Diagnostika a hodnocení chorob rostlin, se zaměřením na obilniny

Transkript

1 Výzkumný ústav rostlinné výroby Praha 6 - Ruzyně Diagnostika a hodnocení chorob rostlin, se zaměřením na obilniny Odborný seminář

2 Výzkumný ústav rostlinné výroby, Praha 6 Ruzyně, Drnovská 507 Odborný garant: Ing. Lubomír Věchet, CSc. ISBN:

3 Obsah Lubomír Věchet: Diagnostika a měření chorob rostlin. 4 Leona Leišová: Hodnocení a diagnostika chorob obilnin způsobených houbovými patogeny s využitím molekulárně-biologických metod. 7 Lubomír Věchet: Určení a hodnocení padlí travního (Blumeria graminis f. sp. tritici; anamorph Erysiphe graminis) na pšenici. 14 Alena Hanzalová, Jana Šárová: Původci listových skvrnitostí v ČR 19 Jana Chrpová, Václav Šíp, Eliška Sychrová, Eva Matějová: Klasové fuzariózy u pšenice. 23 Eliška Sychrová: Choroby pat stébel. 26 Evženie Prokinová: Diagnostika listových skvrnitostí ječmene. 31 Lubomír Věchet: Diagnostika a hodnocení braničnatky pšeničné (Mycosphaerella graminicola). 35 Michaela Kochanová, Evženie Prokinová: Diagnostika snětí rodu Tilletia na pšenici. 40 Jozef Gubiš, Martina Hudcovicová: Využitie PCR metód v detekcii Rhynchosporium secalis na jačmeni siatom. 44 Blanka Kokošková: Význam a diagnostika bakterií Pseudomonas syringae a patovarů vyskytujících se na obilninách. 47 Josef Hýsek, Milan Vach: Diagnostika a hodnocení fytopatogenních hub rodu Fusarium (Posuny v houbovém spektru po aplikaci biopreparátů při pěstování jarního ječmene. 53 Markéta Hejná, Miroslav Kolařík, Jaroslava Marková: Molekulárně-genetická analýza aecií na rodu Ranunculus. 56 3

4 Diagnostika a měření chorob rostlin Lubomír Věchet Výzkumný ústav rostlinné výroby, Drnovská 507, Praha 6 Ruzyně vechet@vurv.cz Udává se, že je celosvětově známo asi chorob rostlin. Abychom si dovedli udělat představu o závažnosti napadení rostlin chorobou, je třeba nejprve chorobu správně určit. Choroba je zhoršení normálního stavu živé rostliny, které narušuje nebo pozměňuje životní funkce. Rostlina stává ochořelou, když je nepřetržitě postižena nějakým příčinným agens, které končí v abnormálních fyziologických procesech, jež narušují normální strukturu, růst, funkci a jiné aktivity, například změní ekonomické hodnoty produktu. Jde prostě o řadu událostí spouštěných patogenem, které vedou k destrukci tkání nebo právě k ovládnutí rostliny patogenem. Důsledkem může být abnormální růst nebo disfunkce rostliny způsobená živými organizmy nebo neživými faktory. Choroba se většinou projevuje v místě infekce rostliny patogenem. U nadzemních částí to mohou být chlorotické skvrny, později s ložiskem infekce. Při pohledu pouhým okem je vidět řada příznaků choroby v podobě například mycelia na povrchu rostliny nebo je mycelium skryto uvnitř hostitele a jsou vidět jen ložiska výtrusů, jindy to jsou skvrny charakteristicky tvarované a zbarvené. Někdy může být rostlina napadena více patogeny a často není jednoduché určit, který patogen je primární. U chorob kořenů to mohou být nápadné barevné změny (např. černání). Zdrojem infekce může být také vyseté zrno a k projevu choroby dochází na listech nebo klasech. Běžně se vyskytující choroby mohou být rozděleny na listové a klasové a půdou přenosné choroby. Některé choroby je relativně snadné diagnostikovat, protože symptomy jsou charakteristické a zřejmé. Ostatní choroby může být obtížné diagnostikovat bez mikroskopických nebo laboratorních analýz. Diagnóza je tedy první krok směrem k dosažení efektivní kontroly. Správné určení choroby je možné podle charakteristických příznaků napadení. Obecně lze říci, že do metod určení choroby patří polní diagnostika, laboratorní testy (jako kultury původce choroby), sérologické testy (ELISA), molekulární testy (PCR), indexace biologickými indikátory. Příznaky ochoření podzemních a nadzemních částí rostliny mohou být však značně odlišné. Pokud příznaky nejsou jednoznačné a nestačí vizuální posouzení, musíme provést podrobnější hodnocení pod mikroskopem. Jindy je třeba patogena izolovat z ložiska infekce a provést určení pomocí různých identifikačních metod jako jsou metody biochemické, imunochemické, molekulárně biologické nebo testy patogenity. Tyto metody je nezbytné použít také ve sporných případech. Kromě hlavních příznaků ochoření se v některých případech mohou objevit druhotné, někdy velice nápadné změny v habitu rostliny (např. lom stébla, bělení klasů, malá výška rostliny, bohaté odnožování ap.). V řízení ochrany rostlin je kromě přesné identifikace choroby důležité, kromě jiného, určit počátek objevení choroby v porostu rostliny. Jednou z metod, jak poměrně přesně určit nástup choroby v porostu plodiny je metoda sumace průměrných efektivních denních teplot. Tato metoda byla úspěšně použita při stanovení počátku výskytu padlí travního na ječmeni ( Věchet a Kocourek, 1988). Diagnostika a měření intenzity choroby hrají klíčovou úlohu ve fytopatologii. Bez kvantifikace choroby by nebyla možná žádná studie epidemiologie, odhad ztrát na výnosu plodiny, žádný průzkum výskytu choroby. Intenzita choroby může být vyjádřena (Kranz & Rotem, 1988) buď jako výskyt (frekvence) nebo jako závažnost. Výskyt je procento ochořelých rostlin nebo částí rostliny ve vzorku nebo populaci, bez ohledu na samotnou závažnost. Závažnost choroby je procento příslušné tkáně nebo orgánu hostitele pokrytého symptomy (nebo skvrnami) choroby. 4

5 Závažnost vyplývá z počtu a velikosti skvrn. Výběr mezi hodnocením choroby podle závažnosti nebo výskytu (frekvence) záleží převážně na typu choroby a na účelu hodnocení. Závažnost choroby se zdá být více vhodná pro rzi, padlí travní, plísně, listové skvrnitosti apod. Hodnocení chorob podle výskytu je vhodné pro většinu chorob v časných stádiích jejich epidemií. Vizuální odhad napadení rostliny chorobou je důležitý pro studium epidemiologie choroby, rezistence rostlin k chorobě, účinku fungicidů a odhadu ztráty na výnosu plodiny. Například vizuální odhad procenta ochořelé listové plochy je ovlivněn strukturou rostliny, velikostí a typem skvrn. Tento odhad můžeme provádět na poli a to buď přímo na rostlinách nebo částech rostlin, případně na odtržených rostlinách. Jiným způsobem je použití klíčů (obrázkový odhadovací klíč), standardních diagramů (mohou být použity i pro měření intenzity choroby) nebo stupnice měření intenzity choroby. Kromě těchto odhadovacích klíčů byly vytvořeny i fotografické klíče (Flath, Andersch, 1996; Obr. 1). Při hodnocení listových chorob se používají a používaly různé stupnice s větším nebo menším počtem hodnotících kategorií. V současné době se nejvíce používá 9-ti bodová stupnice. Každý hodnotitel je při hodnocení napadení rostliny chorobou zatížen vlastní, subjektivní chybou. Důsledkem toho je, že například dva hodnotitelé odhadnou stejné napadení různě. U napadení rostlin biotrofními patogeny (např. padlí travní, rzi) hodnotíme procento pokrytí listové plochy příznaky napadení. U napadení rostlin nekrotrofními patogeny (například braničnatka pšeničná) hodnotíme procento nekrotických skvrn, s charakteristickými příznaky na listu. Můžeme hodnotit napadení jednoho listu na rostlině (např. praporcového) nebo všech listů a z toho vypočítat napadení celé rostliny. Při vyjádření napadení celé rostliny, kdy vycházíme z napadení všech listů na rostlině, může dojít k rozkolísání hodnot v několika po sobě jdoucích hodnoceních. Důsledkem, kromě subjektivní chyby, je skutečnost, že počet listů na rostlině se v růstových fázích mění. Může se totiž stát, že v následném hodnocení uděláme nižší odhad, než v předchozím hodnocení. Přesnější je potom použití tzv. kumulativního procenta napadení (CPLAD), kdy v jednotlivých termínech hodnocení se načítají pouze vyšší hodnoty. Často potřebujeme měřit rychlost vývoje choroby. Zvláště při aplikaci fungicidů je třeba znát jak jejich použití ovlivnilo snížení rychlosti epidemie, třeba v porovnání s neošetřeným porostem. Existují tři způsoby výpočtu rychlosti epidemie (Kranz & Rotem, 1988): (1) dvoubodová metoda, (2) lineární regrese transformovaných hodnot intenzity choroby a (3) nelineární hodnoty odpovídající intenzitě choroby. Podívejme se na ten nejjednodušší způsob, to je dvoubodovou metodu výpočtu rychlosti. V křivce průběhu choroby jsou vybrány dvě hodnoty, které jsou v našem zájmu a z těch vypočítáme rychlost epidemie. Jestliže má křivka choroby logistický průběh (logistická rovnice je nejjednodušší model růstu, která počítá rychlost růstu vůči nule v nějakém časovém bodě) je rychlost vypočítána takto: r= [logit(y 2 )- logit(y 1 )]/dt, kde logit (y) je log e (y/(1-y)) a dt je časový interval mezi vybranými body. Jestliže křivka průběhu choroby má asymetrický, sigmoidální charakter (podoba C), pak se používá Gompertzova transformace. Výpočet je podobný: k=[gompit(y 2 ) gompit (y 1 )]/dt, kde gompit(y) je log)-log(y)). Nejčastěji používaným způsobem výpočtu v korelaci intenzity choroby k odhadu ztráty na výnosu je AUDCP- plocha pod křivkou rozvoje choroby. Ta byla prvně použita Vanderplankem v roce Je obvykle počítána trapezoidální transformací AUDPC= Σ(y i +y i+1 )/2xdt i, kde dt i je časový interval mezi každými dvěma pozorováními y i a yi +1 Z hlediska ochranného zásahu proti chorobě je třeba napadení hodnotit již v ranných fázích vývoje choroby. Byla také snaha vyvinout metody, které by tomuto mohly být nápomocny. Jedním příkladem může být metoda sumace efektivních teplot, kterou jsme v roce 1990 vyvinuli pro počátek hodnocení padlí travního na jarním ječmeni. Správné určení choroby na rostlině a jeho přesné měření je předpokladem dobré vypovídací schopnosti našich výsledků. 5

6 LITERATURA FLATH K., ANDERSCH A. (1996): Assessment of partial resistence to powdery mildew in German winter wheat varieties by a laboratory methhod. Proceedings of th 9 th European and Mediterranean Cereeal & Powdery Mildews Conference 2-6 September 1996, Lunteren, The Netherlands KRANZ J., ROTEM J. (1988): Experimental techniques in plant disease epidemiology. Springer-Verlag Berlin, Heidelberg, New York, London, Paris, Tokyo: VĚCHET L., KOCOUREK F. (1988): Model řízení ochrany ječmene jarního proti padlí travnímu. Ochrana rostlin 24, (3): Tento výzkum byl podporován výzkumným záměrem MZE ČR č

7 Hodnocení a diagnostika chorob obilnin způsobených houbovými patogeny s využitím molekulárně-biologických metod Leona Leišová Výzkumný ústav rostlinné výroby, Drnovská 507, Praha 6 Ruzyně leisova@vurv.cz Nejčastějšími chorobami obilovin jsou choroby způsobené houbovými patogeny. Způsobují značné ekonomické ztráty, a proto se jejich studiu věnuje stále větší pozornost. Houby (Fungi) jsou eukaryotické, stélkaté organismy, jejichž heterotrofie je odkazuje k saprofytickému, parazitickému nebo symbiotickému způsobu výživy. Genom vláknitých hub o velikosti 20 až 50 Mb je rozdělen na jaderný, mitochondriální a plasmidový. Obsahuje málo repetitivní DNA s výjimkou genů pro rrna, trna a úseků podobných retrotransposonům. Jaderný genom je uspořádán v chromosomech podobně jako u ostatních eukaryot. Mitochondriová DNA je většinou kružnicová a je značně velikostně i sekvenčně variabilní. Plasmidy u vláknitých hub se primárně vyskytují v mitochondriích. Kompletní sekvence genomu není dosud známa u žádného druhu houby parazitující na rostlinách. Nejprostudovanější částí genomu jsou tzv. ITS a IGS oblasti, které se často využívají pro taxonomické studie (Mugnier, 1995) a k přípravě diagnostických markerů (Bates et al., 2001). ITS (Internal Transcribed Spacers) jsou mezerníky, které oddělují geny kódující ribosomální rrna: ITS1 se nachází mezi geny pro 18S rrna a 5,8S rrna a ITS2 mezi geny pro 5,8S rrna a 26S rrna. Mezi jednotlivými opakujícími se jednotkami jsou opět mezerníky, tzv. IGS (Intergenic Spacers). Kódující oblasti jsou značně konzervativní, naopak oblast mezerníků ITS a IGS vykazují vysokou míru variability. Klasická metodika detekce houbových patogenů zahrnuje pěstování na umělých živných médiích (Arabi and Jawhar, 2003), imunologické testy (ELISA) a patologické testy na diferenciačních odrůdách hostitele (Afanasenko et al., 1995). Tyto metody selhávají tam, kde se jedná o vysoce variabilní populaci patogena a tam, kde existují druhy či formy geneticky si velmi blízké. To je např. případ houby Pyrenophora teres, jejíž populace vykazují vysokou míru variability, a která se vyskytuje ve dvou formách: Pyrenophora teres f. sp. teres a Pyrenophora teres f. sp. maculata (Smedegård-Petersen, 1971). Obě formy produkují podobné kultury na umělých živných půdách, mají takřka identickou morfologii; liší se pouze typem symptomu na listech hostitele. Vzhledem k tomu, že se rezistence k oběma formám dědí nezávisle (Ho et al., 1996) je důležité, aby byl patogen korektně identifikován. Taktéž následný výzkum chování patogena musí být založen na správné identifikaci druhu a formy. Nové možnosti detekce patogenů se otevřely s objevením polymerázové řetězové reakce. První metodou použitou k detekci a vzájemnému rozlišení druhů Pyrenophora teres f. sp. teres, Pyrenophora teres f. sp. maculata a Pyrenophora graminea byla RAPD (Reeves and Ball, 1991). Autoři použili 4 primery, z nichž pomocí jednoho dokázali rozlišit všech osm studovaných izolátů. Tento počet je však pro přípravu markeru nedostatečný. Peltonen et al. (1996) dokázali pomocí metody RAPD rozlišit 50 izolátů Pyrenophora teres a Pyrenophora graminea. Dvě formy Pyrenopora teres: Pyrenophora teres f. sp. teres a Pyrenophora teres f. sp. maculata však rozlišit nedokázali. Taylor et al. (2001) použili 60 RAPD primerů k vyhledání diagnostického druhově specifického markeru. Ten převedli na tzv. SCAR (Sequence-Characterised Amplified Region) marker, pomocí něhož lze specificky detekovat Pyrenophora graminea v zrnu ječmene (Hordeum vulgare). Tento postup: převod RAPD markeru na specifický SCAR marker je hojně využíván, pro detekci Pyrenophora teres jej použili Williams et al. (2001). Vytvořili diagnostický set molekulárních SCAR markerů vyvinutých pomocí metody RAPD, specificky detekujících obě formy Pyrenophora teres. 7

8 V posledních několika letech se objevuje snaha vyvinout metodiku pro kvantitativní stanovení obsahu houbového patogena v pletivech hostitele. Metody kvantifikace lze rozdělit na přímé a nepřímé. Mezi nepřímé metody patří ty, které nestanovují vlastní obsah patogena, ale posuzují jej z míry jeho vedlejších projevů: velikosti lézí, množství vyprodukovaných mykotoxinů či dalších sekundárních metabolitů, míry vlivu na výnos, apod. Nepřímými metodami jsou např.: vizuální hodnocení míry napadení, počítání hmotnosti tisíce zrn (HTZ) či stanovení obsahu příslušných mykotoxinů a dalších sekundárních metabolitů pomocí metod ELISA a HPLC. Pro správnou interpretaci výsledků je nutné, aby stanovené hodnoty korelovaly se skutečnou mírou napadení rostliny patogenem. Přímé metody kvantifikace stanovují přímo obsah patogena v pletivech hostitele. Kromě metody ELISA se dnes využívá řady metod molekulární biologie založených výhradně na polymerázové řetězové reakci (PCR) (Böhm et al., 1999; Bates et al., 2001; Fraaije et al., 2002; Schena et al., 2004). Doohan et al. (1999) použili techniku kompetitivní PCR s druhově specifickými primery ke kvantitativní detekci přítomnosti patogenů rodu Fusarium v pletivech pšenice (Triticum aestivum). Jako kompetitoru použili DNA o známé koncentraci izolovanou z mycelia patogena napěstovaného in vitro. Touž technikou stanovili Mahuku et al. (1995) obsah patogena Leptosphaeria maculans v pletivech řepky. Výhodou metody je její jednoduchost, nenáročnost na vybavení a nízká cena analýz, nevýhodou malá přesnost daná velikostí chyby při odečtu intenzit záření barviva ethidiumbromidu interkalovaného do PCR produktů po elektroforetické separaci v agarózovém gelu. Simpson et al. (2001) studovali závislost obsahu patogena a jím produkovaných toxinů v zrnu na množství použitých fungicidů mj. pomocí kvantitativní SYBRGreen real-time PCR. Tuto metodu popsal Hopwood et al. (1997) a je založená na sledování PCR reakce se specifickými primery v reálném čase. V každém cyklu reakce je detekován vzrůst fluorescence interkalačního barviva SYBRGreen při λ = 530 nm, který odpovídá rostoucímu počtu kopií amplikonu. Metoda je přesnější než kompetitivní PCR, neboť hodnoty fluorescence jsou odečítány CCD kamerou, nevýhodou je nutnost post amplifikačních kontrol přítomnosti nespecifických PCR produktů pomocí elektroforetické separace nebo analýzy disociačních křivek. Tato metoda byla použita např. ke stanovaní obsahu padlí travního (Erysiphe graminis) v listových pletivech pšenice (Triticum aestivum) (Fraaije et al., 2002) či patogena Pyrenophora graminea v zrnu ječmene (Hordeum vulgare) (Bates et al., 2001). Další metodou kvantifikace patogenů je opět real-time PCR se specifickými primery, kde jsou PCR produkty detekovány pomocí různých typů sond. Nejčastěji se využívají tzv. TaqMan sondy, což jsou oligonukleotidy, které se specificky hybridizují od oblasti mezi primery a tím zvyšují specifičnost reakce. Na 5 konci jsou značeny fluorescenční značkou (FAM, VIC, apod.) a na 3 konci je kovalentně navázán zhášeč fluorescence, kterým může být buď fluorescenční značka TAMRA nebo nefluorescenční kovalentně navázaný MGB (Minor Groove Binder) zhášeč. 5 3 exonukleázová aktivita Taq polymerázy v elongačních fázích PCR způsobuje degradaci sondy a tím dochází ke vzrůstu intenzity fluorescence, která je v každém cyklu PCR reakce detekována pomocí CCD kamery. Porovnáním odečtených hodnot Ct (Cycle treshold) s kalibrací lze stanovit kvantitativní zastoupení PCR produktu v reakční směsi. Böhm et al. (1999) použili tuto metodu ke stanovení rozsahu napadení pletiv hostitele patogeny rodu Glomus a Phytophtora. Bates and Taylor (2001) vyvinuli nový typ sondy pro real-time PCR, který využívá Scorpion Amplified Refractory Mutation System (ARMS) technologie. Jedná se vlastně o forward primer prodloužený přes interní zhášeč a nástavce tvořící vlásenku o sondu a fluorescenční značku FAM. Během reakce se uvolňuje vlásenka, sonda se rozbalí a hybridizuje se na nově se tvořící vlákno DNA. Dochází tak k oddálení fluoroforu od zhášeče. Uvolněné kvantum záření je detekováno CCD kamerou. Sonda byla vytvořena na základě 8

9 sekvence ITS oblasti hub Pyrenophora teres a Pyrenophora graminea, kde se v pozici 42 vyskytuje druhově specifická bodová mutace (SNP) (Stevens et al., 1998). Deoxythimidin-5 fosfát (T), specifický pro druh Pyrenophora teres, je umístěn na 3 konci forward primeru a tím je zaručena vysoká specifičnost reakce (Bates and Taylor, 2001). Výhodou metod real-time PCR s použitím sond je, že je možné provádět multiplexové analýzy, kdy jsou v reakci použity dvě sondy s různými fuorescenčními značkami (např. FAM a VIC). Je pak možno kvantifikovat zároveň obsah patogena i hostitelské DNA (Winton et al., 2002). Jako standardy se používají často DNA extrahované z nenapadené rostliny a čistého mycelia pěstovaného in vitro. Pro přesnější kvantifikaci se používají standardy, kdy je cílový fragment DNA klonován do plasmidu a amplifikován spolu se vzorky (Block and Schwarz, 2003; Reischer et al., 2004). MATERIÁL A METODY K vývoji diagnostických markerů bylo použito 80 izolátů hub Pyrenophora teres f. sp. teres, Pyrenophora teres f. sp. maculata, Pyrenophora graminea a Cochliobolus sativus. Primery a Taq Man sondy byly navrženy pomocí programu Primer Expres (Applied Biosystems) na základě publikovaných sekvencí (Leišová et al. 2005; Leišová et al. 2006). Inokulace u každého z patogenů byla provedena podle na pracovišti VÚRV zavedených protokolů. V případě listových pletiv napadených P. teres byl materiál zamražen a DNA byla izolována pomocí detergentu CTAB (Leišová et al. 2004). Koncentrace DNA byla zjištěna spektrofotometricky; vzorky byly naředěny na koncentraci 50ng DNA/μl. Jako výchozí pro získání diagnostických markerů byla zvolena metoda AFLP (Vos el al. 1995). Základem metody je aplikace restrikčních endonukleáz EcoRI a MseI na genomovou DNA patogena a provedení výběru restrikčních fragmentů tzv. selektivní amplifikací. Analýzou výsledků amplifikace metodou kapilární elektroforézy byly vytříděny fragmenty specifické vždy pro jeden druh rodu Pyrenophora. Fragmenty reprezentované nejvýraznějšími signály byly klonovány do ppcr-script Amp SK+ phagemidu (Stratagene) a sekvencovány. Na základě získaných sekvencí byly navrženy specifické primery a Taq Man sondy pro realtime PCR. Konvenční PCR reakce byly prováděny v cykleru Flexigene (Techne). Reakční směs o objemu 15μl obsahovala 0,33μM primerů, 0,25mM dntp, 1x pufr, 2,0mM MgCl 2, 1U Tth polymerázy (BioTools) a 100 ng templátové DNA. Reakční cyklus byl následující: 95 C 5min., 35 cyklů: 95 C, 30 sec., 50/60 C, 30 sec., 72 C, 40 sec. a na závěr 72 C, 5 min. Produkty reakce byly separovány elektroforeticky v 2,5% agarózovém gelu, vizualizovány ethidiumbromidem a detekovány pod UV lampou. Taq Man real-time PCR reakce byly prováděny v cykleru ABI PRISM 7700 podle protokolu PN (Applied Biosystems). PCR reakce byly prováděny jak v multiplexovém tak i v uniplexovém uspořádání. Taq Man MGB sondy pro detekci houbového patogena byly značeny fluorescenční barvou FAM a sondy detekující DNA rostliny fluorescenční barvou VIC. Pro kvantifikaci DNA rostlinného hostitele byly zvolen jednokopiový gen RacB. Primery a Taq Man MGB sondy byly navrženy pomocí programu Primer Expres na základě publikované sekvence (Schultheiss et al. 2002). Reakční směs o objemu 25 μl obsahovala 1 x PCR pufru, 4mM MgCl 2, 0,1mM (každého) datp, dgtp, dctp, 0,2mM dutp, 2,5U Gold Taq polymerázy, 0,3μM směsi primerů, 0,3μM Taq Man MGB sond značených fluorescenčními značkami fam a vic a 250ng templátové DNA. Reakce byly prováděny v optických PCR destičkách s optickými víčky v přístroji ABI PRISM Reakce obsahuje následující kroky: 2min. při 50 C, 10 min. při 95 C a 40 cyklů: 15 sec. při 95 C, 1 min. při 60 C. Ke sběru a analýze dat byl použit program 9

10 ABI PRISM 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems). Na základě nadefinovaných hodnot koncentrací DNA a zjištěných hodnot Ct reakcí s DNA ředicí řady směsi standardů byla vytvořena kalibrační křivka. Z rovnice kalibrační křivky byl vytvořen vzorec pro výpočet počátečního obsahu DNA z naměřených hodnot C T reakcí se vzorky. VÝSLEDKY A DISKUSE Korektní identifikace patogenů je důležitá pro kontrolu choroby, šlechtění na rezistenci a epidemiologické studie. Zvláště v případě houby Pyrenophora teres, kde křížení jejích dvou forem poskytuje genotypy projevující se intermediárními symptomy, které mohou být zaměnitelné s jinými patogeny, je nutná přesná diagnostika. V této práci se AFLP ukázala jako citlivá metoda, která dokázala rozlišit obě formy Pyrenophora teres. Podobně Williams et al. (2001) dospěli k názoru, že pomocí AFLP lze obě formy Pyrenophora teres rozlišit a určit spolehlivěji, než na základě symptomů. Přímé použití metody AFLP pro detekci a rozlišení patogenů je příliš zdlouhavé a finančně nákladné, proto byly některé z diagnostických markerů převedeny na tzv. STS (Sequence Tagged Site) markery. Optimalizovaná metodika byla použita k detekci obou forem Pyrenophora teres přímo v pletivech hostitele (Obr. 1). Obr 1 Výsledky amplifikace vzorků DNA z napadených listových pletiv s markerem PTM494d (velikostní standard 100bp, 1-70 vzorky, 71 pozitivní kontrola, 72 negativní kontrola). AFLP byla použita rovněž pro navržení primerů a TaqMan sond pro kvantitativní detekci Pyrenophora teres metodou real-time PCR. Metoda TaqMan real-time PCR byla zvolena zejména pro svou vysokou specifičnost, citlivost a přesnost. Existuje několik technik pro kvantifikaci fytopatogenních hub založených na konvenční PCR. Jsou však pracné a méně přesné, zejména proto, že během pozdějších cyklů klesá účinnost PCR reakce (Ginzinger, 2002). Ve stanovení pomocí real-time PCR je počet amplikonů detekován v časných cyklech, kdy je účinnost reakce stále konstantní (Schena et al., 2004). Počet cyklů PCR nutných k vygenerování fluorescenčního signálu, který statisticky významně převyšuje úroveň pozadí (Ct, Cycle treshold) je nepřímo úměrný logaritmu počátečního množství cílových sekvencí DNA. Otázka účinnosti reakce je v literatuře často diskutována (Block and Schwarz, 2003; Schena et al., 2004). V této práci byly účinnosti reakce počítány podle práce Blockové a Schwarze (2003). Ve všech stanoveních byly vysoké, s průměrnou hodnotou 95% a průměrnou standardní odchylkou mezi stanoveními 3,3%. Přesnost stanovení rovněž ovlivňuje volba standardů. Plasmidové standardy obsahující cílovou sekvenci DNA patogena či hostitele a mohou být amplifikovány zároveň se vzorky. Do reakce vstupují kopie plasmidů místo koncentrace DNA vzorku houby a rostliny zvolené 10

11 za standard. Tím dochází ke zpřesnění vstupní informace o počtu cílových kopií a následné kalibrační křivky. Směs plasmidových stadardů v poměru 1:1000 simulovala velmi zhruba poměr obsahu DNA patogena a hostitele v napadeném pletivu. Ředicí řada se sestávala z osmi vzorků směsi plasmidových standardů každý v poměru 1:1000 s koncentracemi od 10 do 10 8 počtu kopií plasmidu s DNA patogena a od 10 3 do počtu kopií plasmidů s DNA hostitele. Detekčním limitem TaqMan real-time PCR ve všech stanoveních bylo 5 kopií cílové DNA sekvence v reakci, podobně jako v práci Reischera et al. (2004). Optimalizovaná metodika poskytuje spolehlivá data v rozsahu šesti řádů vstupního počtu kopií cílové DNA sekvence. Pokud jsou v reakci dvě sondy značené různými fluorofory, je možno kvantifikovat simultánně DNA hostitele i patogena (Winton et al., 2002). V tomto případě detekce hostitelské DNA slouží jako interní pozitivní kontrola k odstínění odlišností daných extrakcí DNA a účinností reakce. Rovněž lze pak vyjádřit množství patogena jako míru napadení hostitele, což je z hlediska fytopatologické praxe výmluvnější. Kvantifikace a odhad míry napadení hostitele patogenem je nejatraktivnější aplikací realtime PCR přímo využitelnou v zemědělské praxi. Aplikací TaqMan technologie na vzorky odrůd ječmene pěstovaných v Kroměříži v letech 2003 a 2004 se ukázalo, že v těchto letech byl dominantní výskyt formy Pyrenophora teres f. sp. teres (Obr. 2) Obr. 2 Výskyt obou forem P. teres v roce 2003 (obr. vlevo) a 2004 (obr. vpravo) u 18 odrůd ječmene pěstovaných na lokalitě Kroměříž. cn(ptt,ptm)/cn(pt) Prestige Philadelphie Olbram Nordus Maridol Madonna Madeira Krona Jersey Forum odrůdy ječmene PTM/PT PTT/PT Atribut Annabel Akcent Primus Orthega Ladík Heris Saloon Sabel cn(ptm,ptt)/cn(pt) 12, ,0000 8,0000 6,0000 4,0000 2,0000 0,0000 PTM/PT PTT/PT Prestige Philadelphie Olbram Nordus Maridol Madonna Madeira Krona Jersey Forum Atribut Annabel odrůdy ječmene Akcent Primus Orthega Ladík Heris Saloon Sabel CI739 U několika odrůd ječmene byla sledována rychlost růstu a pronikání dvou izolátů Pyrenophora teres f. sp. teres a Pyrenophora teres f. sp. maculata v závislosti na genotypu hostitele (Obr 3). Obr 3 Detekce přítomnosti P. teres v listových pletivech ječmene v závislosti na době odběru vzorků. Počet kopií P. teres ve vzorku ,00 Forum Akcent ,00 Scarlett Beate CI , , , ,00 0,00 6 dpi 13 dpi 21 dpi Dny po infekci 11

12 Tato metoda může být využita rovněž ke studiu pronikání patogena do pletiv hostitelské rostliny za různých podmínek růstu, po aplikaci fungicidů apod. Např. nízký obsah DNA patogena v rezistentní rostlině by mohl být důsledkem účinné obrany rostliny a zastavení růstu houby. Přítomnost vysokého obsahu patogena v pletivech rezistentního hostitele svědčí spíše o toleranci než o opravdové rezistenci. V této práci byla nalezena statisticky významná korelace mezi hodnotami Ct a velikostmi symptomů na listech (R 2 = 0,52) pouze v počátečních stádiích infekce. V pozdějších stádiích velikost symptomů neodpovídá obsahu patogena, rozsah nekrotických pletiv bývá větší než skutečný obsah patogena. Tato skutečnost odpovídá i faktu, že Pyrenophora teres produkuje toxiny, které usmrcují buňky v okolí penetrujících hyf (Keon and Hargreaves, 1983). LITERATURA AFANASENKO O.S., HARTLEB H., GUSEVA N.N., MINARIKOVA V., JANOSHEVA M. (1995): A set of differentials to characterize populations of Pyrenophora teres Drechs. for international use. Journal of Phytopathology 143: ARABI M.I.E., JAWHAR M. (2003): In vitro quantification of barley reaction to leaf stripe. Plant Breeding 122: BATES J.A., TAYLOR E.J.A., KENYON D.M., THOMAS J.E. (2001): The application of real-time PCR to the identification, detection and quantification of Pyrenophora species in barley seed. Molecular Plant Pathology 2: BATES J.A., TAYLOR E.J.A. (2001): Scorpion ARMS primers for SNP real-time PCR detection and quantification of Pyrenophora teres. Molecular Plant Pathology 2: BLOCK A., SCHWARZ G. (2003): Validation of different genomic and cloned DNA calibration standards for construct-specific quantification of LibertyLink in rapeseed by real-time PCR. European Food Research and Technology 216: BÖHM J., HAHN A., SCHUBERT R., BAHNWEG G., ADLER N., NECHWATAL J., OEHLMANN R., OSWALD W. (1999): Real-time quantitative PCR: DNA determination in isolated spores of the mycorrhizal fungus Glomus mosseae and monitoring of Phytophthora infestans and Phytophthora citricola in their respective host plants. J. Phytopathol. 147: DOOHAN F.M., PARRY D.W., NICHOLSON P. (1999): Fusarium ear blight of wheat : the use of quantitative PCR and visual disease assessment in studies of disease control. Plant Pathol., 48: FRAAIJE B.A., BUTTERS J.A., COELHO J.M., JONES D.R., HOLLOMON D.W. (2002): Following the dynamics of strobilurin resistance in Blumeria graminis f.sp. tritici using quantitative allel-specific real-time PCR measurements with the fluorescent dye SYBR Green I. Plant Pathol., 51: HO K.M., TEKAUZ A., CHOO T.M., MARTIN R.A. (1996): Genetic studies on net blotch resistance in a barley cross. Canadian Journal of Plant Science 76: HOPWOOD A., OLDROYD N., FELLOWS S., WARD R., OWEN S.A., SULLIVAN K. (1997): Rapid quantification of DNA samples extracted from buccal scrapes prior to DNA profiling. Biotechniques, 23: KEON J.P.R., HARGREAVES J.A. (1983): A cytological study of the net blotch disease of barley caused by Pyrenophora teres. Physiological Plant Pathology 22:

13 LEIŠOVÁ L., KUČERA L., MINAŘÍKOVÁ V., OVESNÁ J. (2005): AFLP-based PCR markers that differentiate spot and net forms of Pyrenophora teres. Plant Pathology 54: LEISOVA L., MINARIKOVA V., KUCERA L., OVESNA J. (2006): The quantification of Pyrenophorat teres in infected barley leaves using real-time PCR. Journal of Microbiological Methods (in press). MAHUKU G.S., GOODWIN P.H., HALL R. (1995): A competitive polymerase chain reaction to quantify DNA of Leptosphaeria maculans during blackleg development in oilseed rape. MPMI, 8, 5: MUGNIER J. (1995): Les taches brunes des orges Une nouvelle approche du diagnostic de l Helminthosporiose : la PCR. Phytoma 469: PELTONEN S., JALLI M., KAMMIOVIRTA K., KARJALAINEN R. (1996): Genetic variation in Drechslera teres populations as indicated by RAPD markers. Annual of Applied Biology 128: REISCHER G.G., LEMMENS M., FARNLEITNER A., ADLER A., MACH R.L. (2004): Quantification of Fusarium graminearum in infected wheat by species specific real-time PCR applying a TaqMan probe. Journal of Microbiological Methods 59: REEVES J.C., BALL S.F.L. (1991): Research note: Preliminary results on the identification of Pyrenophora species using DNA polymorphisms amplified from arbitrary primers. Plant Varieties and Seeds 4: SCHENA L., NIGRO F., IPPOLITO A., GALLITELLI D. (2004): Real-time quantitative PCR: a new technology to detect and study phytopathogenic and antagonistic fungi. European Journal of Plant Pathology 110: SIMPSON D.R., WESTON G.E., TURNER J.A., JENNINGS P., NICHOLSON P. (2001): Differential control of head blight pathogens of wheat by fungicides and consequences for mycotoxin contamination of grain. Europ. J. Plant Pathol., 107: SMEDEGÅRD-PETERSEN V. (1971): Pyrenophora teres f. maculata f. nov. and Pyrenophora teres f. teres on barley in Denmark. In: Yearbook of the Royal Veterinary and Agricultural University, Copenhagen, TAYLOR E.J.A., STEVENS E.A., BATES J.A., MORREALE G., LEE D., KENYON D.M., THOMAS J.E. (2001): Rapid-cycle PCR detection of Pyrenophora graminea from barley seed. Plant Pathology 50: VOS P., HOGERS R., BLEEKER M., REIJANS M., VAN DE LEE T., HORNES M., FRIJTERS A., POT J., PELEMAN J., KUIPER M., ZABEAU M. (1995): AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Research 23: WILLIAMS K.J., SMYL C., LICHON A., WONG K.Y., WALLWORK H. (2001): Development and use of an assay based on the polymerase chain reaction that differentiates the pathogens causing spot form and net form of net blotch of barley. Australasian Plant Pathology 30: WINTON L.M., STONE J.K., WATRUD L.S., HANSEN E.M. (2002): Simultaneous one-tube quantification of host and pathogen DNA with real-time polymerase chain reaction. Phytopathology 92: PODĚKOVÁNÍ Tato práce byla financována Národní agenturou pro zemědělský výzkum, projekt č. QC1361 a Grantovou agenturou ČR projekt č. 521/06/

14 Určení a hodnocení padlí travního (Blumeria graminis f. sp. tritici; anamorph Erysiphe graminis) na pšenici. Lubomír Věchet Výzkumný Ústav Rostlinné výroby, Drnovská 507, Praha 6 - Ruzyně vechet@vurv.cz Padlí travní je řazeno do podtřídy Ascohymenomycetes, řádu Erysiphales. Padlí jsou závazní patogeni cévnatých rostlin. Jsou známy svou specializací na určité rody nebo druhy hostitelů a jsou u nich známy speciální formy (Urban & Kalina, 1977). Určení padlí travního je možné podle typických příznaků na listu (Obr. 1.2.) nebo i klasu (Obr. 4) pšenice. Padlí travní tvoří kupky bílého až šedého, vatovitého mycelia, příznaky ve formě kupek na listech nebo klasu pšenice. To je nepohlavní stádium patogena. Kupky jsou tvořeny povrchovým myceliem. Na něm se vytváří konidiofory (nosiče konidií). Z nich vyrůstají krátká vlákna (Obr. 3), která se začnou od konce přehrádkovat (bazální část vlákna má schopnost částečně dorůstat). Obr. 1. Pšenice ozimá Ulka (Věchet, 2006). Obr. 2. Akteur x Caphorn,2006 (Věchet, 2006). 14

15 Obr. 3. Padlí travní na pšenici ozimé Kanzler, listový segment (Věchet, 2004). Obr. 4. Padlí travní v klasu. Pšenice ozimá Kanzler (Věchet, 2005). 15

16 Vzniká tak řetízek soudečkovitých konidií, přičemž nejstarší je umístěna nejdále od báze vlákna. Koncem vegetace nebo při zvýšených teplotách i dříve, dochází k pohlavnímu rozmnožování padlí. V myceliu se tvoří černé plodničky, kleistotecia (Obr. 5). Uvnitř jsou vějířovitě umístěná vřecka, přirostlá k bázi. U padlí travního je v kleistoteciu více vřecek. Je to přezimující stádium této houby. Pod mikroskopem můžeme pozorovat vývojová stádia této houby. Vývoj je určen teplotou prostředí a odolností rostliny. Charakteristická stádia vývoje jsou klíčení konidie (kolem čtvrté hodiny po dosednutí konidie na list (Obr. 6), tvorba apresoria (přísavky, terčovitě rozšířená část hyfy přitisknutá na buňku; z ní zpravidla vyrůstá infekční hyfa pronikající do buňky) (14-18 hod.). Sledování tvorby haustoria, orgán vyrůstající z hyfy a pronikající do buňky jako kyjovitý nebo jinak tvarovaný výběžek určený k absorpci živin (kolem 24. hod.). Jeho pozorování je však náročnější na techniku mikroskopování. Asi po 46 hod. od infekce se začne vytvářet sekundární hyfa, která se asi za 4-6 hod. větví a mění se v prodlouženou Obr. 5. Kleistotecia padlí travního na pšenici ozimé; odrůda Ludwig (Věchet, 2005). sekundární hyfu. Kolem 72 hod. se počínají tvořit konidiofory a diferencované konidie jsou vytvořeny asi ve hod. po inokulaci. Tyto časové údaje jsou pouze orientační, neboť odpovídají specifickým podmínkám sledovaní (listové segmenty a řízené podmínky). K odhadování nebo určení stupně napadení, to je pokryvnosti listu kupkami padlí travního se užívá řada stupnic, jednak s numerickým vyjádřením nebo s grafickým vyjádřením. V poslední době se používají spíše podrobnější stupnice. Příkladem může být devítibodová stupnice (Obr. 7) Saari & Prescott (1975), kde stupeň 9 znamená pokrytí listu 0 a stupeň 1 pokrytí listu 75% a více. 16

17 Obr. 6. Infekční struktury padlí travního na pšenici (Blumeria graminis f.sp. tritici). Klíčí konidie (4. hod. po inokulaci), apresorium s infekčním klíčkem (18. hod. po inokulaci), konidie s apresoriem a počátkem sekundární prodloužené hyfy (46. hod po inokulaci) (Věchet, 2004). Obr. 7. Stupnice k odhadování stupně napadení porostu ječmene padlím travním (Saari & Prescott 1975). 17

18 Na závěr je možné říci, že příznaky padlí travního jsou tak typické, že určení choroby nedělá obvykle potíže. LITERATURA SAARI E.E., PRESCOTT J.M. /1975): A scale for appraising the foliar intensity of winter wheat diseases. Plant Disease Reporter, 595: URBAN Z., KALINA T. (1977): Sinice, řasy, houby. Systém a vývoj. Katedra botaniky přírodovědecké fakulty Univerzity Karlovy Praha Tento výzkum byl podporován výzkumným záměrem MZE ČR č

19 Původci listových skvrnitostí v ČR Alena Hanzalová, Jana Šárová Výzkumný ústav rostlinné výroby, Drnovská 507, Praha 6 Ruzyně hanzalova@vurv.cz Mezi nejvýznamnější původce listových skvrnitostí pšenice patří Phaeosphaeria nodorum (anam. Stagonospora nodorum), Mycosphaerella graminicola (anam. Septoria tritici) a Pyrenophora tritici-repentis (anam. Drechslera tritici-repentis). Dříve v našich podmínkách převažovala Phaeosphaeria nodorum, v posledních několika letech se však vyskytuje hojně i P. tritici-repentis a M. graminicola. V rámci pětiletého monitoringu byly každoročně získány vzorky listových skvrnitostí z různých okresů v ČR. V letech 2000, 2003 a 2004, 2005 převládala ve vzorcích P. triticirepentis, která je původcem hnědé skvrnitosti pšenice zvané tan spot. V roce 2001 a 2002 se nejhojněji vyskytovala ve vzorcích M. graminicola. P. nodorum byla ve sledovaném období též izolována poměrně často. Výskyt zjištěných původců listovách skvrnitostí Didymella exitialis, Cochliobolus sativus a Ascochyta sp. byl do 10%, pouze v roce 2001 byla D. exitialis zaznamenána poměrně hojně, ale většina autorů ji považuje za sekundárního patogena. C. sativus preferuje spíše teplé a vlhké klima, v ČR se vyskytoval ojediněle. Frekvence jednotlivých patogenů byla ovlivněna průběhem počasí v jednotlivých letech a na jednotlivých lokalitách a také obdobím sběru vzorků. V jarním období většinou v porostech převládala M. graminicola, teprve později se v případě příznivých klimatických podmínek rozvinula infekce P. tritici-repentis a P. nodorum. Obecně lze však říci, že tyto tři patogenní druhy převládají i v jiných evropských státech (Bankina 2001, Csösz 2001). Pyrenophora tritici-repentis byla zjištěna v ČR v roce 1967 (Benada a kol. 1967), další zmíňka o výskytu tohoto patogena je však až z roku 1997 (Vícha 1998). Od té doby byl výskyt P. tritici-repentis pozorován v ČR každoročně (Šárová a kol. 2003a). Její význam v ČR i v celé Evropě roste je jí věnována v tomto příspěvku větší pozornost. Pyrenophora tritici-repentis má široký okruh hostitelů a byla vedle pšenice izolována i z mnoha druhů trav v různých zemích světa. Na listech náchylných odrůd pšenice způsobuje drobné skvrny světlehnědé barvy, později se léze prodlužují a vytváří se chlorotický okraj s typickým typický tmavým středem. Na rezistentních nebo částečně rezistentních odrůdách pšenice tvoří patogen podstatně menší tmavě hnědé léze, chlorózy a nekrózy mohou zcela chybět. V současné době je popsáno 8 ras tohoto patogena, které jsou determinovány na základě virulence/avirulence k testovacímu sortimentu odrůd (Strelkov a Lamari 2003). V ČR je dominantní rasa 1. Jednotlivé rasy jsou schopny produkovat hostitelsky specifické toxiny, zatím byly identifikovány čtyři - Ptr ToxA, B, C, D. Rasové spektrum bylo více studováno především v Severní Americe, kde stejně jako u nás převažuje rasa 1. Vzrůstající tendence výskytu se začíná projevovat u rasy 2. Nejvhodnější metodou ochrany proti listové skvrnitosti je šlechtění na rezistenci. Rezistence odrůd ozimé a jarní pšenice vůči P. tritici-repentis má kvantitativní nebo kvalitativní charakter. Ve skleníkových podmínkách ukazují reakce sledovaných odrůd ke směsi ras (Tab.1) velký počet odrůd s mírně náchylnou až mírně rezistentní reakcí. Odrůdy Clarus, Rheia, Cubus, Šárka, Vlasta a Dromos měly rezistentní reakci. Většina odrůd pšenice nese střední rezistenci vůči patogenu, vysoká úroveň rezistence je spíše ojedinělá. Neexistuje však žádná odrůda, která by byla zcela bez příznaků onemocnění, tedy bez symptomů. 19

20 V polních podmínkách se jeví jako rezistentní odrůdy ozimé pšenice registrované v ČR odrůdy Vlasta, Rialto, Athlet, Trane, Siria, Vega, Alana a Samara. Naopak odrůdy Ina, Bruta, Samanta, Mona a Boka vykazovaly poměrně vysokou náchylnost vůči P. tritici-repentis (Šárová a kol. 2003b). Tab.1: Reakce odrůd zimní pšenice k Pyrenophora tritici-repentis ve skleníkových podmínkách. Odrůda/linie Reakce k PTR Odrůda/linie Reakce k PTR Clarus R Etela (HE 6130) MR-MS Rheia R Ludwig MR-MS Cubus R Apache MR-MS SHMK WW R Rapsodia MR-MS Šárka R Banquet MR-MS Vlasta R Floret (PBIS 01/1035) MR-MS Dromos (SWS ) R Complet MR-MS Buteo (LP ) MR-MS Drifter MR-MS Alana MR-MS Meritto MR-MS Grandios MR-MS Akteur MR-MS Alibaba MR-MS Bill MR-MS CEBECO 0104 MR-MS PBIS 01/1034 MR-MS LP MR-MS Batis MR-MS Simila (SG-S ) MR-MS Nela MR-MS Globus MR-MS Samanta MR-MS Semper MR-MS Versailles MR-MS MR-MS CEBECO 0306 MR-MS CEBECO 0207 MR-MS Caphorn S Mladka MR-MS Corsaire S SG-RU 370 MR-MS Karolinum S Darwin MR-MS Heroldo (PBIS 00/91) S Ebi MR-MS Hedvika S Ilias MR-MS Biscay S SG-U 7125 MR-MS Svitava S Sulamit MR-MS Barroko (PBIS 00/140) S R rezistentní reakce, MR-MS mírně náchylná až mírně rezistentní reakce, S náchylná reakce 20

21 Stupnice pro hodnocení reakce odrůd ozimé pšenice k PTR ve skleníkových podmínkách 1. malé, tmavě hnědé až černé skvrny bez okolní chlorózy a světle hnědé nekrózy rezistentní (R) 2. malé tmavě hnědé až černé skvrny s velmi malými chlorózami a nekrózami mírně rezistentní (R) 3. malé tmavě hnědé až černé skvrny úplně obklopené výrazným chlorotickým nebo nekrotickým kruhem, léze vesměs nesplývají mírně rezistentní až mírně náchylný (S) 4. malé tmavě hnědé až černé skvrny úplně obklopené chlorotickou nebo nekrotickou zónou, některé léze splývají mírně náchylný (S) 5. tmavě hnědé až černé středy mohou nebo nemusí být rozpoznatelné, většina lézí se skládá ze splynutých chlorotických nebo nekrotických zón náchylný (S) 21

22 Procenta napadení při hodnocení v polních podmínkách LITERATURA BANKINA B. (2001): Some aspects of wheat leaf diseases epidemiology in Latvia, In: Book of Abstracts, Conference Healthy Cereals in Kroměříž, p. 53. BENADA J., ŠEDIVÝ J., ŠPAČEK J. (1967): Atlas chorob a škůdců obilnin. 218 p., Praha. CSÖSZ M. (2001): Incidence of saprophytic and necrotrophic pathogens on wheat in Hungary in In: Book of Abstracts, Conference Healthy Cereals in Kroměříž, p. 46. STRELKOV S. E., LAMARI L. (2003): Host-parasite interactions in tan spot [Pyrenophora tritici-repentis] of wheat. Can. J. Plant Pathol. 25: ŠÁROVÁ J., HANZALOVÁ A., BARTOŠ P. (2003a): Incidence of wheat leaf spot pathogens in the Czech Republic. Cereal Research Communications 31: ŠÁROVÁ J., ŠÍP V., HANZALOVÁ A. (2003b): Response of winter wheat cultivars to artificial infection with Pyrenophora tritici-repentis in field conditions. Plant Protection Science 38(2): VÍCHA Z. (1998): Listová skvrnitost pšenice Helminthosporium tritici vulgaris Nisikado. Agro 5: 10. Práce vznikla za podpory projektů MZE NAZV 1G a výzkumného záměru MZE

23 Klasové fuzariózy u pšenice Jana Chrpová, Václav Šíp, Eliška Sychrová, Eva Matějová Výzkumný ústav rostlinné výroby, Drnovská 507, Praha 6 - Ruzyně chrpova@vurv.cz Klasové fuzariózy, které jsou ve sledovaných podmínkách působeny převážně druhy Fusarium graminearum (Schwabe) a Fusarium culmorum (W.G. Smith) Sacc., patří k nejškodlivějším chorobám ovlivňujícím výnos a jakost zrna. Závažnou skutečností je též produkce sekundárních metabolitů mykotoxinů. Obsah mykotoxinů je nově sledovaným parametrem pro nákup produkce obilovin. Limity maximálního obsahu fuzariových toxinů v obilovinách podle nařízení komise (ES) č.466/2001 (včetně novely nařízení č.856/2005) jsou následující: deoxynivalenol (DON) 1,25 mg/kg; zearalenon (ZEA) 0,1 mg /kg pro nezpracované obiloviny kromě pšenice tvrdé, ovsa a kukuřice s účinností od Tyto limity byly uplatňovány již od počátku intervenčního nákupu, tj. od Mykotoxiny bezprostředně ohrožují hygienickou kvalitu zrna. Uplatnění kontaminovaného zrna pro výrobu potravin nebo krmiv se jeví jako velmi problematické. Výskyt fuzarióz na území České republiky je sledován v rámci studie prováděné ve spolupráci se Státní rostlinolékařskou správou. V současné době jsou k dispozici výsledky získané sběrem klasů podezřelých z napadení fuzariózou klasu, který probíhal ve třech ročnících ( ) Analýza obsahu DON u získaných vzorků (celkový počet 916) byla provedena metodou ELISA s využitím RIDASCREEN R FAST DON kits (R-Biopharm GmbH, Darmstadt, Germany). Přesná determinace druhů rodu Fusarium v klasech je možná (jen) mikroskopicky (a někdy i s následnou kultivací). Mykologické analýzy odhalily převažující výskyt F. graminearum, dále F. avenaceum, F. culmorum, a F. poae. Byla zjištěna statisticky významná korelace (r=0,65) mezi hodnocením symptomů v odebraných klasech a zjištěným obsahem DON. V současné době probíhají analýzy divergence zjištěných patogenů na molekulární úrovni, zkoušky patogenity a hodnocení získaných izolátů v polních podmínkách. Na základě vyhodnocení získaných údajů s ohledem na ročník, oblast, odrůdu, předplodinu a zpracování půdy bylo zjištěno, že k variabilitě obsahu DON v zrnu přispívá z 49 % ročník a lokalita, pak následuje odrůda (34 %) a způsob pěstování (zpracování půdy, předplodina -17 %). Byly detekovány oblasti s vysokým rizikem kontaminace zrna mykotoxiny (jižní a východní Morava). Významně vyšší obsah DON byl zjištěn u vzorků z porostů pěstovaných po kukuřici (průměrný obsah DON 6,54 mg/kg; celkový obsah DON 2,55 mg/kg) a po aplikaci minimalizačního zpracování půdy (3,54 mg/kg). Nejvyšší obsah DON (10,84 mg/kg) byl zjištěn po kukuřici, kdy byla zároveň použita minimalizace. Bylo potvrzeno, že cílená aplikace fungicidů ve vhodnou dobu a v doporučné dávce snižuje obsah DON v průměru o 50 %, avšak při nedodržení termínu a dávky je fungicidní ochrana neúčinná. V rámci četněji zastoupených odrůd (>15) Nela, Alana, Šárka a Ebi vykazovaly průměrný obsah DON nižší než 1,25 mg/kg (limitní hodnota), zatímco u odrůd Drifter, Complet, Alibaba a Clarus byl zjištěn průměrný obsah DON vyšší než 4,5 mg/kg. Boj proti této závažné chorobě je založen na agrotechnických opatřeních, fungicidní ochraně, pěstování odrůd s vyšší odolností ke klasové fuzarióze a k akumulaci mykotoxinů, pozornost se věnuje i možnostem biologické ochrany. Ochranná opatření by měla vycházet z podmínek příslušného ročníku, při rozhodování o aplikaci fungicidu je třeba brát v úvahu předplodinu, způsob zpracování půdy i to, zda v dané oblasti již byly problémy s nadlimitním obsahem mykotoxinů. V problematických oblastech je vhodné volit odrůdu s vyšší odolností. Fungicidy na bázi tebuconazole a metconazole potlačují projevy fuzariózy klasu a tvorbu mykotoxinů, nejsou však účinné za všech okolností. Nyní jsou k dispozici i fungicidy na bázi prothioconazole s vyšší účinností, přesto je zřejmé, že ke snížení rizik je třeba použít komplex 23

24 opatření. V pokusech prováděných ve VÚRV byla po fungicidním ošetření u rezistentních odrůd dosažena 89 % redukce obsahu DON a 96 % redukce obsahu patogena. K omezení ztrát v rizikových oblastech a po rizikových předplodinách (především kukuřice) by nepochybně měla přispět volba odrůd s vyšším stupněm rezistence, dle možností v kombinaci s fungicidní ochranou. Tvorba odrůd s vyšší odolností k fuzarióze klasu je jedním ze šlechtitelských cílů. V českém šlechtění pšenice je věnována pozornost jak využití adaptovaných zdrojů s mírnou rezistencí, tak i využití vzdálených zdrojů s vysokou rezistencí (Sumai 3, Nobeoka Bozu,). V současné době je možné využít nově odvozené QTL markéry, které byly detekovány na různých chromozomech (velký efekt na redukci obsahu DON byl zaznamenán na 3B a 5A). Důležitou roli ve šlechtitelském procesu hraje testování rezistence k této chorobě. Hodnocení rezistence probíhá na šlechtitelských pracovištích většinou od generace F4-F6. Pokročilé šlechtitelské materiály jsou spolu se zdroji rezistence, vybranými registrovanými odrůdami a kontrolními odrůdami hodnoceny ve spolupráci VÚRV se šlechtitelskými pracovišti v kruhových testech, které v současné době probíhají na 9 stanovištích. Je sledována reakce na umělou infekci prováděnou postřikem inokula do klasů v době květu u odrůd pšenice, novošlechtění a u zdrojů rezistence. V současné době je při testech využíváno F. culmorum, izolát B. V budoucnu bude nepochybně třeba zohlednit ve šlechtění na rezistenci převládající výskyt druhu Fusarium graminearum na našem území a na základě provedených analýz vybrat vhodný izolát tohoto druhu. Pro podporu rozvoje infekce je používána mikrozávlaha. K objevení prvních symptomů, kterými jsou drobné nevýrazné skvrnky na plevách nebo bělení květních obalů až celých klásků u pšenic, obvykle dochází 7-10 dní po infekci. Symptomy a jejich rozvoj jsou zaznamenávány 14., 21. a 28. den po infekci. Při hodnocení je používána 9 bodová stupnice, kterou využívá ÚKZÚZ. Při hodnocení odolnosti je kromě hodnocení rozvoje choroby v klase za důležitý znak považováno i % fuzariózou poškozených zrn. Tento znak vysoce významně koreluje s obsahem DON. Pro stanovení rezistence odrůd je nezbytné opakované hodnocení rezistence i testování na více lokalitách. Získané výsledky dokumentují závažnost sledované choroby i nutnost věnovat se dále problematice klasových fuzarióz. Jako účinný se jeví komplexní přístup ke ochranným opatřením proti této chorobě. Povzbuzující je zjištěná vyšší úroveň rezistence především u některých registrovaných odrůd a novošlechtění procházejících registračním řízením (Obr. 1). Rozšíření odrůd s vyšší rezistencí k fuzarióze klasu by spolu s dalšími opatřeními mělo přispět ke snížení rizika kontaminace mykotoxiny. 24