbu s biomolekulami [12]. Jiné MPs jako třeba MFe 2 O 4 (M = Co nebo Mn) Co Fe 2 O 4 superparamagnetické nanočástice byly syntetizovány a zkoumány pro bisenzorové aplikace. Nicméně procedury syntéz těchto částic jsou poměrně složité a drahé ve srovnání s nanočásticemi z oxidů železa [28, 29]. 1.4 Separace látek založená na magnetizovatelných částicích pokrytých protilátkami Samotné magnetické částice se skládají z kovového jádra, které může být například ze zlata nebo z oxidů železa (nejčastěji γ Fe 2 O 3 zvaný maghemit a Fe 3 O 4 magnetit). Na kovové jádro se poté navážou další důležité látky tak, aby vytvořily speciální biokompatibilní slupku, která bude reagovat pouze s hledanými biomolekulami (Obr. 2). Takto upravené nanočástice se přidají do roztoku, odkud chceme izolovat hledané látky. Nanočástice s navázanými biomolekulami se nakonec odstraní z roztoku pomocí magnetu a v následujícím kroku se od sebe oddělí chemickou či fyzikální cestou, aby byla možná jejich další analýza. Při tomto postupu detekce pomocí magnetických nanočástic je možné vynechat spoustu jinak nutných složitých separačních kroků, jako je odstřeďování apod., čímž se významně zkrátí doba analýzy. Obrázek 2: Model magnetické nanočástice s modifikovaným povrchem pro detekci biomolekul. Převzato z [28]. Prostřednictvím magnetických nanočástic se dají snadno odhalit různé nemoci, zejména virového původu. Princip je podobný: na povrch magnetické nanočástice se nanese polymerní slupka (dextran či polyethylenglykol) a na ni se naváže protilátka, která je schopná vyhledat virus a pevně se k němu připoutat (Obr. 3). Celý komplex se poté vyloučí z těla opět pomocí magnetu. Tím ještě výčet možných aplikací magnetických nanočástic stále nekončí. Velice výhodné je jejich použití při hypertermické léčbě nádorů. Tkáň postižená rakovinou se vystaví střídavému magnetickému poli, přičemž zdravá tkáň zůstává vůči tomuto magnetickému poli netečná. Následně dochází k uvolnění tepla a ke zničení rakovinných buněk při teplotě nad 43 C, zatímco zdravé buňky přežijí i při vyšších teplotách. Výsledný efekt samozřejmě záleží na magnetických vlastnostech nanočástic a nastavení optimální intenzitu magnetického pole. Obrázek 3: Schéma detekce virů pomocí magnetické nanočástice. Převzato z [29]. 84

99 1.5 Biosenzory pro detekci specifické sekvence nukleových kyselin za využití magnetické separace ve spojení s elektrochemickou detekcí Tato sekce bude zaměřena na magnetickou separaci jako základ pro elektrochemický DNA biosenzor. Magnetická separace umožňuje vytvořit jednoduchý DNA biosenzor, založený na elegantním způsobu zachycení cílené nukleové kyseliny (tj. DNA a RNA) z krve, kosti, kostní dřeně, buněčných kultur, rostlinných pletiv a jiných surových vzorků před tím, než se provedou kroky jako je cílená amplifikace nebo detekce. Tento způsob významně redukuje celkové nakládání s časem pro zpracování vzorku [30, 31]. Povrch MPs má na rozdíl od jednoduchého povrchu pevné elektrody velký povrch, což MPs propůjčuje vysokou separační schopnost. MPs navíc nabízí další povrch pro imobilizaci DNA a elektrochemickou detekci [32]. Tato dvou povrchová strategie zlepšuje výkon senzoru v několika rovinách. V tradičním elektrochemickém DNA biosenzoru je povrch pevných elektrod (kovové, uhlíkové nebo chemicky modifikováné elektrody) nejdříve modifikován jednořetězcovou DNA (ssdna) sondou pomocí různých imobilizačních metod jako je adsorpce, kovalentní vazba, sestavením interakcí avidin biotin nebo zachycení polymerem [33]. Hybridizace a následující elektrochemická detekce jsou provedeny na stejné elektrodě. Nicméně DNA film na povrchu elektrody může interferovat s transdukčním elektrochemickým signálem z elektrody. Ve dvoupovrchovém přístupu jsou ssdna sondy imobilizovány na povrch MPs. Hybridizace mezi volnou cílovou molekulou a na MPs navázanou DNA sondou, která se nachází v kapalné fázi má vyšší schopnost hybridizace než na pevné elektrody. Po té co je DNA navázána na povrch částic a nedetekována povrchem elektrody, nemůže hybridizovaná DNA působit na transdukci signálu. Elektrochemické přístupy pro detekci specifických sekvencích jsou popsány [34]. Hlavní metody detekce zahrnují: i) přímá detekce oxidačních signálů z purinových bází (A, G) cílové DNA, ii) měření elektrochemických signálů elektroaktivních značek (sond) nebo enzymů a iii) detekci elektrochemických změn (impedance, proudu, kapacitance) na elektrodu. Erdem et al., ukazuje magnetickou separaci, která je založena na elektrochemickém DNA biosenzoru za účelem detekce specifické DNA sekvence související se Salmonelózou pomocí měření oxidačního signálu guaninu na malém magnetu obsahující elektrodu ze skleného uhlíku (GCE) [35]. 2 Závěr Magnetické nanočástice jsou dalším typem nanostruktur, které se hojně využívají v lékařství - zejména pro detekci různých biomolekul jako jsou nukleové kyseliny či bílkoviny. Protože mají vysokou reaktivitu a výhodné fyzikální vlastnosti, předčily svou citlivostí a selektivitou dosud běžně používané metody detekce. Magnetické částice jsou tedy do budoucna velmi vhodným nástrojem pro řešení problémů specifické izolace konkrétních látek z biologických vzorků. 3 Reference [1] I.-M. Hsing, Y. Xu and W. Zhaob, Micro- and Nano- Magnetic Particles for Applications in Biosensing, Electroanalysis, 2007, pp [2] R. Blakemore, MAGNETOTACTIC BACTERIA, Science, 1975, pp [3] K. Obata, H. Tajima, M. Yohda and T. Matsunaga, Recent developments in laboratory automation using magnetic particles for genome analysis, Pharmacogenomics, 2002, pp [4] I. Safarik and M. Safarikova, Use of magnetic techniques for the isolation of cells, Journal of Chromatography B, 1999, pp [5] P. Moroz, S.K. Jones and B.N. Gray, Magnetically mediated hyperthermia: current status and future directions, International Journal of Hyperthermia, 2002, pp

100 [6] N. Pamme, Magnetism and microfluidics, Lab on a Chip, 2006, pp [7] L. Murphy, Biosensors and bioelectrochemistry, Current Opinion in Chemical Biology, 2006, pp [8] S. Sole, A. Merkoci and S. Alegret, New materials for electrochemical sensing - III. Beads, Trac Trends in Analytical Chemistry, 2001, pp [9] A.F. Ngomsik, A. Bee, M. Draye, G. Cote and V. Cabuil, Magnetic nano- and microparticles for metal removal and environmental applications: a review, Comptes Rendus Chimie, 2005, pp [10] S. Lefebure, E. Dubois, V. Cabuil, S. Neveu and R. Massart, Monodisperse magnetic nanoparticles: Preparation and dispersion in water and oils, Journal of Materials Research, 1998, pp [11] D.K. Kim, Y. Zhang, W. Voit, K.V. Rao and M. Muhammed, Synthesis and characterization of surfactant coated superparamagnetic monodispersed iron oxide nanoparticles, Journal of Magnetism and Magnetic Materials, 2001, pp [12] T. Matsunaga, M. Kawasaki, X. Yu, N. Tsujimura and N. Nakamura, Chemiluminescence enzyme immunoassay using bacterial magnetic particles, Analytical Chemistry, 1996, pp [13] M. Fojta, L. Havran, S. Billova, P. Kostecka, M. Masarik and R. Kizek, Two surface strategy in electrochemical DNA hybridization assays: Detection of osmium labeled target DNA at carbon electrodes, Electroanalysis, 2003, pp [14] E. Palecek, M. Fojta and F. Jelen, New approaches in the development of DNA sensors: hybridization and electrochemical detection of DNA and RNA at two different surfaces, Bioelectrochemistry, 2002, pp [15] A.K. Gupta and M. Gupta, Synthesis and surface engineering of iron oxide nanoparticles for biomedical applications, Biomaterials, 2005, pp [16] S. Stolnik, L. Illum and S.S. Davis, LONG CIRCULATING MICROPARTICULATE DRUG CARRIERS, Advanced Drug Delivery Reviews, 1995, pp [17] C.S. Lee, H. Lee and R. M. Westervelt, Microelectromagnets for the control of magnetic nanoparticles, Applied Physics Letters, 2001, pp [18] S.A. Rishton, Y. Lu, R. A. Altman, A.C. Marley, X.P. Bian, C. Jahnes, R. Viswanathan, G. Xiao, W.J. Gallagher and S.S.P. Parkin Magnetic tunnel junctions fabricated at tenth micron dimensions by electron beam lithography, Micro and Nano Engineering Conference 1996 (MNE 96), Elsevier Science Bv, Glasgow, Scotland, 1996, pp [19] Y.S. Kang, S. Risbud, J.F. Rabolt and P. Stroeve, Synthesis and characterization of nanometer size Fe3O4 and gamma Fe2O3 particles, Chemistry of Materials, 1996, pp &. [20] H.R. Zhang and M.E. Meyerhoff, Gold coated magnetic particles for solid phase immunoassays: Enhancing immobilized antibody binding efficiency and analytical performance, Analytical Chemistry, 2006, pp [21] T. Nakagawa, R. Hashimoto, K. Maruyama, T. Tanaka, H. Takeyama and T. Matsunaga, Capture and release of DNA using aminosilane modified bacterial magnetic particles for automated detection system of single nucleotide polymorphisms, Biotechnology and Bioengineering, 2006, pp [22] B. Yoza, A. Arakaki, K. Maruyama, H. Takeyama and T. Matsunaga, Fully automated DNA extraction from blood using magnetic particles modified with a hyperbranched polyamidoamine dendrimer, Journal of Bioscience and Bioengineering, 2003, pp [23] B. Yoza, A. Arakaki and T. Matsunaga, DNA extraction using bacterial magnetic particles modified with hyperbranched polyamidoamine dendrimer, Journal of Biotechnology, 2003, pp [24] B. Yoza, M. Matsumoto and T. Matsunaga, DNA extraction using modified bacterial magnetic particles in the presence of amino silane compound, Journal of Biotechnology, 2002, pp [25] S. Sole, A. Merkoci and S. Alegret, New materials for electrochemical sensing - III. Beads, Trac Trends Anal. Chem., 2001, pp [26] T. Matsunaga and H. Takeyama, Biomagnetic nanoparticle formation and application, Supramolecular Science, 1998, pp [27] N. Nakamura and T. Matsunaga HIGHLY SENSITIVE DETECTION OF ALLERGEN 86

101 USING BACTERIAL MAGNETIC PARTICLES, 2nd Symp on Biosensors, Elsevier Science Bv, Geneva, Switzerland, 1993, pp [28] S.G. Grancharov, H. Zeng, S.H. Sun, S.X. Wang, S. O Brien, C.B. Murray, J.R. Kirtley and G.A. Held, Bio functionalization of monodisperse magnetic nanoparticles and their use as biomolecular labels in a magnetic tunnel junction based sensor, Journal of Physical Chemistry B, 2005, pp [29] H.W. Gu, K.M. Xu, C.J. Xu and B. Xu, Biofunctional magnetic nanoparticles for protein separation and pathogen detection, Chemical Communications, 2006, pp [30] A. Deggerdal and F. Larsen, Rapid isolation of PCR ready DNA from blood, bone marrow and cultured cells, based on paramagnetic beads, Biotechniques, 1997, pp [31] M.L. Smit, B.A.J. Giesendorf, S.G. Heil, J.A.M. Vet, F.J.M. Trijbels and H.J. Blom, Automated extraction and amplification of DNA from whole blood using a robotic workstation and an integrated thermocycler, Biotechnology and Applied Biochemistry, 2000, pp [32] M. Fojta, L. Havran, S. Billova, P. Kostecka, M. Masarik and R. Kizek Two surface strategy in electrochemical DNA hybridization assays: Detection of osmium labeled target DNA at carbon electrodes, 9th International Conference on ElectroAnalysis (ESEAC), Wiley V C H Verlag Gmbh, Krakow, Poland, 2002, pp [33] H. Cai, Y. Xu, P.G. He and Y.Z. Fang, Advances of the deoxyribonucleic acid immobilization on electrode surface for the electrochemical deoxyribonucleic acid biosensor designing, Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2004, pp [34] T.G. Drummond, M.G. Hill and J.K. Barton, Electrochemical DNA sensors, Nature Biotechnology, 2003, pp [35] A. Erdem, M.I. Pividori, A. Lermo, A. Bonanni, M. del Valle and S. Alegret, Genomagnetic assay based on label free electrochemical detection using magneto composite electrodes, Sens. Actuator B Chem., 2006, pp

102 88 POZNÁMKY

103 8APLIKACE FLUORESCENČNÍCH A MAGNETICKÝCH NANOČÁSTIC V IN VIVO ZOBRAZOVÁNÍ 8Markéta Vaculovičová

104

105 1 Úvod In vivo zobrazovací metody hrají nezastupitelnou roli v lékařské diagnostice. Do této skupiny lze zařadit metody pracující na různých principech a poskytují rozdílné informace o zkoumaném objektu (pacientovi). 1.1 In vivo zobrazovací metody Základní druhy zobrazovacích (in vivo) technik jsou: radiodiagnostika, magnetická rezonance, počítačová tomografie, jednofotonová počítačová tomografie, pozitronová emisní tomografie, ultrazvukové zobrazování a optické zobrazování (Obr. 1). Obrázek 1: Druhy zobrazovacích metod. Převzato z [1]. 1.2 Diagnostická radiologie (Radiodiagnostika) Radiodiagnostika je jednou z nejzákladnější, nejstarších a nejběžněji používaných metod in vivo zobrazování. Rentgenové paprsky byly objeveny W. C. Röntgenem v roce 1895 a okamžitě byl rozpoznán jejich význam pro medicínu. Pronikají většinou biologických tkání s minimálním utlumením a jednoduše poskytují stín nebo projekci pro vytvoření obrazu. Při použití filmové rentgenografie dopadá záření, které prošlo tělem pacienta, na kazetu, která obsahuje obrazovku z fluorescenčního fosforu, a tím vyvolá rentgenový film. Plochy tohoto filmu, které byly vystaveny většímu množství záření, se na filmu zobrazí tmavě (černě nebo šedě), zatímco plochy vystavené menšímu množství záření se zobrazí světle až bíle. Při počítačové rentgenologii (CR) projde rentgenové záření pacientem a dopadne na destičku se zvýšenou citlivostí, která je potom přečtena a zdigitalizována přímo do počítačového obrazu samostatným přístrojem. Při digitální rentgenologii dopadá záření na destičku se senzory pro rentgenové paprsky, čímž se přímo vytvoří digitální počítačový obraz. 1.3 Magnetická rezonance Magnetická rezonance (MR/MRI) využívá silné magnetické pole, které orientuje jádra vodíku v molekulách vody podle směru magnetického momentu. Pokud je vytvořeno další kolmé pole, vodíkové jádro rotuje s rezonanční frekvencí MRI poskytuje větší přesnost při zobrazení většiny orgánů, jež je důsledkem rozdílné intenzity signálu u odlišných měkkých tkání. Zobrazení probíhá bez možného škodlivého ionizujícího záření a poskytuje velmi dobré prostorové rozlišení. Na druhou stranu je pro dosažení potřebné citlivosti podávat vysoké dávky kontrastních látek (např. gadolinium), které se mohou v těle akumulovat. Výhoda magnetické rezonance spočívá ve schopnosti vytvořit snímky v osové, věncovité a předozadní rovině stejně snadno, jako i v jiných nepřímých rovinách. Snímky získané pomocí MR poskytují nejlepší rozlišení měkkých tkání ze všech zobrazovacích způsobů. MRI se stala nezbytným prostředkem v muskuloskeletální radiologii a neuroradiologii díky pokroku v zobrazovací rychlosti a prostorovém rozlišení, a díky vylepšení 3D počítačových algoritmů a hardwaru. 1.4 Počítačová tomografie Konvenční radioterapie neposkytuje hloubkovou informaci, vzhledem k tomu že 3D objekt 90

106 je promítán do 2D plochy. Dalším omezením je nízký kontrast měkkých tkání, což je důležité především pro zobrazován mozku, kde je měkká tkáň obklopena vysoce tlumící lebkou. CT poskytuje tenké 2D obrazy o tloušťce asi 1 mm a lze dosáhnout sub milimetrového prostorového rozlišení s dobrým rozpoznáním tkání. CT využívá rentgenové paprsky společně s počítačovými algoritmy k zobrazování těla. Při CT se trubice, která vytváří rentgenový paprsek směrem k protilehlému detektoru těchto paprsků, otáčí kolem pacienta a vytváří počítačově generovaný průřezový obraz (tomogram). CT se získává v osové rovině, zatímco koronální (věncovité) a sagitální (předozadní) zobrazení se dají získat pomocí počítačové rekonstrukce. Při CT se často používají kontrastní látky za účelem lepšího vykreslení snímku. Nitrožilní kontrastní látky umožňují rekonstrukci 3D obrazu tepen a žil. Ačkoli rentgenový snímek poskytne lepší prostorové rozlišení, CT umí detekovat nepatrné odchylky ve ztlumení rentgenových paprsků. CT vystavuje pacienta více ionizujícímu záření než rentgen. 1.5 Jednofotonová počítačová tomografie (SPCT) Je to zobrazovací metoda z oboru nukleární medicíny, která dokáže zobrazit prostorové rozložení nějaké radioaktivně značené látky v těle, tato látka je před zobrazením do organismu podána nejčastěji nitrožilně. Radioaktivní atom je v čase nestabilní, má tendenci se přeměnit na atom nesoucí nižší energii a přebytečná energie se, v případě látek používaných při scintigrafii, přitom vyzáří ve formě takzvaného gama záření. trojrozměrný obraz cesty radiofarmaka tělem. Pacientovi je před vyšetřením podáno radiofarmakum s velmi krátkým poločasem rozpadu. U PET se využívá radiofarmak, která při svém rozpadu produkují pozitrony tzv. beta rozpad. Pozitron po svém vzniku záhy (řádově v průběhu milimetrů, které urazí za několik nanosekund) anihiluje s nějakým elektronem, který se nacházel v jeho blízkosti. Pozitron i elektron zaniká a z místa anihilace odlétají v přímém úhlu dva fotony anihilačního záření s energií 510 kev. Současnou interakci těchto fotonů v detektorech snímacího prstence lze zaznamenat tzv. koincidenčním detektorem. Z velkého množství (až několik set tisíc) takových záchytů pak lze výpočetním algoritmem rekonstruovat tomografický obraz vyšetřovaného. Vyšetření PET se používají hlavně v neurologii, onkologii a kardiologii. 1.7 Ultrazvukové zobrazování Při diagnostickém ultrazvukovém zobrazování je tělo vystaveno akustickým pulsům o vysoké frekvenci a tyto pulsy, které se odrážejí na rozhraních tkání s různou specifickou impedancí. Měřením časového zpoždění a intensity odražených signálů je vytvořen obraz jednotlivých tkáňových rozhraní. Slouží zejména k zobrazování jemných tkáňových struktur v těle ve skutečném čase. Omezení ultrazvuku spočívá v jeho neschopnosti projít skrz vzduch (plíce, smyčky na střevech) nebo kosti. Riziko pro pacienta je v případě ultrazvukového zobrazování považováno za zanedbatelné vzhledem k tomu, že se nepoužívá žádné ionizující záření. Jednoduchá technologie způsobuje, že je tato metoda v porovnání s ostatními zobrazovacími technikami relativně málo nákladná. 1.6 Pozitronová emisní tomografie (PET) Spočívá v detekci fotonů, které vznikají v těle anihilací pozitronů, uvolněných radiofarmaky. Počítačem zpracované údaje detektorů pak dají 1.8 Optické zobrazování Optické zobrazování zahrnuje klasické mikroskopické zobrazovací techniky, ale také prostorová fluorescenční spektroskopie. 91

107 2 Nanotechnologie v in vivo zobrazování Nanostruktury mohou být definovány jako systémy o velikosti 100 nm. Je nutné ještě dodat, že rozměrů 100 nm nabývá alespoň jedna dimenze struktury ve 3dimenzionálním systému. Z tohoto pohledu je možné rozeznávat 2dimenzionální systémy (obvykle vrstvy), 1dimenzionální systémy (v podobě nanodrátů) nebo 0dimenzionální systémy (nanoklustery nebo nanotečky) [3]. Při tvorbě nanočástic využitelných v in vivo zobrazování je třeba zvážit několik základních kritérií, jako jsou: rozumná doba života (dost dlouhá pro pořízení snímku, dost krátká aby bylo zajištěno vyloučení z těla), minimální nespecifické interakce, vazba na požadované epitopy (např. buněčné povrchové receptory), efektivní vyloučení z těla a minimální toxicita. Základní druhy nanočástic, které lze pro zobrazování použít spolu s jejich rozměry jsou zobrazeny na Obr. 2. Obrázek 2: Druhy nanočástic. Převzato z [2]. 2.1 Kvantové tečky Při rozměrech krystalů menších než 10 nm se již začínají uplatňovat kvantové jevy a je tedy nutné na takové krystaly pohlížet jako na kvantové systémy. Kvantové tečky (QD z ang. quantum dots) patří právě do těchto mesoskopických systémů [4]. Jedná se o polovodičové krystaly kulovitého tvaru složené z prvků II VI (např. CdSe) nebo III V (InP) skupiny periodického systému. Vyznačují se fyzikálními a optickými vlastnostmi, které jsou na rozhraní mezi molekulou a ato mem. Jednou z nejvýznamnějších vlastností QDs je schopnost emitovat záření o různé vlnové délce, která je závislá na jejich velikosti (Obr. 3A). Obecně se rozměry QDs pohybují v řádech jednotek nanometrů, ale závislost mezi velikostí a emitovanou vlnovou délkou je hlavním benefitem kvantových teček. Čím je tečka menší, tím více se její barva blíží modré oblasti spektra a naopak čím je její poloměr větší, tím je emitované záření blíže červené oblasti. Společný mají všechny druhy kvantových teček fakt, že díky malým rozměrům se celý krystal chová jako jedna molekula, jejíž atomy jsou současně excitovány a současně také emitují záření, čímž je dosaženo vysoké intenzity takového záření. Další výhodou je prakticky nulové vyhasínání fluorescence vlivem okolního světla, což je způsobeno jejich anorganickým složením a dlouhým časem vyhasínání fluorescence (10 40) ns ve srovnání s organickými fluoreskujícími sloučeninami (jednotky ns). Do výčtu výhod je nutno také zahrnout vysoký molární extinkční koeficient (množství světla absorbované látkou při dané vlnové délce), vysoký Stokesův posun (rozdíl mezi absorpčním a emisním maximem), dlouhý čas vyhasínání fluorescence a již zmíněná lepší fotostabilita oproti organickým fluoroforům (asi 1000krát). Zajímavý poznatek byl publikován v práci Xing et al [5], ze které vyplývá, že intenzita fluorescence je závislá na poloměru, a tedy že zelené QDs (525 nm) mají až 17krát nižší intenzitu fluorescence než červené QDs (655 nm) a až 32krát nižší než infračervené QDs (705 nm). Tento fakt hraje velmi důležitou roli při praktickém použití QDs s různou emisní vlnovou délkou protože získaná data je třeba normalizovat. Díky těmto optickým vlastnostem jsou QDs stále více používány právě pro optické zobrazovací techniky. Základní otázkou ale pro praktické použití QD v biologii je jejich toxicita. Aby bylo možné kvantové tečky využít, je nutné porozumět několika fundamentálním fyzikálně chemickým vlastnostem. Přestože se v přírodě běžně vyskytují 92

108 biogenické a antropogenní částice o velikostech nanometrů, liší se od námi vyrobených díky svým unikátním fyzikálně chemickým vlastnostem a složení (krystalové polovodičové jádro/ stavba) a kvantovému omezení díky rozměrům. Diskuse o toxicitě QDs jsou širokým tématem a jsou matoucí, nejen kvůli více druhům částic, které se syntetizují, ale hrají zde roli i některé další faktory jako dávkování, doba vystavení, koncentrace a další. Je nutné zdůraznit, že syntetizované QDs nemají samy o sobě žádnou významnou biologickou funkci a bez jejich dalšího spojení s biologicky aktivními látkami je nelze dále využít v biomedicíně. Konjugace QDs s dalšími biomolekulami je základem pro jejich využití v živých organismech (Obr. 3B, C). A) B) razným způsobem zvyšují kontrast zobrazení (Obr. 4). Rychlý pokrok v syntéze magnetických nanočástic umožňuje přesnou kontrolu důležitých parametrů, jako jsou velikost částic, obsah magnetických dopantů nebo úpravu povrchu pomocí biologicky aktivních ligandů, které zvyšují koloidní stabilitu, biokompatibilitu, schopnost cílené interakce enbo dokonce terapeutické vlastnosti. Pod vlivem magnetického pole se v superparamegnetických částicích indukuje magnetický dipól. Molekuly vody v tkáni pak difundují do vnější sféry těchto dipólových momentů a magnetické relaxační procesy protonů vody jsou narušeny a relaxační časy jsou zkráceny. Tyto změny způsobí ztmavnutí příslušné oblasti v MRI obrazech Jedním z důležitých parametrů pro zvyšování kontrastu MRI zobrazení je velikost použitých magnetických částic. V ideálním případě jsou všechny magnetické spiny v magnetickém materiálu orientovány paralelně s externím magnetickým polem. Ale v nano rozměrech se spiny na povrchu magnetické částice vychylují podél povrchu částice, čímž signifikantně ovlivňují celkový magnetický moment, který má vliv na zvýšení rozlišení MRI. Tento jev závisí na velikosti částice, protože s klesající velikostí tento povrchový efekt více zlepšení rozlišení protože klesá celkový magnetický moment. C) Obrázek 3: A) schematické zobrazení různých QDs použitých pro fluorescenční zobrazení myši, B) Pět druhů QDs injektovaných do myších lymfatických uzlin současně vizualizované skrz kůži pomocí in vivo zobrazení, C) ex vivo fluorescenční obraz uzlin po chirurgickém vyjmutí. Převzato z [3]. 2.2 Magnetické nanočástice Magnetické nanočástice nacházejí uplatnění v MRI zobrazování především proto, že vý 2.3 Multimodální zobrazování Multimodální zobrazování kombinuje výhody jednotlivých metod a umožňuje jejich současné využití. Například kombinace PET MRI spojuje vysokou citlivost PET s vysokým rozlišením MRI a tím naopak obcházejí nízké rozlišení PET a nízkou citlivost MRI. Každá ze zobrazovacích technik má specifické požadavky na zobrazovací sondy. Paramagnetické částice jsou používány v MRI, radionuklidy v PET, atomy s vysokým protonovým číslem v CT a fluoreskující částice v optickém zobrazování. Kombinované vlastnosti jednotlivých sond 93

109 A) B) Obrázek 4: A) Nanočástice oxidů železa pokryté lidským sérovým albuminem, 64Cu DOTA a Cy5.5 umožňující MRI, PET a NIRF zobrazování, B) in vivo zobrazení myši pomocí i) NIFR, ii) PET, iii) MR 18 hodin po podání nanočástic. Převzato z [4]. umožňují jejich použití jako laditelné nanočásticové platformy pro zobrazovací techniky. 3 Závěr Jako každá nová technologie i nanotechnologie zažívá fáze nadšení, kritizování a pečlivého hodnocení. Je jasné, že ani nanotechnologie nepřinese odpovědi na všechny biomedicínské otázky, ale může hrát důležitou roli v diagnostice a léčbě určitých nemocí. Je také zřejmé, že uplatnění některých nanomateriálů v medicíně je a bude omezeno fyziologií živých organismů (velikostí pórů tkání, vylučováním ledvinami a játry, aj.), potenciální toxicitou a interferencemi s dalšími diagnostickými a léčebnými postupy. Na druhou stranu, už nyní je zřejmý obrovský potenciál nanomateriálů a nanotechnologií v dlouhé řadě vědních oborů jako je elektronika, materiálová věda, stejně tak biologie, biochemie nebo analytická chemie. Z toho důvodu je zařazení nanotechnologií do běžného života v oblasti medicínské diagnostiky a léčby otázkou velmi blízké budoucnosti. 4 Reference [1] Janib, S. M., Moses, A. S., MacKay, J. A., Advanced Drug Delivery Reviews 2010, 62, [2] Choi, H. S., Frangioni, J. V., Mol. Imaging 2010, 9, [3] Coto Garcia, A. M., Sotelo Gonzalez, E., Fernandez Arguelles, M., Pereiro, R., et al., Analytical and Bioanalytical Chemistry 2011, 399, [4] Swierczewska, M., Lee, S., Chen, X. Y., Mol. Imaging 2011, 10,

110 95 POZNÁMKY

111 9CÍLENÝ TRANSPORT LÉČIV POMOCÍ POKROČILÝCH NANOTECHNOLOGIÍ 9Vojtěch Adam

112

113 1 Úvod Nanotechnologie není jenom současný a rychle rozvíjející trend vědeckého odvětví, ale lze se s ní setkat i v živých organismech například v podobě funkčních proteinů a dalších sloučenin na buněčné úrovni nepostradatelných pro život. Některé biologické systémy se vyznačují specifickými funkcemi, které jsou zabezpečovány molekulami v měřítku nanometrů. Názorným systémem je lokomoce zabezpečující pomocí tzv. molekulových motorů, které jsou složeny proteinů s enzymatickou aktivitou a které jsou schopny přeměnit energii v podobě ATP na energii kinetickou, aktivní pohyb organismů [1]. Dostatečný vhled do biologických systémů může tedy přinést nové možnosti využití nanotechnologií a nanomateriálů. Nanotechnologie je definována jako technologie v měřítku několika nanometrů alespoň v jednom rozměru, která se zabývá vývojem, charakterizací, syntézou a aplikací materiálů, struktur, zařízení a systému u kterých je během jejich výroby kontrolován tvar a velikost [2]. Díky možnosti pracovat na úrovni atomu, molekuly a supramolekuly, získávají nanomateriály zcela nové vlastnosti [3]. V měřítku (1 100) nm se vlastnosti nanomateriálů mění díky změně plochy a dominance kvantových jevů, které jsou asociovány s velmi malými velikostmi a velkým povrchem. Tyto kvantové jevy závisí na nanostupnici, která určuje magnetické, termální, optické nebo elektrické vlastnosti nanomateriálu [4]. V posledních letech došlo k prudkému rozvoji nanomateriálů a velký přínos byl zaznamenán hlavně v medicíně a farmaceutickém průmyslu. Revolučním objevem je zcela určitě jejich využití při odhalování nemocí nebo jako náhrada tělních tkání. Za zmínku rozhodně stojí i tzv. cílený transport léčiv neboli dopravování léčiva ve správný čas na správné místo v organismu (Obr. 1). Pro tyto účely byla vyvinuta řada různých postupů [5 9]. Navržené postupy v medicíně umožňuje snížit dávky podávaných léků a tím výrazně zmírnit i jejich škodlivé vedlejší účinky [7]. Magnetické nanočástice a mikročástice jsou středem velkého zájmu pro své potenciální použití v různých biologických disciplínách, biotechnologiích, environmentálních technologiích, medicíně i v analytických aplikacích. Tyto částice mají většinou charakter kompozitních materiálů, které jsou složeny z vlastní fero- nebo feromagnetické složky (zodpovědné za interakci s vnějším magnetickým polem) a složky většinou diamagnetické (nemagnetické), která zajišťuje požadovanou interakci s biologickými systémy. Obecnou výhodou magnetických kompozitních materiálů je možnost cílené manipulace působením vnějšího magnetického pole. Spojením magnetických nosičů (jak v podobě magnetických nanočástic s rozměrem pod 100 nm, tak i magnetických mikročástic) s biologicky aktivní látkou lze dosáhnout unikátních vlastností vzniklých materiálů využitelných v biochemii, molekulární a buněčné biologii, (nano)biotechnologii, (nano)medicíně a jinde. Tyto materiály je možné separovat i ze složitých biologických systémů (např. buněčných suspenzí, homogenátů, fermentačních médií apod.). Nejčastějšími materiály pro přípravu magnetických nosičů biologicky aktivních látek jsou biokompatibilní magnetické oxidy železa magnetit a maghemit (případně jejich směsi) a rovněž různé typy feritů, a to ve formě prášků nebo magnetických kapalin. V současné době se věnuje velká pozornost jednodoménovým a superparamagnetickým nanočásticím. Jednodoménové částice obsahují pouze jednu magnetickou doménu, ve které jsou magnetické momenty uspořádány paralelně a výsledný vektor magnetizace je mnohem vyšší než u multidoménových mikročástic. Unikátní magnetické vlastnosti nanočástic spolu s jejich ohromným povrchem umožňující navázat velké množství ligandů jsou podstatou jejich využití jako efektivních nosičů pro účinnou a rychlou imobilizaci a separaci biologicky aktivních látek. 97

114 Cílená léčba možnosti Diagnostické zobrazovací metody Cílená terapie Diagnostika rakoviny Nanoroboti, nanočástice, cílená doprava léčiva Zabíjení nádorových buněk Specifická interakce s nádorovými buňkami Úspěšná léčba Obrázek 1: Možnosti cílené léčby. Převzato z [5]. 2 Praktické využití Díky svým rozměrům se nanočástice dostávají blízko ke svým cílovým biologickým entitám. Nanotechnologie je definována jako oblast, která aplikuje principy platící na úrovni nanočástic a techniky pro porozumění vlastnostem vedoucí k novým materiálům a nástrojům. Podle definice NIH (National Institute of Health, USA) je nanomedicína definována jako aplikace nanotechnologie pro diagnózu, léčení, monitorování a kontrolu biologických systémů. Výzkum se soustřeďuje především na racionální transport diagnostických a terapeutických látek dovolující odstranit vedlejší účinky a přesně zacílit na požadované místo v organismu (Obr. 1) [10]. Nanotechnologie otevírají nové úhly pohledu. Vlastnosti látek jsou totiž také funkcí velikosti částic, z nichž se skládají, protože právě velikost částic, pokud se dostaneme do oblasti nanosvěta, určuje výsledné vlastnosti. Velikost částic určuje např. bod tání a spektrální vlastnosti dané látky. Vědci z oblasti katalýzy o těchto skutečnostech vědí už několik desítek let, v poslední době se ale objevují zcela nové souvislosti. V oblasti medicíny také platí, že např. při farmakologické intervenci účinnost aktivní farmaceutické komponenty závisí na velikosti částic. Naše znalosti příčin velké řady chorob se v posledních letech dostaly z úrovně znalostí orgánového postižení na úroveň celulární, subcelulární, organelovou a molekulární. V prudkém kontrastu k současným diagnostickým možnostem je naše neschopnost účinného terapeutického zásahu s minimem nežádoucích efektů u řady chorob, postihujících velké skupiny obyvatel. Odhalení cest, které umožní dopravit léčivo ve správný čas nejen do postiženého buněčného systému, ale které umožní individuálně reagovat vlastním sebeskladným procesem na signály vychýleného buněčného, resp. organelového metabolismu, 98

115 přešlo využitím dostupných nanotechnologií z oblasti fikce do možností skutečného terapeutického zásahu. V terapii se nanočástice mohou použít buď přímo jako aktivní činidla, nebo jako nosiče léků (Obr. 2). Jejich použití pro transport léčiv má ve srovnání s klasickým způsobem řadu výhod: ochranu léčiv a dalších biologicky aktivních látek před degradací v organismu, zvýšení stability transportovaných látek a větší kontrolu distribuce látek v organismu. Vlastnosti nanočástic nejsou závislé jen na jejich tvaru a velikosti, ale také na jejich povrchové modifikaci [11]. Například nanočástice s dextranovou vrstvou mohou být použity pro selektivní dopravu léčiva do specifických tkání, např. lymfatických uzlin nebo mozkového tumoru. Povrch modifikovaný dextranem navíc nanočástici chrání před fagocytosou a prodlužuje dobu pobytu nanočástice v krvi. Nyní se ukazuje, že důležité je provádět selektivní transport nejen do vybraných tkání, ale i do vybraných organel [10]. Nanočástice mohou být použity např. jako fotosenzitizéry při fotodynamické terapii. Po absorpci světla molekula produkuje singletový kyslík, který ničí cílovou buňku [10]. Nedávné práce ukázaly, že imobilizace fotosenzitizérů na nanočásticích, např. silikagelu, vede k výraznému zlepšení terapeutických vlastností oproti volnému senzitizéru. Díky snížení velikosti částic a výhodnému poměru velikost částice/velikost povrchu dovoluje nanotechnologie zvýšit rozpustnost lipofilních látek za fyziologických podmínek. Tím ale využitelnost v oblasti nanosvěta nekončí. Cílený transport léčiva do cílové tkáně je jednou z potenciálně nejzajímavějších aplikací nanotechnologie, a to především díky tomu, že řada léků působí velmi nespecificky. Podléhají obecnému distribučnímu pravidlu v organismu a díky ataku zdravých tkání, především u chemoterapií to způsobuje značné vedlejší efekty. Podobně také protizánětlivá léčiva vyžadují (např. v případě chronické artritidy) cílenou lokalizaci, aby bylo zabráněno vedlejším účinkům, a naopak vyvolá žádoucí terapeutický efekt. Cílený transport léčiv v pohledu nanomedicíny je založen na obecném postupu, kdy nanočástice v sobě inkapsuluje léčivo. Přitom nanočástice sama, nebo rozpoznávací elementy na jejím povrchu, umějí na základě specifických receptorů na povrchu buňky najít to pravé místo pro účinek. Vlastní realizace zahrnuje přípravu nanočástic, zachycení léčiva a připojení specifického receptoru, např. protilátky (Obr. 2). I když je základní myšlenkový postup pro cílený transport léčiv (TDD Targeted Drug Delivery) jednoduchý, transportní systém musí splňovat řadu podmínek. Předně musí mít nanočástice vysokou kapacitu pro zvolené léčivo. Dále musí zůstat stabilní za fyziologických podmínek, obvykle v kardiovaskulárním systému. Těmto požadavkům dobře vyhovují např. liposomy. Řada různých typů liposomů pro cílený transport léčiv byla již schválena regulačními autoritami. Liposomů se např. využívá k cílenému transportu tetracyklinového antineoplastika doxorubicinu. Doxorubicin je vnesen do stabilního liposomu, čímž dojde k tvorbě nanoagregátu s vysokým obsahem léčiva. Dalším důležitým faktorem je kontrolované uvolnění léčiva v cílové tkáni. To obvykle závisí na typu léčiva a způsobu inkapsulace. Cílem je kontrolované uvolňování léčiva v terapeutickém rozmezí. Uvolňování léčiva lze nastartovat např. působením intracelulárních látek, či kolapsem liposomů v důsledku snížené hodnoty ph v cílové tkáni [12]. V současné době je kontrolovaná rychlost uvolňování léčiv centrálním bodem aplikace nanotechnologií pro chemoterapii, protože v řadě případů uvolňování účinné látky probíhá nedostatečným způsobem. Jeden z atraktivních způsobů řešení spočívá v destabilizaci liposomu indukované enzymem. V současné době se také používají polymerní micely, které ale mají oproti liposomům obvykle nízký enkapsulační objem pro léčivo. Další postupy využívají ph senzitivní transportní nanočástice. Dendrimery, větvené 99

116 supramolekulární, či polymerní systémy, se dají také použít jako nosiče protinádorových léčiv. Např. dendrimer obsahující aminové skupiny byl použit pro dopravu 5-fluorouracilu. Dendrimery lze také použít přímo v terapii. V současnosti je nejaktivnější oblastí ve výzkumu terapeutik využívajících nanočástic genová transfekce prováděná dendrimery jako nevirovými vektory [13]. Komerčně dostupné polyaminové a polypropylované dendrimery jsou vzhledem ke svému kladnému náboji používány za fyziologických podmínek při genové terapii. Dendrimery s aniontovými skupinami, např. sulfátovými nebo se zbytky sialové kyseliny (kyseliny N -acetylneuraminové), se dají použít jako antivirové prostředky [14] a jsou schopny snížit počet infekčních částic v krvi. Jejich účinek spočívá v napodobování anionického buněčného povrchu. Polylysinový dendrimer se sulfitovými a naftylovými skupinami se používá jako inhibitor viru Herpex simplex. Obdobný dendrimer má antivirální účinky vůči HIV. Tento dendrimer působí také ve fázi replikace, neboť interferuje s HIV integrasou a reverzní transkriptasou. Narozdíl od antivirových dendrimerů obsahují antibakteriální dendrimery kationické skupiny, jako jsou aminy a tetraalkylaminové soli. Jejich účinek je založen na lýze anionické bakteriální membrány. Tyto dendrimery působí jak na Gram -negativní, tak na Gram -pozitivní bakterie. Polylysinové dendrimery s mannosylovými skupinami mohou inhibovat adhesi E. coli na krevní buňky a shlukovaní červených krvinek. Dendrimery se dají také použít při léčbě rakoviny, a to např. jako fotosenzitizéry ve fotodynamické terapii. Po absorpci světla molekula produkuje singletový kyslík, který ničí nádorovou buňku. Nanomedicína Nanonosiče pro léčiva Liposomy Obrácená micela Micela Polyethylen glykol Poly(lakto-glycolová kyselina) Liposomy modifikované PEGem Polymerní micely Protilátky a jejich konjugáty Viry jako vektory pro genovou terapii H 3 C CH 3 H 3 C H 3 C N + H 3 C CH 3 H 3 C CH N + H 3 3 C N + CH 3 N + H 3 C CH 3 H 3 C CH 3 H 3 C N + CH 3 CH 3 nanočástice Polymer-protein konjugáty CH H 3 3 C CH 3 Dendrimery Obrázek 2: Nanonosiče pro léčiva. Převzato z [10]. 100

117 Při transportu léčiv magnetickými nanočásticemi např. do nádoru se výhodně používá magnetických vlastností těchto nanočástic [15]. V místě nádoru je umístěn magnet a nanočástice s léčivem (Doxorubicin, Mitomycin C, Methotrexat, Camptothecin atd.) jsou tam dopraveny injekčně. Dalším způsobem transportu léčiv v organismu je jejich inkapsulace. Tento proces zahrnuje použití liposomů a polymerů, které jsou použity jako nanočástice (1 100) nm. Kolem léčiva vznikne kapsle. Z ní je léčivo uvolněno její biodegradací v organismu. Tato metoda se zkouší pro léčbu neurologických a očních poškození. Firma Adventus Life Sciences zkouší použít doxorubicin inkapsulovaný polybutylkyanoa krylátem pro léčbu mozkových nádorů. Povrch této nanočástice obsahuje polysorbát 80, čímž dojde k záměně nanočástice za lipoproteiny, a tím je umožněn průchod přes mozkovou bariéru. Další zajímavou a významnou skupinou nanomolekul používaných pro léčbu řady různých chorob jsou fulereny. Rozpustné deriváty fulerenů jsou slibnými farmaceutický mi činidly. Tyto deriváty mají dobrou biokompatibilitu a jejich toxicita je nízká i ve vysokých koncentracích. Fulereny jsou duté koule s průměrem 1 nm sestavené nejčastěji ze 60 uhlíkových atomů (C 60 ). Jejich konstrukce umožňuje přiřadit léčivu, které je na nich zakotveno, určitou prostorovou orientaci. Systém je vyvinutý pro spojení fulerenu s protilátkou nebo s jiným prostředkem pro navedení na cíl. Tyto systémy např. zahrnují fulereny s chemoterapetickými léčivy, fulereny s radiofarmaky a fulerenové liposomální systémy. Fulerenové deriváty se používají jako antivirová činidla, při fotodynamické terapii, při léčbě Parkinsonovy choroby, při terapii nádorů a v dalších aplikacích. Fulerenové deriváty byly navrženy rovněž pro léčbu AIDS a rakoviny. Nanoslupky jsou zlatem pokryté křemíkové nanočástice, které obsahují léčivo. Nanoslupky mohou absorbovat světelnou energii a přeměnit ji v teplo. Zkoumá se jejich použití jako antinádorových látek [16]. Zeolity jsou krystalické porézní hlinotokřemičitany [17]. Zeolity mohou absorbovat různé malé molekuly (plyny, kapaliny s nízkou molární hmotností, jako je voda a methanol), usnadňovat iontovou výměnu a fungovat jako molekulární síta. Vykazují vysokou stabilitu bez ohledu na prostředí, v němž se vyskytují, a jsou prakticky netoxické. Kovové komplexy zeolitů mohou slou.it jako nosiče kyslíku, a tak napodobovat cytochrom P450. V současnosti se pracuje na novém typu kontrastních látek pro magnetickou tomografii na bázi zeolitového komplexu Ga 3+. Zeolity byly také použity jako protinádorové činidlo. Nanozeolitické krystaly byly také použity jako hemostatické činidlo [18]. Při srovnání s klasickým postupem bylo pozorováno výrazné zlepšení. 3 Závěr Cílená léčba pomocí nanotechnologických nástrojů je na počátku svého vývoje, ale první dosažené výsledky naznačují, že její potenciál je obrovský a možnosti v léčbě různých vážných onemocnění včetně nádorových jsou téměř neomezené. Mezi hlavní výhody bezesporu paří zvýšení rozpustnosti léčiva či dokonce využití léčiv, které nejsou běžně rozpustné ve vodných roztocích (Obr. 3). Tímto se zvyšuje efektivia léčby a také oblasti použití léčiva. Dalšími výhodami jsou výrazné zkrácení doby léčby, čímž se snižuje zátěž pacienty a taky cena léčby. Cílený transport léčiv má velký farmako -ekonomický potenciál také z pohledu minimalizace nežádoucích efektů běžně užívaných léčiv (Obr. 3). Obrázek 3: Výhody cíleného transportu léčiv. Převzato z [15]. 101

118 4 Reference [1] R. D. Vale, The molecular motor toolbox for intracellular transport, Cell, 2003, pp [2] G.K. Stylios, P.V. Giannoudis and T. Wan, Applications of nanotechnologies in medical practice, Injury International Journal of the Care of the Injured, 2005, pp. S6-S13. [3] M.C. Roco, Nanotechnology: convergence with modern biology and medicine, Curr Opin Biotechnol, 2003, pp [4] P.K. Jain, X. Huang, I.H. El -Sayed and M.A. El -Sayed, Noble Metals on the Nanoscale: Optical and Photothermal Properties and Some Applications in Imaging, Sensing, Biology, and Medicine, Accounts of Chemical Research, 2008, pp [5] R. Duncan, The dawning era of polymer therapeutics, Nature Reviews Drug Discovery, 2003, pp [6] M. Ferrari, Cancer nanotechnology: Opportunities and challenges, Nature Reviews Cancer, 2005, pp [7] S.M. Moghimi, A.C. Hunter and J.C. Murray, Nanomedicine: current status and future prospects, Faseb Journal, 2005, pp [8] J. Panyam and V. Labhasetwar, Biodegradable nanoparticles for drug and gene delivery to cells and tissue, Advanced Drug Delivery Reviews, 2003, pp [9] D. Peer, J.M. Karp, S. Hong, O.C. FaroKhzad, R. Margalit and R. Langer, Nanocarriers as an emerging platform for cancer therapy, Nature Nanotechnology, 2007, pp [10] V. Kral, J. Sotola, P. Neuwirth, Z. Kejik, K. Zaruba and P. Martasek, Nanomedicine - Current status and perspectives: A big potential or just a catchword?, Chemicke Listy, 2006, pp [11] C. Lemarchand, R. Gref and P. Couvreur, Polysaccharide-decorated nanoparticles, European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 2004, pp [12] Y. Barenholz, Liposome application: problems and prospects, Current Opinion in Colloid & Interface Science, 2001, pp [13] M.J. Liu and J.M.J. Frechet, Designing dendrimers for drug delivery, Pharmaceutical Science & Technology Today, 1999, pp [14] U. Boas and P.M.H. Heegaard, Dendrimers in drug research, Chemical Society Reviews, 2004, pp [15] S. Rudge, C. Peterson, C. Vessely, J. Koda, S. Stevens and L. Catterall, Adsorption and desorption of chemotherapeutic drugs from a magnetically targeted carrier (MTC), Journal of Controlled Release, 2001, pp [16] E. Katz and I. Willner, Integrated nanoparticle -biomolecule hybrid systems: Synthesis, properties, and applications, Angewandte Chemie International Edition, 2004, pp [17] L. Tosheva and V.P. Valtchev, Nanozeolites: Synthesis, crystallization mechanism, and applications, Chemistry of Materials, 2005, pp [18] H.B. Alam, D. Burris, J.A. DaCorta and P. Rhee, Hemorrhage control in the battlefield: Role of new hemostatic agents, Military Medicine, 2005, pp

119 POZNÁMKY 103

120

121 ANALYTICKÉ METODY MATERIÁLŮ: 10SPECIÁLNÍ RAMANOVA A MÖSSBAUEROVA SPEKTROSKOPIE Jana Drbohlavová

122

123 1 Úvod do Ramanovy spektroskopie Ramanova spektroskopie je spektrální metoda, jejíž podstatou je Ramanův jev založený na neelastickému rozptylu fotonů monochromatického záření v ultrafialové, viditelné či blízké infračervené oblasti světla. Tato technika je důležitá při studiu vibračních, rotačních a jiných nízkofrekvenčních přechodů v materiálech. Pomocí znalostí těchto přechodů je pak možné analyzovat detailní molekulární strukturu, tzn. postavení atomů v molekule, rozložení elektronů a mezimolekulárních sil. Metoda je široce používaná pro výzkum v oblasti fyziky, biologie i chemie, v geologii, ve farmacii při testování totožnosti léčiv a odhalování padělků, u zásahových jednotek pro rychlou a bezpečnou identifikaci neznámých látek, ve forenzních a materiálových vědách [1]. Měření může probíhat v různých skupenstvích od roztoků, pevných i plynných látek, po gely, povrchové filmy, krystaly, buňky i celé tkáně. Rozvoj metody spadá na poč. 20. století (1923), kdy se teoretickému studiu rozptylu monochromatického záření se změnami frekvence intenzivně věnoval rakouský fyzik A. Smekal. K experimentálnímu objevu pak roku 1928 dospěli C. V. Raman a K. S. Krishnan (Obr. 1), kteří si při svých pokusech všimli změn ve vlnové délce slunečního světla rozptýleného kapalinou. V témže roce učinili nezávisle stejný objev vědci G. Landsberg a L. Mandelstam při studiu vibračního rozptylu světla v krystalech. Raman získal za svůj objev Nobelovu cenu za fyziku (1930). Pokud je vzorek ozářen intenzivním monochromatickým zdrojem světla (obvykle laserem), molekuly přejdou do vyšších elektronových stavů, tzv. kvaziexcitovaných virtuálních stavů a většina z nich vyzáří foton se stejnou vlnovou délkou jakou má záření dopadající jedná se o elastický (Rayleighův) rozptyl. Část fotonů dopadajícího záření může být rozptylován makroskopickými částicemi vzorku (Tyndalův rozptyl). Ramanův (příp. Ramanův Smekalův) jev nastává tehdy, má li rozptýlené záření jinou vlnovou délku (resp. energii fotonů) než záření dopadající jedná se o neelastický (Stokesův či anti Stokesův) rozptyl (Obr. 2). Tomuto jevu, který nastává v důsledku interakce dopadajícího záření s molekulami vzorku (přesněji s elektronovými oblaky vazeb v molekule), podléhá jen malá část záření, přibližně jeden foton z milionu. Obrázek 1: Vědci, kteří přispěli k objevu Ramanovy spektroskopie: nahoře zleva C. V. Raman, K. S. Krishnan, G. Landsberg a L. Mandelstam. Převzato z [2,3,4,5]. Rozdíl v energiích rozptýlených fotonů je způsoben změnami v rotačních a vibračních energiích molekuly. V Ramanově spektru pak rozlišujeme posuny frekvencí, Stokesovy a anti Stokesovy linie, od frekvence použitého laserového zdroje. Jinými slovy, u pružného rozptylu nenastává během interakce fotonu s molekulou změna polohy jader molekuly a molekula se z virtuálního stavu vrátí do stavu původního. 105

124 Obrázek 2: Zjednodušené schéma Ramanova jevu. Přepracováno podle [6]. excitovaný elektronový stav ENERGIE základní elektronový stav dopadající foton Stokesův rozptyl dopadající foton Rayleighův rozptyl dopadající foton anti-stokesův rozptyl Naopak u nepružného rozptylu dochází během krátké doby života virtuálního stavu (obvykle s) k výměně kvanta vibrační, rotační či jiné energie mezi molekulou a fotonem dopadajícího záření a ke změně polohy jader. Molekula se již nevrátí z virtuálního stavu do původního, ale vyšle foton s nižší energií (delší vlnovou délkou), jelikož část energie byla spotřebována na zvýšení vibrační energie molekuly Stokesovy linie, viz Obr. 3. Druhým, méně pravděpodobným případem je, že foton interaguje s molekulou ve vibračně exitovaném stavu, přičemž dojde k deexcitaci molekuly a foton se pak odráží s větší energií dopadající foton prerezonančně rozptýlený foton dopadající foton rezonančně rozptýlený foton dopadající foton fluorescenčně vyzářený foton IR Raman Rayleigh Raman Prerezonanční Raman Rezonanční Fluorescence Obrázek 3: Energetický diagram zobrazující stavy zapojené do jednotlivých typů rozptylu a spektroskopických přechodů. Přepracováno podle [1] V = 1 V = 0 (kratší vlnovou délkou) anti Stokesovy linie. Jelikož je za běžných podmínek v základním stavu větší počet molekul než ve stavu excitovaném, je Stokesova část spektra intenzivnější než anti Stokesova. V důsledku toho se v praxi měří jen polovina spektra, a to v oblasti Stokesově. Poloha pásů v Ramanově spektru je určena stejnými parametry, jako je tomu v infračervené (IČ) spektroskopii, tzn. počtem a hmotností vibrujících atomů, silovými konstantami a geometrií molekuly. Na rozdíl od IČ spektroskopie však k absorpci záření daným vibračním módem molekuly nedochází v důsledku interakce tohoto záření s oscilujícím dipólem vibrující molekuly 106

125 (intenzita rozptylu je úměrná čtverci změny dipólového momentu), ale v důsledku interakce s oscilujícím indukovaným dipólem vibrující molekuly, který vzniká změnou polarizovatelnosti molekuly vlivem vnějšího elektrického pole dopadajícího záření. Intenzita Ramanova rozptylu je pak úměrná čtverci změny polarizovatelnosti molekuly. Jinými slovy, v IČ spektroskopii jsou aktivní spíše asymetrické vibrace způsobující změnu dipólového momentu molekuly a vibrace v polárních částech molekuly, kdežto v Ramanově spektroskopii převládají vibrace způsobující změnu polarizovatelnosti molekuly (symetrické vibrace a vibrace v nepolárních částech molekuly). Míra polarizace rozptýleného záření je závislá na symetrii vibrací molekuly a je charakterizována depolarizačním poměrem. Z tohoto důvodu je tvar Ramanovských a IČ spekter silně ovlivněn symetrií molekul (buněk krystalu) a symetrií jednotlivých vibračních pohybů. Pokud mají molekuly nízkou symetrii, jsou pásy všech vibrací pozorovatelné v obou typech spekter, ale s odlišnou intenzitou. Pro molekuly s vysokou symetrií je Ramanovo a IČ spektrum navzájem komplementární (Obr. 4). A pro molekuly se středem symetrie platí princip alternativního zákazu, tj. pásy vibrací aktivní v Ramanově spektru jsou zakázány v IČ spektru a naopak. 1.1 Experimentální uspořádání Ramanova spektrometru Pro Ramanovu spektrometrii se používají jak disperzní spektrometry, tak spektrometry s Fourierovou transformací (FT). Hlavními součástmi spektrometru jsou: zdroj excitujícího záření (laser), vzorkovací prostor (komora), sběrná optika, disperzní prvek u disperzních spektrometrů či interferometr u FT spektrometrů a detektor. Jak už bylo zmíněno výše, nejčastěji používaným zdrojem dopadajícího (excitačního) záření v Ramanově spektrometru je laser z plynných laserů např. He Ne (červený, λ = 632,8 nm), Kr (červený, λ= 647,1 nm), dále Ar poskytující záření o dvou vlnových délkách (zelený, λ= 514,5 nm a modrý, λ = 488 nm). Problém nastává u látek vykazujících luminiscenci či takových, u nichž může použití laseru vyvolat luminiscenci. I nepatrné koncentrace fluorescenčních příměsí totiž způsobují překrytí spektra relativně silnější luminiscencí, takže se Ramanovy pásy ztrácí v šumu intenzivního pozadí. Pokud je intenzita fluorescence nízká, lze interference korigovat za pomocí softwaru nebo jiným způsobem, např. měřením s vysokým časovým rozlišením umožňující časově oddělit Ramanův rozptyl od pomalejší luminiscence. Pokud je však fluorescence silná a dochází při ní k saturaci CCD detektoru, nelze Ramanovo spektrum Obrázek 4: Porovnání infračerveného (nahoře) a Ramanova (dole) spektra cyklohexanu. Převzato z [7]. 107

126 interpretovat. Jelikož je fluorescence závislá na vlnové délce, je pravděpodobné, že pokud látka fluoreskuje při určité vlnové délce, při jiné už fluorescenci vykazovat nebude. Proto je vhodné použít jiný zdroj budícího záření, jako je laserová dioda z okraje viditelné oblasti (λ = 785 nm) či Nd : YAG z blízké infračervené oblasti (λ = 1024 nm). Při výběru Ramanova spektrometru je tedy lépe zvolit takový, který obsahuje více laserových zdrojů s možností rychlé a snadné výměny. Intenzita budícího záření se zpravidla volí maximální s ohledem na druh měřeného vzorku. Nebezpečí poškození vzorku intenzivním budícím zářením se snižuje užitím rotujících držáků, které umožňují rozdělit celkovou dávku záření do většího objemu vzorku. V případě tekutých vzorků lze použít též průtočných kyvet a kapilár. Ramanův spektrometr se dále skládá z optiky pro ozáření vzorku, optiky pro sběr rozptýleného záření, monochromátoru a detektoru. Optická soustava vzorkové části zachycuje rozptýlené záření v co nejširším prostorovém úhlu. Užívá se buď čočkový sběrný objektiv s velkou aperturou či zrcadlový objektiv. Vzhledem k tomu, že do monochromátoru je optickou soustavou spolu se zářením Ramanova rozptylu vedeno i elasticky rozptýlené záření (Rayleighův rozptyl), jehož intenzita může značně převýšit intenzitu užitečného Ramanova signálu, je nezbytné velmi dokonalé potlačení pozadí monochromátoru. Zpravidla se proto užívá monochromátor dvojitý či trojitý, kdy záření prochází přes dvě, resp. tři mřížky. Druhým způsobem pro separaci nežádoucího Rayleighova záření je použití komerčních interferenčních filtrů, které odstraní spektrální rozsah (±80 100) cm 1 od frekvence laseru, avšak nedovolí detekci Ramanových módů v oblasti pod 100 cm 1. Nyní se používá nový typ filtrů na bázi holografické optiky, popř. dielektrické filtry. K detekci se dříve využívaly fotonásobiče (často chlazené pro snížení temnostního signálu) spojené s čítačem fotonů. V poslední době se používají CCD detektory. Nejčastěji je vzájemné uspořádání ozařovací techniky a optiky zachy cující rozptylující záření do monochromátoru pod úhlem rozptylu 90, ale existuje rovněž 180 geometrie uspořádání (Obr. 5). Pravoúhlé vzájemné uspořádání je typičtější pro disperzní přístroje a volí se především proto, že je při něm minimální intenzita elasticky rozptýleného záření, kdežto celková intenzita Ramanova rozptylu se podstatně nesníží. Uspořádání pod úhlem 180 umožňuje kombinovat Ramanův spektrometr s optickým mikroskopem a takto analyzovat i velmi malé plochy vzorků (1 µm). Pokud je však vzorek příliš velký nebo křehký na umístění v mikroskopu, je nutné přistoupit k nekonvenčnímu měření in situ. Významný pokrok v mikroramanovské spektroskopii je založený na konfokální mikroskopii. Ke zvýšení poměru signálu k šumu se při měření Ramanova rozptylu často užívá kumulace spekter (měřené hodnoty jsou zaznamenávány pomocí mnohokanálového analyzátoru nebo počítače a po několika opakovaných měřeních jsou získaná spektra průměrována). Při N-provedených opakováních se úroveň náhodného šumu sníží Nkrát. Jednou skupinou metod potlačení šumu jsou metody vyhlazovací. Tento způsob redukce šumu je obsažen téměř v každém spektroskopickém softwaru a využívá polynomickou funkci vyhlazování navrženou Savitzkym a Golayem. Tento algoritmus byl nadále vylepšován, ale stále není zcela optimální, protože vyhlazuje každý ostrý pík, včetně úzkých charakteristických píků příslušících vzorku. Tímto dochází k degradaci efektivního spektrálního rozlišení a dokonce k úplnému odstranění některých spektrálních znaků. Jiným způsobem korekce šumu je využití filtračních algoritmů FIR (z angl. Finite Impulse Response). Tento výhodnější způsob umožňuje výběr určité části vstupního signálu, která zůstane nezměněna, zatímco se potlačí jiná část [8]. Zvláštní nároky jsou kladeny při měření Ramanova rozptylu na čistotu a optickou homogenitu vzorku. U kapalin jsou překážkou měření i rozptylující makroskopické částice (bublinky, chloupky, prach), vznášející se v tekutině. Tyto částice se nahodile dostávají do budícího svazku 108

127 a způsobují náhlý vzrůst intenzity elasticky rozptýleného záření o několik řádů. To se projeví ve fluktuacích pozadí Ramanova spektra, které mohou být srovnatelné s výškou vibračních linií. Přitom nahodilost a relativně velká časová konstanta fluktuací znemožňuje jejich odfiltrování v elektrickém signálu detektoru. vzorek hranolové zrcadlo rozptýlené světlo vzorek 90 geometrie 180 geometrie A) B) Obrázek 5: A) a B) Možnosti uspořádání ozařovací techniky v Ramanově spektrometru. Přepracováno podle [1]. 1.2 Praktické využití Ramanovy spektrometrie rozptýlené světlo Velkou výhodou Raman spektroskopie je široké spektrum látek, které je možno touto metodou studovat. Navíc je tato metoda nedestruktivní, takže je možno ve většině případů vzorek po měření použít k dalším experimentům. Na měření je potřeba pouze minimální množství vzorku (u kapalin stačí již několik mikrolitrů), protože lze laserový svazek na vzorek velmi dobře fokusovat. U biologických vzorků nehraje roli velikost molekuly, což je zvláště výhodné v případě nukleových kyselin, zejména dlouhovláknové genomové DNA. Ramanův rozptyl probíhá ve velmi krátké časové škále (cca s), proto je tato metoda vhodná i ke studiu dynamiky biologických procesů. V současnosti už je k dispozici poměrně rozsáhlá Ramanových a IČ spekter nukleových kyselin, proteinů i dalších biomolekul s jednoznačným přiřazením pásů, popisem vibrací i nalezenou korelací mezi spektrálními rysy a strukturou. Na rozdíl od IČ spektroskopie lze pomocí Ramanovy spektroskopie analyzovat technicky významné prvkové materiály, např. uhlíkové materiály, jako jsou grafitické vrstvy, saze či přírodní i umělé diamanty, a křemíkové materiály s využitím v elektronice. Rovněž lze studovat anorganické materiály obsahující těžké prvky, např. korozní oxidické, /di/sulfidické vrstvy pro slitiny těžkých kovů (koroze materiálů v přírodním nebo výrobním prostředí). Při studiu polypeptidů a proteinů je významná možnost sledovat symetrické valenční S S vibrace disulfidických můstků (např. rovnováha cystin cystein, resp. vznik jiných lépe rozpustných disulfidů s cysteinem pro léčbu cystinurie) [9]. Další výhodou Ramanovy spektroskopie oproti IČ je možnost měření ve vodných roztocích. Voda má slabý signál v oblasti vlnočtů ( ) cm 1, který jen málo interferuje se spek-trem vzorkem a tuto interferenci lze snadno korigovat. Ramanova spektrometrie se uplatňuje i v kvantitativní analýze, ale protože se nejedná o absorpční spektrometrii, není v této metodě obvykle splněn jednoduchý princip lineární závislosti intenzity pásu na koncentraci analytu. Rovněž nelze vyloučit překryvy pásů různých složek a vzájemné vlivy měnících se koncentrací jednotlivých složek na tvar příslušných Ramanových pásů. Pro kalibraci je v Ramanově spektrometrii často třeba vyvíjet složitější kalibrační modely s využitím pokročilých chemometrických algoritmů, které vyžadují rozsáhlou sadu standardů. Při použití pokročilých regresních metod se v rámci kalibračního modelu využívají nikoli hodnoty intenzity v maximech vybraných pásů, ale většinou se vyhodnocují širší spektrální úseky či dokonce celá Ramanova spektra (oblast Stokesova rozptylu). Cílem je tak nalézt vztah mezi vícedimenzionální spektrální informací a složením vzorků. Spektrální informace je reprezentována maticí hodnot intenzity rozptylu ve vybraných spektrálních úsecích pro sadu kalibračních vzorků; složení vzorků pak maticí hodnot koncentrací skupiny sledovaných analytů. 109

128 1.3 Metody zvýšení intenzity Ramanova signálu Ramanův signál je v konvenčním experimentálním uspořádání slabý a navíc je Ramanova spektroskopie omezena dosahovaným prostorovým rozlišením na úrovni mikronů. Zvýšení citlivosti a zlepšení prostorového rozlišení umožňují nové variace této techniky. Příkladem může být povrchově zesílená Ramanova spektroskopie (Surface enhanced Raman spectroscopy, SERS), která využívá k zesílení slabého Ramanova signálu energii povrchového plazmonu vznikající při absorbci elektromagnetického záření vhodné vlnové délky na povrchu nanočástic z ušlechtilých kovů (stříbro, zlato, měď a řada dalších kovů) ve formě koloidů či elektrod [10]. Po adsorpci molekul zkoumané látky na povrchu nanočástic kovu se získá jednoduchý systém pro měření zesílených spekter Ramanova rozptylu. V praxi lze metodu použít pro charakterizaci polovodičů, klasifikaci hornin, v muzejnictví a archeologii pro nalezení vhodného způsobu restaurování památek. V biologii a biochemii lze pomocí této metody studovat strukturu, dynamické a funkční vlastnosti biomolekuly. Intenzita Ramanových signálů je ( )krát vyšší než u konvenční Ramanovy spektroskopie. Podobného zesílení Ramanova signálu ve velmi malé, přesně lokalizované oblasti lze dosáhnout využitím Ramanovy spektroskopie v kombinaci s AFM mikroskopií se speciálně upraveným AFM hrotem. Tato metoda se pak nazývá hrotem zesílená Ramanova spektroskopie (Tip Enhanced Raman Scattering, TERS) a umožňuje získávat informace ze struktur na submikronové nebo nanometrové úrovni, např. klasifikovat průměr uhlíkových nanotrubek. Jinou modifikaci Ramanovy spektroskopie je možné aplikovat pro analýzu barevných sloučenin vykazujících silnou fluorescenci, která částečně či úplně překrývá Ramanův signál. Jedná se o rezonanční Ramanovu spektroskopii využívající excitaci laserem s takovou frekvencí, která odpovídá frekvenci záření potřebného na přechod elektronu do excitovaného stavu v části molekuly způsobující její barevnost (chromofor). Intenzita Ramanových pásů pocházejících z chromoforů, kde nastal elektronový přechod, se krát zvýší, což umožňuje získat Ramanovy spektra i u vzorků s velmi nízkou koncentrací (až 10 8 M). Pro dosažení rezonančního Ramanova efektu je velmi užitečné používat laditelné lasery. Existuje rovněž kombinace této techniky s výše zmíněnou SERS, tzv. povrchově zesílená rezonanční Ramanova spektroskopie (SERRS), která využívá efekty obou metod, takže výsledné zesílení je v řádu a lze ji tedy využít k detekci jednotlivých molekul. Další možností zesílení Ramanovských signálů je použití koherentní anti Stokesovy Ramanovy spektroskopie (Coherent Anti Stokes Raman Spectroscopy, CARS), kde se vzorek ozařuje dvěma velmi silnými koherentními (kolineárními) lasery. Obvykle je frekvence prvního laseru konstantní, zatímco frekvence druhého laseru laditelná tak, aby jejich rozdíl odpovídal frekvenci některého módu aktivního v Ramanově spektru. Jelikož získáme ve spektru pouze jeden extrémně zesílený Ramanův pás, není nutné s CARS používat monochromátor, ale pouze široký interferenční filtr a za ním detektor. Zesílení Ramanova signálu v případě CARS je obvykle 10 5 krát. K zesílení Ramanova signálu je rovněž vhodná stimulovaná Ramanova spektroskopie, kde se namísto kontinuálního ozařování laserem s elektrickým polem 104 V/cm využívá silného pulzního laseru (s elektrickým polem 109 V/m), který je schopen transformovat mnohem větší část dopadajícího záření na užitečný Ramanův rozptyl. Výhodná je rovněž úhlově rozlišená Ramanova spektroskopie (Angle Resolved Raman Spectroscopy), která respektuje úhel dopadajícího laserového paprsku. Pokud je známá orientace vzorku, pak lze z tohoto měření získat detailní informaci o rozptylu fononů. Zajímavou variantou je Ramanova mikrospektroskopie kombinovaná s optickou pinzetou (Optical Tweezers Raman Spectroscopy, OTRS), 110

129 která využívá jednoho fokusovaného laserového svazku k zachycení mikroobjektů a k jejich manipulaci v prostoru. Vlnová délka je volena tak, aby nebyla objektem pohlcována a objekt zůstal nepoškozený. Umožňuje studium individuálních části a dokonce biochemických procesů v jednotlivých buňkách. Pro detekci a analýzu léčiv, drog a výbušnin je efektivní SORS adaptace Ramanovy spektroskopie (Spatially offset Raman spectroscopy) [11]. Tato metoda umožňuje díky vysoké chemické specifičnosti, relativní jednoduchosti a možnosti použití v příručních zařízeních neinvazivní identifikaci různých nebezpečných látek. Například při analýze kapalných výbušnin v lahvi zahrnuje Ramanovo spektrum rozdílné příspěvky z jednotlivých vrstev (nádoba i kapalina) související s větším příčným rozptylem fotonů z hlubší vrstvy vzorku. Tento rušivý signál povrchové vrstvy (nádoby) může být potlačen zvětšením úhlu dopadu paprsku k ose snímání spektra a odečtením Ramanova spektra získaného měřením s laserovým paprskem v ose snímání. 2 Úvod do Mössbauerovy spektroskopie Základy této spektroskopické metody položil v roce 1958 mladý německý fyzik, Rudolf Ludwig Mössbauer, který se ve své dizertační práci věnoval rezonanční fluorescenci 129 kev γ záření izotopu 191 Ir. Zjistil, že pro uvažovaný fluorescenční přechod je při pokojové teplotě energie zpětného odrazu menší než dopplerovské rozšíření emisních a absorpčních linií, avšak při snížení teploty experimentu intenzita rezonanční fluorescence vzrostla. Část 129 kev záření byla vyzářená a pohlcená bez energie zpětného odrazu a bez dopplerovského rozšíření a vykazovala jen přirozenou šířku čáry. Mössbauerův přínos spočívá ve vysvětlení jevu bezodrazové jaderné rezonanční emise a absorpce γ záření. O tři roky později byl za tento objev, který nese jeho jméno, společně s Robertem Hofstadterem oceněn Nobelovou cenou za fyziku. Velmi záhy od objevu a teoretického zdůvodnění tohoto jevu dosáhla Mössbauerova jaderná spektroskopie zejména díky extrémně velké rozlišovací schopnosti (10 12, což je o 4 řády více než u atomové spektroskopie) a univerzálnosti velmi široké uplatnění nejen ve fyzice, ale i v chemii, biologii a v mnoha technických oborech. Z výše uvedeného plyne, že podstatou Mössbauerova jevu je bezodrazová rezonanční emise a absorpce gama kvant atomovými jádry některých izotopů (zejména 57 Fe, 119 Sn, 121 Sb, 152 Eu, 197 Au) zabudovaných do mřížky pevných látek. V současnosti je známo asi 47 prvků s přibližně 110 přechody (Obr. 7), na kterých je možno pozorovat Mössbauerův jev, ale více než 65 % veškerých prací se týká izotopu 57 Fe [14]. Proto výraz Mössbauerova spektroskopie obvykle označuje spektrometrii na jádrech 57 Fe a pokud jsou výsledky získané pomocí jiného izotopu, jeho použití je explicitně uvedeno. Mössbauerova spektroskopie je důležitá při studiu valenčních a spinových stavů, tj. určení oxidačního stupně (např. Fe 2+ /Fe 3+, Sn 2+ /Sn 4+ ) a vlastností chemické vazby (kovalentnost, elektronegativita) v pevných vzorcích ve formě slisovaného minerálního prášku nebo tenké hladké destičky. Optimální tloušťka vzorku se řídí koncentrací Mössbauerovského izotopu (u Fe je to cca 5 mg/cm 2 ). Obrázek 6: R. Mössbauer (vlevo, převzato z [12]) a příklad jednoho z nejmenších Mössbauerovských spektrometrů (5 cm x 2,5 cm x 3 cm), který využívá NASA pro studium materiálů obsahujících železo na Marsu (vpravo, převzato z [13]). Tuto techniku lze tedy použít pro určení koordinačního čísla, což je zvláště vhodné pro charakterizaci struktury špatně krystalických 111

130 Obrázek 7: Prvky periodické soustavy, které lze studovat pomocí Mössbauerovy spektroskopie. Převzato z [15]. a amorfních látek, lokálního uspořádání atomů a magnetické struktury látek. Mössbauerova spektroskopie je nedestruktivní metoda s možností využití in situ experimentů, přičemž spektrum je charakteristické pro dané fázové složení, sloučeninu, krystalografickou polohu a rovněž magnetický stav. Jev jaderné rezonanční fluorescence neboli atomové absorpce nízkoenergetických fotonů z oblasti viditelného záření zobrazuje následující schéma (Obr. 8). excitovaný stav jádro mateřské základní stav Mössbauerův zdroj (emitor) jádro dceřinné E γ = E jader. přechodu - E R Mössbauerův přijímač (absorbátor) Obrázek 8: Schématické znázornění Mössbauerova jevu. Přepracováno podle [15]. Zdroj záření (vysílač, emitor) a přijímač (absorbátor) jsou v rezonanci se zářením. Pokud jádro přechází ze vzbuzeného do základního stavu, vyzáří foton o určité energii, který může být dále pohlcen jiným jádrem stejného typu (prvku), který je v základním stavu. Jádro přijímače tedy přejde do vzbuzeného stavu a po určitém čase opět nastává vyzáření fotonu a deexcitace. Podrobněji lze princip Mössbauerova jevu popsat následovně: volný jaderný systém přechází ze vzbuzeného do základního stavu, které se vzájemně liší o energii E 0. Při tomto přechodu emituje volné jádro gama kvantum s energií odpovídající rozdílu příslušných energetických hladin, která se rozdělí mezi emitované kvantum a jádro. Část energie, kterou odnáší jádro, odpovídá energii zpětného odrazu. Pokud je tato energie zpětného odrazu E R menší než vazebná energie atomu v tuhé mřížce (~ 10 ev), ale je srovnatelná s energií fotonů (přibližně 10 3 ev), atom nebude uvolněný ze svého místa v krystalové mřížce, ale může rozptylovat energii zpětného odrazu vytvořením fotonů. Jestliže je jádro pevně zabudováno do mřížky, připadá na zpětný odraz tolikrát menší energie, kolikrát je jádro menší než celý krystal. Jelikož je tento proces kvantovaný, existuje konečná pravděpodobnost bezfononového přechodu, čili bez přenosu energie mezi γ zářením a tuhou látkou. Pokud celý děj proběhne současně jak ve zdroji záření, tak v absorbátoru (vzorek jakákoliv pevná látka obsahující rezonanční atomy), splní se tak podmínka pro rezonanční absorpci jaderného γ záření. Rozdíl v emisních a absorpčních liniích rezonančního γ záření pro volné a vázané jádro je na Obr

131 Obrázek 9: Horní část ukazuje relativní posun emisních a absorpčních linií v důsledku energie zpětného odrazu volných jader. Dolní část odpovídá jádrům vázaným v krystalové mřížce, které mohou oscilovat pouze kolem rovnovážných poloh a výsledkem jsou bezfononové, jedno a vícefononové linie. Převzato z [16]. Klasickým příkladem Mössbauerova jevu je rozpad izotopu 57 Co na 57 Fe s emisí γ záření, které je bezodrazově absorbováno sousedními izotopy 57 Fe, což má za následek rozštěpení energetických hladin v jádře (Obr. 10). Podmínkou je, aby rozpadající se Co byl obklopen stejnými atomy jako je absorbující Fe. Mössbauerova spektroskopie se týká přeskoků mezi základními hladinami jádra, resp. mezi jejich složkami rozvětvenými následkem lokálních a vnějších polí (podrobnější popis dále v textu) a spadá do oblasti gama záření (příslušné energie jsou řadu desítek kev). 2.1 Interpretace Mössbauerova spektra Mössbauerovo spektrum je zápisem intenzity γ záření dopadajícího na detektor v závislosti na rychlosti v a získává se dopplerovskou modulací energie tohoto záření. Načítání jednoho spektra trvá běžně (24 48) hodin. Ke zpracování spektra se používá rychlá Fourierovská transformace (FFT). Experimentálně naměřený tvar spektrální čáry je výsledkem konvoluce čáry emitoru a absorbátoru. Intenzita rezonanční čáry je závislá na pravděpodobnosti vzniku či zániků fononů jádry zdroje či absorbátoru, jinými slovy na počtu fotonů emitovaných či absorbovaných bez ztráty energie na zpětný odraz. Dále je intenzita absorpce různých vlnových délek citlivá na lokální elektronovou konfiguraci a elektrické a magnetické pole v pevné látce. relativní transmise γ záření I=3/2 I=1/2 14 kev 10-4 ev 10-4 ev izomerní posun (Dopplerovská) rychlost zdroje (mm/s) Obrázek 11: Schématické znázornění izomerního posunu (nahoře) a vliv na tvar Mössbauerovského spektra (dole). Přepracováno podle [17]. Obrázek 10: Rozpad izotopu 57 Co na 57 Fe. Přepracováno podle [15]. Mössbauerovo spektrum vykazuje jednoduchou čáru pouze v tom případě, pokud jaderné hladiny zdroje či absorbátoru nejsou rozštěpeny působením hyperjemných interakcí. Hyperjemné interakce vznikají důsledkem vazby mezi jaderným momentem a příslušnými elektronovými a atomovými momenty, což způsobuje posunutí, 113

132 a rozštěpení hladin energie v jádře. Jedná se o elektrické monopolní interakce (coulombovská interakce mezi protony a s elektrony) způsobující izomerní posun, dále o kvadrupólové interakce (interakce mezi kvadrupólovým momentem jádra a nehomogenním elektrickým polem) způsobující kvadrupólové štěpení a magnetické dipólové interakce (interakce mezi magnetickým dipólovým momentem jádra a magnetickým polem) mající za následek jaderný Zeemanův efekt BHf. Izomerní posun (Obr. 11) nastává, pokud Mössbauerův zdroj a přijímač nejsou tvořeny identickými atomy, tedy když průměry zdroje a přijímače se liší a rovněž jejich elektronová hustota není stejná. Vlivem tohoto rozdílu mají Coulombické interakce odlišný vliv na základní a excitovaný stav. Rozdíl v energii potřebné na excitaci přijímače způsobí posun (negativní či pozitivní) Dopplerovské rychlosti z 0 na v 1. Při těchto hyperjemných interakcích se uplatňuje stínění elektronů p, d a f. I=3/2 I=1/2 14 kev 10-4 ev izomerní posun 10-7 ev kvadrupólové štěpení ± 3/2 ± 1/2 ± 1/2 Obrázek 12: Schématické znázornění kvadrupólového štěpení. Přepracováno podle [17]. Nepůsobí-li magnetické interakce, nastává tzv. kvadrupólové štěpení, kdy jsou jaderné excitované stavy rozštěpeny na dva degenerační dublety (dublet s vyšší energií s magnetickým kvantovým číslem m = ±3/2 a dublet s nižší energií s magnetickým kvantovým číslem m = ± 1/2), jak ukazuje Obr. 13. Tyto interakce poskytují ve spektru informace o lokální symetrii okolí Mössbauerovského jádra, o valenčním a spinovém stavu a charakteru chemické vazby. Třetím typem hyperjemných interakcí jsou magnetické dipólové interakce, z kterých lze získat informace o magnetickém chování a teplotě magnetických přechodů. relativní transmise γ záření (Dopplerovská) rychlost zdroje (mm/s) Obrázek 13: Vliv kvadrupólového štěpení na tvar Mössbauerovského spektra. Přepracováno podle [17]. Důsledkem těchto interakcí je magnetické rozštěpení hladin excitovaného a základního stavu v důsledku dipolárních interakcí jaderného spinového momentu s magnetickým polem, tzv. jaderné Zeemanovo štěpení. Dovolené přechody odpovídají změně magnetického kvantového čísla o Δm = 0, ±1. Nepůsobí li kvadrupólové interakce, nastává rozštěpení na energeticky stejně vzdálené hladiny. 2.2 Experimentální uspořádání Mössbauerova spektrometru Základem spektrometru je zdroj záření γ (emitor) s energií přesně odpovídající excitované hladině jádra zkoumaného vzorku umístěný na elektromagnetickém pohybovém zařízení. Nejčastěji se jedná izotopy 57 Co nebo 119m Sn. Pohybem celého emitoru vůči vzorku (absorbátoru) pomocí lineárního motorku s rychlostí 1 mm/s se celková energie emitovaného kvanta modifikuje tak, aby mohlo dojít k rezonanční absorpci fotonů stejnými atomy v absorbátoru I=3/2 I=1/2 14 kev 10-4 ev izomerní posun 2x10-7 ev - 3/2-1/2 + 1/2 + 3/2 + 1/ / magnetické dipólové štěpení Obrázek 14: Schématické znázornění jaderného Zeemanova štěpení. Přepracováno podle [17]. 114

133 relativní transmise γ záření (Dopplerovská) rychlost zdroje (mm/s) Obrázek 15: Vliv jaderného Zeemanova štěpení na tvar Mössbauerovského spektra. Přepracováno podle [17]. a bylo dosaženo Dopplerova frekvenčního posu Dopplerovým jevem se vykompenzuje ztráta energie odražených jader. Emitor i absorbátor jsou ze stejné látky. Dále přechází záření γ do scintilačního detektoru (např. NaI(Tl)), eventuálně do proporcionálního detektoru, které mají lepší rozlišení. Detektor měří intenzitu prošlého nebo odraženého (rezonančně rozptýleného) záření v závislosti na jemných změnách energie γ záření. Signál z detektoru je následně zesílen a uschován v mnohokanálovém analyzátoru. Vzorek může být ve formě tenké fólie nebo prášku (o hmotnosti několika gramů), přičemž u tenkého vzorku je malá koncentrace rezonančních jader a u vzorku tlustého větší míra nerezonanční absorpce fotonu, ale nastává rozšíření spektrálních čar. V případě prášku je ideální polykrystalický vzorek bez přednostní orientace krystalu, aby nenastával tvz. texture efekt. Pro měření v různém teplotním režimu a sledování změn magnetismu s teplotou lze absorbátor umístit do kryostatu nebo pece. Základním typem uspořádání je transmisní geometrie vhodná pro měření vzorků s tloušťkou do 50 m. Pro silnější vzorky je pak výhodnější rozptylová geometrie s detektorem umístěným mimo směr kolimovaného záření zdroje. Avšak existuje celá škála dalších spektroskopických technik využívajících Mössbauerův jev. Patří zde například CEMS založená na emisi konverzních elektronů (Conversion electron MS), CXMS (Conversion X ray MS) a jiné (CERS, DCEMS, GEMS, RFMS, RSMR, SRMS, STRMS, TDMS). 3 Reference [1] MILATA, V. et al. Aplikovaná molekulová spektroskopia. Slovenská technická univerzita v Bratislave, s. ISBN [2] Sir Venkata Raman - Biographical. [online] [cit ]. [3] CHARI, T. K. S. The illustrious scientist who teamed with C.V. Raman. [online] [cit.]. Grigory Landsberg. [online] [cit ]. Leonid Mandelshtam. [online] [cit ]. Introduction to Raman Spectroscopy. [online]. Thermo Fisher Scientific, [cit ]. [4] Ramanova spektroskopie. [online] [cit ]. [5] CLUPEK, M. et al. Noise reduction in Raman spectra: Finite impulse response filtration versus Savitzky Golay smoothing. Journal of Raman Spectroscopy, Sep 2007, sv. 38, č. 9, s ISSN [6] DENDISOVÁ, M. et al. RAMANOVA SPEKTROMETRIE. [online] [cit ]. [7] SHARMA, B. et al. SERS: Materials, applications, and the future. Materials Today, Jan Feb 2012, sv. 15, č. 1-2, s ISSN [8] OLDS, W. J. et al. Spatially offset Raman spectroscopy (SORS) for the analysis and detection of packaged pharmaceuticals 115

134 116 and concealed drugs. Forensic Science International, Oct 2011, sv. 212, č. 1-3, s ISSN [9] Rudolf Mössbauer - Biographical. [online] [cit ]. [10] WILLIAMS, D. R. Mossbauer Spectrometer. [online] [cit ]. [11] MACHALA, L. et al. Polymorphous Transformations of Nanometric Iron(III) Oxide: A Review. Chemistry of Materials, Jul 2011, sv. 23, č. 14, s ISSN [12] MACHALA, L. Základy Mössbauerovy spektroskopie. [online] [cit ]. [13] MOSSBAUER, R. L. The discovery of the Mossbauer effect. Hyperfine Interactions, 2000, sv. 126, č. 1-4, s ISSN [14] ZÁVĚTA, K. Mössbauerova spektroskopie. [online] [cit ].

135 POZNÁMKY 117

136

137 (SEM, TEM, PŘÍPRAVA VZORKŮ, EDX, WDX) 11ELEKTRONOVÁ MIKROSKOPIE 11Radim Hrdý

138

139 1 Úvod Dějiny mikroskopie, začínají v 17. století. Jejich první kapitolu vytvořil holandský obchodník a vědec samouk Anthony van Leeuwenhoek ( ), jenž pro lepší pozorování detailů živé přírody sestrojil první, dosud velmi primitivní mikroskop. Naproti tomu elektronový mikroskop vznikl až o 200 let později. K jeho sestrojení nestačila jedna geniální myšlenka, ale cesta k němu vedla přes postupné skládání objevů mnoha badatelů ve spojení s technologickým pokrokem. Jedním ze základních kamenů této mozaiky byl objev elektronu, který popsal J. J. Thompson v roce Objevení elektronu bylo v přímé souvislosti se studiem elektrických výbojů v Geisslerově trubici, známé už v polovině 19. století. Dalším krokem vedoucím k použití elektronů k zobrazení mikrosvěta byl poznatek, který v roce 1925 publikoval Luis de Broglie, že rychle letící částice mají nejen korpuskulární, ale i vlnový charakter jako např. viditelné světlo. Toto potvrdili nezávisle na sobě v roce 1927 Davisson s Germerem a Thompson s Reidem elektronovou difrakcí. Důležitou roli na cestě k elektronovému mikroskopu sehrály práce H. Buscha, uveřejněné v roce 1926, které se zabývaly analogií ve vychylování paprsku elektronů pomocí magnetických polí solenoidů a světla skleněnou čočkou. Novou část dějin mikroskopie otvírá německý vědec Ernst Ruska ( ), vynálezce elektronového transmisního mikroskopu (TEM). Toto zařízení umožňuje zvětšení výrazně překročující možnosti optického mikroskopu, který je limitován délkou světelného paprsku ( ) nm. První jednoduchý transmisní elektronový mikroskop zkonstruoval Ernst Ruska již v roce Tento mikroskop, umožňující do té doby nevídané zvětšení, začal jako první ve své vědecké práci uplatňovat Dr. Helmut Ruska, vynálezcův bratr. Na konci 30. let vznikl poblíž Berlína Ústav elektronové optiky a v této době spatřily světlo světa i první transmisní elektronové mikroskopy, určené k prodeji dalším vědeckým pracovištím. Obrázek 1: Ernst Ruska. Převzato z [1]. Válečná léta tomuto směru vědeckého bádání nepřála, ale po roce 1945 byla činnost ústavu znovu obnovena. V první polovině 50. let Ernst Ruska a jeho spolupracovníci zkonstruovali vylepšený elektronový mikroskop Elmiskop 1, který vyráběla společnost Siemens a jehož služby k objevování neviditelného světa využívalo na vědeckých institucí a univerzit po celém světě. Objevení skenovacího elektronového mikroskopu přišel na svět o něco později. V roce 1938 německý fyzik M. von Ardenne popsal teoreticky i prakticky princip rastrování u transmisního elektronového mikroskopu. Vlastní skenovací elektronový mikroskop poprvé sestrojil americký vědec Zworikyn, který vynalezl fotonásobič a použil je k detekci sekundárních elektronů. Konstrukcí SEMu se v Anglii ve stejné době zabývala skupina vědců vedená C. W. Oatleyem a výsledky jejich práce byly použity k výrobě komerční verze firmou Cambridge Scientific Instruments v roce Obrázek 2: Armin Delong. Převzato z [4]. 119

140 V bývalém Československu v šedesátých letech vznikla v Ústavu přístrojové techniky v Brně velmi silná skupina vedená V. Drahošem a A. Delongem (Obr. 2), která se zabývala konstrukcí elektronových mikroskopů. V současné době se po privatizaci Tesly v Brně vyrábí mikroskopy ve firmách Delong Instruments. Kromě už zmíněných firem se výrobou a vývojem elektronových mikroskopů zabývají firmy JEOL, LEO, Hitachi, Tescan, FEI a Zeiss. Mezi nejvýznamnější inovace patří dále především atomový silový mikroskop (atomic force microscope, AFM) a skenovaci sondový mikroskop (scanning probe microscope, SPM), který kombinuje metody STM a AFM. Na základě revolučních prací na poli elektronové mikroskopie vyvinuli Gerd Binning a Heinrich Rohrer ve švýcarském výzkumném pracovišti IBM v Zurichu, skenovací tunelový mikroskop (scanning tunneling microscope, STM). Vědci Ruska, Binning a Rohrer, získali v roce 1986 Nobelovu cenu za fyziku, Ruska za transmisní el. mikroskop, ostatní pak za objev skenovacího tunelového mikroskopu. Vývoj dosažený od dob konstrukce prvních mikroskopů dokumentuje 3 MV transmisní elektronový mikroskop, který představuje nejvýkonnější nástroj pro pohled do nanokrosvěta, který zatím člověk vytvořil. A díky jemu lidé poprvé spatřili atom. jich opětovným soustředěním pomocí magnetové čočky se vytváří stínový obraz mikroskopovaného vzorku. K jeho zviditelnění se u zdokonalených typů elektronových mikroskopů využívá stejného principu, na jehož základě vzniká obraz na monitoru počítače [2]. Elektrony a jejich vlastnosti je předurčily k tomu, aby nám v elektronových mikroskopech zprostředkovávaly pohled do mikrosvěta. Toto prioritní postavení přineslo elektronu hned několik jeho vlastností. Je nositelem záporného náboje a má nepatrnou hmotnost ve srovnání například s protony či neutrony. Záporný náboj umožňuje urychlovat elektron elektrickým napětím U, přičemž získá kinetickou energii podle vztahu: 1 e U = m v 2, (1) kde m hmotnost elektronu (9, kg), e náboj elektronu (1, C), U urychlovací napětí (V), v rychlost elektronu. Do vztahu (1) lze za rychlost dosadit z rovnice de Broglieho (2), která popisuje vztah mezi vlnovou a korpuskulární povahou hmotných částic: λ = h m v 2, (2) 2 Princip elektronové mikroskopie Jaký je princip elektronové mikroskopie? Světlo je zde nahrazeno svazkem urychlených elektronů, jehož vlnová délka, výrazně nižší než vlnová délka světla, je závislá na urychlujícím napětí. Zjednodušený popis činnosti transmisního elektronového mikroskopu pak vypadá takto: Zrychlený, usměrněný proud elektronů emitovaný zdrojem je veden vakuem a probíhá tenkým mikroskopovaným vzorkem zde se využívá toho, že se část elektronů odráží od atomů a molekul tvořících hmotu vzorku. Je kde λ vlnová délka, h Planckova konstanta (6, Js 1 ) Odtud: h v =, (3b) m λ e U 2 h, (3a) 2 m λ = 2 h λ = ( 2 m e U ) (3) Z výsledného vztahu vyplývá (3), že vlnová délka urychleného elektronu je nepřímo závislá na

141 použitém urychlovacím napětí. Pokud dosadíme za konstanty, vztah se zjednoduší do podoby 1,226 λ = 1 2 U (4) Vlnové délky jsou různé pro rychlosti letícího elektronu při daném urychlovací napětí a je zřejmé, že elektrony se v mikroskopu dosahují obrovských rychlostí, pro U = 100 kv dosahuje jejich rychlost již 1/2 rychlosti světla ve vakuu (2, m/s). 3 Transmisní elektronový mikroskop Transmisní elektronový mikroskop (TEM) je možné popsat jako složité technické zařízení, které umožňuje pozorování preparátů do tloušťky 100 nm při vysokém zvětšení a s velkou rozlišovací schopností. TEM je obdobou světelného mikroskopu. Světelný zdroj optického mikroskopu je zde nahrazen zdrojem elektronů (elektronovým dělem), skleněné čočky jsou nahrazeny čočkami elektromagnetickými a místo okuláru je zde fluorescenční stínítko. Celá dráha elektronů od elektronového děla až po stínítko musí být ve vakuu z důvodů absorpce elektronů molekulami vzduchu a jejich možnou kontaminaci částí mikroskopu. Výsledný obraz vzniká, když proud elektronů prochází vzorkem. Urychlovací napětí elektronů je ( ) kv. Dále je obraz zvětšen a zaostřen čočkami na objektivu a objeví se na obrazovce, případně na fotografickém filmu, nebo je detekován senzory [3]. 3.1 Základní konstrukce TEM Transmisní elektronový mikroskop se skládá ze čtyř hlavních částí: tubusu s elektronovou optikou, vakuového systému, nezbytné elektroniky (napájení čoček pro zaostřování a vychylování elektronového paprsku a zdroj vysokého napětí pro zdroj elektronů) (Obr. 3). Obrázek 3: Konstrukce transmisního elektronového mikroskopu. Převzato z [3]. 3.2 Elektromagnetické čočky Jsou tvořeny prstenci (solenoidy) (Obr. 4.) z velmi čistého železa, které jsou zasazené v cívkách napájených stejnosměrným proudem. Elektromagnetické čočky pracují pouze ve vakuu (celý tubus musí být pod vakuem), slouží pouze jako spojky a jsou lehce fokusovatelné. Jestliže cívkami prochází elektrický proud, vznikne mezi pólovými nástavci elektromagnetické pole, které tvoří mezeru v magnetickém obvodu. Zvětšení čoček lze měnit změnou proudu, který cívkami teče. 3.2 Elektromagnetické čočky Jsou tvořeny prstenci (solenoidy) (Obr. 4.) z velmi čistého železa, které jsou zasazené v cívkách napájených stejnosměrným proudem. Elektromagnetické čočky pracují pouze ve vakuu (celý tubus musí být pod vakuem), slouží pouze jako spojky a jsou lehce fokusovatelné. Jestliže cívkami prochází elektrický proud, vznikne mezi pólovými nástavci elektromagnetické pole, které tvoří 121

142 mezeru v magnetickém obvodu. Zvětšení čoček lze měnit změnou proudu, který cívkami teče. To je základní rozdíl mezi magnetickými a skleněnými čočkami. Obrázek 5: Princip sférické vady. Převzato z [4]. Obrázek 6: Princip chromatické vady. Převzato z [4]. Obrázek 4: Magnetické solenoidu ovlivňují dráhy elektronů, které vycházejí z bodového zdroje A a které zakřivení jejich dráhy magnetickém poli cívky, opět protínají její osuv bodě B. Převzato z [2]. Jinak se chovají stejně a mají stejné druhy optických vad, které nejvíce způsobují to, že reálné rozlišení neodpovídá vlnové délce. Sférická (kulová) vada (Obr. 5.) tato vada je velmi důležitá. Z velké části závisí na tvaru a zpracování čočky. Projeví se tím, že zvětšení ve středu čočky je jiné než na okrajích. Odpovídá to různému tvaru fokusace elektronů procházejících středem svazku a na okraji. Řešením bývá použití clonek, pro separaci určité části svazku. Chromatická (barevná) vada (aberace) zvětšení čoček je závislé na vlnové délce elektronů v paprsku. Tuto vadu lze zmenšit co možná největší stabilizací urychlovacího napětí a použitím velmi tenkých preparátů. Bohužel ve svazku se nachází elektrony s různou hladinou energie tj. vlnovou délkou, tím pádem je jejich fokusace elektromagnetickou čočkou rozdílná a vzniká chromatická aberace, spektrum ohnisek elektronů o dané vlnové délce (Obr. 6). Astigmatismus je vadou čoček, která se projevuje tím, že se kruh na preparátu zobrazí jako elipsa. Vzniká nedokonalým tvarem clonek popř. nečistotami v optické soustavě (Obr. 7). Obrázek 7: Astigmatismus čoček. Převzato z [4]. 3.3 Elektronové dělo Elektronové dělo se skládá z katody, tzv. Wehneltova válce a anody. Jako katoda se používá wolframové vlákno, které je přímo žhavené na teplotu C. V posledních letech se staly 122

143 oblíbenými dva jasnější zdroje elektronů, a to elektronová tryska na bázi hexaboridu lanthanu (LaB6), která emituje 10krát více elektronů než wolfram zahřátý na stejnou teplotu, a tryska emitující elektrony vlivem elektrického pole (field emission gun FEG). V tomto případě jsou elektrony "vysávány" z velmi ostrého hrotu silným elektrickým polem. S FEG se tak dá docílit až tisícinásobné elektronové hustoty (Obr. 8). A) B) C) Obrázek 8: A) Wolframové vlákno, B) LaB6 krystal, C) Autoemicní tryska. Převzato z [2]. umísťuje stínítko pokryté nejčastěji ZnS, který je schopen v závislosti na energii a množství dopadajících elektronů emitovat světlo s vlnovou délkou 450 nm. Díky nečistotám je emise posunuta blíže 550 nm, tedy zelenému světlu. Zjednodušeně lze interakce, ke kterým dochází při průchodu elektronového svazku hmotou preparátu, rozdělit do dvou skupin: pružný nebo li elastický rozptyl když urychlený elektron prolétá elektronovým oblakem atomu preparátu, je vychýlen pod úhlem, který je tím větší, čím blíže míjí elektron jádro a čím větší je náboj jádra. Dokonce tento úhel může dosáhnout až 180 a elektron může být zpětně odražen (Obr. 9). V praxi od elektronového zdroje vyžadujeme, aby poskytoval koherentní svazek elektronů, což znamená, že by elektrony měly vycházet z bodového zdroje, měly by mít stejnou energii a dokonce by se měla jejich průvodní vlna nacházet ve stejné fázi. Trysku tvoří katoda emitující elektrony a anoda s kruhovým otvorem ve svém středu, která je přitahuje a dává jim dostatečné zrychlení na průlet tubusem mikroskopu. Vlákno katody je vystředěno do otvoru tzv. Wehneltova válce, který má záporné předpětí a díky jehož působení se okolo emitujícího hrotu katody vytvoří mrak elektronů. Ty jsou potom postupně odsávány z otvoru Wehneltova válce k anodě a ty které mají správný směr a rychlost, prolétnou dále do tubusu. Tímto jednoduchým způsobem je zajištěna dostatečná zásoba elektronů s přibližně stejnou počáteční energií tak, aby elektronový paprsek měl výše zmíněné vlastnosti. 3.4 Zobrazovací soustava Abychom mohli vidět elektrony, které prošly preparátem a zobrazovacím systémem, je třeba převést informace, které nesou, do oblasti viditelného světla. K tomuto účelu se na dno tubusu Obrázek. 9: Interakce elektronu při průletu vzorkem. Převzato z [2]. Při těchto dějích se předpokládá, že se energie primárních, elasticky rozptýlených elektronů nemění. Jejich počet elektronů závisí na součinu hustoty a tloušťky preparátu v místě průchodu. Část elektronů rozptýlených s dostatečně velkým 123

144 úhlem je zachycena objektivovou clonou a tím vyřazena z tvorby obrazu na stínítku. V důsledku toho se mění intenzita elektronového svazku a vzniká kontrast obrazu. Ve standardním transmisním elektronovém mikroskopu první dva jevy připívají ke vzniku běžného obrazu u biologických preparátů, zatímco u krystalických (materiály jiného než biologického původu) preparátů jsou nejdůležitějšími faktory tvořícími obraz fázový a difrakční kontrast [1, 3, 7]. 4 Rastrovací elektronový mikroskop Rastrovací neboli skenovací elektronový mikroskop (dále SEM) je přístroj určený k pozorování povrchů. Jedná je o určitou obdobu světelného mikroskopu, kde světelné paprsky nahrazuje elektronový svazek a obraz je tvořen sekundárními nebo odraženými elektrony. Výhodou této metody je dále generování dalších signálů, při interakci primárního svazku se vzorkem, jako např, rtg. záření, Augerovy elektrony, katodoluminiscence, které nesou mnoho dalších informací. Při jejich detekci je možné určit např. prvkové složení preparátu v dané oblasti a při porovnání s vhodným standardem určit i kvantitativní zastoupení jednotlivých prvků. Zjednodušené schéma skenovacího elektronového mikroskopu je na (Obr. 10). Zdrojem elektronů ve špičce tubusu je přímo žhavené wolframové vlákno. Vzhledem k tomu, že v SEM je požadován větší emis-ní proud, je třeba po každém zapnutí mikroskopu zkontrolovat vystředění katody a žhavit ji přesně do nasyceného stavu. Rozlišovací schopnost u SEM do značné míry závisí na průměru zfokusovaného svazku primárních elektronů dopadajících na povrch preparátu a hodnota tohoto průměru je zase výrazně ovlivněna průměrem katody. Proto rozlišovací schopnost přístrojů s wolframovou přímo žhavenou katodou se pohybuje mezi (10 15) nm [4]. Obrázek 10: Schéma rastrovacího elektronového mikroskopu. Převzato z [8]. V současné době stávají přístroje s autoemisní tryskou. Mnohem menší průměr hrotu katody a vysoká emise umožňují dosáhnout rozlišovací schopnosti pod 1 nm. Elektrony jsou urychleny potenciálem mezi katodou a anodou, která má ve svém středu kruhový otvor, kudy prolétají primární elektrony do soustavy elektromagnetických čoček. V SEM při prohlížení preparátů se používá urychlovací napětí do 30 kv. Výběr urychlovacího napětí závisí především na typu preparátu, zvětšení, kterého chceme dosáhnout a do jaké míry se nabíjí povrch prohlíženého preparátu a sekundární elektrony jsou generovány z větší oblasti vzorku. Snižováním urychlovacího napětí lze zčásti eliminovat nepříznivé efekty nabíjení, na druhé straně se zvyšuje chromatická a sférická vada čoček, což vede ke snížení rozlišovací schopnosti. Elektromagnetickými čočkami zkoncentrovaný paprsek primárních elektronů je před dopadem na povrch preparátů rozpohybován vychylovacími cívkami tak, že pokryje 124

145 řádky rastruje malou plošku. Synchronně s primárním svazkem elektronů rastruje i paprsek tvořící obraz na obrazovkách mikroskopu [5]. Při dopadu elektronů na vzorek může nastat několik případů, některé elektrony jsou absorbovány v závislosti na tloušťce a složení vzorku viz (Obr. 11). To způsobuje tzv. amplitudový kontrast obrazu. Další elektrony jsou rozptýleny pod malými úhly, jejichž velikost závisí na složení vzorku, to způsobuje tzv. fázový kontrast v obraze. V krystalických preparátech jsou elektrony rozptýleny do velmi odlišných směrů, které jsou v závislosti na krystalické struktuře. To způsobuje tzv. difrakční kontrast obrazu. Některé z dopadajících elektronů mohou být odraženy, nazývají se zpětně odražené elektrony tzv. backscattred electrons. Obrázek 11: Schéma signálů vyzářených po dopadu elektronového svazku na vzorek. Převzato z [9]. Dopadající elektrony mohou také způsobit to, že vzorek sám emituje elektrony (Obr. 12). Takto emitované elektrony se nazývají sekundární elektrony, které používáme pro primární zobrazené topografie vzorku. Elektrony, které dopadají na preparát, způsobují, že vzorek emituje rentgenové paprsky, jejichž energie a vlnová délka závisí na chemických prvcích obsažených v preparátu. V některých případech mohou elektrony způsobit u preparátu emisi fotonů (nebo světla). Tento jev se nazývá katodoluminiscence. Obrázek 12: Schéma vzniku odraženého nebo emise sekundárního elektronu vlivem průletu primárního elektronu. Převzato z [4]. V dolní části tubusu se nachází komora s manipulačním stolkem. Ten umožňuje pohybovat s preparátem, otáčet ho i naklánět. V současné době se téměř standardně vybavují mikroskopy motorovým stolkem, který je možno ovládat pomocí joysticku nebo myši řídícího počítače. Velkou předností tohoto uspořádání je například možnost jednoduše zaznamenávat pohyb po preparátu a vracet se do jednotlivých prohlížených míst. V blízkosti preparátu jsou umístěny detektory jednotlivých signálů: např. sekundárních a odražených elektronů, rtg. záření. Samostatnou kapitolou je detekce signálu v SEM. Interakce mezi primárními elektrony a atomy preparátu můžeme rozdělit do dvou skupin: elastické kolize, které mají na svědomí vznik zpětně odražených elektronů a neelastické, při kterých dochází k předávání energie primárních elektronů atomům vzorku a následně k uvolnění sekundárních a Augerových elektronů, rtg. záření a katodoluminiscenci. K zobrazení povrchu preparátu se v SEM využívají sekundární elektrony. Od zpětně odražených elektronů se odlišují svojí nízkou energií a rychlostí. Aby byly schopné dostat se k detektoru sekundárních elektronů, je třeba je přitáhnout mřížkou s předpětím okolo 10 kv. Pro jejich detekci se využívá detektor sekundárních elektronů Everhart Thornley. Patří mezi nejčastěji používané. Je tvořen scintilátorem (např. YAG), který po dopadu uvolní záblesk světla ze středu viditelné oblasti ( ) nm, jehož intenzita je přímo úměrná energii elektronů, které ho vyvolaly. Potenciál 10 kv přivedený na tenký kovový film na přední straně scintilátoru urychlí 125

146 dopadající elektrony, aby měly energii dostatečnou na vyvolání světelného pulsu. Světlo je dále vedeno světlovodem a komoru SEM opustí průchodem křemenným okénkem. Mimo vakuum je umístěn fotonásobič, který zachytí světelný signál a převede je na elektrický, přičemž dojde k zesílení. Dalším detektorem je detektor zpětně odražených elektronů. Jeho umístění je většinou mezi vzorkem a pólovým nadstavcem. Jeho účinnost záchytu přesahuje 50 %. Dalším oblíbeným typem je polovodičový detektor využívající p n přechodu nebo Schottkyho diodu. Při skenování povrchu dochází několika rušivým jevům např. nabíjení povrchu preparátu, na který dopadají záporně nabité primární elektrony, v případě, malé vodivosti. Důsledkem je odklon primárního svazku elektronů, které zahltí detektor sekundárních elektronů. Teplo, které lokálně ve vzorku uvolňují primární elektrony, je velké a projevuje se např. kontaminací skenované oblasti, pohybem preparátu pod svazkem nebo přímo jeho poškozením, např. popraskáním. Dalším negativním jevem, který znesnadňuje interpretaci získaných snímků, je hranový jev. Dopad primárního svazku na hranu zvětšuje oblast, ze které se mohou uvolnit sekundární elektrony, a v důsledku toho se zvyšuje signál z detektoru. Ve výsledném obraze se hrany zobrazují jako přesvícené oblasti. Kvalita výsledného zobrazení závisí na řadě parametrů např. volba urychlovacího napětí, kdy vyšší hodnoty vedou k lepší rozlišovací schopnosti, ale mohou způsobit nabíjení. Volba směrem k nižším hodnotám snižuje rozlišovací schopnost, ale také snižuje nepříznivé nabíjecí jevy. Mezi další parametry patří výběr pracovní vzdálenosti, kdy s rostoucí pracovní vzdáleností roste hloubka ostrosti [1, 2, 7, 8]. 5 EDX a WDX detekce Při interakci primárního svazku dochází k uvolňování rtg. záření. To je možné detekovat a využívat pro materiálovou analýzu zkoumaného vzorku. Analýzy pomocí EDX neboli energiová a WDX (Obr. 13) resp. vlnová disperzní spektroskopie se někdy označují společným názvem bodová analýza, protože stanovaní prvkového složení vzorku se provádí ve velmi malém objemu, prakticky v bodě. Další možností elektronové mikroanalýzy (EDX i WDX) je úsečková analýza (též liniový scan, line analysis). V tomto případě se svazek primárních elektronů pohybuje po povrchu vzorku po vybrané úsečce, buď po jednotlivých měřících bodech, nebo kontinuálně. Výsledkem je graf zobrazující změnu obsahu prvků ve zvolené linii (používá se například pro studium zonálnosti minerálů). Dále je možno využít plošnou analýzu (též mapping, scanning, area analysis), metodu zobrazující distribuci (rozložení) prvků v ploše preparátu. Primární paprsek dopadá postupně v hustě naskládaných řádcích na povrch preparátu (tzv. rastrování, obdobný princip jako v televizní obrazovce). V jednotlivých bodech je vybuzeno rentgenové záření, které se po detekci a vyhodnocení projeví jako svítící body na obrazovce, indikující přítomnost vybraného prvku. Výsledkem je mapa rozložení prvku v ploše vzorku. A) B) Obrázek 13: Schéma umístění a) WDX a b) EDX systému na SEM mikroskopu. Převzato z [10]. Rentgenové záření vybuzené dopadem svazku primárních elektronů má složku spojitou a charakteristickou. Charakteristická složka je tvořena sérií spektrálních čar, které vznikají zaplňování ionizovaných energetických hladin v obalech atomů. Charakteristické záření tak poskytuje informaci o prvkovém složení vzorku, protože 126

147 vlnová délka čar je pro každý prvek charakteristická a nezávisí na energii primárních elektronů. Děj se odehrává ve velmi malé oblasti (řádově 1 10 µm 3 ) hruškovitého tvaru pod povrchem vzorku, proto je možno metodami elektronové mikroanalýzy analyzovat velmi drobné objekty (už od velikosti jednotek µm). Rentgenové záření je detekováno a analyzováno rentgenovými spektrometry, které jsou součástí mikroanalyzátoru. Ve spektru charakteristické rentgenové záření lze jednotlivé spektrální čáry indikovat dvěma způsoby: podle vlnových délek nebo podle energie. Na základě toho rozlišujeme energiově disperzní analýzu a vlnově disperzní analýzu (obě možnosti jsou často umožněny v jednom přístroji). Energiově disperzní systém (EDX) analyzuje rentgenové spektrum na základě energie jednotlivých čar. Záření dopadá na polodičový detektor s p n přechodem, kde je přeměněno na napěťový impuls. Tento signál je veden do zesilovače a odtud do počítače, kde je automaticky vyhodnocován. Mez stanovitelnosti je pro různé prvky různá, pro prvky mezi 5 B až 10 Ne se pohybuje mezi (1 2) hmot. %, pro prvky od Na výše mezi (0,1 0,2) hmot. %. EDX se tedy 11 používá především ke stanovení kvalitativního složení vzorku a k rychlé (i když méně přesné) kvantitativní analýze. Minoritní prvky je nutno analyzovat pomocí WDX (viz dále). Většina přístrojů neumožňuje měření prvků lehčích než 5 B. EDX analýza s mezí detekce cca 1 % pro lehčí (> B, případně C) a cca 0,1 % pro těžší prvky. Excitovaná oblast má průměr ~ 100 μm, takže drsnost, morfologie, nebo heterogenita povrchu tolik nevadí. Rychlejší, ale méně přesná analytická metoda. Nevýhody: překryv některých prvků (Pb S). Vlnově disperzní systém (WDX) analyzuje rentgenové spektrum na základě vlnové délky jednotlivých čar. Rentgenové spektrum je snímáno vlnově disperzním spektrometrem. Jeho součástí je analyzující krystal (monochromátor), detektor a mechanika pro pohyb krystalu a detektoru. Rentgenové záření dopadá na krystal, kde podle úhlu dopadu dochází k difrakci spektrální čáry o příslušné délce (podle Braggovy rovnice). Všechny ostatní čáry nesplňují Braggovu rovnici a proto nejsou difraktovány. Aby bylo možno analyzovat jiný prvek, je nutno natočit krystal do odpovídajícího úhlu. Součástí elektronového mikroanalyzátoru jsou obvykle tři až čtyři různé vlnově disperzní spektrometry, proto je možno měřit tři až čtyři prvky najednou. Potom se změní nastavení krystalů ve spektrometrech a je možno měřit další tři (čtyři) prvky. Difraktované rentgenové záření se v detektoru přemění na elektrický signál a zpracovává se počítačem. Pomocí WDX je možno poměrně velmi přesně stanovovat obsahy většiny prvků těžších než B. Mez stanovitelnosti této metody je pro B až 5 Ne (0,3 0,5) hmot. %, pro 5 Na a těžší prvky (0,03 0,05) hmot. %. Proto je možno analyzovat i prvky s velmi nízkým obsahem (stopové prvky). Nevýhodou je naopak vyšší časová náročnost. WDX analýza s mezí detekce cca 0,01 % a přesností podstatně přesahující EDS. Nevýhodami jsou nutnost vysoce rovného, tj. dokonale vyleštěného povrchu, dlouhý měřící čas a nutnost práce v hlubokém vakuu (čekání na vyčerpání vzduchu, problémy s porézními a hydratovanými vzorky) [2, 3, 5]. 6 Příprava vzorků Pro přípravu vzorků pro elektronovou mikroskopii obecně platí, že nesmí obsahovat vodu, protože v mikroskopu jsou vystaveny vysokému vakuu a z mokrých preparátů by se voda bouřlivě uvolňovala. To vede k brždění urychlených elektronů, degradaci vzorku a výrazné ovlivněný výsledného obrazu. Příprava vzorků pro TEM nebo SEM analýzu se od sebe výrazně liší. Zatímco při SEM je možno do mikroskopu vkládat celé vzorky u TEM je omezení pouze na nepatrné objekty (suspenze virů, bakterií nebo izolovaných buněčných organel). V opačném případě je nutné vzorky nakrájt na velmi tenké řezy méně než 100 nm. Silnějšími preparáty by neprošel elektronový svazek nebo by byl silně 127

148 zatížen chromatickou vadou bez možnosti výsledný obraz dobře zaostřit. Výroba řezu probíhá zalitím vzorku do pryskyřice a následně vytvoření řežu, které probíhá na přístroji nazývaném ultramiktoron. Ten byl vyvinut na konci padesátých let, Na pohyblivé rameno ultramikrotomu je pevně připevněn preparát a proti němu je postaven pevný nůž s vaničkou naplněnou vodou tak, aby dosahovala k řezné hraně. Po přiblížení nože a vzorku ukrojené ultratenké řezy sklouzávají z řezné hrany na hladinu, kde již je možné celkem pohodlně s nimi manipulovat a nabírat je na síťky. Příprava vzorku obsahujících vodu předchází fixace vzorku (roztok glutaraldehydu), kdy jsou zesíťovany proteinové struktury v buněčných stěnách, zvýšením kontrastu (oxid osmičelý) a následnou dehydratací vzorku. U vzorků pro SEM je situace o něco jednoduší. Lze je sice vložit v surové nativní formě ovšem musejí i tak splňovat několik podmínek. bezprašnost, stabilita ve vakuu, stabilita vůči působení elektronového svazku, schopnost produkovat dostatečné množství sekundárních elektronů, dostatečná vodivost vzorku jako prevence vůči nabíjení primárním svazkem. se v dnešní době ukazuje použití kryotechniky pro fixaci vzorku a jeho pozorování za snížené teploty. V oblasti práce s biovzorky se jeví jako velmi perspektivní metoda, která umožňuje pozorování bez větších deformací. Její nevýhodou je relativně drahá pořizovací cena a problematické udržování stability a skladování vzorků [2]. 7 Reference [1] Miroslav Karlík, Transmisní elektronová mikroskopie: pohled do nitra materiálů, 2005, Čs. čas.fyz. 55, [2] Jana Nebesářová, Elektronová mikroskopie pro biology, 2002, dostupné z paru.cas.cz/lem/book/index.html [3] Elektronová mikroskopie TEM, studijní texty ČVUT, dostupné z cvut.cz/elektronova mikroskopie/216 [4] Mikroskopie, studijní texty VŠCHT, dostupné z bioinfo/lekce/mikroskopie.pdf [5] Goldstein, J et al, Scanning Electron Microscopy and X ray Microanalysis, [6] Kage S, Kudo K et al., 2001 A simple method for detection of gunshot residue particles from hands, hair, face, and clothing using scanning electron microscopy/wavelength dispersive X ray (SEM/WDX). J Forensic Sci;46(4): V případě splnění výše popsaných podmínek bývají vzorky nejčastěji zafixovány na hliníkový substrát a umístěny do mikroskopu. V opačném případě, že se jedná o nestabilní, nevodivé nebo biologické vzorky je nutné zvolit některou možných úprav. Nejčastějším řešením bývá pokovení tenkou vrstvou zlata, které eliminuje nabíjení vzorku primárním svazkem. Pokud se jedná o biologické vzorky, je nutné použití chemické fixace a dehydratace. Veškeré výše popsané úpravy vzorků, způsobují jeho částečnou deformaci a popř. zastínění některých detailů. Pozorujeme tedy modifikovaný obraz původního vzorku. Jako další moderní alternativou 128

149 POZNÁMKY 129

150

151 12 MOŽNOSTI 12 Markéta KAPILÁRNÍ ELEKTROFORÉZY V NANOTECHNOLOGIÍ Vaculovičová

152

153 1 Kapilární elektroforéza Elektroforéza je účinná elektromigrační metoda využívající separace nabitých částic v elektrickém poli na základě jejich elektroforetických mobilit. V kapilární elektroforéze (CE) dochází k separaci v tenké kapiláře, na jejíž konce je vloženo konstantní stejnosměrné napětí (Obr. 1). Výhodou tohoto uspořádání je především vysoká účinnost, nízká spotřeba chemikálií a dávkovaných vzorků, krátké časy analýz nebo široké uplatnění v oblasti jak anorganické tak organické chemie nebo biochemie. v roce 1974 R. Virtanen převedl CZE do skleněných kapilár ( ) µm. Teflonové kapiláry (200 µm) použil v roce 1979 F. Mikkers a do kapilár o rozměrech 75 µm převedli elektroforézu J. Jorgenson, K. Lukacs v roce Koncem osmdesátých let (1988) vznikl první komerční přístroj (Beckman Instruments) [1]. Metoda je založena na rozdílné rychlosti pohybu iontů v elektrickém poli, která je dána vztahem (1), v = µ. E, (1) kde v je rychlost, μ je elektroforetická mobilita a E je intenzita elektrického pole. Na iont v CZE působí dvě, navzájem opačně orientované síly, které jej udržují v rovnoměrném přímočarém pohybu, síla elektrická F e (2) a síla třecí F f (3), F e = q. E, (2) F f = 6π η r v, (3) Obrázek 1: Schéma CE. 1.1 Historie kapilární elektroforézy Jako separační metoda využívající elektrického pole, které způsobuje pohyb nabitých částic v matrici, byla elektroforéza zavedena již v roce 1937 Tiseliem, který za práci v této oblasti dostal v roce 1948 Nobelovu cenu. Elektroforéza se začala vyvíjet až v padesátých letech, kdy byla použita i pro aminokyseliny a dokonce anorganické ionty. Původně byla pro elektroforézu používána média jako papír, škrobový gel, acetát celulózy nebo polyakryamidový gel. Gelový nosič se stále používá k separaci proteinů i v kapilárním měřítku (CGE). Kapilární formát se vyvíjel postupně. Již v roce 1958 S. Hjertén provedl zónovou elektroforézu v rotujících trubicích (1 3) mm, později kde q je náboj iontu, E je intenzita elektrického pole, η je viskozita, r je poloměr iontu a v je rychlost iontu [2]. 1.2 Jevy ovlivňující průběh CE Průběh elektroforézy a její účinnost ovlivňuje mnoho faktorů a jevů, které v kapiláře probíhají Elektroosmotický tok Elektroosmotický tok (EOF) je efekt, který vzniká průchodem proudu kapilárou s elektrolytem. Jde o pohyb vnitřního objemu křemenné kapiláry v důsledku pohybu elektrické dvojvrstvy. Ta se vytvoří na vnitřním povrchu disociací, případně protonizací hydroxylových skupin křemene, jejichž náboj je následně kompenzován opačně nabitými ionty z roztoku. Důsledkem EOF je především tok kapaliny s odlišným profilem ve 131

154 srovnání s profilem hydrodynamickým (Obr. 2), což má za následek daleko menší rozšíření zón analytu a tím i výrazně ostřejší píky než v chromatografii [2]. Obrázek 2: A) Laminární tok, B) EOF. Existuje mnoho způsobů jak EOF ovlivnit, mezi nejdůležitější patří: ph použitého elektrolytu, iontová síla roztoku, teplota a pokrytí kapiláry. Vzniku EOF v kapiláře se využívá pro analýzu všech analytů včetně nenabitých částic a aniontů, jejichž elektroforetická mobilita je menší než mobilita EOF Jouleovo teplo Jednou z vlastností kapilární elektroforézy je vysoký poměr povrchu vůči objemu kapaliny, který způsobuje relativně dobrý odvod tepla, vznikajícího průchodem proudu elektrolytem. Pokud je však proud příliš vysoký, dochází v důsledku tepelné distribuce k urychlení částic ve středu kapiláry a tím k rozšíření zóny analytu. Za limitní hodnotu tepelného výkonu, při které k tomuto rozšíření nedochází, je považován výkon vztažený na délku kapiláry 1 W/m. Nejjednodušším řešením je externí chlazení systému, které je zajištěno vzduchem nebo chladicí kapalinou. Dalšími způsoby, jak snížit zahřívání systému, je například snížení intenzity elektrického pole, zúžení vnitřního průměru kapiláry, případně snížení vodivosti elektrolytu ovlivněním jeho iontové síly nebo koncentrace [2] Sorpce Sorpce je jev, který způsobuje vznik nežádoucích nesymetrických píků v důsledku interakce analytu s vnitřním povrchem kapiláry. K nejjednodušším řešením, jak zamezit sorpci patří modifikace elektrolytu například přidáním vhodného organického rozpouštědla (EtOH, MeOH, ) nebo použití extrémních hodnot ph. Dalším řešením může být také použití kapilár s vnitřním pokrytím ať už dynamickým nebo trvalým. 1.3 Detekce v CE Možnost spojení kapilární elektroforézy s mnoha různými detekčními metodami umožňuje stanovení velmi širokého spektra analytů od jednoduchých anorganických iontů až po složité biomolekuly. Asi nejčastěji se CE spojuje s absorbanční detekcí, která je vhodná pro většinu analytů. Další oblíbenou technikou je fluorescenční detekce a to především pro svou extrémní citlivost. V poslední době se také často využívá spojení s hmotnostním spektrometrem, díky kterému lze získat také informace o struktuře studované látky. Elektrochemické metody jako například amperometrie nebo vodivostní detekce jsou vhodné pro elektroaktivní molekuly a anorganické ionty, které nefluoreskují ani neabsorbují světelné záření. Limity detekce, které jsou základní charakteristikou každé detekční techniky, a základní výhody a nevýhody jednotlivých metod jsou shrnuty v Tabulce

155 Tabulka 1 : Detekční limity pro jednotlivé detekční techniky a jejich výhody/nevýhody [2]. Detekce D e t e k č n í limit (mol) Koncentrační detekční limit (mol/l) *předpokládá injektovaný objem 10 nl LIF Amperometrická Vodivostní CE v nanotechnologiích vs. nanotechnologie v CE Na spojení CE a nanotechnologií můžeme pohlížet z několika různých úhlů. 2.1 CE analýza vzorků extrahovaných pomocí nanomateriálů Výhody /nevýhody Absorbanční Univerzální,DAD poskytuje spektrální informaci E x t rém ně citlivá, často vyžaduje derivatizaci analytů Citlivá, selektivní pro elektroaktivní analyty Univerzální MS poskytuje strukturní Citlivá, informaci Jako nejjednodušší se nabízí využití CE jako metody pro analýzu vzorků, které byly podrobeny specifické před-separaci pomocí nanomateriálů. Především izolace analytu pomocí magnetických částic je v dnešní době již poměrně běžná v analytické praxi. Je tomu tak především z toho důvodu, že povrch magnetických částic lze relativně snadno modifikovat pro izolaci požadovaného analytu. Pro analýzu nukleových kyselin se využívá modifikace povrchu částic pomocí komplementární sekvence, izolaci proteinů lze provádět pomocí protilátkami modifikovaných nanočástic. Princip celé izolace je znázorněn na Obr. 3. A) B) C) D) E) F) Obrázek 3: Postup extrakce pomocí magnetických částic. A) přidání magnetických částic modifikovaných nukleotidovou sekvencí komplementární (oranžová) k sekvenci zájmu (modrá); B) hybridizace komplementárních sekvencí; C) imobilizace částic na stěnu pomocí magnetu a odstranění nežádoucích interferentů (zelená); D, E) eluce požadovaného analytu pomocí zvýšené teploty (lze použít i chemickou eluci); F) imobilizace částic na stěnu pomocí magnetu a odsátí vyizolovaného analytu. Stejným principem lze provádět i analýzu produktů enzymatického štěpení [3]. Vybraný enzym (např. trypsin) lze imobilizovat na magnetické mikro- nebo nanočástice a po provedení příslušné enzymatické reakce s proteinem zájmu lze vzniklé peptidy analyzovat pomocí CE. Dalším běžně používaným praktickým příkladem je čištění produktů sekvenační reakce [4]. 2.2 CE pro charakterizaci nanomateriálů Ve druhém případě lze CE využít jako účinného nástroje pro charakterizaci nanomateriálů jako jsou kvantové tečky, kovové, křemenné nebo uhlíkové nanočástice. Pomocí CE lze monitorovat velikost mikro- a nanočástic. Obrázek 4: Separace latex-polystyrenových nanočástic o různé velikosti. Převzato z [5]. 133

156 Na Obr. 4 převzatém z práce Ute Pyell [5] je ukázána separace směsi latex-polystyrenových nanočástic o různých velikostech. Jak je vidět na Obr. 5 převzatém z práce C. Carrillo-Carrion a spoluautorů [6] pomocí CE je možné separovat kvantové tečky stejně jako jiné nanočástice na základě jejich velikosti. Ovšem důležitější je, že vzhledem k tomu, že velikost kvantových teček udává současně jejich fluorescenční vlastnosti (emisní maximum), lze podle jejich migračního času určit také vlnovou délku jejich emisního spektra (samozřejmě v porovnání se standardem). t (min) Obrázek 6: Elektroferogramy β-amyloid peptidu po interakci s nanočásticemi. Dalším příkladem je interakce kvantových teček s hovězím sérovým albuminem na obrázku 7 [7]. A) Obrázek 7: CE separace kvantových teček a jejich komplexu s hovězím albuminem. B) Obrázek 5: A) elektroferogram směsi kvantových teček S1 3,1 nm; S2 3,6 nm; S3 4,3 nm; S4 4,9 nm; B) fluorescenční spektra jednotlivých druhů kvantových teček. CE je efektivním nástrojem také pro monitorování interakcí různě povrchově modifikovaných nanočástic s příslušnými analyty. Práce D. Brambila a jeho spolupracovníků studuje interakce β-amyloid peptidu (Aβ 1-42 ), který slouží jako marker Alzheimerovy choroby, s polymerními částicemi. Na Obr. 6 je jasně vidět změna (pokles) CE signálu v závislosti na době inkubace peptidu s částicemi. 2.3 Nanomateriály pro zvýšení efektivity CE analýzy Dalším úhlem pohledu na spojení CE a nanotechnologií je využití nanomateriálů pro zlepšení parametrů CE. Pomocí nanomateriálů lze zlepšit jak separační účinnost, tak citlivost a univerzálnost detekce Nanomateriály pro zlepšení separace Nanomateriály mohou být naplněny do kapilárních kolon pro vytvoření stacionární fáze podobně jako v chromatografických technikách. Ovšem při zachování separace pomocí elektromagnetického pole vzniká nový separační mód kapilární elektrokinetická chromatografie. Tento separační mód lze rovněž 134

157 2.3.2 Zlepšení detekce Detekce analytů závisí především na jejich vlastnostech a na požadované citlivosti. Jak již bylo řečeno, nejcitlivější detekční metodou je laserem indukovaná fluorescenční (LIF) detekce, která poskytuje extrémně nízké limity detekce. Na druhou stranu aplikovatelnost LIF detekce je omezena na fluoreskující analyty. Kvantové tečky se díky svým výjimečným fluorescenčním vlastnostem vysoký výtěžek fluorescence, široké excitační a úzké emisní pásy, pokrytí širokého rozsahu možných emisních maxim jeví jako vhodné fluorescenční značky pro značení nefluoreskujících molekul (např. peptidy, proteiny, nukleové kyseliny, aj.). Samy o sobě jsou ale kvantové tečky jako značky nevhodné, protože se na jejich povrch nenachází selektivně reagující skupiny, které by umožnily značit požadované analyty. Z toho důvodu je třeba povrch kvantových teček modifikovat a tím dosáhnout požadované reaktivity a selektivity. Příkladem takové modifikace je pokývání povrchu kvantových teček streptavidinem, který díky své obrovské afinitě k biotinu umožní konjugovat kvantovou tečku s analytem (například nukleovou kyselinou), který by modifikován biotinem. Existuje relativně široké spektrum možností jak modifikovat povrch kvantových teček (viz Obr. 10). Přehled těchto možností je shrnut v práci Algar et al. [9]. Další oblastí, ve které lze využít kvantových teček je elektrochemiluminiscenční (ECL) depoužít v uspořádání tzv. PLOT kolon (porous layer open tubular column), kdy je na vnitřním povrchu kapiláry vytvořena tenká vrstva polymeru, který díky své pórovitosti funguje jako stacionární fáze. Tyto polymery mohou být jednoduše nahrazeny nanomateriály (např. uhlíkovými nanotrubicemi), jak je ukázáno na Obr. 8. A) B) C) s vnitřním povrchem kapiláry. Sorpce na stěnu kapiláry snižuje rozlišení i kapacitu separace a v některých případech není separace možná vůbec (všechen analyt se nasorbuje na povrch kapiláry). Z toho důvodu je třeba tuto sorpci omezit nebo v ideálním případě úplně eliminovat. Dalším faktorem je elektroosmotický tok (EOF), jehož směr a elektroforetická mobilita mají na CE separaci výrazný vliv. Manipulace s EOF v závislosti na náboji analytu je jednou z běžných součástí optimalizace CE metody. Obrázek 8: A) standardní PLOT kolona, B) uhlíkové nanotrubice imobilizované na stěně kapilární kolony, C) rozhraní mezi kapilární stěnou a nanotrubicovou vrstvou. Další možností je přidání nanočástic do separačního elektrolytu a tím vytvoření pseudostacionární fáze. Tímto způsobem lze použít jak polymerní, zlaté nebo křemenné nanočástice, tak i uhlíkové nanotrubice nebo dendrimery. Na Obr. 9 je příklad separace osmi analytů za přítomnosti pěti různých koncentrací uhlíkových nanotrubic v separačním elektrolytu. Obrázek 9: Vliv koncentrace SC-SWNTs (surfactant coated single wall carbon nanotube) na separaci 8 analytů (A) bez SC-SWNTs, (B) 1,5 mg/l SC-SWNTs, (C) 3,0 mg/l SC-SWNTs, (D) 4,5 mg/lsc-swnts, (E) 6,0 mg/l SC-SWNTs. 1. epikatechin, 2. epigalokatechin galát, 3. epikatechin galát, 4. k. kávová, 5. galová, 6. k. 3,4-dihydroxybenzoová, 7. kvercetin, 8. kempferol [8]. Jedním z nejdůležitějších jevů, který výrazně ovlivňuje CE separaci, je interakce analytů 135

158 Obrázek 10: Možnosti funkcionalizace povrchu kvantových teček převzato z [9]. Obrázek 11: Princip elektrochemiluminiscenční detekce s využitím kvantových teček. Převzato [10]. tekce. Na rozdíl od fluorescenční detekce není pro ECL detekci potřeba zdroje excitačního záření, energie pro excitaci je molekule dodávána chemickou reakcí (Obr. 11). Naproti tomu například uhlíkové nanotrubice lze využít pro modifikaci elektrod a ty následně pro elektrochemickou detekci. Nanočásticemi modifikované elektrody mají větší povrch a tím i větší citlivost než nemodifikované elektrody (Obr. 12). 136

159 A) B) šení separace, zvýšení rozlišení nebo pro přidání dalšího separačního principu jako je interakce se stacionární fází. Také v oblasti detekce mohou nanomateriály výrazně zlepšit citlivost což bylo demonstrováno nejen u elektrochemické ale i chemiluminiscenční a fluorimetrické detekce. C) Obrázek 12: Elektoferogramy A) antioxidantů: (1) arbutin, (2) phloridzin, (3) catechin, (4) rutin, (5) kys. askorbová; B) vůní: (1) vanillic alcohol, (2) ethyl maltol, (3) maltol, (4) ethyl vanillin, (5) vanillin; C) ve vodě rozpustných vitaminů: (1) pyridoxine, (2) vitamin C, (3) kys. listová analyzovaných pomocí elektrochemického detektoru (a) SPE bez nanotrubic (b) SPE modifikovaného SWCNT, (c) SPE modifikovaného MWCNT-A, (d) SPE modifikovaného MWCNT-B. Převzato [11]. 3 Závěr Závěrem lze říci, že nanotechnologie a kapilární elektroforéza si mohou vzájemně poskytnout mnoho výhod. CE je účinným nástrojem pro charakterizaci nanočástic, zjišťování jejich velikosti, schopnosti fluoreskovat nebo pro ověření efektivity funkcionalizace jejich povrchu. Další důležitou aplikační oblastí je pozorování interakcí nanostruktur s jinými molekulami, chování nanomateriálů v různých prostředích a za různých podmínek. Na druhou stranu nanotechnologie mohou být elegantním a efektivním nástrojem pro zlepšení výkonu CE analýzy. Jak bylo ukázáno, lze nanomateriály využít pro zlep- 4 Reference [1] Pazourek, J. h. f. v. c. e. s. f. s.-f. s. u. u. c. l. v. a.-c. e. p., [2] Lauer, H. L., Rozing, G. P., High Performance Capillary Electrophoresis, Agilent Technologies [3] Xu, X. Q., Deng, C. H., Yang, P. Y., Zhang, X. M., J. Proteome Res. 2007, 6, [4] Tong, X. C., Smith, L. M., DNA Seq. 1993, 4, [5] Pyell, U., Electrophoresis 2010, 31, [6] Carrillo-Carrion, C., Moliner-Martinez, Y., Simonet, B. M., Valcarcel, M., Anal. Chem. 2011, 83, [7] Huang, X. Y., Weng, J. F., Sang, F. M., Song, X. T., et al., J. Chromatogr. A 2006, 1113, [8] Cao, J., Dun, W. L., Qu, H. B., Electrophoresis 2011, 32, [9] Algar, W. R., Tavares, A. J., Krull, U. J., Anal. Chim. Acta 2010, 673, [10] Bertoncello, P., Forster, R. J., Biosens. Bioelectron. 2009, 24, [11] Pumera, M., Escarpa, A., Electrophoresis 2009, 30,

160 138 POZNÁMKY

161 13 PRŮTOKOVÁ INJEKČNÍ ANALÝZA - METODA VYUŽITELNÁ PRO NANOTECHNOLOGIE Ondřej Zítka

162

163 1 Úvod Průtoková injekční technologie je prezentována jako mocný analytický nástroj, jehož vývoj neustále směřuje k větší automatizaci, miniaturizaci, univerzálnosti a cenové dostupnosti. Tato technika tak nachází uplatnění nejen ve forenzní analytické chemii, ale také v dalších oborech analytické chemie. FI technologie přitahuje stále větší pozornost vědců a to díky tomu, že splňuje požadavky pro provedení správné chemické analýzy. Průtoková injekční analýza (Flow Injection Analysis FIA) je analytická metoda, která může být definována jako metoda s plynulým tokem všech roztoků, založená na vstřikování vzorku do proudu reagentů. Díky variabilnosti v instrumentaci a metodologii, FI technologie vynikají svojí automatizací, miniaturizací, univerzálností, jednoduchostí a nízkými provozními náklady. Tyto vlastnosti jsou tak jistým benefitem jak pro základní chemickou analýzu tak pro aplikaci složitějších detekčních systémů. Automatizace zabezpečuje šetrné zacházení s často nebezpečnými a vzácnými vzorky a drahými chemikáliemi. Dále dovolují zavedení one shot on line analytických procedur zahrnujících přípravu vzorků, vyvíjení reakcí, separaci a měření. Mimoto se automatizací zvyšuje přesnost a preciznost a snižují se i náklady na pracovní lidskou sílu. Minimalizace zase umožňuje nižší spotřebu chemikálií a vzorků a tím nedochází k přílišnému zatěžovaní životního prostředí. 1.1 Názvy metod a používaných zařízení V oblasti průtokové injekční analýzy dochází díky univerzálnosti této metody k jejímu čím dál intenzívnějšímu prorůstání do stále více analytických oblastí. Díky tomuto dynamickému rozvoji lze sice všechny typy instrumentace klasifikovat jako průtokové metody avšak podstata funkce jednotlivých zařízení se u některých typů zařízení podstatně liší. Proto vědci, kteří vyvíjejí nové postupy v oblasti FI technik, často své instrumenty pojmenovávají dle technické skladby jednotlivých zařízení. V názvu zařízení je případně skryt i účel, ke kterému bylo zařízení sestaveno. Z technického hlediska se můžeme ve FI metodikách setkat s mnoha zkratkami. BIA bead injection analysis (částicová injekční analýza), CE capillary electrophoresis (kapilární elektroforéza), FI flow injection (průtoková injektáž) FIA flow injection analysis (průtoková injekční analýza), HPLC high performance liquid chromatography (vysokoúčinná kapalinová chromatografie), ICP inductively coupled plasma (indukčně vázaná plasma), MS mass spectrometer (hmotností spektrometr), μsia LOV micro sequential injection analysis laboratory on valve (mikrosekvenční injekční analýza laboratoř na ventilu), MCFIA multi commutation flow injection analysis (multi výměnná průtoková injekční analýza), MPV multi position valve (multi poziční ventil), MPFIA multi pumping flow injection analysis (multi pumpová průtoková injekční analýza), MSFIA multi syringe flow injection analysis (multi syringová průtoková injekční analýza), PP peristaltic pump (peristaltická pumpa), RC reaction coil (reakční cívka), SFA segmented flow analysis (segmentová průtoková analýza), SIA sequential injection analysis (sekvenční injekční analýza), SIC sequential injection chromatography (sekvenční injekční chromatografie), SPE solid phase extraction (extrakce na pevné fázi), 140

164 SP syringe pump (syringe pumpa), TPV two position valve (dvoupoziční ventil). 1.2 Historie FI technologie Potřeba technologických inovací a pokroku v analytických postupech vede vědce k neustálému nacházení nových analytických přístupů a jejich efektivních využití. V padesátých letech minulého století byla představena segmentová průtoková analýza (SFA) [1], která odstartovala využívání a vývoj průtokově založených analýz. Díky plné automatizaci tohoto systému, se SFA snadno stala velmi oblíbenou technikou v klinických laboratořích pro rutinní diagnostiku. Později SFA našla využití i v environmentálních, zemědělských, oceánografických a průmyslových laboratořích. Přesto ale existují nevýhody, a to především nedostatečné odplynování mobilní fáze před vstupem do detektoru a spotřeba poměrně velkých objemů chemikálií a vzorků. Během sedmdesátých let představili Růžička et al [2] první generaci FI technologie, průtokovou injekční analýzu (FIA). Tento systém je složen z peristaltických pump (PP), dvoupozičních chlopní (TPV), reakční smyčky (RC) a detektoru. Výhodou FIA je přímé vstřikování vzorku do protékajícího nosiče. Vzhledem k jednoduchosti nastavení, operací a nízké ceny FIA předčila všechny nevýhody SFA. V roce 1990, Ruzicka et al navrhli novou metodu sekvenční injekční analýzu (SIA), jako druhou generaci FIA, značně vylepšenou a inovovanou [3]. Základní SIA systém je složen z nástřikové pumpy (SP), kapilární smyčky (HC), MPV, RC a detektoru. SIA vyniká významnými výhodami oproti FIA, protože využívá miniaturního plně automatického obousměrného diskontinuálního, přesně seřízeného průtoku. Programovatelnost průtoku umožňuje použití široké škály odlišných chemikálií a analytických metod, zvláště kinetických, které jsou více přesné a preciznější. Navíc použití MPV umožňuje nastavit přesnou automatickou kalibraci. Třetí generací je částicová injekční analýza (BIA), publikována v roce 1993 Růžičkou et al [4]. BIA je kombinací použití částic s plynoucím tokem roztoku do FIA nebo SIA systému. Tato kombinace umožňuje využití pro specifické aplikace, které jsou často vyžadovány například v bioanalýze. V roce 1994 představil Reis et al technologii MCFIA, která vyřešila hlavní problém FIA; a to nepřetržitý průtok [5] mobilní fáze. Multikomunikační FIA je založena na několika nezávislých automaticky kontrolovaných solenoidových mikro pumpách. Cerda et al sestrojili systém multi syringe FIA (MSFIA) [6], který je složen z více syringe pump. MSFIA sebou nese všechny výhody FIA, SIA a MCFIA. Ruzicka et al představili v roce miniaturizovanou verzi SIA, microsia lab on valve, která umožňuje snížit spotřebu chemikálií a množství vzorků [7]. S výjimkou integrovaného micro conduit systému, který má transparentní monolitickou strukturu, jsou tyto použité periferie shodné se SIA systémem. V dalším pokroku byl využit pulzní průtok. Lapa et al navrhli multi pumping FIA systém (MPFIA) [8]. MPFIA systém zahrnuje několik pump, které umožňují řídit ředění mobilních fází, zlepšují směšovací podmínky, přivádějí reagenty a vzorky do analytické dráhy, zastavují vzorek a zajišťují propojení celého zařízení. Všechen extenzivní výzkum věnovaný těmto technologiím, doposud neřešil separaci a multi component determinaci. Tento problém se snažili vyřešit Satinsky et al v roce Byl navržen systém sekvenční injekční chromatografie (SIC) [9]. Základ je postaven na typickém SIA systému s instalovanou krátkou monolitickou kolonou (10 50) mm, která umožňuje efektivní separaci. Následně byla SIC vylepšena vysokotlakým systémem SP a MPV, a tím se zlepšila separace a redukoval se zpětný tlak. 141

165 2 Instrumentace a princip FIA 2.1 Obecné schéma FIA Systém pro realizaci měření se skládá ze zdroje toku kapaliny, kterým může být peristaltická a nebo syringe pumpa, injekčního (dávkovacího) systému, kterým může být buď nízkotlaký šesticestný ventil (FIA) anebo multipoziční ventil (SIA). Dalším důležitým prvkem je reakční zóna, která je tvořena smyčkou nebo reaktorem. Posledním prvkem je detektor, který může být UV, DAD, ICP MS, elektrochemický detektor a další detektory, které jsou uzpůsobeny pro průtok kapaliny. Po nadávkování vzorku ventilem je analyt unášen transportním systémem (kapiláry s průměrem (0,5 1) mm), prochází přes reakční zónu a dále vystupuje na detektor, který má obvykle průtokové uspořádání. 2.2 Doprava kapaliny Nosný proud kapaliny je ve FIA systému zabezpečen pumpou nebo více pumpami u složitějších systémů. Nejvíce se používají dva typy pump. Peristaltická pumpa je využitelná pro kontinuální tok kapaliny po velmi dlouhou nebo časově neomezenou dobu. Pumpa obsahuje otočnou hlavici s určitým počtem válečků, které tlačí na hadičku, nejčastěji silikonovou, o definovaném průměru proti opěrné ploše. Rychlost průtoku je tak definována průměrem hadičky a také rychlostí otáčení hlavy pumpy. Peristaltické pumpy mohou být vybaveny dvěma a více válečky. Vyšší počet válečků zaručuje nižší pulzování toku kapaliny v systému. Pulzace je nežádoucím faktorem při průchodu kapaliny detektorem kdy způsobuje vlnění základní linie a tak snižuje kvalitu detekce. Dalším typem je syringe pumpa, která je vybavena pístkem a krokovým motorem, který zabezpečuje jeho velmi rovnoměrné stlačování. Díky tomu má syringe pumpa velmi nízkou úroveň pulzace. Nevýhodou je diskontinuální pracovní cyklus pumpy. V systému musí být pro to nainstalovány ventily pro přesměrování toku kapaliny tak, aby bylo možné nasávat kapalinu z rezervoáru v jednom kroku a pak vypouštět nasátou kapalinu do systému v druhém kroku. V samostatně konstruovaných FIA systémech se většinou používají oba typy těchto pump a to kvůli kombinaci jejich vlastností. Všechny prvky systému jsou většinou integrovány jako jedno zařízení. 2.3 Injekční ventily Injekční ventily jsou potřebné jednak pro přepínání toku kapaliny, jak již bylo zmíněno u syringe pump a dále se využívají k dávkování vzorku do systému. Pro FIA systémy lze použít více typů ventilů. Rozdělit je lze v základě na dva typy a to dvou poziční a multipoziční. Dvou poziční ventil je ideální pro dávkování přesného objemu a často se využívá i v instrumentaci pro vysoko účinnou kapalinovou chromatografii (HPLC), kde je potřeba oddělit vysokotlaký okruh separačního systému od nízkotlakého okruhu dávkovače vzorku. Takovéto ventily mají nejčastěji 6 vstupních cest, které ústí k rotoru ventilu. Tento rotor se otáčí ve dvou polohách a tím vždy spojí dvě cesty, které jsou umístěny vedle sebe. Dvě cesty jsou spojeny s vysokotlakým systémem, další dvě jsou spojeny s nízkotlakým systémem a zbylé dvě jsou spojeny s dávkovací smyčkou. V poloze 1 (LOAD) ventil propojuje dávkovací systém se smyčkou dochází k naplnění smyčky vzorkem. V poloze 2 (INJECT) se ventil pouhým otočením propojí dávkovací smyčku s vysokotlakým systémem a vzorek je injektován do systému. Dávkovací smyčka má definovaný objem, který může být v závislosti na kapacitě systému a jeden až tisíce mikrolitrů. Multipoziční ventily jsou využívané zejména pro potřebu změny zapojení více různých roztoků do systému. Tento ventil vždy propojuje jednu centrální cestu vždy s jednou další možnou cestou. Nejnižší počet možných propojení je dva 142

166 a nejvyšší počet je omezen kapacitou vstupů daného ventilu nejčastěji je to však 6, 8 nebo 10 možných portů. 2.4 Reakční zóna Po nadávkování vzorku do toku reagentu, kterým může být například pufr a nebo derivatizační činidlo, je většinou potřeba rychle a kontrolovaně promíchat obě kapalné složky. To je nutno provést tak, aby došlo k dokonalému smísení a přitom byla zachována nízká disperze zóny vzorku do okolí mobilní fáze. Překážky v toku kapaliny způsobují zvýšení disperze, což snižuje výšku analytického signálu a tím také citlivost metody. Při aplikaci mísení reagencií se vzorkem je však často promíchání nutné aby došlo k žádané chemické reakci, která zajišťuje selektivitu dané metody. V závislosti na dané aplikaci lze použít různé typy reakčních zón. 2.5 Záznam FIA Z FIA analýzy lze získat záznam klasického píku podobně jako u separačních technik, avšak zde se až na výjimky některých systémů o separaci nejedná. Výsledný pík vzniká nástřikem vzorku, který může obsahovat jeden nebo více analytů, které jsou registrovány detektorem. Symetrie získaného píku závisí na kontrole disperze. Příklad signálu z UV detektoru, kde je měřenou veličinou absorbance na ose y s vysvětlením jednotlivých sledovaných parametrů je popsán na obrázku. 2.6 Detektory pro FIA Detektory mohou fungovat na rozdílných principech. UV detektor obsahuje průtočnou kyvetu. Elektrochemický detektor naopak obsahuje průtočnou elektrochemickou celu, která může mít různé uspořádání. Symetrie a kvalita signálu je dána nejen průtokem, ale i mírou disperze a pulzací pumpy. Na obrázku lze vidět vliv rychlosti průtoku na symetrii signálu šířku píku. Detektory používané pro FIA aplikace jsou povětšinou odvozeny od HPLC instrumentů. Avšak jedním z největších výhod FIA systému je miniaturizace, která použití některých typů detektorů jako jsou například detektory ICP OES a nebo MS vylučuje Fluorescenční detektory, které obsahují miniaturizované LED diody nebo lasery mohou, stejně jako elektrochemické detektory, jejichž elektrody mohou být vyrobeny na bázi chipu, být daleko lépe miniaturizovány. Použití různých typů detekce ale stále závisí spíše na aplikačním požadavku dané metody. 3 Využití metody FIA v praxi Metody FIA jsou většinou vyvíjeny za účelem konkrétní aplikace. Díky velké variabilitě použití jednotlivých komponentů si FIA zařízení mohou vědci často stavovat sami jako stavebnici. V dnešní době je k dispozici celá řada funkčních komponent, které lze sehnat od specializovaných výrobců přes internet. Díky tomu jsou FIA metody velmi přístupné různým vědeckým účelům a zejména díky velmi nízkým pořizovacím nákladům získávají stále větší popularitu pro realizaci jednoúčelový analýzy. Složitost systémů je přitom různá podle náročnosti aplikace. Následující kapitoly pouze demonstrují univerzálnost použití FI technik [10]. 3.1 Analýza DNA Vyvíjení metod pro analýzu DNA vyžaduje největší možnou minimalizaci přístrojového vybavení, zabránění možné křížové kontaminace, zredukování objemů používaných chemikálií a vzorků, stejně jako dosažení lepší senzitivity, selektivity a rychlosti. Možnost párování FI techniky s různými detekčními přístupy přináší uspokojující selektivitu a senzitivitu i pro malé stopy DNA pocházející z různých matric. Tyto výhody přináší především fluorescenční a chemiluminiscenční detektory. Literatura uvádí, že limit detekce DNA za použití chemiluminiscenčního detektoru je v rozmezí 143

167 (7, ,2) ng/ml [11, 12, 13, 14, 15, 16, 17]. Nejčastěji se využívají chemické systémy, jako je rhodamin B Ce(IV) [14, 15, 16], Luminol H 2 O 2 [14], Cu 2 +-H 2 O 2 [14] a enzymaticky produkovaný H 2 O 2 [16]. Avšak další chemické systémy jako jsou 9,10 anthrachinon 2,6 disulfonová kyselina etanol [17] a Ce(IV) Na 2 SO 3 Tb(III) fluorochuinolon antibiotikum [18] způsobovaly daleko nižší účinnosti. Účinnost fluorescenčních detektorů zvyšují chemické systémy, kde lze použít Hoechst barvivo [19], ethidium bromid [20], berberin [21] a pikogen [22], naopak 3,3,5,5 tetramethylbenzidin dichlorid fluorescenci snižuje [23]. Použití UV a viditelné spektroskopie také užívaných pro analýzu DNA, je možné dosáhnout limitu detekce až kolem 70 ng/ml. Pro analýzu DNA se také využívá elektrochemická detekce, zejména amperometrická a voltametrická [24, 25, 26] s využitím různých elektrod. Zejména modifikovanou peroxid mercaptopropionovou kyselinou- [24], polypyrolemodifikovanou[25] a tris (2,2 bypridyl) dichlororuthenium(ii) modifikovanou uhlíkovou elektrodou [26]. Avšak jak dosavadní studie naznačují, amperometrická detekce vykazuje lepší limity detekce (> 0,5 µg/ml) oproti voltametrické detekci (> 500 µg/ml). Využití zde nachází i hmotnostní detekce [27] se zapojením do systému FIA, kde je přidáno on line odsolující zařízení, pro eliminaci interferencí Na, K, a Mg iontů. Následně byl vyvinut FIA kapacitní biosenzorový systém, který umožňuje analyzovat i nepatrné množství DNA [28]. Tato metoda je založena na afinitní vazbě mezi imobilizovaným histonem a DNA. Histony jsou imobilizovány za pomocí zlaté elektrody pokryté vrstvou thioktovou kyselinou. Tato metoda poskytuje akceptovatelný limit detekce (0,1 ng/ml) a také široký lineární rozsah (0,01 10 ng/ml). V dalších studiích byla využita FIA s chemiluminiscencí pro analýzu hybridizované a pozměněné DNA [29]. Značená amplifikace, která je založena na bio bar code uzpůsobených magnetických nanočástic slibuje zlepšení senzitivity a detekčních limitů. Je také třeba poznamenat, že cenným přínosem vývoje FI technik pro analýzu DNA je schopnost zpracovaní velkého množství vzorků, a to až (24 112) vzorků/hod. Ze všech FI technologií, však µsia LOV vykazuje nejvyšší efektivitu a to právě díky nízké spotřebě reakčních chemikálií. 3.2 Analýza léčiv Díky zvyšujícím se počtum kriminálních případů požívání, distribuce a výroby omamných látek, nastala potřeba vyvinout metodu, která by byla schopna detekovat jak kvantitativně tak kvalitativně široké spektrum drog a jejich metabolitů z biologických vzorků jako jsou tělní tekutiny nebo vlasy. Nejvíce v těchto analýzách nachází využití GC MS a v neposlední řadě i HPLC nebo kapilární elektroforéza s použitím UV, fluorescenčních, elektrochemických či hmotnostních detektorů. Pro forenzní účely se FI techniky používají také, avšak nedosahují takového zájmu jako ostatní metody. Studie Francisca et al představila použití chemiluminiscenční detekce alkaloidů máku setého z různých biologických matric [30]. FIA [31, 32, 33] a SIA [34] s chemiluminiscenční detekcí lze použít ke kvantifikaci morfinu [35, 31, 33, 34] a heroinu [32], z moči [31], vodných i nevodných tekutin [34] či k přímé kvantifikaci omamných látek ze vzorku drogy [35, 33]. LOD těchto metod je v rozmezí až mol/l. V dalších studiích byl použit ke zvýraznění chemiluminiscenčního záření tris (2,2-bipyridyl)ruthenium(II) pro analýzu kodeinu [36, 37] a heroinu [32] jak vyrobených v laboratorních podmínkách, tak zadržených z ilegálního trhu. Pro analýzu papaverinu se také využívá chemiluminiscenčního záření, které vzniká při jeho reakci s cerem(iv). Limity detekce jsou v rozmezí mol/l. Chemiluminiscence je vynikající a senzitivní metoda pro analýzu i dalších chemických látek extrahovaných z různých matric. Nedávno byla představena nová automatická metoda pro analýzu 144

168 trifluperazinu (49) a morfinu [38] z lidské moči za použití systému SIA. Vzorek byl extrahován pomocí SIA SPE. Následná UV detekce byla zlepšena reakcí trifulperazinu s ceriem (IV) v kyselém prostředí. Při této reakci jsou uvolněny volné radikály trifulperazinu, které jsou snadněji detekovatelné při vlnové délce 500 nm. Pokrokem v analýze a detekci morfinu bylo zreagování morfinu s diazoniovou solí hydrochloridu anilinu. Při této reakci vzniká azo morfinový derivát, dobře detekovatelný při 390 nm. LOD této metody je pro obě látky v rozmezí (18,2 až 23) ng/ml. Senzitivita těchto metod byla zajištěna především zakoncentrováním výchozích látek, jejich chemická přeměna na látky snáze detekovatelné UV detektorem a prodloužení délky průchodu analytu v průtokových celách. Plná automatizace pak z této metody vytváří velmi rychlou technologii (11 vzorků/ hod) s dobrou opakovatelností (RSD < 3,9 %) a nízkou chybovostí (RSD < 4,3 %). Idris et al dále představili jinou metodu pro využití SIA SPE. Ve studii separovali celkem 19 omam ných látek, které se v lidské moči vyskytují jak v alkalické, tak i neutrální nebo kyselé formě [39]. Vzorky byly připraveny pomocí SIA SPE a následně separovány a analyzovány pomocí CE UV. Limity detekce byly u této metody v rozmezí (5 30) ng/ml. FI SPA extrakce je dnes hojně rozšířená metoda, která nachází uplatnění pro přípravu vzorků z mnoha biologických matric. Nejvíce však převažuje FIA SPE, v menší míře je využívána i SIA SPE. Přesto je systém SIA vhodnější a to díky jeho plné automatizaci a nízké spotřebě chemikálií a vzorku. 3.3 Toxikologická analýza FIA systém může být také využit pro rozptýlení vzorku v MS [40]. V jedné ze studií byly odebrány biologické vzorky tkáně z úst, jícnu, trávících orgánů a nelegálně vyrobených drog. Cílem studie bylo identifikovat toxikologicky významné sloučeniny: sildenafil, dihydrocodeine, diphenhydramin, oxprenolol, N methyl- 3,4-methylenedioxyamphetamine, morfin, Obrázek 1: Využití FI technik. Převzato z [10]. 145

169 A A) PC chromatographic pump dumper data software: Clarity injection valve Coulochem III (control module) reaction coil control signal Amperometric cell 5040 auxiliary electrode working electrode output solvent UV ED input referent electrode B) C) B Influence of ph waste C Influence of flow rate Peak height (10%) Peak height (10%) Obrázek 2: A) Uspořádání systému FIA s elektrochemickou a UV detekcí. B) Vliv ph na změnu výšky píku. C) Vliv rychlosti průtoku na výšku píku. Převzato z [43]. amfetamin, kofein, pemoline, orphenadrine, m chlorphenylpeperazin a tramadol. V dalším experimentu byl FIA systém použit pro převedení vzorků plazmy k hmotnostní detekci arseničnanu [41]. Vzorek plazmy byl ošetřen pomocí trichloroethylenem (TCE), arsenitan ve vodné fázi pak zreagoval s pyrrolidindithiokarbamátem (PCD, C 4 H 8 NCSS-) za vzniku As(PDC) 3, který byl následně pomocí FIA přiveden k MS. Tím, že FIA neřeší separaci analytu, je oblíbená a všeobecně používaná pro převedení vzorku do MS. Mezi další výhody pro toto využití patří plná automatizace a možnost takto analyzovat velké množství vzorků. Nevýhodou ovšem zůstává možná koeluce sledovaných látek, což zhoršuje kvalitativní analýzu [42]. Na obrázku je schematicky naznačeno využití FI technik v jednotlivých oblastech chemického výzkumu (Obr. 1). 4 Využití metody FIA v elektrochemii a nanotechnologiích 4.1 Elektrochemická charakterizace látek FIA spojená s elektrochemickou detekcí umožňuje charakterizovat chování elektrochemicky aktivích látek. Zítka et al využili FIA spojenou s amperometrickou detekcí v tandemu s UV detektorem pro studium elektrochemického chování adeninu a jeho dvanácti derivátů (adenosin, 2-aminopurin, 2,6-diaminopurin, 6-benzyl aminopurin, adenosin monofosfát, cyklického adenosinu monofosfátu, nikotinamid adenin dinukleotid, adenosin trifosfát a S adenosyl Lmethionin a tři syntetické deriváty AD3, AD6, a AD9) [43]. Tento systém byl složen z autosampleru temperovaného na 8 C, dvou 146

170 Adenine Adenosine 2-aminopurine 2,6-diaminopurine 6-benzylaminopurine 0.1 µa 0.1 AU 1 min N NH NH 2 N N 0.1 µa 0.1 AU 1 min N HO N O OH OH NH 2 N N 0.1 µa 0.1 AU 1 min H N N N H N NH µa 0.1 AU 1 min N NH NH 2 N N NH µa 0.1 AU 1 min HN N NH N N Peak height (%) UV - 260nm HDV mv Peak height (na) Peak height (%) Peak height (na) Peak height (%) Peak height (na) Peak height (%) Peak height (na) Peak height (%) Peak height (na) Potential (mv) Potential (mv) Potential (mv) Potential (mv) Potential (mv) Obrázek 3: Struktura, získané záznamy a křivky hydrodynamických voltamogramů (HDV) studovaných látek (klasických HDV - zelená a součtový HDV- modrá). Převzato z [43]. 2,6-diaminopurin 9 nm, 6-benzyl aminopurin 30 nm, adenosin monofosfít 30 nm, cyklického adenosinu monofosfátu 20 nm, nikotinamid adenin dinukleotid 30 nm, adenosin trifosfát 100 nm, S adenosyl Lmethionin 6 nm, AD3 3nM, AD6 1nM, a AD9 6 nm. Tyto výsledky ukazují, že FIA spojená s elektrochemickou detekcí je vhodným nástrojem pro studium elektroaktivity a biologické stability důležitých biologických a elektrochemicky aktivních sloučenin jako je adenin a jeho deriváty, které zastávají důležitou roli v metabolismu živých organismů. Z analytického hlediska může být tato modifikovaná metoda použita k separaci pomocí HPLC, vzhledem ke komplementaritě obou systémů. Cílem této studie bylo také ukázat srovnání citlivosti UV detektoru a elektrochchemického detektoru pro analýzu studovaných látek. Parametry obou detektorů byly nastaveny na univerzální hodnotu pro všechny detekovachromatografických pump, guard cely, reakční smyčky, UV vis detektoru a elektrochemického detektoru, který obsahoval elektrodu ze skelného uhlíku jako pracovní elektrodu, referenční hydrogen palladiovou elektrodu a pomocnou uhlíkovou elektrodu (Obr. 2). Jako nosné rozpouštědlo byl použit pufr Britton Robinson o ph 5 a průtok nosného rozpouštědla byl 0,75 ml/min. Oba tyto parametry byly v experimentu optimalizovány přímo pro podmínky detekce adeninu a jeho derivátů. Ke studiu elektrochemického chování zvolených látek byly proměřeny hydrodynamické voltamogramy pro každou látku v rozsahu ( ) mv. Rozdíl mezi každým aplikovaným potenciálem byl 100 mv. Kalibrační závislosti všech sloučenin byly naměřeny při aplikovaném potenciálu mv, při kterém dané sloučeniny vykazovali dobrou elektrochemickou odezvu. Zjištěné limity detekce byly pro adenin 0,9 nm, adenosin 70 nm, 2-aminopurin 0,5 nm, 147

171 né látky. UV detektor byl nastaven na vlnovou délku 260 nm a elektrochemický detektor jehož potenciál byl zoptimalizován byl nastaven na mv. Výsledné získané záznamy z analýzy adeninu a některých z jeho derivátů jsou ukázány na obrázku (Obr. 3). 4.2 FIA ve spojení s magnetickými nanočásticemi Paramagnetické částice, nebo také superparamagnetické částice jsou velmi slibným nástrojem v analytické chemii. Jejich výhodou je snadná manipulace, rychlá příprava a možnost upravit při přípravě jejich velikost. Snadno se váží na bioaktivní molekuly. Tímto pak získávají odolnost vůči fyzikálnímu a biologickému poškození, jako je například denaturace. Zitka et al využili jmenovaných vlastností protilátek ke stanovení 8-hydroxy-2 deoxyguanosinu (OHDG), látku, která je považována za marker oxidačního stresu. A) B) A 3 Sample /rinsing buffer inlet 4 5 (control) 1 Detector (CHI Cell) 2 C) E) D) PC 7 Switching valve 6 Syringe Pump waste 2 3 Obrázek 4: A) Zapojení SFIA. B, C) Detail na detekční elektrochemickou průtokovou celu. E) Možnost připojení elektrochemické detekční cely pro HPLC systém. D) Schéma systému reverzního dávkování vzorku v SFIA. Převzato z [44]. 1 4 C Na nanočástice modifikované protilátkami byl navázán OHDG a následně dle systému ELI SA byla navázána značená protilátka. OHDG byl detekován na základě produktu (1-naftol) vznikající při reakci alkalické fosfatázy (AP) se substrátem, kterým byl naftylfosfát. Vznikající produkt 1-naftol, který je velmi elektrochemicky aktivní, byl stanoven pomocí průtokové injekční analýzy se zastaveným tokem (SFIA) a elektrochemickou detekcí s využitím detekční metody voltametrie s lineárním skenem. Celý instrument byl postaven tak, aby bylo možno dávkovat vzorek v co nejmenším možném objemu. Toto zapojení se vyznačuje odlišným uspořádáním v porovnání s klasickou FIA a hlavně opačným směrem průtoku kapaliny. Systém SFIA byl složen z automatické pipety, která reverzně injektovala vzorek přímo do detektoru, dvoupozičního ventilu, dávkovací kapiláry a elektrochemického detektoru s nízkoobjemovou celou (1,5 µl), kde pracovní elektroda byla ze skelného uhlíku, referenční Ag/AgCl elektrodu a pomocnou uhlíkovou elektrodou (Obr. 4). Detektor byl zapojený k miniaturizovanému potenciostatu, který kontroloval aplikovaný potenciál a sledoval změnu proudu. Využití magnetizovatelných nanočástic modifikovaných specifickými biomolekulami je jedním z nanotechnologických směrů v oblasti stanovení biologicky aktivních látek. Princip separace cílové látky (OHDG) a jeho následná detekce je ukázána na obrázku stejně jako kalibrační křivka, která vykazovala vynikající linearitu R 2 = 0,9954 s limitem detekce 360 fg na nástřik 5 µl vzorku (Obr. 5). 5 Závěr Potenciál FI technik může poskytnout prakticky nekonečné možnosti pro automatizaci a miniaturizaci, spotřebu chemikálií a vzorků. Ještě přínosnější je možnost využití různých selektivních a senzitivních detektorů. Automatizace FI technologie nabízí vysokou bezpečnost 148

172 A) B) OH O P O HO OH y = x R² = Signal analysis I E electrode + HPO 4-2 H + O e - Peak height (na) Dynabeads protein G Mouse immunoglobulin OHdG Rabbit anti-mouse immunoglobulin modified by alkaline phosphatase RAM-AP Goat imunoglobulin Concentration of 8-OHdG (ng/ml) Obrázek 5: A) Schema vazby protilátek a izolované molekuly OHDG na magnetickou částici. B) Kalibrační křivka stanovení 1-naftolu pomocí metody SFIA s elektrochemickou detekcí. Převzato z [44]. zacházení s chemikáliemi a vzorky. Také přináší pokrok v one shot on line analytických metodách. Mimo to se zvyšuje přesnost a preciznost analýz. Miniaturizace FI technik redukuje spotřebu vzorků a chemikálií a tím se také snižuje množství vyprodukovaného odpadu. Spojení s elektrochemickou detekcí lze sestavit zařízení, které může být snadno miniaturizováno a také je využitelné pro stanovení látek s využitím magnetizovatelných nanočástic. 6 Reference [1] L.T. Skeggs and H. Hochstrasser, "RAPID AUTOMATIC ELECTROPHORETIC ANALYSIS.1. METHODS AND APPARATUS", Annals of the New York Academy of Sciences, 1962, pp. 144-&. [2] J. Ruzicka and E.H. Hansen, "FLOW INJECTION ANALYSES.1. NEW CONCEPT OF FAST CONTINUOUS FLOW ANALYSIS", Analytica Chimica Acta, 1975, pp [3] J. Ruzicka and G.D. Marshall, "SEQUENTIAL INJECTION - A NEW CONCEPT FOR CHEMICAL SENSORS, PROCESS ANALYSIS AND LABORATORY ASSAYS", Analytica Chimica Acta, 1990, pp [4] J. Ruzicka, C.H. Pollema and K.M. Scudder, "JET RING CELL - A TOOL FOR FLOW INJECTION SPECTROSCOPY AND MICROSCOPY ON A RENEWABLE SOLID SUPPORT", Analytical Chemistry, 1993, pp [5] B.F. Reis, M.F. Gine, E.A.G. Zagatto, J. Lima and R. A. Lapa, "MULTICOMMUTATION IN FLOW ANALYSIS.1. BINARY SAMPLING - CONCEPTS, INSTRUMENTATION AND SPECTROPHOTOMETRIC DETERMINATION OF IRON IN PLANT DIGESTS", Analytica Chimica Acta, 1994, pp [6] V. Cerda, J.M. Estela, R. Forteza, A. Cladera, E. Becerra, P. Altimira and P. Sitjar, "Flow techniques in water analysis", Talanta, 1999, pp [7] J. Ruzicka, "Lab on valve: universal microflow analyzer based on sequential and bead injection", Analyst, 2000, pp [8] R. A.S. Lapa, J. Lima, B.F. Reis, J.L.M. Santos 149

173 and E.A.G. Zagatto, "Multi pumping in flow analysis: concepts, instrumentation, potentialities", Analytica Chimica Acta, 2002, pp [9] D. Satinsky, P. Solich, P. Chocholous and R. Karlicek, "Monolithic columns - a new concept of separation in the sequential injection technique", Analytica Chimica Acta, 2003, pp [10] A.M. Idris, "Flow Injection, Overlooked Techniques in Forensic Analysis", Critical Reviews in Analytical Chemistry, 2010, pp [11] H. Chen, M. Zhou, X.Y. Jin, Y.M. Song, Z.Y. Zhang and Y.J. Ma, "Chemiluminescence determination of ultramicro DNA with a flow injection method", Analytica Chimica Acta, 2003, pp [12] M. Zhou, Y.J. Ma, X.Y. Jin, X.L. Teng, Z.Y. Zhang and H. Chen, "Flow injection chemiluminescence determination of trace calf thymus DNA", Chinese Chemical Letters, 2003, pp [13] Y.J. Ma, M. Zhou, X.Y. Jin, Z.Y. Zhang, X.L. Teng and H. Chen, "Flow injection chemiluminescence assay for ultra trace determination of DNA using rhodamine B Ce(IV)-DNA ternary system in sulfuric acid media", Analytica Chimica Acta, 2004, pp [14] Y.X. Ci, Y.G. Zheng, J.K. Tie and W.B. Chang, "CHEMILUMINESCENCE INVESTIGATION OF THE INTERACTION OF METALLOPORPHYRINS WITH NUCLEIC ACIDS", Analytica Chimica Acta, 1993, pp [15] M.L. Liu, B.X. Li, Z.J. Zhang and J.M. Lin, "Enhancing effect of DNA on chemiluminescence from the decomposition of hydrogen peroxide catalyzed by copper(ii)", Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2005, pp [16] K.A. Defillipo and M.L. Grayeski, "FLOW INJECTION CHEMILUMINESCENT METHOD FOR AN ENZYME LABELED DNA PROBE", Analytica Chimica Acta, 1991, pp [17] T. Perez Ruiz, C. Martinez Lozano, V. Tomas and J. Martin, "Flow injection chemiluminescence determination of DNA based on a photochemical reaction", Analytica Chimica Acta, 1999, pp [18] L. Yi, H.C. Zhao, C.Y. Sun, S. Chen and L.P. Jin, "Flow injection chemiluminescence study of Ce(IV)-Na2SO3-Tb(III)- fluoquinolone antibiotic system with DNA", Spectrochimica Acta Part a Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 2003, pp [19] X.W. Chen, W.X. Wang and J.H. Wang, "A DNA assay protocol in a lab on valve meso fluidic system with detection by laser induced fluorescence", Analyst, 2005, pp [20] E.M. Caldarone and L.J. Buckley, "QUANTITATION OF DNA AND RNA IN CRUDE TISSUE EXTRACTS BY FLOW INJECTION ANALYSIS", Analytical Biochemistry, 1991, pp [21] G.R. Fang, G.W. Song, L. Li, H.J. Zhan and X.H. Li, "Determination of DNA by fluorimetry with flow injection", Spectroscopy and Spectral Analysis, 2002, pp [22] M. Decuir, I. Lahdesmaki, A.D. Carroll and J. Ruzicka, "Automated capture and on column detection of biotinylated DNA on a disposable solid support", Analyst, 2007, pp [23] R. H. Yang, K.M. Wang, D. Xiao, K. Luo and X.H. Yang, "Flow injection renewable drops technique for assay of micro amounts of DNA", Analytica Chimica Acta, 2001, pp [24] O.A. Loaiza, S. Campuzano, A.G.V. de Prada, M. Pedrero and J.M. Pingarron, "Amperometric DNA quantification based on the use of peroxidase mercaptopropionic acid modified gold electrodes", Sensors and Actuators B Chemical, 2008, pp [25] J. Wang, M. Jiang and B. Mukherjee, "Flow detection of nucleic acids at a conducting polymer modified electrode", Analytical Chemistry, 1999, pp [26] J. Wang, L. Chen and M. Chicharro, "Trace measurements of nucleic acids using flow injection amperometry", Analytica Chimica Acta, 1996, pp [27] C.G. Huber and M.R. Buchmeiser, "On line cation exchange for suppression of adduct formation in negative ion electrospray mass spectrometry of nucleic acids", Analytical 150

174 Chemistry, 1998, pp [28] A. Numnuam, P. Kanatharana, B. Mattiasson, P. Asawatreratanakul, B. Wongkittisuksa, C. Limsakul and P. Thavarungkul, "Capacitive biosensor for quantification of trace amounts of DNA", Biosensors & Bioelectronics, 2009, pp [29] S. Bi, H. Zhou and S.S. Zhang, "Bio bar code functionalized magnetic nanoparticle label for ultrasensitive flow injection chemiluminescence detection of DNA hybridization", Chemical Communications, 2009, pp [30] P.S. Francis, J.L. Adcock, J.W. Costin, S.D. Purcell, F.M. Pfeffer and N.W. Barnett, "Chemiluminescence detection of opium poppy (Papaver somniferum) alkaloids", Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2008, pp [31] Y.H. He, J.R. Lu, M. Liu, J.X. Du and F. Nie, "Determination of morphine by molecular imprinting chemiluminescence method", Journal of Analytical Toxicology, 2005, pp [32] K.M. Agg, A.F. Craddock, R. Bos, P.S. Francis, S.W. Lewis and N.W. Barnett, "A rapid test for heroin (3,6-diacetylmorphine) based on two chemiluminescence reactions (vol 51, pg 1080, 2006)", Journal of Forensic Sciences, 2007, pp [33] N.W. Barnett, S.W. Lewis and D.J. Tucker, "Determination of morphine in process streams by sequential injection analysis with chemiluminescence detection", Fresenius Journal of Analytical Chemistry, 1996, pp [34] N.W. Barnett, C.E. Lenehan, S.W. Lewis, D.J. Tucker and K.M. Essery, "Determination of morphine in water immiscible process streams using sequential injection analysis coupled with acidic permanganate chemiluminescence detection", Analyst, 1998, pp [35] N.W. Barnett, D.G. Rolfe, T.A. Bowser and T.W. Paton, "DETERMINATION OF MORPHINE IN PROCESS STREAMS USING FLOW INJECTION ANALYSIS WITH CHEMILUMINESCENCE DETECTION", Analytica Chimica Acta, 1993, pp [36] N.W. Barnett, T.A. Bowser, R. D. Gerardi and B. Smith, "Determination of codeine in process streams using flow injection analysis with chemiluminescence detection", Analytica Chimica Acta, 1996, pp [37] B. Qiu, X. Chen, H.L. Chen and G.N. Chen, "Electrochemiluminescence determination of codeine or morphine with an organically modified silicate film immobilizing Ru(bpy) (3)(2+)", Luminescence, 2007, pp [38] A.M. Idris and A.O. Alnajjar, "Exploiting sequential injection analysis technique to automate on line sample treatment and quantitative determination of morphine in human urine", Talanta, 2008, pp [39] A. Alnajjar, A.M. Idris, M. Multzenberg and B. McCord, "Development of a capillary electrophoresis method for the screening of human urine for multiple drugs of abuse", Journal of Chromatography B Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences, 2007, pp [40] M. Pavlic, B. Schubert, K. Libiseller and H. Oberacher, "Comprehensive identification of active compounds in tablets by flow injection data dependent tandem mass spectrometry combined with library search", Forensic Science International, pp [41] K. Minakata, H. Nozawa, I. Yamagishi, K. Gonmori, S. Kanno, K. Watanabe, M. Suzuki, W.H.A. Ahmed and O. Suzuki, "Sensitive determination of arsenite and arsenate in plasma by electrospray ionization tandem mass spectrometry after chelate formation", Forensic Toxicology, 2009, pp [42] A.S. Fang, X.S. Miao, P.W. Tidswell, M.H. Towle, W.K. Goetzinger and J.N. Kyranos, "Mass spectrometry analysis of new chemical entities for pharmaceutical discovery", Mass Spectrometry Reviews, 2008, pp [43] O. Zitka, H. Skutkova, V. Adam, L. Trnkova, P. Babula, J. Hubalek, I. Provaznik and R. Kizek, "A New Approach how to Define the Coefficient of Electroactivity of Adenine and Its Twelve Derivatives Using Flow Injection Analysis with Amperometric Detection", Electroanalysis, 2011, pp [44] O. Zitka, S. Krizkova, L. Krejcova, D. Hynek, J. Gumulec, M. Masarik, J. Sochor, V. Adam, J. Hubalek, L. Trnkova and R. Kizek, 151

175 "Microfluidic tool based on the antibody modified paramagnetic particles for detection of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine in urine of prostate cancer patients", Electrophoresis, 2011, pp

176 153 POZNÁMKY

177 14 Libuše 14ELEKTROCHEMIE V NANOTECHNOLOGIÍCH Trnková, René Kizek, Jaromír Hubálek, Vojtěch Adam

178

179 1 Úvod V posledních deseti až patnácti letech lze pozorovat enormní zájem o výzkum, který se pojí s předponou nano (nanověda, nanotechnologie, nanočástice, nanoroboty, nanosenzory). Jaký je k tomu důvod? Nejčastější odpověď na tuto otázku se pojí s faktem, že nanočástice mají neobyčejné vlastnosti fyzikální (konstrukční, elektrické, magnetické a optické) a chemické (struktura a s ní spojená interakce částic a specifická katalýza a že nanotechnologie mají neuvěřitelné aplikace v textilním průmyslu (outdoor, uniformy, informace na textilu), v medicíně (cílená doprava léků, léčení ran, dezinfekce), v optoelektronice a v přípravě nejrůznějších sensorů nebo sensorových polí (arrays). Odpověď se v podstatě opírá o výrok Richarda Feynmana There is plenty of room on the bottom, (Tam dole je spousta místa), vyslovený 29. prosince 1959 na ročním setkání Americké společnosti fyziků na Kalifornském Institutu technologií (Caltech). Neustává snaha vědců zkoumat objekty (materiály a jejich povrchy) na úrovni nanometrů [1]. Do procesu bouřlivého vývoje nanověd a nanotechnologií vstupuje, jako jedna z nejdůležitějších disciplín, elektrochemie. Co může nabídnout, na to se zaměřuje tento příspěvek v rámci kurzu V. Letní školy elektrochemie (LŠE). Abstrakt: Kurz poskytuje přehled o nedávných pokrocích v oblasti elektrochemické nanotechnologie, která v poslední době patří k jedné z nejvíce se rozvíjejících oblastí vědy a výzkumu. Ukazuje se, že elektrochemie v nanotechnologiích poskytuje řešení pro celou řadu významných technických úkolů, dotýkajících se širokého spektra nanomateriálů. Tyto nanomateriály nacházejí dalekosáhlé uplatnění především díky svým jedinečným fyzikálním (elektrickým, optickým, magnetickým) a chemickým (strukturním, katalytickým) vlastnostem. Kromě klasifikace a vlastností nanočástic je věnována pozornost jejich funkcím, jako je schopnost (i) imobilizovat biopolymery na vhodný povrch, včetně elektrod, (ii) katalyzovat vybrané reakce, (iii) zvýšit elektronový transfer, (iv) značkovat studované látky, zejména biopolymery a (v) převzít roli reaktantu. Pro studium a pochopení jednotlivých funkcí, včetně charakterizace nanočástic a nanomateriálů, jsou vhodným a velmi užitečným nástrojem moderní elektrochemické techniky. Zabývají se nejen objasněním elektrodových procesů a mezifázového rozhraní, ale i přenosu náboje do nanostrukturovaných materiálů. Výstupy elektrochemické nanotechnologie, umožňující řešit důležité problémy v elektroanalýze, v regulaci organických syntéz, v elektronice, v životním prostředí a v medicíně, jsou skutečnou výzvou pro další nanotechnologický výzkum. 2 Elektrochemie jako klíčová složka ve vědě nanočástic Ukazuje se, že elektrochemie je skutečně klíčovou složkou ve vědě nanočástic. Slouží jako fundamentální věda pro přípravu, výzkum a vývoj nanostrukturovaných materiálů a nanostrukturovaných povrchů. Je spojovacím článkem mezi přípravou nanočástic spadajících do fyzikálních metod (naprašování, napařování, laserová ablace) a do chemických metod (redukce, oxidace, elektrochemicky řízená imobilizace). Jedna z prvních příprav kovových nanostrukturovaných povrchů je galvanické pokovení přes porézní membrány. Vznik a výstavba kovových nanočástic metal (NP) v různé podobě (nanotyčinky, nanotrubičky, nanodrátky) na různých naprašovaných či napařovaných vrstvách může být regulována právě pomocí elektrochemických parametrů. Kromě hardwarových parametrů (nastavení na elektroanalyzátoru), rozdílných koncentrací a rozdílného složení elektrolytů se jedná i o typ redukčních nebo oxidačních činidel [2]. Elektrochemie je pak schopna regulovat velikost připravovaných nanočástic, jejich rozptyl v médiu, elektrokatalytickou aktivitu, vodivost, jejich modifikaci a funkcionalizaci. 155

180 Charakterizace nanostruktur je prováděna také pomocí běžných elektrochemických metod, často i za asistence reverzibilních redox systémů, jako je Ru(NH 3 ) 6 3+/2+ a Fe(CN) 6 3-/4-. Výhodou elektrochemické přípravy nanočástic je jednak možnost jejich zpětné obměny, jednak, pokud jsou uvolňovány do roztoků, možnost lepšího rozptylu v příslušném médiu. Jednou z nevýhod by mohla být flokulace a koagulace nanočástic, což je však otázka přidávaného stabilizátoru [2]. Využití kovových nanočástic v elektrokatalytických procesech je dokladováno na příkladu modifikovaných (často grafitovými NP) nebo nemodifikovaných platinových, železných, zlatých, stříbrných a iridiových nanočástic. Díky těmto kovovým NP mohou katalyticky probíhat například tyto děje: oxidace methanolu na grafitových substrátech, popř. na pastových elektrodách, elektrokatalýza oxidačního procesu peroxidu, oxidace oxidů (SO 2, NO) proudících přes porézní elektrodu, SAM, Au -SH deriváty, různé procesy při sensorové analýze oligonukleotidů. Procesy s účastí NP lze studovat metodami potenciostatickými: LSV (linear sweep voltammetry), CV (cyclic voltammetry), DPV (differential pulse voltammetry), EVLS (elimination voltammetry with linear sweep), často kombinovanými s technikou strippingu, galvanostatickými: CPSA (current constant potentiometric stripping analysis) a CP (chronopotenciometry) a metodami elektrospektrálními [3]. 1.2 Funkce nanočástic v elektrochemii V souvislosti nanočástic a elektrochemie nejčastěji hovoříme o [4 5]: a) imobilizaci biopolymerů, b) katalýze elektrochemických reakcí, c) amplifikaci elektron transferu, d) značkování biomolekul, e) zapojení NP do úlohy reaktantu. Imobilizace biopolymerů Biomolekuly mají vysokou povrchovou energii, relativně lehce se adsorbující na povrch elektrod a na povrch NP. Vedle jejich využití k modifikaci elektrod je nutné zdůraznit podstatný atribut jejich adsorpce se zárukou zachování bioaktivity díky biokompatibilitě nanočástic. NP nesou náboj, který může působit elektrostaticky na adsorpci biomolekul s opačným nábojem. Kromě elektrostatických interakcí pro tvorbu modifikované vrstvy biopolymeru, kdy se jedná většinou o fyzikální adsorpci, se může tvořit modifikovaná vrstva polymeru pomocí kovalentní vazby, kdy se jedná o chemisorpci. Například AuN na sebe imobilizují proteiny nebo nukleové kyseliny či oligonukleotidy (ODN) prostřednictvím SH vazeb. Podobné modifikace slouží jako základ imunosenzorů, které jsou založené na imobilizaci antigenu nebo protilátky spolu s nanočásticemi. Příkladem modifikace pomocí SH skupiny a její interakce s AuNP je schematicky ukázán na následujícím obrázku. Obrázek 1: Imobilizace DNA na zlatých nanočásticích (upravený obrázek z publikace [5]). Je třeba poznamenat, že imobilizace biopolymerů s určitými nanočásticemi může efektivně zvýšit stabilitu systému se zachováním aktivity biopolymeru. Katalýza elektrochemických reakcí Mnoho nanočástic a nanostrukturovaných materiálů, především kovových, mají excelentní katalytické vlastnosti. Mohou snižovat přepětí mnoha elektrochemických reakcí, které jsou ireverzibilní na běžných nemodifikovaných 156

181 elektrodách. Příkladem je např. NO oxidace na AuNP, separace kyseliny askorbové a dopaminu tím, že se sníží díky AuNP oxidační potenciál kyseliny askorbové, zatímco u dopaminu zůstává oxidační potenciál nezměněn: PtNP jsou schopny snížit oxidační potenciál H 2 O 2, NiNP snižují oxidační potenciál cukrů, atd. Jedním z excelentních příkladů je katalyzovaná interakce biotin -streptavidin pomocí AuNP, která umožňuje stanovení streptavidinu na femtomolární úrovni [5]. Amplifikace elektronového přenosu U enzymových elektrod se velmi často stává, že přenos elektronu (ET elektron transfer) je pod vlivem prostetické skupiny blokován. Byly učiněny pokusy zvýšit rychlost ET. V tomto směru mohou být nápomocné NP, neboť působí jako mediátory, tedy něco jako elektrické drátky (bridges). Takovou úlohu pro případ povrchů z pyrolytického grafitu sehrávají stříbrné nanočástice s imobilizovaným cytochromem C nebo ZrO 2 nanočástice s imobilizovaným hemoglobinem. Pro amplifikaci ET je možné využít i polovodičových nanočástic. Je třeba zdůraznit, že amplifikace ET je závislá nejen na vodivosti nanočástic, ale i na vzájemném uspořádání nanočástic a biomolekul [5]. Značkování (labeling) biomolekul V rozvoji biosenzorů hraje důležitou roli značkování (labeling) a následné využití velmi citlivých elektrochemických technik včetně stripping techniky. Značkování NP antigenem nebo protilátkou (antibody) je základem heterogenního elektrochemického testu. Molekuly protilátky značené zlatými nanočásticemi jsou zachyceny analytem s neznačenou protilátkou a po oxidativním odstranění zlaté nanočástice v kyselém prostředí je roztok podroben elektrochemické analýze (anodic stripping detection). Nanočástice jako reaktanty Výzkum v nanotechnologii ukázal, že nanočástice jsou lepšími reaktanty než jejich odpovídající objemové (bulk) materiály. V použitých reakčních médiích jsou NP lépe rozptýleny a mají mnohem větší povrch než odpovídající práškovité formy. Z hlediska reakčních nanotechnologických procesů je možné hledat určité podobnosti: podobně jako PbO 2 NP mohou reagovat MnO 2 NP. Nezanedbatelnou vlastností NP je tedy schopnost účinné a specifické katalýzy. Obrázek 2: Heterogenní elektrochemická imunoesej založená na zlatých nanočásticích (upravený obrázek z publikace [5]). 3 Praktické využití Elektrochemie nabízí též nové cesty k získání různých nanočástic a navrhuje způsoby jejich praktického využití a ukazuje jak sledovat specifické vlastností nových funkčních nanomateriálů. Elektrochemie je vhodným nástrojem pro všechny následně uvedené oblasti: A. Nanomateriály Nanopráškové materiály, nanočástice, kvantové tečky, nanovlákna. Kompozitní materiály obsahující nanočástice. Materiály s uhlíkovými nanotrubicemi nebo fullereny. Tenké vrstvy, nanovrstvy, nanopovlaky. Nanostrukturní kovy a slitiny. Nanokeramika. Polymerní nanokompozity, polymerní nanomateriály. Cíl: Vytvořit nové materiály a metody jejich přípravy, vypracovat metody optimalizace a dosahování cíleně modifikovaných užitných 157

182 mechanických, elektrických a dalších vlastností materiálů, často vyplývajících z unikátních vlastností nanočástic, nanovláken a kompozitlů. B. Nanotechnologie pro ukládání a přenos informací, mikro- a nanoelektronika Nanoelektronika, materiály a zařízení. Fotonika. Optické materiály, struktury a zařízení. Magnetické materiály a zařízení, spintronika. Organická fotonika, bioelektronika. MEMS (Microelectromechanical systems), NEMS (Nanoelectromechanical systems). Cíl: Navrhnout nové nástroje, přístroje a zařízení pro tvorbu a charakterizaci nanostruktur s vysokým rozlišením a vypracovat nové metody pro manipulaci a propojování nanoobjektů s makrookolím, zejména s mikro- a nanoelektronikou [4]. C. Nanobiotechnologie, nanomedicína Zapouzdřování léků. Cílená doprava léků. Tkáňové inženýrství. Biokompatibilní a bioanalogické mate-riály a vrstvy. Molekulární analýza, analýza DNA. Biologicko -anorganické rozhraní a hybridy. Diagnostika, molekulární rozpoznávání. Cíl: Využít nanostruktury a nanokomplexy, včetně hybridních materiálů ovladatelných vnějším magnetickým polem, pro nové lékové formy, pro kontrastní látky a nosiče zajišťující cílený transport těchto látek či přenos genové informace, jejich aktivaci a biodegradaci v organismu. Výzkum lékových forem, kontrastních látek a tím i diagnostik založených na biodegradovatelných (zejména polymerních) systémech umožňujících vazbu požadovaných léčiv, případně dalších biologicky aktivních molekul jako jednotek zajišťujících orgánově či buněčně specifickou dopravu celého systému v živém organismu s jeho specifickou aktivací v požadovaném místě účinku. V ideálním případě by tento systém měl fungovat jako diagnostikum a zároveň i specifické terapeutikum. Zcela zásadní je transport chemoterapeutik a radioterapeutik určených pro léčbu nádorových onemocnění. Důraz je kladen na hybridní materiály, skládající se z magnetických jader a biokompatibilního makromolekulárního obalu, kdy vnějším magnetickým polem lze ovládat jejich transport, distribuci a chování. Tyto nanočásticové systémy by měly sloužit in vivo v diagnostice i terapii jako (i) cílené transporty léků, chemoterapeutik a radioterapeutik, (ii) jako kontrastní látkové toky pro zobrazovací magnetickou rezonanci a (iii) lokální destrukce rakovinných nádorů magnetickou hyperthermií. Nedílnou součástí tohoto bloku je výzkum biofunkcionalizace povrchů. Jedná se o pochopení fundamentálních procesů ovlivňujících interakci molekulárních objektů na površích kovů a polovodičů, jejich tvorby či samouspořádání. Důraz je kladen na nanobiotechnologie pro vytváření definovaného rozhraní mezi biologickým a nebiologickým prostředím umožňujícím dosažení specifické biologické aktivity, např. tvorbu, regeneraci a rekonstrukci buněk a tkání (bioinženýrství) a vytváření biokompatibilních povrchů z lékařských přípravků, zařízení a přístrojů a úpravě povrchů specificky reagujících na přítomnost vybraných molekul (detekční systém biosenzorů), a to nejen pro lékařské využití. K těmto cílům se pojí příprava, studium vlastností a výzkum komplexů DNA umožňujících in vivo účinný cílený transport genové informace do předem vybraných typů buněk anebo používaných jako systémy zajišťující účinnou transfekci více typů buněk a využití pro terapii. 158

183 D. Nanotechnologie pro aplikaci v senzorech Senzory využívající nanomateriály. Biomolekulární senzory. Cíl: Navrhnout nové biosenzory a diagnostické systémy umožňující citlivou, rychlou a selektivní detekci molekulárních objektů, podpořit zavádění moderních nanotechnologických materiálů a metod do zdravotnické praxe. Výzkum diagnostických systémů a čipů založených na povrchové modifikaci nanovláken, mřížek nebo citlivých snímačů protilátek specifických proti různým molekulám. Interakce i malého množství molekul s protilátkami a s tím spojená vysoce citlivá změna vodivosti nebo dalších vlastností by měla být využita pro jejich specifickou elektrochemickou detekci [5]. E. Nanotechnologie pro (elektro)chemické technologie zpracování Filtrace, membrány, molekulární síta, zeolity. Katalýza nebo elektrody s nanostruk-turními povrchy. Chemická syntéza, supramolekulární chemie. Cíl: Navrhnout, připravit, charakterizovat a modelovat nové nanostruktury, vhodné pro nové technologické procesy, pro syntézu, elektrokatalýzu, pro detektory, fotonické krystaly či lasery a nové polovodičové spintronické materiály - vývoj nové generace nano-součástek pro záznam a přenos informace. Supramolekulární vytváření nanostruktur. Pro biomedicínské využití je zásadní vytváření umělých nanostruktur řízeným sestavováním cíleně připravených molekulárních stavebních prvků. To je, spolu s maximálním využitím samouspořádání, kovalentních i nekovalentních vazeb, jeden z hlavních cílů supramolekulární chemie. F. Dlouhodobý výzkum s širokou oblastí aplikace Self -assembly (samosestavování, samouspořádání monovrstev SAM). Kvantová fyzika, kvantové jevy v nanorozměrech, nanofyzika. Nano- a mezoskopické systémy. Chemické materiály a procesy nanochemie. Ultra-přesné inženýrství. Cíl: Vypracovat nové metody přípravy nanostruktur a nanomateriálů s cíleným řízením rozměrů objektů či jejich samoorganizaci, zejména připravit, charakterizovat a optimalizovat nové nanouhlíkové a nanodiamantové materiály pro bioaplikace a nanoelektroniku. Rozvoj metod pro manipulaci a propojování nanoobjektů s mikro a makrookolím, zejména s mikroelektronikou, které umožní měření elektrických a provozních parametrů jednotlivých elektronických elementů a nanostruktur. Budou zkoumány metody manipulace s atomy, molekulami a klastry, litografické metody pro kontaktování nanostruktur a nanosoučástek a jejich zabudování do složitých obvodů a elektronických přístrojů [6]. G. Přístroje a zařízení, výzkum a aplikace technologií Analytické přístroje, metody, techniky, výzkum. Výroba (příprava) nanoprášků (nanočástic) a jejich zpracování. Zařízení a metody pro vytváření vrstev a povlaků. Zařízení a metody vytváření objektů (patterning, ECAP equal -channel angular pressing, tvorba vláken ap.). Ultra -přesné obrábění, nanometrologie. Cíl: Účinným transferem poznatků rozšířit spektrum průmyslově využitelných technologií, založených na praktickém využití nanočástic, nanovláken, nanopovlaků, nanostruktur a nanokompozitů v materiálové výrobě v ČR a zejména 159

184 u volných nanočástic a nanovláken posoudit možný negativní vliv na životní prostředí a člověka. Dílčím kolem je výzkum nanopovlaků a funkčních nanostruktur v tenkých vrstvách, cíleně orientovaný na zlepšení užitných vlastností významných materiálů, např. vývoj samočisticích antibakteriálních vrstev a produktů použitelných v ochraně životního prostředí, zejména pro odstraňování škodlivin z vody a vzduchu. Výzkum nanokompozitů je zaměřen na nalezení vhodné vazby mezi kovovou, keramickou či polymerní matricí a vyztužující nanostrukturní (zpravidla keramickou) fází kompozitů, určených pro extrémní mechanické a chemické namáhání. Oblastmi využití jsou miniaturizované systémy a jejich integrace do nové generace výrobků na úrovni mikro- a nanorozměrů [7]. Rozvoj nástrojů, přístrojů, zařízení a metod pro tvorbu a charakterizaci nanostruktur s vysokým rozlišením, který je zaměřen na charakterizaci materiálů z hlediska topografických, elektrických, optických a magnetických vlastností, jejich pasivace, tepelné odolnosti a odolnosti vůči intenzivním svazkům a mechanickým vlivům. Takovéto nanotechnologické nástroje umožní přímou kontrolu v jednotlivých technologických krocích. H. Zdravotní, ekologické, etické, sociální a jiné aspekty nanotechnologií Toxicita nanočástic. Ekologické aspekty. Sociální a etické aspekty. Standardizace. Patentování. Prognózy a prozíravost (foresight). Popularizace nanotechnologie. Cíl: Pro technicky zajímavé objemové a gradientní materiály vytvořit nové metrologické postupy za účelem současné charakterizace topografie a chemického složení jejich povrchů s vysokým laterálním rozlišením. Dále vypracovat metody optimalizace užitných me- chanických, elektrických a dalších vlastností těchto materiálů. Sledovat toxické, ekologické a etické aspekty nanotechnologií. Při popularizaci nanotechnologie poukázat na prognózu výzkumu v nanotechnologiích [7]. 4 Závěr Na závěr si dovolíme zamyšlení nad jedním článkem uvedeným v žurnálu americké chemické společnosti (Journal of the American Chemical Society), ve zkratce uveřejněným i v běžných sdělovacích prostředcích. Týká se propojení nanotechnologie a elektrochemie. Krátkému dvoustránkovému článku dominuje otázka: Budeme mikroelektroniku sestavovat v roztocích? Vědci z francouzských výzkumných institucí (Institut des sciences moléculaires a Universités Bordeaux) přišli s návrhem nové technologie, která umožní posunovat mikroskopickými objekty. Metoda by mohla najít uplatnění ve výrobnách elektroniky nebo v medicíně. Podstatou postupu je tzv. bipolární elektrochemie. Je třeba poznamenat, že zatím byly vyzkoušeny pouze předměty z kovu. Kovová struktura je umístěna v roztoku, na jedné straně se rozpouští a na druhém se kov opět z roztoku sráží, objekt se tedy neustále regeneruje (poněkud filozofickou otázkou je, zda můžeme mluvit stále o tom samém objektu). Podle vědců lze takto zajistit pohyb v řádu mikrometrů za sekundu, přičemž rychlost elektrochemické reakce i pohybu lze řídit. Kovový předmět v roztoku se vystaví vnějšímu elektrickému poli, až se jedna z jeho stran stane katodou a druhá anodou. Polarizace musí být dost vysoká na to, aby spustila redoxní (oxidačně -redukční) chemickou reakci. Míra polarizace odpovídá rychlosti reakce a tedy i pohybu. Zatím si vědci takto hráli především s vločkami zinku v roztoku zinečnaté soli, dále i částečkami mědi a železa (opět v odpovídajících roztocích). Experiment lze uspořádat tak, že rozpuštěné i vyloučené množství kovu je stejné, předmět si tedy zachová svou velikost, ale údajně i tvar. Technika by 160

185 tedy měla být využitelná nejen přímo k pohybu, ale i sestavování miniaturních elektronických komponent, které lze tímhle postupem dostat s velkou přesností na potřebné místo. Změnami orientace elektrického pole lze vyvolat i složitý pohyb. Na konci se rozpouštědlo odsaje. Uvažuje se o aplikaci v nanomedicíně, kdy by se účinné látky tímto způsobem dostávaly do cílového místa (opět účinkem vnějšího elektrického pole; jak by se zajistilo, aby kapsle plavala v roztoku žádoucího složení, zdroj bohužel nevysvětluje). Teoretici by pomocí pohybujících se kapiček mohli údajně dobře modelovat fungování biologických systémů, například bakterií [8]. Nanoparticles in Electrochemical Sensors and Biosensors, Electroanalysis, 18, (2006) [6] Martin Pumera, Samuel Sanchez, Izumi Ichinose, Jie Tang, Electrochemical Nanobiosensors, Sensors and Actuators B 123, (2007) [7] Shaojun Guo, Erkang Wang, Synthesis and electrochemical applications of gold nanoparticles, Analytica Chimica Acta (2007) [8] Gabriel Loget, Alexander Kuhn, Propulsion of Microobjects by Dynamic Bipolar Self- Regeneration, J. Am. Chem. Soc.,132 (45) (2010) Obrázek 3: Diagram ukazující princip bipolární vlastní regenerace (self regeneration). Tento závěr jasně dokazuje sofistikované a stále se rozvíjející propojení nanotechnologie a elektrochemie. Jednoduše řečeno, elektrochemie spolu s nanotechnologií tvoří nerozlučnou a perspektivní dvojici. 5 Reference [1] Richard P. Feynman, There s Plenty of Room at the Bottom, [2] Pavel Řezanka, Kamil Záruba a Vladimír Král, Potenciál modifikovaných nanočástic v analytické chemii. Chem. Listy 101, (2007) [3] David Hernandez -Santos, MarÌa Begona Gonzalez -GarcÌa, Agustin Costa Garcia, Metal -Nanoparticles Based Electroanalysis, Electroanalysis, 14, (2002) [4] D. Jason Riley, Electrochemistry in Nanoparticle Science, Current Opinion in Colloid & Interface Science 7, (2002) [5] Xiliang Luo, Aoife Morrin, Anthony J. Killard, Malcolm R. Smyth, Application of 161

186 162 POZNÁMKY

187 15 René A NANOTECHNOLOGIE 15BIOELEKTROCHEMIE Kizek

188

189 1 Úvod 1.1 Elektrochemická analýza Elektrochemická analýza využívá skupinu elektroanalytických metod vycházejících z poznatků odvětví fyzikální chemie elektrochemie. Podstatou je studium závislosti elektrochemického chování roztoků na jejich složení a koncentraci. Předmětem zkoumání je elektrochemický systém soustava, v níž je roztok v kontaktu s elektrodami a sleduje se některá z elektrických veličin (proud I, potenciál E, atd.). Dalšími důvody jeho využívání je jednoduchá konstrukce, nízké pořizovací náklady a vysoká citlivost [1]. 1.2 Polarografie a voltametrie Vzhledem k rozsáhlosti problematiky elektrochemických metod se budeme v následujícím textu věnovat popisu pouze voltametrickým metod konkrétně pak square wave voltametrii. S pojmem polarografie je neodmyslitelně spjata postava profesora Jaroslava Heyrovského, který za její objev získal roku 1959 Nobelovu cenu za chemii. Principem metody je vkládání měnícího se napětí mezi dvě elektrody ponořené v roztoku a následném sledování procházejícího proudu. Tato klasická metoda prošla v průběhu let řadou změn. Vzhledem k faktu, že základní princip provedení je u polarografie a voltametrie stejný, jako polarografie se označuje voltametrie využívající rtuťovou kapající elektrodu jako pracovní elektrodu [2]. Voltametrická analýza zahrnuje nepřeberné množství metod, např. lineární voltametrie, cyklická voltametrie nebo diferenční pulzní volumetrie, při kterých se sleduje proudová odezva systému na vložený potenciál na pracovní elektrodě, zapojené tak, aby jí neprocházel proud a nedocházelo k polarizaci konstantní potenciál. Naměřené hodnoty se měří vůči referenční elektrodě, zatím co změny proudu se měří proti pomocné elektrodě (nejčastěji z platiny nebo uhlíku). Výsledky měření jsou znázorněny jako polarizační křivka voltamogram [8]. Jednotlivé píky na voltamogramu jsou charakteristické pro každou molekulu analytu. Výška píku udává koncentraci látky, resp. množství molekul, které podlehly elektrochemické reakci a podle potenciálu, ve kterém je pík na voltametrické křivce umístěn lze určit danou látku [8]. 1.3 Square wave voltametrie (SWV) Během této metody je na elektrodu rovněž vnášen lineárně se měnící potenciál modulovaný napěťovými pulzy, které však jsou pozitivní a negativní vůči potenciálové rampě. Proud se měří vždy těsně před změnou potenciálu, tj. ke konci každého vloženého pulzu. Hodnoty proudu na pozitivním pulzu a předchozím negativním pulzu se navzájem od sebe odečítají. Když srovnáme SWV s DPV zjistíme, že SWV může pracovat při rychlých změnách potenciálu a pro reverzibilní systémy citlivost činí asi mol/l, pro ireverzibilní systémy 10 6 mol/l. Mezi výhody této metody je velká citlivost, schopnost Obrázek 1: Schéma elektrochemické měřící nádobky. Převzato z [2]. 164

190 potlačovat proudy pozadí a také rychlost. Tato rychlost spojená s využitím počítače dovoluje, aby byly experimenty prováděny opakovaně. Navíc zvyšuje poměr signál šum [3]. Obrázek 2: Charakteristika vstupního potenciálu a proudové odezvy SWV. Převzato [3]. 1.4 Elektrochemické vlastnosti DNA Studiem elektrochemických vlastností nukleových kyselin se jako první začal zabývat profesor Emil Paleček. Pomocí oscilografické polarografie objevil elektrochemické vlastnosti nukleových kyselin. Konkrétně pak možnost rozlišení jednovláknové a dvouvláknové formy metodou teplotní denaturace. Tím, že se šroubovice denaturuje, dojde k tomu, že jsou adeninové a cytosinové zbytky nukleotidů na rtuťové elektrodě dostupné redukci. Redukce se projeví vznikem píku na voltametrické křivce a jeho výška se zvyšuje s množstvím adeninu a cytosinu dostupného reakci na elektrodě. Tento významný objev byl v průběhu let dále vylepšován a rozpracováván do jiných variant použití. Dnes je již elektrochemická aktivita nukleových kyselin známým faktem a moderní metody jako polarografie, voltametrie nebo chronopotenciometrie nám je pomáhají analyzovat [4, 5]. Podstatou elektrochemie nukleových kyselin je skutečnost, že analyzovaná molekula je schopna přijímat elektrony od pracovní elektrody (redukována) nebo elektrodě elektrony předávat (oxidovat), případně se na elektrodu specificky adsorbovat a pod vlivem elektrického potenciálu desorbovat. Elektroaktivními složkami nukleových kyselin jsou dusíkaté báze. Z jednotlivých bází podstupuje redukční procesy na rtuťových či pevných elektrodách pouze adenin (A), cytosin (C) a guanin (G). Jejich redukce nastává při velmi záporných potenciálech, jichž může být docíleno jen na rtuťových elektrodách. Oxidačních procesů podléhá na uhlíkatých elektrodách ze všech bází adenin a guanin. To samé se prokázalo pro thymin a cytosin. Ribóza a deoxyribóza je stejně jako fosfátové skupiny elektroneaktivní [4, 5]. Důležitým výsledkem studia elektrochemické oxidace nukleových kyselin nízkých molekulových hmotností byl poznatek, že nukleosidy adeninu a guaninu jsou oxidovatelné na vyšších potenciálech než samotné molekuly bází. Také bylo poukázáno na to, že voltametrické potenciály oxidačních píků guanosinu a adenosinu jsou zcela jiné. Kdyby totiž zbytky guaninu a adeninu nukleových kyselin zvyšovaly odezvu na uhlíkových elektrodách, což lze snadno rozeznat, pak by bylo možné vyvinout účinnou elektrochemickou techniku na sledování určitých míst adeninu a guaninu v nukleové kyselině. První studie elektro oxidace nukleových kyselin na uhlíkových elektrodách byly provedeny v podmínkách, kdy monomerní adenin, guanin a jejich deriváty způsobily dobře ohraničené voltametrické píky. Bylo však zjištěno, že citlivost klasické linear sweep voltametrie je velmi nízká. Pozdější studie proto byly založeny především na SW voltametrii. Tato technika umožňuje zvýšení měřených voltametrických píků DNA a RNA [4, 5]. 1.5 Elektrochemické senzory Elektrochemické senzory obsahují čidlo s převodníkem chemické veličiny na elektrickou, který je tvořen pouze elektrodami. Převodníkem je roztok v pevné nebo kapalné fázi. Ten je připojený na elektrody, pomocí nichž se elektrická veličina měří. Každý senzor obsahuje vždy nejméně 2 elektrody z různých materiálů (nejčastěji Pt nebo Au). Díky těmto drahým kovům se elektrody nerozpouští, jsou polarizovatelné. Elektrody lze propojit s elektrickým detektorem prostřed 165

191 nictvím vývodů, které jsou vyrobeny z různých kovů (Au) s přihlédnutím k co nejmenšímu termoelektrickému napětí, které může na spojení kovů vzniknout. V případě používání senzoru v roztocích je nutné jej chránit krycí vrstvou, která ponechá pouze elektrody ve styku s roztokem. Zobrazení takového senzoru ukazuje Obr. 3 [6, 8]. Obrázek 3: Elektrochemický senzor Převzato [2]. Elektrody mohou mít různý tvar a velikost, ale běžně se konstruují mikroelektrody hřebínkové v planární formě. Také se jim říká interdigitální mikroelektrody (anglická zkratka IDEs Inter Digitated Electrodes). Je to hlavně proto, že při zachování malé vzdálenosti elektrod a plochy čipu je plocha elektrod velká a tím i citlivost čidla. Na druhou stranu miniaturizace přináší problémy, které u standardních elektrod nebyly. Jedním takovým problémem je rozložení hustoty proudů. Toto rozložení není homogenní jako např. u deskových elektrod, ale probíhá sféricky či hemisféricky, přičemž se vzdáleností od substrátu se hustota snižuje (Obr. 4) [2, 3]. Obrázek 4: Průběh proudů mezi elektrodami. Převzato [2]. 1.6 Aplikace nanotechnologie v kombinaci s elektrochemií Nukleové kyseliny jsou jedny z nejvíce studovaných látek v oblasti bioelektrochemie. Proto je tato oblast rozvíjena pomocí nanotechnologií a to konkrétně v rámci izolace pomocí paramagnetických částic. Existuje mnoho různých postupů pro izolaci a purifikaci nukleových kyselin pomocí magnetizovatelných částic. Každý výrobce pro svůj produkt uvádí mírně odlišný postup. Všechny metody ale mají společný princip. Částice jsou vždy nejdříve promytím odděleny od roztoku, ve kterém byly uchovány. Následuje hybridizace, kdy se částice přidají k roztoku nukleových kyselin, které je potřeba purifikovat. Částice s již navázanými nukleovými kyselinami se opět promyjí pro odstranění kontaminantů a posledním krokem je eluce, kdy se nukleové kyseliny uvolňují do čistého roztoku. Po zajištění rovnoměrné disperze MPs v uchovávacím roztoku bylo do mikro zkumavky umístěno 10 μl MPs. Mikro zkumavka se poté umístila na magnetický stojan, takže MPs byly vlivem vnějšího magnetického pole zmagnetizovány a přilnuly ke stěně zkumavky přilehlé k magnetickému stojanu. Bylo tak možné odstranit z mikro zkumavky přebytečný uchovávací roztok. Následně bylo přidáno 20 μl promývacího roztoku, zkumavka byla odstraněna z vnějšího magnetického pole a manuálně byla zajištěna rovnoměrná disperze MPs v promývacím roztoku. Poté byla zkumavka opět umístěna na magnetický stojan a promývací roztok byl odstraněn. Přidal se čistý promývací roztok, ale disperze MPs byla tentokrát provedena automaticky, třepáním a následným odstředěním. Třepání bylo nastaveno na nejsilnější stupeň a probíhalo po dobu 20 s, odstředění probíhalo při centrifugační síle 285 g po dobu 1 sekundy. Celé promývání (s manuální i automatickou disperzí částic) bylo následně dvakrát zopakováno. 166

192 Obrázek 5: Schéma příkladu konstrukce mikroelektrod a mikropotenciostatu pro detekci molekul jako jsou nukleové kyseliny. Převzato [2]. Interaction surface Automatic procedure 4 sample 6 B 7 hybridization 10 3 washing A washing C 11 2 Separation surface 15 D 85 C E Detection surface Biotinilated ODN probe Biotinilated ODN probe Biotinilated ODN probe signal Obrázek 6: Schéma izolace nukleových kyselin pomocí paramagnetických částic s následnou elektrochemickou detekcí. Převzato [9] 167

193 Hybridizace je krokem, při kterém dochází k samotné izolaci a purifikaci nukleových kyselin. Na základě afinity nukleových kyselin k látce, kterou byl modifikován povrch MPs, dojde k jejich pevnému navázání na částice, pokud se nacházejí ve vhodném prostředí. Po odstranění promývacího roztoku tak bylo přidáno 10 μl roztoku hybridizačního, který zajišťuje vhodné podmínky pro hybridizaci, a 10 μl samotného vzorku. Hybridizace probíhala v několika cyklech po dobu 15 minut. Každý cyklus sestával z třepání na nejsilnějším stupni po dobu 20 s, s následným odstředěním při centrifugační síle 285 g po dobu 1 s. Po hybridizaci následovalo promytí částic s navázanými nukleovými kyselinami. Výše uvedený postup promytí byl proveden třikrát. K promytým částicím s navázanými nukleovými kyselinami bylo poté přidáno 30 μl elučního roztoku a eluce probíhala při 85 C po dobu 5 minut. Vlivem teploty a ph elučního roztoku byly nukleové kyseliny uvolněny z částic do elučního roztoku. Magnetizovatelné částice byly uchyceny ke stěnám zkumavky působením vnějšího magnetického pole a roztok obsahující pouze nukleové kyseliny byl přenesen do čisté zkumavky. Pro detekci výsledku izolace DNA byla použita elektrochemická analýza provedená pomocí adsorptivní přenosové techniky. Jako pracovní elektroda byla použita HMDE. Při adsorptivní přenosové technice se nukleové kyseliny adsorbují na povrch pracovní elektrody. Po adsorpci byla elektroda vyjmuta z roztoku a omyta ve vodě pro odstranění zbytku analytu, který se neadsorboval na povrchu rtuťové kapky. Následně došlo k detekci DNA pomocí square wave voltametrie v acetátovém pufru, který je vhodným elektrolytem pro analýzu nukleových kyselin. Typický záznam (voltamogram) detekce DNA pomocí square wave voltametrie viz Obr. 7. Obrázek 7: Typický voltamogram izolované DNA naměřený pomocí square wave voltametrie. Převzato [9]. 2 Závěr Cílem tohoto textu práce bylo provést velmi krátkou literární rešerši zabývající se přehledem o elektrochemických metodách a jejich aplikovatelnosti nejen v elektrochemických senzorech ale i ve spojení magnetizovatelnými mikro- a nanočásticemi. Ty lze využit pro izolaci a purifikaci nukleových kyselin. Byly popsány obecné podmínky této izolace a byly stručně shrnuty poznatky o metodách detekce nukleových kyselin, převážně pomocí elektrochemických metod, konkrétně square wave voltametrie. 3 Reference [1] YANG, Dongya Y.; ENG, Barry; WAYE, John S. Improved DNA extraction from ancient bones using silica based spin columns. American Journal of Physical Anthropology. 1998, Volume 105, Issue 4, s [2] SKLÁDAL, Petr. Biosensory. Brno, s. Skripta. Masarykova univerzita, Přírodovědecká fakulta. Dostupné z WWW: <orion.chemi.muni.cz/pskl/vyuka/biosensory. pdf>. [3] HUBÁLEK, J., KLOSOVÁ, K. Chemosenzory a biosenzory. Elektronická skripta. VUT Brno: p ISBN: ABM [4] [4] Nováková, L., Studium struktury a interakcí nukleových kyselin pomocí elektrochemických metod: Diplomová práce, MU Přírodovědecká fakulta, Brno 2007 [5] Paleček, E., Past, present and future of nucleic 168

194 169 acids electrochemistry, Talanta, č [6] WALKER, John; RAPLY, Ralph. Molecular Biology and Biotechnology. 5th Edition. Cambridge: RSC Publishing, Biosensors, s ISBN [7] Phenol chloroform extraction. In Wikipedia : the free encyclopedia [online]. St. Petersburg (Florida) : Wikipedia Foundation, 1 April 2009, last modified on 4 December 2010 [cit ]. Dostupné z WWW: < en.wikipedia.org/wiki/phenol chloroform_ extraction> [8] RUŽICKA, T. Tlustovrstvé amperometrické senzorové pole. Brno: Vysoké ucení technické v Brně, Fakulta elektrotechniky a komunikacních technologií, s. Vedoucí bakalárské práce Ing. Martin Adámek, Ph.D. [9] HÚSKA, Dalibor; HUBÁLEK, Jaromír; ADAM, Vojtěch; VAJTR, David; HORNA, Aleš; TRNKOVÁ, Libuše; HAVEL, Ladislav; KIZEK, René. Automated nucleic acids isolation using paramagnetic microparticles coupled with electrochemical detection. Talanta. 2009, Vol. 79, Issue 2, s ISSN

195 POZNÁMKY 170

196

197 ZÁKLADY, 16BIOSENZORY, APLIKACE, NANOTECHNOLOGIE 16Vojtěch Adam

198

199 1 Úvod V prosinci roku 1959 vystoupil americký fyzik a pozdější nositel Nobelovy ceny za fyziku Richard Phillips Feynman na konferenci Americké asociace fyziků, kde prohlásil, že na základě jeho znalostí nevidí žádný důvod, který odporuje možnosti pohybovat věcmi atom po atomu. Od této přednášky uplynulo téměř padesát let a vědci dostáli slovům tohoto velmi slavného fyzika. Proces miniaturizace dnes zasahuje do všech vědních disciplín od samotné fyziky, přes chemii až po biologii a medicínu. Samotná miniaturizace se dá definovat jako technologická snaha zmenšit zařízení využívaná člověkem. Nejprve se tato snaha dotkla mechanických, následně optických a v poslední době elektronických zařízení. Analytické přístroje byly vždy vyvíjeny s cílem využít specifické vlastnosti detekované látky analytu pro jeho citlivou, a pokud to podmínky dovolují selektivní, detekci. Postupný vývoj přináší stále nové požadavky na analytické instrumenty od velmi nízkých detekčních limitů, přes simultánní analýzu několika látek v jedné analýze, až po nízké provozní a technické náklady. V posledních několika letech se ovšem objevuje nový trend v navrhování takových přístrojů a tím je právě výše zmíněná miniaturizace. Snem vědců v mnoha oborech lidského bádání je mít přístroj, sondu, elektrodu, kterou ponoří či zavede do zkoumaného objektu, ať už ze živé či neživé přírody a bude moci monitorovat změny on line. A zde přichází velké pole působnosti pro elektrochemii, protože elektrochemické přístroje jsou v dnešní době jedny z nejlépe miniaturizovatelných nalytických instrumentů na světě. Podle definice uvedené v práci Reichnitze je biosensor analytický přístroj obsahující citlivý prvek biologického původu, který je buď součástí, nebo v těsném kontaktu s fyzikálně chemickým převodníkem. Poskytuje průběžný elektronický signál, který je přímo úměrný koncentraci jedné nebo několika (skupiny) chemických látek ve Obrázek 1: Princip funkce biosensoru. Bioreceptor (např. enzym, peptid protilátka) je vhodně navázán na fyzikálně chemický převodník (elektrody, termistor, piezoelektrické zařízení), který je schopen při navázání stanovované látky na biologickou část biosensoru detekovat změnu vyjádřenou teplem, světlem, změnou hmoty a dalších. Přepracováno z [8]. 172

200 vzorku. Obecně můžeme biosensory definovat jako zařízení využívající specifické biochemické reakce zprostředkované izolovanými enzymy, imunosystémy, tkáněmi, organelami nebo celými buňkami k detekci chemické látky, nejčastěji měřením elektrického, tepelného nebo optického signálu, které se provádí pomocí vhodného fyzikálně chemického snímače (Obr. 1). Mezi vyjmenované biologické elementy je nutno zařadit i neenzymové proteiny a nukleové kyseliny. Je patrné, že pojem biosensor je široce použitelný, velmi populární i módní. Kromě toho je aplikace biosensorů mezioborové, zasahuje do oblastí biochemie a biotechnologie, analytické a fyzikální chemie, elektroniky, informatiky a nauky o materiálech. Základní schéma biosensoru je zobrazeno na Obr. 1. Z obrázku vyplývá, že se biosensor obecně skládá z biologické části (tzv. bioreceptoru či biorekogničního prvku) a fyzikálně chemického převodníku. 2 Vlastnosti biosensoru Citlivost je konečná ustálená změna výstupního signálu biosensoru (S) v důsledku změny koncentrace analytu tj. ΔS/Δc, nebo ds/dc. Při provádění kinetických měření (sleduje se časová změna signálu ds/dt) se citlivost vypočítá jako Δ(dS/dt)/Δc. Speciálními druhy signálu mohou být plocha (časový integrál), frekvenční analýza apod. V ideálním případě by citlivost měla být konstantní a maximální po celou dobu životnosti biosensoru. Kalibrace spočívá ve vystavení biosensoru různým standardním roztokům o známé koncentraci analytu. Kalibrační body by měly uzavírat pracovní oblast biosensoru, aby nebylo třeba provádět nespolehlivé extrapolace. Je vhodné použít co nejméně kalibračních bodů, pokud je znám tvar kalibrační závislosti (nejvhodnější je samozřejmě přímka), stačí 1 nebo 2 body. Ideálně by stačilo provést kalibraci pouze 1krát pro nový biosensor, prakticky je ji nutné periodicky opakovat. Linearita u ideálního biosensoru existuje v celé pracovní oblasti, tj. biosensor má konstantní cit livost pro všechny možné koncentrace analytu, tj. od limitu detekce pro daný biosensor po limit daný rozpustností. Prakticky je oblast linearity pouze užším intervalem uvnitř pracovní oblasti. Nelineární části existují zpravidla v horní části (oblast saturace). Pro praktické použití biosensorů není linearita nezbytně nutná (počítače), ale je třeba mít stálý průběh kalibrační křivky. Nelineární úseky lze např. aproximovat několika přímkami. Nelineární kalibrační závislosti samozřejmě vyžadují víc kalibračních bodů a komplikují praktické použití. Šum je zejména elektromagnetické povahy, lze ho omezit elektrickým stíněním biosensoru a přívodních vodičů. Jiným zdrojem šumu mohou být turbulence vznikající při míchání. Snížení velikosti šumu lze dosáhnout uspořádáním elektronických měřících obvodů ( frekvenční závislosti zesilovačů, analogové filtry) nebo digitálními technikami (akumulace signálu, průměrování, vyhlazování). Limit detekce (LOD, limit of detection) biosensoru je nejnižší stanovitelná koncentrace analytu. Ideálně je dán rozlišením elektronického měřícího přístroje, obvykle je však zhoršován vedlejšími procesy. Pro definici se často používá velikost šumu (N, noise) signálu a limit detekce se bere pro poměr S/N = 3. S tímto výrazem se pojí mez stanovitelnosti metody (LOQ, limit of quantification), což je nejnižší množství analytu ve vzorku, které může být stanoveno jako exaktní hodnota s požadovanou hodnotou nejistoty. Signál pozadí (background) je signál v nepřítomnosti analytu, obvykle se automaticky odečítá od měřeného signálu: S = S(měřený) S(pozadí). V některých případech je výhodnější použít referentní koncentraci analytu a vůči ní vztáhnout měřený signál. Hystereze značí vliv minulých měření na aktuální signál. Ideálně by měla být nulová. Pozná se ze změny tvaru kalibračních křivek objevuje se na nich konkávní resp. Konvexní prohyb. Důvodem může být to, že vysoká koncentrace analytu může narušit okolí biosensoru nebo prostředí uvnitř bioreceptoru (nahromadění 173

201 produktů reakce, lokální změny ph či teploty) a to ovlivní následující měření. Vliv hysterese se může omezit zpomalením měření. Dlouhodobá stabilita (drift) je podmíněna změnami citlivosti biosensoru v čase. Citlivost obvykle klesá, ale může i přechodně vzrůst (změna biovrstvy ztenčení, nabobtnání). Postupný pokles citlivosti může být vyvolán oxidací povrchu kovových elektrod, usazováním vrstev proteinů či jiných biomolekul (měření in vivo), otrava biovrstvy těžkými kovy. Selektivita (vliv interferencí). Odezva biosensoru by měla být vyvolána pouze přítomností stanovované látky, ostatní látky by se neměly projevit. Prakticky je často nutné rušivé látky eliminovat (zředění, selektivní bariéra) nebo jejich příspěvek na měřený signál paralelně určit jiným sensorem. Rychlost odezvy je určována zejména fyzikálními vlastnostmi biosensoru (velikost). Závisí na rychlosti difúze analytu z okolního prostředí k povrchu biosensoru a dále pak vnitřní difúzí uvnitř systému biosensoru. Uplatňují se koncentrace analytu, velikost difúzních koeficientů, délka difúzní dráhy (počet vrstev biosensoru). Z praktického hlediska je výhodné, pokud odezva je limitována difúzí a nikoliv rychlostí bioreakce. Doba odezvy se obvykle určuje jako čas potřebný k dosažení určité velikosti signálu v konečném ustáleném stavu (τ ), např. t 90 pro dosažení 90 %. Rychlost konvekce je určena přísunem látek z okolí k biosensoru. Lze ji zvýšit zrychleným mícháním nebo tokem nosného média, je ovšem třeba dát pozor na vznik turbulentních jevů, které zase konvekci mohou zpomalit. Teplotní závislost při měřeních s biosensory působí jednak na difúzní jevy, jednak na probíhající chemické reakce. Proto se obvykle pracuje za isotermických podmínek, používá se vodní cirkulující termostat nebo vyhřívaný kovový blok. Životnost biosensoru je obvykle limitována nejslabším prvkem, což je bioreceptor. Přitom je třeba odlišit stabilitu při skladování (shelf life) od operační stability, která může být závislá na počtu a druhu analyzovaných vzorků. Pro dlouhodobé uložení biosensoru je obecně vhodná nižší teplota (chladnička, mraznička), z praktického hlediska je pohodlnější skladování v suchém stavu. Biokompatibilita má zvláštní význam pro biomedicínské aplikace (měření in vivo). Při umístění biosensoru přímo v krevním toku je třeba zamezit srážení krve (impregnace heparinem), ve tkáních hrozí nebezpečí zánětlivých reakcí, zajizvení a zarůstání pojivovou tkání. Případná sterilizace biosensoru nesmí negativně ovlivnit jeho aktivitu. 3 Fyzikálně chemické převodníky Pro konstrukci biosensorů se obecně používají čtyři různé druhy fyzikálně chemických převodníků a to elektrochemické, optické, piezoelektrické a akustické, a kalorimetrické. Elektrochemické systémy reprezentují nejrozšířenější typ převodníku používaného pro konstrukci biosensorů, zejména katalytických. Hlavními výhodami jsou jednoduchá konstrukce měřícího systému, nízké pořizovací náklady a výborná citlivost. Pro sestavení elektrochemického měřícího systému jsou zapotřebí nejméně dvě elektrody pracovní (měřící) a referentní. Podle aplikace a konstrukce biosensoru může být tento dvouelektrodový systém doplněn o elektrodu pomocnou. 3.1 Elektrody Samotné tříelektrodové zapojení, které bylo naznačeno v předchozí kapitole, má mnoho výhod oproti dvouelektrodovému. Jednou z hlavních pro samotné použití biosensoru v praxi je citlivost, která je v případě tříelektrodového zapojení řádově vyšší ve srovnání s použitím dvou elektrod. 174

202 3.1.1 Pracovní elektrody Elektrody představují jednu z významných možností jak snadno a rychle provést analýzu v environmentálním prostředí nebo v automatických systémech. Cílem je zavést jednoduchou a rychlou analýzu přímo in vivo. Pro elektrochemickou analýzu jsou využívány polarizovatelné elektrody. Polarizovatelné elektrody můžeme rozdělit na dvě hlavní skupiny rtuťové a pevné elektrody. Rtuťové elektrody Pro své dobré elektrické vlastnosti se nejčastěji používají kovové elektrody, mezi nimiž má zvláštní postavení rtuťová elektroda. Rtuťová elektroda má dokonale obnovitelný povrch, což je velmi výhodné při elektroanalytickém stanovení. Rtuťová elektroda je polarizovatelná ve větším rozsahu negativnějších potenciálů ve srovnání s ostatními kovovými elektrodami (díky vysokému přepětí vodíku na rtuti) a umožňuje sledování dějů probíhajících i ve velmi negativních oblastech potenciálů (až do 2 V) vzhledem k nasycené kalomelové elektrodě (saturated calomel electrode SCE). Rtuťové elektrody můžeme rozdělit na dvě hlavní skupiny: Kapající rtuťová elektroda (dropping mercury electrode; DME), která je využívaná v polarografické analýze. Hlavní výhodou je snadno definovatelný a obnovitelný povrch. Nevýhodou jsou velké nároky na objem analytu (1 2) ml. Visící rtuťová kapková elektroda (hanging mercury drop electrode; HMDE). HMDE je využívaná především ve voltametrii. Výhodou je, že celý experiment probíhá na jedné kapce (pracovní elektrodě). Studovaný analyt je možno akumulovat na elektrodě. Navíc je možné použit transferových metod. Pevné elektrody Podle jejich složení je možné je rozdělit na uhlíkové a kovové: Uhlíkové elektrody jsou při studiu biologicky aktivních látek vhodným doplněním elektrod rtuťových, neboť jsou polarizovatelné do oblasti kladných potenciálů (až nad +1 V na rozdíl od HMDE, kterou lze polarizovat jen asi k +0,2 V), čímž se rozšiřuje využitelná potenciálová oblast a možnost elektrochemického studia těchto látek. Nejvíce používanou pevnou pracovní elektrodou je uhlíková elektroda ze skelného uhlíku (glassy carbon electrode, GCE). GCE je připravován z polymerních fenolformaldehydových živic při kontrolovaném zahřívání v inertní atmosféře. Do této skupiny dále patří uhlíková elektroda z pyrolytického grafitu (pyrolytic graphite electrode; PGE). Významné postavení má uhlíková pastová elektroda CPE (carbon paste electrode; CPE). CPE je vyrobená ze směsi práškového grafitu (85 %) a minerálního oleje (maximálně do 15 %). Do CPE je možné dále přidávat další rozdílné příměsi. Složkami modifikované CPE mohou být jak nízkomolekulární látky, tak i vysokomolekulární látky. Kromě oleje je možné do uhlíkové elektrody vmísit vosk, a tak vzniká vosková uhlíková elektroda (WISGE), případně parafínem impregnovaná grafitová elektroda (PIGE). Z uhlíkových vláken je možné připravovat ultramikroelektrody. Vlastní uhlíkové vlákno (5 20) µm se umístí do ústí skleněné kapiláry a upevní epoxidovým lepidlem. Síťovaný sklovitý uhlík (reticulated vitreous carbon; RVC) našel využití v průtokové analýze. Díky své vysoké pórovitosti má velký povrch a klade velmi nízký odpor protékající kapalině. Pracovní povrch kovových elektrod může být dále modifikován. Hlavním smyslem modifikace povrchu elektrody je zvýšení selektivity a citlivost. Povrch pevné elektrody může být pokryt vrstvou rtuti (vzniká filmová elektroda), nebo lipidy apod. Další zajímavou možností je interakce kovu v elektrodě se rtutí za vzniku amalgámy. Takové elektrody jsou označovány jako amalgámové. Elektrody mohou být podle jejich velikosti rozlišeny na makroelektrody (velikost plochy v cm 2 ), 175

203 minielektrody (DME, velké HMDE), semimikroelektrody (některé HMDE), mikroelektrody (meniskové elektrody) a ultramikroelektrody. V určitých případech analýzy je třeba zajistit dvě základní podmínky: a) miniaturizaci celého elektrodového systému; b) reprodukovatelnost měřícího postupu. Miniaturizace s sebou přináší výrazné zmenšení povrchu pracovní elektrody a tím je potřebné zajistit výrazně vyšší citlivost stanovení studovaného analytu. Plocha takové elektrody se z jednotek mm 2 zmenšuje na μm 2. Kromě vlastní měřící elektrody je důležité, aby došlo k výraznému zmenšení referentní elektrody Referentní elektrody Referentní elektrody slouží jako srovnávací bod pro měření respektive nastavování potenciálu pracovních elektrod. Jejich vlastní potenciál je přesně definovaný a pokud možno časově stálý. Mezi nejčastěji používané referentní elektrody patří elektrody druhého druhu, které jsou tvořeny kovem pokrytým vrstvičkou málo rozpustné soli a ponořený v roztoku anionů této soli. U vyráběných elektrod se vždy před použitím zkontroluje hodnota potenciálu vůči kvalitní referentní elektrodě. Referentní elektrody se obvykle uchovávají v roztoku KCl a nesmí se nechat vyschnout. U amperometrických biosensorů, kdy stabilita referentní elektrody není až tak kritická, se často používá pouze holý povrch stříbra a jako elektrolyt slouží okolní prostředí Pomocné elektrody Pomocné elektrody musí být tvořeny z dobrého vodiče s dostatečnou plochou a elektrochemicky neaktivní. Používá se platina ve formě drátku či plíšku, uhlíková tyčinka, mnohdy stačí i nerezový drát. Hlavním funkcí pomocné elektrody je zbavit proudového zatížení referentní elektrodu a tím snížit šum a chybu stanovení. 4 Bioreceptory Bioreceptor je velmi kritickou složkou biosensoru. Na jeho správné funkci záleží úspěch celé analýzy. Podle druhu dělíme bioreceptory na biokatalytické (enzym, organela, buňka, tkáň, orgán, organismus; analyt přeměňují v průběhu chemické reakce) a bioafinitní (lektin, protilátka, nukleová kyselina, receptor; analyt váží v afinitním komplexu). Nedávno bylo publikováno využití kovy vázajícího thiolu pro jako biologické složky biosensoru pro detekci těžkých kovů. 4.1 Thiolové sloučeniny Síra existuje v mnoha oxidačních stavech, což z ní dělá velmi univerzální prvek nezbytný v mnoha biologických sloučeninách a systémech. Nejvíce aktivní a zároveň redukovanou formou síry v biomolekulách je thiolová skupina ( SH). Můžeme ji nalézt ve velkém množství biologicky aktivních látek jako je aminokyselina cystein (Obr. 2), neproteinová aminokyselina homocystein a mnoho dalších. Thiolové sloučeniny mají velké množství biologických funkcí, jako jsou například kontrola genové exprese, signalizace a detoxikace těžkých kovů. Kromě toho mohou také sloužit jako markery mnoha různých onemocnění. Glutathion Glutathion (GSH) je ve vodě rozpustný tripeptid skládající se z glutaminu, cysteinu a glycinu (Obr. 2) a je nejrozšířenějším neproteinovým thiolem, vyskytujícím se prakticky ve všech buňkách rostlinných i živočišných organismů, hub a v některých prokaryotických organismech. Jeho koncentrace může v některých tkáních či pletivech dosáhnout milimolární hladiny. Jako důležitý antioxidant, GSH hraje důležitou roli v detoxikaci mnoha elektrofilních sloučenin (např. těžkých kovů) a peroxidů prostřednictvím katalýzy glutathion S transferázou a glutathion S peroxidasou. Kromě detoxikace se GSH účastní i dalších buněčných celulárních reakcí zahrnujících glyoxalátový cyklus, 176

204 Cys O GSH O O SH O GSSG H 2 N O OH H S NH 2 OH HO NH 2 NH O NH OH O HO HN O HN O S HO S NH NH O O NH 2 OH O O PC O H CH 2 SH H HN CH 2 C C NH COOH C CH 2 NH C CH 2 HOOC H O n (γ-glutamylcysteinyl) n glycin Obrázek 2: Chemická struktura cysteinu (Cys), redukovaného glutathionu (GSH), oxidovaného glutathionu (GSSG) a fytochelatinu (PC2). Převzato z [22]. redukci ribonukleotidů na deoxyribonukleotidy, regulaci proteinové a genové exprese prostřednictvím thiol disulfidové výměnné reakce. Glutathion může v organismu existovat ve dvou stavech: oxidovaném (GSSG) a redukovaném (GSH) (Obr. 2). Udržování optimálního poměru GSH : GSSG v buňce je kritické pro její přežití. Nedostatek glutathionu vystavuje buňku nebezpečí oxidativního poškození. A proto není překvapení, že nerovnováha tohoto poměru je pozorována v průběhu mnoha onemocněních např. rakoviny, neuro degenerativní onemocnění, cystická fibróza, HIV i stárnutí. Fytochelatiny (PC) GSH je dále součástí významných rostlinných peptidů, které jsou označovány jako fytochelatiny. PC mají základní strukturu (γ Glu Cys) n Gly, kde se dipeptidická repetice glutamové kyseliny a cysteinu (γ -Glu Cys) může opakovat 2 až 11krát (nejčastěji 2 5krát) (Obr. 2). Koncová aminokyselina (Gly) může být nahrazena jinou aminokyselinou (Ala, Glu, Ser), potom hovoříme o iso PC. PC obsahují velké množství cysteinu (SH skupiny odpovídají za vazbu iontů kovů) a jsou syntetizovány post translačně redukcí GSH takzvanou transpeptidizační reakcí. U PC bylo studováno kromě funkce detoxikační, která má vztah především k těžkým kovům také funkce homeostatická u kovů esenciálních. Bylo navrženo, že PC hrají roli v metabolismu esenciálních prvků. Například u Zn PC a Cu PC komplexů bylo potvrzeno, že mohou reaktivovat apoformu enzymu diamino oxidázy (transport Cu(II)) a karbon anhydrázy (transport Zn(II)). Autoři ale také prokázali, že z hlediska přenosu kovů k apoenzymu je komplex PC méně efektivní než samotné ionty kovu dodané v podobě sulfidu. Z těchto experimentů vyplývá, že v současné době jsou pouze nepřímé důkazy, že PC mají jinou roli než detoxikace iontů těžkých kovů. Role PC v metabolismu železa a síry byla navržena celou řadou autorů. 177

205 4.2 Metalothionein V živočišných organismech existuje také kovy vyvazující látka, protein metalothionein. Objev tohoto proteinu je datován rokem 1957, kdy Margoshes a Vallee izolovali nízkomolekulární protein z koňských ledvin. Metalothioneiny (MT) patří do skupiny intracelulárních, nízkomolekulárních na cystein bohatých proteinů o molekulové hmotnosti od (6 10) kda. Díky své vysoké afinitě k těžkým kovům (Zn, Cd, As, atd.) je jejich hlavní funkcí homeostatická kontrola a detoxikace iontů těžkých kovů v řadě různých organismů. Řetězec tohoto proteinu je složen z přibližně 60 aminokyselin (Obr. 3). V jeho molekule nejsou přítomny aromatické aminokyseliny a aminokyselina cystein nejvíce zastoupena. Obrázek 3: Zastoupení aminokyselin v molekule metalothioneinu. (C cystein, S serin, K lysin, G glycin, A alanin, T threonin, N asparagin, E kyselina glutamová, M methionin, P prolin, D kyselina asparagová, Q glutamin, I isoleucin). Převzato z [40]. Pomocí rentgenové krystalografické strukturní analýzy bylo zjištěno, že molekula MT se skládá ze dvou přibližně sférických domén α a β stejné velikosti o rozměrech 1,5 2, m, které jsou složeny z cysteinových klastrů. Sulfhydrylové zbytky cysteinů se účastní kovalentní vazby kovů. N terminální část peptidu, označená jako β-doména, má tři vazebná místa pro dvojmocné ionty a C terminální část (α-doména) má schopnost vyvázat čtyři dvojmocné ionty kovů. V případě jednomocných iontů kovů je MT schopen vázat celkem až 12 atomů. Pro β doménu, která obsahuje 3 kovy (II) a 9 S skupin, byla navržena struktura cyklohexanu. Pro α-doménu, která obsahuje 4 kovy (II) a 11 S skupin, pak struktura adamantanu v jednom rohu otevřená. Výsledných 6 negativních nábojů je kompenzováno NH 3+ skupinami lysinu. Celkový záporný efektivní náboj se pohybuje v rozmezí 2 3 na molekulu MT. Domény se liší svojí stabilitou a afinitou ke kovům. Obecně je β-doména méně stabilní vůči chelatačním i alkylačním činidlům působím na SH skupiny. Kovy nejsou distribuovány mezi doménami nahodilým způsobem. Afinita iontů kovů k α-doméně klesá v pořadí Cd, Zn, Cu a k β-doméně klesá v pořadí Cu, Zn, Cd. Na základě sekvenční analýzy bylo popsáno 15 MT rodin a 38 MT podrodin. Fylogenetický vztah různých rodin MT byl získán z proteinové a genové sekvence. Výsledky umožnily rozlišit fylogeneticky podobné rodiny a podrodiny evolučně podobných komplexů obratlovčích rodin MT. Metalothioneiny byly rozděleny nejdříve do tří tříd. Třída I jsou MT vyskytující se u různých savčích druhů. Třída II jsou všechny ostatní proteinové MT nepatřící do třídy I. Do třídy III byly zařazeny metaloisopolypeptidy obsahující gamaglutamyl cysteinovou jednotku. Metalothioneinová superrodina je fenomenologicky definována jako polypeptidy odvozené od metalothioneinu z koňských ledvin. Základní obecnou vlastností je nízká molekulová hmotnost, vysoký obsah kovů, charakteristický aminokyselinový obsah (vysoký obsah cysteinů, nízký obsah aromatických aminokyselinových zbytků). Cysteinové zbytky vytváří repetice a tak thiolátové klastery. Bylo navrženo několik MT rodin na základě charakteristické sekvence genů. Členové jedné rodiny vykazují sekvenčně specifické podobnosti. Další rodiny byly identifikovány u řady taxonomických skupin. Dále bylo možné rozlišit podrodiny, podskupiny, isoformy a nebo alelické isoformy MT. Sekvenční podobnost však často není dostatečná, a proto byla navržena definice klanu. Klany, sdružují MT podle jiných vlastností, tj. obecné struktury, termodynamických vlastností, kovy vázajících skupin a pod. Metalothionein nevykazuje absorpci v oblasti 178

206 280 nm, která je známa u bílkovin a odpovídá přítomnosti aromatických aminokyselin. V molekule metalothioneinu nejsou přítomné disulfidické můstky. Mohou se vyskytnout pouze jako artefakt, způsobený oxidací a vznikem polymerů. Metalothionein vykazuje v UV spektru absorpční pás, jehož maximum je přibližně shodné s absorpčním maximem komplexu daného kovu s thioly (např. maximum pro Cd MT je 250 nm). Charakteristickou vlastností MT je uvolňování kovu v kyselém prostředí, čehož se využívá při přípravě apomt. Masivní vzestup koncentrace MT byl pozorován u zvířat po intenzivním fyzikálním stresu. Fyziologická syntéza MT a koncentrace jsou závislé na průběhu buněčné proliferace. MT pravděpodobně umožňuje interakce mezi volným zinkem a vázaným do proteinů zinkových prstů, a tak jeho pravděpodobný vliv na genovou expresi. 5 Měřící uspořádání při práci s biosensory 5.1 Přímý kontakt se vzorkem Biosensor se nachází přímo ve sledovaném prostředí (řeka, tkáň, krevní řečiště, fermentor atd.). Přitom by jeho činnost neměla okolní prostředí ovlivnit vyčerpávání analytu důsledkem měření, ovlivnění toku jiných látek. Při tomto způsobu použití může být užitečné měnit polohu biosensoru, tak lze získat dodatečné informace o distribuci analytu v prostředí a odhalit případné existující koncentrační gradienty. 5.2 Uzavřená nádoba Biosensor je umístěn ve vhodné nádobce (často opatřená vodním pláštěm pro temperaci a magnetickým míchadlem). Nejprve se vyčká ustavení pozadí signálu v přítomnosti pracovního roztoku (pufr obsahující dle potřeby další pomocné reagenty). Přidá se vzorek a po ustálení se odečte signál. Přídavky vzorku lze často několikrát opakovat. Někdy je možné celou nádobku vy plnit vzorkem (např. voda, mléko). Podmínky měření (druh a koncentrace pufru, teplota, ph) je vhodné pro každý typ biosensoru optimalizovat. Toto uspořádání je velmi jednoduché a nenáročné na vybavení, nevýhodou je potřeba manuální obsluhy. 5.3 Průtočný systém Biosensor je umístěn ve vhodné průtočné cele. Jsou možné dva způsoby činnosti: A) Systémem se nechá střídavě protékat zóna základního roztoku a zóny vzorků. Měřený signál je funkcí odezvy přímo neředěného vzorku analytu. B) Při druhém způsobu systémem neustále protéká pracovní roztok, do kterého se nastřikují vzorky (FIA, flow injection analysis). Přitom vždy dojde k definovanému naředění vzorku a signál má charakteristický tvar píků. Vyhodnocuje se buď jejich výška, nebo plocha. Průtočná uspořádání umožňují automatizovat měření. 6 Praktické využití Jak je zmíněno výše, z pohledu biologické složky můžeme biosenzory pro detekci těžkých kovů obecně rozdělit na proteinové a biosenzory založené na použití DNA. Biosenzory využívající nukleových kyselin jsou pro detekci iontů těžkých kovů nově se rozvíjejícím odvětvím, kde mezi první publikace patří biosenzor pro detekci olovnatých iontů. Proteinové se mohou dále dělit na enzymové a afinitní, které zahrnují protilátkové biosenzory. V následujících kapitolách je uveden stručný přehled jednotlivých skupin a jejich aplikací pro různé těžké kovy. 6.1 Enzymové biosenzory Pro detekci iontů kovů byla použita řada různých enzymů, přičemž samotná detekce je založena na aktivaci či inhibici enzymové aktivity. Detekovaný ion těžkého kovu aktivuje enzym, 179

207 pokud tvoří nedílnou součást struktury, anebo jej inhibuje v případě, že je schopen se vázat do aktivního centra použitého enzymu a tak jej inaktivovat. Byl vyvinut biosenzor pro detekci zinečnatých iontů založený na aktivaci alkalické fosfatázy, protože je tento ion součástí aktivního centra enzymu. Celý systém byl implementován do podoby mikro injekční průtokové analýzy ve spojení s kalorimetrickým senzorem. Enzym byl kovalentně imobilizován a autoři deklarují, že byli schopni stanovit zinečnaté ionty v rozmezí od mikromolárních až po milimolární koncentrace. Doba odezvy byla tři minuty, což je velmi důležité pro analýzu většího počtu vzorků. Autoři navíc dosáhli pozoruhodné stability biosenzoru, kdy byli schopni analyzovat vzorky více než dva měsíce bez větší ztráty citlivosti a selektivity. Biosenzory pro detekci iontů těžkých kovů založené na inhibici enzymové aktivity používány několikanásobně více ve srovnání s aktivačními. Iontů kovů se nejčastěji vážou na. Mezi nejběžněji používané enzymy patří oxidázy a dehydrogenázy. Tyto enzymy jsou imobilizovány pomocí síťování v želatinovém filmu anebo afinitní interakcí se speciálním typem membrány. Pro detekci rtuťnatých iontů byla použita L glycerolfosfát oxidáza ve spojení s Clarkovou elektrodou, kde bylo dosaženo detekčního limitu 20 µm. Biosenzor bylo možné regenerovat pomocí kyseliny ethylendiamintetraoctové (EDTA) a dithiothreitolu. Stejní autoři následně pro srovnání použili pyruvát monoaminooxidázu a dosáhli o tři řády nižšího detekčního limitu (50 nm rtuťnatých iontů). Biosenzor bylo možné také regenerovat. Dále byl vyvinut biosenzor, který byl složen z enzymatického systému zahrnující L laktát dehydrogenázu a na přítomnost iontů kovů necitlivou L laktát oxidázu, který se ukázal být vhodný pro detekci několika různých iontů kovů. Dosažené detekční limity byly následující 1,0 µm HgCl 2, 0,1 µm AgNO 3, 10 µm CdCl 2, 10 µm ZnCl 2, 50 µm Pb (CH 3 COO) 2 a 250 µm CuSO 4. Tento systém byl dále využit pro detekci Hg(II), Ag(I), Pb(II), Cu(II) a Zn(II) iontů, kde autoři Fenouh a kol. dosáhli až o dva řády nižších detekčních limitů ve srovnání s předchozí prací. Biosenzor bylo možné regenerovat ve směsi EDTA, KCN a dithiothreitolu. Inhibiční působení iontů chrómu na L laktát dehydrogenázu, hexokinázu a pyruvát kinázy bylo využito pro tvorbu na chróm citlivých biosenzorů. V této studii bylo navíc využito různých interferentů, včetně kovových iontů, a výsledky byly vyhodnoceny pomocí umělých neuronových sítí. Specifická inhibice peroxidázy rtuťnatými ionty byla zkoumána po imobilizaci enzymu v chitosanu. Dosažený koncentrační interval použitelnosti byl 0,02 až 1000 µm Hg(II). Další velkou skupinu enzymových biosenzorů tvoří ty založené na enzymu ureáze. Optický biosenzor založené na ureáze imobilizované na skleněných pórech byl vyvinut pro stanovení rtuťnatých iontů. Detekční interval byl ale pouze v řádu jednotek až desítek µm. Jeden z jednorázových přístupů využívajících ureázu byl založen na kombinaci čpavek citlivé optody a optody citlivé na amonné ionty. Detekční limity byly následující Ag (I) 0,18 µm, Hg(II) 0,35 µm a Cu(II) a 3,94 µm. Studie také ukázala, že tři zmíněné kovy mají synergické účinky na inhibici, kdy při analýze směsi zmíněných iontů kovů docházelo k vyšší inhibici v porovnání s jednotlivými kovy. Kromě optod byly v kombinaci s ureázou využity tranzistorové elektrody ISFET (ion sensitive field effect transistor). Takto navržený systém dosáhl detekčního limitu v řádech jednotek µm Ag(I), Hg(II) a Cu(II). Autoři dále navrhli způsob, kdy byli schopni při použití NaI maskovat Ag(I) a pomocí EDTA maskovat Cu(II), čímž získali biosenzor specifický na přítomnost Hg(II). Inhibice ureázy rtutí byla také studována pomocí potenciometrického biosenzoru. Interakce ureázy s nikelnatými ionty patří mezi další velmi slibné možnosti v navrhování biosenzorů pro detekci těžkých kovů. Nedávno bylo ukázáno, že systém ureázy a glutamové dehydrogenáza je možné použít pro detekci rtuťnatých, mědnatých, kademnatých a zinečnatých iontů pomocí amperometrické detekce. 180

208 6.2 Afinitní biosenzory Pro ne enzymatické neboli afinitní biosenzory je oblasti detekce iontů těžkých kovů používána široká škála kov vázajících proteinů od přirozeně se vyskytujících až po uměle připravené pomocí proteinového inženýrství, které jsou většinou specifické pro jeden ion kovu. Proteiny vázající těžké kovy jako SmtA metalothionein, regulační protein MerR, periplasmatický protein MerP a syntetický fytochelatin EC20 jsou nejčastěji používány pro navrhování biosenzorů pro stanovení různých iontů těžkých kovů, jako je rtuť, měď, kadmium, zinek a olovo v širokém rozmezí koncentrací od fm až po mm. Tyto biosenzory mají kromě širokých koncentračních intervalů, použitelnosti a selektivity, také přijatelnou dobu stability a to přibližně 2 týdny. Biosenzor založený na použití syntetického fytochelatinu a detekce elektronické kapacity byl úspěšně použit pro detekci Hg(II), Cd(II), Pb(II), Cu(II) a Zn(II) iontů v rozsahu 100 fm 10 mm. Biologická složka byla regenerovatelná v EDTA se stabilitou 15 dní. Fytochelatin2 byl dále použit pro detekcí kademnatých a olovnatých iontů. Fúze SmtA metalothioneinu ze sinic a glutation S-transferázy ilustruje jeden přístup použitý v biosenzingu iontů těžkých kovů. Takto upravený metalothionein vykazoval širokou selektivitu k různým těžkým kovům (Zn(II), Cd(II), Cu(II) a Hg(II)) s vysokou citlivostí až na jednotky fm. Glutation S-transferázy SmtA elektrody byla založena na detekci elektrické kapacity a bylo možné ji regenerovat pomocí EDTA a skladovat více než 16 dnů. Králičí metalothionein byl úspěšně použit jako biologická složka biosenzoru pro detekci kademnatých a zinečnatých iontů, paladnatých iontů, stříbrných iontů a cisplatiny. Kromě elektrochemických biosenzorů byl autory Zeng a kol. navržen velmi citlivý biosenzor pro in situ detekci Cu(II), který byl založen na použití fluorescenčně značené lidské karboanhydrázy II a optody. Detekční limit byl 0,1 pm. Nevýhodou navrženého biosenzoru byla jeho stabilita, která byla pouhých dvanáct hodin a dále interferenty v podobě Zn(II) a Hg(II). Pozoruhodnou citlivost na přítomnost měďných iontů ukazují autoři Changela a kol., kterým se pomocí proteinu CueR, který patří k aktivátorům transkripce u E. coli, podařilo detekovat analyt v řádu 10 21, což je na úrovni molekul. Myší metalothionein byl použit jako složka fluorescenčního biosenzoru pro detekci kademnatých iontů. A dále byl pomocí proteinového inženýrství připraven mutant zeleně fluoreskujícího proteinu (GFP) nazvaný BFPms1, který byl použit pro detekci iontů kovů na základě změny jeho fluorescenčních vlastností. Zn(II) a Cu(II) se vážou na tento protein, kdy vazba zinečnatých iontů způsobí konformační změny vedoucí ke zvýšení intenzity fluorescence, zatímco vazba mědnaté ionty zháší fluorescenci daného mutantního proteinu. Imunodetekce patří mezi další způsoby stanovení iontů kovů a nabízí výrazné výhody oproti tradičním detekčním metodám, jako jsou vysoká citlivost, selektivita a jsou teoreticky použitelné pro některé kovové komplexy, u nichž je možné připravit protilátku. Monoklonální protilátky byly připraveny pro komplexy EDTA zejména s kademnatými, rtuťnatými, měďnatými, nikelnatými, olovnatými, kobaltnatými a stříbrnými ionty. Připravené protilátky měly nejvyšší afinitu k Cd(II) s detekčním limitem 100 µm. Další autoři připravili monoklonální protilátky pro detekci tohoto komplexu s o tři řády nižším detekčním limitem. Dále byly připraveny protilátky pro detekci zinečnatých, kobaltnatých a nikelnatých iontů s různými kompletačními činidly. 7 Závěr Některé směry pro další výzkum v oblasti biosensorů byly navrženy Evropskou unií. Výzkum by se měl soustředit na problémy spojené s miniaturizací sensorů, dále pak na výrobní techniky, přípravu a chemickou modifikaci povrchů matric a sensorů, vývoj nových materiálů, značení a přípravu konjugátů, proteinové inženýrství, hledání nových enzymů, stabilizační postupy, 181

209 biokompatibilitu, kinetiku a modelování, neinvazivní monitorování, interakce na rozhraních, chemické procesy v pevné fázi a chemometrii. Mezi oblasti, kam biosensory zasahují nebo mohou potenciálně zasáhnout, jsou zdravotnictví, potravinářství a fermentační průmysl, ochrana životního prostředí a vojenská a bezpečnostní oblast (Obr. 4). Závěrem lze říci, že s rozvojem nanomateriálů můžeme očekávat intenzivní pokrok i v oblasti biosensorů. Obrázek 4: Oblasti praktického využití biosensorů. 8 Reference [1] R. P. Feynman, Structure of Proton, Science, 1974, pp [2] S. Sengupta and R. Sasisekharan, Exploiting nanotechnology to target cancer, British Journal of Cancer, 2007, pp [3] J. Petrlova, D. Potesil, R. Mikelova, O. Blastik, V. Adam, L. Trnkova, F. Jelen, R. Prusa, J. Kukacka and R. Kizek, Attomole voltammetric determination of metallothionein, Electrochim. Acta, 2006, pp [4] J. Petrlova, R. Mikelova, K. Stejskal, A. Kleckerova, O. Zitka, J. Petrek, L. Havel, J. Zehnalek, V. Adam, L. Trnkova and R. Kizek, Simultaneous determination of eight biologically active thiol compounds using gradient elution liquid chromatography with Coul Array detection, Journal of Separation Science, 2006, pp [5] O. Zitka, A. Horna, K. Stejskal, J. Zehnalek, V. Adam, L. Havel, L. Zeman and R. Kizek, Study of structural changes of lactoferrin using flow injection analysis with electrochemical detection on glassy carbon electrode, Acta Chim. Slov., 2007, pp [6] G.A. Rechnitz, Biosensors into the 1990 s, Electroanalysis, 1991, pp [7] P. Vopalensky, T. Ruml and P. Kotrba, Biological components of heavy metal biosensors, Chem. Listy, 2007, pp [8] P. Skladal Biosenzory, Masarykova univerzita Brno, Brno, [9] D.C. Harris Quantitative chemical analysis, W. H. Freeman and Company, New York, [10] M.U.A. Bromba and H. Ziegler, Application hints for Savitzky Golay digital smoothing filtres, Anal.Chem., 1981, pp [11] K. Markusova Elektrochemicke metódy, Univerzita Pavla Jozefa Šafarika v Kosiciach, Kosice, [12] J. Wang Analytical Electrochemistry, VCH Publishers, Inc., New York, [13] J. Heyrovsky and J. Kuta Zaklady polarografie, ÈS AV, Praha, [14] J. Garaj, J. Bercik, D. Bustin, J. Èeròak, J. Štefanec and M. Traiter Fyzikalne a fyzikalnochemicke analyticke metódy, Vydavatelstvo technickej a ekenomickej literatury, Bratislava, [15] R. Solna and P. Skladal, Amperometric flow injection determination of phenolic compounds using a biosensor with immobilized laccase, peroxidase and tyrosinase, Electroanalysis, 2005, pp [16] M. Pohanka and P. Skladal, Piezoelectric immunosensor for Francisella tularensis detection using immunoglobulin M in a limiting dilution, Anal. Lett., 2005, pp [17] R. Solna, E. Dock, A. Christenson, M. Winther Nielsen, C. Carlsson, J. Emneus, T. Ruzgas and P. Skladal, Amperometric screen printed biosensor arrays with co immobilised oxidoreductases and cholinesterases, Anal. Chim. Acta, 2005, pp [18] C.-M. Wu and L.-Y. Lin, Immobilization of metallothionein as a sensitive biosensor chip for the detection of metal ions by surface plasmon resonance, Biosen. Bioelectron., 182

210 2004, pp [19] S.E. Moriarty Craige and D.P. Jones, Extracellular thiols and thiol/disulfide redox in metabolism, Annu. Rev. Nutr., 2004, pp [20] A. Meister and M.E. Anderson, Glutathione, Ann. Rev. Biochem., 1983, pp [21] D.M. Townsend, K.D. Tew and H. Tapiero, The importance of glutathione in human disease, Biomed. Pharmacother, 2003, pp [22] C.S. Cobbett, Phytochelatins and their roles in heavy metal detoxification, Plant Physiol., 2000, pp [23] S.L. di Toppi and R. Gabbrielli, Response to cadmium in higher plants, Environ. Exp. Bot., 1999, pp [24] R. Prusa, R. Kizek, L. Trnkova, J. Vacek and J. Zehnalek, Study of relationship between metallothionein and heavy metals by CPSA method, Clinical Chemistry, 2004, pp. A28-A29. [25] M.H. Zenk, Heavy metal detoxification in higher plants - a review, Gene, 1996, pp [26] P.M. Ridker, C.H. Hennekens, J.E. Buring and N. Rifai, C reactive protein and other markers of inflammation in the prediction of cardiovascular disease in women, N. Engl. J. Med., 2000, pp [27] D. Grill, M. Tausz and L.J.D. Kok Plant Ecophysiology, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Boston, London, [28] D. Grill, M. Tausz and L.J.D. Kok Significance of glutathione to plant adaptation to the Environment, Kluwer Academic Publisher, London, [29] H. Jefferies, J. Coster, A. Khalil, J. Bot, R. D. McCauley and J.C. Hall, Glutathione, Anz. J. Surg., 2003, pp [30] M. Asensi, J. Sastre, F.V. Pallardo, A. Lloret, M. Lehner, J. Garcia de la Asuncion and J. Vina, Ratio of reduced to oxidized glutathione as indicator of oxidative stress status and DNA damage, Methods Enzymol., 1999, pp [31] M.E. Anderson, Glutathione: an overview of biosynthesis and modulation, Chem Biol. Interact, 1998, pp [32] C.S. Cobbett, Phytochelatin biosynthesis and function in heavy metal detoxification, Curr. Opin. Plant Biol., 2000, pp [33] C.S. Cobbett, Heavy metal detoxification in plants: phytochelatin biosynthesis and function, IUBMB Life, 2001, pp [34] C.S. Cobbett and P.B. Goldsbrough, Phytochelatins and metallothioneins: roles in heavy metal detoxification and homeostasis, Annu. Rev. Plant. Biol., 2002, pp [35] C.S. Cobbett, A family of phytochelatin synthase genes from plant, fungal and animal species, Trends Plant Sci., 1999, pp [36] E. Grill, E.-L. Winnacker and M.H. Zenk, Phytochelatins: the principal heavy metal complexing peptides of higher plants, Science, 1985, pp [37] E. Grill, S. Loffler, E.-L. Winnacker and M.H. Zenk, Phytochelatins, the heavy metal binding peptides of plants, are synthesized from glutathione by a specific g glutamylcysteine dipeptidyl transpeptidase (phytochelatin synthase), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, pp [38] J. Thurmann, E. Grill, E.-L. Winnacker and M.H. Zenk, Reactivation of metal requiring apoenzymes by phytochelatin metal colmpex, FEBS Lett., 1991, pp [39] L. Sanita di Toppi and R. Gabbrielli, Response to cadmium in higher plants, Environ. Exp. Bot., 1999, pp [40] R. Kizek, J. Vacek, V. Adam and B. Vojtesek, Vztah metalothioneinu k rakovine a protinadorove lecbe, Klin. Biochem. Metab., 2004, pp [41] R. Kizek, J. Vacek, L. Trnkova, B. Klejdus and L. Havel, Application of catalytic reactions on a mercury electrode for electrochemical detection of metallothioneins, Chem. Listy, 2004, pp [42] K. Kasahara, Y. Fujiwara, K. Nishio, T. Ohmori, Y. Sugimoto, K. Komiya, T. Matsuda and N. Saijo, Metallothionein content correlates with the sensitivity of human small cell lung cancer lines to cisplatin, Cancer Res., 1991, pp [43] M. Studnickova, J. Turanek, H. Zabrsova, M. Krejci and M. Kysel, Rat liver metallothioneins are metal dithiolene clusters, J. Electroanal. Chem., 1997, pp

211 [44] D.J. Otvos and I.M. Armitage, Structure of the metal clusters in rabbit liver metallothinein, Biochemistry, 1980, pp [45] R. W. Olafson, Electrochemical characterization of metallothionein metal mercaptide complexes - Application of cyclic voltammetry to investigation of metalloproteins, Bioelectrochem. Bioenerg., 1988, pp [46] J.H.R. Kägi and Y. Kojima, Biochemistry of Metallothionein, Experientia. Suppl., 1987, pp [47] D.H. Hamer, Metallothionein, Annu. Rev. Biochem., 1986, pp [48] Y. Kojima, Definitions and nomenclature of metallothioneins, Methods Enzymol., 1991, pp [49] A.R. Rodriguez Characterisation of mammalian Cd, Zn metallothioneis using differential pulse polarography, in: C. Klaassen (Ed.), Methallothionein IV, Birkhauser Verlag Basel, Basel/ Switzerland, 1999, pp [50] J.W. Liu and Y. Lu, A colorimetric lead biosensor using DNAzyme directed assembly of gold nanoparticles, Journal of the American Chemical Society, 2003, pp [51] N. Verma and M. Singh, Biosensors for heavy metals, Biometals, 2005, pp [52] I. Satoh, An apoenzyme thermistor microanalysis for zinc(ii) ions with use of an immobilized alkaline phosphatase reactor in a flow system, Biosensors & Bioelectronics, 1991, pp [53] P. Corbisier, D. van der Lelie, B. Borremans, A. Provoost, V. de Lorenzo, N.L. Brown, J.R. Lloyd, J.L. Hobman, E. Csoregi, G. Johansson and B. Mattiasson, Whole cell- and protein based biosensors for the detection of bioavailable heavy metals in environmental samples, Analytica Chimica Acta, 1999, pp [54] T.K.V. Krawczyk, T. Moszczynska and M. Trojanowicz, Inhibitive determination of mercury and other metal ions by potentiometric urea biosensor, Biosensors & Bioelectronics, 2000, pp [55] J.C. Gayet, A. Haouz, A. Gelosomeyer and C. Burstein, Detection of heavy metal salts with biosensors built with an oxygen electrode coupled to various immobilized oxidases and dehydrogenases, Biosensors & Bioelectronics, 1993, pp [56] S. Fennouh, V. Casimiri, A. Geloso Meyer and C. Burstein, Kinetic study of heavy metal salt effects on the activity of L lactate dehydrogenase in solution of immobilized on an oxygen electrode, Biosensors & Bioelectronics, 1998, pp [57] D.C. Cowell, A.A. Dowman, T. Ashcroft and I. Caffoor, The detection and identification of metal and organic pollutants in potable water using enzyme assays suitable for sensor development, Biosensors & Bioelectronics, 1995, pp [58] T.N. Shekhovtsova, S.V. Muginova and N.A. Bagirova, Determination of organomercury compounds using immobilized peroxidase, Analytica Chimica Acta, 1997, pp [59] R. T. Andres and R. Narayanaswamy, Effect of the coupling reagent on the metal inhibition of immobilized urease in an optical biosensor, Analyst, 1995, pp [60] C. Preininger and O.S. Wolfbeis, Disposable cuvette test with integrated sensor layer for enzymatic determination of heavy metals, Biosensors & Bioelectronics, 1996, pp [61] V. Volotovsky, Y.J. Nam and N. Kim, Urease based biosensor for mercuric ions determination, Sensors and Actuators B Chemical, 1997, pp [62] J. Hubalek, J. Hradecky, V. Adam, O. Krystofova, D. Huska, M. Masarik, L. Trnkova, A. Horna, K. Klosova, M. Adamek, J. Zehnalek and R. Kizek, Spectrometric and voltammetric analysis of urease - nickel nanoelectrode as an electrochemical sensor, Sensors, 2007, pp [63] N. Verma and A. Singh, A Bacillus sphaericus based biosensor for monitoring nickel ions in industrial effluents and foods, Journal of Automated Methods & Management in Chemistry, 2006, pp. 4. [64] B.B. Rodriguez, J.A. Bolbot and I.E. Tothill, Urease glutamic dehydrogenase biosensor for screening heavy metals in water and soil samples, Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2004, pp

212 [65] B.B. Rodriguez, J.A. Bolbot and I.E. Tothill, Development of urease and glutamic dehydrogenase amperometric assay for heavy metals screening in polluted samples, Biosensors & Bioelectronics, 2004, pp [66] J. Castillo, S. Gaspar, S. Leth, M. Niculescu, A. Mortari, I. Bontidean, V. Soukharev, S.A. Dorneanu, A.D. Ryabov and E. Csoregi, Biosensors for life quality - Design, development and applications, Sensors and Actuators B Chemical, 2004, pp [67] I. Bontidean, J. Ahlqvist, A. Mulchandani, W. Chen, W. Bae, R. K. Mehra, A. Mortari and E. Csoregi, Novel synthetic phytochelatin based capacitive biosensor for heavy metal ion detection, Biosensors & Bioelectronics, 2003, pp [68] V. Adam, J. Zehnalek, J. Petrlova, D. Potesil, B. Sures, L. Trnkova, F. Jelen, J. Vitecek and R. Kizek, Phytochelatin modified electrode surface as a sensitive heavy metal ion biosensor, Sensors, 2005, pp [69] V. Adam, S. Krizkova, O. Zitka, L. Trnkova, J. Petrlova, M. Beklova and R. Kizek, Determination of apo metallothionein using adsorptive transfer stripping technique in connection with differential pulse voltammetry, Electroanalysis, 2007, pp [70] V. Adam, J. Petrlova, D. Potesil, J. Zehnalek, B. Sures, L. Trnkova, F. Jelen and R. Kizek, Study of metallothionein modified electrode surface behavior in the presence of heavy metal ions biosensor, Electroanalysis, 2005, pp [71] V. Adam, P. Hanustiak, S. Krizkova, M. Beklova, J. Zehnalek, L. Trnkova, A. Horna, B. Sures and R. Kizek, Palladium biosensor, Electroanalysis, 2007, pp [72] S. Krizkova, D. Huska, M. Beklova, J. Hubalek, V. Adam, L. Trnkova and R. Kizek, Protein based electrochemical biosensor for detection of silver(i) ions, Environmental Toxicology and Chemistry, 2010, pp [73] V. Adam, J. Petrlova, D. Potesil, P. Lubal, J. Zehnalek, B. Sures and R. Kizek, New electrochemical biosensor to determine platinum cytostatics to DNA structure, Chemicke Listy, 2005, pp [74] J. Petrlova, D. Potesil, J. Zehnalek, B. Sures, V. Adam, L. Trnkova and R. Kizek, Cisplatin electrochemical biosensor, Electrochimica Acta, 2006, pp [75] S. Krizkova, V. Adam, J. Petrlova, O. Zitka, K. Stejskal, J. Zehnalek, B. Sures, L. Trnkova, M. Beklova and R. Kizek, A suggestion of electrochemical biosensor for study of platinum(ii)-dna interactions, Electroanalysis, 2007, pp [76] D. Huska, I. Fabrik, J. Baloun, V. Adam, M. Masarik, J. Hubalek, A. Vasku, L. Trnkova, A. Horna, L. Zeman and R. Kizek, Study of Interactions between Metallothionein and Cisplatin by using Differential Pulse Voltammetry Brdicka s reaction and Quartz Crystal Microbalance, Sensors, 2009, pp [77] H.H. Zeng, R. B. Thompson, B.P. Maliwal, G.R. Fones, J.W. Moffett and C.A. Fierke, Real time determination of picomolar free Cu(II) in seawater using a fluorescence based fiber optic biosensor, Analytical Chemistry, 2003, pp [78] A. Changela, K. Chen, Y. Xue, J. Holschen, C.E. Outten, T.V. O Halloran and A. Mondragon, Molecular basis of metal ion selectivity and zeptomolar sensitivity by CueR, Science, 2003, pp [79] A. Varriale, M. Staiano, M. Rossi and S. D Auria, High affinity binding of cadmium ions by mouse metallothionein prompting the design of a reversed displacement protein based fluorescence biosensor for cadmium detection, Analytical Chemistry, 2007, pp [80] D.P. Barondeau, C.J. Kassmann, J.A. Tainer and E.D. Getzoff, Structural chemistry of a green fluorescent protein Zn biosensor, Journal of the American Chemical Society, 2002, pp [81] D.A. Blake, R. C. Blake, M. Khosraviani and A.R. Pavlov, Immunoassays for metal ions, Analytica Chimica Acta, 1998, pp [82] M. Khosraviani, A.R. Pavlov, G.C. Flowers and D.A. Blake, Detection of heavy metals by immunoassay: Optimization and validation of a rapid, portable assay for ionic cadmium, Environmental Science & Technology, 1998, pp [83] D.A. Blake, P. Chakrabarti, M. Khosraviani, F.M. Hatcher, C.M. Westhoff, P. Goebel, 185

213 D.E. Wylie and R. C. Blake, Metal binding properties of a monoclonal antibody directed toward metal chelate complexes, Journal of Biological Chemistry, 1996, pp [84] D.A. Blake, R. M. Jones, R. C. Blake, A.R. Pavlov, I.A. Darwish and H.N. Yu, Antibody based sensors for heavy metal ions, Biosensors & Bioelectronics, 2001, pp

214 187 POZNÁMKY

215 METHODS OF SURFACE NANOSTRUCTURING 17Dmitry 17ADVANCED Solovei

216

217 1 Introduction The emerging disciplines of nanodevices, including nanoelectronics, nanooptoelectronics and sensing, require the development of surface nanopatterning techniques to obtain large scale arrays of nanostructures (mostly nanoparticles and nanoholes) on a given substrate, for example silicon. In order to tailor the properties of nanostructure arrays and nanodevices, it is favorable to fabricate ordered arrays of nanostructures with tunable size, shape, and spacing, using different nanopatterning techniques that are applicable to a wide range of materials. Moreover, it is technologically required to develop nanopatterning techniques that allow high throughput, large pattern area, and low equipment costs. There are several methods to produce nanostructure arrays on substrates. In general, they can be divided into physical and chemical methods. Structuring using laser beam (ablation), electron beam, and ion beam, physical vapor deposition (PVD), and molecular beam epitaxy can be included in physical methods. Chemical, thermal, and electric discharge deposition from gas phase, including chemical vapor deposition (CVD), electrochemical vapor deposition (EVD), metalorganic chemical vapor deposition (MOCVD), and others, can be belong to chemical methods. Electrochemical oxidation (anodization) and electrochemical deposition methods, and methods of chemical etching (plasma chemical, ion, reactive ion, and electron beam surface modification) can be assigned to chemical methods as well. Besides, diverse self assembly processes, scanning probe techniques, sol gel techniques, and methods that utilize diblock copolymers can be employed for surface nanostructuring as well. Some methods for nanostructure formation combine both physical and chemical processes. Such methods may include photolithography of submicron resolution (extreme UV and X ray lithography), electron beam lithography (EBL), nanoimprinting and etching, and others. Using these methods, many kinds of metal, semiconductor, and metal oxide nanostructure arrays have been successfully fabricated on different substrates. Physical beam methods are usually used for the formation of metallic films with nanoscale thickness and morphology. Chemical gas methods, like CVD, EVD, MOCVD, PVD, and others, can be employed for the formation of nanoscale objects, like nanotubes, nanowires, nanofibers, etc., on flat or in nm scale flat surfaces. Electrochemical methods can be used for the formation of nanoporous films, nanodots, nanowires, etc. on metal oxide and metal structures. Chemical etching processes are used for the formation of thin film layers having nanostructured surfaces. Lithographic methods offer precise control over the size, shape, and spacing of nanostructures (or rather sub microstructures) on large surface area. Self assembly processes, which use interaction of nanoparticles to achieve the surface patterning, present efficient approaches in fabricating large areas of nanoparticle arrays. The scanning probe microscopy (SPM) techniques are writing processes on substrates using both scanning tunneling microscopy (STM) and atomic force microscopy (AFM) with ultra sharp nanotips. The resolution that can be obtained with the SPM techniques can vary from atomic sized to micrometer sized scale. The diblock copolymer technique uses interactions of two chemically distinct polymer chains to achieve ordered arrays of surface patterns with a size scale limited to chain lengths of the polymers. After removal of one component polymer, an ordered porous nanostructure can be obtained on substrates, which can be used as a mask for fabrication of nanodots or nanopores on substrates. However, there are some technical and application restrictions for each of these methods. The EBL method has its inherent limitations, such as limited pattern area, low throughput due to long exposure time, high purchase equipment costs, and restrictions coupled with the need to use resist materials. The self assembly processes of 189

218 We are dealing with epitaxy if a layer is deposited on a monocrystalline substrate in such a way that it adopts corresponding crystallogrananoparticles (including the diblock copolymer approach), however, suffer from a rather poor control of spatial and size distribution of the resulting nanostructures, and it is only applicable to limited classes of materials. Moreover, byproducts are sometimes generated in the wet chemical preparation of self assembling particles, which makes it difficult to keep the substrate surface clean. The SPM techniques, due to their slow writing processes, cannot easily be adapted in fabricating large areas of nanostructured surfaces. Based on these restrictions, realization of highly ordered nanopatterned surfaces using a process characterized by flexibility, high throughput, low cost, and high structural controllability represents an important and actual issue. 2 Methods for Surface Nanostructuring 2.1 Physical Methods Physical techniques include vacuum evaporation in which a material is deposited under secondary vacuum conditions (about 10 6 torr) onto a substrate maintained at a controlled temperature, and an extension of this known as molecular beam epitaxy (MBE), in which atoms are piled up on a crystalline substrate maintaining its crystallographic orientation (i.e. epitaxial growth). MBE operates in ultrahigh vacuum conditions (below torr) and allows precise control of growth parameters, which is required for production of monocrystalline films. During electron beam deposition, an electron gun (e gun) produces an electron beam accelerated to, e.g., 10 kev (Fig. 1). This beam is directed onto a target material, which is intended for deposition onto a substrate. The gun s advantage is its unlimited supply of evaporating material and applicability to non conductive and high melting materials. Its shortcomings lie in the production of radiation defects, for instance in the underlying oxide coating. Figure 1: Evaporation by means of an electron gun [6]. In case of laser ablation, the following process data are typical. A high energy focused laser beam (100 mj, 1 J/cm 2 ) is capable of eroding the surface of a target rotating with a velocity of one revolution per second. The material is vaporized and deposited onto the substrate, and, as a result, a film is produced at a rate of 0.07 nm/laser pulse. The growth can be supported by heating the substrate (to 750 C) and by chemical reactions (presence of oxygen at 50 Pa). So far, the used lasers are excimer, Nd:YAG, ruby, and CO 2 lasers. Advantages of laser ablation are deposition of materials of high melting points, a good control over impurities, possibility of vaporization in oxidizing environments, and stoichiometric vaporization. A shortcoming is the formation of droplets on the vaporized layer. A common system, described in literature, is presented in Fig. 2. Figure 2: A typical laser ablation system under O 2 partial pressure. Note the so called plume, a luminous cloud close to the irradiated target surface. RHEED detector: reflection high energy electron diffraction [14]. 190

219 phic orientation and is also monocrystalline. In many cases, the film takes 99.9 % of the entire solid state, as in the example of a Czochralski crystal, which is pulled from a narrow seed nucleus. If film and substrate are from the same material, we are dealing with homoepitaxy (e.g., silicon on silicon), otherwise with heteroepitaxy (e.g., silicon on sapphire). Another distinction is made by the phase from which the film is made: vapor phase epitaxy, liquid phase epitaxy (LPE), and solid state epitaxy. A subclass of vapor phase epitaxy is molecular beam epitaxy (MBE) see Fig. 3. required for the growth of nanoscale surfaces or objects. The fundamental chemical method is chemical vapor deposition (CVD), other chemical gas methods are based on technological principles of CVD with some modification of the fabrication process. The CVD process is performed in an evacuated chamber (Fig. 5), usually at elevated temperatures between (350 and 1 000) C. Figure 5: Schematic drawing of a microwave plasma CVD system [18]. Figure 3: Schematic structure of an MBE [15]. By using these physical methods it is possible to fabricate thin films of metals, metal oxides, and semiconductors, with thickness of about few nanometers, having nanoscale morphology (see few examples in Fig. 4). A) B) C) Figure 4: Bright field TEM image of a MnS/ZnSe structure on GaAs: the MnS film thickness varies in the range of 1.8 to 2 nm between 60 nm thick ZnSe cladding layers A); FESEM micrograph of noble metal modified TiO 2 films prepared by electron beam irradiation B) and corresponding TEM micrograph C) [17]. One or several gaseous species are let inside so that gas pressure increases to between very low and normal pressure. The gas flow hits the substrate at normal or glancing incidence, followed by dissociation (in the case of a single gas species) or a reaction between two species. In both cases, a newly formed molecule adheres to the substrate surface and participates in the formation of a new layer. Few examples of thin film layers fabricated by different CVD methods are shown in Fig. 6. A) B) 2.2 Chemical Methods Chemical methods typically involve a chemical reaction that leads to release of those species Figure 6: Films fabricated by CVD methods: SEM micrographs of TiO 2 Cu films deposited on silicon wafer A); SEM surface morphologies of the diamond film deposited from CO 2 /CH 4 /H 2 gas mixture B) [20]. 191

220 2.3 Electrochemical Methods Electrochemical methods, in particular electrochemical anodization, can be used for fabrication of nanoporous metal oxide structures from different valve metals (Al, Ti, W, Ta, etc.) with pore diameter changing between (5 and 500) nm on a large surface area. A) B) C) D) Additionally, it is possible to fabricate arrays of metal oxide nanodots and nanopillars from different valve metals, e.g. Ta, Ti, W or semiconducting materials, by electrochemical anodization technique. For this purpose, porous anodic alumina matrices, formed on a surface of valve metal layer by electrochemical anodizing process, are used very often. In this case, valve metal layer is oxidized locally through the alumina pores, yielding the possibility for formation of nanostructured tantalum, titanium, or tungsten oxide layers. Thus, during local anodization process through a porous alumina matrix, nanodots, nanosized pillars or columns of valve metals can be formed (see Fig. 9). A) Figure 7: Anodic alumina nanoporous membranes. Top view A) and cross sectional view B) of a membrane with pore diameter and cell size of about 65 and 105 nm, respectively.) is the top view of a pore widened membrane with ultra thin pore walls. D) is a schematic diagram of porous alumina membranes [1]. Nanoporous membranes with thickness from tens to hundreds of micrometers can be formed by anodizing metal foils (see Fig. 7) or nanoporus matrixes are produced by anodizing sputtered metallic layers with thickness from hundreds nanometers to few micrometers (see Fig. 8). In the case of thin film anodization process it is possible to create ultra thin nanosized porous templates (Fig. 8). B) C) Figure 8: Surface nano patterning using ultra thin alumina masks (UTAMs) - a typical UTAM on a Si substrate. The pore diameter, cell size, and thickness of the UTAM are about 80, 105, and 350 nm, respectively [1]. Figure 9: Ordered nano particle arrays (CdS) on Si substrate with part of the UTAM remaining, the average diameter and spacing of the nano particles are about 80 and 105 nm, respectively A); nanocolumns tantalum oxide array formed by electrochemically anodization process of Al/Ta metal layers sputtering deposited on to a silicon wafer B); views at various tilts of the surface of a WO 3 nanodot film which had been formed by anodic processing of Al/W/Ti metal layers sputtering deposited on to a silicon wafer C) [22]. 192

221 Electrochemical deposition process is also widely used for formation of nanostructured surfaces. Fabrication of nanowire, nanotube, nanopillar, and nanodot arrays on the flat surfaces or inside of porous alumina matrices or other templates is possible using this method. The chosen template has to be chemically stable in the electrolyte during the electrolysis process. Cracks and defects in the templates are detrimental to the nanostructure growth, since the deposition processes occur primarily in the more accessible cracks, leaving most of the nanopores unfiled. Particle track etched mica films or polymer membranes are typical templates used in a simple dc electrolysis. To use anodic aluminum oxide films in the dc electrochemical deposition, the insulating barrier layer, which separates the pores from the bottom aluminum substrate, has to be removed, and a metal film is then evaporated onto the back of the template membrane. It is also possible to employ an ac electrodeposition method in anodic alumina templates without the removal of the barrier layer, by utilizing the rectifying properties of the oxide barrier. In ac electrochemical deposition, although the applied voltage is sinusoidal and symmetric, the current is greater during the cathodic half cycles, making deposition dominant over the etching, which occurs in the subsequent anodic half cycles. Since no rectification occurs at defect sites, the deposition and etching rates are equal, and no material is deposited. The use of pulse currents is believed to be advantageous for the growth of crystalline wires because the metal ions in the solution can be regenerated between the electrical pulses and, therefore, uniform deposition conditions can be produced for each deposition pulse. One advantage of the electrochemical deposition technique is the possibility of fabricating multi layered structures within nanowires. By varying the cathodic potentials in the electrolyte which contains two different kinds of ions, different metal layers can be controllably deposited. Different examples of electrochemically synthesized nanowires, nanotubes, and nanodots for different materials (semiconductors and metals) are shown in Fig. 10. A) B) C) D) F) E) Figure 10: SEM micrograph of electrodeposited Cu 2 O nanowires A); SEM image of Au tubules B); SEM image of Ni nanotubes C); FE SEM images of the large scale uniform Cu 3 Se 2 nanowires with the AAM partly dissolved with 1 M NaOH D); SEM images of multi segmented Au/ Ni nanorod arrays on Au nanoparticle film E); Ni nanodots, with inset of AAO template, scale bar is 200 nm F) [27]. 2.4 Lithographic Methods The term lithography generally means a transfer of structures of an electronic or an image pattern into a thin radiation sensitive layer, a resist, by means of electromagnetic waves or particle beams. The execution of lithography involves a series process consisting of deposing the resist, exposure, and development of the resist Ultraviolet Lithography The process of continuous stepwise improvement of equipment and technologies ranging from visible through the near, medium and far ultraviolet (UV) to the vacuum UV is leading from a micro- to a true nanotechnology. Such a development was unbelievable several years ago. It seems possible, that, with the extension of optical projection of small structures into the extreme UV (EUV) range, further developments will address the medium nanometer range ((20 50) nm) and so the optical lithography will reach a seamless transition into EUV and X ray lithography. 193

222 2.4.2 Electron beam Lithography In electron beam (EB) lithography, like in the case of direct photolithographic writing of photomasks, a finely focused computer controlled electron beam is scanned over the substrate coated with a special electron beam sensitive resist. The areas that are not to be exposed are blanked, i.e. they are not illuminated with electrons. For irradiation, the semiconductor wafer coated with electron sensitive resist must be transferred into the high vacuum of the system. There, scanning can take place line by line (line scan procedure) or in a vector scan procedure, whereby the latter manifests higher throughput. Since not only chip for chip must be written one by one, but also each structure of each chip, the exposure procedure is time consuming. In order to minimize the writing time, the beam width in the point of focus can be continuously varied during writing (variable beam shape). The resolution of the electron beam lithography procedure of modern devices with finely focused beam is clearly smaller than 30 nm in line width; 5 nm structure widths are partly achieved. However, the writing time increases strongly with the required resolution, thus for direct writing of very fine structures irradiation times of some hours/substrate are expected. Few examples of patterns prepared by e beam lithography are shown in Fig. 11. A) C) B) Figure 11: SEM image of TaN UV pattern of 40 nm A), SEM image of 25 nm UV pattern B); SEM images of ultrahigh density resist dot arrays on Si substrate EB lithography C) [29] Ion Beam Lithography Ion beam lithography can be used for projection exposure with masks, but also, similarly to electron beam lithography, for direct writing. In the case of direct exposure with a finely focused ion beam, the higher particle mass in comparison to the electron mass causes a decrease of the required ion dose for resist exposure of about a factor of (10 100) in relation to the electron dose. Comparable to parallel light, parallel ion beams can be applied for proximity lithography. In analogy with optical proximity lithography, this process is characterized by only a small distance between a mask and a substrate; the distance is denoted as a proximity distance. A high resolution requires a constant distance between the mask and the substrate, which means a highly parallel arrangement and a low beam divergence. Because ion beams are virtually not diffraction limited, greater apertures can also allow for a high resolution. In addition, combinations of masks are applicable due to the highly parallel beam. Although this approach cannot decrease the dimensions of the periodic structures, small openings can be realized through the application of similar but slightly shifted masks. For the lithographic generation of structures in resists or the direct writing of small structures, lithography with a focused ion beam (focused ion beam lithography FIBL) is of special interest. Ion beams can be focused, and beam diameters in the lower nanometer range can be achieved. The interaction of energetic ions with the target material is more favorable than in the case of electron beams, because ion beams have only a reduced tendency to induce secondary electrons or X rays. Therefore, the excitation pear is reduced, and the resulting proximity effect minimized. A beam of energetic ions can be focused and used for local implantation of foreign atoms without the need of a mask. Therefore, the atoms to be implanted have to be used as the ion beam. With a focused ion beam (FIB), extremely small structures can also be realized, such as lines in GaAs of (2 3) nm width. 194

223 2.4.4 X ray Lithography Because of the substantially smaller wavelength in comparison to the optical lithography, diffraction patterns at structure edges occur only with structural widths well below 100 nm when using X rays. Therefore finer structures can be imaged with X ray lithography than with optical procedures. The wavelength of approximately 1 nm promises a considerably higher resolution. However, due to the Fresnel diffraction and because of the generated photo electrons, limiting effects occur for the minimum attainable structure width, so that the limit of the resolution as a function of the projection distance lies in the order of approximately 70 nm. X ray lithography also operates according to the step and repeat procedure with a 1 : 1 mask, which is transferred as the shadow image in the proximity distance. Plasma sources (see EUV) or synchrotron radiation are used as X ray sources. X ray lithography requires a mask with non absorbing material instead of the usual quartz masks with strength of about 3 mm and coated with chromium. Therefore, the substrate of the masked layer must have a low ordinal number (beryllium, silicon nitride, or silicon carbide) and must be present in the form of a thin, mechanically stable foil (thickness of approx. (5 10) μm). X ray lithography has been unsuccessful so far despite intensive research over more than two decades, because the optical lithography is substantially simpler to execute with the previous line widths. X ray lithography may be a solution for structure widths between (70 and 40) nm. Presumably, finer structures cannot be imaged. 2.5 Scanning Probe Techniques Scanning probe techniques, such as scanning force or scanning tunneling microscopy (STM), are important ultramicroscopic methods due to their ease of application and extremely high resolution (especially perpendicular to the surface plane). This high resolution made them attractive for nanotechnology. Besides the microscopic aspect (measurement and characterization of small structures), these techniques are also interesting as fabrication methods. STM is not only a microscopic method for highest (e. g. atomic) resolution, but also a tool for manipulations of very small structures, which had already been applied before the introduction of the SFM. The manipulation of single atoms and small molecules with a scanning tunneling probe is achieved by tuning the interaction between the tip and the atom/molecule on the one hand and between the atom/molecule and the surface on the other. Preferential treatment of one or the other interaction is achieved by adjustment of the STM potential in combination with the distance between the tip and surface. Thus single Cu atoms were moved or CO molecules were picked up and transferred by the STM tip on a crystalline Cu surface (Fig. 12). In an analogous experiment, Si atoms were moved on an Si(001) surface and arranged into lines, resulting in trench structures of 3 nm width and (2 3) nm depth. Electrically induced structure generation utilizes an electrical current to change the local surface state of the material. Metals or semiconductors are often transformed into their oxides, using the surface humidity layer or the ambient oxygen as a reaction partner (Fig. 12). The scanning tip positioning is realized by either force sensing (SFM) or is based on the tunneling current (STM). The latter uses the tunneling current for both distance control and local electrochemical transformation of the surface. Nanostructure generation by anodic oxidation with an SFM tip prefers materials with a tendency towards stable oxide surface layers. This is the case for Si, Al, and several transition metals. Thus the substrate is used as the anode. Voltages in the range between (2 30) V are used; this is because they have to overcome the oxidation potential of the substrate, and often voltage drops between the substrate and tip or as a result of resistive surface layers on the scanning tip. 195

224 A) B) C) Figure 12: Scanning probe based manipulation of single molecules on solid substrates: transfer of CO onto a Cu substrate A); Electrochemical processes during the anodic manipulation of metals and semiconductors with the scanning tunneling microscope B); Preparation of aluminum nanostructures by transfer from a scanning probe tip using an electrical pulse C) [32]. Electrical pulses allow the transfer of groups of atoms from the probe tip onto the substrate surface (Fig. 12). A) B) C) Larger clusters of about 100 nm diameter are created in the case of tungsten or aluminum tips. Line gratings with a periodicity of 100 nm were fabricated by an equidistant arrangement of deposited Al clusters. Voltage pulse induced material transfer from a gold tunneling tip creates gold islands of (10 40) nm diameters. A W tip wrote lines of only 0.8 nm width on a Ge monocrystalline surface. In Fig. 13, STM images of surfaces modified by scanning probe techniques are shown. Figure 13: STM images of the NBMN pda film on HOPG pattern formed by voltage pulses of 3.5 V and 2 ms A); STM image of Cu(111) with 0.1 % of a ML oxygen adsorbed at room temperature and some CO adsorbed at 15 K as obtained with a metal tip B); the 3D picture of the oxide lines prepared by LAO in the GaMnAs layer using the semi contact mode C) [34]. 2.6 Nanoimprinting and Nanoindentation Techniques Generally, nanoimprinting stands for a number of methods where definition of a lateral pattern of a surface layer is mechanically performed. The most important among these are embossing, 196

225 printing, and molding. These techniques are characterized by the fact that a template (master, stamp) carrying the envisaged nanopattern is replicated on a thin surface layer on a substrate. Some of these techniques are well known for patterning in the micrometer and sub millimeter range typical for micromechanical devices and microelectromechanical systems (MEMS). The novel feature of nanoimprint is its application for nanometer patterning as well as its use as a lithography technique. The latter means patterning of a thin layer, usually an organic material (polymer, resist) on top of a substrate. This patterned layer serves as a mask or enables mask definition for a subsequent etching step where the pattern is transferred to the substrate itself. Therefore in nanoimprint the template plays the role of a photomask in a conventional lithography process [6]. This technique has been proposed first by Chou and the term nanoimprint lithography (NIL) has become a generic term for all mechanical nano patterning concepts. The process itself is a hot embossing process (hot embossing lithography, HEL). Its principle is explained in Fig. 14. A substrate, covered with a thin layer of thermoplastic polymer, is heated up together with the template (stamp). At a temperature above the glass transition (glass transition temperature T g ) of the polymer, where its viscosity is sufficiently low to conform to the template, substrate and stamp are brought into contact and pressure is applied. As soon as the polymer has filled the stamp relief, the stack is cooled to below the polymer s T g and stamp and sample are separated, leaving the inverted pattern of the stamp frozen into the polymer layer as a thickness contrast. Finally, the polymer remaining in the gaps, the residual layer, is removed in an anisotropic dry etch step, thus completing the lithography process. The so patterned polymer layer is now ready for use as an etch mask for pattern transfer to the substrate or as a mask for lift off. For lift off, the patterned polymer layer is covered with evaporated metal layer. Due to the inhibited coverage of steep walls in an evaporation process the polymer can be dissolved, flooding away the metal on the top of it. The remaining metal corresponds to the stamp pattern and may be directly used as an electrical wiring. Alternatively it may again serve as an etching mask for patterning of the substrate. Due to the superior mask selectivity of metals compared to a polymer this is the preferred technique for pattern transfer in the several nanometer range. SEM images of few nanopattern stamps are shown in Fig 15. A) C) B) D) Figure 14: Patterned stamp (template) and sample (substrate with spincoated polymer layer) are heated to process temperature A) and brought into contact. As soon as the polymer has conformed to the stamp relief under pressure B) the stack is cooled down. Separation of stamp and sample C) is done below the glass temperature, where the thickness contrast is frozen in the polymer layer. The residual layer remaining is removed in an anisotropic dry etch process D) for opening of the mask windows [39]. A) B) C) D) Figure 15: SEM images of resist patterns obtained by the developed NIL equipment with quartz stamp; SEM images of A) and cross sectional view B) [40]; view of double layer PMMA nanostructures reverse nanoimprinted at the T g of PMMA (107 C) (C, D) [41]. 197

226 3 Conclusions Reviewed methods for surface nanostructuring can be used for the fabrication of ordered and not ordered arrays, films, layers of surface nanostructures with controllable size and morphology and adjustable properties. By using these methods it is possible to create nanostructured films and objects on large (square centimeters) and small (square micrometers) surface area with geometrical parameters ranging between 100 and 1 nm in one or more directions (0D, 1D, 2D, 3D nanostructures). In the last 15 years, the research field of nanostructuring and nanopatterning has expanded very fast and it has already shown many new ordered surface nanostructures, including ordered arrays of nanoparticles, nanodots, nanoholes, nanospheres, nanorings, nanowires, and nanotubes. These surface nanostructures present interesting properties that can be used in many application fields in optics, electronics, optoelectronics, magnetism, and sensing. Every method is good for some application. For example physical methods are suitable for the preparation of nanostructured films or layers with nanoscale thickness. Chemical methods are often used for the fabrication of nanostructured multilayers, diamond films, nanotubes, or fullerenes. Electrochemical methods are very suitable for the preparation of nanoporous matrices, templates, nanowires, and nanodots on a large surface area and it is a low cost technological process. Lithographic methods are very attractive for serial fabrication of nanostructured surfaces with high reproducibility of nanomorphology, but it is also a very expensive and complicated process. Scanning probe technique is good for single atom manipulation and fabrication of very local nanostructures on a small surface area, but it has high precision and usefulness for specific applications. Nanoimprinting and nanoindentation techniques have advantages of lithographic methods according to high reproducibility of nanomorphology, they are cheaper, but the lowest size of geometrical elements is about 100 nm. To increase the functionality and decrease limitations of the methods, it is a good practice to combine some methods together. For example, electrochemically formed porous templates can be combined with CVD synthesis of carbon nanotubes or electron beam evaporation of thin film. Nanoindentation technique can be used for fabrication of highly ordered nanoporous matrices. Lithographic process can be combined with physical, chemical, or electrochemical methods for the creation of nanostructured arrays of not self structuring materials. Anyway, research and development in the field of nanostructured surface formation is a continual process, evolving and improving constantly, allowing obtaining of new nanostructured materials for different practical applications. 4 References [1] Y. Lei, W. Cai and G. Wilde, Highly ordered nanostructures with tunable size, shape and properties: A new way to surface nano patterning using ultra thin alumina masks, Progress in Materials Science, 2007, pp [2] R. R. Krishnan, K.G. Gopchandran, V.P. MahadevanPillai, V. Ganesan and V. Sathe, Microstructural, optical and spectroscopic studies of laser ablated nanostructured tantalum oxide thin films, Applied Surface Science, 2009, pp [3] J.M. Gibson, Reading and Writing with Electron Beams, Physics Today, 1997, pp [4] S.B. Clendenning, S. Aouba, M.S. Rayat, D. Grozea, J.B. Sorge, P.M. Brodersen, R. N.S. Sodhi, Z.H. Lu, C.M. Yip, M.R. Freeman, H.E. Ruda and I. Manners, Direct Writing of Patterned Ceramics Using Electron Beam Lithography and Metallopolymer Resists, Advanced Materials, 2004, pp [5] M. Shinji and O. Yukinori, Focused ion beam applications to solid state devices, Nanotechnology, 1996, pp [6] W. Fahrner Nanotechnology and 198

227 Nanoelectronics, Springer, [7] M.F. Köhler, W. Nanotechnology, Wiley, [8] V.F. Puntes, K.M. Krishnan and A.P. Alivisatos, Colloidal Nanocrystal Shape and Size Control: The Case of Cobalt, Science, 2001, pp [9] G.M. Whitesides and B. Grzybowski, Self Assembly at All Scales, Science, 2002, pp [10] S. Kramer, R. R. Fuierer and C.B. Gorman, Scanning probe lithography using self assembled monolayers, Chemical Reviews, 2003, pp [11] T. Thurn Albrecht, R. Steiner, J. DeRouchey, C.M. Stafford, E. Huang, M. Bal, M. Tuominen, C.J. Hawker and T. Russell, Nanoscopic templates from oriented block copolymer films, Advanced Materials, 2000, pp [12] D.Y. Ryu, K. Shin, E. Drockenmuller, C.J. Hawker and T.P. Russell, A generalized approach to the modification of solid surfaces, Science, 2005, pp [13] D. Zschech, D.H. Kim, A.P. Milenin, S. Hopfe, R. Scholz, P. Goring, R. Hillebrand, S. Senz, C.J. Hawker, T.P. Russell, M. Steinhart and U. Gosele, High temperature resistant, ordered gold nanoparticle arrays, Nanotechnology, 2006, pp [14] M. Kawasaki, J.P. Gong, M. Nantoh, T. Hasegawa, K. Kitazawa, M. Kumagai, K. Hirai, K. Horiguchi, M. Yoshimoto and H. Koinuma, PREPARATION AND NANOSCALE CHARACTERIZATION OF HIGHLY STABLE YBA2CU3O7-DELTA THIN FILMS, Japanese Journal of Applied Physics Part 1-Regular Papers Short Notes & Review Papers, 1993, pp [15] H. Ibach and H. Lueth Solid State Physics: An Introduction to Principles of Materials Science, Springer Verlag, [16] M. Demper, L. Chen, C. Bradford, K.A. Prior and W. Heimbrodt, Dimensional dependence of the energy transfer in MBE grown MnS layers, Solid State Communications, 2010, pp [17] X.G. Hou and A.D. Liu, Modification of photocatalytic TiO2 thin films by electron beam irradiation, Radiation Physics and Chemistry, 2008, pp [18] M. Nagatsu, M. Miyake and J. Maeda, Plasma CVD reactor with two microwave oscillators for diamond film synthesis, Thin Solid Films, 2006, pp [19] J. Mungkalasiri, L. Bedel, F. Emieux, J. Dore, F.N.R. Renaud and F. Maury, DLI CVD of TiO2-Cu antibacterial thin films: Growth and characterization, Surface & Coatings Technology, 2009, pp [20] A. Kromka, O. Babchenko, T. Izak, K. Hruska and B. Rezek, Linear antenna microwave plasma CVD deposition of diamond films over large areas, Vacuum, 2012, pp [21] A. Mozalev, A.J. Smith, S. Borodin, A. Plihauka, A.W. Hassel, M. Sakairi and H. Takahashi, Growth of multioxide planar film with the nanoscale inner structure via anodizing Al/Ta layers on Si, Electrochimica Acta, 2009, pp [22] R. Calavia, A. Mozalev, R. Vazquez, I. Gracia, C. Cane, R. Ionescu and E. Llobet, Fabrication of WO3 nanodot based microsensors highly sensitive to hydrogen, Sensors and Actuators B Chemical, 2010, pp [23] A.L. Daltin, A. Addad and J.P. Chopart, Potentiostatic deposition and characterization of cuprous oxide films and nanowires, Journal of Crystal Growth, 2005, pp [24] M. Lai and D.J. Riley, Templated electrosynthesis of nanomaterials and porous structures, Journal of Colloid and Interface Science, 2008, pp [25] Q.T. Wang, Electrochemical template synthesis of large scale uniform copper selenides nanowire arrays, Materials Letters, 2009, pp [26] S.H. Yoo, L. Liu and S. Park, Nanoparticle films as a conducting layer for anodic aluminum oxide template assisted nanorod synthesis, Journal of Colloid and Interface Science, 2009, pp [27] R. E. Sabzi, K. Kant and D. Losic, Electrochemical synthesis of nickel hexacyanoferrate nanoarrays with dots, rods and nanotubes morphology using a porous alumina template, Electrochimica Acta, 2010, pp [28] Y. Fukushima, Y. Yamaguchi, T. Iguchi, T. Urayama, T. Harada, T. Watanabe and H. Kinoshita, Development of interference 199

228 lithography for 22 nm node and below, Microelectronic Engineering, 2011, pp [29] S. Hosaka, Z. Mohamad, M. Shirai, H. Sano, Y. Yin, A. Miyachi and H. Sone, Nano dot and -pit arrays with a pitch of 25 nm x 25 nm fabricated by EB drawing, RIE and nano imprinting for 1 Tb/in(2) storage, Microelectronic Engineering, 2008, pp [30] Y.-C. Tseng, K. Phoa, D. Carlton and J. Bokor, Effect of Diameter Variation in a Large Set of Carbon Nanotube Transistors, Nano Letters, 2006, pp [31] D. Basko, G.C. La Rocca, F. Bassani and V.M. Agranovich, Forster energy transfer from a semiconductor quantum well to an organic material overlayer, European Physical Journal B, 1999, pp [32] J.C. Weeber, C. Girard, J.R. Krenn, A. Dereux and J.P. Goudonnet, Near field optical properties of localized plasmons around lithographically designed nanostructures, Journal of Applied Physics, 1999, pp [33] G. Meyer, L. Bartels and K.H. Rieder, Atom manipulation with the STM: nanostructuring, tip functionalization, and femtochemistry, Computational Materials Science, 2001, pp [34] J. Voves, Z. Soban, M. Janousek, V. Komarnickij, M. Cukr and V. Novak, Nanostructures defined by the local oxidation of the ferromagnetic GaMnAs layer, Microelectronics Journal, 2009, pp [35] J.A. Rogers, M. Meier and A. Dodabalapur, Using printing and molding techniques to produce distributed feedback and Bragg reflector resonators for plastic lasers, Applied Physics Letters, 1998, pp [36] H. Becker and C. Gartner, Polymer microfabrication methods for microfluidic analytical applications, Electrophoresis, 2000, pp [37] S.Y. Chou, P.R. Krauss and P.J. Renstrom, IMPRINT OF SUB-25 NM VIAS AND TRENCHES IN POLYMERS, Applied Physics Letters, 1995, pp [38] S.Y. Chou, P.R. Krauss, W. Zhang, L.J. Guo and L. Zhuang, Sub-10 nm imprint lithography and applications, Journal of Vacuum Science & Technology B, 1997, pp [39] Y.-C. Lee and S.-H. Tu Improving the Light Emitting Efficiency of GaN LEDs Using Nanoimprint Lithography, in: B. Cui (Ed.), Recent Advances in Nanofabrication Techniques and Applications, InTech, 2011, pp [40] J. Lee, K.B. Choi and G.H. Kim, Design and analysis of the single step nanoimprinting lithography equipment for sub-100 nm linewidth, Current Applied Physics, 2006, pp [41] S.Y. Yew, T.S. Kustandi, H.Y. Low, J.H. Teng, Y.J. Liu and E.S.P. Leong, Single material based multilayered nanostructures fabrication via reverse thermal nanoimprinting, Microelectronic Engineering, 2011, pp

229 POZNÁMKY 201

230

231 A SIMULACE 18NÁVRH MIKROSTRUKTUR 18Pavel Kulha, Adam Bouřa

232

233 1 Úvod Modelování a simulace elektrických nebo mechanických vlastností je prakticky nezbytné při jakémkoli návrhu nových MEMS struktur. Moderní simulační prostředky tento návrh velmi usnadňují a umožňují optimalizaci nejrůznějších parametrů ještě před vlastní výrobou nové struktury. Cílem kurzu je seznámit studenty s moderními metodami návrhu a simulace MEMS a NEMS struktur pomocí FEM (metody konečných prvků). Studentům bude představen kompletní Design Flow s využitím profesionálního návrhového softwarového balíku CoventorWare (Coventor, Inc.). Důraz je kladen zejména na praktickou část návrhu a na samostatnou práci na jednotlivých částech návrhu jako jsou: kreslení 2D topologie struktury, tvorba technologického souboru, generování 3D modelu, diskretizace a generování vhodné sítě, výběr vhodného simulátoru, nastavení okrajových podmínek a zobrazení výsledků. 2 Představení programu CoventorWare Jednotlivé nástroje CoventorWare si můžeme představit jako moduly spojené do jednoho rámce, přičemž návrh může začínat v různých modulech podle toho, na jaké úrovni se je uživatel rozhodne navrhovat. CoventorWare podporuje návrh MEMS nebo mikro-fluidických systémů jak na systémové tak na fyzické úrovni (Obr. 1). Na systémové úrovni může uživatel využít rozsáhlých knihoven behaviorálních modelů a rychlého systémového simulátoru. Návrh na fyzické úrovni začíná s kreslením 2D layoutu struktury, zahrnuje tvorbu 3D modelu, generaci sítě a simulaci metodou FEM nebo BEM (FEM Finite Element Method, BEM Boundary Element Method). Takto vytvořené makromodely mohou být následně extrahovány pro použití v systémovém simulátoru. CoventorWare umožňuje import a export modelů a souborů do různých formátů kompatibilních s ostatními softwarovými nástroji. Hlavní moduly CoventorWare Architect Systémový návrh a simulace využívá strukturovaný přístup uživatele k návrhu MEMS systémů. Parametrické knihovny ARCHITECTu byly vyvinuty tak, aby umožnily systémovým návrhářům simulovat a rychle vyhodnocovat výsledky různých konfigurací návrhu. Designer Designer je plnohodnotný nástroj pro vytváření 2D a 3D modelů, umožňuje hierarchický návrh a import i export v běžných formátech jako GDS, CIF a DXF. 3D modely vyexportované z Designeru jsou vhodné i pro diskretizaci v jiném softwaru. Model musí být pro následnou simulaci opatřen sítí s pojmenovaným povrchem/ objemem. Analyzer Okrajové podmínky musí být aplikovány na pojmenované části Jednoduchá nebo parametrická simulace pak může být spuštěna pomocí nástrojů MemElectro, MemMech, MemPZR nebo dalších. Výsledky mohou být zobrazeny ve formě tabulek nebo grafů, případně pomocí nástroje Visualizer. Integrator CoventorWare obsahuje několik nástrojů, které umí extrahovat makromodely použitelné na úrovni systé- -mové simulace. Tyto modely lze pak použít v jiných návrhových prostředích, např. CA- DENCE. Kurz je zaměřen na návrh MEMS struktur na fyzické úrovni, proto se další text zaměřuje na detailnější popis modulů Designer a Analyzer. 3 Designer Softwarový modul Designer je komplexní soubor nástrojů, sloužících pro kreslení layoutu struktury, vytváření a editaci materiálové 203

234 Obrázek 1: Bloková struktura softwarového balíku CoventorWare. Převzato z [1]. Obrázek 2: Nástroje pro návrh MEMS v Designer (v červeném rámečku). Převzato z [1]. databáze a zjednodušeného technologického postupu výroby Process File a generování a přípravu 3D modelu pro simulaci (blokově znázorněn na Obr. 2). Popis nástrojů Designer Materiálová databáze V této databázi jsou uloženy vlastnosti jednotlivých materiálů (mechanické, elektrické, piezoelektrické, piezorezistivní a další). CoventorWare poskytuje základní set materiálů běžně používaných v elektrotechnice, jejichž vlastnosti lze editovat, nebo i vytvářet záznamy nových materiálů. Technologický soubor Tzv. Process File popisuje zjednodušený technologický pro- 204

235 CoventorWare obsahuje sadu nástrojů ( Solver ) pro FEM, FVM, BEM simulaci v různých energetických doménách (zejména mechanické, elektrické a optické). Dostupné jsou jak statické tak transientní a modální simulace. MemElectro je elektrostatický nástroj, který počítá rozložení elektrického náboje a kapacitní efekty. Výsledkem je matice kapacit. MemMech je nástroj pro simulaci ustálených a transientních mechanických jevů. Je možné nastavit i modální, harmonickou, tepelnou, tepelně mechanickou a piezorezistivní analýzu problému. MemPZR tento modul počítá rozložení napětí a s tím související proudovou hustoces výroby, dostupné jsou běžné technologické kroky jako nanášení/růst vrstev, litografie a rotaci/offset masky, různé druhy leptání apod. Soubor je spolu s layoutem potřeba pro vygenerování 3D modelu. Layout editor Nástroj pro kreslení layoutu (2D topologie struktury). Preprocessor Nástroj pro vytváření 3D modelu z layoutu a technologického souboru. Je to interaktivní nástroj pro zobrazování 3D modelů, pojmenovávání jejich částí a povrchů, a přípravu modelu pro simulaci. síť, kdy jednotlivé objemové elementy mají tvar krychle nebo kvádru. Tetrahedrons trojúhelníková síť, kdy jednotlivé elementy mají tvar nepravidelného jehlanu. Surface povrchová 2D síť, kdy jednotlivé elementy na povrchu mají tvar trojúhelníku nebo čtverce, případně jejich kombinace. Výběr vhodné sítě pro jednotlivé fyzikální nástroje je zobrazen v tabulce 1. Tabulka 1: Výběr vhodné sítě pro jednotlivé simulační nástroje. Převzato z [1]. 4 Analyzer Softwarový modul Analyzer (blokově znázorněn na Obr. 3) slouží pro generování vhodné sítě ( Meshing pomocí Prepocesoru), výběru vhodného nástroje pro simulaci a definici okrajových podmínek simulace ( Simulation ) a zobrazení výsledků simulací v tabulkové, grafické nebo 3D formě s konturami ( Results Analysis ). Solver Mem- Electro Mem- Mech MemPZR Not Suitable None Suitable Triangles, Tetrahedra Best Practice Quadrilaterals, Hexahedra Surface Tetrahedra Hexahedra Surface for any part, Tetrahedra for electrical parts Volume for structural parts, Hexahedra for electrical parts Parabolic Hexahedra 4.1 Typy sítí Nástroj pro generování sítě ( Mesher ) diskretizuje vytvořený 3D model na malé elementy vhodné pro numerickou analýzu. Uživatel má možnost vybrat si z několika objemových či povrchových sítí (názvy sítí i další terminologie nebude překládána a bude uváděna tak jako v CoventorWare) Extruded bricks, Manhattan bricks, Tetrahedrons a Surface. Síť je definována zejména velikostí elementu v jednotlivých osách, je možné i nas-tavení zjemňování sítě v místech zájmu ( mesh refinement ). Síť typu: Extruded bricks šestiboká síť, kdy jednotlivé objemové elementy mají tvar kosoúhelníku Manhattan bricks šestiboká ortogonální 4.2 Nástroje pro simulaci 205

236 Obrázek 3: Nástroje pro generování sítě, simulaci a zobrazení výsledků (v červeném rámečku). Převzato z [1]. Obrázek 4: Struktura nosníku se ZnO piezoelektrickou vrstvou. Převzato z [1]. tu a jejich změny způsobené mechanickým namáháním piezorezistivního elementu. MemHenry tento modul počítá frekvenčně rezistivity a matici indukčnosti, s využitím pro magnetické senzory, výpočet parazitních indukčností na čipu apod. CoSolveEM nástroj pro vázanou simulaci kvazistabilních elektrostatických jevů, typickým příkladem je analýza elektrostatického aktuátoru: MemElectro poskytuje výsledky s rozložením elektrického náboje, MemMech poskytuje výsledky rozložení mechanického namáhání podél struktury. CoSolveEM využívá interaktivní proceduru k zajištění konzistence mezi elektrostatickými a mechanickými výsledky. 5 Řešené příklady 5.1 Piezoelectrický aktuátor s jednostranně vetknutým nosníkem Nástroj MemMech může být použit i pro řešení piezoelektrických efektů jak přímých (vytvoření elektrické polarizace/napětí v důsledku mechanického namáhání) tak nepřímých (vzniku mechanického namáhání v důsledku napětí přiloženého na krystal). Součástí první úlohy je i představení základních funkcí softwaru a orientace v jednotlivých modulech. Základní tvar jednostranně vetknutého nosníku s piezoelektrickou vrstvou ZnO je na Obr

237 Demonstrované techniky: Předvedení základních vlastností systému (Obr. 5). Editace a vložení nových materiálů do materiálové databáze MPD (Obr. 6). Vytvoření a editování technologického souboru Process File a práce s editorem layoutu (Obr. 7). Vytvoření 3D modelu, pojmenování povrchových a objemových částí, generování sítě (Obr. 8). Nastavení MemMech a okrajových podmínek pro výpočet ohybu a mechanických namáhání po přiložení napětí na elektrody a příprava simulace (Obr. 9). Zobrazení výsledků mechanické a piezorezistivní simulace, ohyb nosníku v důsledku přiložení vnějšího napájení (Obr. 10 a 11). 5.2 Membránový piezorezistivní tlakový senzor Piezorezistivita je jedním z nejrozšířenějších fyzikálních jevů využívaných v celé řadě senzorových prvků různých, zejména neelektrických veličin. Základní funkcí piezorezistoru Obrázek 5: Úvodní okno Coventor se záložkami Architect, Designer, Analyzer. Přepracováno z [1]. Obrázek 6: Vložení a editace materiálu v MPD editoru. Převzato z [1]. 207

238 A) Obrázek 7: Vložení a editace materiálu v MPD editoru(a), B)). Přepracováno z [1]. B) A) Obrázek 8: Nosník s označením jednotlivých částí a nastavení generátoru sítě (A, B). Přepracováno z [1]. B) 208

239 A) B) Obrázek 9: Nastavení piezorezistivní simulace v MemMech a okrajové podmínky (A,B). Přepracováno z [1]. Obrázek 10: Výsledky piezorezistivní simulace v tabulkové formě. Přepracováno z [1]. A) B) Obrázek 11: Výsledky piezorezistivní simulace ve Visualizer rozložení mechanického namáhání (vlevo), rozložení napětí (vpravo). Přepracováno z [1]. 209

240 (tenzomentru) je transformovat mechanické namáhání působící v určitém směru na odpovídající změnu jeho odporu. Vhodnou volbou mechanického převodníku pak můžeme měřit mechanické veličiny jako sílu, tlak, zrychlení apod. Demonstrované techniky: Příprava 3D modelu pomocí nástrojů Plane a Partition a vytvoření pravidelné sítě membrány a jejího rámu (Obr. 12). Obrázek 14: Přidání piezorezistorů na membránu a simulace v Mem PZR. Obrázek 12: Vytvoření Partition a generování pravidelné sítě (vlevo), výsledek MemMech mechanické simulace pro tlak působící na samotnou membránu 0,3 Mpa. Převzato z [3]. Citlivostní analýza, postupné posouvání piezorezistoru po membráně (po středové ose) a simulace změny odporu (proudu) při konstantním napětí (Obr. 15). Vložení výsledku (rozložení mechanického namáhání) do nástroje MemPZR (Obr. 13). Obrázek 15: Výsledek citlivostní analýzy pro jednotlivé piezorezistory. Obrázek 13: Vytvoření Partition a generování pravidelné sítě (nahoře), výsledek MemMech mechanické simulace pro tlak působící na samotnou membránu 0,3 Mpa. Úprava 3D modelu (přidání a zasíťování piezorezistoru), simulace změny proudu protékajícího piezorezistorem při změně mechanického namáhání (Obr. 14). 5.3 Elektrostatický aktuátor pro laditelný kondenzátor Elektrostatický aktuátor je základním typem aktuátoru, který se používá u aktivních MEMS struktur. Je založen na projevu Coulombovských sil mezi různě nabitými vodiči. Vztah (1) popisuje změnu potenciální energie tělesa na který působí síla F(x) při změně polohy o vzdálenost dx. ( ) d E = F x d x. (1) 210

241 Změna energie kondenzátoru nabitého na konstantní hodnotu napětí U a při změně jeho kapacity o dc je určena vztahem (2). d E 1 2 = U 2 dc.. (2) Kombinací rovnic (1) a (2) lze získat vztah pro velikost síly, která působí na mechanickou soustavu nabitého kondenzátoru pro konkrétní směr změny její geometrie (v tomto případě ve směru osy x). F ( x) 1 2 = U 2 dc d x ( x).. (3) Elektrostatická síla, která působí na kondenzátor je tedy úměrná druhé mocnině napětí a úměrná změně kapacity kterou vyvolá změna mechanického uspořádání. Pro elektrostatické aktuátory jsou nejčastěji používány dvě konfigurace. Je to aktuátor, který mění vzdálenost mezi elektrodami deskového kondenzátoru (Obr. 16A) a hřebenová struktura zvaná combdrive, která mění velikost překryvu elektrod (Obr. 16B). Velikost síly je nepřímo úměrná druhé mocnině vzdálenosti mezi elektrodami. Tento fakt je podstatný zejména pro malé vzdálenosti. V případě, že je jedna z elektrod zavěšena na pružině o tuhosti k a počáteční vzdálenost mezi elektrodami je x 0, lze spočítat velikost napětí U d, při kterém dojde k dotyku obou elektrod (rovnice (6) [2]). U d = 3 8 k x0 27 ε S. (6) Obr. 17 udává závislost normalizované vzdálenosti mezi elektrodami kondenzátoru vůči normalizovanému napětí na jeho elektrodách při konfiguraci podle Obr. 16A. Normalizovaná vzdálenost x/x 0 1 0,67 ε 0 Normalizované napětí r 1 U/U d L1(x) = x S 1 S 1 k (+) (-) F 1 (x) 2 L 2 h (-) (-) A) B) (+) S 2 (x) = h x F 2 (x) Obrázek 16: Aktuátor se změnou vzdálenosti mezi elektrodami A) a změnou plochy překryvu B). Rovnice (4) udává velikost kapacity deskového kondenzátoru, u kterého se mění vzdálenost mezi elektrodami x. Derivací této rovnice podle x a dosazením do vztahu (3) lze získat vztah (5), který udává absolutní velikost síly mezi elektrodami tohoto kondenzátoru. S1 C1 = ε 0 ε r = ε 0 ε r L F 1 1 ( x) ε ε r U 2 x S 0 1 ( x) = 2 2 S1 x. (5), (4) k Obrázek 17: Závislost polohy elektrod deskového kondenzátoru na přiloženém napětí, přepracováno z [2]. Z grafu je zřejmé, že aktuátor je stabilní pouze do vzdálenosti asi jedné třetiny počáteční vzdálenosti. Poté dochází k velmi rychlému kontaktu obou elektrod, jelikož síla nekontrolovatelně narůstá (vliv x 2 ve jme-novateli). Při tomto kontaktu může dojít i k trvalému a nevratnému spojení obou elektrod, proto je nutno se tomuto stavu vyhnout. Druhým typem elektrostatického aktuátoru je hřebenová struktura, která využívá změny plochy překryvu mezi elektrodami (Obr. 16B). Rovnice (7) udává velikost kapacity pro případ kdy je zanedbána tloušťka prostřední elektrody. To odpovídá paralelní kombinaci dvou kondenzátorů o ploše elektrod S 2 a vzdáleností mezi elektrodami L 2. Derivací této rovnice a dosazením do vztahu (3) lze získat rovnici (8), která udává velikost síly, kterou je prostřední elektroda vtahována. 211

242 C S 2 = ε 0 ε r 2 L ( x) = ε ε 2 0 r 2 2 F 2 ε ε r U L 0 ( x) = h x, (7) L. (8) Síla je opět úměrná druhé mocnině přiloženého napětí, ale tentokrát je již nezávislá na aktuální poloze vychýlení. Síla je tedy při zasouvání prostřední elektrody konstantní. Velikost této síly se dá zvětšit pouze rozšířením elektrod. Proto se nepoužívá samotná elektroda, ale vytváří se hřebenová struktura (Obr. 18). 2 2 h Návrh laditelného kondenzátoru, řízeného elektrickým polem Laditelný kondenzátor (varaktor) je součástka, která se využívá především v radioelektronice pro ladění filtrů. V rámci tohoto kurzu bude představena a popsána MEMS struktura, kterou lze jako varaktor využít. Její konstrukce je založena na principu deskového kondenzátoru, kde je nastavitelná vzdálenost mezi jeho elektrodami pomocí elektrostatické síly mezi aktivní a pomocnou elektrodou. K návrhu bude využit design kit PolyMUMPs, který je standardní součástí instalace programu CoventorWare. Budou představeny nástroje pro analýzu počátečního mechanického napětí ve struktuře, nástroje pro zjištění velikosti kapacity, nástroje pro modální analýzu mechanických vlastností a na závěr nástroj, který umožňuje kombinovat mechanické a elektrické analýzy. Technologie PolyMUMPs umožňuje návrh MEMS struktur se třemi vrstvami polykřemíku a jednou vrstvou metalizace. Na Obr. 19 je zjednodušený řez navrhovanou strukturou. Metalizace: 0,5 µm Polykřemík 2: 1,5 µm Polykřemík 1: 2 µm 0,75 µm 2 µm Polykřemík 0: 0,5 µm Substrát křemík: 20 µm Obrázek 19: Zjednodušený řez navrhovanou strukturou varaktoru, přepracováno z [2]. Obrázek 18: Aktuátor využívající hřebenovou strukturu, převzato z [2]. Struktura se skládá ze tří elektrod. Vnější elektrody (Polykřemík 0 a Polykřemík 2) jsou mechanicky fixovány a prostřední elektroda (Polykřemík 1) je ukotvena na pružných závěsech. Přivedením napětí mezi pružnou a některou z fixovaných elektrod dojde k vychýlení prostřední elektrody a dojde tak ke změně vzájemné kapacity. Jako hlavní kapacita v tomto případě bude uvažována struktura Polykřemík 1 Polykřemík 2; kapacitu Polykřemík 0 Polykřemík 1 lze považovat za parazitní. Přivedením statického napětí mezi horní a prostřední elektrodu lze zvětšit vzájemnou kapacitu, jelikož elektrody se k sobě přiblíží z důsledku elektrostatické síly tak, jak bylo popsáno v předchozí kapitole. Je nutno mít na paměti že velikost výchylky by neměla překročit 1/3 počáteční vzdálenosti, jelikož poté je již struktura nestabilní a může dojít k jejímu poškození. 212

243 Vlastní návrh a analýza struktury bude probíhat v několika krocích. Prvním krokem je vytvoření vlastní struktury a návrh vhodné síťové struktury (mesh). Na Obr. 20A je výsledný návrh, který vznikl definicí masek pro jednotlivé technologické kroky PoluMUMPs výrobního procesu. Rozměr desek kondenzátorů je ( ) µm, tloušťka jednotlivých vrstev odpovídá hodnotám z Obr. 19. Pro názornost je struktura zobrazena s dvacetinásobným zvětšením v ose Z. A) A) B) Obrázek 21: Deformace struktury v důsledku počátečního mechanického napětí (A,B). B) Obrázek 20: Navržená struktura včetně mesh sítě (A, B). Na Obr. 20B je řez touto strukturou i s patrným návrhem diskretizační sítě (mesh). Pro desky kondenzátorů byla volena síť řídká, pro pružné závěsy byla zvolena síť jemnější. První analýzou, kterou je nutno aplikovat, je zjištění deformace v důsledku počátečního mechanického napětí ve struktuře. K tomu je využito výpočetní prostředí (solver) MemMech. Na Obr. 21 jsou výsledky pro horní i prostřední elektrodu. V obou případech jsou velikosti výchylek několikanásobně zvětšeny. Zejména prohnutí horní elektrody má vliv na počáteční velikost kapacity kondenzátoru. Důležitá je také znalost mechanické stability struktury při aplikaci vibrací (externích nebo v důsledku střídavého elektrického pole). K tomu slouží modální analýza. Přístupná je opět z prostředí MemMech a slouží k zjištění rezonančních frekvencí mechanických kmitů. Na Obr. 22 je ukázka třináctého rezonančního módu horní elektrody. Pro zjištění elektrických vlastností je nutno použít nástroje MemElectro. Pro příslušnou konfiguraci elektrod lze pomocí tohoto nástroje stanovit rozložení náboje na povrchu elektrod a také se dají spočítat vzájemné kapacity mezi jednotlivými elektrodami. Pro tři desky kondenzátoru existují tři vzájemné kapacity. Pro zjištění celkové kapacity mezi dvěma z nich je třeba započítat též vliv těch ostatních. Celková kapacita je dána paralelní kombinací vzájemné kapacity a sériové kombinace dvou zbylých kapacit. Velikosti vzájemných kapacit jsou patrny z diagonály kapacitní matice analýzy MemElectro. 213

244 Posledním nástrojem, který je v tomto cvičení představen je nástroj CoSolveEM. Tento nástroj slouží k současné analýze elektrických i mechanických veličin. Jedna veličina se vždy nastaví jako nezávisle proměnná a zbylé je pak možno dopočítat. U elektrických veličin lze považovat za konstantní buď náboj, nebo napětí. Pro účely simulace varaktoru je nutno zvolit jako nezávisle proměnnou napětí mezi deskami kondenzátoru, pomocí kterého je prostřední elektroda vychylována. A) B) Obrázek 23: Prohnutí prostřední elektrody v důsledku napětí 1 V vůči horní elektrodě (A, B). Obrázek 22: Třináctý rezonanční mód modální analýza mechanické rezonance. Na Obr. 23 je výsledek analýzy výchylky prostřední elektrody po aplikaci 1 V mezi prostřední a horní elektrodu. Velikost výchylky je asi 0,1 µm. Ta vyvolá změnu kapacity v řádech procent počáteční hodnoty, která je asi 2 pf. V rámci procvičování je možno podrobně propočítat závislost výchylky prostřední elektrody pro změnu napětí od 0 do 5 V a sledovat nástup nestabilního chování podle grafu z Obr. 17. Celou analýzu je možno provést pro případ, kdy se prodlouží pružné závěsy na dvojnásobek. 5.4 Tepelný aktuátor Tepelný aktuátor se u aktivních MEMS struktur využívá především pro svoji snadnou realizovatelnost a pro sílu, kterou je tento aktuátor schopen vyvinout. Jeho základní princip je založen na tepelné roztažnosti materiálů. L L + L α T Obrázek 24: Vliv změny teploty na prodloužení nosníku. T T + T Na Obr. 24 je naznačen vliv změny teploty na prodloužení nosníku. V rozsahu běžně používaných teplot ( ) K lze teplotní koeficient roztažnosti materiálů α zjednodušeně považovat za konstantu. V tomto případě se nosník o počáteční délce L 1 a při změně teploty o ΔT prodlouží na délku L 2, která je určena rovnicí (9). 214

245 Toto prodloužení vyvolá mechanický tlak, který je pro nosník o průřezu S a Youngově modulu pružnosti E dán rovnicí (10). Tabulka 2 udává typické hodnoty materiálových parametrů pro křemík a nikl. L = L ( 1+ α )., (9) 2 1 T F = α T E S.. (10) Tabulka 2: Typické hodnoty teplotní roztažnosti a Youngova modulu pružnosti pro křemík a nikl. Křemík Nikl α(k -1 ) 2,5E-6 1,3E-5 E (Pa) 1,7E+11 2,1E+11 Z rovnic (9) a (10) a z Tabulky 2 lze spočítat, že nosník o průřezu (10 10) μm vyvolá při změně teploty o 100 K mechanickou sílu o velikosti až 4,24 mn, což odpovídá tíze závaží o hmotnosti 0,4 g. Pro mikromechanické struktury lze tento tlak povařovat za velmi vysoký. Pokud bychom takovouto sílu chtěli vyvolat elektrostatickým aktuátorem typu combdrive ( rovnice (8)), pak pro šířku mezery mezi elektrodami 2 μm a výšku elektrod 10 μm bychom museli mezi elektrody přivést napětí o velikosti téměř 10 kv. To však není technicky proveditelné vzhledem k omezené velikosti průrazného napětí vzduchu. Tepelné aktuátory jsou tak velmi důležité zejména v aplikacích, kde se vyžaduje velká síla. Jejich nevýhodou je však vyšší náročnost na energetickou spotřebu. V praxi se využívá velké množství variant tohoto aktuátoru. Jedním ze základních typů je takzvaný vyklenutý (obloukový) aktuátor z Obr. 25. Jedná se o vyklenutý vodič, ukotvený pouze na svých koncích. Průchodem proudu vodičem dochází k jeho zahřátí a následně k jeho prodloužení. Vzhledem k ukotvení na koncích dojde ke zvětšení vyklenutí. Na obrázku jsou naznačeny rovněž různé varianty převodu síly do různých směrů a na rotační pohyb. Kromě obloukového aktuátoru je často využíván aktuátor tvořený dvěma nosníky o různém průřezu (Obr. 26). Elektricky jsou tyto nosníky spojeny v jeden vodič. Když strukturou prochází proud, začínají se oba nosníky ohřívat v důsledku Joulova tepla. Studený nosník má mnohem větší průřez než nosník horký, a proto se zahřívá jen minimálně. Naproti tomu horký nosník se zahřívá hodně a v důsledku toho dochází k jeho dilataci. Oba nosníky jsou na jedné straně pevně ukotveny a na volném konci jsou navzájem spojeny. Proto dochází při prodloužení jedné strany k vychýlení směrem ke studené straně. Tento typ aktuátoru bude předmětem návrhu a podrobné analýzy. Studený nosník Horký nosník Nízká proudová hustota Směr pohybu konce Vysoká proudová hustota Vyklenutý aktuátor (TAB) Ukotvení Vyklenutý aktuátor H (H-TAB) Rotační aktuátor 1 Rotační aktuátor 2 Ovládací napětí - Ukotvení + Obrázek 26: Princip činnosti nosníkového aktuátoru, přepracováno podle [2]. Obrázek 25: Vybrané typy vyklenutých tepelných aktuátorů, přepracováno podle [2]. Návrh tepelného aktuátoru Tepelný aktuátor podle Obr. 26 je navržen pomocí masky obecného výrobního procesu, který byl předtím nadefinován. Pro vytvoření struktury z polykřemíku plně dostačuje jediná maska. Na Obr. 27 jsou uvedeny rozměry celé 215

246 Obrázek 27: Rozměry tepelného aktuátoru, převzato z [1]. struktury, včetně červených oblastí pro definici okolní teploty a svorek pro přivedení ovládacího napětí. Navržená struktura bude podrobena několika analýzám. Budou na ní sledovány elektrické veličiny, které popisují rozložení proudové hustoty a rozložení elektrického pole. Dále bude vypočteno rozložení teploty a tepelného toku v ustáleném stavu. Z hodnot teploty nakonec budou vypočteny dilatace jednotlivých struktur a výsledné prohnutí aktuátoru. Pro řešení elektro-termo-mechanických úloh se využívá nástroj ETherm. Obr. 28 představuje výsledky simulace rozložení elektrického potenciálu a proudové hustoty. Společně s měrným odporem materiálu jsou tyto výsledky převedeny na velikosti ztrátového tepla, která je na struktuře přítomna. Teplo způsobí ohřátí a následně dilataci materiálu, která nosníkovou strukturu ohýbá (Obr. 29). Obrázek 29: Výsledky simulace teplotního rozložení a mechanické deformace, převzato z [1]. A) B) Obrázek 28: Výsledky simulace rozložení elektrického potenciálu a proudové hustoty (A), B)), přepracováno podle [1]. Ztrátové teplo je ze struktury odváděno vedením. Studená část nosníku obsahuje oblasti s definovanou konstantní teplotou, které teplo odvádí. Tím lze při simulaci dosáhnout ustáleného stavu. Výsledek simulace odpovídá reálné situaci při aplikaci krátkého proudového impulzu, kdy lze studenou část nosníku považovat za tepelný absorbér s dostatečně velkou tepelnou kapacitou. V reálné situaci by se po určitém čase začala zahřívat také studená část nosníku a teplo by muselo být odváděno radiací do okolí, vedením přes oblast vetknutí a chlazením okolním vzduchem. Takto složitý simulační model je však již mimo rámec tohoto základního kurzu a vyžaduje nadstandardní simulační nástroje. Výsledek dosažený upraveným simulačním modelem je v dobré shodě chováním reálných struktur. 216

247 V rámci procvičování je možno podrobně propočítat závislost výchylky nosníkové struktury na velikosti přiloženého napětí od 0 do 3 V a sledovat vliv změny geometrie jednotlivých částí nosníku (průřez a délka horké části, délka části nosníku na studené straně apod.). 5.5 MEMS akcelerometr MEMS akcelerometry jsou velmi důležitým typem senzoru v moderních aplikacích. Základní princip měření je založen na sledování výchylky x hmotného bodu (seismické hmoty) o hmotnosti m na pružném závěsu o tuhosti k. Na hmotný bod působí síla v důsledku zrychlení (rovnice (11)) a jako reakce na tuto sílu vzniká síla v důsledku protažení elastického závěsu (rovnice (12)) F = m a, (11) F = k x., (12) k x a =. (13) m Velikost zrychlení (rovnice (13)) se pak dá spočítat porovnáním rovnic (11) a (12). Z rovnice (13) vyplývá, že pokud je tuhost pružiny konstantní a nezávislá na velikosti protažení, tak je velikost zrychlení přímo úměrná velikosti výchylky x. Nejjednodušší akcelerometr se dá zkonstruovat podle Obr. 16A, kde seismickou hmotu tvoří jedna deska kondenzátoru a velikost výchylky se dá odvodit ze změny kapacity. Pro reálný akcelerometr je ještě nutno uvažovat tlumení mechanických kmitů, které může být realizováno například přítomností okolního vzduchu, nebo zabezpečeno elektronicky. Pro konstrukci moderních akcelerometrů se nejčastěji využívá modifikovaná hřebenová struktura na pružném závěsu (Obr. 30). Modifikace spočívá jednak ve směru pohybu, kde je struktura aktivní, jednak v nesymetrickém umístění jednotlivých prsů v mezeře (patrno z Obr. 31B). Prstová struktura již v tomto případě nemá za úkol zasouvat se dovnitř mezery, ale detekovat (případně vyvolat) pohyb prostřední elektrody k elektrodám krajním. Pro detekci výchylky seismické hmoty je nutno mít informaci o velikosti, ale též o směru výchylky. Při nesymetrickém umístění se stává jedna kapacita dominantní a ta druhá (kde je vzdálenost ke krajní elektrodě vetší) je pouze parazitní. Při pohybu se tak celková kapacita zvětšuje nebo zmenšuje podle směru pohybu. Vyhodnocení zrychlení se v praxi obvykle nedělá přímým měřením změny kapacity, ačkoli to v zásadě možné je (pomocí rovnice (4)). Mnohem přesnější metodou vyhodnocení je metoda, která využívá elektrostatickou zpětnou vazbu pro kompenzaci výchylky. Prstová struktura se v tomto případě používá pro dva účely. Jednak slouží k vyhodnocení velikosti a směru pohybu, jednak slouží jako elektrostatický aktuátor, který má za úkol udržovat seismickou hmotu v rovnovážné poloze. Velikost zrychlení se pak dá spočítat z velikosti napětí, které je k tomu potřeba. Tato metoda má několik výhod. Zabraňuje velkým pohybům hmoty, čímž zabezpečuje konstantní velikost tuhosti pružného závěsu. Rovněž se tím linearizuje odezva změny kapacity, která by byla pro velké výchylky nestabilní (Obr. 17). V neposlední řadě tento způsob usnadňuje průměrování výchylek seismické hmoty, a dají se kompenzovat vlastní mechanické kmity (elektronické tlumení). Detekce změny kapacity při pohybu seismické hmoty se dá realizovat pomocí měření napětí na elektrodách nabitého kondenzátoru. Při zachování konstantního náboje se při změně vzdálenosti mezi elektrodami mění napětí mezi nimi. Změna tohoto napětí se dá vyhodnotit pomocí komparátoru, který přímo spíná aktuátor pro kompenzaci této změny. Výstupní 217

248 Obrázek 30: Popis základních funkčních struktur akcelerometru. signál z akcelerometru je pak obdélníkový signál se sigma - delta modulací, který je odebírán z výstupu tohoto komparátoru. Simulace akcelerometru 1. Vzhledem k náročnosti návrhu akcelerometru bude pro simulace využit již předem připravený model (Obr. 31). V rámci simulací budou provedeny tyto analýzy: 2. Simulace prohnutí a mechanického napětí v závěsech seismické hmoty při aplikaci výchylky na její osu, výpočet změny kapacity mezi seismickou hmotou a krajními elektrodami při tomto vychýlení (snímací režim). 3. Simulace změny napětí na elektrodách combdrive struktury při konstantním náboji pro různé velikosti výchylky seismické hmoty (snímací režim). 4. Simulace síly, která působí na seismickou hmotu při přiložení napětí na elektrody sledování velikosti mechanického napětí a výchylky pro různá napětí na elektrodách (režim aktuátoru). Simulace podle bodu 2 slouží k potvrzení závislosti změny napětí na elektrodách při konstantním náboji a změně výchylky. samotný návrh zpětnovazební struktury pro vyhodnocení zrychlení vyžaduje pokročilé simulační nástroje a je mimo rámec tohoto kurzu. A) Simulace podle bodů 1 a 3 lze přímo využít k návrhu vyhodnocovací elektroniky pro měření zrychlení přímou metodou. Ze simulačních dat se dá stanovit závislost velikosti kapacity na velikosti síly (zrychlení) na seismické hmotě. B) Obrázek 31: Výsledek simulace mechanického napětí v pružných závěsech při přítomnosti zrychlení v ose seismické hmoty. 218