ČESKÁ ZEMĚDĚLSKÁ UNIVERZITA V PRAZE Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů Katedra ochrany rostlin

Transkript

1 ČESKÁ ZEMĚDĚLSKÁ UNIVERZITA V PRAZE Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů Katedra ochrany rostlin Charakterizace a diagnostika latentního viru meruňky disertační práce Autor: Ing. Lenka Grimová Školitel: Doc. Ing. Pavel Ryšánek, CSc. Konzultant: Ing. Miloslav Zouhar, PhD. Praha 2011

2 Prohlašuji, že jsem tuto disertační práci vypracovala samostatně, pod vedením vedoucího disertační práce a s použitím citované literatury. V Praze dne Ing. Lenka Grimová

3 Poděkování Na tomto místě bych ráda vyjádřila svou nejhlubší a srdečnou vděčnost všem, kteří jakýmkoliv způsobem přispěli k sepsání této práce. Především děkuji vedoucímu mé disertační práce Doc. Ing. Pavlu Ryšánkovi, CSc. za jeho odborné vedení, cenné rady, za jeho lidský přístup a vloženou důvěru v mé pracovní schopnosti. Mému konzultantovi a kolegovi Ing. Miloslavu Zouharovi, PhD. bych chtěla poděkovat za pomoc při zpracování laboratorních pokusů a za živé obohacující diskuze nad danou problematikou. Mé velké díky patří i Ing. Janě Mazákové, PhD. za její pomoc při závěrečném zpracování této práce a za její laskavost a dobrotu. Rovněž bych chtěla poděkovat mým spolužákům a kolegům z katedry ochrany rostlin za vytvoření klidné a přátelské atmosféry na našem pracovišti. Touto cestou také děkuji svým kolegům z Università Degli Studi Di Bari v Itálii za nabídnutou možnost působení na jejich pracovišti a za neocenitelné zkušenosti, které jsem díky nim v průběhu mých studijních stáží na tamní katedře získala. Jmenovitě bych chtěla poděkovat Dr. Maxovi Morelli za jeho spolupráci a za jeho upřímné přátelství. Mé poděkování také patří Doc. RNDr. Karlu Petrzikovi CSc. z Ústavu molekulární biologie rostlin Akademie věd České republiky za jeho cenné rady a doporučení při přípravě vzorků na klonování a sekvenování. Dále bych chtěla vyjádřit své díky mým nejlepším kamarádům, kteří respektovali mou práci a snažili se mé nadšení pro vědu, ač často bezvýsledně, ale zcela upřímně, vždy pochopit. Závěrem bych ráda z celého srdce poděkovala mým úžasným rodičům a mé milované sestře za neuvěřitelnou psychickou podporu, bez které by tato práce nebyla nikdy dokončena.

4 Tato disertační práce byla vypracována v rámci řešení projektů Národní agentury pro zemědělský výzkum Ministerstva zemědělství ČR - QG60123 Výzkum a inovace postupů diagnostiky hospodářsky významných, regulovaných a karanténních fytopatogenních organismů pro systém certifikace ovocných dřevin s důrazem na molekulární metody a s přispěním výzkumného záměru MSM Ministerstva školství, mládeže a tělovýchovy ČR.

5 Obsah Obsah 1. Úvod 1 2. Literární přehled Pěstování peckovin v České republice Viry peckovin Stručná charakteristika vybraných virů peckovin Viry peckovin na území České republiky Čeleď Betaflexiviridae Rod Foveavirus Zástupci rodu Foveavirus Apricot latent virus Biologické vlastnosti ApLV Molekulární vlastnosti ApLV Geografické rozšíření ApLV Metody detekce ApLV ApLV versus Peach asteroid spot disease Hospodářský význam virů peckovin Ochrana proti virovým chorobám peckovin Certifikační programy pro produkci zdravého pěstebního materiálu Vybrané diagnostické metody pro detekci rostlinných virů Diagnostika rostlinných virů dle příznaků Diagnostika rostlinných virů dle jejich biologických vlastností Diagnostika virů pomocí sérologických metod Diagnostika virů pomocí molekulárně genetických metod Hybridizační techniky Polymerázová řetězová reakce Sekvenační analýzy Cíle disertační práce Metodika práce Biologická charakteristika ApLV Hostitelský okruh ApLV Přenos ApLV na semenáče broskvoní GF Přenos ApLV na komerčně pěstované kultivary peckovin 24 i

6 Obsah Přenos ApLV na bylinné hostitele Studium symptomů ApLV Vyhodnocení zdravotního stavu testovaných rostlin Vývoj a adaptace diagnostických metod pro detekci ApLV Zdroje rostlinného materiálu Odběr rostlinného materiálu Uchování rostlinného materiálu Izolace celkové RNA Homogenizace rostlinného materiálu Izolační techniky využité pro extrakci celkové RNA Stanovení koncentrace, čistoty a integrity celkové RNA Vyhodnocení jednotlivých izolačních metod Detekční metody založené na RT-PCR Metoda Two-Step RT-PCR Metoda One-Step RT-PCR za využití QIAGEN OneStep RT-PCR kit Metoda One-Step RT-PCR vlastní výroby Metoda Direct binding RT-PCR Metoda Immuno-capture RT-PCT bez využití specifických protilátek Metoda Spot-capture RT-PCR bez využití specifických protilátek Metoda Print-capture RT-PCR bez využití specifických protilátek Elektroforetická separace a vizualizace nukleových kyselin Detekční metody založené na hybridizaci nukleových kyselin Příprava templátové DNA Příprava RNA sond značených digoxigeninem Dot Blot hybridizace Vyhodnocení vybraných detekčních metod Vyhodnocení relativní citlivosti vybraných detekčních metod Vyhodnocení relativní spolehlivosti vybraných detekčních metod Molekulární charakteristika ApLV Analýza dsrna Izolace dsrna Elektroforetická separace a vizualizace dsrna Purifikace a amplifikace dsrna Studie genomu ApLV Zdroje rostlinného materiálu Izolace celkové RNA, syntéza cdna a PCR Ligace PCR produktů a jejich transformace do bakteriálních buněk Kontrola bakteriálních klonů Příprava PCR produktů pro sekvenační analýzy 48 ii

7 Obsah Příprava bakteriálních plazmidů pro sekvenační analýzy Analýzy sekvencí Monitoring ApLV na území ČR Odběr vzorků Testování vzorků Výsledky Biologická charakteristika ApLV Hostitelský okruh ApLV Přenos ApLV na semenáče broskvoní GF Přenos ApLV na komerčně pěstované kultivary peckovin Přenos ApLV na bylinné hostitele Studium symptomů ApLV Semenáče broskvoní GF Kultivary broskvoní Kultivary meruněk Kultivary třešní a švestek Výsledky testů ELISA a RT-PCR na přítomnost vybraných virových patogenů Vývoj a adaptace diagnostických metod pro detekci ApLV Zdroje rostlinného materiálu Doba odběru rostlinného materiálu Způsob uchování rostlinného materiálu Izolace celkové RNA Homogenizace rostlinného materiálu Vyhodnocení izolačních technik Detekční metody založené na RT-PCR Detekční metody založené na Dot-blot hybridizaci Vyhodnocení vybraných detekčních metod Specifita detekčních metod Relativní citlivost vybraných detekčních metod Relativní spolehlivost vybraných detekčních metod Molekulární charakteristika ApLV Analýza dsrna Studie parciálních fragmentů genomu izolátů ApLV Molekulární charakteristika ApLV izolátů Procentuální sekvenční identita Fylogenetické analýzy Monitoring ApLV na území ČR 79 iii

8 Obsah 6. Diskuze Biologická charakteristika ApLV Hostitelský okruh Studium symptomů ApLV Diagnostické metody pro detekci ApLV Detekce ApLV pomocí molekulárně genetických technik Rostlinný materiál a izolace celkové RNA Detekční metody založené na RT-PCR Detekční metody založené na molekulární hybridizaci Molekulární charakteristika ApLV dsrna Studie parciálních fragmentů genomu izolátů ApLV Monitoring ApLV na území ČR Závěry 95 Seznam použité literatury 97 Přílohy 111 iv

9 Seznam obrázků a tabulek v textu Seznam obrázků a tabulek v textu Obr. 4. Symptomy spojované s infekcí ApLV na listech semenáčů broskvoní GF Obr. 5. Symptomy spojované s infekcí ApLV na listech kultivarů broskvoní...54 Obr. 6. Symptomy spojované s infekcí ApLV na listech meruňky cv. Tirynthos...55 Obr. 7. Detekce ApLV v průběhu vegetačního období...57 Obr. 8. Porovnání integrity izolované celkové RNA...60 Obr. 9. Detekce ApLV metodou Two-Step RT-PCR Obr. 10. Detekce ApLV metodou Two-Step RT-PCR s koamplifikací rostlinné mrna...61 Obr. 11. Detekce ApLV metodou Two-Step RT-PCR s využitím UDG...61 Obr. 12. Detekce ApLV metodou Two-Step RT-PCR s koamplifikací rostlinné mrna a Two-Step RT-PCR s koamplifikací rostlinné mrna s využitím UDG...61 Obr. 13. Detekce ApLV metodou Co-RT-PCR...62 Obr. 14. Detekce ApLV metodou Nested RT-PCR...62 Obr. 15. Detekce ApLV metodou One-Step RT-PCR s využitím QIAGEN OneStep RT-PCR kit...62 Obr. 16. Detekce ApLVmetodou One-Step RT-PCR vlastní výroby...62 Obr. 17. Detekce ApLV metodou DB-RT-PCR...62 Obr. 18. Detekce ApLV metodou IC-RT-PCR...63 Obr. 19. Detekce ApLV metodou SC- a PC-RT-PCR...63 Obr. 20. Detekce ApLV metodou dot-blot hybridizace...63 Obr. 21. Relativní citlivost metody Two-step RT-PCR...65 Obr. 22. Relativní citlivost metody Two-Step RT-PCR s koamplifikací rostlinné mrna...65 Obr. 23. Relativní citlivost metody Two-Step RT-PCR s využitím UDG...65 Obr. 24. Relativní citlivost metody Two-Step RT-PCR s koamplifikací rostlinné mrna a s využitím UDG...66 Obr. 25. Relativní citlivost metody Co-RT-PCR...66 Obr. 26. Relativní citlivost metody Nested RT-PCR...66 v

10 Seznam obrázků a tabulek v textu Obr. 27. Relativní citlivost metody One-Step RT-PCR s využitím QIAGEN OneStep RT-PCR kit...67 Obr. 28. Relativní citlivost metody One-Step RT-PCR vlastní výroby...67 Obr. 29. Elektroforeogram dsrna...69 Obr. 30. Detekce ApLV z dsrna metodou Two-step RT-PCR...69 Obr. 31. Organizace parciálního genomu palestinského izolátu ApLV a klonovací strategie DNA fragmentů...71 Obr. 33. Organizace parciálního genomu moldávského izolátu ApLV a klonovací strategie DNA fragmentů...72 Obr. 34. Organizace parciálního genomu českého izolátu ApLV a klonovací strategie DNA fragmentů...73 Obr. 37. Fylogenetický strom založený na sekvencích aminokyselin ORF2 izolátů ApLV a ostatních zástupců rodu Foveavirus...76 Obr. 38. Fylogenetický strom založený na sekvencích aminokyselin ORF3 izolátů ApLV a ostatních zástupců rodu Foveavirus...77 Obr. 39. Fylogenetický strom založený na sekvencích aminokyselin ORF4 izolátů ApLV a ostatních zástupců rodu Foveavirus...78 Obr. 40. Fylogenetický strom založený na sekvencích aminokyselin ORF5 izolátů ApLV a ostatních zástupců rodu Foveavirus...79 Tab. 13. Vývoj symptomů spojovaných s infekcí ApLV na rostlinách broskvoní...55 Tab. 14. Vývoj symptomů spojovaných s infekcí ApLV na rostlinách meruněk...56 Tab. 15. Výtěžnosti a čistota celkové RNA...59 Tab. 16. Porovnání izolačních metod na základě výtěžnosti, čistoty a integrity celkové RNA...60 Tab. 17. Relativní citlivost vybraných RT-PCR metod...67 Tab. 18. Relativní spolehlivost vybraných RT-PCR metod...68 Tab. 19. Organizace parciálního genomu palestinského izolátu ApLV...71 Tab. 20. Organizace parciálního genomu moldavského izolátu ApLV...72 vi

11 Seznam obrázků a tabulek v textu Tab. 21. Organizace parciálního genomu českého izolátu ApLV...73 Tab. 22. Procentuální sekvenční identita ApLV izolátu Pal s vybranými izoláty ApLV a ASPV...74 Tab. 23. Procentuální sekvenční identita ApLV izolátu Mol s vybranými izoláty ApLV a ASPV...75 Tab. 24. Procentuální sekvenční identita ApLV izolátu Tom s vybranými izoláty ApLV a ASPV..75 Není-li v textu uvedeno jinak, autorem obrázků je autorka disertační práce. vii

12 Seznam použitých zkratek Seznam použitých zkratek Zkratka Anglický název Český název A absorbance absorbance aa amino-acid aminokyselina AAF acetylaminofluoren acetylaminofluoren ACSLV Apple chlorotic leaf spot virus virus chlorotické skvrnitosti jabloně ApLV Apricot latent virus latentní virus meruňky ApMV Apple mosaic virus virus mozaiky jabloně ASGV Apple stem grooving virus virus žlábkovitosti kmene jabloně ASPV Apple stem pitting virus virus mělké vrásčitosti kmene jabloně BSA bovine serum albumin hovězí sérový albumin bp pair of bases pár bází cdna complementary deoxyribonucleic acid komplementární deoxyribonukleová kyselina CMV Cucumber mosaic virus virus mozaiky okurky Co-RT-PCR co-operational RT-PCR co-operational RT-PCR CP coat protein bílkovinný obal cv. cultivar kultivar Da Dalton Dalton DAS-ELISA double antibody sandwich ELISA double antibody sandwich ELISA DB-RT-PCR direct binding RT-PCR direct binding RT-PCR ddh 2O double-destilled water re-destilovaná voda DIBA dot immunoblot assay dot immunoblot assay DMSO dimethyl sulfoxide dimetyl sulfoxid DNA deoxyriboluncleic acid deoxyribonukleová kyselina dntp deoxiribonucleic triphosphate deoxyribonukleotid trifosfát dutp deoxiuridine triphosphate deoxyuridin trifosfát dsrna double-stranded nucleic acid dvouvlákenná ribonukleová kyselina DTT dithiothreitol dithiothreitol EDTA ethylene diamino tetraacetic acid etylen diamin tetraoctová kyselina ELISA enzyme linked immunosorbent assay imunochemická testovací metoda na pevné fázi EPPO European plant protection organization Evropská organizace pro ochranu rostlin g (RCF) relative centrifugal force relativní odstředivá síla GRSPaV Grapevine rupestris stem pitting associated virus virus spojovaný s mělkou vrásčitostí kmene révy vinné HEPES 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid [4-(2-hydroxyethyl)-piperazin]-ethan sulfonová kyselina IC-RT-PCR immunocapture RT-PCR immunocapture RT-PCR IgG immunoglobulin G imunoglobulín G IgG-AP immunoglobulin G conjugated with alcaline phosfatase IgG konjugovaný s alkalickou fosfatázou ISEM immunosorbent electron microscopy imunosorbentní elektronová mikroskopie kda kilodalton kilodalton kbp pair of bases tisíc párů bází MLRSV Myrobalan latent ringspot virus virus latentní kroužkovitosti myrobalánu MP movement protein movement bílkovina mrna messenger ribonucleic acid mediátorová ribonukleová kyselina nt nucleotide nukleotid ORF open reading frame otevřený čtecí rámec PAGE polyacrylamide gel electrophoresis polyakrylamidová gelová elektroforéza viii

13 Seznam použitých zkratek Seznam použitých zkratek (pokračování) Zkratka Anglický název Český název PAS Peach asteroid spot disease nemoc projevující se asteroidními skvrnami na broskvoni PCMoV Peach chlorotic mottle virus virus chlorotické strakatosti broskvoně PCR polymerase chain reaction polymerázová řetězová reakce PC-RT-PCR print capture RT-PCR print capture RT-PCR PDV Prune dwarf virus virus zakrslosti slivoně PNRSV Prunus necrotic ringspot virus virus nekrotické kroužkovitosti slivoně Pol complex of replicase proteins komplex replikačních bílkovin PPV Plum pox virus virus šarky švestky PVP polyvinylpyrrolidone polyvinylpyrolidon RdRp RNA dependent RNA polymerase RNA dependentní RNA polymeráza RIPA rapid immunofilter paper assay analýza s bočním proudem RNA ribonucleic acid ribonukleová kyselina rpm rounds per minute otáčky za minutu RpRV Raspberry ringspot virus virus kroužkovitosti maliníku RT reverse transcription reverzní transkripce RT-PCR reverse transcription polymerase chain reaction reverzní transkripce - polymerázová řetězová reakce SC-RT-PCR Spot capture RT-PCR spot capture RT-PCR SDS sodium dodecyl sulphate dodecylsulfát sodný SLRSV Strawberry latent ringspot virus virus latentní kroužkovitosti jahodníku ssrna Single-strand ribonucleic acid jednovlákenná ribonukleová kyselina TAS -elisa triple antibody sandwich ELISA triple antibody sandwich ELISA Taq DNA polymerase from Thermus aquaticus DNA polymeráza z Thermus aquaticus TGB triple gene block triple gene block TMV Tobacco mosaic virus virus mozaiky tabáku TIBA tissue-blot immunoassay tissue-blot immunoassay Tris trishydroxymethylaminomethane trishydroxymethylaminomethan Tth DNA Polymerase from Thermus thermophilus DNA polymeráza z Thermus thermophilus U unit jednotka UDG uracil DNA Glykosylase Uracil-DNA Glykosyláza UV ultraviolet light ultrafialové záření X-GAL 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-thiogalaktoctoside 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galaktopyranosid ix

14 Kapitola 1: Úvod Kapitola 1 Úvod Pěstování peckovin má v České republice dlouholetou tradici. Mezi nejvýznamnější druhy ovocných stromů jsou řazeny švestka domácí (Prunus domestica L.), broskvoň obecná (P. persica L.), meruňka obecná (P. armeniaca L.), třešeň obecná (P. avium L.) a višeň obecná (P. cerasus L.). Rozhodujícími faktory pro stabilizaci a ekonomicky výhodné pěstování těchto ovocných stromů jsou bezesporu správný výběr odrůd, příznivé klimatické podmínky a v neposlední řadě dobrý zdravotní stav samotných rostlin. Široká druhová diverzita rodu Prunus L. se odráží ve velkém počtu virů vyvolávajících na těchto rostlinách choroby. Některé z nich se stávají v rozsáhlých oblastech pro ovocnářskou komoditu nepřehlédnutelným problémem, neboť jsou častou příčinou vzniku ať již přímých či nepřímých ekonomických ztrát. Peckoviny jsou nejčastěji přirozenými hostiteli virů z rodů Ilarvirus, Potyvirus a Trichovirus. Jednou z dalších skupin virů infikujících tyto dřeviny jsou i někteří zástupci rodu Foveavirus, jejichž rozšíření a ekonomický význam pro ovocnářství je doposud ne zcela známý. Do tohoto rodu je taxonomicky řazený i latentní virus meruňky (Apricot latent virus, ApLV). Včasná detekce virových patogenů a přesná diagnostika nemocí, které vyvolávají, mají pro prevenci, nebo alespoň částečné snížení škod na ovocných plodinách obrovský význam a jsou bezesporu nepostradatelné pro zhodnocení efektivity metod ochrany rostlin a pro zajištění zdravých, viruprostých plodin či jejich rozmnožovacích orgánů pro další pěstování. Aby mohl být původce virózy určen, je nezbytné virus identifikovat, odhalit jeho přítomnost v infekční rostlině a ověřit, že tento patogen je s ohledem na Kochovy postuláty opravdu zodpovědný za vznik pozorovaných symptomů. Z výše uvedených důvodů bylo hlavním cílem předkládané disertační práce rozšířit dosavadní znalosti o latentním viru meruňky, jak na biologické, tak i molekulární úrovni, na jejichž základě by bylo možné navrhnout dostatečně citlivé a spolehlivé diagnostické metody pro jeho diagnostiku. 1

15 Kapitola 2: Literární přehled Kapitola 2 Literární přehled 2.1. Pěstování peckovin v České republice V současné době se na našem území rozkládá ha ovocných sadů. Nejvýznamnějším ovocným druhem je jabloň domácí (Malus domestica L.), která se pěstuje na ploše ha (plodné stromy). Velmi rozšířené je i pěstování peckovin, které má v České republice dlouholetou tradici. Mezi nejvýznamnější druhy jsou řazeny višeň obecná (Prunus cerasus L.), švestka domácí (P. domestica L.), meruňka obecná (P. armeniaca L.), třešeň obecná (P. avium L.) a broskvoň obecná (P. persica L.). V roce 2010 zaujímaly produkční sady peckovin přibližně ha zemědělské půdy, z čehož rozloha sadů višní byla ha, slivoní a švestek ha, meruněk ha, broskvoní 781 ha a třešní 880 ha. Průměrný výnos višní byl v roce ,15 t/ha, slivoní a švestek 4,01 t/ha, meruněk 1,24 t/ha, broskvoní 3,37 t/ha a třešní 2,78 t/ha. Meruňky, broskvoně, slivoně a švestky se nejvíce pěstují na území jižní Moravy, pěstování třešní a višní je hlavní ovocnářskou komoditou středních Čech (Anonym 1, 2, 2010). Seznam nejčastěji pěstovaných odrůd peckovin v ČR je uveden v tab. 1 (kapitola Přílohy) Viry peckovin Velmi široká druhová diverzita rodu Prunus L. se odráží ve velkém počtu virů vyvolávajících na těchto rostlinách choroby, z nichž se některé stávají v rozsáhlých oblastech pro ovocnářskou komoditu závažným problémem (Uyemoto & Scott, 1992). Peckoviny jsou napadány zejména viry rodů Ilarvirus, Potyvirus a Trichovirus. Mezi hospodářsky nejvýznamnější viry patří virus šarky švestky (Plum pox virus), virus nekrotické kroužkovitosti slivoně (Prunus necrotic ringspot virus), virus zakrslosti slivoně (Prune dwarf virus), virus mozaiky jabloně (Apple mosaic virus) a virus chlorotické skvrnitosti jabloně (Apple chlorotic leaf spot). Výskyt rodu Nepovirus není v evropských zemích tak častý. Jedná 2

16 Kapitola 2: Literární přehled se např. o virus latentní kroužkovitosti jahodníku (Strawberry latent ringspot virus), virus latentní kroužkovitosti myrobalánu (Myrobalan latent ringspot virus) a virus kroužkovitosti maliníku (Raspberry ringspot virus). Viry z rodů Foveavirus a Closterovirus byly v poslední době zaznamenány jen na určitých omezených lokalitách, informace o jejich výskytu a ekonomickém významu jsou omezeny (Myrta et al., 2003) Stručná charakteristika vybraných virů peckovin Plum pox virus (PPV). Virus šarky švestky, zástupce rodu Potyvirus čeledi Potyviridae (López-Moya et al., 2000), způsobuje významné ztráty na výnosech peckovin, které mohou dosáhnout u náchylných odrůd až 95 %. Přítomnost a intenzita symptomů vyvolaných infekcí PPV se liší na základě jednotlivých kmenů patogena, druhů, kultivarů, a zdravotního stavu hostitelských rostlin. Příznaky se objevují na listech, plodech (včetně pecek) a někdy i na květních orgánech (Llácer & Cambra, 2006). PPV je široce rozšířen ve většině států Evropy, v řadě zemí Asie a na severu Afriky (Simon et al., 1997), pravděpodobně i v Číně a v Severní i Jižní Americe (Malinowski et al., 2006). PPV je přenosný vegetativním množením (Németh, 1986) a velkým počtem různých druhů mšic necirkulativním nepersistentním způsobem (Labonne et al., 1994). Prune dwarf virus (PDV). Virus zakrslosti slivoně, zástupce rodu Ilarvirus, čeledi Bromoviridae je jedním z ekonomicky nejvýznamnějších virů peckovin. Jeho hostitelskými rostlinami jsou broskvoň, třešeň, višeň, švestka a mandloň (Nemeth, 1986; Uyemoto & Scott, 1992). Velmi často se vyskytuje ve směsné infekci spolu s PNRSV a ApMV. Tento celosvětově rozšířený virus je přenosný semeny, pylem a vegetativním množením (Mink, 1992; Brunt et al., 1996). Prunus necrotic ringspot virus (PNRSV). Virus nekrotické kroužkovitosti slivoně je taxonomicky zařazený do rodu Ilarvirus, čeledi Bromoviridae. Přítomnost PNRSV byla zaznamenána po celém světě. Patogen způsobuje na celé řadě dřevinných opadavých druhů stromů a keřů různě se projevující choroby. Infekce může být latentní nebo se projevuje širokou škálou symptomů, jako jsou listové chlorózy, mozaiky, redukce růstu i výnosu (Mink, 1992; Uyemoto & Scott, 1992). Do této doby nebyli u tohoto viru indentifikováni žádní vektoři. Je přenosný pylem, semeny nebo vegetativním množením (Fulton, 1996). V současné době je známo několik desítek kmenů viru lišících se navzájem biologickými, serologickými či molekulárními vlastnostmi (Fulton, 1981; Hammond et al., 1999; Vašková et al., 2000; Myrta et al., 2001). 3

17 Kapitola 2: Literární přehled Apple mosaic virus (ApMV). Virus mozaiky jabloně je zástupce rodu Ilarvirus, čeledi Bromoviridae. Tento kosmopolitně se vyskytující virus má velmi široký okruh hostitelů (Fulton, 1972), mezi něž řadíme ostružiník, maliník, jabloň, meruňku, třešeň, mandloň, švestku, broskvoň, lísku, růži, chmel a břízu (Brunt et al., 1997; Francki et al., 1991). Do této doby nebyl popsán přenos pomocí vektorů. Virus je přenosný velmi pravděpodobně pylem, vegetativním množením z infekčních stromů či mechanicky. ApMV je velmi často přítomen ve směsné infekci s PNRSV a PDV, ale četnost výskytu ApMV je o hodně nižší než četnost zbylých dvou virů (Fulton, 1972). Apple chlorotic leaf spot virus (ACLSV). Virus chlorotické listové skvrnitosti jabloně je zařazený do rodu Trichovirus, čeledi Flexiviridae. Jeho hostitelský okruh je velmi široký, mezi nejčastější hostitele patří jabloň, hruška, broskvoň, švestka, třešeň a meruňka (Nemeth, 1986; Desvignes & Boye, 1989). Jeho ekonomická významnost je velká, neboť je celosvětově rozšířen a je velmi často v ovocných školkách příčinou inkompatibility při roubování. I když se většina kmenů viru na peckovinách neprojevuje příznaky, některé mohou být příčinou rozetky a odumírání podnoží (Desvignes & Boye, 1989). Přenos patogena se uskutečňuje vegetativním množením (Németh, 1986) Viry peckovin na území České republiky Nejzávažnější virovou chorobou peckovin v České republice je bezesporu šarka švestky (Polák, 1997). Příznaky PPV byly na rostlinách peckovin poprvé pozorovány ve východních Čechách na počátku 40. let 20. století, od té doby se virus rozšířil do většiny regionů, kde se tyto stromy pěstují (Navrátil, 2006). V České republice byl výskyt viru šarky švestky prokázán v přírodě i v ovocných sadech na všech druzích peckovin vyjma třešně a višně. Onemocnění peckovin šarkou se v současné době vyskytuje plošně nejen v nížinách, ale i v podhůří a vyšších polohách, kde ještě před třiceti nebo čtyřiceti lety byly švestky zdravé. Slabší výskyt viru je pouze v jižních Čechách a na jižní Moravě. K přirozeným hostitelům tohoto viru patří trnky, které byly infikovány přenosem mšicemi z infikovaných švestek, slivoní a myrobalánu a staly se sekundárním zdrojem infekce (Polák, 2006). Mezi nejvýznamnější ilarviry napadající peckoviny v České republice patří virus zakrslosti slivoně a virus nekrotické kroužkovitosti slivoně. V současnosti je PDV v České republice rozšířen převážně na trnkách, třešni a myrobalánu, PNRSV je rozšířen na třešni a myrobalánu. 4

18 Kapitola 2: Literární přehled Výskyt viru chlorotické skvrnitosti jabloně a viru mozaiky jabloně, které mohou na slivoních vyvolávat příznaky podobné šarce, tzv. pseudošarku, je v ČR ojedinělý. Ve výsadbách třešně se může také vyskytnout virus svinutky třešně, avšak i jeho výskyt je sporadický (tab. 2, kapitola Přílohy) (Polák, 2006). O systematickém průzkumu výskytu virů na teplomilných ovocných dřevinách, to jest na broskvoních a meruňkách na našem území nebyly v literatuře nalezeny žádné odkazy. Po ústní konzultaci s Doc. Ing. Jaroslavem Polákem DrSc. jsme se ujistili, že se touto problematikou v poslední době v České republice nikdo podrobně nezabýval Čeleď Betaflexiviridae Čeleď Betaflexiviridae, taxonomicky řazená do řádu Tymovirales, je pojmenována podle pružného virionu jejich zástupců ( flexuous znamená ohybný, pružný, vlnící se). Čeleď zahrnuje rostlinné viry rodů Capillovirus, Carlavirus, Citrivirus, Foveavirus, Trichovirus a Vitivirus, společně s některými příbuznými nezařazenými viry (Anonym 3, 2011). Čeleď je odvozena od fylogenetické analýzy sekvencí RNA polymerázy a obalového proteinu. Hlavní charakteristiky zástupců čeledi jsou: pružný vláknitý virion o průměru nm monopartitní pozitivní jednovlákenný RNA genom s 3 polyadenylovým koncem translace alespoň několika otevřených čtecích rámců (ORF) ze subgenomických mrna až 6 otevřených čtecích rámců organizovaných od 5 k 3 konci: 1. alpha-like replikační protein ( kda) zahrnující konzervativní methyl-transferázu, helikázu a RNA dependentní RNA polymerázu (RdRp) (Koonin & Dolja, 1993) 2. jeden nebo více movement proteinů, které umožňují translokaci viru v rostlině (MP) 3. jednoduchý kapsidový obalový protein (CP) (22-44 kda) 4. u některých virů šestý otevřený čtecí rámec, který může částečně přesahovat 3 -konec genu obalového proteinu a je možné, že má nukleotidové vazebné vlastnosti (Adams et al., 2004). 5

19 Kapitola 2: Literární přehled Řád zahrnuje viry obsahující jak jednoduchý movement protein 30K nadčeledi i viry kódující triple gene block (TGB) (Morozov & Solovyev, 2003), avšak analýzy RdRp a CP sekvencí naznačují, že se jedná o jednu soudržnou taxonomickou jednotku (Adams et al., 2004). Z hlediska biologických vlastností jsou jednotlivé viry čeledi Betaflexiviridae velmi odlišné. Jejich přítomnost byla prokázána na řadě bylinných i dřevinných, jedno i dvouděložných rostlinných druzích, avšak hostitelský okruh jednotlivých členů je obvykle omezený. K přirozené infekci zástupců rodů Foveavirus, Capillovirus, Vitivirus a Trichovirus dochází většinou nebo výhradně u dřevinných hostitelů. Většina virů má na hostitele poměrně mírné dopady. Všechny rody této čeledi mohou být často bezproblémově přenášeny mechanicky. Většina virů této skupiny nemá žádné známé vektory. Výjimku tvoří zástupci rodu Trichovirus, které jsou pravděpodobně přenášeny roztoči a většina druhů z rodu Carlavirus, jež jsou neperzistentně přenášeny mšicemi. Řada vektorů je zaznamenána také u různých druhů z rodu Vitivirus (Adams et al., 2004) Rod Foveavirus Rod Foveavirus je zařazen do čeledi Betaflexiviridae. Název rodu je odvozen od latinského slova fovea, které v češtině znamená důlek, díra (tyto výrazy mají představovat základní symptomy u typového zástupce rodu Apple stem pitting virus). Pružná vlákna virionu o průměru nm jsou dlouhá od 800 do nm. RNA molekuly mají helikalní symetrii. Viriony neobsahují lipidy ani sacharidy, mají positivní ssrna genom o velikosti 8,4 až 9,3 kb s 3 polyadenylovým koncem a jednoduchý typ bílkovinného obalu o velikosti kda. Jejich genom je složen z 5 otevřených čtecích rámců (ORF), které kódují proteiny v pořadí: bílkoviny související s replikací (ORF 1), movement proteiny (ORF 2-4, triple gene block) a obalový protein (ORF 5). Genomová struktura a organizace je úzce podobná rodům Potexvirus, Carlavirus a Allexvirus, ale ORF 1 a bílkovinný proteinový cistron rodu Foveavirus je podstatně delší. Okruh přirozených hostitelů jednotlivých druhů rodu je omezen na jeden jediný (Grapevine rupestris stem pitting-associated virus) nebo jen na několik hostitelů (Apple stem pitting virus, Apricot latent virus). Viry nejsou přenášeny žádným vektorem. K přenosu virů dochází mechanicky, k jejich rozšiřování napomáhá infekční množitelský materiál. 6

20 Kapitola 2: Literární přehled Experimentální hostitelský okruh je omezen, ale v přirozeném prostředí jsou viry poměrně široce geograficky rozšířeny (Martelli & Jelkmann, 1998). Typovým zástupcem rodu Foveavirus je Apple stem pitting virus, dalšími druhy jsou Apricot latent virus, Grapevine rupestris stem pitting-associated virus a Peach chlorotic mottle virus (Anonym 3, 2011) Zástupci rodu Foveavirus Apple stem pitting virus (ASPV), virus mělké vrásčitosti kmene jabloně, je široce rozšířený patogen. ASPV byl poprvé zaznamenán na M. silvestris ve středozápadní části USA (Smith, 1954). Ačkoliv je ASPV na většině komerčně pěstovaných kultivarů jabloní a hrušní bezpříznakový, na citlivých indikátorových rostlinách jsou symptomy přítomné (Yanase et al., 1990). Virus způsobuje vrásčitost kmene M. pumila Virginia Crab a epinastii s celkovým oslabením okrasné jabloně Spy 227. Dhir et al. (2009) detekovali ASPV v Indii na rostlinách třešní (P. avium) cv. Stella a višní (P. cerasus) a Youssef et al. (2011) v pletivech révy vinné, což naznačuje, že hostitelský okruh ASPV je širší, než se dříve předpokládalo. ASPV je příčinou onemocnění způsobující nekrotické skvrny a žlutou žilkovitost hrušní, Pear vein yellows disease (Lemoine, 1979; Nemeth, 1986; Jelkmann, 1997). Virus se často objevuje ve směsné infekci s dalšími latentními viry jako např. Apple chlorotic leaf spot virus a Apple stem grooving virus. ASPV je přenosný roubováním (Leone et al. 1998; Kundu, 2003). Jeho ekonomická významnost pro pěstování jabloní a hrušní je nepřehlédnutelná. Redukce růstu může u jabloní dosáhnout 10 % a u hrušní %. Snížení výnosu u obou komerčně pěstovaných ovocných druhů může dosahovat % (Lemoine, 1979; Desvignes, 1999; Lemoine, 2000). Poslední monitoring tohoto patogena v České republice označil asi 28 % jabloní jako ASPV pozitivní (Kundu, 2003). Grapevine rupestris stem pitting-associated virus (GRSPaV), virus spojovaný s mělkou vrásčitostí kmene révy vinné, je asi nejčastěji přítomným virem rodu Vitis L. (Meng & Gonsalves, 2003). Tento patogen je velmi často spojován s chorobou mělké vrásčitosti kmene révy vinné Rupestris stemp pitting (RSP) (Goheen, 1988), která představuje jednu z komplexu 4 chorob nazývaného Rugose wood (RW). RW je celosvětově rozšířené, rouby či očky přenosné onemocnění, napadající dřevní části rostlin (Martelli, 1993). Samotný GRSPaV vyvolává na rostlinách pouze mírné symptomy, některé jeho kmeny jsou i latentní (Meng et al., 2005), avšak směsná infekce s jinými viry révy vinné, například s Grapevine virus A, může vznik virových příznaků silně podnítit (Bonfiglioli et al., 1998; Gribaudo et al., 7