CADASIL analýza mutací v genu NOTCH3 H. Vlášková, M. Boučková Hnízdová, A. Loužecká, M. Hřebíček, R. Matěj, M. Elleder Ústav dědičných metabolických poruch 1. LF UK a VFN Oddělení patologie a nár. ref. laboratoř TSE-CJN, FTN http://udmp.lf1.cuni.cz/
CADASIL Cerebrální Autozomálně Dominantní Arteriopatie se Subkortikálními Infarkty a Leukoencefalopatií Patofyziologický podklad: postižení malých subkortikálních artérií v důsledku mutací v genu NOTCH3 Klinický obraz: subkortikální ischemické ikty (30 50 let) kognitivní poruchy, závratě, poruchy řeči, sluchu, zraku migrény (s nebo bez aury) psychiatrické potíže progredující vaskulární demence První příznaky: mezi 20 50 lety věku Incidence: neznámá v ČR, 2 : 100 000 dosp. ve Skotsku
CADASIL Morfologické změny: Makroskopické Mozek -mnohočetné infarkty malých artérií (typický MRI obraz) Mikroskopické Hladké svalstvo arterií (mozek, kůže) - přítomnost GOM na zevní ploše bazální laminy buněk hladkého svalstva arteriol (el. mikroskop) 18 000 x
MRI pacienti s mutací v genu NOTCH3 ve věku A, B : 20-30 let C : 40-50 let D : 50-60 let van den Boom, R. et al. Radiology 2003;229:683-690 Copyright Radiological Society of North America, 2003
Notch 3 - protein o velikosti 2321 AA - rodina transmembránových receptorů (Notch1-4) - vazba s ligandy -odštěpení intracelulární části jako signálu Notch signální dráha: regulace růstu, apoptózy, buněčné diferenciace u živočichů
Diagnostika CADASIL dřívější model - klinický obraz, pozitivní rodinná anamnéza - typický MRI obraz - kožní biopsie -ELMI (přítomnost GOM) - imunohistochemicky prokázané zvýšené množství materiálu reagujícího s protilátkou proti Notch3 - mutace v genu NOTCH3
Nový diagnostický postup - klinické podezření a MRI nález - sekvenování exonů 3 až 12 - negativní nález hluboká kožní biopsie - pozitivní ELMI nebo imunohistochemie - sekvenování zbylých 13 exonů
Gen NOTCH3 HGMD databáze: 172 mutací 161 missence mutací 5 malých delecí, 2 sestřihové mutace, 2 malé inzerce, 1 indel mutace, 1 velká delece Joutel et al, 1997
EGF-like doména - doména podobná motivu v epidermálním růstovém faktoru - v extracelulární doméně transmembránových proteinů nebo u sekretovaných proteinů -v genu NOTCH3 34 EGF-like domén - konzervovaný motiv 30-40 aminokyselin - šest 100% konzervovaných cysteinů tvoří 3 disulfidovémůstky
Mutační analýza výsledky v ÚDMP od r. 2005 vyšetřeno 48 probandů 13 nalezených mutací (12 cysteinových, 1 ne) 3 nové mutace (nepopsané v HGMD) Pacienti bez mutace Pacienti s prokázanou patogenní mutací Pacient spotenciálně patogenní mutací
Mutační analýza výsledky 1. část Rodina Pacient Prokázané variace Vliv na protein Lokalizace 2 Proband (1) c.866 G >T p. G296C Exon 6 syn probanda (2) c.866 G >T p. G296C syn probanda (3) -/- dcera probanda (4) c.866 G >T p. G296C bratr probanda (5) -/- synovec probanda (6) c.866 G >T p. G296C sestra probanda (7) c.866 G >T p. G296C 5 probandka c.1931 T >A p. V644D Exon 12 6 probandka c.566 A >G p. Y189C Exon 4
Mutační analýza výsledky 2. část Rodina Pacient Prokázané variace Vliv na protein Lokalizace 7 proband c. 994 C >T p. R332C Exon 6 syn probanda -/- 10 probandka c.544 C >T p. R182C Exon 4 dcera, synovec c.544 C >T p. R182C neteř, synovec -/- 11 proband c.1261 C >T p. R421C Exon 8 13 probandka c.431 G >T p. C144F Exon 4 23 proband c.1732 C >T p. R578C Exon 11 27 proband c.3172 C >T p. G1058C Exon 20 28 proband c.994 C >T p. R332C Exon 6 38 proband sestra c.544 C >T c.544 C >T p. R182C p. R182C Exon 4 44 proband c.994 C >T p. R332C Exon 6 47 probandka c.544 C >T p. R182C Exon 4 Celkový záchyt činí 27% (13 z 48), s příbuznými ale 34% (23 z 67)
Korelace genotypu a fenotypu Mutace Klinické příznaky Familiární výskyt Kožní biopsie 1 wt/wt demence,? ne neprokázáno 2 G296C/wt kognitivní, CMP ano GOM/imunohisto 3 wt/wt?? neprokázáno 4 wt/wt? ano neprokázáno 5 V644D/wt?? 1 céva, negativní 6 Y189C/wt migrény, TIA, MRI ano GOM/imunohisto 7 R332C/wt CT, MRI, kognitivní ano GOM/imunohisto 11 R182C/wt migrény, CT ano nevyšetřeno 12 R421C/wt kognitivní, TIA? GOM 14 C144F/wt migrény, TIA, MRI ano GOM/imunohisto 15 wt/wt CMP ano nevyšetřeno
Fragmentační analýza - 15 negativních probandů -běžné polymorfismy v homozygotním stavu -přítomnost rozsáhlejší delece na druhé alele? - vysoce polymorfní STR markery (D19S252, D19S923, D19S415) na chromozomu 19 Výsledek: neprokázali jsme přítomnost rozsáhlé delece u žádného z výše zmíněných probandů, ale zároveň ani nevyloučili možnost menší delece mezi použitými markery.
CADASIL analýza mutací v genu Notch3 Závěr - shoda mutační a morfologické analýzy - upozornění na výskyt této choroby v ČR (incidence neznámá) - nezbytnost genetické porady v rodině (u presymptomatických konzultandů ve více fázích jako u M. Huntington)
MUDr. Martin Hřebíček, PhD. MUDr. Radoslav Matěj, PhD. Prof. MUDr. Milan Elleder, DrSc. RNDr. Lenka Dvořáková, CSc. Michaela Boučková Hnízdová Alena Loužecká Bc. Helena Myšková MUDr. Larisa Stolnaja Eva Richterová hana.vlaskova@lf1.cuni.cz MŠM ČR 0021620806 a MZ ČR 64165