Stanovení karboxylových kyselin pomocí plynové chromatografie v kombinaci s plamenově ionizačním detektorem - optimalizace metody

Transkript

1 MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV BIOCHEMIE Stanovení karboxylových kyselin pomocí plynové chromatografie v kombinaci s plamenově ionizačním detektorem - optimalizace metody Bakalářská práce Aneta Šrajerová Vedoucí práce: Mgr. Jiří Žeravík, Ph.D. Brno 2014

2 Bibliografický záznam Autor: Název práce: Studijní program: Studijní obor: Vedoucí práce: Aneta Šrajerová Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav biochemie Stanovení karboxylových kyselin pomocí plynové chromatografie v kombinaci s plamenově ionizačním detektorem optimalizace metody Biochemie Biochemie Mrg. Jiří Žeravík, Ph.D. Akademický rok: 2013/2014 Počet stran: Klíčová slova: Alkyl chloroformiáty; derivatizace; karboxylové kyseliny; plynová chromatografie; plamenově ionizační detektor

3 Bibliographic Entry Author: Title of Thesis: Degree programme: Field of Study: Supervisor: Aneta Šrajerová Faculty of Science, Masaryk University Department of biochemistry Determination of carboxylic acids using GC-FID optimization of method Biochemistry Biochemistry Mgr. Jiří Žeravík, Ph.D. Academic Year: 2013/2014 Number of Pages: Keyword: Alkyl chloroformates; derivatization; carboxylic acids; gas chromatography; flame ionization detector

4 Abstrakt V této bakalářské práci se věnujeme stanovení vybraných karboxylových kyselin. Byl vytvořen přehled derivatizačních metod pro úpravu karboxylových kyselin a následně byla vybrána a optimalizována metoda, která využívala specifických reakcí alkyl chloroformiátů. K analýze byla použita plynová chromatografie s plamenově ionizačním detektorem. U stanovovaných karboxylových kyselin byly určeny retenční časy, limit detekce a vytvořeny kalibrační křivky. Abstract In this thesis we study the determination of selected carboxylic acids. There has been created an overview of derivatization methods for carboxylic acids. Subsequently methods based on alkylchloroformates derivatization reaction were selected and optimized. Gas chromatography with a flame ionization detector was used for analysis. For the determined carboxylic acids retention times, limit of detection and calibration curves were observed.

5

6 Poděkování Na tomto místě bych chtěla poděkovat panu Mgr. Jiřímu Žeravíkovi, Ph.D., vedoucímu mé bakalářské práce, za odborné rady, cenné připomínky a čas, který mi věnoval při vedení bakalářské práce. Dále bych chtěla poděkovat své rodině, která mě podporuje ve studiu.

7 Prohlášení Prohlašuji, že jsem svoji bakalářskou práci vypracovala samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány. Brno 19. května 2014 Aneta Šrajerová

8 Obsah Seznam použitých zkratek I. Teoretická část Úvod Karboxylové kyseliny Význam a výskyt karboxylových kyselin Využití karboxylových kyselin Charakteristika vybraných zástupců karboxylových kyselin Kyselina citrónová Kyselina fumarová Kyselina jablečná Kyselina jantarová Kyselina malonová Kyselina mléčná Kyselina octová Kyselina oxaloctová Kyselina vinná Metody stanovení karboxylových kyselin Plynová chromatografie Kapalinová chromatografie Enzymové metody Elektromigrační metody Použití GC pro stanovení karboxylových kyselin Princip metody GC Instrumentace Nosný plyn mobilní fáze

9 Injektor Kolona Detektor Pomocné plyny Záznam chromatogramu Kvalitativní vyhodnocování metody v GC Kvantitativní vyhodnocování metody v GC Příprava vzorku k analýze Silylace Acylace Alkylace Reakce s alkyl chloroformiáty Cíle práce II. Experimentální část Použité přístroje Použité chemikálie a materiál Metody přípravy vzorku Metoda I Metoda II Metoda III Metoda IV Metoda V Metoda VI Metoda VII Optimalizace metody Výsledky Výsledky měření testovaných postupů

10 9.2. Výsledky optimalizace metody VI Identifikace karboxylových kyselin Retenční časy Limit detekce Kalibrační křivky Diskuze Souhrn Summary Seznam použité literatury Seznam grafů Seznam obrázků Seznam tabulek Seznam příloh

11 Seznam použitých zkratek ACF AED AMK CA CE Citr Citram DES DMS ECD ECF EtOH FID Fum GC GLC GSC GTP HPLC IDP IEC IS ITP Lac LC L-LDH LOD Mal Malon MS Oct Oxal alkyl chloroformiáty atomově emisní detektor aminokyseliny karboxylové kyseliny kapilární elektroforéza citrát, citrónová kyselina citramalát, citramalová kyselina diethylsulfát dimethylsulfát detektor elektronového záchytu ethyl chloroformiát ethanol plamenově ionizační detektor fumarát, fumarová kyselina plynová chromatografie plynová rozdělovací chromatografie plynová adsorbční chromatografie glutamát-pyruvát transamináza vysokoúčinná kapalinová chromatografie inosin-5-difosfát iontově výměnná chromatografie interní standard inosin-5-trifosfát laktát, mléčná kyselina kapalinová chromatografie L-laktát dehydrogenáza limit detekce malát, jablečná kyselina malonát, malonová kyselina hmotnostní spektrometrie octová kyselina oxaloctová kyselina 11

12 P PrCF PEP Ph-But PID PK PrOH RP SCS Suc Tar TCD TLC monofosfát propyl chloroformiát fosfoenolpyruvát fenylbutanová kyselina fotoionizační detektor pyruvátkináza 1-propanol separace na reverzní fázi sukcinyl-koenzym A-syntetáza sukcinát, jantarová kyselina tartarát, vinná kyselina tepelně vodivostní detektor tenkovrstvá chromatografie 12

13 I. Teoretická část 1. Úvod Karboxylové kyseliny a jejich deriváty patří k biochemicky velmi významným látkám, účastní se většiny životních funkcí (energetický metabolismus, regulační mechanismy, výstavba struktur organismu). Jednou z možností, jak stanovit tyto látky, je využití standardní metody - plynové chromatografie ve spojení s plamenově ionizačním detektorem (GC-FID). Přímé stanovení pomocí GC-FID je výrazně omezeno, vzhledem k nízké těkavosti těchto látek. V tomto případě se využívá různých derivatizačních postupů, které tyto látky převádí na látky s vyšší těkavostí, což už vyhovuje podmínkám stanovení pomocí GC-FID. Stanovení karboxylových kyselin je zde rozebráno z hlediska přístrojových možností i potřebných derivatizačních úprav vzorků. 13

14 2. Karboxylové kyseliny Karboxylové kyseliny (CA) jsou organické sloučeniny, které jsou charakteristické přítomností karboxylové funkční skupiny, jejíž vzorec je C(=O)-OH. Tvoří velmi významnou skupinu organických sloučenin v rostlinné i živočišné říši. Podílejí se na buněčném metabolismu, ale slouží také jako výchozí látky pro přípravu řady derivátů. Karboxylové kyseliny mohou mít ve své molekule jednu nebo více karboxylových skupin. [1,2] Podle počtu karboxylových skupin se organické kyseliny rozdělují na: - jednosytné (monokarboxylové) obsahující jednu karboxylovou skupinu, např. kyselina octová, - vícesytné (di-, trikarboxylové) obsahující dvě a více karboxylových skupin, např. kyselina šťavelová. [3,4] Dle druhu uhlovodíkového zbytku je možno karboxylové kyseliny rozdělit na alifatické (nasycené, nenasycené) a aromatické. [2] 2.1. Význam a výskyt karboxylových kyselin Karboxylové kyseliny jsou biochemicky velmi významné látky a jsou nepostradatelnou složkou živých organismů. Aminokyseliny jsou základem bílkovin, tedy i enzymů, které umožňují složité metabolické procesy. Estery ve formě triacylglycerolů mají zásobní i strukturní funkci. [4,5] Některé karboxylové kyseliny se v přírodě vyskytují volně (např. kyselina mravenčí v tělech mravenců), velká řada jich je vázaná ve formě svých solí, esterů, amidů či jiných derivátů. Soli kyseliny šťavelové nalezneme v rostlinách (šťavelu, špenátu), esterifikované vyšší mastné kyseliny se nacházejí v tucích a olejích, estery nižších karboxylových kyselin jsou složky vonných esencí (např. v ovoci). Karboxylová skupina je vázána i v několika isoprenoidech, jako jsou žlučové kyseliny. [6] Kyselina octová je hlavní organickou složkou octa. Kyselina butanová způsobuje zápach žluklého másla. Kyselina cholová je hlavní složkou lidské žluči. Alifatické kyseliny s dlouhým řetězcem (např. kyselina palmitová) jsou biologickými prekurzory tuků a dalších lipidů. [2] Karboxylové kyseliny se nacházejí i v ovzduší jak v plynné fázi, tak vázané na částice atmosférického aerosolu. Jsou produkty fotooxidací těkavých organických 14

15 sloučenin nebo jsou výsledkem lidské činnosti. Zúčastňují se atmosférických transformací a přispívají ke kyselosti srážek. [7] Důležité jsou ketolátky, které vznikají z kyseliny β-hydroxymáselné a acetonu. Ketolátky jsou za určitých podmínek přítomny v krvi nebo v moči (metabolismus tuků, poruchy metabolismu při diabetu). [8,9] 2.2. Využití karboxylových kyselin Organické kyseliny nacházejí využití v mnoha průmyslových odděleních. Je to zejména potravinářský, lékařský, farmaceutický nebo kožedělní průmysl. K rozmanitým průmyslovým účelům se používají kyselina mravenčí a octová (rozpouštědla, výchozí látky pro výrobu esterů, konzervace). Obě koncentrované kyseliny patří mezi látky žíravé. Kyselina mravenčí má široké využití v konzervárenství, při barvení látek a pro své baktericidní účinky také jako dezinfekční prostředek. Velké množství této kyseliny se spotřebuje i při zpracování kůží v kožedělném průmyslu. [4,11-14] Kyselina šťavelová je považována za toxickou látku. V lidském organismu váže vápenaté ionty do nerozpustné vápenaté soli. Kyselina ftalová se používá k výrobě syntetických vláken (polyesterů). Při výrobě polymerů se také uplatňují kyselina adipová a kyselina akrylová a od ní odvozené sloučeniny. [4,14] V potravinářském průmyslu se organické kyseliny čím dál více uplatňují jako potravinářská aditiva, neboli přídatné látky, které se k potravinám záměrně přidávají při výrobě, zpracování, skladování nebo balení z důvodu zvýšení jejich kvality (zlepšení vůně, chuti, barvy, výživové hodnoty i prodloužení trvanlivosti). [12] Ve farmaceutickém průmyslu je využívána kyselina octová a kyselina mléčná. Kyselina vinná slouží jako dávivý kámen. Kyselina salicylová a především její ester (kyselina acetylsalicylová) jsou významným lékem proti zánětu a horečce. Kyselina acetylsalicylová je účinnou látkou aspirinu. [5] Textilní průmysl využívá kyselinu octovou. Její ester je umělé acetátové hedvábí. Z kyseliny tereftalové se uměle vyrábí vlákno terilen. [5] 15

16 2.3. Charakteristika vybraných zástupců karboxylových kyselin Kyselina citrónová Obr. č. 1: Kyselina citrónová [14] Jedná se o trikarboxylovou kyselinu, která obvykle krystalizuje jako monohydrát, který však v suchém prostředí snadno ztrácí vodu. Je snadno rozpustná ve vodě, methanolu, ethanolu a podobných polárních rozpouštědlech. [14] Je to kyselina silně hygroskopická, a proto se musí uchovávat v suchu nebo v hermeticky uzavřené sklenici. [11] Kyselina citrónová (Citr) přírodního původu se hojně vyskytuje v ovoci (především v citrónech, kde tvoří 7 9 % sušiny), v menším množství je obsažena i v ostatním ovoci, zvláště v rybízu, v malém množství i v bramborách a obilí, ve stopovém množství se vyskytuje v mléce a v mase. [12] V potravinářském průmyslu je kyselina citrónová hojně využívána v konzervárenství ke snížení ph, působí jako antioxidant, je stabilizátorem barvy ve výrobcích z ovoce, umožňuje tvorbu některých pektinových gelů, srážení mléka chymosinem a zabraňuje tvorbě krystalů v cukrovinkách. [15] V organismu je kyselina citrónová biochemicky velmi významná, protože je součástí Krebsova cyklu, který se podílí na odbourávání bílkovin, tuků a sacharidů až na konečné produkty oxid uhličitý a vodu. Tento cyklus reakcí je též označován jako cyklus kyseliny citrónové neboli citrátový cyklus. Citrát však hraje roli i v procesech glukoneogeneze, transaminace, deaminace a syntézy mastných kyselin. [5,15] Kyselina fumarová Obr. č. 2: Kyselina fumarová [14] Kyselina fumarová (Fum) je organická nenasycená dikarboxylová kyselina. Přidává se do potravin jako regulátor kyselosti. Účastní se citrátového cyklu, kdy vzniká 16

17 ze sukcinátu pomocí sukcinátdehydrogenázy a na malát se mění pomocí fumarázy. Fumarát je zároveň produktem katabolismu některých aminokyselin a také vzniká u savců při detoxikaci amoniaku v močovinovém cyklu. [5,14] Kyselina jablečná Obr. č. 3: Kyselina jablečná [14] Kyselina jablečná (Mal) je významná dikarboxylová kyselina. Může se vyskytovat ve dvou opticky aktivních formách. V přírodě byla zjištěna pouze v levotočivé L-formě, která je meziproduktem v cyklu citrónové kyseliny. Ve větším množství je obsažena v ovoci a zelenině, byla však dokázána i v mase, sýrech aj. [12] Je meziproduktem citrátového cyklu a procesu fiaxace oxidu uhličitého u C4 a CAM rostlin. Oxidací kyseliny jablečné vzniká kyselina oxaloctová. [5] Kyselina jantarová Obr. č. 4: Kyselina jantarová [14] Kyselina jantarová (Suc) je běžnou složkou téměř všech rostlinných i živočišných tkání. Je metabolicky velmi významná (vzniká v citrátovém cyklu), jako anion sukcinát nebo jako acyl sukcinát (např. sukcinylkoenzym A). Její oxidací (dehydrogenací) vzniká kyselina fumarová. [14] Vyskytuje se jako přirozená složka v ovoci a v zelenině a také v nealkoholických nápojích. Nachází se v řepě, rebarboře, sýrech, masu, melase, medu, vejcích a v ovoci. Také je přítomna ve vínu a v pivu. V dozrávajícím ovoci jí ubývá shodně s poklesem intenzity dýchání. [12,13] V potravinářském průmyslu se používá jako jedna se složek zesilující chuťové vlastnosti masných výrobků. [12] 17

18 Kyselina malonová Obr. č. 5: Kyselina malonová [14] Kyselina malonová (Malon), neboli propandiová je významným metabolickým meziproduktem. Malonová kyselina se tvoří z acetylkoenzymu A přes karboxylaci závislou na biotinu a acetylkarboxyláze. [4] Kyselina mléčná Obr. č. 6: Kyselina mléčná [14] Kyselina mléčná (Lac) patří k nejvýznamnějším hydroxykyselinám. Má jeden asymetrický uhlíkový atom, a může se tedy vyskytovat ve dvou opticky aktivních formách. L-mléčná kyselina je pravotočivá a bývá přítomna v mase a vnitřnostech, kde vzniká při tělesné námaze z glykogenu. Tvoří se také při mléčném kvašení cukrů. [12,14] Levotočivá D-forma kyseliny mléčné vzniká také při kvašení cukrů. Opticky inaktivní D, L-mléčná kyselina (racemická) se rovněž tvoří během kvašení za určitých podmínek. [12] Vápenaté soli mléčné kyseliny slouží jako potravinářská aditiva. Kyselina mléčná se používá jako okyselující a ochucující látka, zvýrazňuje chuť, zesiluje účinnosti antioxidantů a kontroluje ph. Účinkuje také jako antimikrobiální látka, rozpouštědlo a nosič. [16] Laktát cirkulující v krvi je produktem anaerobního metabolismu glukózy, a proto je významný markerem oxygenace tkání. [5] 18

19 Kyselina octová Obr. č. 7: Kyselina octová [14] Kyselina octová (Oct) je bezbarvá kapalina štiplavého zápachu. V těle se vyskytuje ve svalech, potu a moči. Je velmi rozšířená, jak volná, tak i ve formě derivátů. Její soli (octany, acetáty) i deriváty jsou významné v medicíně a biochemii. Důležitá je v metabolismu např. jako thioester s koenzymem A (acetylkoenzym A). [14] Používá se k výrobě acetátového hedvábí, v konzervárenství, pří výrobě léčiv (acylpyrin), její 5 8 % vodný roztok se běžně prodává jako ocet. Kvašením lihových roztoků vzniká kyselina octová také v přírodě. Jde o tzv. octové kvašení, způsobené některými druhy bakterií, které oxidují alkohol na kyselinu octovou. [17,18] Základem výroby kyseliny octové je oxidativní fermentace ethanolu. Proces katalyzuje systém octových bakterií. Koncentrovaná kyselina octová, tzv. ledová, tuhne již při 17 C. [17,19] Kyselina oxaloctová Obr. č. 8: Kyselina oxaloctová [14] Kyselina oxaloctová (Oxal) je dikarobxylová kyselina vyskytující se převážně v ketoformě. V cyklu kyseliny citrónové je důležitým substrátem pro tvorbu citrátu (pomocí acetylkoenzymu A). Je také konečným produktem při odbourávání některých aminokyselin. [5,14] Kyselina vinná Obr. č. 9: Kyselina vinná [14] 19

20 Kyselina vinná (Tar) je dikarboxylová dihydroxy kyselina. Má dva asymetrické uhlíkové atomy, takže existuje pravotočivá D-forma, levotočivá L-forma, opticky inaktivní mesovinná a racemická kyselina. [12,14] V přírodě se nejčastěji vyskytuje D-vinná kyselina, zatímco L-forma se vyskytuje jen ojediněle a mesovinná kyselina nebyla vůbec v přírodě dokázána. Vinná kyselina neboli kyselina hroznová byla obvykle jako dihydrát dokázána ve šťávě hroznů, po nichž je pojmenována. [12] Nepatrné množství kyseliny vinné se nalézá i v některých jiných bobulích, jako je červený rybíz, angrešt a brusinky. V černém rybízu, v jablkách, borůvkách a v mnoha jiných druzích úplně schází. Soli kyseliny vinné jsou méně rozpustné než volná kyselina a vylučují se z hroznových šťáv a vín jako usazenina (vinný kámen). [13] Používá se v potravinářském (výroba prášku do pečiva) a chemickém průmyslu. [4] 20

21 3. Metody stanovení karboxylových kyselin Karboxylové kyseliny mohou být stanoveny použitím různých separačních technik. Tyto metody jsou zvláště vhodné pro identifikaci směsí organických kyselin. Nejčastěji používané jsou kapalinová chromatografie (LC), vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC), tenkovrstvá chromatografie (TLC), plynová chromatografie (GC) a kapilární elektroforéza (CE). [20,21] Nejrozšířenější metodou pro stanovení karboxylových kyselin je plynová chromatografie. Její výhodou je vysoká rozlišovací schopnost. Mezi nevýhody patří nutnost derivatizace analyzované látky a stejně jako u HPLC dlouhá doba analýzy. Nižší monokarboxylové a nižší dikarboxylové kyseliny lze analyzovat iontovou chromatografií. [8,20,21] Sledování obsahu karboxylových kyselin v potravinách je součástí kontroly kvality potravin, často k této kontrole se využívají chromatografické metody. Další možností je využití enzymových metod a elektromigračních technik. Velkou výhodou elektromigračních technik oproti chromatografickým je jednoduchá příprava vzorku, což je zvláště důležité pro rutinní analýzy velkých souborů vzorků. Také doba analýzy je obvykle kratší při stejné separační účinnosti. [12,22,23] 3.1. Plynová chromatografie Plynová chromatografie je fyzikální separační a analytická metoda, která má významnou úlohu v analýze těkavých látek. Používá se v mnoha průmyslových odvětvích, např. v chemickém, petrochemickém nebo farmaceutickém průmyslu. Významné uplatnění má v průmyslu organických syntéz. Převedení analytů na těkavé produkty pomocí derivatizace umožnilo širší aplikaci GC v lékařských, biologických a biochemických oborech. Standardně se využívá pro stanovení zbytků rozpouštědel v léčivech nebo pro stanovení stopových množství pesticidů v půdě, ve vodách a v potravinách. Má také velké využití při sledování kvality životního prostředí (aromatické polutanty v ovzduší a ve vodě, detekce pesticidů atd.). Mezi hlavní výhody této techniky patří jednoduché a rychlé provedení analýzy, účinná separace látek, vysoká citlivost a malé množství vzorku potřebné k analýze. [8,15,22] GC je separační metoda, která neposkytuje informace o struktuře látek ve vzorku. Při kvalitativní analýze v chromatografii se identifikace analytu provádí na základě srovnání retenčních dat analytu a standardu. Retenční data analytu odrážejí 21

22 specifické interakce analytu se stacionární a mobilní fází. Identifikace neznámých složek se provádí pomocí hmotnostní spektrometrie (MS). V současné době se často používá kombinace plynového chromatografu s plamenově ionizačním detektorem (GC-FID) nebo hmotnostním spektrometrem (GC-MS). [15] Tuto metodu lze použít k analýze dostatečně těkavých a teplotně stabilních organických látek. Některé nižší alifatické karboxylové kyseliny lze analyzovat přímo, vhodnější je však polární karboxylové kyseliny převést na těkavé estery. Plynovou chromatografií lze rovněž určit množství oxidu uhličitého vzniklé při kvantitativní dekarboxylaci [8] Kapalinová chromatografie Nedostatky kapalinové chromatografie byly z počátku dány nízkým rozlišením. Spojení LC s MS, však rozšířilo její analytické možnosti, zejména pak v profilování metabolitů. Využití LC-MS je zaměřeno na diagnostiku v oblasti medicíny, ideální je pro profilování některých tělních tekutin. Ve farmaceutickém průmyslu je LC-MS hojně využívána pro analýzu rostlinných extraktů. [20] HPLC je metodou často používanou pro stanovení karboxylových kyselin. Organické kyseliny je možné stanovit iontově výměnnou chromatografií, iontově párovou chromatografií a chromatografií na reverzní fázi použitím vodných mobilních fází. [22,24,25] Iontově výměnnou chromatografií (IEC) se separace provádí pomocí silně kyselého iontoměniče a jako mobilní fáze se používají zředěné roztoky anorganických kyselin. Při separaci na reverzní fázi (RP) se používají kolony s nepolární stacionární fází. [22] 3.3. Enzymové metody Stanovení některých karboxylových kyselin (kyselina mléčná a jantarová) se nejčastěji provádí enzymově, s pomocí komerčních souprav. [7,26] Princip stanovení L-mléčné kyseliny: L-laktát + NAD + pyruvát + NADH + + H + pyruvát + L-glutamát L-alanin + 2-oxoglutarát 22

23 Množství NADH vznikajícího v první reakci je ekvivalentní množství L-mléčné kyseliny. Vznikající množství NADH je stanoveno měřením absorbance při 340 nm. Princip stanovení jantarové kyseliny: sukcinát + ITP + CoA IDP + sukcinyl-coa + P IDP + PEP ITP + pyruvát pyruvát + NADH + H + L-laktát + NAD + Množství oxidovaného NADH je ekvivalentní množství jantarové kyseliny a stanoveno měřením absorbance při 340 nm Elektromigrační metody Elektromigrační metody jsou jednoduché a nevyžadují složité úpravy vzorku. Kapilární elektroforéza (CE) se vyznačuje vysokou účinností, kratšími časy analýz a nižší provozní cenou spojenou s malou spotřebou vzorku a základních elektrolytů. CE ve spojení s MS má velký potenciál v metabolomických studiích. V oblasti farmakologie se CE-MS využívá pro analýzu rostlinných sekundárních metabolitů. [20] Pro stanovení kapilární zónovou elektroforézou je nutné zvolit nosný elektrolyt s takovou hodnotou ph, která co nejblíže odpovídá hodnotám pk a stanovovaných kyselin, aby byly ve vzorku přítomny ve formě iontů, které jsou disociovány a které lze následně separovat. [27] Kapilární izotachoforéza je vhodnou metodou pro identifikaci a stanovení karboxylových kyselin v potravinách. Její výhodou je jednoduchá úprava vzorku a krátký čas analýzy. [28] 23

24 4. Použití GC pro stanovení karboxylových kyselin Plynová chromatografie je velmi rozšířenou technikou pro stanovení karboxylových kyselin. V současnosti se nejvíce kombinuje s hmotnostním spektrometrem, tedy s nejlepší analytickou technikou pro identifikaci a kvantifikaci stopových množství organických látek. K detekci karboxylových kyselin lze použít i plamenově ionizační detektor (FID). Karboxylové kyseliny mají relativně vysokou teplotu varu a malou tepelnou stabilitu. Proto jsou před analýzou převedeny (derivatizovány) na stabilnější deriváty (estery). Nicméně nutnost derivatizačních postupů a dlouhá doba analýzy na kapilární koloně patří mezi nevýhody GC metod. [8] 4.1. Princip metody GC Při analýze je vzorek vnesen mezi systém dvou vzájemně nemísitelných fází stacionární a mobilní. Vzorek je umístěn na začátek stacionární fáze a pohybem mobilní fáze je unášen mezerami mezi částicemi porézní náplně stacionární fáze. Jednotlivé složky vzorku mohou být stacionární fází zachyceny a při pohybu se zdržují. Tím dochází k postupné separaci složek. [22,29] Prvním krokem při použití metody GC je odpaření vzorku v temperovaném dávkovacím zařízení (injektoru), následné oddělení jednotlivých složek směsi v chromatografické koloně, detekce každé složky a její vyhodnocení. [30] Vzorek z injektoru je zaveden do proudu nosného plynu, který protéká kolonou se stacionární fází umístěnou v termostatu. Při průtoku plynu kolonou se jednotlivé složky směsi pohybují různými rychlostmi ovlivněnými mírou interakce se stacionární fází. V důsledku toho se jednotlivé složky směsi oddělují a při výstupu z kolony mohou být kvantifikovány vhodným detektorem. [30] Separace probíhá v plynné fázi obvykle za teplotního gradientu (ohřev z počáteční teploty na konečnou dostatečně vysokou teplotu) v proudu nosného plynu. Mezi povrchem stacionární fáze a dělenými analyty v plynné fázi dochází k periodickému ustanovení rovnováhy, která je závislá na povaze analytu (bod varu, polarita, tvar molekuly) a použité stacionární fázi následkem toho dochází k separaci (rozdílné eluci látek v závislosti na čase). [31] Metoda plynové chromatografie může být využívána jak ke kvantitativnímu stanovení analytu ve vzorku, tak ke kvalitativní analýze směsi neznámých vzorků. 24

25 Množství analytu je detekováno měřícím systémem. Jeho signál je funkcí obsahu analytu ve vzorku a citlivosti detekčního zařízení. [31] Obr. č. 10: Zjednodušené schéma plynového chromatografu FID [30] 4.2. Instrumentace Nosný plyn mobilní fáze Mobilní fáze je v plynové chromatografii představována nosným plynem. Jako zásobník tohoto plynu slouží tlaková lahev. Nosný plyn transportuje vzorek přes kolonu do detektoru. Musí být inertní nebo alespoň nereaktivní vzhledem ke stacionární fázi. Nejčastěji používaný je vodík, dusík nebo helium. Při volně nosného plynu se berou v úvahu následující faktory: viskozita, účinnost, čistota, reaktivita, separační schopnost, rychlost průtoku, typ používaného detektoru a kolony a cena plynu. [15,22,30] Injektor Injektor je vstupním zařízením, kterým analyzovaná látka proniká do plynového chromatografu (kolony) společně s inertním plynem. Nástřik látky se nejčastěji provádí pomocí speciální injekční stříkačky přes septum, které odděluje vnitřek injektoru od vnějšího prostoru. Součástí injektoru je skleněná vložka (liner), ve které dochází při vysoké teplotě k rychlému odpaření vzorku a ke správnému promíchání par vzorku s nosným plynem. Mezi injektorem a kolonou je umístěn dělič toku (splitter), který umožňuje vést jen část odpařeného vzorku na kolonu (splitovací poměr, split ratio). 25

26 Technika nástřiku bez splitu (splitless injection) se používá při stopové analýze směsí látek, které se výrazně liší v bodu varu. [56] Obr. č. 11: Schéma injektoru [32] Kolona Kolona je část chromatografu, kde je uložena stacionární fáze. Dle skupenství stacionární fáze se plynová chromatografie dělí na chromatografii v systému plyn pevná látka (plynová adsorbční chromatografie, GSC) a na chromatografii plyn kapalina (plynová rozdělovací chromatografie, GLC). Podle charakteru analyzovaného vzorku se volí typ stacionární fáze. Při výběru platí, že stacionární fáze by měl mít podobný charakter jako analyzovaný vzorek. Stacionárních fází existuje mnoho druhů, ale v současné době se jejich výběr zúžil na několik typů, které jsou vyráběny na bázi polysiloxanů. [15,33] V koloně dochází ke zpomalení průchodu molekul zkoumané látky. Rychlost je závislá na délce kolony, na tlaku, pod kterým je směs vháněna dovnitř a na teplotě. Existují dva základní druhy kolon, které se používají v plynové chromatografii: náplňové a kapilární. Náplňové kolony se zhotovují ze skla nebo nerezové oceli. V dnešní době jsou nejpoužívanějším typem kolony kapilární pro jejich vyšší účinnost. Kapilární kolony jsou vyráběny z taveného křemene, jehož vnější povrch je potažen vrstvou polyimidu, což přispívá k větší pružnosti kolony. Vnitřní průměr kolon je μm. Stacionární fáze je rozprostřena na vnitřních stěnách kapiláry. Podle specifikace můžeme kolony rozdělit na univezální a specifické, které se dále dělí podle efektu na nepolární a polární. Nepolární kolony jsou vhodné pro nepolární sloučeniny, 26

27 pořadí eluce odpovídá bodům varu dělených látek. Polární kolony se používají pro separaci polárních látek. [15,22,33] Kolona je umístěna v peci, která je temperována na určitou teplotu. Teplota je důležitá proměnná v plynové chromatografii. Pokud je teplota kolony během analýzy vzorku konstantní, jedná se o isotermální analýzu. Pro analýzu směsí látek s rozdílnými body varu je vhodné použít teplotního gradientu, kdy se teplota kolony během analýzy mění podle teplotního programu. Výhodou je zlepšení tvaru chromatografických píků (zúžení signálů, vyšší citlivost) a výrazné zkrácení doby analýzy. [15,22,33] Detektor Zařízení, v němž dochází k převádění množství analytu, nejčastěji na elektrický signál. Je umístěn na výstupu z kolony a je spojen s hardwarovým zařízením zobrazujícím signály pro různé analyty. [22,34] V plynové chromatografii se využívá několik typů detektorů. Jsou děleny na univerzální a selektivní. Nejčastěji používaným univerzálním detektorem je plamenově ionizační detektor (FID). Mezi selektivní detektory patří detektor elektronového záchytu (ECD). V současnosti se často používá spojení GC s hmotnostním spektrometrem (MS). To umožňuje nejen detekci přítomnosti analytu, ale také jeho identifikaci na základě hmotnostního spektra. Mezi další detektory patří: tepelně vodivostní detektor (TCD), atomově emisní detektor (AED) nebo třeba fotoionizační detektor (PID). [15,22] Plamenově ionizační detektor (FID) V současné době je nejrozšířenějším detektorem v plynové chromatografii. Princip je založen na měření elektrického proudu procházejícího sběrnými metodami. Výstup z kolony ústí do hořáku, ve kterém je spalována směs vodíku, vzduchu a analytu vycházejícího z kolony. [15,22] Plyn z chromatografické kolony je zaváděn do kyslíko-vodíkového plamene, kde probíhají chemiionizační reakce vedoucí ke vzniku nabitých částic. Detektor se sestává z ocelové trysky, do které vstupuje směs nosného plynu, vodíku a doplňkového plynu. Na špičce mikrohořáku pak dochází v proudu vzduchu ke ionizaci této směsi na ionty, které se detekují na polarizovaných elektrodách. [15,22] 27

28 Obr. č. 12: Plamenově ionizační detektor (FID) [30] FID poskytuje odezvu téměř na všechny organické látky. Výsledný signál je závislý na počtu C-H vazeb v molekule. Odezvu nedává většina anorganických plynů a par a některé organické látky (formaldehyd, tetrachlormethan). Nastavení průtoku vodíku a vzduchu je velmi důležité a musí být provedeno s ohledem na nosný plyn. Maximální linearity a citlivosti se dosahuje při optimálním poměru doplňkový plyn / vodík. Odchylky od optimálního poměru mají za následek nestabilní plamen a velký šum [15,22] Výhody: - nižší pořizovací náklady, malý rozměr - vyšší dynamický rozsah - prakticky univerzální odezva pro uhlovodíky využití při kvantitativní analýze - jako nosný plyn lze i N 2 Nevýhody: - více provozních plynů (nosný plyn, H 2, vzduch) - detekce pouze sloučenin obsahujících C-H vazbu [31] Pomocné plyny V detektorech se používají různé pomocné plyny podle způsobu detekce. FID vyžaduje k vytvoření plamene směs syntetického vzduchu a vodíku, zatímco pro ECD se používá dusík a methan nebo jejich směs v argonu. V TCD je pomocný plyn shodný s nosným plynem. Stejně tak jako pro nosné plyny je i čistota pomocného plynu velmi důležitá pro výkon, údržbu a životnost detektoru. [30] 28

29 4.3. Záznam chromatogramu Chromatogram je grafický záznam závislosti napěťové odezvy detektoru na čase. Ze získaných chromatogramů lze vyhodnotit retenční parametry jednotlivých signálů, plochy a výšky píku. [15,22] Kvalitativní vyhodnocování metody v GC Pro identifikaci látek je podstatné umístění maxima píku v chromatogramu. Toto umístění lze vyjádřit pomocí retenčních dat. Retenční čas R t je pro látky za daných separačních podmínek (rozměry kolony, průtoková rychlost nosného plynu, teplota kolony, tlakový spád na koloně) charakteristikou vlastností. [22] Kvantitativní vyhodnocování metody v GC Za předpokladu lineární odezvy detektoru je plocha úměrná množství látky. To umožňuje určovat množství či koncentraci dané látky v neznámém vzorku. Kvalita kvantitativní analýzy je především ovlivněna přípravou vzorků, správnou funkcí přístroje a kvalitou zpracování dat. [15,22] Metoda vnitřní normalizace Touto metodou se určuje obsah látek ve směsích, je-li počet komponent relativně nízký a všechny komponenty jsou známy. Množství určité komponenty se vyjadřuje jako relativní frakce z celku. Tedy, v určité směsi je x % látky A, y % látky B, z % látky C atd. Výsledky při použití této metody nezávisí na přesnosti objemu při nástřiku vzorku. [15,22] Metoda absolutní kalibrace Touto metodou se určuje absolutní koncentrace nebo absolutní množství látky na základě kalibrační závislosti. Protože u této metody je kritický objem nástřiku, závisí správnost metody na dobré reprodukovatelnosti dávkovaných objemů. Často se doporučuje pracovat s automatickým dávkovačem (autosampler). [15,22] Metoda vnitřního standardu Při této metodě se ke vzorku přidává určité množství známé látky, tzv. vnitřní standard. Tato látka nesmí být přítomna v původním vzorku, nesmí reagovat s žádnou 29

30 složkou vzorku, musí být dobře oddělena od všech složek v původním vzorku a musí eluovat v blízkosti stanovované složky. Výhodou této metody je, že není třeba znát přesný objem nástřiku vzorku. Navíc, s použitím vnitřního standardu se eliminuje vliv změn pracovních podmínek, protože jak stanovovaná složka, tak vnitřní standard jsou těmito změnami stejně ovlivněny. [15,22] Metoda standardního přídavku Při použití této metody se ke vzorku přidává známé množství stanovované látky. Z plochy píku látky obsažené ve vzorku a plochy píku po přidání definovaného množství látky ke vzorku lze vypočítat množství látky v původním vzorku. [15,22] 4.4. Příprava vzorku k analýze Plynová chromatografie se používá pro separaci a detekci těkavých látek. Sloučeniny obsahující funkční skupiny s aktivním vodíkem (-SH, -OH, -NH, -COOH) tvoří intermolekulární vodíkové vazby. Tyto vodíkové vazby působí na vlastní těkavost sloučenin, které tyto vazby obsahují, ovlivňuje jejich tendenci reagovat s materiály kolony, a dále má vliv na jejich tepelnou stabilitu. Modifikace funkční skupiny v molekule pomocí derivatizace umožňuje analýzu těchto látek. [35,36] Derivatizační proces by měl splňovat určitá kritéria. Se vzorkem by mělo být snadno manipulováno, a pokud je to možné, používat jedno činidlo. Důležité je, aby byla derivatizační reakce prováděna ve vodném prostředí. Reakce by měla být rychlá a probíhat za pokojové teploty. Požadováno je také malé množství levných činidel. Výsledný produkt by měl být více těkavý, méně polární, teplotně stabilní a analýza by měla dávat vysoký výtěžek. Mezi nejčastější derivatizační reakce patří silylace, alkylace a acylace. [35,36] Silylace Tato reakce zahrnuje nahrazení aktivního vodíku trialkylsilylovou skupinou. Jedná se o nukleofilní substituci. Deriváty jsou těkavější a stabilnější než výchozí látka. Reaktivita funkčních skupin v silylačních reakcích klesá v následujícím pořadí: alkoholy > fenoly > karboxylové kyseliny > aminy > amidy > amidová / hydroxylová skupina. Použitý vzorek i rozpouštědlo musí být suché. Použitá rozpouštědla by měla být v co nejvyšší čistotě. Mnoho činidel vyžaduje zahřívání na teplotu, která není vyšší 30

31 než 60 C po dobu asi minut, aby se zabránilo rozpadu derivátu. Silylové látky jsou kompatibilní s většinou detekčních systémů, ale v případě, že jsou použity v nadbytku, můžou způsobit potíže s FID (tvorba oxidu křemičitého). Po přidání katalyzátoru se zvyšuje reaktivita činidla. [35,36] Obr. č. 13: Reakční schéma silylace Acylace Principem této metody je zavádění acylové skupiny do organické sloučeniny. Sloučeniny, které obsahují aktivní vodíky (např. OH, -SH, -NH) mohou být nejdříve převedeny na estery, thioestery a amidy. V případě karboxylových kyselin, reakce zahrnuje zavedení acylové skupiny a ztrátu hydroxylové skupiny. [35, 36] Obr. č. 14: Reakční schéma acylace Acylace zlepšuje stability sloučenin, které jsou tepelně nestabilní vložením chránící skupiny do molekuly. Může poskytovat těkavost látkám, které mají mnoho polárních skupin, jsou netěkavé a obvykle se při zahřátí rozkládají (např. sacharidy nebo aminokyseliny). Nevýhodou acylačních činidel je, že jsou citlivá na vlhkost, jsou nebezpečná a zapáchající. Může být obtížné připravit acylační deriváty, protože reagují s jinými reakčními produkty, které musí být odstraněny dříve, než dochází k separaci pomocí plynové chromatografie. [35,36] 31

32 Alkylace Proces nahrazení aktivního vodíku alifatickou nebo alifaticky-aromatickou skupinou se nazývá esterifikace. Alkylační reakce se používají pro přípravu esterů, etherů, thioetherů, thioesterů, N-alkyaminů, amidů a sulfonamidů. [35,36] Obr. č. 15: Reakční schéma alkylace Produkty alkylace jsou méně polární než výchozí látky v důsledku nahrazení aktivního atomu vodíku za alkylovou nebo arylovou skupinu. Alkylestery mají dobrou stabilitu, což umožňuje jejich dlouhodobé skladování. Mezi často používaná činidla alkylace patří dimethylsulfát (DMS) a diethylsulfát (DES). Tato reakce se používá jako první krok pro další derivatizaci. [35, 36] Reakce s alkyl chloroformiáty Obr. č. 16: Typické reakce s alkyl chloroformiáty Metoda derivatizace za použití alkyl chloroformiátů (ACF) je často používána především pro její jednoduchost. Výhodou této reakce je, že trvá řádově pár minut a probíhá i při pokojové teplotě a ve vodném prostředí. Podmínkou pro dobrý průběh reakce je udržení zásaditého ph reakční směsi. Při reakci je zapotřebí použít katalyzátor (pyridin nebo 3-pikolin). Náklady na použitá činidla jsou zanedbatelná. Použitím ACF 32

33 se zvyšuje citlivost detektoru a zlepšuje se separace úzce souvisejících analytů. [35,36,37,38] Obr. č. 17: Reakce alkyl formiátu s karboxylovou kyselinou 33

34 Cíle práce Náplní této bakalářské práce je charakterizace karboxylových kyselin pomocí metody plynové chromatografie. K přípravě vzorku byla vybrána specifická reakce s alkyl chloroformiáty, vzhledem k tomu, že reakce probíhá ve vodném prostředí. Cílem experimentální části bylo osvojit si metodu derivatizace karboxylových kyselin pomocí alkyl chloroformiátů a oddělení derivatizovaných karboxylových kyselin od zbylé reakční směsi pomocí extrakce kapalina kapalina pro stanovení pomocí plynové chromatografie v kombinaci s plamenově ionizačním detektorem. Dále optimalizovat postup derivatizace vybraných karboxylových kyselin, separačních podmínek a detekci ionizačním detektorem. Poté v rámci chromatografické analýzy charakterizovat jednotlivé karboxylové kyseliny pomocí retenčních časů, stanovit limit detekce a vytvořit kalibrační křivky. Dalším cílem je ověřit možnost stanovení karboxylových kyselin a aminokyselin (AMK) v jednom vzorku. 34

35 II. Experimentální část 5. Použité přístroje - Plynový chromatograf Bruker GC Výrobce: Bruker Corporation, Billerica, Massachusetts, USA - Automatický nástřikový systém PC Nástřikový prostor - Septum: 9 mm Marathon Center Guide - Liner: Gooseneck splitless liner, 4 mm x 6,5 mm x 78,5 mm for Varian GC - Kolona: ZB-50 - Plamenově ionizační detektor (FID) - Vyhodnocovací software: Compass CDS - Tlakové lahve: - Dusík (čistota 5.0) - Nosný plyn - Výrobce: SIAD Czech spol., s.r.o. Praha, ČR - Vodík (čistota 5.0) - Pomocný plyn (spalovací palivo pro FID) - Výrobce: SIAD Czech spol., s.r.o. Praha, ČR - Vzduch (čistota 5.0) - Pomocný plyn (spalovací palivo pro FID) - Výrobce: SIAD Czech spol., s.r.o. Praha, ČR - Vortex MS2 Minishaker od firmy IKA -Werke GmbH & Co. KG, Staufen, Německo - Ultrazvuk SONODREX Digitec od firmy BANDELIN electronic GmbH & Co. KG, Berlín, Německo 35

36 6. Použité chemikálie a materiál K přípravě vzorků pro testované postupy byly použity standardy CA o čistotě 98 % od firmy Sigma-Aldrich, Co., St. Louis, USA. Pro vybrané CA (Citr, Citram, Fum, Lac, Mal, Malon, Oct, Oxal, Ph-But, Suc, Tar) byly pomocí deionizované vody připraveny zásobní roztoky CA standardů o koncentraci 10 mm, které byly skladovány v lednici při teplotě 5 C. Pro jednotlivé analýzy byly zásobní roztoky podle potřeby ředěny. Jako vnitřní standard byla použita fenylbutanová kyselina. Pro přípravu vzorků byla používána tato derivatizační činidla: ECF (čistota 98 %) a PrCF (čistota 98 %). Všechna tato činidla byla od firmy Sigma-Aldrich, Co., St. Louis, USA. Do reakčních směsí byly přidávány tyto alkoholy: EtOH (čistota 99,8 %) a PrOH (čistota 99,9 %) od firmy Sigma-Aldrich, Co., St. Louis, USA. Jako katalyzátor byl používán pyridin (čistota 99,8 %) nebo 3-pikolin (čistota 99,5 %) od firmy Sigma-Aldrich, Co., St. Louis, USA. Další používané chemikálie pro přípravu vzorků byly hydroxid sodný (čistota 99 %), isooktan (čistota 99,8 %), chloroform (čistota 99,9 %), hexan (čistota > 99 %), 37% kyselina chlorovodíková a uhličitan sodný (p.a.). Všechny tyto látky byly od firmy Sigma-Aldrich, Co., St. Louis, USA. Příprava i analýza vzorků byla prováděna ve vialkách o objemu 1,5 ml od firmy Labicom s.r.o, Olomouc, ČR, za použití plastových šroubovacích víček se silikon/teflonovým septem (9 mm). 36

37 7. Metody přípravy vzorku Na základě literární rešerše byly vybrány postupy přípravy vzorku pro analýzu CA pomocí GC. Jedná se o nepřímé metody za použití derivatizačních činidel alkyl chloroformiátů. Tyto metody byly vybrány na základě hlavní výhody ACF, a to možnosti derivatizace ve vodném prostředí. Na základě získaných výsledků, byla navržena a optimalizována nejvhodnější metoda, aby byly získány nejvyšší výtěžky. Pro prvotní testování byly vybrány kyselina citrónová a jablečná. Jako blank byla použita voda vždy ve stejném množství jako vzorek a následně byl proveden stejný postup jako v případě vzorku obsahujícího karboxylovou kyselinu. U některých postupů bylo v rámci jedné metody testováno několik separačních analýz Metoda I K 600 µl vzorku (590 µl H 2 O + 10 µl roztoku CA) bylo přidáno 240 µl EtOH a 160 µl pyridinu. Reakční směs byla následně protřepána. K této směsi bylo přidáno 10 µl ECF a vše bylo opět protřepáno. Poté bylo přidáno 500 µl isooktanu s 1 % ECF. Celá směs byla protřepána na vortexu po dobu 1 minuty. Po oddělení fází (1 2 hodiny) bylo odebráno 400 µl vrchní (isooktanové) fáze k analýze na GC-FID. [39] Takto připravený vzorek byl měřen na GC-FID pomocí analýzy I a VI (viz. příloha č. 1) Metoda II Ke 200 µl vzorku (190 µl H 2 O + 10 µl roztoku CA) byla přidána směs 40 µl NaOH (5%), 240 µl alkoholu a 120 µl katalyzátoru. Celá směs byla následně protřepána a bylo k ní přidáno 10 µl alkyl chloroformiátu. Opět došlo k protřepání směsi. Následně bylo přidáno 500 µl isooktanu s 1 % alkyl chloroformiátu. Reakční směs byla protřepána na vortexu po dobu 1 min. Po oddělení fází (1 2 hodiny) bylo odebráno 400 µl vrchní (isooktanové) fáze k analýze na GC-FID. [39] Tato metoda byla provedena ve 2 modifikacích (viz. tabulka č. 1). Vždy za použití jiného alkoholu, alkyl chloroformiátu a katalyzátoru. Takto připravený vzorek byl měřen na GC-FID pomocí analýzy I v případě A, a VIII v případě B (viz příloha č. 1). 37

38 Tab. č. 1: Schematické znázornění modifikací metody II A B 200 µl vzorku 40 µl NaOH (5 %) 240 µl EtOH 240 µl PrOH 120 µl pyridinu 120 µl 3-pikolinu 10 µl ECF 10 µl PrCF 500 µl isooktanu s 1 % ECF 500 µl isooktanu s 1 % PrCF 7.3. Metoda III Na základě získaných poznatků z předešlých experimentů byl vytvořen postup III. K 100 µl vzorku (90 µl H 2 O + 10 µl roztoku CA) byla přidána směs 300 µl NaOH (5%), 200 µl alkoholu a 50 µl 3-pikolinu. Celá směs byla promíchána na vortexu po dobu 10 s. Poté bylo přidáno 50 µl alkyl chloroformiátu a směs byla opět protřepána vortexem 10 s. Následně bylo přidáno 300 µl NaOH (5%) a 5 s třepáno na vortexu. Poté bylo přidáno 500 µl isooktanu nebo hexanu a vše promícháno na vortexu 5s. Poté byl přidán znovu alkyl chloroformiát v množství 20 µl a celá reakční směs byla míchána na vortexu po dobu 10 s. Po ustálení fází bylo odebráno 400 µl vrchní (isooktanové nebo hexanové) fáze k analýze na GC-FID. Tato metoda byla provedena v 5-ti modifikacích (viz. tabulka č. 2). Testoval se vliv 2 přídavků NaOH, 2 typů alkoholů a alkyl chloroformiátů a také vliv sonikace. Takto připravený vzorek byl měřen na GC-FID pomocí analýzy I, VII (v případě A), II, VII, VIII, X (v případě B), VII, VIII (v případě C) a VIII (v případě D a E), (viz příloha č. 1). 38

39 Tab. č. 2: Schematické znázornění modifikací postupu III A B C D E 100 µl vzorku 300 µl NaOH µl EtOH 200 µl PrOH 50 µl 3-pikolinu 50 µl ECF 50 µl PrCF - sonikace 1 min 300 µl NaOH 300 µl NaOH µl NaOH 300 µl NaOH 500 µl isooktanu nebo hexanu 20 µl ECF 20 µl PrCF - sonikace 1 min 7.4. Metoda IV K 100 µl vzorku (80 µl H 2 O + 10 µl 1M HCl + 10 µl roztoku CA) byla přidána směs 100 µl PrOH, 10 µl PrCF a 20 µl 3-pikolinu. Cela směs byla jemně promíchána. Následně k ní bylo přidáno 300 µl chloroformu a 100 µl Na 2 CO 3 (1M). Směs byla protřepána na vortexu po dobu 30 s. Poté došlo k ustálení fází a byla odsáta vrchní vrstva a ke spodní fázi bylo přidáno 150 µl chloroformu. Poté bylo odebráno 200 µl spodní (chloroformové) fáze k analýze na GC-FID. [40] Takto připravený vzorek byl měřen na GC-FID pomocí analýzy XI (viz. příloha č. 1) Metoda V Ke 200 µl vzorku (180 µl H 2 O + 20 µl roztoku CA) bylo přidáno 20 µl NaOH (20 %), 200 µl směsi alkohol katalyzátor (v poměru 7:1) a 50 µl směsi isooktan alkyl chloroformiát (v poměru 5:1). Celá směs byla protřepána na vortexu. Dále bylo do reakční směsi přidáno 20 µl NaOH (20 %), 50 µl směsi isooktan alkyl chloroformiát (v poměru 5:1) a 100 µl chloroformu s 2 % alkyl chloroformiátu. Směs byla protřepána a následně k ní bylo přidáno 100 µl Na 2 CO 3 (5 %). Směs byla znovu protřepána a po ustálení fází byla odsáta vrchní vrstva. Ke spodní vrstvě bylo přidáno 150 µl HCl (3,7 39

40 %) a směs byla promíchána. Poté bylo odebráno 100 µl spodní fáze k analýze na GC- FID. [41] Tato metoda byla provedena ve 3 modifikacích (viz. tabulka č. 3). Testoval se vliv dvou typů alkoholů a alkyl chloroformiátů a také vyšší přídavek chloroformu. Takto připravený vzorek byl měřen na GC-FID pomocí analýzy XII (viz. příloha č. 1). Tab. č. 3: Schematické znázornění modifikací metody V A B C 200 µl vzorku 20 µl NaOH 200 µl směsi EtOH 3-pikolin (7:1) 200 µl směsi PrOH 3-pikolin (7:1) 50 µl směsi isooktan ECF (5:1) 50 µl směsi isooktan PrCF (5:1) 20 µl NaOH 50 µl směsi isooktan ECF (5:1) 50 µl směsi isooktan PrCF (5:1) 100 µl chloroformu se 2 % ECF 200 µl chloroformu se 2 % ECF 100 µl Na 2 CO µl HCl 200 µl chloroformu se 2 % PrCF 7.6. Metoda VI Na základě získaných poznatků z předešlých experimentů byl vytvořen postup VI. K 100 µl vzorku (90 µl H 2 O + 10 µl roztoku CA) bylo přidáno 300 µl NaOH (5 %), 200 µl PrOH a 50 µl 3-pikolinu. Tato směs byla protřepána na vortexu po dobu 10 s. Poté bylo přidáno 20 µl PrCF a následně opět protřepáno na vortexu po dobu 10 s. Následně bylo přidáno 100 µl chloroformu a směs byla míchána na vortexu 10 s. Ke směsi bylo přidáno 300 µl NaOH (5 %) a vše opět promícháno pomocí vortexu po dobu 5 s. Následně bylo přidáno 500 µl isooktanu a opět protřepáno na vortexu 5 s. K celé směsi bylo nakonec přidáno 20 µl PrCF a celá reakční směs byla míchána na vortexu po dobu 10 s. Po ustálení fází bylo odebráno 400 µl vrchní (isooktanové) fáze k analýze na GC-FID. Takto připravený vzorek byl měřen na GC-FID pomocí analýzy III, IV, V, IX, XIII (viz příloha č. 1). 40

41 7.7. Metoda VII K 100 µl vzorku (50 µl H 2 O + 50 µl roztoku CA) bylo přidáno 16 µl pyridinu, 84 µl PrOH a 50 µl směsi isooktan PrCF (v poměru 5:1). Tato směs byla protřepána. Následně k ní bylo přidáno 20 µl NaOH (5 %) a vše bylo opět promícháno. Poté bylo přidáno 50 µl směsi isooktan PrCF (v poměru 5:1) a směs byla protřepána. Následně bylo přidáno 100 µl chloroformu se 2 % PCF. Směs byla protřepána a v posledním kroku k ní bylo přidáno 100 µl Na 2 CO 3 (5 %) a 150 µl HCl (5 %). Celá reakční směs byla promíchána na vortexu a po oddělení fází bylo odebráno 100 µl vrchní (isooktanové) fáze k analýze na GC-FID. [41] Takto připravený vzorek byl měřen na GC-FID pomocí analýzy XIII (viz. příloha č. 1). 41

42 8. Optimalizace metody Ze získaných výsledků poskytovala nejvyšší odezvu metoda VI. Proto byla vybrána pro následnou optimalizaci pro zvýšení výtěžku a citlivosti. Jako vzorek byla analyzována kyselina citrónová a fenylbutanová. Tato metoda byla provedena v 7 modifikacích (viz. tabulka č. 4). Testovaly se různé přídavky NaOH a PrCF. Dále se vyzkoušely dva typy katalyzátorů (3-pikolin a pyridin). Takto připravený vzorek byl měřen na GC-FID pomocí analýzy V (v případě A a C), V, XIII (v případě B), a XIII (v případě D G), (viz. příloha č. 1). Tab. č. 4: Schematické znázornění modifikací metody VI A B C D E F G 50 µl 3- pikolinu 10 µl PrCF 10 µl PrCF 300 µl NaOH 20 µl PrCF 10 µl PrCF 100 µl vzorku 200 µl PrOH 200 µl NaOH 50 µl pyridinu 20 µl PrCF 100 µl chloroformu 20 µl PrCF 300 µl NaOH - 20 µl PrCF 10 µl PrCF 500 µl isooktanu 20 µl PrCF 20 µl PrCF 400 µl NaOH 20 µl PrCF 20 µl PrCF 300 µl NaOH 40 µl PrCF - 42

43 A [ V.min -1 ] 9. Výsledky V této kapitole jsou shrnuty výsledky všech testovaných postupů a modifikací, které jsou graficky vyhodnoceny. Dále jsou zde uvedeny experimentálně získané retenční časy, chromatogram průběhu stanovení CA, limity detekce a parametry kalibračních křivek jednotlivých testovaných karboxylových kyselin Výsledky měření testovaných postupů Kyselina citrónová a jablečná byly vybrány jako nejvhodnější zástupci karboxylových kyselin pro testování všech 7 metod přípravy vzorku. V rámci měření, nejlepší odezvu poskytovala metoda VI (viz graf č. 1). Následně byla tato metoda optimalizována pro dosažení co nejlepší citlivosti Citr Mal met I met II met III met IV met V met VI met VII metody Graf č. 1: Přehled ploch píků vybraných CA získaných různými metodami Zbylé metody nevykazovaly žádnou odezvu na výše uvedené karboxylové kyseliny. V rámci testovaných metod byl sledován vliv parametrů vodné i organické fáze na výtěžek derivatizace citrónové a jablečné kyseliny. U metody III byl testován vliv isooktanu nebo hexanu. Za použití hexanu, analýza prakticky neprobíhala. V případě metody III byl také sledován vliv sonikace, který je v literatuře často doporučován pro zvýšení výtěžku. V našem případě však sonikace neměla na výsledek žádný vliv. 43