EUROPEAN AND MEDITERRANEAN PLANT PROTECTION ORGANIZATION ORGANISATION EUROPEENNE ET MEDITERRANEENNE POUR LA PROTECTION DES PLANTES EVROPSKÁ A STŘEDOZEMSKÁ ORGANIZACE PRO OCHRANU ROSTLIN 00/7845 (99/7214) PCF Bod 4.2 Schéma pro produkci zdravých sazenic CERTIFIKAČNÍ SCHÉMA PRO MANDLOŇ, MERUŇKU, BROSKVOŇ A ŠVESTKU Specifická platnost Tento standard popisuje produkci materiálu mandloně, meruňky, broskvoně a švestky testovaného na přítomnost škodlivých organizmů. Data schválení a novelizace Poprvé schváleno v září 1990. Novelizace schválena v září Úvod Certifikační schéma pro materiál odrůd a podnoží mandloně, meruňky, broskvoně a švestky testovaných na přítomnost škodlivých organizmů poskytuje podrobný návod na produkci roubovaných ovocných stromů (odrůd), vegetativně množených podnoží a semenných podnoží. Z druhů, na něž se toto schéma vztahuje, jsou v regionu EPPO nejběžnější tyto: Druh/poddruh běžný název P. armeniaca meruňka P. cerasifera myrobalán P. domestica ssp. domestica švestka domácí P. domestica ssp. insititia slíva P. domestica ssp. italica renkloda P. domestica ssp. syriaca mirabelka P.amygdalus mandloň P. persica broskvoň/nektarinka P. salicina japonská slíva Schéma je vhodné také pro certifikaci okrasných stromů tohoto rodu. Jeho smyslem je nabídnout příklady aplikace, nevylučuje jiné možné postupy. Rostlinný materiál vyprodukovaný podle tohoto schématu je odvozen z matečnic předzákladního materiálu, které byly testovány na přítomnost škodlivých organizmů uvedených v Tabulkách 1 až 5 a shledány viruprostými. Kromě toho byly vyprodukovány v podmínkách minimalizujících infekci dalšími významnými škodlivými organizmy napadajícími tento rod dřevin. Certifikovaný materiál ovocných stromů určený k vývozu musí v každém případě odpovídat fytosanitárním předpisům země dovozce, především s ohledem na veškeré škodlivé organizmy zahrnuté v tomto schématu, které jsou rovněž karanténními škůdci. Schéma je předkládáno v souladu s obecným postupem navrženým Výborem EPPO pro certifikaci ovocných plodin a přijatým Radou EPPO (OEPP/EPPO, 1992). Osnova schématu Pro produkci certifikovaných odrůd a podnoží je třeba postupně provést následující kroky: (1) pomologická kvalita: vyberte jednotlivé rostliny z každého druhu, typu podnoží nebo odrůdy 1, které mají být zařazeny do schématu. Případně dovezte viruprostý výchozí materiál z jiných zemí. (2) Produkce matečnic předzákladního materiálu: kandidátní rostliny na matečnice předzákladního materiálu získáte naočkováním nebo naroubováním tohoto materiálu na podnože, které mají 1 V tomto schématu jsou termíny odrůda a podnož používány v tradičním ovocnářském smyslu: odrůdou se rozumí roubový kultivar, zatímco podnož může být klon, typ nebo druh. 46
status předzákladního materiálu. Rostliny udržujte v podmínkách zabraňujících infekci. Kandidátní rostliny na matečnice předzákladního materiálu testujte nejpřísnějšími procedurami, které schéma obsahuje. Jinou možností je vyprodukovat viruprosté rostliny (kandidátní rostliny na matečnice předzákladního materiálu ) pomocí termoterapie následované testováním. Pouze ty kandidátní rostliny, které splní všechny požadavky, budou považovány za matečnice předzákladního materiálu. (3) Matečnice předzákladního materiálu udržujte v podmínkách zabraňujících infekci pylem, kontaktem kořenů i vzdušnými nebo půdními vektory. Provádějte příslušné retesty. (4) V podmínkách zabraňujících infekci vyprodukujte z matečnic předzákladního materiálu co nejnižším počtem přemnožení základní materiál. Provádějte příslušné retesty. (5) Naroubováním základního materiálu na podnože, které mají minimálně status rozmnožovacího materiálu, vyprodukujte certifikované rostliny. V průběhu celého procesu je třeba dbát na udržení pomologických znaků původně vybraných rostlin. V procesu je třeba kontrolovat výskyt možných mutací nebo zpětných mutací, a to především u odrůd. Schéma je znázorněno na Obrázcích 1 a 2. Certifikační schéma musí provádět státní nebo úřední orgán nebo úředně zaregistrované, specializované pracoviště splňující stanovená kritéria (viz OEPP/EPPO, 1993). Vstupní kritéria jsou méně přísná pro pracoviště vykonávající poslední stupeň produkce (5) než pro pracoviště vykonávající stupně 1-4. Všechny testy a kontroly provedené během produkce musí být zaznamenány. Pokud jednotlivé stupně certifikačního schématu provádí registrovaná školka, bude osvědčení uděleno úředním orgánem na základě záznamů o testech a kontrolách provedených během produkce a na základě vizuálních certifikačních kontrol, které ověří, že je materiál na pohled zdravý. Definice kategorií rozmnožování Matečnice předzákladního materiálu Rostliny individuálně testované nejpřísnějšími procedurami, které schéma obsahuje. Všechny rostliny musí být neustále udržovány v podmínkách naprosto vylučujících infekci. Pokud jsou matečnice předzákladního materiálu roubovány na podnože, musí mít tyto podnože také status materiálu předzákladního materiálu. Rostliny odvozené množením z matečnic předzákladního materiálu mohou zůstat matečnicemi předzákladního materiálu za předpokladu, že jsou neustále udržovány ve stejných podmínkách jako matečnice předzákladního materiálu. Pokud rozmnožovací materiál z matečnic předzákladního materiálu opouští certifikační schéma, lze jej nazývat předzákladní materiál. Základní materiál Rostliny odvozené z matečnic předzákladního materiálu za podmínek zabraňujících infekci. Nepřítomnost škodlivých organizmů je ověřována náhodným testováním podle odpovídajících testovacích metod. Pokud je rozmnožovací materiál roubován na podnože, musí mít tyto podnože minimálně status rozmnožovacího materiálu. Je možné vyprodukovat několik generací základního materiálu; rostliny odvozené množením ze základního materiálu mohou zůstat základním materiálem za předpokladu, že jsou neustále udržovány ve stejných podmínkách jako základní materiál. Jestliže základní materiál z množitelského porostu opouští certifikační schéma, lze jej nazývat 'základní materiál'. Certifikované rostliny Rostliny vyprodukované za stanovených podmínek roubováním nebo očkováním odrůd základního materiálu na podnože, které mají minimálně úroveň základního materiálu. Certifikované rostliny již nespadají pod rámec certifikačního systému a lze je nazývat 'certifikovaný materiál'. 1. Výběr kandidátních rostlin na matečnice předzákladního materiálu Odrůdy Ze sadů a/nebo z pokusných pomologických ploch vyberte určitý počet (jeden nebo více) plodících stromů s typickými pomologickými znaky od každé odrůdy, která má být zařazena do schématu. Případně dovezte viruprostý výchozí materiál z jiných zemí. Materiál importovaný ze zemí mimo region EPPO musí být testován metodami doporučenými ISHS (viz Příloha II) také na přítomnost všech ostatních virů, které se přirozeně vyskytují na daném rodu dřevin v oblasti původu. 47
Vegetativně rozmnožované podnože Z několika různých podnožových množáren vyberte vitální, dobře zakořeněné rostliny zdravého vzhledu, se známými pomologickými znaky, od každého typu podnoží, který má být zařazen do schématu. Případně dovezte viruprostý výchozí materiál z jiných zemí. Materiál importovaný ze zemí mimo region EPPO musí být testován stejným způsobem jako odrůdy (viz výše). Semenné podnože Stromy vybrané pro produkci semen musí být bez příznaků virů a musí být známo, že plodí uniformní potomstvo. Pokud to známo není, je třeba tuto skutečnost ověřit. Po vyklíčení vypěstujte semenáče do dostatečné velikosti v podobných podmínkách jako odrůdy a vegetativně rozmnožované podnože matečnic technického izolátu (viz bod 3) nebo rozmnožovacího materiálu (viz bod 4). 2. Produkce matečnic předzákladního materiálu Odrůdy Obecný postup. Z pomologicky vybraných stromů odeberte rozmnožovací materiál a naočkujte nebo naroubujte jej na viruprosté podnože. Po dobu provádění testů udržujte tyto rostliny (= kandidátní stromy na matečnice předzákladního materiálu) v podmínkách zabraňujících infekci pylem, kontaktem kořenů a vzdušnými nebo půdními vektory. Rostliny musí být pěstovány ve sterilním pěstebním substrátu a po dobu testování umístěny v izolovaném, vhodně konstruovaném objektu bez přítomnosti mšic, odděleně od matečnic předzákladního materiálu. Jednotlivé kandidátní rostliny na matečnice předzákladního materiálu testujte na přítomnost virů, fytoplazem a virózám podobných chorob uvedených v Tabulkách 1 až 5, metodami popsanými v Přílohách I a II. Pouze ty kandidátní rostliny na matečnice předzákladního materiálu, které byly testovány na všechny škodlivé organizmy uvedené v Tabulkách 1-5 s negativním výsledkem, mohou být prohlášeny za předzákladního materiálu a přemístěny do matečnic předzákladního materiálu. Ozdravovací procedura. Z odrůd, u nichž nebyl žádný z vybraných stromů v testech negativní, připravte očkováním nebo roubováním základního materiálu na několik podnoží v květináčích materiál pro termoterapii. Rostliny tepelně ošetřete (Příloha III). Po uplynutí jednoho vegetačního období, které poskytuje dostatek času na to, aby se rozvinul případný přítomný virus, nově vyprodukované rostliny otestujte (všeobecně, roubované vrcholy). Pouze rostliny, které byly v testech negativní, mohou být prohlášeny za matečnice předzákladního materiálu a přemístěny do matečnic předzákladního materiálu. Pokud je u dané odrůdy pravděpodobné, že jsou všechny kandidátní rostliny na matečnice předzákladního materiálu infikovány virem, je možné ušetřit čas vynecháním prvního testování a přistoupit přímo k termoterapii. Vegetativně rozmnožované podnože. Po dobu provádění testů udržujte jednotlivé vybrané rostliny a řízky (= kandidátní rostliny na matečnice předzákladního materiálu) v podmínkách zabraňujících infekci kontaktem kořenů a vzdušnými nebo půdními vektory. Rostliny musí být pěstovány ve sterilním pěstebním substrátu a po dobu testování umístěny v izolovaném, vhodně konstruovaném, hmyzuprostém objektu, odděleně od matečnic předzákladního materiálu. Jednotlivé matečnice předzákladního materiálu testujte na přítomnost virů, fytoplazem a virózám podobných chorob uvedených v Tabulkách 1 až 5, metodami popsanými v Přílohách I a II. Pokud měl nějaký materiál daného typu podnoží v testech negativní výsledek, je možné prohlásit příslušné kandidátní rostliny na matečnice předzákladního materiálu, nebo jejich pravokořenné potomstvo, za předzákladní materiál a přesadit je do matečnice předzákladního materiálu, nebo z nich lze množením získávat předzákladní materiál. Pro tento typ podnoží nebude nutné použít termoterapii ani jinou proceduru k odstranění virů (Příloha III). U typu podnoží, které se používají již delší dobu, může být výhodnější vynechat první testování a přistoupit přímo k termoterapii. Avšak u nově vyšlechtěných typů podnoží může přímé selektivní testování ušetřit čas. Stromy pro produkci semen pro semenné podnože Obecný postup. Vybrané stromy testujte na přítomnost virů přenosných semeny (Příloha II) pro dané druhy (Tabulky 1-5). Ze stromů s negativními výsledky testů odeberte rozmnožovací materiál a naočkujte nebo naroubujte jej na viruprosté podnože. Pokud je to vhodné, odeberte semena pro pomologickou kontrolu. Rostliny použijte přímo pro produkci semen v podmínkách zabraňujících infekci pylem, ale izolovaně od matečnic předzákladního materiálu, nebo je příslušnými metodami (Příloha I a II) testujte na přítomnost všech virů, fytoplazem a virózám podobných chorob uvedených v Tabulkách 1-5. 48
Rostliny s negativními testy lze považovat za matečnice předzákladního materiálu a přesadit je do matečnic předzákladního materiálu. Kontrola přítomnosti dalších škůdců Kromě zmíněných chorob a škodlivých organizmů musejí být kandidátní rostliny na matečnice předzákladního materiálu (odrůdy, podnože a stromy pro produkci semen) kontrolovány také na přítomnost dalších škůdců, kteří jsou přenosní na rozmnožovací materiál. Pozornost by měla být věnována zejména Agrobacterium tumefaciens, Pseudomonas syringae pv. morsprunorum na švestce a pv. persicae na broskvoni, Xanthomonas campestris pv. pruni, Chondrostereum purpureum, Phytophthora spp., Roessleria pallida a Quadraspidiotus perniciosus. 3. Udržování matečnic předzákladního materiálu Matečnice předzákladního materiálu udržujte v podmínkách zabraňujících (re)infekci. S ohledem na riziko infekce vzdušnou cestou je vhodné udržovat rostliny ve hmyzuprostém objektu. Rostliny by měly být pěstovány v nádobách se sterilním pěstebním substrátem, izolovaných od půdy. Pokud je známo, že je riziko vzdušné infekce (zejména infekce viry plum pox virus a European stone fruit yellows phytoplasma) v dané oblasti velmi nízké, je možné pěstovat matečnice předzákladního materiálu na poli. V tom případě je třeba je izolovat 1000 m od ostatních ovocných sadů a předejít vykvetení. Navíc musí být testem prokázáno, že je půda prostá háďátek přenášejících viry, Longidorus a Xiphinema (Příloha IV). Každých pět let musí být půda znovu otestována a nepřítomnost háďátek musí být potvrzena. U každé rostliny je během vegetační fáze třeba kontrolovat odrůdovou pravost. Každý rok je také nutné vizuálně kontrolovat možné mutace nebo zpětné mutace. Všechny matečnice předzákladního materiálu musí být každoročně znovu testovány na viry prunus necrotic ringspot virus, prune dwarf virus, apple mosaic virus a plum pox virus. Mimoto všechny rostliny vždy znovu otestujte na všechny viry a virům podobné organizmy, významné pro daný druh (Tabulky 1 až 5), jakmile se objeví nové a lepší detekční techniky, antiséra nebo indikátory. Rostliny každoročně vizuálně kontrolujte na příznaky virových a virózám podobných chorob a na přítomnost ostatních škůdců zmíněných v Oddíle 2. Každá rostlina s pozitivním testem nebo s příznaky virových nebo virózám podobných chorob nebo s příznaky přítomnosti ostatních škůdců uvedených v Oddíle 2 musí být ihned vyřazena z prostředí matečnic předzákladního materiálu. 4. Produkce základního materiálu Co nejmenším počtem přemnožení získejte z matečnic předzákladního materiálu potřebné množství základního materiálu. Materiál z matečnic předzákladního materiálu naočkujte nebo naroubujte na podnože stejné certifikační úrovně nebo na semenáče podnoží vypěstované za stejných podmínek jako matečnice předzákladního materiálu. Základní materiál musí být udržován na pozemcích, u nichž bylo testem prokázáno, že jsou prosté háďátek přenášejících viry, Longidorus a Xiphinema (Příloha IV), a musí být izolován od materiálu stejného rodu, který není certifikován nebo má nižší certifikační status. U podnoží lze použít množení in vitro, návod je uveden v Příloze V. Základní materiál každoročně vizuálně kontrolujte na příznaky virů a ostatních škůdců zmíněných v Oddíle 2. Je vhodné náhodně retestovat základní materiál pravidelně na plum pox virus, zejména v oblastech, kde je tato choroba rozšířená, a testovat každou rostlinu, u níž existuje podezření na infekci. Všechny infikované rostliny musí být odstraněny. Pokud existuje důvod se domnívat, že infekce může pocházet z předchozí generace, je vhodné znovu testovat rostlinu, která je pravděpodobně zdrojem infekce, a odstranit všechny rostliny odvozené z této rostliny. Vizuálně kontrolujte možné mutace nebo zpětné mutace, především u odrůd sledujte barvu ovoce, spurtyp a genetické poruchy (chiméry, apod.) Teprve v této fázi je možné vyhodnotit ovoce, ale je třeba si uvědomit, že typ podnože může ovlivnit jeho vlastnosti. 5. Produkce certifikovaných rostlin Při produkci certifikovaných ovocných stromů smí být roubový materiál naroubován nebo naočkován pouze na podnože stejné nebo vyšší certifikační úrovně. Rostliny musí být na poli izolovány od potenciálních zdrojů infekce. K certifikaci je nutné, aby úřední orgán provedl kontrolu rostlin na 49
příznaky virových a virózám podobných chorob a škůdců zmíněných v Oddíle 2. Všechny rostliny vykazující příznaky musí být odstraněny. Osvědčení může být uděleno zbývajícím rostlinám. Náhodný výběr semen pro podnože musí být po sklizni a čištění úředně otestován na viry přenosné semeny. Pak musí být zapečetěn do pytlů. Administrace certifikačního schématu Monitorování schématu Úřední orgán zodpovídá za administrování a monitorování schématu. Pokud jednotlivé stupně schématu provádějí úředně registrované školky, musí úřední orgán ověřit, že byly během produkce vykonány všechny potřebné testy a kontroly, a vizuálními kontrolami musí ověřit celkový zdravotní stav rostlin ve schématu. V opačném případě nebude osvědčení uděleno a/nebo nebude možné, aby dané rostliny zůstaly nadále součástí certifikačního řízení. Kontrola používání a stavu certifikovaného materiálu V celém průběhu certifikačního procesu musí být znám původ každé rostliny, aby mohly být vysledovány zdroje případných problémů se zdravotním stavem nebo s odrůdovou pravostí. Používání rozmnožovacího materiálu ve školkách k produkci certifikovaného materiálu ověřuje úřední nebo úředně pověřený orgán, který kontroluje zdravotní stav, původ a množství materiálu na základě terénních inspekcí a záznamů i dokladů předložených školkou. Opatření na ochranu rostlin ve školkách a kontrolní inspekce by měly zohledňovat také další významné škůdce, kteří mohou mít vliv na kvalitu, tak, aby byly certifikované rostliny dodávané ovocnářům v zásadě prosté těchto škůdců. Certifikovaný materiál ovocných stromů určený k vývozu musí v každém případě odpovídat fytosanitárním předpisům země dovozce. Certifikované rostliny opouštějící schéma by měly být opatřeny úředním certifikátem (může být v podobě štítku) uvádějícím certifikační orgán, pěstitele a certifikační status rostlin. Příloha I Návod na testovací postupy 1.Testování na dřevitých indikátorech (pole a skleník) Použití dřevitých indikátorů je dosud v každém certifikačním procesu povinné, protože existují choroby (z nichž některé mají zásadní význam), které lze identifikovat pouze na dřevitých diferenčních hostitelích. Metoda spočívá v naočkování indikátorových rostlin očkem odebraným z kandidátních rostlin na matečnice předzákladního materiálu nebo z rostlin, u nichž je podezření na infekci. Dále je pozorován další růst a/nebo plody indikátorových rostlin a jsou sledovány příznaky. Příznaky jsou obvykle specifické a lze podle nich dobře diagnostikovat mnoho chorob. Pokud je testování prováděno ve skleníku, měl by být k dispozici systém regulace teploty (teplota se pohybuje mezi 18 a 25 C), aby bylo možné nastavovat správné teploty pro rozvinutí příznaků (Příloha II). Ve skleníku by měly být použity nejméně tři rostliny od každého indikátoru. Indikátory udržované v polních podmínkách (3-5 rostlin na každý) by měly být pozorovány nejméně po dobu dvou let. 2. Inokulace bylinných indikátorů (skleník) Použití bylinných indikátorů umožňuje detekci mechanicky přenosných virů, včetně virů vedlejšího významu. Metoda by však měla být pokládána za doplněk jiných diagnostických metod, ne za jejich náhradu. Může být použita například při předběžném ohledání nebo náhodném testování. Testy na bylinných indikátorech se provádějí ve skleníku s možností regulovat teplotu (teplota se pohybuje mezi 18 a 25 C). Mělo by být použito nejméně pět rostlin od každého indikátoru. 3. Test ELISA Test ELISA umožňuje širokospektrální identifikaci jednotlivých virů napadajících ovocné stromy, pro které jsou dostupná polyklonální a/nebo monoklonální antiséra. Každá technika využívající protilátky má však určitá omezení, jako je např. skutečnost, že některé viry se mohou v dřevině vyskytovat ve velmi nízkých koncentracích, mohou být nerovnoměrně rozloženy nebo jsou v určitých fázích roku nezjistitelné. 50
4. Fluorescenční a elektronová mikroskopie Test DAPI - založený na specifické vazbě barviva DAPI (4'-6 diamidino-2-phenylindol) na DNA a její detekci pomocí fluorescenční mikroskopie lze použít k nespecifické detekci fytoplazem v infikovaných sítkovicích. Elektronovou mikroskopii lze použít také k detekci fytoplazem. 5. Molekulární hybridizace a PCR Molekulární hybridizaci s neradioaktivními sondami je možné použít k detekci peach latent mosaic viroid. Viroid je v rostlině pravidelně rozložen a lze jej zjistit z různých typů pletiva (listů, plodů, kůry) po celé vegetační období. Polymerázovou řetězovou reakci (PCR) lze využít k detekci fytoplazmy, která způsobuje European stone fruit yellows, k detekci viroidů (PLMVd) a virů. Sérologické a molekulární testy lze kombinovat, aby se zvýšila citlivost obou metod použitých samostatně (např. immuno capture PCR). Příloha II - Návod na detekci chorob Metody detekce jednotlivých chorob nebo virů (viz níže) jsou upřesněny pod názvem: = testy na dřevitých indikátorech v polních podmínkách = testy na dřevitých indikátorech ve skleníku Bylinné testy = testování ve skleníku na bylinných indikátorech Sérologické nebo molekulární testy = využití testu ELISA, reversní polymerázová řetězová reakce (reverse transcriptase polymerase chain reaction,rt-pcr), polymerázová řetězovánreakce (immunocapture PCR, IC-RT-PCR). U dřevitých testů jsou uvedeny indikátory; hodnoty v závorkách představují počet použitých rostlin, teplotu ve C (pro testování ve skleníku) a dobu trvání testu (d = dny, t = týdny, r = roky, s = roky sběru plodů); dále je uveden stručný popis příznaků. Obecně je ke stanovení nepřítomnosti virů v matečnicích předzákladního materiálu vždy zapotřebí provést test na dřevitých indikátorech. Ten je proto v následujícím přehledu vždy uveden. Testy na bylinných indikátorech, sérologické testy nebo RT-PCR jsou používány především pro rychlé a ekonomické otestování kandidátního materiálu s cílem vyřadit infikované rostliny, nebo jsou využívány při retestování rozmnožovacího materiálu. Informace o testech jsou převzaty především z publikací Pracovní skupiny ISHS pro viry na ovocných stromech, zveřejňovaných v periodiku Acta Horticulturae po každém jednání ISHS, které se koná třikrát ročně (Anon, 1998). Čtenáři by se měli seznámit s nejnovějšími doporučení ISHS, jejichž součástí jsou také odkazy na klíčovou literaturu k jednotlivým technikám, především k technice PCR, která v současnosti prochází převratným technologickým vývojem. Doporučení ISHS obsahují i komentář k přednostem a omezením jednotlivých metod. Výbor EPPO pro ovocné plodiny testované na přítomnost škodlivých organizmů identifikoval, po zhodnocení doporučení ISHS, několik dřevitých indikátorů, které na základě svých zkušeností obzvláště doporučuje pro jejich účinnost a snadné používání. Tím není nicméně vyloučeno používání jiných indikátorů, které uvádí ISHS nebo s nimiž mají jednotliví pěstitelé uspokojivé zkušenosti. A. Viry Apple chlorotic leafspot virus (ACLSV) Semenáč GF305 (nebo Elberta) (3/-/2r) (tmavozelená propadlá skvrnitost na listech) Semenáč GF305 (5/20/12t) (tmavozelená propadlá skvrnitost na listech) Bylinné testy: Chenopodium quinoa, Ch. amaranticolor. Sérologické nebo molekulární testy ELISA, PCR a IC-PCR. Přirozený přenos: neznámý Apple mosaic virus (ApMV) Semenáč GF305 nebo Elberta nebo pro slivoň Ersingerská (3/-/2r) (na infikovaných listech jsou světlezelené, žlutavě zelené nebo jasně žluté kroužky, skvrny, proužky nebo vzorce připomínající dubový list ) 51
Semenáč GF305 nebo Elberta (5/20/12t) (na infikovaných listech jsou světlezelené, žlutavě zelené nebo jasně žluté kroužky, skvrny, proužky nebo vzorce připomínající dubový list ) Bylinné testy K mechanické inokulaci je vnímavých přes 65 bylinných rostlinných druhů v 19 čeledích. Mezi nimi např. Ch. quinoa, Ch. amaranticolor, Cucumis sativus, Cucurbita maxima, Nicotiana clevelandii, Petunia hybrida. Sérologické nebo molekulární testy ELISA Přirozený přenos: neznámý Cherry green ring mottle virus (CGRMV) Bing, Kwanzan (3/-/2r) epinastie na listech, nekróza středního nervu nebo postranních žilek, kroucení a stáčení infikovaných listů. Kůra je často zdrsněna podélnými prasklinami. - Bylinný test v současné době nemožný Sérologické nebo molekulární testy PCR Přirozený přenos: neznámý Myrobalan latent ringspot virus (MLRSV) - semenáč GF305 nebo Elberta (5/20/12t) (zakrslost, krátká internodia a růžicovitost) Bylinné testy Ch. quinoa Sérologické nebo molekulární testy ELISA Přirozený přenos: neznámý Plum pox virus (PPV) Bylinné testy Sérologické nebo molekulární testy Přirozený přenos Semenáč GF305 nebo Elberta nebo P. tomentosa (3/-/2r) (infikované listy jsou zkroucené, deformované a projevuje se u nich žloutnutí žilnatiny. Silné izoláty viru mohou vyvolat nekrózu a zakrslost celé rostliny) GF 31 (1/-/1r) (rezavě hnědá korkovitost a praskání kůry) Ersingerská (3/-/2r) (typická kroužkovitost na listech) Semenáč GF305 (5/20/12t) (infikované listy jsou zkroucené, deformované a projevuje se u nich žloutnutí žilnatiny. Silné izoláty viru mohou vyvolat nekrózu a zakrslost celé rostliny) Ch. foetidum, N. clevelandii ELISA a PCR. Vzhledem k nerovnoměrnému rozložení viru v infikovaných stromech je třeba testovat několik vzorků z každého stromu. mšice Prune dwarf virus (PDV) Bylinné testy: Sérologické nebo molekulární testy Přirozený přenos: Bing (3/-/2r) (chlorotická skvrnitost a kroužkovitost) Shirofuga (5/-/6-52t) (nekrotické pletivo a gumóza kolem zdrojového pupene, vsazeného do jednoletých výhonů) Semenáč GF305 (3/-/2r) (infikované listy jsou menší; rostlina je zakrslá a internodia jsou redukována) Semenáč GF305 (5/20/12t) (infikované listy jsou menší; rostlina je zakrslá a internodia jsou redukována) C. sativus, C. maxima ELISA, PCR pyl, semena Prunus necrotic ringspot virus (PNRSV) Bing (3/-/2r) (chlorotická skvrnitost a kroužkovitost) Shirofuga (5/-/6-52t) (nekrotické pletivo a gumóza kolem zdrojového pupene, vsazeného do jednoletých výhonů) 52
Semenáč GF305 (nepravidelná nekrotická ložiska na infikovaných listech) Semenáč GF305 (5/20/12t) (infikované listy jsou menší; rostlina je zakrslá a internodia jsou redukována) Bylinné testy C. quinoa, C. sativus, C. maxima Sérologické nebo molekulární testy ELISA, PCR Přirozený přenos pyl, semena Strawberry latent ringspot virus (SLRSV) Semenáč GF305 nebo Elberta (zakrslost, krátká internodia a růžicovitost) Semenáč GF305 (5/20/12t) (zakrslost, krátká internodia a růžicovitost) Bylinné testy C. quinoa, C. amaranticolor, C. sativus Sérologické nebo molekulární testy ELISA Přirozený přenos Xiphinema diversicaudatum Tomato black ring virus (TBRV) (na mandloni) Dřevité testy Semenáč GF305 (zakrslost, krátká internodia a růžicovitost) Bylinné testy Ch. quinoa, Ch. amaranticolor, C. sativus Sérologické nebo molekulární testy ELISA Přirozený přenos Longidorus attenuatus, L. elongatus B. Viroidy Peach latent mosaic viroid (PLMVd) - Sérologické nebo molekulární testy PCR, hybridizace Přirozený přenos neznámý C. Fytoplazmy Semenáč GF305. Latentní kmeny je možné zjistit pomocí křížové reakce. GF305 jsou inokulovány štítkem kůry s očkem a o dva měsíce později znovu naočkovány silným kmenem schopným vyvolat listovou mazaiku). Absence typických příznaků silného kmene na indikátorové rostlině prokazuje přítomnost latentního kmene (Desvignes 1976). European stone fruit yellows phytoplasma (ESFY) Semenáč GF305, Luizet. Roubování by mělo proběhnout v létě (celkové hynutí rostliny; žloužnutí a svinování listů) Semenáč GF305 (5/20/12t), Luizet. Roubování by mělo být uděláno v létě (celkové hynutí rostliny; žloužnutí a svinování listů) Sérologické nebo molekulární testy PCR Mikroskopie DAPI Přirozený přenos křísi, mery (Cacopsylla pruni) D. Virózám podobné choroby Peach asteroid spot agent Semenáč GF305 (po 4 měsících sazovitá skvrnitost) Sérologické nebo molekulární testy Nejsou Přirozený přenos: Neznámý [vzácný a téměř neškodný, doporučujeme zrušit] 53
Příloha III Návod na ozdravování rostlin Metody eliminace patogenů z peckovin zahrnují nebo kombinují termoterapii, metody in vitro a/nebo chemické procedury. Po ozdravení musí být zdravotní stav ošetřeného materiálu otestován. Termoterapie. Vzhledem k široké škále dostupných metod termoterapie ovocných plodin (podle typu materiálu, který má být ozdraven) zde neuvádíme podrobný popis, s odkazem na následující publikace: Anonymous (1970) La thermotherapie des especes ligneuses.station de cultures fruitières et maraîchères, Gembloux (BE). Fridlund, P, (1989) Thermotherapy. In Virus and Virus-like Diseases of Pome Fruits and Simulating Noninfectious Disorders (ed. Fridlund, P.), pp. 284-295. Cooperative Extension, Washington State University, Pullman (US). Németh M. (1986) Virus, Mycoplasma and Rickettsia diseases of fruit trees, pp.135-139.martinus Nijhoff, Dordrecht (NL). Meristémová kultura Tato technika je běžně používána pro jahodník, ale není příliš častá u ovocných stromů. Je však velmi účinná při eliminaci virů, především pokud jsou meristémy odebrány z mikrorozmnožených explantátů. Roubování vrcholku výhonů Technika roubování vrcholu výhonu in vitro se provádí speciálními nástroji za sterilních podmínek a zahrnuje následující kroky: 1. semenáče podnoží jsou pěstovány v agarovém živném médiu ve tmě; 2. jsou odebrány výhony dlouhé přibližně 1 cm a a dezinfikovány v laboratoři; 3. nezralé listy jsou odstraněny a poté je pod mikroskopem odříznut velmi malý vrcholek (asi 0,1-0,2 mm) skládající se z meristému a dvou nebo tří listových primordií; 4. vrcholek je opatrně přiložen na odseknutý semenáč podnoží. 5. mladá naroubovanoá rostlina je pěstována 5 až 15 týdnů ve výživném médiu pod světlem; poté je přesazena do půdy. Tepelná terapie in vitro Prunus spp, u nichž je termoterapie obtížná, je obvykle možné vystavit delšímu působení tepla při mírně vysoké teplotě (34-38 C) jako mikrorozmnožené výhony. Tato technika je v současné době testována na meruňce a broskvoni. Chemické ošetření in vitro Tato metoda závisí na volbě virocidu. Ty mají totiž specifické účinky. Například ribavirin je účinný při odstraňování ACLSV u Prunus, zatímco DHT působí pouze na PNRSV. 54
Příloha IV Návod na analýzu háďátek Z půdy, v níž má být vysazen certifikovaný materiál, musí být odebrány vzorky a musí být prokázáno, že vzorky jsou prosté následujících druhů vektorů háďátek: vektor háďátek viry Xiphinema diversicaudatum Strawberry latent ringspot virus Longidorus attenuatus Tomato black ring virus L. elongatus Tomato black ring virus Vzorky půdy odeberte ze dvou vrstev, v hloubce 0-30 cm a 30-60 cm, pomocí půlválcové sondy o průměru nejméně 2,5 cm. Nepoužívejte šroubovitý vrták, ani nástroje o menším průměru, protože by mohly háďátka při odebírání vzorku poškodit. Pokud je to možné, mělo by vzorkování proběhnout, když je půda vlhká. Parcela je pomyslnou mřížkou rozdělena na menší části a z nich jsou odebrány vzorky, například 20 dílčích vzorků na parcelách do 0,2 ha a 40 dílčích vzorků na parcelách mezi 0,2 a 4 ha. Jiným možným způsobem vzorkování (intenzivnějším, ale v některých zemích používaným) je rozdělit parcelu na jednotky o velikosti 0,2 ha a odebrat 60 dílčích vzorků z každé z těchto jednotek. Doplňkové vzorky by měly být odebrány také ze všech živých plotů, které případně parcelu obklopují. Extrakce háďátek z půdy se provádí například Fleggovou metodou (1967), která nevyžaduje téměř žádné speciální vybavení. Půdní vzorek opatrně, ale důkladně, promíchejte a odměřte dva dílčí vzorky o objemu 200 ml bez vody. Každý z dílčích vzorků nechte nasáknout vodou alespoň 1 hod, pak je promývejte přes síto s oky 4 mm do 10litrové nádoby, která je naplněna téměř po okraj. Obsah nádoby rukou rozmíchejte, abyste z půdy vytvořili suspenzi. Na 25 sec nechte stát, poté supernatant slijte na sadu 3 sít s oky o 150 µm. Nádobu znovu naplňte a obsah opět rozmíchejte a slijte (tentokrát nechte stát jen 15 sec). Vyperte obsah nasbíraný v sítkách a přeneste jej na nylonové sítko s oky o 110 µm. Sítko umístěte na skleněnou nálevku naplněnou vodou tak, aby byl obsah sítka celý ponořen. Nechejte 24 hod stát, poté ze stopky nálevky odeberte asi 25 ml (je proto vhodné, aby stopka nálevky ústila do gumové hadičky uzavřené svorkou) a při 25násobném zvětšení vzorek prozkoumejte. Háďátka je možné počítat při 25násobném zvětšení, ale jednotlivé druhy může rozlišit pouze zkušený odborník v taxonomii při zvětšení podstatně výraznějším. 55
Příloha V Návod na množení in vitro Množení materiálu ovocných stromů in vitro se běžně provádí v několika evropských laboratořích, ať již kvůli rychlému a intenzivnímu množení výsadbového materiálu nebo kvůli eliminaci virů (viz Příloha III). Množení in vitro lze využít u většiny podnoží Prunus. Zkušenosti jsou dnes dostatečné na to, aby bylo možné tuto metodu obecně doporučovat. Obecně platí, že její použití je nejsnazší u materiálu, který se snadno množí řízky, ale nejužitečnější u materiálu, který je jinak obtížné množit. V současné době je množení in vitro snadno využitelné u broskvoně, švestky, mandloně a myrobalánu, ale je nutné propracovat je zvlášť pro každý genotyp meruňky. Na vyřešení těchto problémů v případě meruňky se nyní soustředí velké výzkumné úsilí. Také řada mezidruhových kříženců (např. GF677) je množena tímto způsobem. Obecně lze říci, že množení in vitro nenabízí žádnou zvláštní výhodu u r odrůd pro produkci roubů, které nebudou pěstovány jako pravokořenné. Kulturu in vitro lze také použít k udržování materiálu, který bude chráněn před sebemenším nebezpečím infekce pomocí: 1. pravidelné subkultivace v třítýdenních intervalech; jako explantát se odebírají pouze axilární výhony; je třeba omezit tvorbu kalusu, aby nemohlo dojít ke genetickému posunu somaklonální změnou; 2. uchovávání při teplotě 4 C, ve světle nebo tmě, po dobu několika měsíců bez subkultivace; 3. kryoprezervace vrcholů (meristémů spolu s několika listovými primordii) v tekutém N 2 při teplotě - 176 C kryoprotekci nebo obalenív alginátových kapsulích. Nový materiál podnoží namnožený in vitro by měl být dále rozmnožen, aby se před roubováním ověřily jeho pomologické a juvenilní znaky. Je vhodné, aby bylo u každého takového materiálu, určeného k prodeji, vždy uvedeno, že prošel množením in vitro. Tabulka 1: Viry a jiné škodlivé organizmy na mandloni, které se vyskytují v regionu EPPO a vyžadují v rámci certifikačního schématu testování. Viry Apple chlorotic leaf spot virus Apple mosaic virus Plum pox virus Prune dwarf virus Prunus necrotic ringspot virus ACLSV ApMV PPV PDV PNRSV Tabulka 2: Viry a další škodlivé organizmy na meruňce, které se vyskytují v regionu EPPO a vyžadují v rámci certifikačního schématu testování. Viry Apple chlorotic leaf spot virus Apple mosaic virus Plum pox virus Prune dwarf virus Prunus necrotic ringspot virus Fytoplazma European stone fruit yellows phytoplasma (Apricot chlorotic leafroll phytoplasma) ACLSV ApMV PPV PDV PNRSV ESFY [název ponechejte v závorce] Virózám podobné choroby Peach asteroid spot agent [vzácná a téměř neškodná] 56
Tabulka 3: Viry a další škodlivé organizmy na meruňce, které se vyskytují v regionu EPPO a vyžadují v rámci certifikačního schématu testování. Viry Apple chlorotic leaf spot virus Apple mosaic virus Cherry green ring mottle virus Plum pox virus Prune dwarf virus Prunus necrotic ringspot virus Strawberry latent ringspot virus Tomato black ring virus ACLSV ApMV CGRMV PPV PDV PNRSV SLRSV TBRV (u mandloně) Virózám podobné choroby Peach asteroid spot agent [viz výše] Viroidy Peach latent mosaic viroid PLMVd Fytoplazma European stone fruit yellows phytoplasma ESFY Tabulka 4: Viry a další škodlivé organizmy na švestce (P. domestica, P. salicina a mezidruhoví kříženci), které se vyskytují v regionu EPPO a vyžadují v rámci certifikačního schématu testování. Viry Apple chlorotic leaf spot virus Apple mosaic virus Myrobalan latent ringspot virus Plum pox virus Prune dwarf virus Prunus necrotic ringspot virus Fytoplazma European stone fruit yellows phytoplasma (Plum leptonecrosis (in P. salicina)) ACLSV ApMV MLRSV PPV PDV PNRSV ESFY 57
Tabulka 5: Viry a další škodlivé organizmy na podnožích (P. armeniaca, P. besseyi, P. cerasifera, P. davidiana, P. domestica, P. dulcis P. insititia, P. persica, P. salicina), které se vyskytují v regionu EPPO a vyžadují v rámci certifikačního schématu testování. Viry Apple chlorotic leaf spot virus Apple mosaic virus Myrobalan latent ringspot virus Plum pox virus Prune dwarf virus Prunus necrotic ringspot virus ACLSV ApMV MLRSV PPV PDV PNRSV Fytoplazma European stone fruit yellows phytoplasma ESFY 58