Vyhodnocení aktivity potenciálně antibakteriálních látek pomocí mikrodiluční bujónové metody

Transkript

1 Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové katedra biologických a lékařských věd Vyhodnocení aktivity potenciálně antibakteriálních látek pomocí mikrodiluční bujónové metody (diplomová práce) Vedoucí diplomové práce: Mgr. Marcela Vejsová, Ph.D. Hradec Králové, 2013 Bc. Anna Drbohlavová

2 Prohlašuji, že tato diplomová práce je mým původním autorským dílem a veškeré myšlenky, data a jejich zdroje, z nichž jsem pro zpracování čerpala, řádně cituji. Práce nebyla využita k získání jiného nebo stejného titulu. V Hradci Králové dne Bc. Anna Drbohlavová 2

3 Poděkování Tímto bych chtěla poděkovat Mgr. Marcele Vejsové, Ph.D. za odborné vedení a věcné připomínky k obsahové i formální stránce diplomové práce. Rovněž bych jí chtěla poděkovat za její trpělivost, ochotu a veškerý čas, který mně a mé práci věnovala. Můj dík také patří vždy příjemně naladěné a rovněž velmi ochotné paní laborantce Idě Dufkové, s jejíž pomocí mi bylo umožněno zpracování testovaných látek na katedře biologických a lékařských věd Farmaceutické fakulty v Hradci Králové a získání tak cenných výsledků pro tuto práci. Děkuji také prof. RNDr. Jarmile Vinšové, CSc, Mgr. Martinu Krátkému, Ph.D., prof. PharmDr. Martinu Doležalovi, Ph.D. a Mgr. Ondřeji Janďourkovi za poskytnutí testovaných látek. Neméně si pak cením a touto cestou také děkuji své rodině a přátelům za jejich podporu a velkou dávku trpělivosti, kterou mi po celou dobu poskytovali. 3

4 ABSTRAKT Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biologických a lékařských věd Kandidát: Bc. Anna Drbohlavová Školitel: Mgr. Marcela Vejsová, Ph.D. Název diplomové práce: Vyhodnocení aktivity potenciálně antibakteriálních látek pomocí mikrodiluční bujónové metody Cíl práce V současné době představuje výskyt rezistentních kmenů bakterií již celosvětový problém, který se týká každého z nás. Jedním ze způsobů, jak čelit této problematice, je vývoj nových účinných antibakteriálních preparátů. Cílem diplomové práce bylo otestovat 70 takovýchto potenciálních léčiv a zjistit jejich antibakteriální aktivitu vůči vybraným kmenům bakterií. Metody Pomocí mikrodiluční bujónové metody byly sledovány minimální inhibiční koncentrace testovaných látek, ovlivňující růst osmi nejběžnějších podmíněně patogenních bakterií, včetně významných rezistentních kmenů MRSA a Klebsiella pneumoniae produkující širokospektré beta-laktamázy. Výsledky Testované látky byly podle chemické struktury rozděleny do osmi skupin a následně porovnán jejich účinek na testované kmeny. Nejúčinnější skupinu představovala skupina salicylanilidu a jeho derivátů. Zároveň byl diskutován vliv chemické struktury a tvorba sraženiny v růstovém médiu těchto látek na jejich účinek. 4

5 Závěry Z celkového počtu testovaných látek byl pozorován antibakteriální účinek u 14 z nich. Tyto látky se objevovaly pouze ve skupinách salicylanilidu a jeho derivátů, sulfonamidů a benzylaminopyrazinů. Na účinnost chemicky příbuzných látek má bezesporu vliv charakter a poloha navázaných substituentů. Z testovaných kmenů se grampozitivní bakterie ukázaly jako citlivější. Nejcitlivějším kmenem byl S. aureus. Klíčová slova: rezistence, antimikrobiální látky, mikrodiluční bujónová metoda, minimální inhibiční koncentrace 5

6 ABSTRACT Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Biological and Medical Sciences Candidate: Bc. Anna Drbohlavová Supervisor: Mgr. Marcela Vejsová, Ph.D. Diploma thesis title: Evaluation of activity of potentional antibacterial substances through the use of microdilution broth method Objective The occurrence of resistant bacteria strains is the global problem today, which influences everyone s life. One of the way, how to solve this problem, is to develop new effective antibacterial substances. The goal of the diploma thesis was to test 70 potencial medical drugs and find out their antibacterial activity against selected bacteria strains. Methods The minimal inhibitory concentrations of tested substances, affecting the growth of the most common 8 conditionally pathogenic bacteria, including significant resistant strains such as MRSA and Klebsiella pneumoniae producing extended specter beta lactamase, were monitored by microdilution broth method. Results Tested substances were divided into eight groups according to their chemical structure and then their antibacterial effect was compared. The most effective group was presented by salicylanilide and its derivates. The influence of the chemical structure and production of clot in growth medium of these substances on their effect was discussed as well. 6

7 Conclusions Antibacterial effect of 14 substances was noticed from all tested potencial drugs. They belong primarly just into three groups: salicylanilide and its derivates, sulphonamides and benzylaminopyrazines The effectivity of substances from the same chemical group was influenced by kind and position of bound substituents. Grampositive bacteria were more sensitive than gramnegative ones. The most sensitive was S. aureus. Key words: resistance, antimicrobial substances, microdilution broth method, minimal inhibitory concentration 7

8 OBSAH OBSAH... 8 SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK ÚVOD Zadání práce cíl práce TEORETICKÁ ČÁST Éra antibiotik Antibiotika vs. antimikrobiální látky Mechanizmus účinku antibiotik Látky zasahující do syntézy buněčné stěny bakterií Látky ovlivňující buněčnou membránu Látky zasahující do syntézy bílkovin Látky ovlivňující metabolizmus nukleových kyselin Látky ovlivňující intermediární metabolizmus bakterií Přehled antibiotik Beta-laktamová antibiotika Tetracykliny Aminoglykosidy Makrolidy Linkosamidy Amfenikoly Polypeptidová antibiotika Glykopeptidová antibiotika Ansamycinová antibiotika Kyselina fusidová Sulfonamidy a pyrimidiny

9 Nitroimidazoly Nitrofurany Chinolony Ostatní chemoterapeutika antituberkulotika Nově vyvíjená antibiotika Druhá tvář antibiotik Antimikrobiální rezistence Testované kmeny Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Enterococcus sp Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Pseudomonas aeruginosa Metody využívané k testování citlivosti kmenů na antibiotika Kvalitativní metody Kvantitativní metody Ostatní metody EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST Pomůcky Přístroje Chemikálie Testované koncentrace látek [µmol.l -1 ] Testované kmeny bakterií Postup Příprava růstového média Příprava suspenzí testovaných kmenů bakterií Příprava ředící řady testované látky

10 Pipetování do destičky Vyhodnocení Přehled testovaných skupin látek Fenylaminopyraziny Fenylaminopyrazin-2,3-dikarbonitrily Benzylaminopyraziny Benzylaminopyrazin-2,3-dikarbonitrily Itakonamidy Salicylanilid a jeho deriváty Sulfonamidy Ostatní VÝSLEDKY Fenylaminopyraziny Fenylaminopyrazin-2,3-dikarbonitrily Benzylaminopyraziny Benzylaminopyrazin-2,3-dikarbonitrily Itakonamidy Salicylanilid a jeho deriváty Sulfonamidy Ostatní testované látky DISKUZE ZÁVĚR POUŽITÁ LITERATURA SEZNAM OBRÁZKŮ SEZNAM TABULEK

11 Seznam použitých zkratek AMC AZT CAZ CCM CLSI DAEC DDST DMSO EAEC EAggEC EC EF EHEC EIEC EPEC ESBL ETEC EUCAST GRSA IDSA IZ KP KP-E MBC MH MHB MIC MRSA MW ampicilin/kyselina klavulánová aztreonam ceftazimid česká sbírka mikroorganizmů (z angl. Czech Collection of Microorganisms) Clinical and Laboratory Standards Institute difúzně adherentní E. coli double disc synergy test dimethylsulfoxid enteroadherentní E. coli enteroagregativní E. coli Escherichia coli Enterococcus faecalis enterohemorhagická E. coli enteroinvazivní E. coli enteropatogenní E. coli širokospektré beta-laktamázy (z angl. extended specter beta lactamase enterotoxigenní E. coli European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing glykopeptid rezistentní S. aureus Infectious Diseases Society of America inhibiční zóna Klebsiella pneumoniae Klebsiella pneumoniae ESBL minimální baktericidní koncentrace Mueller-Hinton Mueller-Hinton bujón minimální inhibiční koncentrace methiciclin rezistentní S. aureus molekulová hmotnost [g/mol] 11

12 OXA oxacilin PA Pseudomonas aeruginosa PBP penicilin binding proteins PCR polymerázová řetězová reakce SA Staphylococcus aureus SE Staphylococccus epidermidis STEC shiga-like toxigenní E. coli TSST-1 toxin syndromu toxického šoku 1 UPEC uropatogenní E. coli VRSA vankomycin rezistentní S. aureus 12

13 1. Úvod Mikroorganizmy bezpochyby představují nedílnou součást našeho života od jeho vlastního počátku, a to nejen z hlediska evoluce, ale i našeho života jako takového. Jsou všude kolem nás a dokonce i v nás, kde tvoří tzv. přirozenou mikroflóru. Její význam mj. spočívá především ve schopnosti chránit naše tělo před usídlením patogenních mikroorganizmů a stimulovat imunitní systém. Bakterie pro nás tedy představují nejen užitečného pomocníka a nepostradatelného souputníka, ale existuje celá řada patogenních jedinců, kteří jsou schopni u člověka vyvolat závažné infekce a jeho život tak naopak smrtelně ohrozit. Objev penicilinu a všeobecně vývoj antibiotik představoval ohromný pokrok v boji proti těmto onemocněním a dal lidstvu bohužel falešnou naději, že hrozba smrtelných infekcí bude brzy patřit minulosti. Nadměrné užívání a především zneužívání antibiotických preparátů však následně vedlo k rozvoji bakteriálních kmenů rezistentních vůči daným antibiotikům a problematika infekčních onemocnění zůstala tak stále aktuální. V současné době představuje výskyt rezistentních kmenů bakterií stále větší zdravotnický problém nejen z důvodu omezení a zhoršení možnosti léčby a snížení kvality života, ale má také závažné hospodářské důsledky v podobě nárůstu nákladů na zdravotní péči a poklesu produktivity (internet 1). Existuje několik způsobů, jak tomuto nepříznivému trendu čelit. Patří mezi ně především všeobecné snížení spotřeby antibiotik jdoucí ruku v ruce s racionálním způsobem jejich užívání, dále pak vzdělávání široké veřejnosti týkající se této problematiky a stejně tak je nutné nezapomínat na preventivní opatření vzniku onemocnění mající svůj základ v prostém dodržování hygieny rukou, která je jedním ze základních kroků v prevenci nozokomiálních infekcí, u nichž právě multirezistentní kmeny hrají významnou roli (internet 1). Jednou z dalších možností alespoň dočasného snížení negativních důsledků ve vývoji rezistence je hledání a rychlé klinické uplatnění nových látek s antibakteriálním účinkem i na rezistentní mikroorganizmy. Délka a složitost celého procesu vývoje nových léčiv, které má své opodstatnění ve snaze zavádět na trh přípravky maximálně bezpečné, však není schopna tento 13

14 problém zcela vyřešit. Je tedy více než pravděpodobné, že v nejbližší budoucnosti nelze až na výjimky na tato nová antibiotika příliš spoléhat. Avšak tento výzkum je důležitou součástí komplexního přístupu k řešení problematiky infekčních onemocnění a proto je nutné v této snaze nadále pokračovat a boj nevzdávat (Nyč, 2004; Nyč, 2007) Zadání práce cíl práce Cílem diplomové práce bylo pomocí mikrodiluční bujónové metody otestovat nově vyvinutá potenciální léčiva a jejich antibakteriální aktivitu vůči osmi vybraným nejběžnějším podmíněně patogenním bakteriálním kmenům. Úkolem bylo u každé látky sledovat její minimální inhibiční koncentraci ovlivňující růst každého z testovaných kmenů. Následně byl diskutován vliv chemické struktury těchto látek na jejich účinek. Význam teoretické části práce spočívá ve snaze vytvořit komplexní náhled na problematiku rezistentních kmenů bakterií a současné možnosti léčby infekcí jimi vyvolaných. 14

15 2. Teoretická část 2.1. Éra antibiotik Za počátek éry antibiotik je často považován rok 1928, přesněji 3. září, kdy se skotský vědec Alexander Fleming vrátil po dovolené do své laboratoře v nemocnici St. Mary s Hospital v Londýně. Během úklidu se rozhodl blíže prozkoumat pár zplesnivělých vzorků na svém laboratorním stole a všiml si, že na starých plotnách s naočkovanými kmeny stafylokoků, kterými se v tu dobu zabýval, došlo v důsledku nárůstu plísně k lýze až úplnému vymizení kolonií původně naočkovaného stafylokoka. Tak došlo k jednomu z nejvýznamnějších objevů v historii léčby infekčních onemocnění penicilinu jako produktu plísně Penicillium notatum. Samotnému Flemingovi se však nepodařilo získat penicilin v dostatečně stabilní formě a izolovat tak onu účinnou látku, aby mohla být klinicky využita. Teprve roku 1940 se podařilo tento problém vyřešit skupině vědců z Oxfordské univerzity pod vedením Ernsta Borise Chaina a Howarda Waltera Floreyho, kteří společně s Alexanderem Flemingem získali roku 1945 Nobelovu cenu za objev a přípravu penicilinu. Proto se někdy za počátek éry antibiotik považuje až období okolo roku 1940, kdy byl penicilin poprvé použit a podán jako lék nemocnému člověku (Trejbalová & Trejbal, 1988; Modr, 1997; Votava & kol., 2001; Levy, 2007; internet 2). Penicilin však nebyl prvním objeveným antibiotikem. Objevu penicilinu předcházela řada jiných menších či větších objevů, které vedly k dalším dílčím poznatkům vytvářejícím předpoklady a podmínky pro velké objevy. Mezi takovéto objevy patří například rok 1889, kdy francouzský ředitel Přírodopisného muzea lékařské fakulty univerzity v Nancy, Paul Vuillemin, přišel jako první s teorií, že živí tvorové mohou produkovat látky, které inaktivují nebo usmrcují jiné. Pro takovéto látky zavedl termín antibiosa. Termín antibiotikum, tak jak jej známe dnes, byl navržen až v roce 1941 americkým mikrobiologem a objevitelem streptomycinu Selmanem Waksmanem (Lochmann, 1994; Levy, 2007). 15

16 Mezi další významné objevy před rokem 1928 patří například objev pyocyanázy roku 1888 jako produktu bakterie dříve označované Bacillus pyocyaneus, dnes známé jako Pseudomonas aeruginosa. Jednalo se o modrý pigment, který byl schopen usmrcovat jiné druhy bakterií, jako byly např. původci tyfu, záškrtu, antraxu a další. Avšak po aplikaci postiženým pacientům bylo zjištěno, že je pro člověka pyocyanáza toxická (Levy, 2007). Chemik Paul Ehrlich na počátku 20. století zvolil trochu jiný přístup. Byl okouzlen barvivy, pomocí nichž se obarvovaly různé tkáně a mikroorganizmy. Pro svůj účel najít novou látku, která by mohla být potenciálním antibiotikem, vycházel z faktu, že některá barviva se selektivně vážou pouze na mikroby a doufal, že se mu podaří nalézt tzv. kouzelnou střelu, tedy takovou molekulu barviva, která se bude specificky vázat pouze na mikroby patogenní a zahubí je, aniž by poškodila tělesné tkáně. To se mu také částečně podařilo. Roku 1910 se díky jeho spolupráci s Japoncem Hatou dostalo na trh léčivo s názvem Salvarsan, jako lék proti onemocnění vyvolaného spirochetou Treponema pallidum - syfilis. Jednalo se o barvivo vázané na molekulu arsenu. Salvarsan znamenal významný pokrok i přesto, že jeho účinek nebyl vždy stoprocentní a kromě toho, vedlejší toxické účinky arsenového preparátu způsobovaly pacientům bolesti a velmi je oslabovaly. Byl to však první přímo působící lék na toto rozšířené onemocnění a jeho objev znamenal počátek rozvoje zájmu o chemoterapii a syntézu nových chemoterapeutik (Lochmann, 1994; Votava & kol., 2001; Levy, 2007). Prvními úspěšnými chemoterapeutiky, tedy léky syntetizovanými chemickou cestou, byly sulfonamidy. Jejich předchůdcem, a tedy úplně prvním objeveným přípravkem z této skupiny látek, byl Prontosil. Jednalo se o červené barvivo, jehož účinek byl objeven roku 1935 Němcem G. Domagkem. Účinek léčiva se však projevoval pouze během pokusů na zvířatech, nikoliv na bakteriích rostoucích in vitro. Ještě téhož roku bylo zjištěno, že z Prontosilu až teprve v organizmu dochází ke vzniku vlastní aktivní látky, která je nyní řazena právě mezi tzv. sulfonamidy. Za objev sulfonamidů získal Gerhard Domagk roku 1939 Nobelovu cenu (Votava & kol., 2001; Levy, 2007). Za tzv. zlatou éru antibiotik je pak považováno období od roku 1945 až do sedmdesátých let 20. století. V tomto období byla objevena celá řada 16

17 zcela nových, strukturálně odlišných a především vysoce účinných přípravků. S jejich uvedením do klinické praxe a jejich aplikací nemocným se výrazně dařilo snižovat morbiditu i mortalitu v souvislosti s bakteriálními infekcemi. Díky tomu panovaly v tomto období optimistické myšlenky, že infekční choroby a infekční komplikace budou brzy patřit minulosti a málokdo pochyboval o opaku (Nyč, 2004). Netrvalo však dlouho a ukázalo se, že tyto předpoklady byly optimistické až příliš. S objevem antibiotických preparátů a nárůstem jejich užívání se u různých bakteriálních druhů začala vyskytovat antimikrobiální rezistence a docházelo tak ke snížení až úplné ztrátě původní účinnosti daného léčiva na daný organizmus. Již Alexander Fleming tušil, že k tomuto nežádoucímu jevu brzy dojde. A i když k tomu začalo docházet později, než sám Fleming předpokládal, stal se výskyt rezistentních kmenů celosvětovým problémem. Podle mnohých odborníků je tedy současné období označováno jako krize antimikrobiální léčby, příp. jako počátek postantibiotické éry, kdy k zavedení nových účinných léčiv do klinické praxe dochází jen zřídka a naopak výskytu nových rezistentních kmenů stále častěji (Nyč, 2004; Uhlíř, 2010) Antibiotika vs. antimikrobiální látky Jako antimikrobiální látky, též antiinfektiva, jsou označována léčiva používaná k profylaxi a terapii infekčních onemocnění. Dříve se tato skupina látek dělila podle jejich původu na antibiotika, tedy látky pouze přírodního, resp. mikrobiálního původu, a chemoterapeutika, tedy látky připravené cestou čistě chemickou. Dnes již toto klasické členění antimikrobiálních látek zcela neplatí, jelikož celá řada antibiotik je připravena pouze chemicky, příp. bývá biologického původu pouze výchozí produkt, který je následně podle potřeby chemicky upraven. Jedná se pak o tzv. semisyntetické preparáty. Postupem času proto termín antibiotikum nabyl všeobecnějšího významu a v současné době jsou jím označeny všechny antibakteriální látky bez rozdílu původu (Lochmann, 1994; Bednář & kol., 2009; Votava & kol. 2010). 17

18 2.3. Mechanizmus účinku antibiotik U antibiotik je možné rozlišit dva základní typy působení na bakteriální buňku. Jedná se o účinek bakteriostatický a baktericidní (Horáček, 2003). Baktericidní látky jsou taková antibiotika, která po určitém expozičním čase při dané koncentraci bakterie usmrcují, zatímco bakteriostatická antibiotika zastavují růst a množení bakterií, ale po jejich vymizení z prostředí se postupně růst a množení bakterií obnoví. Princip účinku bakteriostatických antibiotik předpokládá spoluúčast obranných mechanizmů napadeného makroorganizmu, které ve spolupráci s tímto typem antibiotika následně likvidují patogenní mikroorganizmus. Baktericidní antibiotika jsou zvláště výhodná především u infekcí s rychlým průběhem ohrožující život pacienta, při chronických recidivujících infekcích nebo u pacientů s imunosupresí. Stejně jako u jiných typů léčiv je třeba i u baktericidních antibiotik vzít v úvahu i některé jejich nevýhody. Usmrcením mikroorganizmů dochází k rozpadu jejich buněk a možnosti následného uvolnění endotoxinů a antigenně účinných látek do okolí, které vytváří novou zátěž pro imunitní systém a mohou následně způsobit až anafylaktické projevy. Rovněž zbytky odumřelých buněk, především cytoplazmatická membrána, si za určitých podmínek zachovává své antigenní vlastnosti a může tak rozvinout nové imunologické procesy (Trejbalová & Trejbal, 1988; Horáček, 2003). Mezi antimikrobiální látky s primárně bakteriostatickým efektem jsou řazeny např. chloramfenikol, tetracykliny, makrolidová antibiotika, linkosamidová antibiotika, sulfonamidy a další. Mezi antimikrobiální látky s primárně baktericidním efektem jsou pak řazeny např. peniciliny, cefalosporiny, aminoglykosidy, polypeptidy, vankomycin, bacitracin a další (Lochmann, 1994). Některá antibiotika jsou schopna obojího typu působení (Horáček, 2003). Vlastní mechanizmus účinku antimikrobiálních látek na bakteriální buňku může probíhat na různé úrovni. Aby antibiotikum mohlo selektivně působit na bakteriální buňku a nepoškozovalo buňky lidskému organizmu vlastní, je nutné, aby cílová struktura byla dostatečně odlišná od struktur buněk lidského těla. Tuto podmínku v bakteriální buňce splňují prakticky čtyři struktury 18

19 buněčná stěna, ribozomy, bakteriální DNA a buněčná membrána. Kromě účinku antibiotik na dané struktury bakteriální buňky existují antibiotika, která ovlivňují určité typy metabolických drah bakterií. Z tohoto důvodu můžeme antibiotika podle mechanizmu účinku rozdělit do pěti základních skupin: 1) Látky zasahující do syntézy buněčné stěny bakterií 2) Látky ovlivňující buněčnou membránu 3) Látky zasahující do syntézy bílkovin 4) Látky ovlivňující metabolizmus nukleových kyselin 5) Látky ovlivňující intermediární metabolizmus bakterií (Lochmann, 1994; Horáček, 2003; Jedličková, 2009) Látky zasahující do syntézy buněčné stěny bakterií Antibiotika řazená do této skupiny, patří mezi látky s převážně baktericidním účinkem. Základní složkou buněčné stěny bakterií je peptydoglykan (mukopeptid, murein). Jeho přítomnost ve stěně jednoznačně určuje, že se jedná o buňku prokaryontní. Nikde jinde než právě u těchto buněk nebyl zatím nalezen. Peptidoglykan je lineární polymer dvou střídajících se aminocukrů: N-acetylglukosaminu a jeho 3-O-D-laktylderivátu zvaného N-acetylmurámová kyselina. Vzájemně jsou tyto dvě struktury spojené vesměs β-1-4-vazbami. Na karboxyl N-acetylmurámové kyseliny je vždy navázán řetízek čtyř aminokyselin. Tyto tetrapeptidové řetízky jsou mezi sebou navzájem propojeny a díky tomu tvoří lineární polymery síťovinu. Tato propojení katalyzují enzymy zvané transpeptidázy. Transpeptidázy patří do skupiny tzv. PBP ( penicilin binding proteins ), které mají schopnost vázat na sebe penicilinová a cefalosporinová (beta-laktamová) antibiotika. Tato schopnost vazby je dána podobností beta-laktamového kruhu a D-alanyl-D-alanyldipeptidu peptidoglykanu. K různým penicilinům mají různou afinitu a různé jsou pak i důsledky této vazby. Jedním z nich je inhibice transpeptidázové reakce a tím inhibice syntézy peptidoglykanu. Během růstu bakteriální buňky dochází postupně k vsunování základních stavebních jednotek peptidoglykanu do stávající struktury. Aby to bylo možné, musí tomuto procesu vždy nejprve předcházet řízené štěpení peptydoglykanu a po vložení nové podjednotky jeho 19

20 opětná resyntéza. Beta-laktamová antibiotika inhibují syntézu peptidoglykanu, aniž by ovlivňovala proces jeho štěpení. V důsledku toho dochází k postupnému obnažování bakterie a její lýze osmotickým přetlakem nebo snadné likvidaci hostitelem. Z popsaného způsobu účinku vyplývá, že beta-laktamová antibiotika působí na bakteriální buňky pouze v období růstu, neboť v nerostoucí, klidové buňce neprobíhá řízené štěpení peptydoglykanu. Zároveň je zřejmé, že antibiotika s takovýmto způsobem účinku jsou pro člověka zcela netoxická, neboť v eukaryontní buňce peptidoglykan není přítomen (Lochmann, 1994; Bednář & kol., 2009). Kromě beta-laktamových antibiotik jako jsou již zmiňované peniciliny a cefalosporiny, patří do této skupiny antimikrobiálních látek mající vliv na syntézu buněčné stěny ještě např. glykopeptidy (vankomycin) či cykloserin (Lochmann, 1994; Lüllmann & kol., 2005; Bednář & kol., 2009) Látky ovlivňující buněčnou membránu Cytoplazmatická membrána je struktura ohraničující cytoplazmu všech buněk vůči jejich okolí. U bakterií je jedinou vnitřní biologickou membránou na rozdíl od eukaryontních buněk, kde je dále pomocí těchto biomembrán rozdělen vnitřní prostor buněk na množství ohraničených prostorů membránových kompartmentů. Základní strukturu cytoplazmatické membrány představuje tzv. tekuté kontinuum dvojvrstvy fosfolipidů, na jehož obou stranách se nacházejí více či méně ponořené a různými silami poutané molekuly bílkovin. Charakteristická je nepřítomnost cholesterolu. Tento důmyslný systém zajišťuje buňce několik základních funkcí, mezi které patří již zmíněné ohraničení vnitřního vodného prostředí od vnějšího, které je zcela odlišné. Avšak tato izolace nesmí být absolutní. Živá buňka je všeobecně otevřený systém vyměňující si s okolím hmotu, energii i informaci. Cytoplazmatická membrána je tedy struktura, která zajišťuje transport látek mezi buňkou a okolím a zároveň tento proces i reguluje. Další důležitou funkcí plazmatické membrány bakterií je také transformace energie (Nečas & kol., 2000; Bednář & kol., 2009). Antibiotika patřící do této skupiny se váží na cytoplazmatickou membránu a specificky zvyšují její permeabilitu. Vazba daného antibiotika je 20

21 zprostředkována přítomností kyseliny 6-metyloktanové v jejich molekule. V důsledku zvýšené permeability dochází k úniku iontů, metabolicky potřebných látek a k narušení osmotických poměrů. Mezi tato antibiotika jsou řazeny např. polypeptidy (polymyxin B, kolistin a bacitracin), příp. i polyenová antifungální antibiotika, která se váží na steroly plazmatické membrány přítomné pouze v membránách kvasinkových organizmů a plísní (Trejbalová & Trejbal, 1988; Lochamnn, 1994; Jedličková, 2009) Látky zasahující do syntézy bílkovin Syntéza bílkovin neboli proteosyntéza je proces zahrnující několik jednotlivých kroků, jehož cílem je překlad (translace) genetické informace z abecedy čtyř nukleových bází do abecedy dvaceti aminokyselin. Tento překlad je proveden podle předpisu zvaného genetický kód, který určité trojici nukleotidových bází v mrna přiřazuje danou aminokyselinu. Mechanizmus proteosyntézy začíná transkripcí jednoho vlákna z dvoušroubovice DNA do formy mrna. Tento proces je zajištěn pomocí enzymu RNA polymerázy. Dalším krokem je translace neboli překlad mrna do molekuly proteinu. Pro proces translace je nezbytná přítomnost ribozomů. Ribozomy prokaryontních buněk jsou tvořeny dvěma podjednotkami se sedimentačním koeficientem 30S a 50S. Na ribozomech se nacházejí čtyři specifická vazebná místa. Jedno místo slouží k vazbě ribozomu na molekulu mrna a zbylá tři označovaná písmeny A, P a E pro vazbu molekul trna. Místo A slouží pro vazbu trna nesoucí aminokyselinu, místo P slouží k vazbě peptidyl-trna a písmenem E je označeno místo, kde deacylovaná trna opouští ribozom. Nejprve dochází k vazbě ribozomu na molekulu mrna. Ribozom putuje podél molekuly mrna a podle přepsaného genetického kódu řadí postupně aminokyseliny do peptidového řetězce. Jakmile je řetězec kompletní, je uvolněn z vazby na ribozom. Pomocí následných posttranslačních modifikací je protein upraven a získává tak svoji plnohodnotnou biologickou funkci (Lochmann, 1994; Rosypal, 1998; Nečas & kol., 2000; Bednář & kol., 2009). Do skupiny antibiotik inhibující syntézu bílkovin je řazena celá řada látek, které zasahují do různých fází proteosyntézy bakteriální buňky. Zahrnuje např. tetracykliny, aminoglykosidy, chloramfenikol, makrolidy, linkosamidy, 21

22 rifampicin a další. Aminoglykosidy se po průniku do buňky váží na menší 30S podjednotku ribozomu a inhibují tvorbu iniciačního komplexu. Chloramfenikol působí naopak v pozdější fázi růstu peptidového řetězce. Váže se na 50S podjednotku ribozomu a zabraňuje transpeptidaci. Tetracykliny se stejně jako aminoglykosidy váží na 30S podjednotku ribozomu. V tomto případě ale zabraňují vazbě aminoacyl-trna a tím znemožňují přísun aminokyselin pro syntézu peptidového řetězce. Rifampicin na rozdíl od předchozích antibiotik zasahuje již do fáze transkripce, resp. ještě do fáze před transkripcí. Váže se na enzym RNA-polymerázu, se kterou tvoří inaktivní komplex (Trejbalová & Trejbal, 1988; Lochmann, 1994; Bednář & kol., 2009) Látky ovlivňující metabolizmus nukleových kyselin Do této skupiny antibiotik jsou řazeny např. novobiocin, chinolony, fluorochinolony a další. Antibiotika patřící do této skupiny mohou narušovat syntézu nukleových kyselin v různých fázích jejich výstavby. Jedním z cílů těchto antibiotik je enzym DNA-gyráza. Tento enzym je důležitý pro správný průběh replikace DNA. Její funkcí je zabránění vzniku nadšroubovicových závitů během procesu replikace. Mezi antibiotika negativně ovlivňující tento enzym patří např. chinolony, fluorochinolony a novobiocin. Nitroimidazoly jsou pak příkladem antibiotik, která jsou schopna nasyntetizovanou DNA následně destruovat (Lochmann, 1994; Rosypal, 1998; Bednář & kol., 2009; Jedličková, 2009; Votava & kol., 2010; internet 3) Látky ovlivňující intermediární metabolizmus bakterií Mezi látky s tímto typem mechanizmu účinku mohou být zařazena mj. antibiotika negativně ovlivňující syntézu kyseliny listové, jako jsou např. sulfonamidy či trimetoprim. Bakterie nejsou schopné přijímat preformovanou kyselinu listovou z vnějšího prostředí a jsou tedy zcela závislé na její vlastní syntéze. Sulfonamidy patří mezi antibiotika, která kompetitivně inhibují přeměnu kyseliny paraaminobenzoové na kyselinu dihydropteroovou, trimetoprim pak negativně zasahuje do následujícího kroku a zabraňuje tak vzniku tetrahydrofolátu. Jelikož tato dvě antibiotika zasahují do stejného 22

23 metabolického procesu ve dvou různých místech, dochází při jejich kombinovaném podání k potencování účinku (Bednář & kol., 2009; internet 4) Přehled antibiotik Dělení antibiotik do skupin se řídí různými hledisky. Jednotlivé skupiny lze charakterizovat podle chemické struktury, biologického původu nebo léčebného použití. Antibiotika dělená do skupin podle chemické struktury se navzájem podobají i mechanizmem účinku a antimikrobiálním spektrem. Zároveň mají podobné toxické účinky a mezi mikroorganizmy reagujícími na tato antibiotika se může vyskytnout zkřížená rezistence (Simon & Stille, 1998). Antibiotika mohou být dále dělena na dvě velké skupiny podle šíře jejich záběru na antibiotika úzkospektrá a širokospektrá. Antibiotika úzkospektrá působí pouze na určité původce infekcí. Naproti tomu širokospektrá antibiotika vlastní více či méně široké antimikrobiální spektrum účinku (Simon & Stille, 1998). Některá antibiotika lze pro jejich toxicitu aplikovat pouze místně. Tato skupina se označuje jako lokální antibiotika (Simon & Stille, 1998) Beta-laktamová antibiotika Beta-laktamová antibiotika, tzv. beta-laktamy jsou přirozená i semisyntetická antibiotika, která ve své chemické struktuře obsahují betalaktamový kruh (obr. 1). Nejdůležitějšími zástupci této skupiny látek jsou peniciliny a cefalosporiny. Patří mezi ně však i syntetické baktamy a speciální skupinu tvoří inhibitory beta-laktamáz. V zásadě mají až na inhibitory betalaktamáz stejný mechanizmus účinku, který představuje inhibici syntézy peptidoglykanu buněčné stěny bakterií. Rozdíly v účinku mezi jednotlivými antibiotiky jsou podmíněny rozdílnou afinitou k buněčným receptorům, schopností pronikat přes bakteriální buněčnou stěnu a odolností vůči betalaktamázám (Simon & Stille, 1998; Havlík, 2001). 23

24 Obr. 1 Beta-laktamový kruh chemická struktura Peniciliny Z hlediska chemické struktury představují všechny peniciliny deriváty kyseliny 6-amino-penicilanové (obr. 2). Na aminoskupinu kyseliny mohou být navázány různé radikály (R), čímž vznikají penicilinové deriváty a charakter postranních řetězců pak ovlivňuje zejména antibakteriální aktivitu antibiotika. Podle chemické struktury navázaného radikálu jsou rozeznávány např. benzylpenicilin (penicilin G), fenoxypeniciliny (penicilin V, propicilin), acylaminopeniciliny (piperacilin, azlocilin), aminopeniciliny (ampicilin, amoxicilin) a izoxazolypeniciliny (oxacilin). Peniciliny patří mezi vysoce účinná antibiotika s extrémně nízkou toxicitou pro člověka. Spektrum účinku je u jednotlivých preparátů odlišné. Penicilin G, fenoxypeniciliny a izoxazolypeniciliny se uplatňují především v léčbě infekcí vyvolaných grampozitivními bakteriemi, zatímco acylaminopeniciliny a aminopeniciliny vykazují účinek spíše vůči bakteriím gramnegativním (Simon & Stille, 1998; Havlík, 2001; Votava & kol., 2010). Obr. 2 Kyselina 6-amino-penicilanová chemická struktura Mezi penicilinová antibiotika jsou řazeny i karbapenemy, u nichž je v penicilinovém jádru místo síry uhlík a klavulany u nichž se nachází na stejném místě kyslík (Havlík, 2001). Karbapenemy patří mezi širokospektrá antibiotika s baktericidním účinkem. Slouží především jako rezervní antibiotika v léčbě závažných, mnohdy 24

25 polymikrobiálních infekcí vyvolaných multirezistentními kmeny mikroorganizmů, např. Klebsiella pneumoniae produkující širokospektrou beta-laktamázu. Vykazují účinek také proti pseudomonádám. V současné době se však již objevují kmeny, které produkují tzv. metalo-beta-laktamázy, které jsou vůči karbapenemům rezistentní. Z karbapenemů jsou v České republice zatím registrovány pouze imipenem, meropenem a ertapenem (Koblihová & Suchopár, 2008; Votava & kol., 2010). Obr. 3 Jádro karbapenemů chemická struktura Cefalosporiny Cefalosporiny jsou bicyklická beta-laktamová antibiotika, jejichž struktura je odvozena od kyseliny 7-aminocefalosporanové (obr. 4). Jednotlivé cefalosporiny vznikají obměnou různých radikálů na jádře molekuly této kyseliny, především v pozicích 3 a 7. V případě cefamycinu je v pozici 7 připojena navíc metoxyskupina (Simon & Stille, 1998). Obr. 4 Kyselina 7-amino-cefalosporanová chemická struktura Podle své antibiotické účinnosti jsou cefalosporiny děleny do čtyř generací, z nichž je celá řada používána i v České republice. Všeobecně je spektrum účinku cefalosporinů široké. Nepůsobí však vůbec na enterokoky. Od I. generace směrem k IV. generaci obecně stoupá jejich účinnost 25

26 na gramnegativní bakterie, naopak (s výjimkou IV. generace) pak stejným směrem klesá účinnost na grampozitivní koky, zejména pak na stafylokoky. I. generace tedy představuje cefalosporiny vysoce účinné především na grampozitivní bakterie. Pro p.o. podání jsou to např. cefalexin, cefadroxil a cefaclor, ve formě injekcí pak cefalotin, cefazolin a cefapirin. Do II. generace jsou řazeny cefalosporiny působící i na řadu gramnegativních mikrobů produkující beta-laktamázy a patří sem např. cefuroxim-axetil, cefprozil, cefoxitin a cefamandol. Cefalosporiny III. generace vykazují vysokou stabilitu vůči většině beta-laktamáz běžných gramnegativních patogenů, mají však nižší působení na bakterie grampozitivní. Z per orálních přípravku jsou to např. cefixim, ceftibuten a cefpodoxim-proxetil. Injekční formy jsou schopné pronikat hematoencefalickou bariérou a mají různě mohutné účinky na pseudomonády. Mezi tyto formy patří např. cefotaxim, ceftizoxim, ceftriaxon, cefoperazon a ceftazimid. Do IV. generace, dříve označované jako III. generace s rozšířeným účinkem na grampozitivní mikroorganizmy, jsou řazeny pouze injekční preparáty cefpirom a cefepim, které na rozdíl od III. generace oplývají vysokou účinností právě na zmiňované grampozitivní bakterie (Lochmann, 1994; Havlík, 2001; Votava & kol., 2010). Mezi cefalosporiny jsou dále řazeny i karbacefemy a oxacefemy, které ale v České republice nejsou zatím registrovány (Havlík, 2001) Monobaktamy Jejich název je odvozen od jejich struktury, jejíž základ tvoří pouze jeden substituovaný laktamový kruh. V České republice je zatím registrován pouze jediný monobaktam aztreonam, známý pod komerčním názvem Azactam. Působí téměř na všechny gramnegativní bakterie, vč. Pseudomonas aeruginosa, Seratia marcescens, Enterobacter spp. a Citrobacter spp. Je využíván rovněž jako synergista gentamicinu v účinku na Pseudomonas aeruginosa a Klebsiella pneumoniae. Nepůsobí na anaerobní ani grampozitivní bakterie. S beta-laktamovými antibiotiky nevykazuje zkříženou rezistenci (Lochmann, 1994; Simon & Stille, 1998). 26

27 Obr. 5 Aztreonam chemická struktura Inhibitory beta-laktamáz Tyto látky obsahují stejně jako beta-laktamová antibiotika ve své struktuře beta-laktamový kruh. Na bakterie jako takové však téměř neúčinkují. Působí jako tzv. svůdci beta-laktamáz. Tyto inhibitory se trvale váží na aktivní místo beta-laktamázy, čímž zablokují trvale její účinnost. Afinita beta-laktamáz k těmto inhibitorům je mnohem vyšší než k beta-laktamovým antibiotikům. Jestliže jsou tedy tyto ireverzibilní inhibitory beta-laktamáz podány v přesně určeném kvantitativním poměru současně s beta-laktamovým antibiotikem, jehož účinek je rušen působením beta-laktamáz, pak se tyto enzymy naváží přednostně na inhibitor a antibiotikum pak může nerušeně účinkovat na původce nákazy (Havlík, 2001; Votava & kol., 2010). V praxi se dnes využívají tři inhibitory tohoto typu. Jedná se o kyselinu klavulánovou, sulbaktam a tazobaktam (Havlík, 2001; Votava & kol., 2010). Kyselina klavulánováá Sulbaktam Tazobaktam Obr. 6 Inhibitory betalaktamáz chemické struktury Tetracykliny Jak již z názvu vyplývá, jedná se o molekuly obsahující ve své struktuře čtyři šestičlenné kondenzované cykly (obr. 7). Jednotlivé deriváty se navzájem 27

28 liší postranními řetězci vázanými na základní strukturu, nejčastěji v polohách 5, 6 a 7 (Simon & Stille, 1998; Votava & kol., 2010). Obr. 7 Tetracyklin chemická struktura Tetracykliny patří mezi širokospektrá antibiotika s bakteriostatickým účinkem. Kromě celé škály grampozitivních a gramnegativních bakterií působí i na mykoplazmata, rickettsie, chlamydie, spirochety, aktinomycety a některé prvoky. Mnoho běžných bakterií je však dnes již na tato antibiotika rezistentní. Nepůsobí např. na Pseudomonas aeruginosa, kmeny protea, Serratia marcescens a další (Lochmann, 1994; Simon & Stille, 1998; Votava & kol., 2010) Aminoglykosidy Společný základ chemické struktury aminoglikosidů představuje aminocyklitolový kruh, struktura odvozená od inositolu substituovaného různými aminoskupinami, na který jsou následně glykosidicky vázané dva aminocukry. Jednotlivé deriváty patřící do této skupiny antibiotik se liší počtem a druhy těchto aminocukrů (Simon & Stille, 1998; Votava & kol., 2001). Jejich společným mechanizmem účinku je inhibice syntézy proteinů na úrovni bakteriálních ribozomů, kde interferují s vazbou formylmethionyltransferové RNA na ribozom a brání tak vzniku iniciačního komplexu. Výsledný účinek je baktericidní (Simon & Stille, 1998; Votava & kol., 2001). Působí na široké spektrum patogenů zahrnující především aerobní gramnegativní bakterie a stafylokoky. Nedostatečný účinek mají na streptokoky, hemofily a anaerobní bakterie. Některé aminoglykosidy působí i na mykobakterie. K léčbě pseudomonádových a enterokokových infekcí se pak využívá jejich silný synergický efekt v kombinaci s beta-laktamy. Nejstarší 28

29 aminoglykosid, streptomycin, izolovaný roku 1944, se u nás dnes využívá pouze k terapii tuberkulózy, a to jen v kombinaci s jinými antituberkulotiky (Simon & Stille, 1998; Votava & kol., 2001; Votava & kol., 2010). V praxi se nejčastěji používají gentamicin, který působí na většinu gramnegativních tyček, vč. pseudomonád, serracií a acinetobakterů, a na různé druhy stafylokoků, vč. některých kmenů rezistentních na oxacilin. V případě kmenů rezistentních na gentamicin je k léčbě využíván amikacin, který působí i na mykobakterie a nokardie. Další aminoglykosidy jako jsou např. kanamycin, tobramycin a velmi toxický neomycin se užívají pouze lokálně (Votava & kol., 2010). Aminoglykosidy patří všeobecně do skupiny poměrně toxických látek a nežádoucí účinky spojené s podáním těchto antibiotik jsou dosti časté. Jedná se především o jejich nefrotoxicitu (amikacin), ototoxicitu, která může vést až k hluchotě pacienta (zejména po gentamicinu) a neurotoxicitu. Dostavují se především při dlouhodobé léčbě a po aplikaci neredukovaných dávek u pacientů s těžším postižením ledvin (Votava & kol., 2001; Votava & kol., 2010) Obr. 8 Gentamicin chemická struktura Makrolidy Makrolidy jsou z hlediska chemické struktury poměrně složitá antibiotika. Jsou tvořena makrocyklickým laktonovým kruhem, na který se glykosidicky váží neutrální cukry nebo aminocukry. Jednotlivé makrolidy se od sebe liší velikostí laktonového kruhu a druhem navázaného cukru. Základní laktonový kruh se 29

30 skládá zpravidla ze atomů a všeobecně se makrolidy mohou dělit do čtyř základních skupin: a) makrolidy se 14 - členným laktonovým kruhem (např. erythromycin, clarithromycin) b) makrolidy se 16 - členným laktonovým kruhem (např. rokitamycin, spiramycin) c) azalidy látky s 15 - členným laktonovým kruhem obsahujícím dusík (azithromycin) d) ketolidy látky se 14 - členným laktonovým kruhem obsahujícím v poloze 3 místo sacharidového zbytku ketoskupinu (telithromycin) (Simon & Stille, 1998; Suchopár, 2005) Obr. 9 Erythromycin A chemická struktura Jedná se o antibiotika s bakteriostatickým efektem. Mají relativně úzké antibakteriální spektrum účinku. Působí především na grampozitivní mikroorganizmy. Účinkují ale také dobře na gramnegativní koky, spirochety a řadu dalších gramnegativních bakterií (Suchopár, 2005; Votava & kol., 2010) Linkosamidy Linkosamidy patří do skupiny antibiotik s bakteriostatickým účinkem, které brání syntéze bílkovin. Prvním zástupcem této skupiny byl linkomycin, od kterého byl později odvozen semisyntetický derivát klindamycin. Molekula linkomycinu je tvořena aminokyselinou prolinem, která je vázána amidovou vazbou na pyranozid (obr. 10). Klindamycin se pak od linkomycinu liší substitucí 30

31 7-hydroxyskupiny atomem chloru. Spektrum účinku je u obou zmiňovaných linkosamidů totožné. Avšak klindamycin vykazuje o něco vyšší antibakteriální účinnost a lepší farmakokinetiku. Všeobecně tato antibiotika zastavují množení grampozitivních bakterií vč. stafylokoků, avšak neúčinkují na enterokoky. Působí také na anaerobní bakterie a na některé prvoky, jako jsou plasmodia nebo toxoplasmata (Lochmann, 1994; Simon & Stille, 1998; Votava & kol., 2010). Linkomycin Klindamycin Obr. 10 Linkosamidy chemická struktura ( Amfenikoly Jediným u nás dostupným antibiotikem této skupiny je chloramfenikol. Jedná se o bakteriostaticky působící antibiotikum se širokým spektrem účinku. Inhibuje růst aerobních i anaerobních grampozitivních i gramnegativních bakterií, vč. mykoplazmat, rickettsií a chlamydií. Necitlivé jsou mykobakterie, Pseudomonas aeruginosa a nokardie. Pro svou toxicitu se však uplatňuje jen jako antibiotikum druhé volby a to především u závažných infekcí jako jsou např. meningitidy, břišní tyfus a hemofilové sepse (Votava & kol., 2010). Jeho struktura je odvozena od aminokyseliny fenylalaninu (Simon & Stille, 1998). 31

32 Obr. 11 Chloramfenikol chemická struktura Polypeptidová antibiotika Polypeptidová antibiotika jsou rozvětvené cyklické polypeptidy, které jsou využívány zejména pro lokální aplikaci. Výjimku představuje injekčně podávaný polymyxin E, zvaný též kolistin. Do této skupiny látek jsou kromě zmiňovaného polymyxinu E dále řazeny např. polymyxin B, bacitracin a tyrotricin (Simon & Stille, 1998; Votava & kol., 2001; Votava & kol., 2010). Bacitracin je pro svou vysokou nefrotoxicitu určen pouze pro lokální použití. Jeho antibakteriální spektrum je zaměřeno především na grampozitivní bakterie, neisserie a Haemophilus influenzae. Nepůsobí na houby a ostatní gramnegativní bakterie. Osvědčuje se především v léčbě bakteriálních onemocnění kůže, nosu, uší či očí nejčastěji v kombinaci s neomycinem (Simon & Stille, 1998; Votava & kol., 2010). Obr. 12 Bacitracin chemická struktura ( 32

33 Polymyxiny produkované bakterií Bacillus polymyxa jsou tvořeny deseti aminokyselinami. Díky svým volným aminoskupinám působí jako kationické detergenty a rozrušují tak fosfolipidovou vrstvu cytoplazmatické membrány. Jejich antibakteriální spektrum zahrnuje pouze gramnegativní bakterie, včetně Pseudomonas aeruginosa, která je jinak na většinu antibiotik rezistentní. Nepůsobí však na příslušníky rodu Proteus, Providencia, Morganella a Serratia. Oba zmiňované typy jsou výrazně nefrotoxické a pro svoji velkou molekulu špatně difundují tkáněmi. Polymyxin E se využívá zejména při léčbě močových infekcí vyvolaných gramnegativními tyčkami rezistentními na jiná antibiotika, případně jej lze lokálně použít i pro výplach ran. Uplatnění polymyxinu B je stejné jako u bacitracinu (Simon & Stille, 1998; Votava & kol., 2001; Votava & kol., 2010). Obr. 13 Polymyxin B chemická struktura ( Obr. 14 Kolistin chemická struktura ( 33

34 Tyrotricin je baktericidní komplex tvořený molekulami gramicidinu a tyrocidinu. Vzhledem ke své vysoké toxicitě se využívá pouze jako lokální antibiotikum. Účinkuje především na grampozitivní koky a tyčinky (Simon & Stille, 1998) Glykopeptidová antibiotika Jedná se o skupinu antibiotik s velkou molekulou, jejíž základ tvoří peptidová struktura s navázanou cukernou složkou. Hlavním představitelem je vankomycin. Jeho baktericidní účinek je zaměřený především na grampozitivní bakterie a spirochety. Je však poměrně toxický. Svůj velký význam získal především díky silnému vzrůstu nozokomiálních infekcí způsobených stafylokoky rezistentními na oxacilin, vůči kterým je zatím většinou účinný (Simon & Stille, 1998; Votava & kol., 2010). Obr. 15 Vankomycin chemická struktura ( Dalším představitelem této skupiny je teikoplanin. Jedná se o směs látek příbuzných vankomycinu. Jeho spektrum účinku je prakticky stejné jako u vankomycinu, ale na rozdíl od vankomycinu je teikoplanin pro člověka méně toxický (Votava & kol., 2010). 34

35 Ansamycinová antibiotika Ansamycinová antibiotika jsou makrocyklické sloučeniny, jejichž chemická struktura je tvořena systémem aromatických kruhů. Původní sloučenina, rifamycin, byla objevena roku 1957 jako produkt Streptomyces mediterranei. Dnes jsou v lékařské praxi využívány její polysyntetické deriváty rifampicin, rifabutin a rifaximin. U bakterií se tato antibiotika selektivně vážou na bakteriální RNA polymerázu, čímž blokují syntézu mrna a inhibují tak produkci bílkovin. Působí baktericidně. (Votava & kol., 2001; Ingen & kol., 2011). Rifampicin má poměrně široké antibakteriální spektrum. Zahrnuje např. stafylokoky a většinu enterokoků, neisserie, hemofily, rickettsie, chlamydie i některé prvoky a původce pneumocystózy. Nejvýznamnější je však jeho účinek na mykobakteria. Rifabutin má své spektrum o něco užší. Jeho výhodou je však jeho účinnost i na multirezistentní kmeny mykobakterií. Rifaximin je pak určen spíše pro léčbu střevních infekcí vč. cestovatelských průjmů, jelikož se po perorálním podání z gastrointestinálního traktu téměř vůbec nevstřebává (Votava & kol., 2001; Votava & kol., 2010). Obr. 16 Rifampicin chemická struktura (Ingen & kol., 2011) Kyselina fusidová Kyselina fusidová je lokálně působící lipofilní substance se steroidní chemickou strukturou inhibující syntézu proteinů v bakteriální buňce. Poprvé byla izolována z kultury plísně Fusidium coccineum v roce Do klinické praxe byla zavedena o několik let později a to zejména k léčbě stafylokokových infekcí kůže. Její antimikrobiální spektrum zahrnuje především stafylokoky a to 35

36 i včetně kmenů rezistentních na oxacilin. Dále působí na korynebakterie, gonokoky, meningokoky, klostridia a Bacteroides fragilis. Většina kmenů streptokoků a pneumokoků je méně citlivá a gramnegativní tyčinky zcela rezistentní (Simon & Stille, 1998; Jones & kol., 2011). Obr. 17 Kyselina fusidová chemická struktura Výskyt rezistentních kmenů vůči kyselině fusidové však stále narůstá a vývoj nových antibiotik je nezbytný. Jedním z takovýchto novějších je např. retapamulin, polosyntetický derivát sloučeniny pleuromutilinu získané fermentací mikroorganizmu Clitopilus passeckerianus. Stejně jako kyselina fusidová i retapamulin inhibuje syntézu bakteriálních proteinů. Působí bakteriostaticky především na S. aureus, Str. pyogenes a Str. agalactiae. Na rozdíl od kyseliny fusidové byla však u retapamulinu v klinických studiích pozorována snížená účinnost u pacientů s infekcemi způsobenými methicilinrezistentními kmeny S. aureus. Proto by retapamulin v těchto případech neměl být používán (Čapková, 2008) Sulfonamidy a pyrimidiny Sulfonamidy jsou deriváty p - aminobenzolsulfonamidu a patří mezi první významná chemoterapeutika. Nízká aktivita a rychlý vývoj rezistence byly však hlavními důvody, proč bylo od terapie sulfonamidy z velké části upuštěno. Nadále se ale stále používají především jako synergisté, nejčastěji v kombinaci s trimetoprimem. Výhodou této kombinace je dosažení baktericidního účinku, kterým sulfonamidy ani trimetoprim samostatně neoplývají (Lochmann, 1994; Simon & Stille, 1998; Votava & kol., 2010). 36

37 Obr. 18 p-aminobenzolsulfonamid chemická struktura Sulfonamidy jsou řazeny mezi tzv. antimetabolity. Jejich účinek je dán kompetitivní inhibicí enzymu, který inkorporuje kyselinu p - aminobenzoovou do struktury kyseliny listové a podílí se tak na její syntéze. Působí na streptokoky, stafylokoky, klostridia a hlavně nokardie. Dále pak např. na chlamydie a i některé prvoky. V případě kombinace s trimetoprimem je účinek rozšířen na burkholderie a legionely. Důležitý je rovněž účinek na Toxoplasma gondii a Pneumocystis jiroveci. Nepůsobí na Pseudomonas aeruginosa (Simon & Stille, 1998; Votava & kol., 2010). Obr. 19 Trimetoprim chemická struktura Nitroimidazoly Nitroimidazoly tvoří skupinu heterocyklických látek, jejichž základ chemické struktury je tvořen imidazolovým jádrem. Jednotlivé deriváty se pak navzájem liší postranními řetězci vázanými na tuto základní strukturu, jak naznačuje obr. 20. Působí baktericidně na anaerobní bakterie, u kterých inhibují syntézu DNA a účinkují i na některé prvoky. Využívají se především k léčbě anaerobních infekcí, profylaxi infekcí ran u rizikových chirurgických výkonů a k léčbě trichomonóz, giardióz a dalších parazitóz. Mezi zástupce patří např. metronidazol, tinidazol a ornidazol (Simon & Stille, 1998; Votava & kol., 2010). 37

38 Obr. 20 Nitroimidazol základní struktura Nitrofurany Nitrofurany patří mezi chemoterapeutika, jejichž antibakteriální účinek je podmíněn 5 - nitrofuranovou konfigurací. Nitrofurany potlačují syntézu mikrobiálních bílkovin a jejich účinek je převážně bakteriostatického charakteru. Působí na poměrně široké spektrum mikrobů zahrnující např. běžné enterobakterie vyvolávající infekce močových cest a grampozitivní koky, jako jsou Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis a Staphylococcus saprophyticus. Špatně však pronikají do tkání, a proto se využívají pouze k léčbě nekomplikovaných močových infekcí a k lokální léčbě v gynekologii. Mezi nitrofurany patří nitrofurantoin a nifuratel (Hejzlar, 1985; Simon & Stille, 1998; Votava & kol., 2010). Obr. 21 Nitrofurantoin chemická struktura Chinolony Chinolony patří mezi syntetické antimikrobiální látky, jejichž cílem je inhibice enzymu DNA-gyrázy, která je nezbytná pro syntézu nukleových kyselin. Jejich účinek je baktericidní. Chinolonová antibiotika mohou být rozdělena do dvou základních skupin na klasické chinolony a chinolony novějšího typu. Mezi klasické chinolony se řadí např. kyselina oxolinová či nalidixová. Obě tyto kyseliny mají jen velmi úzké spektrum účinku, které prakticky zahrnuje pouze 38

39 enterobakterie. Dříve se využívali k léčbě především infekcí močových cest. Dnes však mají pro svou tendenci k rychlému vývoji rezistence jen malý význam a v praxi se již nepoužívají (Simon & Stille, 1998; Votava & kol., 2010). Naopak chinolony novějšího typu, označované fluorochinolony, jsou cennými antiinfektivy k systémovému použití. Jejich název vychází z jejich chemické struktury, jejíž základ je tvořen chinolinovým jádrem s karbonylovou skupinou a navázaným atomem fluoru v pozici 6 (obr. 22). Jejich spektrum účinku pokrývá nejen běžné gramnegativní bakterie, ale i mykoplazmata a intracelulární patogeny, jako jsou např. legionely a chlamydie. Jejich účinek je rozšířen také na grampozitivní bakterie a některé fluorochinolony zasahují i některá mykobakteria a část anaerobů. Kvůli prudkému nárůstu rezistence se pro léčbu stafylokokových infekcí přestávají používat (Simon & Stille, 1998; Votava & kol., 2010). Obr. 22 Chinolin s atomem fluoru v pozici 6 chemická struktura Mezi zástupce této skupiny léčiv patří např. norfloxacin, ciprofloxacin a ofloxacin (Votava & kol., 2010). Norfloxacin Ciprofloxacin Ofloxacin Obr. 23 Chinolonová antibiotika příklady chemických struktur 39

40 Ostatní chemoterapeutika antituberkulotika Léčba mykobakteriálních infekcí není snadná, jelikož mykobakteria jsou rezistentní k většině běžných antibiotik, skrývají se intracelulárně a mají dlouhou generační dobu. Léčba trvá velmi dlouho, což přispívá k snadnějšímu vzniku rezistence, a proto se antituberkulotika podávají vždy v kombinaci. Z chemoterapeutik využívající se k léčbě mykobakteriálních infekcí jsou to především isoniazid, ethambutol a pyrazinamid (Votava & kol., 2001; Votava & kol., 2010). Izoniazid je z chemického hlediska hydrazid kyseliny isonikotinové. Inhibuje syntézu kyseliny mykolové, která je nezbytnou součástí buněčné stěny mykobakterií. Má baktericidní efekt a působí na bakterie uložené extra i intracelulárně (Simon & Stille, 1998; Votava & kol., 2001). Obr. 24 Izoniazid chemická struktura Ethambutol, etylendiaminový derivát, pravděpodobně brzdí tvorbu RNA a vyvolává tak bakteriostatický efekt. Působí pouze na proliferující kmeny mykobakterií (Simon & Stille, 1998; Votava & kol., 2001). Obr. 25 Etambutol chemická struktura Pyrazinamid je amid kyseliny pyrazinkarbonové s baktericidním účinkem. Působí především na humánní typy mykobakterií. Neúčinkuje na Mycobacterium bovis a atypické mykobakterie (Simon & Stille, 1998; Votava & kol., 2001). 40

41 Obr. 26 Pyrazinamid chemická struktura Pro léčbu lepry bylo vyvinuto chemoterapeutikum Dapson. Jedná se o diaminodifenylsulfon, který kromě Mycobacterium leprae působí i na jiné druhy mykobakterií, Pneumocystis carinii a plazmodia vyvolávající malárii. Pro léčbu lepry je podáván vždy minimálně ve dvojkombinaci s rifampicinem (Simon & Stille, 1998; Votava & kol., 2001; Fojtíková & Vachová, 2008). Obr. 27 Dapson chemická struktura Nově vyvíjená antibiotika Streptograminy Streptograminy nepatří zdaleka mezi úplně nová antibiotika. Jedná se o látky přirozeně produkované Streptomyces pristinaespiralis. Zahrnují několik skupin antibiotik, mezi které patří např. pristinamyciny. Látky, které byly již před mnoha lety užívány jako perorální léky v léčbě stafylokokových infekcí ve Francii. V posledních letech byly vyvinuty a do praxe zavedeny i semisyntetické deriváty pristinamycinu, např. quinupristin a dalfopristin. Streptograminy působí obdobným mechanizmem jako makrolidy a linkosamidy. Ireverzibilně se váží na 50S podjednotku bakteriálního ribozomu a inhibují tak syntézu proteinů. Působí na celou řadu grampozitivních mikrobů a dále pak na gardnerely, legionely a některé kmeny Haemophilus sp. (Simon & Stille, 1998; Hershberger & kol., 2004; Nyč, 2007). V současné době je v klinické praxi využívána především kombinace dvou zmiňovaných derivátů quinupristinu a dalfopristinu, jako alternativního 41

42 léku pro léčbu nemocničních infekcí vyvolaných rezistentními kmeny grampozitivních koků (Nyč, 2007). Quinupristin Dalfopristin Obr. 28 Quinopristin a dalfopristin chemické struktury ( Oxazolidinony Další novou skupinou uvedenou do klinické praxe v nedávné době jsou syntetické oxazolidinony. Jejich originální mechanizmus účinku spočívá ve vazbě na ribozomální podjednotku 50S, čímž blokuje tvorbu tzv. iniciačního komplexu s mrna a N-formylmethionyl-tRNA navázanými na počátku. Jediným doposud schváleným představitelem z této skupiny látek pro klinické použití je linezolid, který je účinný proti grampozitivním bakteriím vč. rezistentních kmenů MRSA, VRE a VRSA, dále pak proti rezistentním koaguláza negativním stafylokokům a pneumokokům rezistentním k penicilinu. Výskyt rezistence je zatím sporadický, ale vždy alarmující, jelikož se jedná o rezervní typ antibiotika. Určen je především k léčbě pneumonií a infekcí kůže a měkkých tkání (Votava & kol., 2001; Nyč, 2007). Obr. 29 Linezolid chemická struktura 42

43 Lipopeptidy Další nově studovanou skupinou antibiotik jsou cyklické lipopeptidy. Hlavním představitelem je daptomycin. Jedná se o 13 členný aminokyselinový cyklický lipopeptid s vedlejším 10 členným uhlíkovým řetězcem. Jeho unikátní vlastností je současná přítomnost lipofilní a hydrofilní oblasti. Daptomycin se váže na cytoplazmatickou membránu bakterie a způsobuje její depolarizaci, také ukončuje syntézu bílkovin, nukleových kyselin a kyseliny lipoteichoové. Smrt bakteriální buňky nastává v důsledku efluxu draslíku. Daptomycin na rozdíl od tzv. stěnových antibiotik jako jsou např. vankomycin nebo oxacilin nezpůsobuje bakteriální lýzu a z usmrcené buňky tudíž nedochází k nadměrnému úniku bakteriálních toxinů a jiných fragmentů, které by vyvolaly silnou protizánětlivou reakci (Marešová & Urbášková, 2011). Antibakteriální spektrum daptomycinu je podobné jako u vankomycinu nebo teikoplaninu. Působí na většinu grampozitivních bakterií, vč. multirezistentních kmenů a některých sporulujících i nesporulujících anaerobů. V České republice byl poprvé registrován v roce 2006 (Marešová & Urbášková, 2011). Obr. 30 Daptomycin chemická struktura (Eisenstein & kol., 2010) Glycylcykliny Glycylcykliny jsou semisyntetické deriváty tetracyklinů, které mají široké spektrum účinku. Prvním zástupcem, který se dostal do klinické praxe a u nás byl registrován v roce 2008, je tigecyklin. Toto antibiotikum se váže na 30S podjednotku bakteriálního ribozomu a brání tak přístupu trna. To vede 43

44 k zamezení inkorporace aminokyselin do peptidových řetězců při syntéze proteinů a následné inaktivaci růstu mikroba. Oproti tetracyklinům se tigecyklin váže na ribozom s mnohem vyšší afinitou a v jiné prostorové orientaci. Působí na celou řadu grampozitivních i gramnegativních bakterií, vč. bakterií atypických a anaerobních. Jeho velký význam spočívá v jeho účinku na rezistentní kmeny stafylokoků (MRSA), enterokoků (VRE) a na producenty širokospektrých beta-laktamáz (Marešová & Urbášková, 2008; Votava & kol., 2010; internet 5). Obr. 31 Tigecyklin chemická struktura 2.5. Druhá tvář antibiotik Jak již bylo zmíněno v předchozím textu, objev antibiotik znamenal obrovský pokrok v historii léčby infekčních onemocnění. Antibiotika totiž umožnila léčit a dokonce vyléčit řadu nemocí, jejichž průběh a výsledek byl v období předcházejícím přinejmenším velmi nejistý, ne-li katastrofální. Dokázala změnit průběh a snížit mortalitu mnoha infekčních chorob, umožnila předcházet jejich pozdním, nezřídka trvalým následkům, přispěla také k vytvoření podmínek pro rozvoj chirurgických a mnoha dalších medicínských oborů díky snížení výskytu infekčních komplikací, které dříve zatěžovaly náročné operace a jiné terapeutické zásahy. Díky antibiotikům se mohla rozvinout účinná terapie těžkých popálenin a polytraumat, transplantace orgánů, alloplastika a celá řada dalších náročných operací. Není tedy divu, že díky objevu takto mocných léčivých přípravků zavládlo mezi lidmi přesvědčení, že nastal čas konečného zúčtování s infekčními nemocemi, že se lidstvu podařilo získat zbraň, která infekční nemoci zcela vymýtí. Netrvalo však dlouho a ukázalo se, že toto přesvědčení bylo optimistické až příliš (Vacek, 1997). 44

45 Antibiotika i přes jejich nesporně velký přínos s sebou přinášejí i řadu komplikací a nežádoucích účinků (Vacek, 1997). Na klinicky použitelné antibiotické preparáty je stanoveno několik základních požadavků. Patří mezi ně především tzv. selektivní toxicita, což znamená, že antibiotikum musí působit výhradně na cílovou skupinu mikroorganizmů a nesmí při tom poškozovat eukaryontní buňky, a dále pak schopnost antibiotika dosáhnout účinku již při nízkých koncentracích, řádově mg/l, v co nejkratší době od podání preparátu pacientovi (Bednář & kol., 2009). I přes tyto dané požadavky jsou antibiotika látkami všeobecně pro člověka látkami cizími, tedy nejsou jeho tělu vlastní, a tudíž žádné antibiotikum není pro makroorganizmus zcela neškodné. Jako celek jsou však antibiotika díky chemické odlišnosti enzymatických systémů a buněčných komponent mikroorganizmů od obdobných struktur lidské resp. savčí buňky pro člověka relativně málo toxická. Tyto rozdíly však nejsou absolutní a proto s každým podáním antibiotika je nutné počítat s určitým stupněm toxicity. Většinou k uplatnění toxického vlivu antibiotik dochází všeobecně až při předávkování, tedy při podání vyšších koncentrací antibiotika než odpovídá terapeutickému rozmezí. V praxi jsou takovémuto riziku vystaveni především pacienti s postižením jater či ledvin, v graviditě a v případě extrémně vysokého nebo nízkého věku jedince. Dnes jsou tyto komplikace díky dostatečným znalostem farmakologie omezené na minimum, avšak k antibiotikům je třeba vždy přistupovat stejně jako ke každému jinému účinnému léku, tedy brát v úvahu indikace, kontraindikace, nežádoucí účinky i lékové interakce a jejich podání vždy patřičně zvážit (Vacek, 1997; Votava & kol., 2001). Jedním z nezanedbatelných nežádoucích účinků antibiotik je jejich negativní ovlivnění přirozené mikroflóry člověka. Mikrobní flóra přirozeně osidlující lidské tělo je významnou součástí tzv. nespecifické resp. vrozené imunity. Její význam spočívá v zabránění usídlení patogenních mikroorganizmů v těle člověka, příp. omezuje přežívání a množení patogenů, kterým se usídlení na tělních površích již podařilo. Zároveň se přítomnost přirozené mikrobioty podílí na permanentní stimulaci imunitního systému hostitele, který je tak schopen odolávat případné invazi patogenů mnohem lépe, než kdyby přirozenou mikroflórou osídlen nebyl. V neposlední řadě je rovněž důležitou 45

46 funkcí mikroorganizmů osidlující střevní sliznice produkce některých vitamínů, zejména vitamínu K (Jílek, 2008; Votava & kol., 2010). Negativní vliv antibiotik na přirozenou mikroflóru člověka spočívá v narušení vzájemných poměrů, které jsou v této složité živé soustavě nesmírně důležité. Podané antibiotikum může způsobit redukci až vyhubení některých běžně přítomných kmenů či druhů mikroorganizmů a umožňuje tak přemnožení jiných. Případně takto oslabená bariéra usnadní kolonizaci pacienta cizím mikrobem z prostředí. Oba tyto stavy mohou vést u pacienta k rozvoji nového onemocnění. Často se jedná pouze o přechodné gastrointestinální potíže či superficiální kandidózu, jindy však mohou být následky závažnější. Může dojít k rozvoji superinfekce či sekundární infekce, jejíž průběh a příp. i následky mohou být podstatně závažnější, než tomu bylo u nemoci, proti které bylo antibiotikum původně předepsáno. Příkladem je pseudomembranózní kolitida způsobená bakterií Clostridium difficile. Tato grampozitivní anaerobní tyčka může být součástí běžné mikroflóry střev. Některé zdroje uvádějí, že se běžně vyskytuje přibližně u 5% zdravých dospělých. U dětí a kojenců je její výskyt vyšší. Clostridium difficile produkuje toxiny, které jsou schopny vyvolat střevní postižení, od lehkého průjmového onemocnění až po zmiňovanou život ohrožující pseudomembranózní kolitidu. Tato onemocnění často vznikají jako nozokomiální infekce v souvislosti s podáním daného antibiotika. Jedná se především o podávání širokospektrých penicilinů, např. amoxicilinu v kombinaci s kyselinou klavulánovou, a cefalosporinů, zejména cefoxitinu. Působení těchto antibiotik vede k eliminaci normální střevní flóry a umožňuje tak přemnožení rezistentních kmenů C. difficile, která následně může poškozovat střevní sliznici a vyvolat klinické příznaky uvedených onemocnění (Vacek, 1997; Votava & kol., 2001; Votava & kol., 2003). Běžný bývá výskyt střevních dyspepsií projevující se především průjmem, vznikající v důsledku narušení mikroflóry zvláště po podání tetracyklinů. K nežádoucím účinkům vznikající v důsledku narušení střevní mikroflóry patří také hypovitaminóza K s následným krvácením. Tato komplikace se může objevovat např. po léčbě cefalosporiny III. generace (Votava & kol., 2001). 46

47 Největší problém však dnes ve spojitosti s podáváním antibiotik představuje alarmující nárůst antimikrobiální rezistence, která v dnešní době dosahuje již globálních rozměrů. Světová zdravotnická organizace uvádí, že každý rok zemře v zemích Evropské unie lidí pouze v důsledku nákazy rezistentní bakterií. Hlavní příčinou nárůstu výskytu rezistentních kmenů je paradoxně právě používání antibiotik, přesněji řečeno jejich nadměrné užívání. Antibiotika jsou často zbytečně předepisována a užívána u virových nebo samoúzdravných banálních infekcí způsobených bakteriemi. Antibiotika v případě virové infekce nemají vliv na uzdravení pacienta, ale negativně ovlivňují přirozeně se vyskytující mikroflóru jedince. Uplatňuje se zde především tzv. selekční tlak antibiotika, který vyvolává inhibici nebo úplné uhynutí citlivých bakteriálních buněk, ale zároveň neovlivňuje proliferaci rezistentních kmenů. Dochází tak k narušení vzájemného poměrného zastoupení jednotlivých druhů přirozeně osidlujících kůži a sliznice pacienta, kdy přemnožené rezistentní kmeny mohou následně vyvolat u daného jedince novou infekci, která z hlediska antibiotické léčby bude z důvodu přítomnosti rezistentních kmenů závažnější a terapie obtížnější. Zároveň je zde zvýšené riziko kolonizace pacienta patogenními bakteriemi z vnějšího okolí, které s sebou nesou opět riziko vzniku nové infekce (Votava & kol, 2001; Urbášková, 2004; Votava & kol., 2010; internet 6). Nejčastěji dochází k výskytu rezistentních kmenů a zároveň infekcí jimi způsobenými v nemocničních prostředích, kde je využití antibiotik nejčastější (Votava & kol., 2001) Antimikrobiální rezistence Světová zdravotnická organizace definuje antimikrobiální rezistenci jako schopnost mikroorganizmů odolávat působení antibiotického preparátu, proti kterému byli původně citliví. V důsledku tohoto jevu se tak léčba daného onemocnění stává neefektivní, infekce přetrvává a může být přenášená na další jedince. Pacient tak může zemřít i na jinak běžně se vyskytující a snadno léčitelnou infekci (Nyč, 2004; internet 7). 47

48 U mikroorganizmů rozlišujeme dva typy rezistencí. Jedná se o rezistenci primární neboli přirozenou a sekundární neboli získanou (Lochmann, 1994). Primárně rezistentní mikroorganizmy jsou přirozeně odolné vůči působení daného typu antibiotika. Tento typ rezistence je způsoben nepřístupností či úplnou nepřítomností cílové struktury pro dané antibiotikum. Příkladem mohou být beta-laktamová antibiotika, která nepůsobí na houbové organizmy, jelikož peptidoglykan jako cílová struktura beta-laktamových antibiotik není součástí stěn hub. Dalším klasickým příkladem primární rezistence mohou být např. vlastní producenti antimikrobiálních látek. Typická je také přirozená rezistence gramnegativních střevních tyček na penicilin, makrolidy a linkosamidy, klebsiel na ampicilin nebo streptokoků na aminoglykosidy (Trejbalová & Trejbal, 1988; Lochmann, 1994; Buchta & kol., 1998; Votava & kol., 2001). Daleko závažnější problém z lékařského hlediska však představuje rezistence získaná, kdy kmeny mikrobiálních druhů původně na dané antibiotikum citlivé se stávají rezistentními. Tento typ rezistence vzniká nejčastěji při dlouhodobé a nekontrolované léčbě antibiotiky nebo může být důvodem nevhodně zvolená antibiotická profylaxe. Nejvíce rezistentních kmenů se objevuje zejména v místech, kde se antibiotika používají ve velkém množství. Jedná se především o nemocnice. Na stoupající rezistenci se však podepisuje i nadměrné používání antibiotik v zemědělství jednak pro léčbu infekcí ale také ke zvýšení váhových přírůstků v chovech dobytka apod. (Lochmann, 1994; Buchta & kol., 1998; Gorbach, 2001; Votava & kol., 2001). Rezistence na antibiotické preparáty může prakticky vzniknout dvěma způsoby. Jedná se buď o tzv. fenotypickou nebo genotypickou adaptaci (Lochmann, 1994). V případě fenotypické rezistence dochází u daného mikroorganizmu k přechodnému přizpůsobení se změnám jeho vnitřního či vnějšího prostředí. Přítomnost např. penicilinu u některých typů bakterií může vyvolat tvorbu penicilináz - enzymů, které rozkládají laktamový kruh v molekule penicilinových antibiotik. U některých mikroorganizmů může v rámci fenotypické rezistence také dojít ke ztrátě či změně struktury buněčné stěny (Lochmann, 1994; Buchta & kol., 1998; internet 8). 48

49 Fenotypický typ rezistence lze poměrně dobře zvládnout buď podáním vyšší dávky daného antibiotika, nebo naopak jeho úplným vysazením, čímž se u mikroorganizmů obnoví původní metabolické pochody (Lochmann, 1994). Z klinického hlediska má však význam především genotypická rezistence. V tomto případě dochází ke vzniku rezistentních kmenů mutací tzv. chromozomální rezistence, nebo přenesením genu pro rezistenci pomocí plazmidu či transpozonu z rezistentní buňky do buňky citlivé tzv. extrachromozomální rezistence (Lochmann, 1994). Vlastní mechanizmy, kterými bakterie nabývají rezistence vůči antimikrobiálním látkám lze rozdělit do 4 typů: 1/ Změna v místě působení antibiotika V tomto případě dochází v důsledku mutace k tvorbě pozměněných bílkovin receptorů, na které se dané antibiotikum běžně váže. Antibiotikum tak není schopno navázat se na daný receptor a uplatnit svůj efekt. Tento mechanizmus je známý např. u rezistence na makrolidy či linkosamidy, ale i na beta-laktamy (Lochmann, 1994; Votava & kol., 2001). 2/ Nepropustnost (impermeabilita) Na transportu antibiotik do buňky se mohou podílet buď tzv. přenašeče, nebo je využit aktivní transport závislý na přítomnosti molekul ATP. Změnou molekuly přenašeče nebo ovlivněním tvorby ATP, které je pro aktivní transport nezbytné, dochází ke snížení až úplnému zastavení transportu antibiotik do buňky. Antibiotikum tak ztrácí přístup k cílové struktuře a tedy i možnost uplatnění svého účinku. Tento mechanizmus byl popsán např. u aminoglykosidů, tetracyklinů nebo chinolonů (Lochmann, 1994; Buchta & kol., 1998; Votava & kol., 2001). 3/ Náhrada cílové struktury V tomto případě je mikrob schopen vytvořit si náhradní strukturu, např. enzym, který je odolný vůči působení daného antibiotika. Nejčastěji tuto schopnost získává díky plazmidickému přenosu rezistence (Lochmann, 1994; Buchta & kol. 1998). 4/ Inaktivace příp. modifikace antibiotika Tento mechanizmus patří mezi nejvšeobecnější mechanizmy přenosné rezistence. Rezistentní kmeny získávají schopnost produkovat enzymy, které 49

50 buď přímo štěpí, nebo substituují molekuly antibiotika a činí je tak opět neúčinnými. Typickým příkladem takovýchto enzymů jsou beta-laktamázy. Tyto enzymy působí proti beta-laktamovým antibiotikům, u kterých vyvolávají hydrolýzu beta-laktamového kruhu (Lochmann, 1994; Buchta & kol., 1998; Votava & kol., 2001) Testované kmeny Staphylococcus aureus Stafylokoky, grampozitivní koky o průměru zhruba 1µm, uspořádané jednotlivě, v párech, tetrádách, velmi krátkých řetízcích a zejména v nepravidelných shlucích tvaru hroznu, byly poprvé pozorovány r Louisem Pasteurem a skotským chirurgem a amatérským mikrobiologem Alexanderem Ogstonem (Votava & kol., 2003). Rod Staphylococcus zahrnuje desítky druhů, z nichž pouze některé se uplatňují v humánní medicíně. Podle schopnosti koagulovat plazmu jsou stafylokoky děleny do dvou hlavních skupin. Pro člověka mají z hlediska patogenity největší význam koaguláza-pozitivní druh S. aureus a koagulázanegativní druhy S. epidermidis a S. saprophyticus (Votava & kol., 2000; Bednář & kol., 2009). Kromě S. aureus je do skupiny koaguláza-pozitivních stafylokoků řazeno ještě několik dalších druhů, resp. poddruhů. Ty se však u člověka běžně nevyskytují a patří spíše mezi zvířecí patogeny. Výjimečně však mohou být tyto druhy izolovány u lidí, kteří přicházejí do častého kontaktu se zvířaty nebo z hnisajících ran po kousnutí kolonizovaným hostitelem (Votava & kol., 2003; Bednář & kol., 2009). U S. aureus jsou rozeznávány ještě další dva poddruhy: S. aureus subsp. aureus a S. aureus subsp. anaerobius. Avšak poddruh S. anaerobius se u člověka běžně nenalézá. Z tohoto důvodu je tato diplomová práce zaměřena na testování citlivosti kmene S. aureus subsp. aureus a pro jednoduchost bude označován pouze S. aureus (Votava & kol., 2003). 50

51 S. aureus představuje pro člověka podmíněného patogena, který přibližně u třetiny lidí žije ve vztahu blízkém komenzalizmu. Nalézá se především na kůži a sliznicích, kde nevyvolává u zdravých jedinců žádné obtíže. Stačí však sebemenší porucha přirozené odolnosti člověka nebo infekce velkou dávkou virulentního kmene a tento nenápadný kok snadno pronikne do tkání a vyvolá onemocnění od banálních kožních hnisavých infekcí přes závažné záněty vnitřních orgánů až po smrtelně probíhající sepse. Významným predisponujícím faktorem může být např. chirurgický zákrok, úraz, umělá náhrada, zavedený katétr, maligní onemocnění, diabetes mellitus či imunologická nedostatečnost. Většímu riziku jsou vystaveni také nedonošení novorozenci, kojenci a staří lidé (Votava & kol., 2003; Bednář & kol., 2009). K jednoznačným výhodám S. aureus, které z něj dělají jednoho z nejúspěšnějších lidských patogenů vůbec, patří bez pochyby jeho poměrně vysoká odolnost vůči zevním podmínkám a celá řada virulentních faktorů, které mu pomáhají v invazi do tkání hostitele a vyvolání až smrtelně nebezpečných infekcí. S. aureus je totiž schopný odolávat vyschnutí, a to především v hnisu, působení teplot okolo 60 C a množit se v přítomnosti až 10% roztoku NaCl. Je odolný vůči některým dezinfekčním prostředkům, jako je např. fenol. Alkohol, zvláště ve vyšších koncentracích, na něj působí spíše jako konzervační činidlo než jako hubící nástroj. V selektivních půdách odolává přítomnosti glycinu, lithia a telluričitanu (Votava & kol., 2003). Faktory virulence, kterými S. aureus oplývá lze rozdělit do dvou skupin, na faktory povrchové a extracelulární. Z povrchových faktorů je to např. protein A mající mimo jiné schopnost nespecificky reagovat s Fc-fragmentem imunoglobulinů a chránit tak stafylokoka před opsonizací protilátkami, nebo polysacharid A, který se uplatňuje v adhezi na sliznice a rány. Extracelulární faktory virulence jsou pak představovány celou řadou enzymů a toxinů, které S. aureus produkuje. Mezi tyto enzymy patří např. koaguláza, kataláza, hyaluronidáza, fibrinolyzin, penicilináza a další. Z toxinů charakteristických pro S. aureus lze zmínit toxin syndromu toxického šoku 1 (TSST-1) vyvolávající stejnojmenné onemocnění, tzv. exfoliantiny způsobující kožní puchýřnaté onemocnění zvané syndrom opařené kůže, a různé druhy enterotoxinů, které způsobují pacientovi gastrointestinální obtíže, zejména průjem a zvracení. 51

52 Z enterotoxinů je nejběžnější produkce enterotoxinu typu A. U nemocničních kmenů je to pak spíše enterotoxin typu B spojený s výskytem pseudomembranózní kolitidy po předchozí léčbě antibiotiky (Votava & kol., 2003; Bednář & kol., 2009). Mezi nejběžnější stafylokokové infekce patří hnisavá onemocnění kůže a jejich adnex obecně nazývané pyodermie. Z těchto pyodermií se jedná nejčastěji o impetigo, folikulitidu a furunkl. S. aureus dále patří mezi nejčastější původce hnisání ran, ať už se jedná o běžná povrchová zranění, popáleniny či rány vzniklé v důsledku operace. Ke vzniku této infekce je však třeba, aby v ráně zůstalo přítomné tzv. corpus alienum neboli cizí těleso, na které stafylokoky snadno adherují. Příkladem může být tříska, špína, stehy apod. Infikované rány bývají pro stafylokoka často vstupní branou do dalších tkání lidského organizmu, především oblastních mízních uzlin, odkud se stafylokoky dostávají do krve, což může vést až ke vzniku sepse. Původní infekční ložisko u takovýchto sepsí často nebývá patrno. Mimo to může být S. aureus krví zanesen do vnitřních orgánů, v nichž může dojít ke vzniku pro stafylokoky charakteristických ohraničených zánětlivých ložisek, tzv. abscesů. Pro člověka životu nebezpečnou se stává také akutní stafylokoková endokarditida, při níž dochází k osídlení srdeční chlopně stafylokoky, kde vytváří zvláštní typ biofilmu tvořeného kromě buněk stafylokoků ještě mezibuněčnou hmotou. Z tohoto biofilmu se stafylokoky postupně uvolňují a jako septické vmetky neboli emboly jsou roznášeny po těle a vyvolávají vznik metastatických abscesů na nejrůznějších místech organizmu jako např. v kůži, plicích, ledvinách či mozku. Z infekcí dýchacích cest jsou pro S. aureus běžné akutní záněty vedlejších dutin nosních a plic. Vyvolává také závažné sekundární pneumonie a bronchopneumonie navazující na předchozí infekci virem chřipky. Virová infekce zastavuje u respiračního epitelu pohyb řasinek, což má za následek hromadění se vdechnutých stafylokoků v bronších. Ti se zde množí a enzymy, které produkují, aktivují virový hemaglutinin, což podněcuje další množení virů chřipky (Votava & kol. 2003; Bednář & kol., 2009). Pravděpodobně díky již zmiňovanému bohatému spektru virulentních faktorů S. aureus, ale také jeho značné odolnosti vůči lysozomálním enzymům 52

53 a schopnosti dočasně přežívat v makrofázích, mají stafylokokové infekce sklon k recidivám a chronickému průběhu (Bednář & kol., 2009). Ačkoliv byl nejvýznamnější antibiotický preparát penicilin Alexanderem Flemingem objeven na základě jeho baktericidních účinků právě vůči stafylokokové populaci, je v dnešní době většina kmenů S. aureus na penicilin rezistentní. Tyto rezistentní kmeny získaly postupem času plazmid kódující schopnost tvořit enzym penicilinázu, tedy druh beta-laktamázy specificky štěpící molekulu penicilinu. Většina komunitních kmenů je v České republice naštěstí ještě stále citlivá k penicilinům semisyntetickým. Do molekuly těchto penicilinů je vnesena vhodná skupina, která brání přístupu penicilinázy k citlivému místu na beta-laktamovém kruhu. Z těchto penicilináza-rezistentních penicilinových antibiotik jsou k dispozici např. oxacilin, kloxacilin, flukloxacilin a methicilin, který se však v České republice neužívá. Naneštěstí se stejně jako v případě klasického penicilinu záhy objevily kmeny S. aureus rezistentní i na tyto semisyntetické peniciliny. Tyto kmeny jsou označovány zkratkou MRSA (z angl. methicilin-resistant S. aureus). Vysoké riziko tyto kmeny představují především v nemocničním prostředí, kde jejich výskyt stále narůstá. Podstatou rezistence buněk S. aureus na methicilin či oxacilin je nejčastěji přítomnost genu meca. Tento gen kóduje pozměněný druh penicilin vázajícího proteinu označovaný PBP2a, který si zachovává svoji enzymatickou schopnost uplatňující se při výstavbě buněčné stěny bakterií, ale na peniciliny se na rozdíl od běžných PBP transpeptidáz neváže. MRSA kmeny jsou všeobecně rezistentní vůči všem beta-laktamovým antibiotikům, včetně jejich kombinací s inhibitory beta-laktamáz. Jsou tedy rezistentní i vůči cefalosporinům, karbapenemům a monobaktamům. Velký problém představuje i fakt, že se MRSA kmeny staly postupně rezistentní i na řadu dalších antibiotik jako jsou především makrolidy, aminoglykosidy, tetracykliny, chloramfenikol, fluorochinolony a rifampicin. Tyto kmeny se vyskytují endemicky ve zdravotnických zařízeních jako původci nebezpečných nozokomiálních nákaz a díky zmiňované multirezistenci, kterou tyto kmeny oplývají, představují u infikovaných oslabených pacientů vážný terapeutický problém. U nejzávažnějších, život ohrožujících infekcí způsobených právě multirezistentními kmeny S. aureus jsou pak indikována tzv. rezervní glykopeptidová antibiotika jako je např. vankomycin či teikoplanin. 53

54 V současné době se však objevují kmeny vysoce rezistentní i vůči těmto lékům poslední volby. Jedná se o tzv. VRSA kmeny (z angl. vancomycin-resistant S. aureus) či lépe GRSA (glycopeptide-resistant S. aureus). Poprvé byly tyto kmeny pozorovány v r Jejich úplná rezistence ke glykopeptidovým antibiotikům souvisí s přítomností genu vana, který pravděpodobně tyto kmeny získaly od enterokoků. Panuje tedy oprávněná obava, že by postupem času mohl vzniknout natolik polyrezistentní kmen, že na infekce jím vyvolané lidem nezbude už žádný lék (Votava & kol., 2003; Bednář & kol., 2009; Vitouš, 2010). Vzhledem k vysoké variabilitě rezistence je u kmenů S. aureus nutné vždy testovat citlivost k antibiotikům a v případě těžších infekcí kvantitativně vyhodnotit minimální inhibiční koncentraci antibiotické terapie (Bednář & kol., 2009). Nezanedbatelný význam v léčbě, resp. v zabránění šíření a rostoucímu výskytu infekcí způsobených rezistentními kmeny S. aureus má však stále profylaxe stafylokokových nákaz, která zahrnuje řádné ošetření ran, jejich vyčištění a dezinfekce antiseptiky, přísné dodržování zásad asepse v rámci péče o operační rány a použití šetrné operační techniky, antibiotická profylaxe při operacích v kontaminovaném prostředí a samozřejmě pečlivé dodržování základních hygienických zásad mytím rukou počínaje (Votava & kol., 2003). Přestože byl v roce 2010 zaznamenán v určitých evropských zemích pokles výskytu MRSA kmenů, který vyvolal naději, že vykonané úsilí potlačit rozvoj rezistence právě u kmenů S. aureus přinesl konečně ovoce, byl naopak prokázán významně rostoucí trend ve výskytu MRSA kmenů např. v Itálii, Maďarsku, Německu a Slovinsku. Podíl methicilin rezistentních kmenů S. aureus představuje stále ve více než čtvrtině evropských zemí více jak 25% všech kmenů S. aureus a existují dnes i státy, kde podíl MRSA tvoří i více než 50% kmenů S. aureus, jak je patrno z následujících schémat (Adámková, 2010, internet 9). 54

55 Obr. 32 S. aureus: výskyt rezistentních kmenů v Evropě (2009) ( Obr. 33 S. aureus: výskyt rezistentních kmenů v Evropě (2010) ( 55

56 Obr. 34 S. aureus: výskyt rezistentních kmenů v Evropě (2011) ( Staphylococcus epidermidis S. epidermidis patří do skupiny koaguláza-negativních stafylokoků, kteří na rozdíl od S. aureus nemají schopnost koagulovat plazmu. Všeobecně se tyto druhy stafylokoků běžně vyskytují na kůži a sliznicích lidí i zvířat jako součást jejich fyziologické mikroflóry. S. epidermidis se pak v porovnání s ostatními koaguláza-negativními druhy vyskytuje u člověka dominantně na kůži obličeje, v axilách a oblasti třísel, na perineu, končetinách, v prostorách mezi prsty a na sliznici nosohltanu (Bednář & kol., 2009). S. epidermidis, na rozdíl od S. aureus, neoplývá produkcí takového spektra enzymů a toxinů. Kromě koagulázy není S. epidermidis schopen produkovat alfa ani beta hemolyzin, leukocidin, fibrinolyzin nebo termostabilní nukleázu a žádný z pro S. aureus typických toxinů jako je TSST-1, exfoliantiny a enterotoxiny (Bednář & kol., 2009). S. epidermidis představuje pro člověka, stejně jako S. aureus, podmíněného patogena, který vyvolává onemocnění především u oslabených 56

57 pacientů např. z důvodu popálenin, těžkých úrazů, chirurgických zákroků nebo imunologické nedostatečnosti. V posledních letech onemocnění vyvolaných tímto patogenem stále přibývá. Příčinou mohou být častější používání náročných invazivních vyšetření, komplikované a dlouhotrvající chirurgické zákroky a léčebné metody spojené s imunosupresí (Bednář & kol., 2009). Stejně jako u S. aureus je pro S. epidermidis důležitým predisponujícím faktorem pro vznik infekce přítomnost cizího tělesa. Jedná se především o předměty vyrobené z umělých hmot zavedené do těla pacienta odborným zákrokem lékaře. Nejčastěji to bývají různé katétry, cévní náhrady, umělé chlopně a klouby a další. Buňky S. epidermidis na tyto umělohmotné předměty dobře adherují a přitom do svého okolí produkují polysacharidovou substanci, která kolem buněk vytváří slizovitou vrstvu. Tato vrstva upevňuje adherenci stafylokokových buněk a zabraňuje průniku antibiotik, protilátek a kontaktu s fagocyty (Bednář & kol., 2009). Jelikož je S. epidermidis běžnou součástí lidské mikroflóry, často mívají infekce endogenní charakter, případně může být jejich původ spojen s ošetřujícím personálem. Jedná se většinou o onemocnění nozokomiálního charakteru, které pacient získává v důsledku jeho pobytu ve zdravotnickém zařízení. Tyto mikroby jsou zpravidla multirezistentní k antibiotikům a často dokonce v mnohem větším rozsahu než je tomu u S. aureus. Proto je vedle antibiotické terapie často nezbytné i odstranění infikované umělé hmoty z organizmu pacienta, které u imunokompetentních pacientů vede ve většině případů k ukončení infekce (Bednář & kol., 2009; Vydra & Prusík, 2011). Mezi nejběžnější onemocnění způsobené S. epidermidis patří sepse, endokarditidy, meningitidy, endoftalmitidy nebo infekce močových cest (Bednář & kol., 2009) Enterococcus sp. Jedná se o grampozitivní, oválné až lehce protáhlé koky uspořádané většinou ve dvojicích, drobných shlucích příp. krátkých řetízcích. V klinickém materiálu mohou svou morfologií připomínat pneumokoky. Patří mezi fakultativně anaerobní mikroorganizmy, které jsou kataláza negativní. Dříve byly enterokoky řazeny do rodu Streptococcus, avšak kvůli řadě odlišných vlastností 57

58 a na základě srovnání genomu byl nakonec ustaven samostatný rod Enterococcus. Enterokoky se od streptokoků liší svojí kultivační nenáročností, rezistencí k vysokému ph (8,5), schopností růst v hypertonickém roztoku (6,5% NaCl) a v širokém rozmezí teplot (10-45 C). Jsou schopni přežívat při teplotě až 60 C přibližně 30 minut (Votava & kol., 2003; Bednář & kol., 2009). Do rodu Enterococcus je dnes řazeno více jak 10 druhů avšak ve vztahu k člověku mají největší význam E. faecalis, E. faecium a E. durans, přičemž z 90% stojí za enterokokovými infekcemi člověka E. faecalis, z 7% pak E. faecium. Ostaní druhy jako jsou např. E. gallinarium, E. casseliflavus, E. mundtii, E. flavescens, a další se při infekcích uplatňují jen velmi vzácně (Votava & kol., 2003; Bednář & kol., 2009). Enterokoky představují důležitou součást normální mikroflóry člověka, především tlustého střeva. Jejich výskyt však může být prokázán i v tenkém střevě, genitálním traktu a výjimečně i v horních cestách dýchacích (Bednář & kol., 2009). Pro člověka tyto mikroorganizmy představují závažné podmíněné patogeny. Patří mezi významné původce infekcí močových a žlučových cest, ale také gynekologických zánětů a pooperačních infekčních komplikací v břišní chirurgii. Zejména u starších jedinců a intravenózních uživatelů drog mohou být izolovány z hemokultur při bakteriální endokarditidě, která je spojována poměrně s vysokou mortalitou pacientů. Svou roli hrají také jako původci bakteriémií a katétrových sepsí, meningitid, peritonitid a osteomyelitid (Votava & kol., 2003; Bednář & kol., 2009). Infekce vyvolané enterokoky mohou mít jak endogenní tak exogenní charakter a často bývá jejich výskyt spojen s hospitalizací pacienta. Nozokomiální kmeny enterokoků bývají často rezistentní na všechna konvenčně používaná antibiotika a nebezpečí představují především pro pacienty dlouhodobě hospitalizované se zavedenými močovými a intravaskulárními katétry a u pacientů léčených širokospektrými antibiotiky, jako jsou např. aminoglykosidy a cefalosporiny (Votava & kol., 2003). Enterokoky jsou všeobecně primárně rezistentní vůči cefalosporinům I., II. a III. generace. Z hlediska léčby lehčích infekcí močového traktu je doporučeno podávat ampicilin, příp. i v kombinaci s inhibitorem beta-laktamáz, 58

59 fluorochinolony a nitrofurantoin. Pro léčbu raných infekcí, abdominálních sepsí, urosepsí a endokarditid se uplatňují především kombinace aminoglykosidů s penicilinem, ampicilinem nebo glykopeptidy jako je vankomycin a teikoplanin. V poslední době však stále roste množství rezistentních kmenů a to nejen vůči vankomycinu, ale i aminoglykosidům, ampicilinům a penicilinům. K léčbě infekcí způsobených těmito kmeny lze použít např. linezolid, kombinaci quinupristin/dalfopristin a některé novější typy fluorochinolonů (Votava & kol., 2003). Obr. 35 E. faecalis: výskyt rezistentních kmenů k vankomycinu v Evropě (2010) ( 59

60 Obr. 36 E. faecalis: výskyt rezistentních kmenů k vankomycinu v Evropě (2011) ( Obr. 37 E. faecium: výskyt rezistentních kmenů k vankomycinu v Evropě (2011) ( 60

61 Escherichia coli E. coli je pravděpodobně jednou z nejznámějších bakterií vůbec. Dříve byla známa pod názvem Bacterium coli. Její současné jméno je odvozeno od rakouského lékaře a bakteriologa Theodora von Eschericha, kterým byla roku 1885 poprvé izolována (Votava & kol., 2003; Votava & kol., 2010). Patří do čeledí Enterobacteriacae, ve které představuje pro člověka nejvýznamnější potenciálně patogenní bakterii. Vedle druhu E. coli patří do rodu Escherichia i další druhy, např. E. vulneris, E. hermanii či E. fergusoni. Tyto druhy však člověka běžně nenapadají a jejich význam pro něj zatím nebyl přesně určen (Bednář & kol., 2009; Votava & kol., 2010). E. coli je běžným komenzálem tlustého střeva a pro člověka představuje důležitou součást střevní mikroflóry. Díky produkci tzv. kolicinů, které jsou pro některé bakterie toxické, zde znemožňuje průnik patogenů a také se podílí na tvorbě některých vitamínů, především vitamínu K. Jedná se však o podmíněného patogena, který je schopný u člověka vyvolat i chorobné stavy a to jak formy intestinální tak extraintestinální. Ve střevě je to možné jen tehdy, pokud je daný kmen vybaven specifickými faktory virulence, mimo střevo je E. coli patogenní téměř vždy (Votava & kol., 2003; Bednář & kol., 2009; Votava & kol., 2010). V případě intestinálních forem se prakticky vždy jedná o průjmová onemocnění. Ta jsou vyvolávána různými kmeny, které se dělí do několika skupin na kmeny enteropatogenní (EPEC), enterotoxigenní (ETEC), enteroinvatzivní (EIEC) a enterohemorhagické (EHEC). Enteropatogenní kmeny způsobují zejména vodnaté průjmy novorozenců a kojenců, u kterých dochází k následné dehydrataci a případně i ke smrti. Nejznámějšími antigenními typy jsou O55, O111, O126, O86 a další. V patogenezi onemocnění se obvykle uplatňuje schopnost těchto kmenů přilnout na střevní sliznici, a proto jsou tyto kmeny též označovány jako enteroadherentní (EAEC). Představují problém především v rozvojových zemích. ETEC kmeny vyvolávají průjmová onemocnění nejen u dětí, ale i dospělých a vyskytují se převážně endemicky v teplých oblastech, jako je např. Egypt, Mexiko apod. Do střední Evropy se dostávají při návratu cestovatelů, a proto se těmto onemocněním obecně říká cestovatelské průjmy. Při mechanizmu účinku se uplatňují dva enterotoxiny, 61

62 které tyto kmeny produkují. Výsledkem je charakteristický vodnatý průjem. Enteroinvazivní kmeny E. coli mají podobně jako shigely schopnost pronikat do buněk střevní sliznice, kde se množí a způsobují jejich destrukci. Infekce těmito kmeny vede ke krvavým průjmům, které se nejen svým mechanizmem účinku, ale i klinickým obrazem velmi podobají právě průjmům vyvolanými kmeny shigel. Nejběžnějším sérotypem je O124. EHEC kmeny označované též STEC (shiga-like toxigenní E. coli) díky schopnosti produkovat toxin podobný shigelovému a stejně tak podobnému průběhu infekce, patří mezi nejzávažnější původce průjmových onemocnění ze zmiňovaných skupin. Kromě těžkých krvavých průjmů, které vyvolávají, totiž často dochází ke generalizaci infekce a vzniku hemolyticko-uremického syndromu. Nejběžnějším sérotypem je O157:H7. Zdrojem infekce je nejčastěji infikované hovězí maso. Kromě zmiňovaných skupin jsou dále popisovány enteroagregativní kmeny E. coli (EAggEC), které mají také svůj podíl na již zmiňovaných cestovatelských průjmech, nebo např. difúzně adherentní kmeny (DAEC) a další (Votava & kol., 2003; Bednář & kol., 2009; Votava & kol., 2010). Mimostřevní infekce jsou vyvolány převážně komenzálními sérotypy vyskytující se běžně jako součást střevní mikroflóry člověka a jedná se tedy především o infekce endogenního charakteru. Mezi významné původce infekcí např. močových cest patří zejména tzv. uropatogenní kmeny (UPEC), vybavené specifickými faktory virulence, které jim umožňují snadnou adhezi na epitelie tohoto traktu. Všeobecně patří E. coli vůbec mezi nejčastější původce uroinfekcí. Uvádí se, že u infekcí ambulantního provozu tvoří tento mikrob více než tři čtvrtiny všech izolátů. Kromě těchto infekcí močových cest mohou E. coli v případě, že se dostanou do míst pro jejich výskyt atypických, vyvolat rovněž infekce cest dýchacích, sepse, infekce ran a další závažná onemocnění včetně novorozeneckých meningitid (Votava & kol., 2003; Bednář & kol., 2009; Votava & kol., 2010). Jako jedna z mála enterobakterií nevykazuje E. coli primární rezistenci k ampicilinu, přesto však počet rezistentních kmenů stoupá. V tomto případě jsou pak využívány především cefalosporiny I., příp. II. generace, chráněné peniciliny (ko-amoxicilin), fluorované chinolony a ko-trimoxazol. U močových infekcí se uplatňuje zejména trimetoprim v kombinaci se sulfamethoxazolem, 62

63 avšak výskyt rezistence na tento kombinovaný přípravek stále narůstá. V oblastech s výskytem rezistentních kmenů větším než 20% společnost IDSA (Infectious Diseasess Society of America) poté doporučuje léčbu fluorochinolonovými preparáty, ale rezistence i k těmto preparátům dnes představuje poměrně závažný problém, jak je vidět na obr. 38. Mezi oblíbené preparáty patří rovněž aminopeniciliny a inhibitory beta-laktamáz. inhibitorům a zmiňovaným cefalosporinům I. a II. Avšak i rezistence vůči těmto generace není dnes výjimkou. Uvádí se, že v posledním období dosáhla téměř až 40% (Klečka & Hora, 2006). Velké riziko rovněž představují multirezistentní kmeny E. coli, jejíž výskyt má také převážně rostoucí tendenci (Votava & kol., 2003; Klečka & Hora; 2006; Votava & kol., 2010; internet 13). Obr. 38 E. coli: výskyt rezistentních kmenů k fluorochinolonům v Evropě (2011) ( aps_report.aspx) Klebsiella pneumoniae Klebsiella sp. byla izolována roku 1883 berlínským patologem Carlem Friedländerem, protoo je ještě dnes klebsiela, především v Německu, označována jako Friedländerův bacil. Avšak své vědecké jméno získala 63

64 po význačném německém lékaři Edwinu Klebsovi, který v letech působil i v Praze (Votava & kol., 2003). K. pneumoniae je nepohyblivá gramnegativní tyčka patřící do čeledi Enterobacteriaceae. Běžně se vyskytuje v zažívacím traktu a dýchacích cestách zdravých lidí. Jsou však dobře adaptovány i na život mimo lidské tělo a mohou se vyskytovat např. v půdě či vodě. Pro člověka představují klebsiely podmíněně patogenní bakterie. Často bývají příčinou nozokomiálních infekcí, přičemž jejím hlavním cílem jsou pacienti na novorozeneckých odděleních a jednotkách intenzivní péče. Na jednotkách intenzivní péče vyvolávají u pacientů nejčastěji infekce močových cest. Velmi významné jsou ale také bronchopneumonie. U novorozenců představují největší riziko v podobě sepsí a hnisavých meningitid (Votava & kol., 2003; Bednář & kol., 2009). Zároveň stojí za zmínku objevení podobnosti některých klebsielových antigenů s antigeny systému HLA, konkrétně HLA-B27, což by mohlo být jedním z podkladů pro vývoj Bechtěrevovy choroby (Votava & kol., 2003). K. pneumonie jakožto nejvýznamnější druh rodu Klebsiella se dále rozlišuje na jednotlivé sérotypy podle pouzderného polysacharidového antigenu. Mezi jednotlivými kmeny existuje značná variabilita ve virulenci, kde klíčovým faktorem virulence je právě přítomnost pouzdra. Avšak význam pouzdra je v tomto případě nejednoznačný. Bylo prokázáno, že schopnost adheze opouzdřených kmenů na epiteliální buňky střeva či močového měchýře je signifikantně nižší než u kmenů neopouzdřených. Na druhé straně bylo zjištěno, že přítomnost pouzdra zřejmě potlačuje imunitní odpověď hostitele. Vedle toho se jednotlivé kmeny dále liší i specifitou svého somatického antigenu (Votava & kol., 2003; Bednář & kol., 2009). Z hlediska léčby představuje zásadní problém nárůst rezistence u nemocničních kmenů Klebsiella sp.. Primárně rezistentní bývají klebsiely pouze k ampicilinu. Terénní kmeny tedy dobře reagují na léčbu např. cefalosporiny, chinolony, ko-trimoxazolem a příp. i tetracykliny. Velké riziko však představují tzv. ESBL kmeny (z angl. extended specter beta lactamase), tedy kmeny produkující širokospektré beta-laktamázy. Tyto enzymy vyvolávají hydrolýzu beta-laktamového kruhu příslušných antibiotik a činí je tak neúčinnými vůči daným mikroorganizmům. Často tyto kmeny odolávají 64

65 i antibiotikům chráněným např. kyselinou klavulánovou či sulbaktamem. Bývají pak citlivé pouze ke karbapenemům, cefalosporinům IV. generace a někdy ještě k aminoglykosidům, nitrofurantoinu a kolistinu. Velké množství kmenů však bývá polyrezistentní a často se u nich objevuje i odolnost vůči dezinfekčním prostředkům a antiseptikům. Léčba onemocnění vyvolaných těmito kmeny pak bývá velmi obtížná (Lochmann, 1994; Votava & kol., 2003)., Ne každá rezistence mikroorganizmů z čeledi Enterobakteriacae je však způsobena pouze produkcí širokospektrých beta-laktamáz. Je proto vždy zjištění, zda kmen produkuje nebo neprodukuje ESBL velmi důležitou součástí diagnostiky enterobakterií, přinejmenším v případě polyrezistentních kmenů (Votava & kol., 2003). V posledních letech byl v Evropě zaznamenán nárůst kmenů rezistentních i vůči karbapenemům, antibiotikům považovaných za poslední volbu v léčbě infekcí vyvolaných multirezistentními kmeny gramnegativních bakterií, zahrnující právě i kmeny ESBL. Možnosti léčby takovýchto pacientů se pak stávají silně omezené. Kromě rezistence klebsiel vůči karbapenemům byl zaznamenán i nárůst rezistence proti působení cefalosporinů III. generace, fluorochinolonů a aminoglykosidů. Výskyt multirezistentních kmenů K. pneumoniae se tak bezpochyby stává jedním ze závažných globálních problémů týkající se tématu rezistence (internet 9). 65

66 Obr. 39 K. pneumoniae: výskyt rezistentních kmenů ke karbapenemům v Evropě (2009) ( Obr. 40 K. pneumoniae: výskyt rezistentních kmenů ke karbapenemům v Evropě (2010) ( 66

67 Obr. 41 K. pneumoniae: výskyt rezistentních kmenů ke karbapenemům v Evropě (2011) ( Obr. 42 K. pneumoniae: výskyt multirezistentních kmenů k cefalosporinům III. generace, fluorochinolonům a aminoglykosidům v Evropě (2011) ( 67

68 Pseudomonas aeruginosa P. aeruginosa je jednoznačně nejčastěji izolovaným a klinicky nejvýznamnějším druhem z celého rodu Pseudomonas. Jedná se o drobné pohyblivé gramnegativní striktně aerobní tyčky, které se v mikroskopu mohou jevit jako rovné, častěji však mírně zahnuté. Pohyb je zajištěn pomocí polárně umístěného svazku 2-5 bičíků. Díky svým nízkým nárokům na růstové podmínky je P. aeruginosa v přírodě poměrně hojně rozšířena. Běžně se vyskytuje v různých vodách včetně odpadních, v půdě, na povrchu rostlin a ve střevním traktu zvířat i člověka. V současné době patří mezi častou příčinu nozokomiálních nákaz a proto je možné ji ve velkém množství pozorovat v nemocničních prostředích, zvláště pak na jednotkách intenzivní péče a resuscitačních a novorozeneckých odděleních, kde kontaminuje např. dýchací přístroje, nebulizátory a katétry (Costerton, 1980; Jedličková, 1981; Votava & kol., 2000; Votava & kol., 2003; Bednář & kol., 2009). Stejně jako předešle popsané druhy mikroorganizmů představuje i P. aeruginosa pro člověka oportunního patogena, který u zdravého jedince nepředstavuje velké riziko pro vznik onemocnění. Kolonizovaný zdravý člověk může však představovat důležitý vektor šíření nemocničních nákaz. Riziko vzniku infekce se týká výhradně osob s poruchami imunity, pacientů se závažným základním onemocněním jako jsou např. maligní procesy (hlavně leukémie), diabetes mellitus, popáleniny, cystická fibróza plic, autoimunitní choroby či těžká traumata a dále pak i pacientů, jimž jsou dlouhodobě podávány různé typy léků, jako jsou kortikoidy, imunosupresiva, cytostatika nebo širokospektrá antibiotika. Mezi predisponující faktory, které přispívají k rozvoji infekce, patří i dlouhodobě zavedené cévky, tracheální kanyly, močové katétry apod. Ohroženi jsou také novorozenci, zvláště ti nedonošení, u kterých P. aeruginosa zapříčiňuje především vznik enterokolitid, sepsí a meningitid. P. aeruginosa může vyvolat závažné infekty prakticky kdekoli v organizmu. Avšak mezi nejobávanější a prognosticky nejméně příznivé patří již zmíněné infekce popálenin, u kterých rychle dochází ke vzniku sepse a smrtnost těchto sepsí se pohybuje kolem 60%. Dále jsou to osteomyelitidy, devastující infekty očí s rizikem následné ztráty oka a slepoty a sepse novorozenců (Votava & kol., 2000; Votava & kol., 2003; Bednář & kol., 2009; Votava & kol., 2010). 68

69 Léčbu onemocnění způsobených P. aeruginosa komplikuje několik faktů. Kmeny vyvolávající nozokomiální infekce jsou obvykle vysoce virulentní, ale také rezistentní na antibiotika. Zvyšující se rezistence těchto kmenů je dána schopností pseudomonád snadno přebírat geny rezistence k antibakteriálním látkám obvyklé vázané na plazmidy od jiných bakterií a následně předávat tyto geny dalším kmenům. Tato schopnost vede často ke vzniku multirezistentních kmenů a doslova lavinovitému šíření polyrezistentních kmenů po klinických zařízeních a nemocnicích. Výběr antibiotik je však omezen nejen sekundární, ale i primární rezistencí P. aeruginosa (Votava & kol., 2000; Votava & kol., 2003; Bednář & kol., 2009). Mezi antibiotické přípravky dosud využívané v léčbě pseudomonádových infekcí patří např. piperacilin příp. jeho chráněná varianta s tazobaktamem ko-piperacilin, ceftazimid a cefalosporiny IV. generace. Ze skupiny aminoglykosidů je to např. gentamicin, netilmicin či amikacin a dále pak ze skupiny fluorochinolonů je to především ciprofloxacin a ofloxacin (Votava & kol., 2003; Bednář & kol., 2009). S nárůstem infekcí způsobených rezistentními a neméně často multirezistentními kmeny P. aeruginosa se stává volba antibiotik pro léčbu pseudomonádových infekcí stále obtížnější. Částečně k tomuto faktu přispívá i skutečnost, že v poslední době nepřichází na trh dostatek nových antibiotik, která by byla pro rezistentní kmeny neznámá a tedy i účinná. Proto se dnes lékaři stále častěji ohlížejí zpět a k léčbě používají antibiotika staršího typu. Příkladem jsou tzv. polymyxiny, skupina polypeptidových antibiotik, která byla objevena v Japonsku v roce Do klinické praxe se z této nadějné skupiny dostaly pouze polymyxin B a polymyxin E označovaný též kolistin. Přes řadu výhod byla však u těchto preparátů deklarována vysoká nefrotoxicita a neurotoxicita a z tohoto důvodu došlo v 80. letech 20. století k redukci jejich indikací. V dnešní době však bylo zjištěno, že tyto toxické účinky nejsou tak vysoké, jak bylo původně prezentováno, a lékaři se v případě infekcí vyvolaných rezistentními kmeny P. aeruginosa začínají vracet k těmto přípravkům. Základ úspěšné léčby však představuje zároveň důsledné monitorování vnitřního prostředí pacienta a zejména pak hodnot azotemie. V současné době již nejsou výjimkou multirezistentní nemocniční kmeny 69

70 P. aeruginosa citlivé pouze ke zmiňovanému kolistinu (Lipový & kol., 2010; Votava & kol., 2010). Obr. 43 P. aeruginosa: výskyt rezistentních kmenů k aminoglykosidům v Evropě (2011) ( 70

71 Obr. 44 P. aeruginosa: výskyt rezistentních kmenů k ceftazimidu v Evropě (2011) ( Obr. 45 P. aeruginosa: výskyt rezistentních kmenů k fluorochinolonům v Evropě (2011) ( 71

72 Obr. 46 P. aeruginosa: výskyt rezistentních kmenů ke kombinaci piperacilinu s tazobaktamem v Evropě (2011) ( Metody využívané k testování citlivosti kmenů na antibiotika Stanovení citlivosti bakteriálních agens k antimikrobiálním látkám in vitro je jednou z nejvýznamnějších činností mikrobiologické laboratoře a po etiologické diagnóze je druhým základním předpokladem racionální antibiotické terapie. Z důvodu neustále narůstajícího výskytu rezistence u stále více bakteriálních druhů často nedosahuje podávání antibiotika bez průkazu etiologického agens a bez určení jeho citlivosti k antibiotikům klinického efektu a vede k mrhání léčivy i finančními prostředky. Navíc mnohdy ohrožuje život samotného pacienta. I přes zvyšující se výskyt rezistentních kmenů existují stále bakteriální agens, u kterých se dosud rezistence nevyskytuje a klinický pracovník tak může zahájit léčbu, aniž by znal citlivost tohoto patogena. Je tomu tak např. u Streptococcus pyogenes původce angíny, který je na celém světě stále velmi citlivý na penicilin, ačkoliv jde o nejstarší klinicky využitelné 72

73 antibiotikum vůbec. Na rozdíl např. od stafylokoků, kteří proti tomuto antibiotiku, získaly odolnost již po několika letech od zavedení penicilinu do klinické praxe. Určení citlivosti in vitro je dnes nezbytnou součástí vyšetření u většiny nálezů patogenních bakterií, pokud se dají kultivovat (Lochmann, 1994; Votava & kol., 2010; Koubová, 2011). Tyto testy jsou rovněž důležité pro provádění tzv. surveillance rezistence - kontrolu a sledování aktuálního výskytu rezistentních kmenů. Dále pak např. pro epidemiologické studie citlivostí jednotlivých kmenů, pro srovnání citlivostí existujících a nově se vyskytujících agens nebo jsou tyto metody využívány v rámci vývoje nových potenciálně antibakteriálních látek, jako je tomu i v této diplomové práci (EUCAST & ESCMID, 2003; internet 10). Metody využívané ke zjišťování citlivosti bakteriálních agens k antibiotikům se všeobecně dělí na kvalitativní (difúzní diskový test) a kvantitativní ( E-test, agarová diluční metoda, diluční bujónové metody). Kvalitativní metody rozdělují testované kmeny mikrobů podle růstu v přítomnosti antibiotika do dvou, resp. třech základních skupin na citlivé, rezistentní a intermediátní. Kvantitativní metody pak poskytují konkrétní hodnotu stupně citlivosti či rezistence testovaného kmene k příslušnému antibiotiku nejčastěji vyjádřenou jako tzv. minimální inhibiční koncentraci antibiotika (MIC). Tato hodnota představuje nejnižší koncentraci testované látky, která zastavuje pouhým okem viditelný růst testovaného kmene. Obdobně lze stanovit tzv. minimální baktericidní koncentraci (MBC), což je hodnota vyjadřující nejnižší koncentraci antimikrobiální látky, která je schopná vyšetřovaný kmen usmrtit. Průkaz spolehlivosti baktericidního účinku se získává pomocí následného výsevu testovací směsi na agarových půdách, kde by neměly vyrůstat žádné kolonie bakterií (Simon & Stille, 1998; Votava & kol., 2000; Jílek & kol., 2002; Votava & kol., 2010) Kvalitativní metody Difúzní diskový test Jedná se o kvalitativní test, který patří mezi nejjednodušší a nejrozšířenější metody v diagnostické rutinní praxi. Umožňuje totiž určit citlivost velkého množství bakteriálních kmenů na širokou škálu antibiotik 73

74 a za standardizovaných podmínek poskytuje velmi cenné základní údaje o citlivosti či rezistenci testovaného kmene. Díky své nenáročnosti na přístrojové vybavení je vhodný i pro malé laboratorní provozy. Metoda má však i některé nevýhody. Není použitelná pro pomalu rostoucí náročné mikroby včetně anaerobních bakterií a zároveň není vhodné využívat difúzní diskový test u některých klinicky závažných stavů, jako jsou sepse, endokarditidy, meningitidy a u všech stavů, které jsou provázeny snížením nebo poruchou funkce imunitního systému (Lochmann, 1994; Ryšková & kol., 1997; Votava & kol., 2000; Votava & kol., 2010). K testování se používají papírové disky nasycené určitou koncentrací antibiotika, které se kladou na pevné kultivační půdy s předem naočkovaným vyšetřovaným kmenem. Nejčastěji se využívá pro testování většiny bakterií půda Mueller-Hinton (MH). Náročnější bakterie, jako jsou např. streptokoky, vyžadují MH půdy obohacené krví a v případě hemofilů a gonokoků je třeba použít speciální půdy a zároveň upravit kultivační atmosféru (např. zvýšením obsahu CO 2 ). Půdy se očkují suspenzí testovaného mikroba ve fyziologickém roztoku o hustotě nejlépe 10 6 bakteriálních buněk na 1 ml, což v praxi odpovídá zhruba 0,5 stupni McFarlandovy zákalové stupnice. Takto připravená suspenze se na půdu očkuje pomocí tampónu ve dvou na sebe kolmých směrech nebo se na plotnu napipetuje přibližně 2 ml suspenze a kývavým pohybem se rozlije po celém povrchu půdy s následným odsátím přebytečné tekutiny. Na takto připravenou půdu jsou pomocí dispenzoru nebo sterilní jehlou kladeny antibiotikem nasycené disky nejpozději do 15 minut po naočkování. Na jednu půdu o průměru 90 mm se umisťuje maximálně 6 disků do kruhu. Půdy s disky se následně kultivují v termostatu asi hodin při teplotě 37 C. Během této doby dochází k nasátí vody z půdy do disku a následné difúzi antibiotika do okolí za tvorby tzv. koncentračního gradientu, takže v nejbližším okolí disku je koncentrace antibiotika nejvyšší a s narůstající vzdáleností se jeho koncentrace snižuje. Podle citlivosti testovaného kmene dochází k inhibici jeho růstu v určité vzdálenosti od naneseného disku a kolem disku se vytvoří tzv. inhibiční zóna (IZ). Druhý den po proběhlé kultivaci se odečítá velikost této zóny, resp. její průměr vč. disku, který se porovnává s velikostí tzv. referenční zóny. Mikrob, který má větší inhibiční zónu než je tato referenční zóna je 74

75 k danému antibiotiku citlivý, naopak je-li tato zóna menší než je zóna referenční nebo rostou-li bakterie až k disku, pak je mikrob k danému antibiotiku rezistentní. Hodnoty těchto tzv. breakpointů neboli referenčních zón se všeobecně řídí pravidly EUCAST nebo CLSI a jsou pravidelně aktualizovány. Někdy se v inhibiční zóně mohou nacházet ojedinělé kolonie, které mohou představovat buď kolonie rezistentních mutant vyšetřovaného kmene, nebo mohou signalizovat, že použitá suspenze nebyla zcela čistá (Lochmann, 1994; Ryšková & kol., 1997; Votava & kol., 2000; Jílek & kol., 2002; Bednář & kol., 2009; Votava & kol., 2010; internet 16, internet 17). V současné době je možné změřené velikosti inhibičních zón nejen zaznamenávat, ale lze je též porovnávat v čase a sledovat tak posun citlivosti či vývoj rezistence daného kmene (Votava & kol., 2010). Obr. 47 Difúzní diskový test S. aureus na Mueller-Hinton agaru ( Kvantitativní metody E-test gradientová difúzní metoda Jedná se o kvantitativní metodu, která v sobě kombinuje principy difúzního testu a dilučních metod. Základní princip testu je obdobný jako 75

76 u kvalitativního difúzního diskového testu, ale v tomto případě se na naočkovanou půdu klade místo disků proužek papíru, který je napuštěný stoupající koncentrací antibiotika od jednoho konce ke druhému. Po 24 hodinové kultivaci se odečítá minimální inhibiční koncentrace v místě, kde okraj inhibiční zóny, která má v tomto případě vejčitý tvar, protíná proužek (Lochmann, 1994; Votava & kol., 2000; Votava & kol., 2010). Výhodou E-testu je bezesporu jeho jednoduché provedení a většinou i velmi dobrá shoda výsledků s referenčními technikami. Nevýhodou však u některých mikrobů může být nejednoznačné odečítání MIC a u všech souprav pak především relativně vysoká cena, která brání jeho širšímu použití (Jílek & kol., 2002). Obr. 48 E-test gradientová difúzní metoda Stanovení MIC vankomycinu, daptomycinu a linezolidu působící proti Staphylococcus aureus (Jorgensen & Ferraro 2009) Diluční metody Diluční metody patří mezi kvantitativní metody, které stejně jako E-test slouží ke stanovení MIC příp. MBC testovaného antibiotika. Na rozdíl od E-testu se jedná však o metody referenční. (Lochmann, 1994; EUCAST & ESCMID, 2003; Votava & kol., 2010). 76