Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biologických a lékařských věd

Transkript

1 Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biologických a lékařských věd Vliv salmonelového lipopolysacharidu na genový přepis a sekreci interferonu gama Diplomová práce Vedoucí diplomové práce: Ing. Bc. Igor Šplíchal, CSc. Garant za KBLV: PharmDr. Petr Jílek, CSc. Hradec Králové 2010 Bc. Jana Machovská

2 Prohlašuji, že tato diplomová práce je mým původním autorským dílem a veškeré myšlenky, data a jejich zdroje, z nichž jsem pro zpracování čerpala, řádně cituji

3 Poděkování Velký dík za pomoc při vypracování této práce patří mému školiteli Ing. Bc. Igoru Šplíchalovi, CSc. a PharmDr. Petru Jílkovi, CSc. za odborné vedení při vypracování diplomové práce. Za pomoc a podnětné přípomínky bych dále ráda poděkovala MUDr. Alle Šplíchalové Ph.D. a ostatním pracovníkům Mikrobiologického ústavu AVČR, v.v.i. v Novém Hrádku. Jsem velmi ráda, že jsem dostala příležitost vypracovat svoji diplomovou práci právě na takovém pracovišti. Tuto příležitost bych také ráda využila k poděkování svým blízkým. Byli mi vždy velkou oporou, nejen při těžkých chvílích během studia. Tato diplomová práce byla vypracována v rámci grantů Grantové agentury České republiky 523/07/0572 a Ministerstva školství, mládeže a tělovýchovy ME915. 3

4 Abstrakt Autor: Bc. Jana Machovská Název: Vliv salmonelového lipopolysacharidu na genový přepis a sekreci interferonu gama Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biologických a lékařských věd (KBLV) studijní obor: Odborný pracovník v laboratorních metodách Cíl práce: Cílem diplomové práce je posoudiv vliv typu salmonelového lipopolysacharidu na aktivaci genového přepisu a produkci interferonu gama (IFN- ) jako ústředního cytokinu imunitní reakce proti intracelulárním bakteriálním patogenům. Studie byla provedena na infekčním modelu gnotobiotického prasete infikovaného gramnegativní bakterií Salmonella enterica serovar Typhimurium kmen LT2 nebo jejím rfal- mutantem. Metody: 1) Vytvoření čtyř skupin selat: kontrolní bezmikrobní skupina (GF), skupina konvenčních selat a skupiny selat infikovaných kmenem LT2 a rfal- 2) stanovení počtu CFU v krvi a výplachu tenkého střeva kultivací na bakteriologických půdách 3) Izolace celkové RNA z ilea, stanovení její koncentrace (spektrofotometricky) a odhad čistoty (A 280 /A 260 ). 4) reverzní transkripce 5) kvantifikce specifické vzniklé cdna (real-time PCR s LNA sondami) 6) normalizace a relativizace dat z real-time PCR 7) stanovení cytokinů jako proteinů v krvi a výplachu tenkého střeva metodou ELISA Výsledky: 1) Počet bakterií v tenkém střevu byl vyšší u skupiny infikované kmenem LT2 než rfal- mutantem 2) Genová transkripce IFN-γ byla vyšší u skupiny infikované kmenem LT2 3) Genové transkripce IL-12/23 p40 a IL-18 byly vůči kontrolní skupině vyšší u skupiny infikované LT2 4) Exprese mrna TLR4 byla zvýšená u skupiny infikované LT2 5) Exprese mrna NF-κB byla zvýšená u skupin selat infikovaných jak kmenem LT2, tak rfal- 6) Hladina IFN-γ jako proteinu byla jak v plasmě, tak ve střevě zvýšena u skupiny selat infikovaných LT2 7) Hladina IL-12/23 p40 byla zvýšená ve střevu i plasmě u skupiny infikované LT2 8) Hladiny IL-18 se v plasmě a střevu lišily, rozdíly mezi jednotlivými skupinami selat však nebyly průkazné. Závěry: K nejvyšší aktivaci mechanismů přirozené imunity došlo u skupiny infikované virulentní S.Typhimurium LT2. Selata infikovaná rfal- mutantem však nevykazovala příznaky salmonelové enteritidy (nechutenství, malátnost, průjem a zvýšená tělesna teplota), avšak indukované hodnoty cytokinů svědčily o aktivaci mechanismů přirozené složky imunity. Dá se tedy předpokládat, že tato Salmonella s R chemotypem lipopolysacharidu by mohla působit protektivně jako živá vakcína chránící před infekcí virulentním kmenem. Důkladné ověření této domněnky však vyžaduje další doplňující experimenty kombinující podání obou Salmonell v experimentech in vivo. 4

5 Abstract Candidate: Bc. Jana Machovská Title of diploma thesis: Influence of salmonella lipopolysaccharide on gene transcription and secretion of interferon gamma Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Biological and Medical Sciences Aim: The aim of this diploma thesis is to evaluate the influence of a type of salmonella lipopolysaccharide on the activation of gene transcription and production of gamma interferon (IFN-γ) as a key cytokine of immune response to intracellular bacterial pathogens. The study was performed on infectious model of a gnotobiotic pig infected with gram-negative bacteria Salmonella enterica serovar Typhimurium strain LT2 or its rfal- mutant. Methods: 1) Four groups of piglets were created: germ-free as a control group, conventional piglets, piglets infected with LT2 strain, piglets infected with rfal- mutant 2) Determination of bacterial CFU in blood and intestinal lavage by cultivation on bacteriological media 3) Isolation of a total RNA from ileum, spectrophotometric quantification and estimation of its purity (A 280 /A 260 ) 4) Reverse transcription into cdna 5) Real-time PCR with LNA probes 6) Normalization and relativization of real-time PCR data 7) Estimation of cytokines in blood and intestinal lavage by ELISA. Results: 1) A bacterial count in the group infected with LT2 strain outnumbered a count in piglets infected with rfal- mutant 2) The gene transcription of IFN-γ was the highest in the LT2 strain 3) The gene transcriptions of IL-12/23 p40 and IL-18 showed higher levels in LT2 group compare with the control 4) Expression of TLR4 mrna was upregulated in the group infected with LT2 5) Expression of NF-κB mrna was increased either in LT2 or in rfal- groups 6) IFN-γ on a protein level was increased both in plasma and intestinal lavage of the LT2 infected pigs 7) IL-12/23 p40 was increased in plasma and intestinal lavage in the LT2 group 8) IL-18 levels differed in plasma and intestinal lavage but the differences among piglets groups were not statistically significant. Conclusions: The highest activation of mechanisms of innate immunity was observed in the group of gnotobiotic piglets infected with virulent S. Typhimirium LT2. The piglets infected with rfal- mutant did not showed symptoms of salmonella enteritidis (anorexia, fatigue, diarrhea, and fever) but the levels of induced cytokines attested about activation of mechanism of innate immunity. It is possible to expect that this Salmonella with R chemotype of the lipopolysaccharide can be effective as a live vaccine protecting against infection with virulent strain. However, a thorough verification of such hypothesis requires other complementary experiments of combined application of both Salmonellas in experiments in vivo. 5

6 Obsah Abstrakt... 4 Abstract... 5 Obsah Literární úvod Lipopolysacharid a jeho význam Struktura LPS Základní struktura Variabilita LPS struktury Rozpoznání LPS v organismu Struktury umožňující rozpoznání LPS TLR4 jako hlavní receptor rozpoznávající LPS Signální kaskáda po aktivaci TLR4 - aktivace NF-kappaB Signální kaskáda závislá na MyD Signální kaskáda nezávislá na MyD IL-12 a IL-18 jako hlavní cytokiny pro indukci exprese IFN-γ Vznik IL IL Receptory pro IL-12 a IL-18 a děje které aktivují Další děje nutné pro tvorbu IFN-γ Místa působení IL-12 a IL IFN-γ Receptor pro IFN-γ a signální kaskáda Vliv IFN-γ na buňky imunitního systému Imunitní odpověď na infekci Salmonellou Typhimurium Výsledky dosud proběhlých studií Protektivní účinky R-typu LPS Změny na buněčné úrovni Změny na cytokinové úrovni v plazmě a výplachu ilea Použité metody analýzy Cíl práce Materiál a metody Gnotobiotická selata Bakteriální kultura rfal- mutant

7 3.3 Odběr a uchování vzorků Stanovení distribuce mikroorganismů v hostiteli Izolace RNA Stanovení koncentrace a čistoty celkové RNA Syntéza cdna Real-time PCR ELISA Statistické a grafické vyhodnocení výsledků Tvorba citací Výsledky izolace RNA Exprese mrna Počet bakterií v krvi a střevě Aktivace genového přepisu na úrovni mrna Hodnoty cytokinů na úrovni antigenu (ELISA) Diskuze Závěr Seznam zkratek Seznam použité literatury Přílohy

8 1. Literární úvod 1.1 Lipopolysacharid a jeho význam Historie lipopolysacharidu (LPS) začala v osmnáctém století hledáním substance, která způsobovala horečku a onemocnění a byla spojena s nehygienickými podmínkami. Říkalo se jí různě, například hnilobný jed nebo toxin. Postupně rostlo uvědomění si role živých organismů jako původců různých onemocnění. Díky pokračujícímu rozvoji bakteriologických technik mohl Pfeiffer v roce 1892 dokázat, že původce cholery Vibrio cholerae produkuje pyrogenní, nesekretovaný toxin, který je oproti sekretovanému toxinu tepelně odolný. Nazval jej endotoxinem, tento termín se pro LPS, který jej tvoří, používá do současnosti (24). LPS je hlavní komponentou vnější membrány gramnegativních bakterií, mezi něž patří i enterobakterie rodu Salmonella. Díky své toxicitě a imunomodulačním vlastnostem je LPS častým předmětem zájmu medicíny. Jednotlivé druhy LPS sdílí stejnou základní strukturu, ovšem strukturální specifity podle příslušnosti bakterie k určitému rodu nebo druhu jsou odpovědné za jejich různou aktivitu. Buňky vrozené imunitní odpovědi jsou totiž schopné rozeznat evolučně konzervované LPS molekulární vzory endotoxinů (25,81). Strukturální detaily tedy silně ovlivňují imunitní odpověď. Zatímco u infikovaného jedince mohou malá množství LPS působit protektivně stimulací imunitního systému (24), velké množství naproti tomu vyvolává vysokou horečku, zrychlení srdeční frekvence až nakonec septický šok a následně smrt způsobenou selháním ledvin a plic, systémovou zánětlivou odpovědí a intravaskulární koagulací (35,139). 1.2 Struktura LPS Základní struktura Molekula LPS se dá rozdělit na dvě hlavní části: bisfosforylovaný lipid (lipid A) a hydrofilní polysacharid (PS). Lipid A formuje matrix krajní části membrány, PS z membrány bakterií vyčnívá. Dá se říci, že PS se skládá ze dvou odlišných částí. Z oligosacharidového jádra, které tvoří cukerných jednotek a z tzv. O- specifického řetězce, který tvoří opakující se jednotky polysacharidu. Jádro PS je k lipidu A vázáno kovalentní vazbou zprostředkovanou kyselým cukrem, obvykle 3- deoxy-d-mano-oct-2-ulopyranosovou kyselinou (Kdo). Zdá se, že Kdo je charakteristickým a základním cukrem velké většiny lipopolysacharidů (25). 8

9 Podle vzhledu kolonií lze enterobakterie rozdělit na R- a S-typy. S-typy ( smooth ) mají v molekule LPS O-řetězec. Zato R-typy ( rough ) O-řetězec ve své molekule postrádají. Podle snižující se délky jejich jádra se u nich rozeznává Ra, Rb,... až Re formy LPS (25). Minimální struktura LPS, která je nutná pro růst bakterií se nalézá u Re typů. Jejich lipid A je spojen pouze se dvěma Kdo zbytky (25). Byla popsána dokonce N. meningitidis, která postrádala LPS úplně. Vyznačovala se pomalejším růstem a ztrátou endotoxické aktivity, přičemž ultrastruktura vnější membrány nebyla viditelně změněna (145). (viz obr. 1) Obr. 1. Schematické znázornění vnější membrány gram-negativních enterobakterií (vlevo), struktura molekuly LPS podle její příslušnosti k R- nebo S-typu (vpravo) (24). Většina lipidu A je strukturně zakonzervována a sestává z mono- a bisfosforylované disacharidové kostry, která je ve specifických pozicích (C2, C3, C2, C3 ) acylována mastnými kyselinami o délce řetězce C12-C14. Tyto mastné kyseliny 9

10 ve své molekule mohou, ale nemusí mít hydroxylovou skupinu. Pokud je hydroxylová skupina přítomna, může dojít k esterifikaci dalšími mastnými kyselinami (tzv. sekundární substituce) (37). (viz obr. 2a) Obr. 2. a) Chemická struktura LPS; b) TLR4-MD2-CD14 receptorový komplex, LRR-na leucin bohatá extracelulární část, HYP-hypervariabilní doména, intracelulární TIR doména (96) Variabilita LPS struktury Jednotlivé bakteriální druhy sdílí stejné strukturně konzervované oblasti LPS, které přispívají k rozvoji nebo udržení základních struktur pro přežití bakterie. Strukturní variabilita LPS tedy mohla vzniknout v oblastech, jejichž změna neměla pro bakterie letální následky. Změny v těchto variabilních oblastech mohou mít za následek jednoduchou modifikaci LPS, ke které se počítá například změna délky řetězce, nebo naopak může dojít ke změně všeobecné chemické konfigurace a připojení dalších skupin, následkem čehož dojde k celkové změně struktury LPS (37). Kromě 10

11 heteregenity polysacharidové části, mající význam u S-typů enterobakterií, lze heterogenitu LPS molekuly pozorovat i v oblasti lipidu A. Stupeň acylace, typ substituce dvou fosfátů lipidu A a dokonce i druh mastných kyselin ovlivňují jeho toxicitu (73,174). viz obr. 5 Strukturální rozdíly typu hydroxylace, sekundární substituce a přítomnosti mastných kyselin s řetězcem delším než C14, mohou být ovlivněny specifickými vlivy prostředí (ph, divalentní kationty-mg 2+ ) a regulačními systémy které na tyto vlivy reagují (24). Konkrétně Salmonella enterica serovar Typhimurium obsahuje dvousložkový regulační systém PhoP-PhoQ, který je citlivý na změny prostředí a reguluje geny nutné pro intracelulární přežití bakterie v makrofágovém fagozomu a rezistenci ke kationickým peptidům (97). Je plně aktivován po proběhnutí makrofágové fagocytózy (5). Systém ovlivňuje strukturu lipidu A díky třem enzymům vnější membrány. Jedná se o enzymy PagP, který katalyzuje acylaci, PagL který katalyzuje deacylaci a LpxO který katalyzuje hydroxylaci (55,59,156) - viz obr. 4. Prvním enzymem pod kontrolou systému PhoP/PhoQ je PagP (lipid A palmitoyltransferasa), která k lipidu A připojuje palmitát, čímž se z něj stane heptaacylovaná forma, která je rezistentní ke kationickým antimikrobním peptidům (16,59). (viz obr. 3) Obr. 3. Původní hexa-acylovaná (A) a změněná hepta-acylovaná (B) struktura lipidu A S. typhimurium (59) 11

12 Druhým enzymem je PagL s 3-O-deacylázovou aktivitou. Deacylovaný lipid A, který vznikne díky jeho působení, je schopný s největší pravděpodobností ovlivnit cytokinovou odpověď hostitele na salmonelovou infekci tím, že snižuje aktivaci signální kaskády po obsazení receptoru TLR4 (Toll-like receptor 4) (75,156). Obr. 4. Chemická struktura modifikací lipidu A u bakterie Salmonella enterica serovar Typhimurium, červeně znázorněny modifikace kontrolované složkou Pho P(96). Struktura, která propůjčuje lipidu A nejvyšší biologickou aktivitu je disacharidová kostra z beta-(1-6)-d-glukosaminu, fosforylovaná v pozici 1 a 4 a ideálně s dvěmi 3- acyloxyacylovými skupinami (37) a dále přítomnost obvykle šesti řetězců hydrofobních mastných kyselin o délce řetězce C12-C18 (37,82). Často se o ní mluví také jako o kanonické struktuře lipidu A. U gramnegativních enterických a non-enterických 12

13 bakterií se jedná o strukturu vysoce strukturně konzervovanou, přičemž jakékoliv změny v její struktuře mají za následek dramatickou změnu biologického účinku (37). Obr. 5. Ukázka strukturální diverzity lipidu A u gram-negativních mikroorganismů, barvy ukazují různou délku uhlíkatých řetězců mastných kyselin (96) 1.3 Rozpoznání LPS v organismu Ačkoliv se oblast lipidu A považuje za vcelku konzervovanou, její variabilita v rámci daného druhu může mít obrovský vliv na její funkci. Tato různorodost strukturálních motivů, která je přítomna jak v části polysacharidové, tak v oblasti lipidu A, se následně odráží v různorodosti molekul, které k obraně proti mikrobiální infekci 13

14 vyvinuly složky přirozené imunity. Buněčná složka přirozené imunity (mastocyty, NK buňky, fagocyty) je díky svým membránovým a solubilním PPR receptorům (Pathogen Pattern Receptors) schopná identifikovat nebezpečné molekulární vzory mikroorganismů. Tyto tzv. PAMP molekuly (Pathogen Associated Molecular Patterns) jsou základní a neměnné mozaiky povrchových a nitrobuněčných molekul patogenních mikroorganismů. V poslední době používá též název MAMP (Microbe Associated Molecullar Patterns). Jsou tvořeny součástmi bakteriální stěny, kromě LPS dále např. peptidoglykanem, mananem, kyselinou lipoteichoovou i bakteriální DNA. PAMP molekuly jsou součástí pouze mikroorganismů, nevyskytují se v hostiteli. Jejich identifikace prostřednictvím PPR je tedy pro organismus jednoznačným důkazem přítomnosti patogena. Kromě toho, že PPR receptory jsou schopny rozlišit mozaiky patogenů od mozaik nepatogenů, je důležitá i skutečnost, že tyto PAMP molekuly jsou pro mikroorganismy životně důležité. Následný zásah přirozené imunity proti těmto strukturám tedy patogeny nemohou obejít aktivací kolaterálních metabolických drah (narozdíl od působení antibiotik) (81) Struktury umožňující rozpoznání LPS LPS jako PAMP molekula tedy musí být v organismu rozpoznán receptorem, následkem čehož dojde k aktivaci intracelulární signální kaskády a konečně k indukci prozánětových cytokinů, chemokinu a interferonů. Celý tento složitý prozánětově orientovaný děj má za úkol odstranit nositele PAMP molekuly. U savců je jako klíčový PPR receptor označována rodina TLR (Toll-like receptor) receptorů (81). Název TLR je odvozen od receptoru Toll, který byl objeven roku 1996 u Drosophilly melanogaster jako receptor důležitý pro orientaci dorzo-ventrální osy během jejího vývoje. Následně byl identifikován jako receptor participující na vrozené imunitní odpovědi proti fungální infekci u Drosophil (84). Postupně byly identifikovány četné homology těchto receptorů i u savců (odtud Toll-like) a byla objasněna jejich schopnost fungovat jako receptory rozpoznávající PAMP molekuly a indukovat tvorbu zánětlivých cytokinů. Dnes je známo u savců 13 těchto receptorů, které jsou schopny rozpoznat PAMP vzory různých patogenů: viry, bakterie, houby i protozoa (3). TLRs jsou exprimovány jak na imunitních buňkách (dendritické buňky, makrofágy, neutrofily) tak na buňkách ostatních (fibroblasty, epiteliální buňky, keratinocyty). Konkrétně LPS je rozeznáván TLR4 receptorem lokalizovaným v plazmatické membráně. Je ovšem nutná jeho součinnost s dalšími složkami jako jsou CD14, LBP (lipopolysaccharide binding protein) a makrofágový MD-2 (42). S těmito složkami tvoří TLR4 receptorový komplex TLR4-MD2-CD14. (viz obr. 2b) K plné funkci tohoto 14

15 komplexu je nutná i přítomnost dalšího proteinu-lbp, který mění oligomerní micely LPS na monomery a předává je dál k CD14. Molekula CD14 zabezpečuje vazbu LPS k TLR4-MD2 komplexu (96) CD14 Molekula CD14 je membránový glykoprotein, který je v membráně zakotven glykosylfosfatidylinositolovou kotvou. Je exprimován na povrchu buněk myeloidního původu (mcd14) a váže endotoxickou komponentu LPS-lipid A. Je schopný převést signál k buňce a tím následně aktivovat fagocyty. Molekula CD14 je schopná vázat LPS i samostatně, účinnost vazby je však krát vyšší v přítomnosti LBP (81). Důležitost molekuly CD14 potvrdila skutečnost, že specifické monoklonální protilátky proti CD14 inhibují schopnost LPS stimulovat fagocyty a dále to, že buňky, které neexprimují mcd14 jsou díky solubilní molekule CD14 (scd14) přítomné v krvi také schopné odpovědět na stimulaci LPS aktivací (42). LPS je amfifilní membránový fosfolipid, který ve vodném prostředí (což je i krev) tvoří agregáty. Difuze monomerů z těchto agregátů k molekule CD14 probíhá velmi pomalu (60) LBP LBP je protein akutní fáze (149) přítomný běžně v krvi v koncentraci zhruba 2-20 μg/ml, přičemž jeho hodnota při zánětlivém onemocnění dramaticky stoupá (106). Přítomnost plazmatického LBP velmi urychluje vazbu vzniklých monomerů LPS k CD14, a tím stupňuje jeho aktivační signál (60). Kromě tohoto pozitivního efektu na aktivaci může mít LBP i vlastnosti opačné. Má totiž schopnost přenášet LPS k lipoproteinovým částicím (konkrétně HDL) a tím biologickou aktivitu LPS neutralizovat (140,168). Schopnost LBP přenášet LPS je způsobena jeho schopností vázat lipid A (150) MD-2 (myeloid differentiation protein) MD-2 lze považovat za spojovací článek mezi TLR4 receptorem a LPS signalizací. V pokusu s buněčnou linií, u které probíhala exprese jak TLR4 tak MD-2, bylo zjištěno, že MD-2 je lokalizován na buněčném povrchu, navíc docházelo ke kolokalizaci právě s TLR4. Tyto výsledky ukazují, že MD-2 je zřejmě zakotven do membrány díky fyzickému spojení s TLR4. Pokud buňka exprimuje zároveň kromě TLR4 i MD-2, zvýší se aktivace NF-κB závislá na TLR4 2-3x, právě díky přítomnosti 15

16 MD-2 (138). Navíc bylo zjištěno, že MD-2 je molekula schopná přímo regulovat jemné rozpoznání konkrétní struktury LPS receptorem TLR4 (2). Kromě těchto tří základních složek receptorového komplexu TLR4-MD2-CD14 existují další molekuly, které se zřejmě nějakým způsobem účastní přenosu signálu, protože jsou s tímto receptorovým komplexem spojeny. Jedná se konkrétně o Hsp (heat shock protein) 90 a 70, CD55 a CD11/18 (42,121). Existují i zprávy o zapojení lumicanu (167), moesinu a HMGB Moesin Jedná se o 78 kda protein, který připojuje cytoskelet k membráně monocytů, kontroluje tvar buněk, jejich adhezi a pohyb. Skutečnost, že exprese moesinu na povrchu monocytů je zvýšena po stimulaci buněk LPS a že moesin koprecipituje s TLR4 naznačuje, že hraje roli ve formaci iniciačního komplexu v LPS signální cestě. Dále bylo zjištěno, že eliminace exprese genu pro moesin má za následek znatelné snížení tvorby LPS-indukovaného TNF-α (67) HMGB1 (High Mobility Group Box 1 Protein) HMGB1 je jaderný protein, který se podílí na stabilizaci nukleosomu a genové transkripci (87). Zřejmě také spouští zánět (135) a působí jako pozdní mediátor endotoxemie a sepse (162). Bylo ovšem také zjištěno, že HMGB1 může vázat a katalyzovat přenos LPS monomerů z jejich agregátů a předávat jej buď molekule CD14 nebo komplexu TLR4/MD-2 (173). Jedná se o vysoce inducibilní protein, který je u zdravých lidí přítomen v plazmě v prakticky nedetekovatelném množství zhruba 50 pg/ml, u osob se sepsí stoupá zhruba na 80 ng/ml (162). Než začne být HMGB1 sekretován ve vyšší míře (nejen imunokompetentními buňkami, ale i neurony, osteoklasty, buňkami hladké svaloviny (87), hlavní roli v přenosu LPS k CD14 hraje zřejmě LBP (173) TLR4 jako hlavní receptor rozpoznávající LPS TLR4 byl první TLR receptor popsaný u lidí, proto byl taky původně nazvaný htoll (human Toll) (95). Patří do skupiny receptorů TLR, které jsou charakterizovány na leucin bohatou extracelulární částí (LRR leucine-rich repeats), jednoduchou transmembránovou oblastí a intracelulární doménou TIR (Toll/IL-1R). Název této 16

17 domény je odvozen od toho, že její sekvence je podobná sekvenci receptorů Toll u Drosophily a je homologem cytoplazmatické sekvence receptoru pro IL-1 (IL-1R) (81,121). Jednotlivé TLR, které se liší ve své extracelulární části a váží odlišné PAMP molekuly, mají ovšem shodnou intracelulární část. Receptory TLR po interakci s ligandy polymerizují (81). Obr. 6. Jednotlivé TLR receptory, jejich ligandy a adaptorové proteiny s TIR doménou (74). TLR4 byl identifikován jako hlavní receptorový a signální protein, kterým LPS aktivuje buňky vrozené imunity (127). Rozpoznání LPS těmito buňkami vychází z LPS receptorového komplexu, složeného ze signální podjednotky TLR4, rozpoznávací podjednotky MD-2 a mcd14 (příp. scd14) (96). K tomu, aby S-typ LPS aktivoval TLR4, je nutná spolupráce dalších proteinů (CD14, LBP) zatímco R-typ LPS je schopný aktivovat komplex TLR4/MD-2 přímo (66). R-typ LPS silně aktivuje buňky cestou závislou na MyD88 (bez nutné přítomnosti CD14 a LBP) a o něco slaběji cestou závislou na TRIF (viz níže). Protože většina gram-negativních patogenů tvoří kromě S- typu LPS i určité množství LPS typu R, buňky postrádající CD14 (žírné buňky a lymfocyty B) mohou přesto rozpoznat přítomnost bakterie právě díky přítomnosti R- typu LPS (66). Ukazuje se tedy, že R-typy LPS mohou aktivovat širší spektrum TLR4/MD-2 pozitivních buněk a to s vyšší účinností než S-typy LPS (50). 17

18 Po rozpoznání PAMP molekuly aktivují TLR receptory signální složky což následně ústí v imunitní odpověď. Receptory TLR užívají sadu adaptorových proteinů s TIR doménou. Interakce TIR domény proteinu s TIR doménou TLR receptorů má za následek spuštění signální kaskády, která vede k aktivaci transkripčního faktoru NF-κB (nuclear factor-kappa B). Ten kontroluje indukci prozánětových cytokinů a chemokinů (74). Každý druh TLR receptorů užívá svoji specifickou kombinaci adaptorových proteinů. Vzhledem k tomu, že LPS je specifickým ligandem pouze receptoru TLR4, budou dále popsány pouze děje probíhající po aktivaci tohoto konkrétního receptoru. 1.4 Signální kaskáda po aktivaci TLR4 - aktivace NF-kappaB Mezi adaptorové proteiny nutné pro přenos signálu receptorem TLR4 patří MyD88 (myeloid differentiation factor 88), Mal (MyD88 adaptor-like protein, také TIRAP), TRIF (TIR-containing adapter molecule, také TICAM-1) a TRAM (TRIF-related adapter molecule, také TICAM-2). Děje následující po aktivaci TLR4 receptoru lze rozdělit do dvou skupin- na časnou odpověď závislou na MyD88 a na odpověď pozdní, která je na MyD88 nezávislá. Obě mají za následek aktivaci NF-κB, ovšem každá cesta aktivuje během svého průběhu jiné další dráhy, které dotvářejí celkovou odezvu buňky. Pro indukci zánětových cytokinů receptorem TLR4 je nutná aktivace obou signálních drah (74) Signální kaskáda závislá na MyD88 MyD88 je molekula, která má na C-terminálním konci TIR doménu a na N- terminálním konci doménu DD (death domain) (22). Doménou TIR se MyD88 spojuje s TIR doménou receptoru TLR4, DD doména interakcí protein-protein aktivuje NF-κB (121,165). Jako další adaptorový protein byl popsán Mal (44). Ukázalo se, že působí společně s MyD88 a tvoří s ním heterodimery. Po vazbě LPS začne TLR4 tvořit homodimery a k receptorovému komplexu se připojí MyD88 a Mal (121). Po aktivaci TLR4 dojde k interakci DD domény MyD88 s DD doménou molekul IRAK (IL-1 receptor-associated kinase). Do rodiny těchto molekul patří IRAK 1, 2, 4 a M (negativní regulátor LPS signální kaskády) (79,164), přičemž jedině kinázově inaktivní IRAK-4 je schopný interakce s MyD88 a může fosforylovat IRAK-1. Jedná se tedy zřejmě o hlavní mediátor v LPS signalizaci (85). Následkem své hyperfosforylace IRAK-1 způsobí disociaci receptorového komplexu a spojení IRAK s TRAF6. TRAF6 se 18

19 aktivuje a spojí se s TAB-2, která aktivuje složku TAK1. Ta se váže se svým adaptorovým proteinem TAB-1. TAK1 působí jako aktivátor NF-κB (113,121). Protože za normálních podmínek je NF-κB v plazmě v inaktivní formě, vázaný na skupinu inhibičních proteinů IκB, musí se z tohoto komplexu před svým přechodem do jádra uvolnit. Aktivace NF-κB je zahájena vytvořením proteinového komplexu signalosomu. Ten tvoří IKKα (inhibitory-binding protein κb kinase) a IKKβ společně s proteinem IKKγ (také zvaný NEMO), který tvoří kostru signalosomu. Fosforylací inhibičních proteinů IκB, navázáním ubiquitinu a jejich následnou degradací dojde k uvolnění NF-κB. K jeho translokaci do jádra může dojít pokud je právě v této volné formě (74) (viz obr. 7) Signální kaskáda nezávislá na MyD88 V této signální cestě jsou zapojeny adaptorové proteiny TRIF (také nazvaný TICAM-1) a TRAM (též TICAM-2). TRIF je schopný aktivovat NF-κB, i když ne v takové míře jako MyD88 spolu s Mal (119,170). TRIF se pokládá za klíčový adaptorový protein v MyD88 nezávislé cestě. Protože se ukázalo, že mezi TLR4 a TRIF dochází pouze k slabé interakci bylo jasné, že musí existovat další adaptorový protein. Dostal název TRAM (a také TICAM-2) a ukázalo se, že aktivuje NF-κB nezávisle na MyD88. Jedná se zřejmě o adaptorový protein pouze pro TLR4, který je strukturně podobný proteinu Mal (45,120). Kaskáda nezávislá na MyD88 zřejmě vypadá tak, že TRAM zprostředkuje kontakt TLR4 s TRIF, který následně váže TRAF6. Zřejmě díky tomu, že TRIF má na svém N-konci doménu vázající právě TRAF6 (134). Další průběh se už podobá kaskádě závislé na MyD88-vytvoření signalosomu, vazba ubiquitinu a degradace IκB vedoucí k translokaci NF-κB do jádra (viz obr. 7). Obě signální kaskády mají kromě aktivace NF-κB za následek také indukci aktivace dalších molekul. Vzhledem k tomu, že předmětem zájmu je IFNγ, byla pozornost věnována pouze aktivaci NF-κB. Pro indukci IFNγ vlivem LPS totiž hraje klíčovou roli právě NF-κB. 19

20 Obr. 7. Zjednodušený model LPS signální dráhy. Dráha závislá na MyD88 vpravo, dráha nezávislá na MyD88 vlevo (121) 1.5 IL-12 a IL-18 jako hlavní cytokiny pro indukci exprese IFN-γ Pro to, aby vznikl funkční IFN-γ je nutná exprese IL-12 a 18 jako základních cytokinů majících vliv na indukci jeho tvorby a jejich synergické působení. Při vzniku obou hlavních cytokinů hraje roli transkripční faktor NF-κB, který kontroluje indukci prozánětových cytokinů a chemokinů i regulaci kostimulačních molekul na dendritických buňkách. Variabilita vlivu různých typů LPS na indukci IFNγ začíná na samém začátku, a to kontaktem LPS s TLR4. Všechny typy LPS mají za výsledek aktivaci NF-κB a expresi cytokinů IL-12 a IL-18 nutných pro tvorbu IFN-γ. O rozdílném výsledku interakce pro různé typy LPS se tedy zřejmě rozhoduje na samém začátku dráhy. 20

21 1.5.1 Vznik IL-12 IL-12 je indukovatelný heterodimerní cytokin složený z 35- a 40-kDa podjednotky (p35 a p40), které jsou spojené disulfidickou vazbou a kódované samostatnými geny (57). Funkční je po vytvoření heterodimeru p35/p40. Jeho exprese je regulována na transkripční úrovni. Exprese 40 kda podjednotky je oproti 35 kda možná pouze makrofágy a B lymfocyty a je silně indukována četnými bakteriálními stimuly (32). O centrálním nervovém systému se dlouho předpokládalo, že díky přítomnosti hematoencefalické bariéry (HEB) se jedná o imunologicky privilegované místo. Nebyly na něm intenzivně studovány účinky septického šoku, pravděpodobně kvůli přítomnosti HEB, která jej v určitém smyslu odděluje od ostatních orgánů (123), i když četné projevy septického šoku svědčí o jeho zasažení (změny mentálního stavupodrážděnost, apatie a také strnulost a koma (61)). V práci, která studovala vliv intraperitoneálně podaného LPS na transkripci IL-12 v mozku bylo zjištěno, že 6 hodin po podání LPS se projeví maximálně zvýšená hladina podjednotky IL12 p40. Zato transkripce podjednotky p35 byla konstitutivně na nižší hladině, zhruba na úrovni transkripce podjednotky p40 po 4 hodinách od podání LPS (123). Ukázalo se tedy, že intraperitoneální podání LPS je schopné indukovat dokonce i v mozku transkripci IL-12, konkrétně jeho podjednotky p40. Promotorová sekvence genu pro 40 kda podjednotku se váže právě s NF-κB (105), který vzniká interakcí LPS a TLR4. Cytokinem, který má vliv na expresi IL-12 je kofaktor trna synthetasy-protein p43 (78). Zřejmě aktivuje promotorovou oblast genu pro 40 kda podjednotku tím, že zvyšuje vazebnou aktivitu NF-κB k DNA. IL-12 je tvořen antigen-prezentujícími buňkami jako odpověď na stimulaci mikroorganismy a jejich produkty. Je zásadní pro rozvoj TH1 buněčné imunity, která hraje roli při obraně proti intracelulárním patogenům, kam patří i Salmonella (81). Bylo zjištěno, že podjednotka p40 IL-12 je současně také podjednotkou IL-23. Proto se tato podjednotka někdy popisuje jako IL12/23 p40. IL-23 se kromě podjednotky p40 skládá ještě z podjednotky p19 (118). Také receptor pro IL-23 sdílí s receptorem pro IL-12 stejnou část, konkrétně β1 podjednotku, druhou část receptoru tvoří jeho vlastní podjednotka β3 (122) IL-18 IL-18 byl poprvé popsán v roce 1989 jako IGIF (IFN-γ inducing factor) (108). Následně bylo provedeno porovnání jeho struktury s ostatními cytokiny. Největší podobnost byla nalezena s lidským cytokinem IL-1β, konkrétně aminokyselinová 21

22 sekvence IGIF se nejvíce shodovala se sekvencí β-skládaného listu IL-1β. Dále byla určitá míra podobnosti nalezena i s IL-1α. Proto se uvažovalo o změně názvu IGIF na IL-1γ (13). Protože nebylo jasné, jestli se IGIF váže k receptoru typu I pro IL-1(IL-1RI), byl nakonec přijat název IL-18 (157). Stejně jako IL-1β také IL-18 je sekretován nejprve jako prekurzor (proil-18), který neobsahuje signální peptid, nutný pro odstranění prekurzorových aminokyselin (36). Aktivita proil-1β je extrémně nízká, po rozštěpení za pomoci ICE (IL-1β-converting enzyme, také nazývaný kaspáza-1) je zralá forma IL- 1β plně aktivní (4,36). ICE je členem rodiny intracelulárních cysteinových proteas, které štěpí v místě kyseliny asparagové (4). Proto není překvapivé, že proil-18 štěpí právě ICE v místě kyseliny asparagové. Výsledkem je zralý a aktivní IL-18 (54,56). Do rodiny IL-1 patří IL-1β, IL-1α a IL-1Ra a to zejména kvůli tomu, že se vážou ke stejnému receptoru-il-1ri. Ačkoliv sdílí méně než 30% primární aminokyselinové sekvence, strukturně si jsou velice podobné, protože všechny tvoří pouze β-skládaný list (36). IL-18, jehož sekundární strukturu také tvoří pouze β-skládaný list a navíc je ligandem IL-1Rrp (IL-1receptor related protein) (151), může být považovaný za dalšího člena rodiny IL-1. Navíc, protože stejně jako IL-1β je syntetizován jako prekurzor postrádající signální peptid a musí být aktivován pomocí ICE, lze ho považovat přímo za člena IL-1β rodiny (36). Mezi ligandy, které přirozeně stimulují jeho expresi patří i LPS (109). Skutečnost, že v promotorové sekvenci IL-18 se nachází rozpoznávací sekvence pro NF-κB ukazuje, že je zřejmě zahrnut také v regulaci jeho exprese. Zatímco IL-12 řídí diferenciaci směrem k TH1 vyzrávání přímo, IL-18 působí spíše jako kofaktor tohoto děje (131) Receptory pro IL-12 a IL-18 a děje které aktivují Po vstupu NF-κB do jádra buňky a za účasti dalších kofaktorů jako je p43 tedy dojde k expresi IL-12 a IL-18. Jde o cytokiny, které svůj účinek na expresi IFN-γ zprostředkují pomocí membránových receptorů, přičemž jak IL-12, tak IL-18 mají svůj vlastní receptor a děj probíhající následně v buňce se pro každý receptor liší. U obou cytokinů je nicméně výsledkem aktivace transkripce IFN-γ. Většina receptorů pro cytokiny postrádá vlastní katalytické domény s kinázovou aktivitou, což je i případ receptoru pro IL-12 (IL12-R). Vazbou ligandu na receptor se indukuje oligomerizace receptorových podjednotek. Dimerizace cytoplazmatických domén cytokinových receptorů umožní aktivaci proteinkináz asociovaných s receptorem, označovaných jako Janusovy kinázy (JAK, Janus activated kinase), u IL- 12 se jedná konkrétně o JAK2. Aktivované JAK2 následně fosforylují receptorové 22

23 podjednotky na tyrozinových zbytcích a tím umožní vazbu cytoplazmatických signálních molekul, označovaných STAT (Signal transducers and activators). Fosforylované STAT4 (indukované IL-12) spolu dimerizují a za pomoci transportních bílkovin přejdou do jádra, kde se navážou na regulační sekvence genů (81). Receptor pro IL-12 je cytokinový receptor typu β a skládá se ze dvou β podjednotek, β1 a β2, které samy o sobě vykazují k IL-12 nízkou afinitu. Vyšší afinitu vykazují pokud se spojí do heterodimeru (128,132). Receptor pro IL-18 (IL-18R) je heterodimer složený ze základního ligand vázajícího řetězce (α řetězec) původně nazvaného IL-1Rrp (IL-1 receptor related protein) a z inducibilního přídavného řetězce β (AcPL-accesory protein like) (124,151). IL-1Rrp váže IL-18 s nízkou aktivitou, AcPL neváže IL-18 vůbec, ale zato zvyšuje afinitu receptoru a účastní se signální transdukce (18). Exprese IL-18R probíhá selektivně na TH1 buňkách (124). Receptor pro IL-18 patří do rodiny IL1-R/TLR receptorů, které sdílí tzv. TIR doménu. Rodina receptorů s TIR doménou se dá rozdělit do třech skupin. Do první skupiny, která obsahuje tři extracelulární domény domény s imunoglobulinovou strukturou, patří právě řetězce IL-18R, IL-1Rrp a AcPL (115). Do druhé skupiny receptorů, které charakterizuje extracelulární LRR doména, patří i TLR4. Do poslední skupiny receptorů, kterou charakterizuje nepřítomnost jakékoliv extracelulární domény patří MyD88. Tato skupina receptorů má spíše signální fukci (15). Protože jak TLR4, tak IL-18R patří do stejné skupiny receptorů s intracelulární TIR doménou, sdílí i podobnou cestu aktivace NF-κB (viz obr. 8). Po spojení podjednotky IL-1Rrp s podjednotkou AcPL tedy dojde přes adaptorový protein MyD88 k připojení IRAK-1. Fosforylovaný IRAK-1 disociuje a interaguje s TRAF6. Ten díky I- κb kinázám IKK-1 a IKK-2 způsobí uvolnění NF-κB z I-κB a jeho translokaci do jádra (15). IRAK-1je zapojen také ve vzniku transkripčního faktoru AP-1 (activator protein 1) (116). 23

24 Obr. 8. Aktivace receptoru pro IL-1, IL-18 a TLR4 spouští podobné signální dráhy pomocí TIR domény. MyD88 působí jako adaptorový protein a váže IRAK-1 a IRAK-2, které následně vážou TRAF-6. To vede k aktivaci dalších dvou kináz-tab-1 a TAK-1 (115) Další děje nutné pro tvorbu IFN-γ Pro indukci genové exprese IFN-γ je nutná nejen přítomnost, ale i synergický účinek IL-12 a IL-18. viz obr. 9. Oba aktivují různé transkripční faktory. IL-12 aktivuje STAT4 (11), IL-18 aktivuje transkripční faktory NF-κB (131) a AP-1 (12). V nepřítomnosti STAT4 je aktivace promotoru IFN-γ pomocí AP-1 (kofaktorem je c- Jun) pouze okrajová. STAT4 a AP-1/c-Jun tvoří komplex. Vazbu komplexu AP-1/c-Jun k sekvencím pro AP-1 zvyšuje právě molekula STAT4 a to díky interakci STAT4 s c- Jun. V tomto synergickém působení IL-12 a IL-18 s promotorovou oblastí IFN-γ se jako klíčová molekula ukazuje STAT4 (107). 24

25 Obr. 9. Mechanismus synergie mezi IL-12 a IL-18 v aktivaci promotoru IFN-γ (107) Kromě toho, že NF-κB reguluje expresi IL-12 a 18, je také přímo zahrnut v regulaci exprese IFN-γ. IL-18 totiž indukuje vazbu NF-κB k oblasti v promotorové sekvenci IFN-γ nazývané KBB místo. Tato vazba NF-κB na KBB oblast je nutná pro úplnou aktivaci transkripce IFN-γ závislé na IL-18 (80) Místa působení IL-12 a IL-18 IL-18 ovlivňuje aktivitu TH1 buněk, cytotoxických T lymfocytů, NK buněk, makrofágů, dendritických buněk a B lymfocytů (viz obr. 10) (15). Samotný IL-18 není schopný indukovat tvorbu IFN-γ klidovými T a B lymfocyty, protože u těch neprobíhá exprese IL-18R. K tomu je nutná přítomnost IL-12, který díky aktivaci STAT4 indukuje expresi IL-18R (172). Podobně IL-18 indukuje expresi IL12-R (169). Ačkoliv byl původně IL-12 objeven jako produkt B lymfocytů, nejde o buňky, které by byly jeho nejdůležitějším producentem. Nejvíce je tvořen fagocytujícími buňkami a antigen-prezentujícími buňkami. Také další buňky, například keratinocyty, jsou schopné jeho tvorby, ovšem v nižší míře. Hlavním místem působení IL-12 jsou T lymfocyty a NK buňky, kde IL-12 indukuje produkci cytokinů, stimuluje jejich proliferaci a zvyšuje cytotoxickou aktivitu (81,132). 1.6 IFN-γ IFN-γ jako jediný člen tvoří skupinu IFN typu II. Původně existovala domněnka, že IFN-γ tvoří pouze TH1 lymfocyty, cytotoxické lymfocyty a NK buňky. Nyní se ovšem ukazuje, že IFN-γ tvoří i B lymfocyty a APC buňky (51,81). Jeho tvorba je řízena IL-12 a IL-18, cytokiny, které sekretují APC. 25

26 IFN-γ má za následek indukci procesů vedoucích ke zpracování a prezentaci antigenu. Řídí také růst, zrání a diferenciaci několika buněčných typů (17), zvyšuje aktivitu NK buněk (23) a reguluje fukce B lymfocytů ve smyslu produkce imunoglobulinů a izotypového přesmyku (17,43). Jednou z důležitých vlastností IFN-γ je aktivace makrofágů, a to na několika úrovních. Zvyšuje fagocytozu zprostředkovanou komplementem, protože zvyšuje jeho sekreci a expresi receptorů pro komplement na povrchu mononukleárních fagocytů (147). Další úrovní působení na fagocytující makrofágy je indukce mikrobicidních schopností-respiračního vzplanutí (viz níže) a lysozomálních enzymů (34). Podobné mikrobicidní mechanismy aktivuje IFN-γ také u neutrofilů (17) Receptor pro IFN-γ a signální kaskáda Receptor pro IFN-γ (IFNGR) je složen ze dvou ligand-vázajících řetězců IFNGR1, spojených se dvěma řetězci IFNGR2, které převádí signál dále do buňky. IFN-γ váže s vysokou afinitou IFNGR1. Oba řetězce patří do druhé třídy cytokinových receptorů. Zatímco řetězec IFNGR1 je v různé denzitě exprimován na povrchu buněk konstitutivně, k expresi IFNGR2 dojde až po aktivaci buněk (14,81). Oba typy řetězců postrádají vnitřní kinázovou/fosfatázovou aktivitu, musí tedy spolupracovat s aktivační dráhou, která tuto schopnost má. Receptor IFNGR využívá cestu JAK1/STAT1 (81,137). Prostřednictvím IFN-γ jsou stimulovány k přepisu geny, které ve své regulační oblasti obsahují tzv. GAS elementy (Gamma interferon activating sequences), na které se váže homodimer STAT1, k aktivaci transkripce příslušných genů dojde zhruba za 6-8 hodin. Naproti tomu IFN-α a IFN-β, které tvoří skupinu interferonů typu I, stimulují geny, které obsahují elementy ISRE (interferon-stimulated response element) a k jejich přepisu dochází zhruba po minutách (81). Signální kaskádu IFN typu I i II zprostředkují mediátory rodiny IRF. Konkrétně v signální kaskádě IFN-γ je zapojen IRF-1, IRF-2 a IRF-9 (také nazvaný ISGF3-IFN-stimulated gene factor 3) (137) (viz obr. 10). 26

27 Obr. 10. Příklad IFN-γ signálního přenosu. Navázání ligandu způsobí konformační změnu IFNGR, dojde k autofosforylaci JAK2, díky které se fosforyluje JAK1. Funkčně aktivní JAK1 fosforyluje IFNGR, kde se vytvoří místo pro STAT1. STAT1 navázaný na receptor se fosforyluje a tím indukuje disociaci STAT1 homodimeru od receptoru. Homodimery STAT1 přechází do jádra a váží se ke GAS elementu genů, které jsou regulovány IFN-γ. IRF-1 a IRF-9 jsou schopné se navázat na ISRE promotorovou oblast příslušných genů (137) Vliv IFN-γ na buňky imunitního systému MHC systém (Major Histocompatibility Complex) je prvkem, který určuje individuální imunologickou reaktivitu jedince. Molekuly MHC systému totiž ve své molekule obsahují místo, kam se mohou navázat antigenní peptidy vzniklé z cizorodých částic. T lymfocyty jsou schopné rozeznat pouze tyto antigenní fragmenty navázené na vlastní molekuly MHC. Na molekulách MHC I. třídy (přítomny na všech jaderných buňkách) jsou prezentovány antigenní fragmenty endogenních cizorodých 27

28 částic (např. virů), které jsou následně rozpoznávány cytotoxickými T lymfocyty CD8+. Naproti tomu na molekulách MHC II. třídy (přítomny na buňkách předkládajících antigen v komplexu s MHC - na APC buňkách) jsou prezentovány exogenní cizorodé částice a jsou rozpoznávány pomocnými CD4+ T lymfocyty. Exprese molekul MHC I. třídy není konstitutivní, zejména IFN-γ (případně ještě IFN-α) vykazuje mohutný indukční potenciál. Tato skutečnost je důležitá pro imunitní odpověď hostitele na intracelulární patogeny. Expresi molekul MHC II. třídy na povrchu APC buněk indukuje pouze IFN-γ (81,137). MHC systém u člověka se označuje HLA (Human Leukocyte Antigens), u myší H2 systém, u prasete SLA (Swine Leukocyte Antigens) a u skotu BLA (Bovine Leukocyte Antigens) (81). IFN-γ je hlavním produktem TH1 buněk a směřuje imunitní odpověď dále směrem k TH1 systému tím, že podporuje jeho mechanismy: imunitu zprostředkovanou buňkami vrozené imunity (aktivace NK buněk), specifickou cytotoxickou imunitu (interakce T lymfocyt:apc) a aktivaci makrofágů (17). Jedním z účinků IFN-γ na makrofágy je aktivace jejich mikrobicidních schopností. Makrofágy vykazují mikrobicidní schopnosti díky tvorbě reaktivních kyslíkových (ROI Reactive Oxygen Intermediates) a dusíkatých (RNI Reactive Nitrogen Intermediates) mediátorů. Jejich tvorba je aktivována indukcí NADPH oxidasového systému (respirační vzplanutí) a inos (viz níže). Zatímco ROI se zaměřují na extracululární patogeny, na intracelulární patogeny (tedy i Salmonellu) se zaměřují RNI (137). Mezi RNI patří i NO. Je tvořen přeměnou L-argininu na L-citrullin, která je závislá NADPH systému a NO syntáze (NOS). Tvorba NO jako takového je řízena třemi izoformami NO syntázy (NOS). Exprese izoformy neuronální a endoteliální probíhá konstitutivně, zato exprese makrofágové inducibilní NOS (inos nebo též mac- NOS) je indukována jako odpověď na imunitní podnět, například právě LPS (89). V promotorové oblasti genu pro inos se nachází dvě oblasti důležité pro jeho transkripci. První oblast obsahuje vazebné místo pro NF-κB (88), druhá oblast obahuje vazebné místo pro IRF-1 (92,163). Tvorba NO makrofágy tedy může být spuštěna přímo LPS- cestou aktivace NF-κB, nebo jako odpověď na stimulaci IFN-γ. (viz obr. 11) 28

29 Obr. 11. Dvě možné cesty aktivace produkce NO jako odpověď na stimulaci LPS (93) Ukázalo se, že IFN-γ má vliv na aktivaci makrofágů tím, že podporuje rychlejší a vystupňovanější odezvu na stimulaci LPS (72,86). A to na úrovni interakce ligand:receptor i následné signální kaskády. V několika experimentech se prokázalo, že IFN-γ podporuje transkripci receptoru TLR4, jeho následnou expresi na povrchu makrofágů a schopnost vázat LPS (19,98). Stimulace buňky IFN-γ může podpořit LPS signalizaci tím, že podporuje expresi adaptorové molekuly MyD88 a signální molekuly IRAK (1,19). Jak bylo popsáno výše, transkripční faktor NF-κB zprostředuje mnoho účinků LPS. IFN-γ napomáhá jeho aktivaci po vystavení buňky LPS, urychluje kinetiku vazby s DNA a rychlejší degradaci jeho inhibitoru, IκB (63) (viz obr. 12). Hodně genů indukovatelných IFN-γ je možné indukovat též pomocí TNF-α. Pokud dojde ke kombinaci obou těchto cytokinů, geny jsou často tzv. superindukovány (65). TNF-α je cytokin sekretovaný především makrofágy jako odpověď na stimulaci LPS a stejně jako IFN-γ je schopný zprostředkovat mnoho účinků LPS díky tvorbě NF-κB (27). 29

30 Obr. 12. Možný mechanismus, který by mohl vysvětlit několikrát popsaný efekt, že buňky předem ošetřené IFN-γ jsou následně citlivější ke stimulaci LPS. 1) IFN-γ zvyšuje expresi TLR4 a MD-2 2) IFN-γ zvyšuje expresi MyD88 a IRAK 3) LPS aktivuje STAT1, pravděpodobně cestou MAPK 4) IFN-γ podporuje aktivaci NF-κB indukovanou LPS 5) LPS indukuje tvorbu IFN typu I, které mohou se signální kaskádou IFN-γ působit synergicky za účelem rozšíření makrofágové odpovědi 6) signální molekuly vzniklé díky působení LPS a IFN-γ se mohou vázat k promotorové oblasti cílových genů, aby synergicky regulovaly transkripci (137). 1.7 Imunitní odpověď na infekci Salmonellou Typhimurium Při perorálním podání proniká Salmonella dále do organismu epitelem terminálního ilea a Peyerovými plaky. Hlavní branou vstupu do Peyerových plaků jsou zřejmě M-buňky, které se zúčastní přenosu antigenu přes slizniční vrstvu do lamina propria. Blíže viz review (69,112). Těsně pod epitelovou vrstvou se nachází lymfatický folikl, který tvoří tři zóny. Folikl je tvořen populací zralých B lymfocytů, mimo folikly je 30

31 v oblasti lamina propria rozptýleny malé T lymfocyty. Další buněčnou populaci tvoří makrofágy, fibroblasty a dendritické buňky (81). Z Peyerových plaků přechází Salmonella dále do mezenteriálních lymfatických uzlin a odtud do cirkulace. Ve slezině a játrech dojde ke kontaktu s makrofágy, resp. Kupfferovými buňkami (99) (viz obr 13). U prasat (a též hlodavců a koček) se do hry přidávají ještě plicní intravaskulární makrofágy (100,166). Během počátečních fází infekce hrají hlavní roli fagocyty, jak makrofágy tak neutrofily. Aktivace makrofágů cytokiny IFN-γ a TNF-α je zřejmě podmínkou ke zničení Salmonell. Oba cytokiny jsou nezbytné během počátečního stadia salmonelové infekce, protože jsou schopné indukovat baktericidní mechanismy makrofágů (110). Obr. 13. Interakce Salmonelly s hostitelským organismem v intestinu, mezenteriálních lymfatických uzlinách, slezině a játrech. MLN-mezenteriální lymfatické uzliny, DCdendritické buňky, PMN-polymorfonukleární neutrofily, MØ-makrofágy (148) 31

32 LPS, jako součást buněčné stěny Salmonelly, je schopný indukovat masivní zánětlivou odpověď tkáně, která má za následek expresi zánětových cytokinů (IL-1, IL- 6,IL -12, IL-18 a TNF-α) (70,94). Během iniciální fáze infekce je produkován také IFN-γ a to NK buňkami, makrofágy a B lymfocyty (101,136,171). Ačkoliv jsou mechanismy přirozené imunity schopné omezit počáteční růst bakterií, není v jejich silách dosáhnout eliminace bakterií z organismu. Navíc se zdá, že bakterie jsou schopné po penetraci ze střeva do hlubších tkání vyvinout mechanismy, které je chrání před působením baktericidních schopností vrozené imunity (29,64). Je tedy nutný nástup specifické imunitní odpovědi, během které se vytváří protilátky. Zatímco v iniciální fázi infekce hraje IFN-γ důležitou roli, potvrzenou několika studiemi (58,110), v pozdních fázích infekce nemá neutralizace IFN-γ na imunitní odpověď organismu žádný vliv a tedy ani sám IFN-γ se pozdní fáze infekce zřejmě nijak významně neúčastní (104,126). Podrobněji cytokinová odpověď na infekci Salmonellou Typhimurium viz review (83,99,153). Obr. 14. Přehled role makrofágů během rané fáze infekce Salmonellou. Setkáním makrofágů s bakterií nebo s jejím LPS se spustí obranná reakce proti infekci. Reakce začíná fagocytozou a pokračuje expresí různých genů, např. pro cytokiny (IL-1, IL-6, IL-12, TNF-α), genů pro proteiny účastnící se prezentace antigenu (MHC II. třídy) a baktericidních schopností (inos). Výsledkem je antiinfekční působení makrofágů za pomoci IFN-γ. Ten je tvořen NK buňkami a/nebo T lymfocyty a je spojen se získanou 32

33 imunitou zprostředkovanou T a B lymfocyty. Aktivace makrofágů je negativně regulována IL-10, který je tvořen TH2 lymfocyty (83) 1.8 Výsledky dosud proběhlých studií Protektivní účinky R-typu LPS Díky tomu, že bezmikrobní zvířata (Germ Free GF) postrádají ve svých střevech jakoukoliv endogenní mikrofloru, Salmonella se může volně množit bez jakéhokoliv omezení a maximální koncentrace dosahuje během několika dní (38). Zejména u patogenních kmenů je výsledná infekční dávka o několik řádů vyšší než původní aplikovaná dávka. Takových hodnot se po podání stejné infekční dávky u klasických konvenčních zvířat dosáhnout nedá. Výsledkem je skutečnost, že po perorálním podání patogenních kmenů GF zvířatům se během několika hodin projeví sepse a během následujících 1-2 dnů dojde ke smrti zvířat (38,129). Je známo, že R- typy Salmonell vykazují ve srovnání s S-typy u konvenčních prasat znatelně sníženou patogenitu (40,130). Nicméně u GF prasat infikovaných spontánně vzniklým R-typem Salmonelly Typhimurium se objevila vyšší hladina mortality (40). Vysvětlením může být to, že z bakterií, které spontánně vykazovaly chemotyp R se stane chemotyp S. Ovšem značné množství prasat z obou skupin přežilo navzdory přítomnosti čisté kultury virulentního S-typu Salmonelly (38). To ukazuje, že R-typy Salmonell mohou indukovat protektivní imunitní odpověď vůči virulentním S-typům. K přezkoumání tohoto protektivního vlivu byly použity dva typy stabilního R-typu Salmonell s odlišným chemotypem LPS-Ra a Re. Perorální aplikaci obou typů GF prasata přežily a navíc se ukázalo, že jeden z nich vykazoval značný protektivní efekt vůči následné infekci virulentními S kmeny. Ve schopnosti kolonizovat střevní trakt se typy S, Ra a Re nelišily. Nicméně v jejich schopnosti proniknout mukozou a rozšířit se do organismu už byly znatelné rozdíly. Re chemotyp jen zřídka pronikl do mezenteriálních lymfatických uzlin (později podaný S-typ pronikl mukozou, volně se množil a během 1-2 dnů zvířata zahynula). Následně byl zvířatům aplikován S typ bakterií rezistentní na streptomycin. Všechna zvířata, kterým byla předtím podána Salmonella typhimurium chemotypu Ra přežila. Naproti tomu všechna zvířata až na jedno, která byla předem očkovaná chemotypem Re, během jednoho týdne po podání S typu zemřela. Poslední bylo euthanizováno v terminálním stádiu salmonelové infekce (39). Všeobecně se má za to, že jen vakcíny obsahující S-typy LPS jsou účinné proti infekcím způsogeným gramnegativními patogeny (53) a že živá oslabená vakcína 33

34 Salmonell účinněji indukuje protektivní imunitu, zejména pokud je podaná perorálně (31,53). To se obvykle vysvětluje tím, že pouze živá vakcína je schopná indukovat jak buněčnou tak protilátkovou imunitní odpověď, včetně lokální produkce IgA. Mrtvé vakcíny přednostně stimulují protilátkovou imunitu, zejména když jsou podány parenterálně (31,53). Nicméně existují důkazy, že také R-typy bakterií jsou schopné indukovat protektivní imunitu vůči patogenním S-typům (52,77) Změny na buněčné úrovni Salmonelová infekce gastrointestinálního traktu má za následek zánět mukózy u sliznice. Makrofágy v oblasti lamina propria tvoří zhruba 2-6 hodin po podání infekční dávky TNF-α (10,76). IFN-γ, který zvyšuje odolnost epitelových buněk vůči invazi Salmonell (20), byl nalezen v oblasti lamina propria u selat infikovaných Salmonellou chemotypu Re, která neměla takovou schopnost proniknutí do organismu jako chemotyp Ra (154). Enterocyty selat infikovaných Salmonellou o chemotypu Ra produkují TGF-β (154), o kterém je známo, že negativně reguluje sekreci IFN-γ, IL-1 a TNF-α (71,133). Snižuje také škodlivé účinky LPS u enterobakteriálních infekcí, indukuje migraci makrofágů a stimuluje produkci IgA (161). Naproti tomu u selat infikovaných chemotypem Re produkce TGF-β zjištěna nebyla, navíc následné podání virulentního S typu těmto zvířatům mělo pro ně fatální následky. Klky v ileu zvířat infikovaných Ra chemotypem obsahovaly makrofágy, zatímco u zvířat infikovaných chemotypem Re se makrofágy v oblasti klků nevyskytovaly (154) Změny na cytokinové úrovni v plazmě a výplachu ilea V práci (143) byla zkoumána hladina zánětových cytokinů plazmy a ilea u GF selat, kterým byl perorálně podán buď virulentní kmen S-typu nebo nevirulentní kmen typu R. Hladina IFN-γ byla v plazmě i výplachu střev u obou skupin zvířat znatelně zvýšená. V plazmě po 24 hodinách od podání infekční dávky téměř chyběl TNF-α a IL- 18, zato hladina IFN-γ se zvýšila. Skutečnost, že v plazmě chyběl TNF-α lze vysvětlit jeho rychlým obratem, tak jak to bylo popsáno u prasat infikovaných E. coli (68). V ileu byla hladina IFN-γ, TNF-α a IL-1β indukována především virulentním kmenem, zatímco hladina IL-18 byla nejvíce zvýšena jako následek podání nevirulentní Salmonelly. Tato zvýšená hodnota TNF-α a IFN-γ byla způsobena lokální sekrecí a neměla souvislost s jejich hladinou v plazmě. Tak velké rozdíly v efektu virulentního a nevirulentního kmene na hladinu cytokinů v ileu se projevily pouze u TNF-α a IFN-γ (143). 34

35 V další práci (155) byl zkoumán vliv stejných typů Salmonell jako v předchozí, ovšem jako pokusná zvířata byla použita konvenční selata, která přijala kolostrum. Selatům byla podána buď dávka virulentního S typu, nebo nevirulentního R typu Salmonelly Typhimurium. Oba typy byly následně vykultivovány z mezenteriálních lymfatických uzlin, ovšem v krvi nalezeny nebyly. Cytokiny IL-1β, 8, 18, TNF-α a IFN-γ v plazmě kontrolní skupiny zvířat chyběly, u ostatních nebyly vůbec nebo pouze na nízké hladině. Ve střevech kontrolní skupiny se běžně vyskytovaly IL-1β, 8 a 18, zatímco TNF-α a IFN-γ chyběly. Hladina IFN-γ byla zvýšena ve střevech zvířat, kterým byl podán nevirulentní R typ Salmonelly. Selata z konvenčního chovu jsou mnohem více odolná vůči infekci než GF zvířata díky tomu, že přijala kolostrum obsahující imunoglobuliny a chrání je jejich střevní mikroflora (efektem kolonizační rezistence (160)), která navíc aktivuje jejich imunitní systém. Bylo prokázáno, že i krátký kontakt s probiotickými bakteriemi zvyšuje odolnost GF selat vůči virulentním salmonelám (90). Skutečnost, že vyšší hladina IFN-γ byla nalezena v plazmě a střevech konvenčně chovaných selat, infikovaných R typem Salmonelly je v souladu s poznatkem, že R typ je schopný vyvolat protektivní efekt vůči následní infekci virulentními S kmeny (39). 1.9 Použité metody analýzy Izolace RNA První fází je lýza buněk a tkání. Vznikne komplexní směs DNA, RNA, proteinů, lipidů, sacharidů, nízkomolekulárních látek a uhlovodíků, od které je nutné nějakým způsoben RNA oddělit (141). Klasickým postupem pro odstranění proteinů z homogenizátu je extrakce směsí fenolu a chloroformu (28,141). V současnosti je k dispozici řada komerčních kitů, které využívají princip adsorpční chromatografie. Dochází k interakcím různé povahy mezi makromolekulami vzorku a adsorpční membránou. Výsledkem je zachycení nukleových kyselin na membráně, ostatní molekuly membránou volně projdou a jsou odmyty. Následně použitím jiného pufru dojde k vymytí molekul nukleových kyselin z membrány (141). Pokud se podaří získat dostatečně čistou RNA, lze odhadnout její koncentraci spektrofotometrickým měřením absorbance roztoku při vlnové délce 260 nm (141). Čistotu získané RNA lze zjistit změřením poměru absorbancí při 260 a 280 nm (A 260 /A 280 ). Reverzní transkripce Reverzní transkripce slouží k převedení vyizolované RNA do cdna (complementary DNA). cdna už lze využít jako templátu pro PCR (polymerase chain reaction) (141). 35

36 K této reverzní transkripci slouží enzymy reverzní transkriptázy. Jejich schopnost syntetizovat cdna z templátu RNA je podmíněna jejch RNA dependentní DNA polymerázovou aktivitou. V další fázi, kdy je nutné odstranit RNA z vzniklého hybridu RNA-DNA přichází ke slovu jejich schopnost fungovat jako hybrid-dependentní RNasa H (7). Real-time PCR V této modifikaci PCR se používají speciální sondy, které se váží pouze na specifický produkt reakce (141). LNA sondy (locked nucleic acid) jsou typem sond, které využívají analogy nukleotidů s 2 -O, 4 -C metylenovým můstkem. Ten je v 3 endo konformaci a mění flexibilní ribofuranosový kruh na rigidní bicyklickou strukturu (viz obr. 15). Tato struktura zlepšuje hybridizační vlastnosti sondy a její biologickou stabilitu (8). Na rozdíl od systému TaqMan používající nukleotidové sondy jsou LNA sondy výrazně kratší (8 9 nukleotidů) (9). Obr. 15. metylenový můstek v LNA sondách (8) Na komerční úrovni se systémem LNA sond zabývá firma Roche Diagnostic (Manheim, SRN). Potřebný software pro výběr sond a návrh primerů je volně k použití na webových stránkách firmy Roche Pro vyhodnocení real-time PCR je stěžejní, kolik cyklů je nutných pro vytvoření statisticky významného detekovatelného množství produktu. Tato hodnota se označuje jako C T (threshold) a závisí na počátečním množství templátu (141). ELISA ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) patří mezi imunoenzymatické metody (41). Pro kvantitativní vyhodnocení je nutný standard o známém množství stanovované látky, který se postupně ředí. Stejným způsobem se zpracuje i vzorek. 36

37 Jednotlivá ředění standardu se vyhodnotí a zjistí se kalibrační závislost pro vyhodnocení obsahu stanovované látky ve vzorku. (81). Zatímco real-time PCR detekuje stupeň transkripce genů na úrovni mrna, ELISA poskytuje informaci o tvorbě konečných produktů genů, tzn. konkrétních cytokinů stanovovaných jako antigeny. 37

38 2. Cíl práce Hlavním cílem diplomové práce je posoudit vliv typu salmonelového LPS na indukci interferonu gama jako hlavního cytokinu majícího úlohu při obraně proti intracelulárním parazitům. Pro srovnání vlivu různého typu LPS byla vybrána Salmonella enterica serovar Typhimurium - laboratorní kmen LT2, který je virulentní pro bezmikrobní selata a jeho mutant rfal-. Hlavním stanovovaným cytokinem je IFN-γ a s ním související cytokiny IL-12 a IL-18. Cytokiny budou stanoveny na úrovni genového přepisu (reverzní transkripce a polymerázová řetězová reakce v reálném čase) a na úrovni proteinu (ELISA). Dále bude stanovena aktivace genu specifického receptoru pro lipopolysacharid TLR4. Studie bude provedena na modelu miniaturního gnotobiotického (mikrobiologicky definovaného) prasete. Dílčí cíle: seznámení se s metodou získávání a odchovu zvířat v mikrobiologicky definovaném prostředí a metodou mikrobiologické kontroly stanovení počtu kolonie tvořících jednotek salmonel (CFU) v plazmě a výplachu tenkého střeva u gnotobiotických selat infikovaných Salmonellou enterica serovar Typhimurium LT2 nebo jejím rfal- mutantem příprava a uchovávání vzorků pro další analýzu izolace RNA a její zevrubná charakterizace teoretické zvládnutí metodiky návrhu detekčních systémů s LNA sondami stanovení aktivace genové exprese vybraných reverzní transkripcí s následnou polymerázovou řetězovou reakcí v reálném čase (qrt-pcr) zhodnocení genové aktivace s ohledem na normalizaci k referenčnímu genu (β-aktin) kvantifikace cytokinů v plazmě a výplachu ilea gnotobiotických selat metodou ELISA vyhodnocení statistické významnosti rozdílů mezi pokusnými skupinami (konvenční selata, gnotobiotická selat infikovaná S.Typhimurium nebo jejím rfal- mutantem) shrnutí získaných poznatků a vyvození závěrů příprava diplomové práce 38

39 3. Materiál a metody 3.1 Gnotobiotická selata Gnotobiotická selata jsme získali hysterektomií březích miniaturních prasnic chovaných v laboratoři v Novém Hrádku ve 112. dni březosti. Měsíc před porodem byl prasnicím injekčně podán vitamin A a D k prevenci avitaminoz selat. Ve 105. dni březosti byl prasnicím podán medroxyprogesteron acetát (Depo-Promone, Pfizer manufacturing, Puurs, Belgium) k vyloučení nežádoucího spontánního porodu. Hysterektomie byla provedena v celkové halotanové anestezii. Získaná selata jsme chovali ve sklolaminátovém izolátoru s pozitivním tlakem a krmili sterilizovanou mléčnou dietou. Po narození byl selatům i. m. aplikován ferridextran. Selata byla ve stáří jednoho týdne orálně kolonizována bakteriemi v celkovém počtu 1x10 8 CFU na sele, podanými v 5 ml mléka. Po uplynutí 24 hodin od podání bakterií byla u selat provedena euthanázie. Selata byla v celkové halotanové anestézii vykrvena kardiální punkcí a odebrány potřebné vzorky. Během pokusu byla u selat dvakrát týdně pomocí výtěrů kontrolována případná kontaminace, i kontaminace izolátorů. Kontrola proběhla taktéž v okamžiku ukončení pokusu. Skupina konvenčních selat byla ve stáří jednoho týdne odebrána od prasnice, euthanázie proběhla stejně jako u selat gnotobiotických. Všechny projekty pokusů a experimentů se zvířaty byly schváleny Odbornou komisí Mikrobiologického ústavu AV v.v.i. a Rezortní komisí AV ČR. 3.2 Bakteriální kultura Bakteriální kmeny se dlouhodobě uchovávají v MBÚ v Novém Hrádku. 24 hodin před přípravou suspenze se kultivují na masopeptonovém živném agaru (Oxoid, Basingtone, UK). Ze vzniklých kolonií se připravila bakteriální suspenze v PBS. Koncentrace bakterií byla zjištěna spektrofotometricky při 600 nm z kalibrační křivky a později ověřena kultivací na mikrobiologických půdách. Pro pokus byl použit virulentní kmen Salmonelly Typhimurium LT2 a její rfalmutant. 39

40 3.2.1 rfal- mutant rfal- mutant byl odvozen od Salmonella enterica serovar Typhimurium, kmen LT2, provedením inaktivace genů rekombinací lineární DNA, která je na svých koncích homologní se sekvencí DNA, která má být z genomu bakterie odstraněna (33). Pomocí speciálních primerů a plazmidu pkd4 obsahujícího gen pro rezistenci na kanamycin byl do genomu bakterie vnesen gen pro rezistenci na antibiotikum. To umožnilo selekci bakterií na půdách obohacených tímto antibiotikem. Vzniklý lineární produkt, obsahující na svých koncích sekvence ohraničující cílový gen, byl přenesen elektroporací do kmene obsahujícího plazmid pkd46. Z genomu byl odstraněn gen s rezistencí na kanamycin pomocí termosenzitivního plazmidu pcp20. Příprava rfal- mutantu Salmonella enterica serovar Typhimurium byla provedena ve spolupráci s doc. Ivanem Rychlíkem a ing. Danielou Karasovou z Výzkumného ústavu veterinárního lékařství v Brně. 3.3 Odběr a uchování vzorků Během kardiální punkce byla odebrána krev s 10% přídavku citrátu sodného a srážlivá krev. Srážlivá krev byla určena k mikrobiologické kontrole, před jejím sražením byl proveden nátěr na mikrobiologickou plotnu. Selatům jsme odebrali část terminálního ilea a uložili do RNAlater (Qiagen, Hilden, SRN) a uschovali na -20 o C do dalšího zpracování. Zbytek ilea a část jejuna v celkové délce 40 cm jsme propláchli 2 ml DPBS (Dulbeccova modifikace PBS; PAA, Pasching, Rakousko). Po odebrání vzorku na stanovení CFU jsme přidali inhibitor proteáz (Roche Diagnostic, Mannheim). Střevní výplach jsme centrifugovali při 4000 otáčkách/min 20 minut při 8 o C a následně supernatant filtrovali přes 0,2 μm nitrocelulosový filtr. 3.4 Stanovení distribuce mikroorganismů v hostiteli Ke zjištění distribuce mikroorganismů je určena metoda záchytnosti v organismu. Do připravené řady zkumavek jsme napipetovali 1,8 ml fosfátového pufru o ph 7,0. Do první zkumavky jsme přenesli 0,2 ml výplachu střeva a po promíchání vždy novou pipetou přenesli do další zkumavky 0,2 ml ze zkumavky předchozí (desítkové ředění). Z každé zkumavky jsme přenesli 0,1 ml na půdu s MacConkey agarem (Merck, Darmstadt, SRN) (selektivní pro Enterobacteriaceae), rozetřeli, vysušili a inkubovali 24 hodin při 37 o C. 40

41 počet mikrobů v 1ml střevního výplachu = n x 10 x ředění n = počet spočítaných kolonií ředění = ředění, při kterém bylo možné spočítat vzniklé kolonie na agaru (maximální rozpoznatelný počet je 200 kolonií) Jako kontrola možné kontaminace gnotobiotických selat se provádí stěry z izolátorů a výtěry selatům, které se kultivují na aeroby, anaeroby a plísně 2x týdně. 3.5 Izolace RNA K izolaci RNA z odebraných vzorků byl použi kit Invisorb Spin Tissue RNA Mini Kit (Invitek, Berlín, SRN). 1. Vyjmuli jsme odpovídající kousek tkáně z RNAlater (zhruba 2 x 2 mm) 2. Provedli jsme manuální homogenizaci vzorku v 1,5 ml eppendorfce s celkovým množstvím 600 μl Lysis solution DCT před homogenizací přidáno pouze 300, po homogenizaci zbylých 300 μl. Roztok jsme promíchali překlápěním zavřené eppendorfky. 3. Vzniklý homogenát jsme zcentrifugovali 2 minuty při maximální rychlosti ( rpm). 4. Přemístili jsme vzniklý supernatant do 2,0 ml Receiver Tube a přidali 330 μl 99,8 % ethanolu a dobře promíchali pipetováním. 5. Celý objem jsme přenesli do RTA Spin Filter Set kolonky, 1 minutu inkubovali a 1 minutu centrifugovali při rpm. To, co během centrifugace prošlo kolonkou jsme vylili. 6. Přidali jsme 500 μl Wash Buffer R1 pufru do Spin Filter kolonky a centrifugovali 30 s při rpm. To, co prošlo kolonkou jsme vylili. 7. Přidali jsme 700 μl Wash Buffer R2 pufru do Spin Filter kolonky a centrifugovatli 30 s při rpm. To, co prošlo kolonkou jsme vylili. 8. Opakovali jsme předchozí krok. 9. Vzorek jsme centrifugovali 5 minut při rpm. Vyhodili jsme Receiver Tube. 10. Přenesli jsme Spin Filter do RNase free Elution Tube a přidali 60 μl Elution Buffer přímo na membránu Spin Filter. Inkubovali jsme 2 minuty a centrifugovali 1 minutu při rpm. 11. Vyhodili jsme Spin Filter a eluovanou RNA dali na led. 41

42 3.6 Stanovení koncentrace a čistoty celkové RNA 15 μl izolované RNA jsme dali do 300 mikrolitrů 10 mm Tris pufru o ph 7,5 a proměřili na spektrofotometru Ultrospec pro (Pharmacia, Upsala, Švédsko). Měření jsme provedli pří 260, 280 a 320 nm na spektrofotometru v kyvetě z křemenného skla o šířce 10 mm. Výpočet koncentrace celkové RNA jsme provedli podle vzorce: Koncentrace RNA = A 260 x 0,040 x 21 [μg/ml] 0,40 = faktor pro jednovláknovou RNA 21= ředící faktor Čistotu izolované RNA udává poměr absorbancí při 260 nm (absorbční maximum nukleových kyselin) a 280 nm (absorbční maximum bílkovin) tj. A 260 /A 280. Za uspokojující se považuje poměr absorbancí nad 1, Syntéza cdna K reverzní transkripci byl použit QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen) a byla provedena v termocykleru iq5 cycler (Bio-Rad, Hercules, USA). Centrifugace jsme prováděli na Mikro 200R, rotor 2424A (Hettich Zentrifugen). Použitá reverzní transkriptáza má velkou afinitu k RNA a je schopná syntetizovat cdna z pg RNA. Do tenkostěnné zkumavky jsme napipetovali následující reagencie: 2 µl gdna Wipeout Buffer, 2 µl PCR H 2 O, 10 µl RNA templátu. Obsah jsme jemně zamíchali a krátce zcentrifugovali. Inkubace proběhla v termocykleru 2 minuty při 42 C. Zkumavku jsme umístili na led a přidali jsme další reagencie: 1 µl Quantiscript RT, 4 µl Quantiscript RT Buffer, 1 µl RT Primer Mix. Směs jsme po promíchání a centrifugaci nechali inkubovat 20 minut při 42 C. Inaktivace reverzní transkriptázy proběhla při 95 C po dobu 3 minut. Následně jsme směs inkubovali 5 minut při 4 C. ke směsi jsme přidali 180 µl PCR H 2 O. Takto připravenou cdna jsme použili jako templát pro real-time PCR. 42

43 3.8 Real-time PCR Použité primery a sondy Použité primery byly syntetizovány jako 50 nm odsolené a dodány v lyofilizovaném stavu (Invitrogen, Carlsbad, USA). β - aktin LNA sonda 9 přístupové číslo: U07786 sekvence L-primeru: 5'-tccctggagaagagctacga-'3 sekvence R-primeru: 5'-aagagcgcctctggacac-'3 amplikon: 5'-tccctggagaagagctacgagctgcccgacgggcaggtcatcaccatcggcaacgagcgcttccgg tgtccagaggcgctctt-'3 délka amplikonu: 83 nukleotidů IFN-γ LNA sonda 21 přístupové číslo: NM_ sekvence L-primeru: 5'-tggaaagaggagagtgacaaaaa-'3 sekvence R-primeru: 5'-caaagaatttgaagtagaaggagaca-'3 amplikon: 5'- tggaaagaggagagtgacaaaaaaataattcagagccaaattgtctccttctacttcaaa ttctttgaaatcttcaaagataaccaggccattc-'3 délka amplikonu: 94 nukleotidů IL-12/23 p40 LNA sonda 77 přístupové číslo: NM_ sekvence L-primeru: 5'-ttcctgtgtccatgaaaacttc-'3 sekvence R-primeru: 5'-aggtaccagtggccctgaat-'3 amplikon: 5'-ttcctgtgtccatgaaaacttccttgcaggggtggtggtaattcagggccactggtacct-'3 délka amplikonu: 60 nukleotidů 43

44 IL-18 LNA sonda 85 přístupové číslo: NM_ sekvence L-primeru: 5'-actttactttgtagctgaaaacgatg-'3 sekvence R-primeru: 5'-ttaggttcaagcttgccaaag-'3 amplikon: 5' - actttactttgtagctgaaaacgatgaagacctggaatcggattactttggcaagcttga acctaaa-'3 délka amplikonu: 67 nukleotidů Kaspáza 1 LNA sonda 63 přístupové číslo: NM_ sekvence L-primeru: 5'-atggcctcttggatgaactatta-'3 sekvence R-primeru: 5'-gcgttttcacctcttactatctcc-'3 amplikon: 5'-atggcctcttggatgaactattagagaccagagtcctgaaccaggaggaggtggagatagtaagag gtgaaaacgc-'3 délka amplikonu: 76 nukleotidů TLR4 LNA sonda 33 přístupové číslo: UAB sekvence L-primeru: 5'-ccatggcctttctctcctg-'3 sekvence R-primeru: 5'-tcagctccatgcattggtaa-'3 amplikon: 5'-ccatggcctttctctcctgcctgagatctgagagctgggacccttgcgtgcaggtggttcctaacattagtt accaatgcatggagctga-'3 délka amplikonu: 90 nukleotidů NF-κB1 LNA sonda 85 přístupové číslo: DQ sekvence L-primeru: 5'-cctggtggagaactttgagc-'3 sekvence R-primeru: 5'-ttcatcctctccatcctcgt-'3 amplikon: 5'-cctggtggagaactttgagcctctgtatgacctggatgactcgtgggacgaggatggagaggatgaa- '3 délka amplikonu: 67 nukleotidů 44

45 Přidáním odpovídajícího množství vody pro PCR (Invitrogen) podle údajů výrobce o množství primeru jsme je rekonstituovali na 100 μm koncentraci a připravili tím zásobní 5x koncentrát primerů. K vlastní polymerázové reakci v reálném čase jsme použili master mix FastStart TaqMan Probe Master (Roche, Mannheim, SRN), vodu pro PCR, primery a odpovídající LNA sondy (Roche) podle následující tabulky: Reakční směs pro PCR Reagencie Objem [ml] Výsledná koncentrace FastStart Universal Probe Master 2x 10,0 1 Voda pro PCR 7,4 LNA sonda (25 μm) 0,2 250 nm Left primer (20 μm) 0,2 200 nm Right primer (20 μm) 0,2 200 nm cdna 2,0 Celkový objem reakční směsi 20,0 Reakční směs jsme rozpipetovali po 20 μl do 200 μl zkumavek 96 zkumavkové destičky, přelepili fólií, mírně zcentrifugovali, protřepali a opět mírně zcentrifugovali a dali do termocykleru iq5 pro real time PCR s iq5 Optical System Software, verze 1.0 (Bio Rad, Hercules, USA). Amplifikační reakce jsme provedli v následujícím teplotním režimu: C 10 min. (1 x) aktivace TaqDNA polymerázy C po 15 s a 60 C po 60 s (45 x) jednotlivé cykly 3. 4 C ( ) Vyhodnocení amplifikační reakce jsme provedli pomocí iq5 Optical Systém Software (Bio Rad) a GenEx Pro (Multid, Göteborg, Švédsko). 3.9 ELISA Metodou ELISA jsme stanovili hladinu prasečích cytokinů IL-18, podjednotky IL- 12/23 p40 a IFN-γ v plazmě a výplachu ilea. Pro stanovení IL-12/23 p40 byl použit Porcine IL-12/IL-23 p40 Quantikine ELISA Kit (R&D Systems, Minneapolis, USA), IFNγ byl stanoven setem Swine IFN-γ CytoSet TM (Invitrogen, Camarillo) a pro stanovení IL-18 byly použity protilátky připravené k tomuto účelu Munetou et al (102). 45

46 Cytokin Vazebná protilátka Detekční protilátka Standard IL-12/23 p40 Mouse anti-porcine IL-12/23 p40 IL-18 Monoclonal antiporcine IL-18 IFN-γ Mouse anti-swine IFN-γ Biotinylovaná Mouse Rekombinantní anti-porcine IL-12/23 porcine IL-12 p70 p40 Biotinylovaná antiporcine Rekombinantní Sw IL-18 (typ 5C5) IL-18? Biotinylovaná mouse Rekombinantní anti-swine IFN-γ swine IFN-γ Pracovní roztoky: ředící roztok (DS) -0,1 M Tris-HCl ph 7,2-7,4; 0,15 M NaCl; odstředěné mléko; 0,05% Tween 20 (Sigma-Aldrich) promývací roztok (WS) - 0,05 M Tris-HCl;0,15 M NaCl, 0,05% Tween 20 roztoky protilátek byly připraveny dle firemních pokynů Stanovení všech cytokinů jsme provedli v 96 jamkových destičkách Maxisorp (NUNC, katalogové číslo ) a pro všechna stanovení (kromě IL12/23 p40) byl použit stejný obecný postup: 1) Do jamek destičky jsme nanesli 100 μl vazebné protilátky a inkubovali 36 hodin při 4 o C. Po inkubaci následovalo 4x promytí WS. 2) Do promyté destičky jsme nanesli 100 μl standardu nebo vzorku ředěného v DS a inkubovali 18 hodin při 4 o C, následovalo čtyřnásobné promytí WS 3) Do promytých destiček jsme nanesli 100 μl detekční (biotinylované) protilátky ředěné v DS a inkubovali 1 hodinu při pokojové teplotě, následně 4x promyli WS 4) Následovalo nanesení 100 μl streptavidinu/hrp (Invitrogen) ředěného 1/5000 v DS, inkubace 45 minut při pokojové teplotě a 4x promytí WS 5) Po vytvoření protilátkového sendviče během předchozích kroků bylo naneseno 100 μl TMB substrátu, systém se inkuboval v temnu při pokojové teplotě minut. 6) Reakci jsme zastavili přidáním 100 μl 2M H 2 SO 4 46

47 7) Změřili jsme absorbanci při 450 a 620 nm. S kitem pro stanovení prasečího IL-12/23 p40 jsme pracovali podle pokynů výrobce: 1) Přidali jsme 50 μl Assay Diluent RD1W do každé jamky. 2) Přidali jsme 100 μl standardu, kontroly nebo vzorku na jamku a inkubovali 2 hodiny při pokojové teplotě na horizontálním orbitální míchačce (3 mm) při 500 rpm. 3) Promyli jsme 5 x 400 ml promývacího roztoku. 4) Přidali jsme 200 μl konjugátu a míchali 2 hodiny na třepačce. 5) Následovalo 5x promytí promývacím roztokem. 6) Přidali jsme 120 μl substrátového roztoku a inkubovali 30 min. při pokojové teplotě a ve tmě 7) Přidali jsme 120 μl zastavovacího roztoku 8) Měřili jsme při 450 a 620 nm. Pro změření absorbance ELISA destičky byl použit ELISA reader Labsystems Multiskan RC (Labsystems, Helsinki, Finsko) Statistické a grafické vyhodnocení výsledků Pro porovnání rozdílů mezi dvěma skupinami jsme použili Studentův t-test. V případě více pokusných skupin jsme Dunettovým testem srovnávali jednotlivé skupiny s bezmikrobními selaty jako kontrolní skupinou. K vyhodnocení statistických rozdílů mezi skupinami jsme použili InStat, verze 3.10 (GraphPad Software, San Diego, USA). Ke grafickému znázornění výsledků jsme použili GraphPad Prism, verze 5.0 (GraphPad Software, San Diego, USA). Do grafu byly vyneseny průměrné hodnoty a SEM (standard error of the mean). U vyjádření exprese cytokinů na úrovni mrna je nutné nejprve C T jednotlivých skupin selat normalizovat k referenčnímu genu a relativizovat k průměru pomocí Genex (Multid, Göteborg, Švédsko) Tvorba citací K vytvoření citací jsme použili software Reference Manager firmy Thomson Reuters, který je určen k usnadnění práce s bibliografickými záznamy. Umožňuje vytvoření vlastní bibliografické databáze a doplňování, řazení a úpravu záznamů. 47

48 Software nabízí několik předdefinovaných stylů k formátování jednotlivých citací v textu i seznamu literárních zdrojů. Zdrojovou literaturu jsme vyhledávali v databázi Pubmed a z ní jsme si pomocí softwaru sestavili vlastní databázi. Zařazení zejména českých prací, které nebyly v databázi Pubmed, jsme provedli manuálně. Formátování vložených citací v textu i v seznamu použité literatury bylo provedeno podle stylu časopisu Infection and Immunity. 48

49 4. Výsledky 4.1 izolace RNA Vzorek Syntéza cdna Izolace celkové RNA H 2 O 0,5 mg RNA Konc. Poměry Absorbance Ředění v 0,1 [ml] [ml] [mg/ml] A 260 /A 280 A 260 /A 230 A 230 A 260 A 280 mm Tris 1 GF 8,9 1,1 0,467 2,08 2,22 0,251 0,556 0, GF 6,7 3,3 0,152 2,13 1,76 0,103 0,181 0, GF 7,6 2,4 0,210 2,07 1,89 0,132 0,250 0, GF 8,9 1,1 0,467 2,08 2,22 0,251 0,556 0, CV 8,4 1,6 0,312 2,05 0,76 0,638 0,487 0, CV 5,2 4,8 0,105 2,08 1,05 0,156 0,164 0, CV 8,9 1,1 0,444 2,09 2,21 0,239 0,528 0, CV 5,0 5,0 0,100 2,02 0,37 0,322 0,119 0, LT2 4,2 5,8 0,087 2,15 0,20 0,514 0,103 0, LT2 7,1 2,9 0,172 2,01 1,65 0,124 0,205 0, LT2 6,6 3,4 0,147 1,94 2,13 0,082 0,175 0, LT2 8,2 1,8 0,283 2,07 2,05 0,164 0,337 0, rfal- 5,9 4,1 0,122 1,99 2,23 0,065 0,145 0, rfal- 6,4 3,6 0,139 1,99 0,53 0,313 0,165 0, rfal- 7,2 2,8 0,180 2,04 1,77 0,121 0,214 0, rfal- 5,7 4,3 0,115 2,01 1,83 0,075 0,137 0, Tab 1. Koncentrace vyizolované celkové RNA v jednotlivých vzorcích a množství této RNA, které obsahuje 0,5 mg RNA. Toto množství je použito pro následnou syntézu cdna. 49

50 4.2 Exprese mrna Hodnoty C T pro jednotlivé vzorky u bezmikrobních (GF) a konvenčních (CV) selat, selat asociovaných virulentním LT2 kmenem Salmonelly Typhimurium a mutantním kmenem rfal-. Jako referenční gen byl použit β-aktin. Hodnoty C T Sele BACT-9 IFNG-21 IL12/23p40-77 IL18-85 CASP1-63 TLR4-33 NFkB-85 1 GF 21,54 42,48 34,96 27,81 27,03 31,36 28,14 2 GF 19,93 41,23 36,40 28,13 26,70 31,61 27,13 3 GF 20,56 37,25 33,46 27,50 25,84 30,72 27,56 4 GF 22,04 40,11 34,91 28,08 27,26 31,79 28,62 1 LT2 20,68 31,04 33,02 27,06 26,64 28,72 26,98 2 LT2 22,10 30,29 30,15 27,02 27,16 29,01 27,50 3 LT2 21,57 32,38 30,77 28,06 27,07 29,92 27,42 4 LT2 20,74 29,98 30,60 27,97 25,94 28,81 26,40 1 rfal- 22,56 36,38 32,06 28,97 27,16 31,06 27,65 2 rfal- 21,29 33,20 34,79 29,83 26,45 30,64 27,81 3 rfal- 21,39 30,80 32,73 28,11 26,82 29,88 27,18 4 rfal- 21,64 35,15 32,65 28,75 27,61 30,42 27,39 1 CV 19,33 39,96 33,17 26,44 26,29 30,71 26,29 2 CV 21,77 38,95 30,10 26,56 25,57 31,26 27,61 3 CV 21,08 39,42 33,66 27,13 26,65 30,61 27,08 4 CV 21,27 38,20 32,64 27,50 26,59 30,45 27,07 Tab. 2 Hodnoty C T pro jednotlivé vzorky Hodnoty exprese z tabulky 2 je nutné normalizovat k určitému referenčnímu genu, v našem případě β-aktinu. Následovala relativizace hodnot k průměru. 50

51 Hodnoty C T normalizované k -aktinu a relativizované k průměrné hodnotě Sele IFNG-21 IL12/23p40-77 IL18-85 CASP1-63 TLR4-33 NFkB-85 1 GF 0,015 0,296 1,248 0,976 0,659 0,730 2 GF 0,011 0,036 0,327 0,402 0,181 0,482 3 GF 0,276 0,424 0,784 1,129 0,520 0,553 4 GF 0,106 0,433 1,463 1,177 0,691 0,740 1 LT2 22,210 0,625 1,156 0,705 2,262 0,899 2 LT2 99,949 12,221 3,181 1,316 4,950 1,677 3 LT2 16,259 5,507 1,071 0,970 1,824 1,228 4 LT2 48,272 3,485 0,641 1,194 2,215 1,401 1 rfal- 2,018 4,473 1,132 1,810 1,644 2,080 2 rfal- 7,585 0,280 0,259 1,227 0,912 0,772 3 rfal- 42,907 1,249 0,913 1,018 1,656 1,280 4 rfal- 2,502 1,571 0,697 0,700 1,354 1,316 1 CV 0,018 0,221 0,697 0,352 0,223 0,569 2 CV 0,197 10,065 3,481 3,151 0,828 1,236 3 CV 0,088 0,529 1,453 0,924 0,805 1,107 4 CV 0,234 1,224 1,283 1,099 1,026 1,271 Tab. 3. Hodnoty C T normalizované k β-aktinu a relativizované k průměrné hodnotě 51

52 4.3 Počet bakterií v krvi a střevě Obr. 16. Počet bakterií v krvi a střevě (CFU) V krvi bylo nalezeno statisticky statisticky velmi významně zvýšené množství (p<0,01) bakterií u skupiny selat infikovaných kmenem LT2 oproti skupině selat infikovaných kmenem rfal-. Ve výplachu tenkého střeva se oproti hodnotám v krvi nacházelo celkově více bakterií, opět bylo statisticky velmi významně zvýšené množství (p<0,01) bakterií kmene LT2 oproti skupině selat infikovaných kmenem rfal-. 52

53 4.4 Aktivace genového přepisu na úrovni mrna Obr. 17. Aktivace genového přepisu IFNγ ve střevě Exprese IFNγ u skupiny selat infikovaných kmenem Salmonelly LT2 je v porovnání s kontrolní skupinou bezmikrobních (GF) selat statisticky průkazná (p<0,05). Exprese IFNγ u skupiny selat infikovaných mutantním kmenem rfal- je v porovnání s kmenem LT2 nižší. Exprese IFNγ u skupiny kontrolních (GF) a konvenčních (CV) selat byla v podstatě na nulové úrovni. 53

54 Obr. 18. Aktivace genového přepisu IL-12/23 p40 ve střevě Exprese IL12/23 p40 byla nejvyšší u skupiny selat infikovaných kmenem Salmonelly LT2. Nižší exprese proběhla u skupiny selat infikovaných kmenem rfal-, exprese u kontrolní skupiny (GF) selat byla v podstatě na nulové úrovni. Rozdíly mezi hladinami u jednotlivých skupin byly bez statistické významnosti. 54

55 Obr. 19. Aktivace genového přepisu IL-18 ve střevě Rozdíly mezi skupinami selat v expresi IL-18 opět bez statistické významnosti. Exprese IL-18 u skupiny selat infikovaných mateřským kmenem LT2 byla vyšší než u kontrolní skupiny bezmikrobních selat (GF), exprese u skupiny selat infikovaných mutantním kmenem rfal- byla ovšem v porovnání se skupinou GF selat o něco nižší. Exprese u konvenčních selat (CV) převyšovala dokonce skupinu selat infikovaných LT2 kmenem. 55

56 Obr. 20. Aktivace genového přepisu kaspázy 1 ve střevě Rozdíly v expresi kaspázy 1 mezi jednotlivými skupinami selat nejsou statisticky významné, u skupiny konvenčních selat (CV) byla exprese dokonce vyšší než u skupiny selat infikovaných jak mateřským virulentním LT2 kmenem Salmonelly, tak mutantním kmenem rfal-. Exprese u skupiny kontrolních bezmikrobních selat (GF) byla téměř na stejné úrovni jako selat infikovaných kmenem LT2. 56

57 Obr. 21. Aktivace genového přepisu TLR4 ve střevě K výraznemu zvýšeni exprese TLR4 došlo u selat infikovaných Salmonellou. Zatimco u skupiny selat infikovaných mateřským kmenem (LT2) bylo zvýšeni statisticky vysoce průkazné (p<0,01), u mutantni Salmonelly (rfal-) bylo toto zvýšeni neprůkazné. U skupiny konvenčních selat (CV) zůstaly hodnoty exprese TLR4 srovnatelné s kontrolni skupinou (GF). 57

58 Obr. 22. Aktivace genového přepisu NF-κB ve střevě Aktivace genového přepisu NF-κB proběhla na nejvyšší úrovni u skupiny selat infikovaných kmenem Salmonelly rfal-. Toto zvýšené genové exprese bylo statisticky významné (p<0,05) v porovnání s kontrolní (GF) skupinou selat. Hladina exprese u skupiny infikované kmenem LT2 byla na podobné úrovni, ovšem už bez prokázané statistické významnosti. Mezi nejnižší hladinou exprese u kontrolní skupiny selat (GF) a nejvyššími hodnotami u skupin selat infikovaných Salmonellovými druhy proběhla exprese NF-κB konvenčních (CV) selat. 58

59 4.5 Hodnoty cytokinů na úrovni antigenu (ELISA) Obr. 23. Hladina IFN-γ v plazmě Statisticky vysoce průkazné bylo zvýšení hodnot IFN-γ v plasmě u skupiny selat infikovaných kmenem LT2, v porovnání s kontrolní skupinou (GF) selat. U selat infikovaných kmenem rfal- byla hladina o poznání nižší. U skupiny konvenčních (CV) selat byla hladina v podstatě na nulové hladině, srovnatelné se skupinou kontrolních selat (GF). 59

60 Obr. 24. Hladina IFN-γ ve střevě Nejvyšší hodnoty IFN-γ ve střevě vykazovala skupina selat infikovaná kmenem LT2. Skupina infikovaná kmenem rfal- vykazovala hodnoty nižší. Skupina konvenčních (CV) i kontrolních (GF) selat byla shodně na nulové úrovni. 60

61 Obr. 25. Hladina IL12/23 p40 v plazmě Na úrovni antigenu byl stanoven IL12/23 p40 v plasmě. Jeho hladina byla staticky velmi významně zvýšena (p<0,01) u skupiny selat infikovaných kmenem Salmonelly LT2. Nejnižší skupina byla nalezena u kontrolní skupiny bezmikrobních (GF) selat, v podstatě shodně se skupinou konvenčních (CV) selat. Hladina IL12/23 p40 u skupiny selat infikovaných kmenem rfal- byla nižší než u kmene LT2. 61

62 Obr. 26. Hladina IL12/23 p40 ve výplachu ilea Hladina IL12/23 p40 ve výplachu střeva byla u kontrolní skupiny bezmikrobních (GF) a konvenčních (CV) selat v podstatě na nulové úrovni, stejně tak i u selat infikovaných kmenem rfal-. Naproti tomu hladina u selat asociovaných kmenem LT2 byla ve srovnání s kontrolní skupinou bezmikrobních (GF) selat statisticky velmi významně zvýšená (p<0,01). 62

63 Obr. 27. Hladina IL-18 v plasmě Hladina IL-18 v plazmě byla u všech skupin selat bez statistického významu. Nejvyšší hladina se projevila u konvenčních (CV) selat. U ostatních skupin selat, jak infikovaných kmenem Salmonelly LT2, tak rfal- byla v podstatě na úrovni kontrolní skupiny (GF). 63

64 Obr. 28. Hladina IL-18 ve výplachu střeva Rozdíly v hladině IL-18 ve výplachu střeva nebyly statisticky významné. Nejvyšší hodnoty se objevily u skupiny selat infikovaných kmenem LT2, o něco nižší hodnoty vykazovaly skupiny konvenčních (CV) selat a selat infikovaných kmenem rfal-. Nejnižší hodnoty se objevily u kontrolní skupiny (GF) selat. 64

65 5. Diskuze Lipopolysacharid (LPS) je hlavní složkou vnější membrány gramnegativních bakterií. Pro svou toxicitu a imunomodulační vlastnosti je objektem zájmu medicíny. Strukturální rozdíly v LPS různých rodů nebo druhů bakterií odpovídají za různou biologickou aktivitu lipopolysacharidu, který je rozeznáván buňkami vrozeného imunitního systému (25,81). Zajímavé je, že zatímco u infikovaného jedince mohou malá množství LPS působit protektivně stimulací imunitního systému (24), velké množství vyvolá vysokou horečku, zrychlení srdeční frekvence a nakonec septický šok a následně smrt způsobenou selháním ledvin a plic, systémovou zánětlivou odpovědí a intravaskulární koagulací (35,139). Potřeba malého množství LPS pro buněčné stimulace je známa např. z práce s buněčnými kulturami, kdy použití fetálního bovinního séra jako doplňku kultivačního média s deklarovanou ultra low hladinou endotoxinu vede ke špatnému růstu buněčné kultury. IFN-γ je interferon označovaný jako interferon II. typu. Jeho tvorba je řízena IL-12 a IL-18 sekretovanými antigen prezentujícími buňkami (APC). IFN-γ indukuje procesy vedoucí ke zpracování a prezentaci antigenu, ovlivňuje růst, zrání a diferenciaci různých buněčných typů (17), zvyšuje aktivitu NK buněk (23) a reguluje produkci imunoglobulinů B lymfocyty a jejich izotypový přesmyk (17,43). V antiinfekční imunitě je významný především při infekci intracelulárními patogeny kdy aktivuje makrofágy - zvyšuje fagocytózu zprostředkovanou komplementem, indukuje respirační vzplanutí a produkci lysozomálních enzymů (34). Obdobné mikrobicidní procesy IFN-γ vyvolává také u neutrofilů (17). Významná složka působení antimikrobiálního působení IFN- γ je stimulace exprese molekul MHC II. třídy (u člověka označováno HLA, u prasete SLA) na antigen prezentujících buňkách (APC) pro rozpoznávání pomocnými T lymfocyty (81,137). IFN-γ je hlavním produktem TH1 buněk a podporuje imunitní mechanismy zprostředkované buňkami jako je aktivace NK buněk, specifická cytotoxická imunita zprostředkovaná interakcemi T lymfocytů s APC a aktivace makrofágů (17). Aktivace makrofágů vede např. k produkci reaktivních kyslíkových (ROI - Reactive Oxygen Intermediates) a dusíkatých (RNI - Reactive Nitrogen Intermediates) mediátorů, kdy v případě intracelulárních patogenů jsou významné především RNI mezi něž patří i NO (137). Tvorba NO makrofágy může být spuštěna přímo LPS aktivací NF-κB, nebo jako odpověď na stimulaci IFN-γ. IFN-γ dále podporuje transkripci receptoru TLR4, jeho následnou expresi na povrchu makrofágů a schopnost vázat LPS (19,98). 65

66 Pro vznik funkčního IFN-γ je nutná exprese IL-12 a 18 jako základních cytokinů majících vliv na indukci jeho tvorby a jejich synergické působení. Při indukci tvorby obou těchto cytokinů hraje důležitou roli transkripční faktor NF-κB, který kontroluje indukci prozánětových cytokinů a chemokinů, stejně jako regulaci kostimulačních molekul na dendritických buňkách. Rozdíly různých typů LPS mající za následek aktivaci NF-κB a expresi IL-12 a IL-18 se projevují již při kontaktu LPS s TLR4, tedy na začátku stimulační dráhy. IL-12 je indukovatelný heterodimerní cytokin složený z 35- a 40-kDa podjednotky (p35 a p40) spojenými disulfidickou vazbou a kódované samostatnými geny (57). Exprese p40 podjednotky je možná pouze makrofágy a B lymfocyty a je silně indukována bakteriálními podněty (32). Bylo zjištěno, že podjednotka p40 IL-12 je současně také podjednotkou IL-23. To je důvod označování této podjednotky v posledních letech jako IL-12/23 p40. IL-18 byl poprvé popsán v roce 1989 jako IGIF (IFN-γ inducing factor) (108). Pro svou strukturální podobnost se řadí do rodiny IL-1 (13,36), kam poměrně nedávno přibyl také IL-33 (175). Biologicky aktivní forma těchto cytokinů vzniká až enzymatickým štěpením prekurzoru ICE (IL-1β-converting enzyme, nazývaným kaspáza-1) (4,36) (54,56), patřícím do rodiny intracelulárních cysteinových proteas (4). Zatímco IL-12 řídí diferenciaci směrem k TH1 vyzrávání přímo, IL-18 působí spíše jako kofaktor tohoto děje (131). Toll-like receptory patří do skupiny receptorů, které jsou charakterizovány na leucin bohatou extracelulární částí (LRR leucine-rich repeats), jednoduchou transmembránovou oblastí a intracelulární doménou. Jednotlivé TLR se liší ve své extracelulární části a váží odlišné PAMP molekuly, avšak mají shodnou intracelulární část. Receptory TLR po interakci s ligandy polymerizují a interagují s adaptorovými proteiny, což má za konečný následek aktivaci aktivaci transkripčního faktoru NF-κB a indukci zánětových mediátorů, včetne cytokinů a chemokinů (74,81). Za hlavní receptor zodpovědný za rozpoznávání LPS je považován TLR4. To je také důvod, proč jsme aktivaci genového přepisu tohoto receptoru a transkripčního faktoru NFkB spolu se stanovením IFN-, IL-12/23 p40 a IL-18 zařadili do svých sledování. Salmonella enterica je intracelulární gram-negativní pathogen infikující člověka nebo zvířata potravní cestou. Při perorálním infekci proniká Salmonella do organismu epitelem terminálního ilea a Peyerovými plaky. Předpokládá se, že hlavním místem vstupu bakterií do Peyerových plaků jsou M-buňky, které se účastní přenosu antigenů ze střevního lumen do lamina propria (69,112). Z Peyerových plaků přechází Salmonella do mezenteriálních lymfatických uzlin a odtud do cirkulace. Ve slezině a játrech dojde ke kontaktu s makrofágy, resp. Kupfferovými buňkami (99) (viz obr 13). U 66

67 některých druhů, jako např. u prasat, sehrávají významnou úlohu plíce jako orgán vychytávání a eliminace bakterií (plicní intravaskulární makrofágy) (100,166). Během počátečních fází infekce hrají hlavní roli fagocyty a to jak makrofágy tak neutrofily. V počátečních stádiích infekce intracelulárními parazity je nezbytná aktivace makrofágů cytokiny IFN-γ a TNF-α, které vedou k indukci baktericidních mechanismů makrofágů (110). LPS, jako součást buněčné stěny Salmonelly, je schopný indukovat masivní zánětlivou odpověď tkáně, která vede k produkci zánětových cytokinů IL-1, IL-6, IL -12, IL-18 a TNF-α různými buněčnými liniemi, především ale makrofágy (70,94). IFN- je NK buňkami, makrofágy a B lymfocyty již v průběhu iniciační fáze obranné reakce organismu (101,136,171). Tyto mechanismy vedou pravděpodobně pouze k zmírnění následků invaze patogenních mikroorganizmů do makroorganizmu. Vytváří se tak čas pro indukci mechanismů specifické imunity, které jsou nezbytné k eliminaci infekčního agens (58,110). IFN-γ je proto v iniciační fázi ústřední cytokin koordinující mechanismy nespecifické imunity, v pozdějších fázích jeho význam ustupuje, jak bylo prokázáné v pokusech s neutralizací IFN- v různých obdobích po vzniku infekce (104,126). Hlavním cílem předložené diplomové práce bylo posoudit vliv změny chemotypu lipopolysacharidu intracelulárního bakteriálního patogena na produkci INF- jako ústředního cytokinu nespecifické složky imunitní odpovědi. Studie takového typu mohou mít praktický dopad při konstrukci atenuovaných mikroorganismů, které mohou být použity v medicínské praxi jako živé vakcíny (114). Studii jsme provedli na modelu gnotobiotického selete se kterým máme dlouholeté zkušenosti (38,39,143,144,154). Gnotobiotická zvířata, tedy sterilně získávaná zvířata chovaná v mikrobiologicky definovaných podmínkách, nám umožňují lépe posoudit vliv interakcí mikroorganismus versus hostitel než konvenčně chovaná zvířata, kde jsou projevy některých mikroorganismů skryty v pozadí nedefinované mikroflóry, která svou hojností zhruba desetinásobně převažuje počet vlastních buněk organismu. Použití gnotobiontů je občas kritizováno s hlavní námitkou, že se jedná o nepřirozené organismy, které se v přírodě normálně nevyskytují. Gnotobiotické organismy je přitom možné chápat jako přechod mezi konvenčními organismy a zjednodušenými systémy in vitro, které jsou v imunologických studiích hojně využívány a které často studovanou problematiku modelují na jedné buněčné linii (viz např. nejvýše hodnocené časopisy experimentální imunologie Immunity a Journal of Experimental Medicine). Experimentální model miniaturního prasete má v gnotobiologii přednost oproti běžně chovaným laboratorním hlodavcům v tom, že díky epiteliochoriálnímu typu placenty nedochází k přenosu imunoglobulinů od matky na plod jako je tomu u většiny tříd imunoglobulinů u člověka (146). Sele přijímá imunoglobuliny, které jsou nezbytné 67

68 pro přežítí v konvenčních podmínkách, až po porodu s napitím se kolostra (152). V případě modelování lidské enteritidy způsobené S. Typhimurium má prase ve srovnání s často používanou myší další přednost, protože zatímco u prasete S. Typhimurium způsobuje onemocnění podobné enteritidě u člověka, stejný serovar způsobuje u myši onemocnění srovnatelné s břišním tyfem způsobené S. Typhi a tato skutečnost je již obsažena ve vlastním názvu tohoto serovaru (62). Odchov ve sterilních podmínkách umožňuje přežití selete i bez příjmu kolostra. Kmen LT2, který je běžně označovaný jako laboratorní kmen jsme zvolili pro experimenty z důvodu jeho odpovídající virulentnosti pro bezmikrobní sele. Bezmikrobní selata jsme zvolili jako kontrolní skupinu vůči níž jsme srovnávali ostatní skupiny jako skupiny s mikroorganismy předpokládaně iniciovanými mechanismy nespecifické imunity. Do studie jsme také zařadili skupinu konvenčních selat, abychom mohli posoudit přirozené pozadí organizmu s běžnou nedefinovanou mikroflórou. Pro zjednodušení jsme skupiny s mikroorganizmy nesrovnávali mezi sebou, protože by to jednak snížilo přehlednost prezentovaných výsledků a jednak to nebylo cílem naší studie. Vliv salmonelového LPS na genový přepis a sekreci IFN-γ a s ním souvisejícího receptoru, transkripčního faktoru a cytokinů jsme stanovovali na dvou úrovních: na úrovni mrna a na úrovni proteinu. Jako zástupce Salmonell jsme vybrali virulentní kmen LT2 a jeho mutant rfal-, který má kratší O-řetězec a měl by tedy mít sníženou virulentnost. Prvním krokem pro stanovení aktivace genové exprese na úrovni mrna byla izolace celkové RNA. Jedná se o důležitý krok, který rozhoduje o výsledku celého stanovení. Vzhledem k velkému množství různých RNáz, které mohou RNA degradovat bylo nutné pracovat s velkou opatrností. Důležitou okolností je také skutečnost, že z celkového množství RNA tvoří mrna pouze minimální podíl (2-5%). Proto je nutné RNA izolovat co nejpečlivěji, abychom z tohoto minimálního množství získali co nejvíce a co nejméně degradovanou. Po homogenizaci vzorku vznikne komplexní směs DNA, RNA, proteinů, lipidů, sacharidů, nízkomolekulárních látek a uhlovodíků. K izolaci celkové RNA z této směsi jsme zvolili kolonkovou metodu. Použili jsme set Invisorb Spin Tissue RNA Mini Kit (Invitek GmbH, Berlin), který obsahuje podle firemních informací pufr, schopný účinně podpořit lýzu buněk a inaktivovat endogenní Rnasy (např. denaturace guanidinthiokyanátem a rozštěpení disulfidických můstku RNáz dithiothreitolem). Kontaminaci genomovou DNA je zabráněno její vazbou na speciální částice, kdy se na částice navázaná DNA odstraní centrifugací. Součástí setu je také speciální RTA Spin Filter, na kterém dochází k zadržení RNA. Za pomoci centrifugace nebo mírného podtlaku jsou ostatní látky z filtru vymyty pufrem. Po následné aplikaci speciálního elučního pufru dojde k vymytí RNA z filtru (6). 68

69 Protože RNA nelze použít jako templát pro PCR, bylo ji nutné nejprve převést do cdna a teprve potom provést klasickou PCR. Firma Qiagen používá svoji vlastní reverzní transkriptázu-quantiscript Reverse Transcriptase (7). Při zahájení reverzní transkripce lze jako jeden z primerů použít oligo (dt)-primer, který rozpoznává poly(a) konec mrna nebo náhodné hexanukleotidy. Lze použít také specifické primery, které umožní rozpoznat produkty RT-PCR a produkty vzniklé v pozdější fázi standardní PCR z genomové DNA (ta může kontaminovat RNA použitou pro RT-PCR). Využívá se té skutečnosti, že zatímco genomová DNA obsahuje introny i exony, mrna už po sestřihu obsahuje pouze exony (111). Pokud jsou primery navrženy tak, aby se připojovaly k sekvencím exonů po stranách určitého intronu, amplifikační produkt z genomové DNA bude třeba 10x větší než produkt vzniklý z mrna. Při případné kontrole produktů elektroforézou bude tedy tento produkt PCR snadno odlišitelný (141). Protože u prasete, na rozdíl od lidí, není většinou známá poloha exonů a intronů, nelze využít tento způsob navrhování primerů. O to více je tedy nutné velice pečlivě izolovat RNA tak, aby příměs genomové DNA byla co nejnižší. Je velmi obtížné získat kvantitativní údaje o míře probíhající genové transkripce. Problém je v tom, že neexistuje jednoduchý a spolehlivý vztah mezi množstvím použitého templátu a množstvím vytvořeného produktu, pokud ovšem PCR neprobíhá opravdu exponenciálně. Exponenciální průběh je narušen například pokud se nedostává některé z reagencií. Proto se ke zjištění genové exprese používá modifikace real-time PCR (141). Při real-time PCR se nedetekuje konečný produkt, ale nárust fluorescence po každém cyku s důrazem na dosažení určité úrovně fluorescence. Platí tedy, že čím více bylo do reakce vloženo templátu (cdna získaná reverzní transkripcí z mrna), tím menší počet cyklů je nutný k dosažení této fluorescenční hladiny. K umožnění fluorescence vznikajícího produktu jsme použili LNA sondy, navržené spolu s primery pomocí volně přístupného softwaru firmy Roche Tyto LNA sondy jsou používány na pracovišti MBÚ v Novém Hrádku od roku 2005 (142). Jejich použití pro detekci prasečích transkriptů bylo poprvé publikováno v roce 2009 pro detekci transkriptu u prasečích epiteliálních buněčných linií IPEC-J2 a IPI-2I (91). Pro to, aby bylo možné srovnávat úroveň transkripce různých genů, tedy hladinu mrna, je nutné zajistit její stejné množství. Vztáhnutí na hladinu celkové RNA není spolehlivé, protože hladina rrna v buňce může velmi kolísat a tím i různou měrou ovlivnit hladinu celkové RNA. Pro standardizaci se tedy používá paralelní RT-PCR pro amplifikaci referenčního (pomocného) genu o kterém je známo, že se exprimuje za daných podmínek co možná konstitutivně (tzv. house-keepingový gen) (141). V našem případě jsme jako referenční gen zvolili β-aktin. Hodnoty získané z real-time PCR je 69

70 nutné normalizovat k referenčnímu genu a poté vhodné relativizovat např. k průměrné hodnotě přepisu tohoto genu. Ke stanovení na úrovni proteinu jsme použili metodu ELISA. Provedli jsme ji s komerčně dostupnými protilátkami (IFN-γ), kitem (IL-12/23 p40) nebo protilátkami a rekombinantním cytokinem od Dr. Munety z National Institute of Animal Health v Tsukubě v Japonsku (IL-18), podle jednotného obecného postupu, zavedeného na pracovišti. Jako vzorky jsme odebrali krev, výplach tenkého střeva a kousek tkáně z ilea. Ileum bylo zvoleno proto, že při orálním způsobu asociace zvířat je právě střevo místem, odkud Salmonelly přechází do cirkulace a kde dochází k prvnímu kontaktu s imunitním systémem (81). Stanovení v kvi má význam pro poznání schopnosti Salmonell přestoupit do systémové cirkulace a je také místem, kde lze stanovit aktivaci cytokinů na úrovni proteinu. Za 24 hodin po perorální infekci GF selat dosahovala mateřská Salmonella (LT2) hodnot řádově CFU/mL (CFU kolonie tvořící jednotky) obr. 16. Oproti tomu deleční mutant (rfal-) s Ra chemotypem LPS dosahoval hodnot o dva řády nižší. Domníváme se proto, že změna chemotypu LPS výrazně snížila kolonizační schopnosti Salmonelly. Na stejném obrázku je také vidět, že zatímco Salmonella LT2 pronikala do krve a translokovala do mezenteriálních lymfatických uzlin, jater, plic a sleziny (translokace do orgánů není v diplomové práci prezentována), výrazně nižší počty rfal- mutantu byly vychytány již v mezenteriálních lymfatických uzlinách (na obrázku v přílohách jsou ukázány výrazně zvětšené mezenteriální lymfatické uzliny selete infikovaného LT2). mrna byla stanovována v terminálním ileu jako hlavním místě bakteriálního přestupu do organismu (69,112). V případě infekce GF selat Salmonellami došlo k výrazné aktivaci genového přepisu IFN-γ Salmonellami, přičemž u skupiny LT2 byla tato aktivace ve srovnání s GF skupinou statisticky průkazná (obr. 18). Zajímavé je, že přirozené pozadí přepisu genu přitom zůstává u konvenčních selat na úrovni srovnatelné s bezmikrobními. Uthe et al. srovnávali aktivaci genového přepisu IFN-γ u konvenčních selat infikovaných Salmonella enterica serovary Typhimurium a Cholerasuis (158). Při infekci našli u obou serovar zvýšení specifické mrna v mezenteriálních lymfatických uzlinách. Zatímco u S.Typhimurium se toto zvýšení projevilo již 24 hodin po infekci S. Typhimurium, v případě S. Cholerasuis se toto zvýšení významně projevilo až po 48 hodinách. Zvýšení exprese IFN-γ v ileu 24 hodin po infekci S. Typhimurium, obdobně jako my, popisuji Collado-Romero et al. (30). Hladiny IFN-γ v krvni a střevě (obr. 23 a obr. 24) odpovídaly svými hodnotami aktivaci genového přepisu s tím rozdílem, že vzestupy u LT2 infikované skupiny byly 70

71 vysoce signifikantní. Hladiny pozorované u mutantní salmonely byly také zvýšeny, avšak bez statistické významnosti. Výrazné zvýšení hladin IFN-γ v krvi 24 hodin po infekci S. Typhimurium pozorovali také Uthe et al., ke zvýšení u selat infikovaných serovarem Cholerasuis však došlo až 48 hodin po infekci (159). Jedním z cytokinů vztahující se k IFN-γ je IL-12. IL-12 se skláda ze dvou podjednotek a uvádí se, že podjednotka indukovaná infekčními podněty je podjednotka p40. Genový přepis pro IL-12/23 p40 byl na rozdíl od IFN-γ nalezen u všech našich pokusných skupin selat. U selat infikovaných plně virulentní Salmonellou (LT2), avšak zvýšení nebylo signifikantní. Skupina M. Murtaugha byla pravděpodobně první, která popsala výskyt IL-12 ve střevu prasete (46). Ve své práci popisují expresi mrna obou podjednotek jako konstitutivní vyskytující se v různých tkáních a na rozdíl od p30 vysokou inducibilnost podjednotky p40. Zajímavá v našem pozorování se nám zdá skutečnost, že přítomnost nepatogenní mikroflóry konvenčních prasat výrazně zvýšila expresi mrna p40 subjednotky v porovnání s kontrolní skupinou bezmikrobních selat. Z našeho pohledu je tedy tvrzení o konstitutivní expresi poněkud relativizováno, protože vidíme jasný vliv přítomnosti mikroorganismů na indukci přepisu genu pro IL-12/23 p40. V případě detekce na úrovni proteinu ve střevě je znovu patrný nárust u skupiny infikované virulentní Salmonellou kde rozdíly ve srovnání s kontrolní skupinou, kde jsme tento cytokin nedetekovali u bezmikrobních selat a jen v minimální hodnotě u konvenčních, jsou vysoce signifikantní. IL-12/23 p40 subjednotka se zdá nadějným markerem sepse, což nedávno popsali ve své práci Castellheim a spol. pro selata i.v. infikovaná E.coli (26). To potvrzuje i náš nález vysokých hodnot IL-12/23 p40 v krvi u gnotobiotických selat infikovaných enteropatogenní E.coli O55 perorálně (zde neprezentováno). Druhým významným cytokinem pro produkci IFN-γ jako klíčového cytokinu antimikrobiální imunity proti intracelulárním parazitům je interferon gama indukující faktor, tedy IL-18. Úsilí o klonování prasečího IL-18 bylo korunováno úspěchem v r kdy skupina Y. Munety v Japonsku (103) naklonovala gen pro prasečí IL-18. Hned v následujícím roce se to obdobně podařilo pracovním skupinám I. Oswaldové ve Francii (49), kteří popsali poměrně vysokou konstitutivní expresi IL-18 mrna ve střevě, a J. Oema v Koreji (117). IL-18 v ileu našich pokusných selat byl přepisován konstitutivně na poměrně vysoké úrovni i u GF skupiny. Nejvyšších hodnot bylo dosaženo v případě konvenčních selat, přičemž žádná skupina ve srovnání s kontrolní GF skupinou nedosahovala statistické významnosti. Je možné, že IL-18 může, kromě své funkce prozánětového cytokinu také sloužit jako stresový marker jak se domnívá Y. Muneta (ústní sdělení). Do toho zapadal i nález mírného zvýšení transkripce IL-18 v tenkém střevě u selat 24 71

72 hodin po odstavu (125), což je pro zvíře beze sporu velice stresující situace. Expresi IL-18 mrna v tenkém střevě a její výraznou stimulaci po bakteriálním podnětu popsala také Murtaughova skupina (47). Profil výskytu IL-18 v krvi byl v našem experimentu obdobný transkripci ve střevě, avšak v případě střevního výplachu bylo nejvyšších hodnot u selat infikovaných virulentní Salmonellou (LT2). Proklamovaná konstitutivní transkripce v různých orgánech je pravděpodobným logickým důsledkem skutečnosti, že IL-18 je regulován jak na úrovni transkripce, tak na úrovni translace, kdy je pro IL-18 štěpen na biologicky aktivní formu IL-18 kaspázou 1 (4,36). Z tohoto důvodu jsme zaměřili svou pozornost také na expresi kaspázy 1. Relativní exprese mrna kaspázy 1 byla u všech skupin poměrně vyrovnaná, mírné zvýšení bylo možné pozorovat pouze u konvenčních selat (obr. 20). Tento nález považujeme poměrně za překvapivý, protože jsme předpokládali výrazné zvýšení v případě infekce Salmonellou kmene LT2. Zajímavé je zjištění Collado-Romero et al. (30), kteří nalezli u selat infikovaných 10 8 CFU S.Typhimurium první den po orální infekci dokonce významné snížení exprese mrna v ileu v porovnání s kontrolní skupinou. Následující den byl pokles dokonce ještě výraznější. Vzhledem k tomu, že je kaspáza 1 produkována jako zymogen, který sám vyžaduje proteolytické štěpení, je možné že vztahy regulace produkce aktivního enzymu budou podstatně složitější. Transkripce TLR4, který je považován za hlavní receptor pro LPS. Zatímco výše uvedení autoři (30) nepozorovali změnu v expresi mrna pro TLR4 u infikovaných selat, v našem případě došlo u skupiny selat infikovaných S.Typhimurium k statisticky vysoce průkaznému zvýšení transkripce TLR4. Zvýšení bylo pozorovatelné také u selat infikovaných mutantní Salmonellou, ale bez statistické signifikantnosti. V souladu s naším nálezem je i pozorování Burkey et al. (21), kteří nalezli výrazné zvýšení mrna pro TLR4 v ileu u konvenčních selat infikovaných S. Typhimurium, avšak u selat infikovaných S. Cholerasuis takový efekt nenalezli. Posledním sledovaným parametrem byl jaderný faktor NF-κB1, který hraje klíčovou úlohu v transkripci IFN-γ. Collado-Romero et al. (30) pozorovali zvýšení exprese jaderného transkripčního faktoru v ileu 24 hodin po orální infekci selat S.Typhimurium. V našem pozorování došlo k zvýšení přepisu u všech selat s mikrobiální složkou ve srovnání s bezmikrobními selaty (obr. 22). Pouze v případě mutantní Salmonelly však byl tento rozdíl statistický významý. V experimentech s gnotobiotickými selaty jsme prokázali, že mutantní Salmonella vykazuje nižší schopnost osídlení trávícího traktu a nezpůsobuje bakteriemii ve srovnání s rodičovskou Salmonellou. U většiny parametrů však byla prokázána vyšší indukce zánětových cytokinů IFN-γ, IL-12/23 p40 a IL-18 72

73 charakterizující buněčný typ imunitní odpovědi na intracelurání patogeny ve srovnání s bezmikrobními a konvenčními selaty. 73

74 6. Závěr V diplomová práci jsme si kladli za hlavní cíl posoudit vliv typu salmonelového lipopolysacharidu (LPS) na indukci interferonu gama (IFN-γ), který je klíčovým cytokinem při obraně proti intracelulárním parazitům. Bezmikrobní selata byla infikována granmegativní bakterií Salmonella enterica serovar Typhimurium - kmenem LT2, který je virulentní pro bezmikrobní selata nebo jejím rfal- mutantem. IFN-γ a s ním související interleukiny 12 (IL-12) a IL-18 jsme stanovovali na úrovni mrna (reverzní transkripce a následná polymerázová řetězová reakce v reálném čase) a v tenkém střeve (ileum a část jejuna) a krvi na úrovni proteinu (ELISA). Jako další transkripty v ileu jsme stanovili Toll-like receptor 4 (TLR4), který je považován za hlavní receptor pro LPS, a jaderný transkripční faktor κb (NFκB). Za srovnávací kontrolní skupinu jsme zvolili bezmikrobní selata a pro dokreslení situace konvenční selata jako organismus s nedefinovanou mikroflórou, jehož imunitní systém je touto mikroflórou stimulován ihned po narozeni. Z výsledků vyplývá, že nejvyšší aktivaci mechanismů přirozené imunity došlo u skupiny infikované virulentní S.Typhimurium LT2. V tomto případě však je již možné, vzhledem k pozorovaným příznakům salmonelové enteritidy jako jsou nechutenství, malátnost, průjem a zvýšená tělesna teplota, hovořit o cytokinové bouři (cytokine storm) popisované v literatuře. Výrazná zánětová odpověď reprezentovaná vysokými hladinami cytokinů v tomto případě již spíše poškozuje vlastní organismu, než vede ke zvládnutí infekce. Selata infikovaná rfal- mutantem nevykazovala příznaky salmonelové enteritidy, avšak indukované hodnoty cytokinů svědčily o aktivaci mechanismů přirozené složky imunity. Dá se tedy předpokládat, že tato Salmonella s R chemotypem lipopolysacharidu by mohla působit protektivně jako živá vakcína tak, jak to bylo již dříve popsáno v literatuře při použití avirulentních kmenů S. Typhimurium. Důkladné ověření tohoto experimentu však vyžaduje další doplňující experimenty kombinující podání obou Salmonell v experimentech in vivo. 74

75 7. Seznam zkratek AcPL Accesory Protein Like AP-1 Actovator Protein 1 APC Antigen Presenting Cells BLA Bovine Leukocyte Antigens cdna complementary DNA CFU Colony Forming Unit DD doména Detah Domain DNA deoxyribonukleová kyselina DS Diluting Solution ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay FRET Fluorescence Resonance Energy Transfer GAS Gamma interferon Activating Sequences GF Germ Free HEB hematoencefalická bariéra HLA Human Leukocyte Antigens HMGB High Mobility Group Box protein Hsp Heat Shock Protein HYP hypervariabilní doména ICE IL-1beta-Converting Enzyme IFN Interferon IFNGR Interferon Gamma Receptor IGIF IFN Gamma Inducing Factor IKK Inhibitory-binding protein KappaB Kinase IL interleukin IL-1Rrp IL-1 Receptor Related Protein inos Inducibilní NO synthasa IRAK IL-1 Receptor-Associated Kinase ISGF3 IFN-Stimulated Gene Factor 3 ISRE Interferon-Stimulated Response Element JAK Janusova kinasa Kdo 3-deoxy-D-mano-oct-2-ulopyranosová kyselina LA PCR Long and Accurate PCR LBP Lipopolysaccharide Binding Protein 75

76 LNA Locked Nucleic Acid LPS lipopolysacharid LRR leucine rich repeats Mal MyD88 Adaptor-Like protein MAMP Microbe Associated Molecullar Patterns MD Myeloid Differentiation protein MHC Major Histocompatibility Complex mrna mediátorová RNA MyD88 Myeloid Differentiation factor 88 NF-kappa B Nuclear Factor kappa B NOS NO Synthasa PAMP Pathogen Associated Molecullar Patterns PCR Polymerase Chain Reaction PPR Pathogen Pattern Receptors PS polysacharid RNA ribonukleová kyselina RNI Reactive Nitrogen Intermediates ROI Reactive Oxygen Intermediates RT-PCR PCR s reverzní transkripcí SEM Standard Error of the Mean SLA Swine Leukocyte Antigens STAT Signal Transducers And Activators TICAM-1 viz TRIF TICAM-2 viz TRAM TIRAP viz Mal TLR Toll-like receptor TRAM TRIF Related Adapter Molecule TRIF TIR-containig adaptor molecule WS Wash Solution 76

77 8. Seznam použité literatury 1. Adib-Conquy, M. and J. M. Cavaillon Gamma interferon and granulocyte/monocyte colony-stimulating factor prevent endotoxin tolerance in human monocytes by promoting interleukin-1 receptor-associated kinase expression and its association to MyD88 and not by modulating TLR4 expression. J Biol.Chem. 277: doi: /jbc.m [doi];m [pii]. 2. Akashi, S., Y. Nagai, H. Ogata, M. Oikawa, K. Fukase, S. Kusumoto, K. Kawasaki, M. Nishijima, S. Hayashi, M. Kimoto, and K. Miyake Human MD-2 confers on mouse Toll-like receptor 4 species-specific lipopolysaccharide recognition. Int.Immunol. 13: Akira, S., S. Uematsu, and O. Takeuchi Pathogen recognition and innate immunity. Cell 124: doi:s (06) [pii]; /j.cell [doi]. 4. Alnemri, E. S., D. J. Livingston, D. W. Nicholson, G. Salvesen, N. A. Thornberry, W. W. Wong, and J. Yuan Human ICE/CED-3 protease nomenclature. Cell 87:171. doi:s (00) [pii]. 5. Alpuche Aranda, C. M., J. A. Swanson, W. P. Loomis, and S. I. Miller Salmonella typhimurium activates virulence gene transcription within acidified macrophage phagosomes. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 89: Anonym suernaminikit.pdf 7. Anonym Anonym Anonym Arnold, J. W., G. R. Klimpel, and D. W. Niesel Tumor necrosis factor (TNF alpha) regulates intestinal mucus production during salmonellosis. Cell Immunol. 151: doi:s (83) [pii]; /cimm [doi]. 11. Bacon, C. M., E. F. Petricoin, III, J. R. Ortaldo, R. C. Rees, A. C. Larner, J. A. Johnston, and J. J. O'Shea Interleukin 12 induces tyrosine phosphorylation and activation of STAT4 in human lymphocytes. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 92: Barbulescu, K., C. Becker, J. F. Schlaak, E. Schmitt, K. H. Meyer zum Buschenfelde, and M. F. Neurath IL-12 and IL-18 differentially regulate the transcriptional activity of the human IFN-gamma promoter in primary CD4+ T lymphocytes. J Immunol. 160: Bazan, J. F., J. C. Timans, and R. A. Kastelein A newly defined interleukin-1? Nature 379:591. doi: /379591a0 [doi]. 14. Bernabei, P., E. M. Coccia, L. Rigamonti, M. Bosticardo, G. Forni, S. Pestka, C. D. Krause, A. Battistini, and F. Novelli Interferon-gamma receptor 2 expression 77

78 as the deciding factor in human T, B, and myeloid cell proliferation or death. J Leukoc.Biol. 70: Biet, F., C. Locht, and L. Kremer Immunoregulatory functions of interleukin 18 and its role in defense against bacterial pathogens. J Mol.Med 80: doi: /s [doi]. 16. Bishop, R. E., H. S. Gibbons, T. Guina, M. S. Trent, S. I. Miller, and C. R. Raetz Transfer of palmitate from phospholipids to lipid A in outer membranes of gramnegative bacteria. EMBO J 19: doi: /emboj/ [doi]. 17. Boehm, U., T. Klamp, M. Groot, and J. C. Howard Cellular responses to interferon-gamma. Annu.Rev.Immunol. 15: doi: /annurev.immunol [doi]. 18. Born, T. L., E. Thomassen, T. A. Bird, and J. E. Sims Cloning of a novel receptor subunit, AcPL, required for interleukin-18 signaling. J Biol.Chem. 273: Bosisio, D., N. Polentarutti, M. Sironi, S. Bernasconi, K. Miyake, G. R. Webb, M. U. Martin, A. Mantovani, and M. Muzio Stimulation of toll-like receptor 4 expression in human mononuclear phagocytes by interferon-gamma: a molecular basis for priming and synergism with bacterial lipopolysaccharide. Blood 99: Bukholm, G. and M. Degre Effect of human gamma interferon on invasiveness of Salmonella typhimurium in HEp-2 cell cultures. J Interferon Res 5: Burkey, T. E., K. A. Skjolaas, S. S. Dritz, and J. E. Minton Expression of Tolllike receptors, interleukin 8, macrophage migration inhibitory factor, and osteopontin in tissues from pigs challenged with Salmonella enterica serovar Typhimurium or serovar Choleraesuis. Vet.Immunol.Immunopathol. 115: doi:s (06) [pii]; /j.vetimm [doi]. 22. Burns, K., F. Martinon, C. Esslinger, H. Pahl, P. Schneider, J. L. Bodmer, M. F. Di, L. French, and J. Tschopp MyD88, an adapter protein involved in interleukin-1 signaling. J Biol.Chem. 273: Carnaud, C., D. Lee, O. Donnars, S. H. Park, A. Beavis, Y. Koezuka, and A. Bendelac Cutting edge: Cross-talk between cells of the innate immune system: NKT cells rapidly activate NK cells. J Immunol. 163: doi:ji_v163n9p4647 [pii]. 24. Caroff, M. and D. Karibian Structure of bacterial lipopolysaccharides. Carbohydr.Res 338: doi:s x [pii]. 25. Caroff, M., D. Karibian, J. M. Cavaillon, and N. Haeffner-Cavaillon Structural and functional analyses of bacterial lipopolysaccharides. Microbes Infect. 4: doi:s x [pii]. 26. Castellheim, A., E. B. Thorgersen, B. C. Hellerud, A. Pharo, H. T. Johansen, F. Brosstad, P. Gaustad, H. Brun, E. Fosse, T. I. Tonnessen, E. W. Nielsen, and T. E. Mollnes New biomarkers in an acute model of live Escherichia coli-induced sepsis in pigs. Scand.J Immunol. 68: doi:sji2122 [pii]; /j x [doi]. 27. Cheshire, J. L. and A. S. Baldwin, Jr Synergistic activation of NF-kappaB by tumor necrosis factor alpha and gamma interferon via enhanced I kappab alpha degradation and de novo I kappabbeta degradation. Mol.Cell Biol. 17:

79 28. Chomczynski, P. and N. Sacchi Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal.Biochem. 162: doi: /abio [doi]; (87) [pii]. 29. Cirillo, D. M., R. H. Valdivia, D. M. Monack, and S. Falkow Macrophagedependent induction of the Salmonella pathogenicity island 2 type III secretion system and its role in intracellular survival. Mol.Microbiol. 30: Collado-Romero, M., C. Arce, M. Ramirez-Boo, A. Carvajal, and J. J. Garrido Quantitative analysis of the immune response upon Salmonella typhimurium infection along the porcine intestinal gut. Vet.Res 41:23. doi: /vetres/ [doi];v09428 [pii]. 31. Collins, F. M. and P. B. Carter Comparative immunogenicity of heat-killed and living oral Salmonella vaccines. Infect.Immun. 6: D'Andrea, A., M. Rengaraju, N. M. Valiante, J. Chehimi, M. Kubin, M. Aste, S. H. Chan, M. Kobayashi, D. Young, E. Nickbarg, and Production of natural killer cell stimulatory factor (interleukin 12) by peripheral blood mononuclear cells. J Exp.Med 176: Datsenko, K. A. and B. L. Wanner One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 97: doi: /pnas [doi]; [pii]. 34. Decker, T., S. Stockinger, M. Karaghiosoff, M. Muller, and P. Kovarik IFNs and STATs in innate immunity to microorganisms. J Clin.Invest 109: doi: /jci15770 [doi]. 35. Di, G. D., C. N. May, and R. Bellomo Vital organ blood flow during hyperdynamic sepsis. Chest 124: Dinarello, C. A., D. Novick, A. J. Puren, G. Fantuzzi, L. Shapiro, H. Muhl, D. Y. Yoon, L. L. Reznikov, S. H. Kim, and M. Rubinstein Overview of interleukin- 18: more than an interferon-gamma inducing factor. J Leukoc.Biol. 63: Dixon, D. R. and R. P. Darveau Lipopolysaccharide heterogeneity: innate host responses to bacterial modification of lipid a structure. J Dent Res 84: doi:84/7/584 [pii]. 38. Dlabac, V., M. Talafantova, L. Mandel, and R. Stepankova Factors influencing the fate of Escherichia coli and Salmonella typhimurium in germ-free piglets and rats. Adv.Exp.Med Biol. 371A: Dlabac, V., I. Trebichavsky, Z. Rehakova, B. Hofmanova, I. Splichal, and B. Cukrowska Pathogenicity and protective effect of rough mutants of Salmonella species in germ-free piglets. Infect.Immun. 65: Dlabač, V., I.Miller, J.Kruml, F.Kovářů, and M.Leon The development and mechanism of bacterial activity of sera and phagocytosis in pig foetuses and germfree newborn piglets, p In: Developmental aspects of antibody formation and structure. Academia, Prague, Czech Republic. 41. Engvall, E. and P. Perlmann Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G. Immunochemistry. 8: Fenton, M. J. and D. T. Golenbock LPS-binding proteins and receptors. J Leukoc.Biol. 64:

80 43. Finkelman, F. D., I. M. Katona, T. R. Mosmann, and R. L. Coffman IFNgamma regulates the isotypes of Ig secreted during in vivo humoral immune responses. J Immunol. 140: Fitzgerald, K. A., E. M. Palsson-McDermott, A. G. Bowie, C. A. Jefferies, A. S. Mansell, G. Brady, E. Brint, A. Dunne, P. Gray, M. T. Harte, D. McMurray, D. E. Smith, J. E. Sims, T. A. Bird, and L. A. O'Neill Mal (MyD88-adapter-like) is required for Toll-like receptor-4 signal transduction. Nature 413: doi: / [doi]; [pii]. 45. Fitzgerald, K. A., D. C. Rowe, B. J. Barnes, D. R. Caffrey, A. Visintin, E. Latz, B. Monks, P. M. Pitha, and D. T. Golenbock LPS-TLR4 signaling to IRF-3/7 and NF-kappaB involves the toll adapters TRAM and TRIF. J Exp.Med 198: doi: /jem [doi];jem [pii]. 46. Foss, D. L. and M. P. Murtaugh Molecular cloning and mrna expression of porcine interleukin-12. Vet.Immunol.Immunopathol. 57: Foss, D. L., M. J. Zilliox, and M. P. Murtaugh Bacterially induced activation of interleukin-18 in porcine intestinal mucosa. Vet.Immunol.Immunopathol. 78: doi:s x [pii]. 48. Foster, N., M. A. Lovell, K. L. Marston, S. D. Hulme, A. J. Frost, P. Bland, and P. A. Barrow Rapid protection of gnotobiotic pigs against experimental salmonellosis following induction of polymorphonuclear leukocytes by avirulent Salmonella enterica. Infect.Immun. 71: Fournout, S., C. M. Dozois, M. Yerle, P. Pinton, J. M. Fairbrother, E. Oswald, and I. P. Oswald Cloning, chromosomal location, and tissue expression of the gene for pig interleukin-18. Immunogenetics 51: Freudenberg, M. A., S. Tchaptchet, S. Keck, G. Fejer, M. Huber, N. Schutze, B. Beutler, and C. Galanos Lipopolysaccharide sensing an important factor in the innate immune response to Gram-negative bacterial infections: benefits and hazards of LPS hypersensitivity. Immunobiology 213: doi:s (07) [pii]; /j.imbio [doi]. 51. Frucht, D. M., T. Fukao, C. Bogdan, H. Schindler, J. J. O'Shea, and S. Koyasu IFN-gamma production by antigen-presenting cells: mechanisms emerge. Trends Immunol. 22: doi:s (01) [pii]. 52. Germanier, R Immunity in Experimental Salmonellosis I. Protection Induced by Rough Mutants of Salmonella typhimurium. Infect.Immun. 2: Germanier, R Immunity in experimental salmonellosis. 3. Comparative immunization with viable and heat-inactivated cells of Salmonella typhimurium. Infect.Immun. 5: Ghayur, T., S. Banerjee, M. Hugunin, D. Butler, L. Herzog, A. Carter, L. Quintal, L. Sekut, R. Talanian, M. Paskind, W. Wong, R. Kamen, D. Tracey, and H. Allen Caspase-1 processes IFN-gamma-inducing factor and regulates LPS-induced IFNgamma production. Nature 386: doi: /386619a0 [doi]. 55. Gibbons, H. S., S. Lin, R. J. Cotter, and C. R. Raetz Oxygen requirement for the biosynthesis of the S-2-hydroxymyristate moiety in Salmonella typhimurium lipid A. Function of LpxO, A new Fe2+/alpha-ketoglutarate-dependent dioxygenase homologue. J Biol.Chem. 275: doi: /jbc.m [doi];m [pii]. 80

81 56. Gu, Y., J. Wu, C. Faucheu, J. L. Lalanne, A. Diu, D. J. Livingston, and M. S. Su Interleukin-1 beta converting enzyme requires oligomerization for activity of processed forms in vivo. EMBO J 14: Gubler, U., A. O. Chua, D. S. Schoenhaut, C. M. Dwyer, W. McComas, R. Motyka, N. Nabavi, A. G. Wolitzky, P. M. Quinn, P. C. Familletti, and Coexpression of two distinct genes is required to generate secreted bioactive cytotoxic lymphocyte maturation factor. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 88: Gulig, P. A., T. J. Doyle, M. J. Clare-Salzler, R. L. Maiese, and H. Matsui Systemic infection of mice by wild-type but not Spv- Salmonella typhimurium is enhanced by neutralization of gamma interferon and tumor necrosis factor alpha. Infect.Immun. 65: Guo, L., K. B. Lim, C. M. Poduje, M. Daniel, J. S. Gunn, M. Hackett, and S. I. Miller Lipid A acylation and bacterial resistance against vertebrate antimicrobial peptides. Cell 95: doi:s (00)81750-x [pii]. 60. Hailman, E., H. S. Lichenstein, M. M. Wurfel, D. S. Miller, D. A. Johnson, M. Kelley, L. A. Busse, M. M. Zukowski, and S. D. Wright Lipopolysaccharide (LPS)- binding protein accelerates the binding of LPS to CD14. J Exp.Med 179: Harris, R. L., D. M. Musher, K. Bloom, J. Gathe, L. Rice, B. Sugarman, T. W. Williams, Jr., and E. J. Young Manifestations of sepsis. Arch.Intern.Med 147: Harrison, J. A., B. Villarreal-Ramos, P. Mastroeni, H. R. Demarco de, and C. E. Hormaeche Correlates of protection induced by live Aro- Salmonella typhimurium vaccines in the murine typhoid model. Immunology 90: Held, T. K., X. Weihua, L. Yuan, D. V. Kalvakolanu, and A. S. Cross Gamma interferon augments macrophage activation by lipopolysaccharide by two distinct mechanisms, at the signal transduction level and via an autocrine mechanism involving tumor necrosis factor alpha and interleukin-1. Infect.Immun. 67: Hensel, M., J. E. Shea, S. R. Waterman, R. Mundy, T. Nikolaus, G. Banks, A. Vazquez-Torres, C. Gleeson, F. C. Fang, and D. W. Holden Genes encoding putative effector proteins of the type III secretion system of Salmonella pathogenicity island 2 are required for bacterial virulence and proliferation in macrophages. Mol.Microbiol. 30: Huang, Y., P. M. Krein, D. A. Muruve, and B. W. Winston Complement factor B gene regulation: synergistic effects of TNF-alpha and IFN-gamma in macrophages. J Immunol. 169: Huber, M., C. Kalis, S. Keck, Z. Jiang, P. Georgel, X. Du, L. Shamel, S. Sovath, S. Mudd, B. Beutler, C. Galanos, and M. A. Freudenberg R-form LPS, the master key to the activation oftlr4/md-2-positive cells. Eur.J Immunol. 36: doi: /eji [doi]. 67. Iontcheva, I., S. Amar, K. H. Zawawi, A. Kantarci, and T. E. Van Dyke Role for moesin in lipopolysaccharide-stimulated signal transduction. Infect.Immun. 72: Jesmok, G., C. Lindsey, M. Duerr, M. Fournel, and T. Emerson, Jr Efficacy of monoclonal antibody against human recombinant tumor necrosis factor in E. colichallenged swine. Am J Pathol. 141:

82 69. Jones, B. D., N. Ghori, and S. Falkow Salmonella typhimurium initiates murine infection by penetrating and destroying the specialized epithelial M cells of the Peyer's patches. J Exp.Med 180: Jung, H. C., L. Eckmann, S. K. Yang, A. Panja, J. Fierer, E. Morzycka-Wroblewska, and M. F. Kagnoff A distinct array of proinflammatory cytokines is expressed in human colon epithelial cells in response to bacterial invasion. J Clin.Invest 95: doi: /jci [doi]. 71. Kagnoff, M. F Mucosal immunology: new frontiers. Immunol.Today 17: doi: [pii]. 72. Kamijo, R., J. Le, D. Shapiro, E. A. Havell, S. Huang, M. Aguet, M. Bosland, and J. Vilcek Mice that lack the interferon-gamma receptor have profoundly altered responses to infection with Bacillus Calmette-Guerin and subsequent challenge with lipopolysaccharide. J Exp.Med 178: Karibian, D., C. Deprun, and M. Caroff Comparison of lipids A of several Salmonella and Escherichia strains by 252Cf plasma desorption mass spectrometry. J Bacteriol. 175: Kawai, T. and S. Akira Signaling to NF-kappaB by Toll-like receptors. Trends Mol.Med 13: doi:s (07) [pii]; /j.molmed [doi]. 75. Kawasaki, K., R. K. Ernst, and S. I. Miller O-deacylation of lipid A by PagL, a PhoP/PhoQ-regulated deacylase of Salmonella typhimurium, modulates signaling through Toll-like receptor 4. J Biol.Chem. 279: doi: /jbc.m [doi];m [pii]. 76. Kelle, N. M., L.Young, and A.S.Cross Differential induction of tumor necrosis factor by bacteria expressing rough and smooth lipopolysaccharide phenotypes. Infect.Immun. 59: Kenny, K. and M. Herzberg Antibody response and protection induced by immunization with smooth and rough strains in experimental salmonellosis. J Bacteriol. 95: Kim, E., S. H. Kim, S. Kim, and T. S. Kim The novel cytokine p43 induces IL-12 production in macrophages via NF-kappaB activation, leading to enhanced IFN-gamma production in CD4+ T cells. J Immunol. 176: doi:176/1/256 [pii]. 79. Kobayashi, K., L. D. Hernandez, J. E. Galan, C. A. Janeway, Jr., R. Medzhitov, and R. A. Flavell IRAK-M is a negative regulator of Toll-like receptor signaling. Cell 110: doi:s [pii]. 80. Kojima, H., Y. Aizawa, Y. Yanai, K. Nagaoka, M. Takeuchi, T. Ohta, H. Ikegami, M. Ikeda, and M. Kurimoto An essential role for NF-kappa B in IL-18-induced IFNgamma expression in KG-1 cells. J Immunol. 162: Krejsek, J. and O. Kopecký Klinická imunologie. NUCLEUS HK, Hradec Králové. 82. Kumazawa, Y., M. Nakatsuka, H. Takimoto, T. Furuya, T. Nagumo, A. Yamamoto, Y. Homma, K. Inada, M. Yoshida, M. Kiso, and Importance of fatty acid substituents of chemically synthesized lipid A-subunit analogs in the expression of immunopharmacological activity. Infect.Immun. 56: Lalmanach, A. C. and F. Lantier Host cytokine response and resistance to Salmonella infection. Microbes Infect. 1: doi:s (99) [pii]. 82

83 84. Lemaitre, B., E. Nicolas, L. Michaut, J. M. Reichhart, and J. A. Hoffmann The dorsoventral regulatory gene cassette spatzle/toll/cactus controls the potent antifungal response in Drosophila adults. Cell 86: doi:s (00) [pii]. 85. Li, S., A. Strelow, E. J. Fontana, and H. Wesche IRAK-4: a novel member of the IRAK family with the properties of an IRAK-kinase. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 99: doi: /pnas [doi];99/8/5567 [pii]. 86. Lorsbach, R. B., W. J. Murphy, C. J. Lowenstein, S. H. Snyder, and S. W. Russell Expression of the nitric oxide synthase gene in mouse macrophages activated for tumor cell killing. Molecular basis for the synergy between interferon-gamma and lipopolysaccharide. J Biol.Chem. 268: Lotze, M. T. and K. J. Tracey High-mobility group box 1 protein (HMGB1): nuclear weapon in the immune arsenal. Nat.Rev.Immunol. 5: doi:nri1594 [pii]; /nri1594 [doi]. 88. Lowenstein, C. J., E. W. Alley, P. Raval, A. M. Snowman, S. H. Snyder, S. W. Russell, and W. J. Murphy Macrophage nitric oxide synthase gene: two upstream regions mediate induction by interferon gamma and lipopolysaccharide. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 90: Lowenstein, C. J., C. S. Glatt, D. S. Bredt, and S. H. Snyder Cloned and expressed macrophage nitric oxide synthase contrasts with the brain enzyme. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 89: Mandel, L., I. Trebichavsky, I. Splichal, and J. Schulze Stimulation of intestinal immune cells by E. coli in gnotobiotic piglets. Adv.Exp.Med Biol. 371A: Mariani, V., S. Palermo, S. Fiorentini, A. Lanubile, and E. Giuffra Gene expression study of two widely used pig intestinal epithelial cell lines: IPEC-J2 and IPI- 2I. Vet.Immunol.Immunopathol. 131: doi:s (09) [pii]; /j.vetimm [doi]. 92. Martin, E., C. Nathan, and Q. W. Xie Role of interferon regulatory factor 1 in induction of nitric oxide synthase. J Exp.Med 180: Matsuura, M., S. Saito, Y. Hirai, and H. Okamura A pathway through interferon-gamma is the main pathway for induction of nitric oxide upon stimulation with bacterial lipopolysaccharide in mouse peritoneal cells. Eur.J Biochem. 270: doi:3792 [pii]. 94. McCormick, B. A., C. A. Parkos, S. P. Colgan, D. K. Carnes, and J. L. Madara Apical secretion of a pathogen-elicited epithelial chemoattractant activity in response to surface colonization of intestinal epithelia by Salmonella typhimurium. J Immunol. 160: Medzhitov, R., P. Preston-Hurlburt, and C. A. Janeway, Jr A human homologue of the Drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity. Nature 388: doi: /41131 [doi]. 96. Miller, S. I., R. K. Ernst, and M. W. Bader LPS, TLR4 and infectious disease diversity. Nat.Rev.Microbiol. 3: doi:nrmicro1068 [pii]; /nrmicro1068 [doi]. 97. Miller, S. I., A. M. Kukral, and J. J. Mekalanos A two-component regulatory system (phop phoq) controls Salmonella typhimurium virulence. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 86:

84 98. Mita, Y., K. Dobashi, Y. Shimizu, T. Nakazawa, and M. Mori Toll-like receptor 2 and 4 surface expressions on human monocytes are modulated by interferon-gamma and macrophage colony-stimulating factor. Immunol.Lett. 78: doi:s (01) [pii]. 99. Mittrucker, H. W. and S. H. Kaufmann Immune response to infection with Salmonella typhimurium in mice. J Leukoc.Biol. 67: MOUTON, D., G. BIOZZI, Y. BOUTHILLIER, and C. STIFFEL Phagocytosis of Salmonellae by reticuloendothelial cells of newborn piglets lacking natural antibody. Nature 197: Munder, M., M. Mallo, K. Eichmann, and M. Modolell Murine macrophages secrete interferon gamma upon combined stimulation with interleukin (IL)-12 and IL-18: A novel pathway of autocrine macrophage activation. J Exp.Med 187: Muneta, Y., O. Mikami, Y. Shimoji, Y. Nakajima, Y. Yokomizo, and Y. Mori Detection of porcine interleukin-18 by sandwich ELISA and immunohistochemical staining using its monoclonal antibodies. J Interferon Cytokine Res 20: doi: / [doi] Muneta, Y., Y. Shimoji, Y. Yokomizo, and Y. Mori Molecular cloning of porcine interleukin-1beta converting enzyme and differential gene expression of IL-1beta converting enzyme, IL-1beta, and IL-18 in porcine alveolar macrophages. J Interferon Cytokine Res 19: doi: / [doi] Muotiala, A. and P. H. Makela Role of gamma interferon in late stages of murine salmonellosis. Infect.Immun. 61: Murphy, T. L., M. G. Cleveland, P. Kulesza, J. Magram, and K. M. Murphy Regulation of interleukin 12 p40 expression through an NF-kappa B half-site. Mol.Cell Biol. 15: Myc, A., J. Buck, J. Gonin, B. Reynolds, U. Hammerling, and D. Emanuel The level of lipopolysaccharide-binding protein is significantly increased in plasma in patients with the systemic inflammatory response syndrome. Clin.Diagn.Lab Immunol. 4: Nakahira, M., H. J. Ahn, W. R. Park, P. Gao, M. Tomura, C. S. Park, T. Hamaoka, T. Ohta, M. Kurimoto, and H. Fujiwara Synergy of IL-12 and IL-18 for IFN-gamma gene expression: IL-12-induced STAT4 contributes to IFN-gamma promoter activation by up-regulating the binding activity of IL-18-induced activator protein 1. J Immunol. 168: Nakamura, K., H. Okamura, M. Wada, K. Nagata, and T. Tamura Endotoxininduced serum factor that stimulates gamma interferon production. Infect.Immun. 57: Nakanishi, K., T. Yoshimoto, H. Tsutsui, and H. Okamura Interleukin-18 regulates both Th1 and Th2 responses. Annu.Rev.Immunol. 19: doi:19/1/423 [pii]; /annurev.immunol [doi] Nauciel, C. and F. Espinasse-Maes Role of gamma interferon and tumor necrosis factor alpha in resistance to Salmonella typhimurium infection. Infect.Immun. 60: Nečas, O. e. a Exprese genetické informace, p In: Obecná biologie Neutra, M. R., A. Frey, and J. P. Kraehenbuhl Epithelial M cells: gateways for mucosal infection and immunization. Cell 86: doi:s (00) [pii]. 84

85 113. Ninomiya-Tsuji, J., K. Kishimoto, A. Hiyama, J. Inoue, Z. Cao, and K. Matsumoto The kinase TAK1 can activate the NIK-I kappab as well as the MAP kinase cascade in the IL-1 signalling pathway. Nature 398: doi: /18465 [doi] Northen, H., G. K. Paterson, F. Constantino-Casas, C. E. Bryant, S. Clare, P. Mastroeni, S. E. Peters, and D. J. Maskell Salmonella enterica serovar Typhimurium mutants completely lacking the F(0)F(1) ATPase are novel live attenuated vaccine strains. Vaccine 28: doi:s x(09) [pii]; /j.vaccine [doi] O'Neill, L. A. and C. A. Dinarello The IL-1 receptor/toll-like receptor superfamily: crucial receptors for inflammation and host defense. Immunol.Today 21: doi:s x [pii] O'Neill, L. A. and C. Greene Signal transduction pathways activated by the IL-1 receptor family: ancient signaling machinery in mammals, insects, and plants. J Leukoc.Biol. 63: Oem, J. K., H. J. Song, S. W. Kang, and W. S. Jeong Cloning, sequencing, and expression of porcine interleukin-18 in Escherichia coli. Mol.Cells 10: Oppmann, B., R. Lesley, B. Blom, J. C. Timans, Y. Xu, B. Hunte, F. Vega, N. Yu, J. Wang, K. Singh, F. Zonin, E. Vaisberg, T. Churakova, M. Liu, D. Gorman, J. Wagner, S. Zurawski, Y. Liu, J. S. Abrams, K. W. Moore, D. Rennick, R. de Waal- Malefyt, C. Hannum, J. F. Bazan, and R. A. Kastelein Novel p19 protein engages IL-12p40 to form a cytokine, IL-23, with biological activities similar as well as distinct from IL-12. Immunity 13: doi:s (00) [pii] Oshiumi, H., M. Matsumoto, K. Funami, T. Akazawa, and T. Seya TICAM-1, an adaptor molecule that participates in Toll-like receptor 3-mediated interferon-beta induction. Nat.Immunol. 4: doi: /ni886 [doi];ni886 [pii] Oshiumi, H., M. Sasai, K. Shida, T. Fujita, M. Matsumoto, and T. Seya TIRcontaining adapter molecule (TICAM)-2, a bridging adapter recruiting to toll-like receptor 4 TICAM-1 that induces interferon-beta. J Biol.Chem. 278: doi: /jbc.m [doi];m [pii] Palsson-McDermott, E. M. and L. A. O'Neill Signal transduction by the lipopolysaccharide receptor, Toll-like receptor-4. Immunology 113: doi: /j x [doi];imm1976 [pii] Parham, C., M. Chirica, J. Timans, E. Vaisberg, M. Travis, J. Cheung, S. Pflanz, R. Zhang, K. P. Singh, F. Vega, W. To, J. Wagner, A. M. O'Farrell, T. McClanahan, S. Zurawski, C. Hannum, D. Gorman, D. M. Rennick, R. A. Kastelein, M. R. de Waal, and K. W. Moore A receptor for the heterodimeric cytokine IL-23 is composed of IL-12Rbeta1 and a novel cytokine receptor subunit, IL-23R. J Immunol. 168: Park, J. H. and S. H. Shin Induction of IL-12 gene expression in the brain in septic shock. Biochem.Biophys.Res Commun. 224: doi:s x(96) [pii]; /bbrc [doi] Parnet, P., K. E. Garka, T. P. Bonnert, S. K. Dower, and J. E. Sims IL-1Rrp is a novel receptor-like molecule similar to the type I interleukin-1 receptor and its homologues T1/ST2 and IL-1R AcP. J Biol.Chem. 271: Pie, S., J. P. Lalles, F. Blazy, J. Laffitte, B. Seve, and I. P. Oswald Weaning is associated with an upregulation of expression of inflammatory cytokines in the intestine of piglets. J Nutr. 134:

86 126. Pie, S., P. Truffa-Bachi, M. Pla, and C. Nauciel Th1 response in Salmonella typhimurium-infected mice with a high or low rate of bacterial clearance. Infect.Immun. 65: Poltorak, A., X. He, I. Smirnova, M. Y. Liu, H. C. Van, X. Du, D. Birdwell, E. Alejos, M. Silva, C. Galanos, M. Freudenberg, P. Ricciardi-Castagnoli, B. Layton, and B. Beutler Defective LPS signaling in C3H/HeJ and C57BL/10ScCr mice: mutations in Tlr4 gene. Science 282: Presky, D. H., H. Yang, L. J. Minetti, A. O. Chua, N. Nabavi, C. Y. Wu, M. K. Gately, and U. Gubler A functional interleukin 12 receptor complex is composed of two beta-type cytokine receptor subunits. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 93: Rejnek, J., J.Trávníček, J.Kostka, J.Šterzl, and A.Lane Study of the effect of antibodies in the intestinal tract of germ-free baby pigs. Folia Microbiol.(Praha) 13: Roantree, R. J The relationship of lipopolysaccharide structure to bacterial virulence, p In: Microbial toxins. Academic Press, New York, N.Y Robinson, D., K. Shibuya, A. Mui, F. Zonin, E. Murphy, T. Sana, S. B. Hartley, S. Menon, R. Kastelein, F. Bazan, and A. O'Garra IGIF does not drive Th1 development but synergizes with IL-12 for interferon-gamma production and activates IRAK and NFkappaB. Immunity 7: doi:s (00) [pii] Romani, L., P. Puccetti, and F. Bistoni Interleukin-12 in infectious diseases. Clin.Microbiol.Rev. 10: Sasaki, H., R. B. Pollard, D. Schmitt, and F. Suzuki Transforming growth factor-beta in the regulation of the immune response. Clin.Immunol.Immunopathol. 65: Sato, S., M. Sugiyama, M. Yamamoto, Y. Watanabe, T. Kawai, K. Takeda, and S. Akira Toll/IL-1 receptor domain-containing adaptor inducing IFN-beta (TRIF) associates with TNF receptor-associated factor 6 and TANK-binding kinase 1, and activates two distinct transcription factors, NF-kappa B and IFN-regulatory factor-3, in the Toll-like receptor signaling. J Immunol. 171: Scaffidi, P., T. Misteli, and M. E. Bianchi Release of chromatin protein HMGB1 by necrotic cells triggers inflammation. Nature 418: doi: /nature00858 [doi];nature00858 [pii] Schafer, R. and T. K. Eisenstein Natural killer cells mediate protection induced by a Salmonella aroa mutant. Infect.Immun. 60: Schroder, K., P. J. Hertzog, T. Ravasi, and D. A. Hume Interferon-gamma: an overview of signals, mechanisms and functions. J Leukoc.Biol. 75: doi: /jlb [doi];jlb [pii] Shimazu, R., S. Akashi, H. Ogata, Y. Nagai, K. Fukudome, K. Miyake, and M. Kimoto MD-2, a molecule that confers lipopolysaccharide responsiveness on Toll-like receptor 4. J Exp.Med 189: Silva, E., R. H. Passos, M. B. Ferri, and L. F. de Figueiredo Sepsis: from bench to bedside. Clinics.(Sao Paulo) 63: doi:s [pii] Skarnes, R. C In vivo interaction of endotoxin with a plasma lipoprotein having esterase activity. J Bacteriol. 95:

87 141. Šmarda, J., J. Doškař, R. Pantůček, Růžičková V., and Koptíková J Metody molekulární biologie. Brno Splichal, I LNA sondy ve stanovení genového přepisu prasečích cytokinů. Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové, Hradec Králové Splichal, I., I. Trebichavsky, Y. Muneta, and Y. Mori Early cytokine response of gnotobiotic piglets to Salmonella enterica serotype typhimurium. Vet.Res 33: doi: /vetres: [doi] Splichal, I., I. Trebichavsky, A. Splichalova, and P. A. Barrow Protection of gnotobiotic pigs against Salmonella enterica serotype Typhimurium by rough mutant of the same serotype is accompanied by the change of local and systemic cytokine response. Vet.Immunol.Immunopathol. 103: doi:s (04) [pii]; /j.vetimm [doi] Steeghs, L., H. R. den, B. A. den, B. Zomer, P. Roholl, and P. van der Ley Meningitis bacterium is viable without endotoxin. Nature 392: doi: /33046 [doi] Sterzl, J. and A. M. Silverstein Developmental aspects of immunity. Adv.Immunol. 6: Strunk, R. C., F. S. Cole, D. H. Perlmutter, and H. R. Colten gamma-interferon increases expression of class III complement genes C2 and factor B in human monocytes and in murine fibroblasts transfected with human C2 and factor B genes. J Biol.Chem. 260: Tierrez, A. and P. F. Garcia-del New concepts in Salmonella virulence: the importance of reducing the intracellular growth rate in the host. Cell Microbiol. 7: doi:cmi540 [pii]; /j x [doi] Tobias, P. S., K. Soldau, and R. J. Ulevitch Isolation of a lipopolysaccharidebinding acute phase reactant from rabbit serum. J Exp.Med 164: Tobias, P. S., K. Soldau, and R. J. Ulevitch Identification of a lipid A binding site in the acute phase reactant lipopolysaccharide binding protein. J Biol.Chem. 264: Torigoe, K., S. Ushio, T. Okura, S. Kobayashi, M. Taniai, T. Kunikata, T. Murakami, O. Sanou, H. Kojima, M. Fujii, T. Ohta, M. Ikeda, H. Ikegami, and M. Kurimoto Purification and characterization of the human interleukin-18 receptor. J Biol.Chem. 272: Travnicek, J. and L. Mandel Haematology of conventional and germfree miniature Minnesota piglets. II. Serum proteins and immunoglobulins. Z.Versuchstierkd. 24: Trebichavsky, I Cytokines in Salmonella infection. Folia Microbiol.(Praha) 44: Trebichavsky, I., V. Dlabac, Z. Rehakova, M. Zahradnickova, and I. Splichal Cellular changes and cytokine expression in the ilea of gnotobiotic piglets resulting from peroral Salmonella typhimurium challenge. Infect.Immun. 65: Trebichavsky, I., I. Splichal, A. Splichalova, Y. Muneta, and Y. Mori Systemic and local cytokine response of young piglets to oral infection with Salmonella enterica serotype Typhimurium. Folia Microbiol.(Praha) 48:

88 156. Trent, M. S., W. Pabich, C. R. Raetz, and S. I. Miller A PhoP/PhoQ-induced Lipase (PagL) that catalyzes 3-O-deacylation of lipid A precursors in membranes of Salmonella typhimurium. J Biol.Chem. 276: doi: /jbc.m [doi];m [pii] Ushio, S., M. Namba, T. Okura, K. Hattori, Y. Nukada, K. Akita, F. Tanabe, K. Konishi, M. Micallef, M. Fujii, K. Torigoe, T. Tanimoto, S. Fukuda, M. Ikeda, H. Okamura, and M. Kurimoto Cloning of the cdna for human IFN-gammainducing factor, expression in Escherichia coli, and studies on the biologic activities of the protein. J Immunol. 156: Uthe, J. J., A. Royaee, J. K. Lunney, T. J. Stabel, S. H. Zhao, C. K. Tuggle, and S. M. Bearson Porcine differential gene expression in response to Salmonella enterica serovars Choleraesuis and Typhimurium. Mol.Immunol. 44: doi:s (07) [pii]; /j.molimm [doi] Uthe, J. J., A. Royaee, J. K. Lunney, T. J. Stabel, S. H. Zhao, C. K. Tuggle, and S. M. Bearson Porcine differential gene expression in response to Salmonella enterica serovars Choleraesuis and Typhimurium. Mol.Immunol. 44: doi:s (07) [pii]; /j.molimm [doi] van der Waaij, D., J. M. Berghuis-de Vries, and v. Lekkerkerk Colonization resistance of the digestive tract and the spread of bacteria to the lymphatic organs in mice. J Hyg.(Lond) 70: Wahl, S. M Transforming growth factor beta (TGF-beta) in inflammation: a cause and a cure. J Clin.Immunol. 12: Wang, H., O. Bloom, M. Zhang, J. M. Vishnubhakat, M. Ombrellino, J. Che, A. Frazier, H. Yang, S. Ivanova, L. Borovikova, K. R. Manogue, E. Faist, E. Abraham, J. Andersson, U. Andersson, P. E. Molina, N. N. Abumrad, A. Sama, and K. J. Tracey HMG-1 as a late mediator of endotoxin lethality in mice. Science 285: doi:7585 [pii] Weisz, A., L. Cicatiello, and H. Esumi Regulation of the mouse inducible-type nitric oxide synthase gene promoter by interferon-gamma, bacterial lipopolysaccharide and NG-monomethyl-L-arginine. Biochem.J 316 ( Pt 1): Wesche, H., X. Gao, X. Li, C. J. Kirschning, G. R. Stark, and Z. Cao IRAK-M is a novel member of the Pelle/interleukin-1 receptor-associated kinase (IRAK) family. J Biol.Chem. 274: Wesche, H., W. J. Henzel, W. Shillinglaw, S. Li, and Z. Cao MyD88: an adapter that recruits IRAK to the IL-1 receptor complex. Immunity 7: doi:s (00) [pii] Winkler, G. C Pulmonary intravascular macrophages in domestic animal species: review of structural and functional properties. Am J Anat. 181: doi: /aja [doi] Wu, F., N. Vij, L. Roberts, S. Lopez-Briones, S. Joyce, and S. Chakravarti A novel role of the lumican core protein in bacterial lipopolysaccharide-induced innate immune response. J Biol.Chem. 282: doi:m [pii]; /jbc.m [doi] Wurfel, M. M., S. T. Kunitake, H. Lichenstein, J. P. Kane, and S. D. Wright Lipopolysaccharide (LPS)-binding protein is carried on lipoproteins and acts as a cofactor in the neutralization of LPS. J Exp.Med 180:

89 169. Xu, D., W. L. Chan, B. P. Leung, D. Hunter, K. Schulz, R. W. Carter, I. B. McInnes, J. H. Robinson, and F. Y. Liew Selective expression and functions of interleukin 18 receptor on T helper (Th) type 1 but not Th2 cells. J Exp.Med 188: Yamamoto, M., S. Sato, H. Hemmi, H. Sanjo, S. Uematsu, T. Kaisho, K. Hoshino, O. Takeuchi, M. Kobayashi, T. Fujita, K. Takeda, and S. Akira Essential role for TIRAP in activation of the signalling cascade shared by TLR2 and TLR4. Nature 420: doi: /nature01182 [doi];nature01182 [pii] Yoshimoto, T., H. Okamura, Y. I. Tagawa, Y. Iwakura, and K. Nakanishi Interleukin 18 together with interleukin 12 inhibits IgE production by induction of interferon-gamma production from activated B cells. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 94: Yoshimoto, T., K. Takeda, T. Tanaka, K. Ohkusu, S. Kashiwamura, H. Okamura, S. Akira, and K. Nakanishi IL-12 up-regulates IL-18 receptor expression on T cells, Th1 cells, and B cells: synergism with IL-18 for IFN-gamma production. J Immunol. 161: Youn, J. H., Y. J. Oh, E. S. Kim, J. E. Choi, and J. S. Shin High mobility group box 1 protein binding to lipopolysaccharide facilitates transfer of lipopolysaccharide to CD14 and enhances lipopolysaccharide-mediated TNF-alpha production in human monocytes. J Immunol. 180: doi:180/7/5067 [pii] Zarrouk, H., D. Karibian, S. Bodie, M. B. Perry, J. C. Richards, and M. Caroff Structural characterization of the lipids A of three Bordetella bronchiseptica strains: variability of fatty acid substitution. J Bacteriol. 179: Zhao, W. and Z. Hu The enigmatic processing and secretion of interleukin-33. Cell Mol.Immunol. doi:cmi20103 [pii]; /cmi [doi]. 89

90 9. Přílohy gnotobiotické sele odběr vzorků 90

91 kardiální punkce mezenteriální lymfatické uzliny 91