Část 3, Čerpadla pro HPLC Celý HPLC systém sestává ze zásobníku mobilní fáze, vysokotlakého čerpadla, injektoru, kolony (obvykle v termostatu), detektoru a datastanice (Schema níže). Vysokotlaké čerpadlo hraje klíčovou roli v separačním procesu a jsou na něj kladeny značné požadavky. 59
Požadavky na čerpadla HPLC čerpadla musí spojovat dva odlišné požadavky: musí to být odolná zařízení schopná poskytovat tlaky až do 40 MPa, ale zároveň je požadována vysoká správnost a přesnost nastaveného průtoku. Rozsah průtoků pro čerpadla určená pro analytickou HPLC bývá od 0.1 ml/min do 5-10 ml/min a průtok bává nastavitelný po 0.01 ml/min. Poskytovaný průtok musí být nezávislý na tlaku, a to i v případě gradientové eluce, kdy se tlak mění. Navíc průtok má být prakticky bezpulzní, zvláště při užití refraktometrického, vodivostního nebo elektrochemického detektoru. Čerpadlo musí mít velkou chemickou odolnost a vysokou životnost zejména vysoce namáhaných dílů, písty, těsnění, ventily. Další požadavky se vztahují k snadné ovladatelnosti čerpadla. Čerpadlo by mělo být připraveno k užití jen provedením několika jednoduchých operací (tj. promytí čerpadla novou mobilní fází, apod.). Vnitřní objem čerpadla by měl být malý, aby se dala rychle a malým množstvím mobilní fáze změnit kapalina v čerpadle. Veškerá údržba by měla být snadná a jednoduchá. Primárním cílem není dosáhnout vysoký tlak, ale zajištění odpovídajícího průtoku mobilní fáze na koloně, to ale vyžaduje aplikaci relativně vysokých tlaků v důsledku poměrně vysoké viskozity kapalin na jedné straně a malých rozměrů částic sorbentů na straně druhé. Navíc platí, že čím je sorbent menšího zrnění, tím jsou separační účinnosti systému větší. Čerpadla reciprokační Nejběžnější HPLC čerpadla jsou tzv. čerpadla reciprokační. Jejich obecné schéma je uvedeno na obrázcích níže. 60
Mobilní fáze je čerpána pístem a vstupní a výstupní ventily zajišťují průtok solventu jen jedním směrem. Pohyb čerpadla je vyvolán krokovým motorem ve spojení s vačkovou hřídelí. Ta pak posouvá píst jedním nebo druhým směrem. Při každé periodě opakujícího se pohybu dojde k nasátí malého množství kapaliny do čerpadla, většinou kolem asi 100 ul. Mohou být užity i elektronicky řízené ventily, ty se osvědčují zvlášť při malých průtocích. Pokud by vačková hřídel byla dokonale kruhová a motor pracoval zcela pravidelně, průtok kapaliny by byl diskontinuální. Pro dosažení bezpulzního toku je třeba, aby hřídel byla nepravidelného tvaru a motor pracoval na základě časového programování, které je závislé na poloze pístu. V době, kdy čerpadlo dodává kapalinu do systému se píst pohybuje pomalu a tvar hřídele zajišťuje téměř konstantní průtok. Naopak v době, kdy se čerpadlo plní, se musí 61
píst pohybovat rychle, protože v té chvíli do systému kapalina není dodávána a tento čas musí být co nejkratší: Píst může být ovládán i elektronicky s využitím lineárního motoru, pohyb může být následně velmi přesně řízen, tyto instrumenty jsou ale poněkud dražší. Tok bývá vyhlazován zapojením dvou čerpadel paralelně tak, aby v okamžiku dodávání kapaliny do sytému jedním čerpadlem se druhé čerpadlo plnilo. Další užívané zapojení je zapojení dvou hlav čerpadel v sérii. Tento typ propojení umožňuje kompenzovat vliv stlačitelnosti kapaliny a potlačuje kavitaci ve hlavě čerpadla. K potlačení vlivu stlačitelnosti kapaliny se používá i elektronická kompenzace. Písty bývají safírové nebo keramické a jsou velmi křehké. Nicméně při jejich běžném užití v čerpadle nedochází k jejich zlomení. Problémem ovšem je, pokud je v čerpadle ponechán pufr a dojde k odpaření kapaliny a na pístech zůstanou krystaly soli. Pokud je pak čerpadlo 62
spuštěno, může dojít k poškrábání pístu a především ke zničení těsnění kolem pístu v hlavě čerpadla a v jeho důsledku k problémům se spolehlivostí průtoku čerpadla. Těsnění kolem pístu je zhotoveno z inertního polymeru, většinou směsi teflonu s grafitem, mívá vloženou pružinku a zaleží při jeho instalaci na orientaci vzhledem k pístu. Kapalina ve velmi malém množství podtéká kolem těsnění a zvlhčuje jej. Většina dnešních moderních čerpadel je vybavena tzv. oplachem těsnění pístů, kdy je na straně za pístem malým průtokem vedena voda nebo její směs s organickým rozpouštědlem a píst je tak kontinuálně oplachován a sole odstraňovány. Ventily v hlavě čerpadla jsou většinou tvořeny rubínovou kuličkou a safírovým sedlem. Kulička dosedá na velmi malou přesně tvarovanou kruhovou část sedla a jeho tvar zajišťuje průtok kapaliny jen jedním směrem. Pokud se do ventilu dostane nečistota, může přestat těsnit a je třeba jej bud vyčistit nebo, pokud se to nepodaří, vyměnit. I to je jedním z důvodů proč musí být mobilní fáze pro HPLC filtrována. ÚDRŽBA HPLC čerpadlo je přesný instrument a musí být ošetřováno s podobnou pečlivostí jako např. laboratorní analytické váhy. Všechna doporučení uvedená v manuálu k přístroji je třeba dodržovat. Přes všechnu pravidelnou péči je ale stejně třeba jistá pravidelná údržba. Při jejím provádění je nutno se řídit pokyny v manuálu. Při všech manipulacích s částmi čerpadla je zásadním požadavkem pracovat čistě a mít dostatek prostoru na práci i čas. Pod hlavou čerpadla je třeba umístit vhodnou nádobu, aby nemohlo dojít k poškození součástek např. pádem na zem. Písty se časem dlouhodobým používáním opotřebovávají a potřebují výměnu, nedají se opravit. K tomu je třeba vyjmout hlavu z těla čerpadla, a tím se vytvoří přístup k těsněním. Těsnění se obvykle vyjímají pomocí speciálního přípravku, ten bývá součástí servisního příslušenství k čerpadlu. Není dobré vyjímat těsnění náhradním nástrojem, protože může dojít k poškození hlavy a následně k podtékání. Těsnění se neopravuje, ale vyměňuje a vkládá se opět speciálním přípravkem. Při jeho instalaci bývá nutné důsledně postupovat podle manuálu. Pokud dojde k vložení těsnění např. v opačném směru, musí se těsnění vyjmout a již není možné jej užít k instalaci ve správném směru, protože bývá poškozené. Nové těsnění by mělo být při jeho instalaci navlhčeno vhodným solventem, např. isopropanolem a v čerpadle by měl být použit také tento solvent, a za nízkého průtoku bez připojení kolony by mělo být těsnění po jistou dobu kondiciováno. 63
Částečně ucpané nebo podtékající ventily mohou být opravitelné aplikací vhodného rozpouštědla a vložením do ultrazvukové lázně. Běžně se musí zkusit více solventů, voda s detergentem, tetrahydrofuran nebo dichlormethan. Některé ventily se při jejich vyjmutí z hlavy čerpadla rozpadnou na jednotlivé díly, a tak případně může dojít ke ztrátě některých částí, jiné ventily nejsou vůbec rozebíratelné, záleží na instrukcích v manuálu a je třeba se jimi při čistění ventilů řídit. Dvě doporučení jsou zásadní: (a) čerpadlo nesmí nikdy běžet bez mobilní fáze tzv. na sucho! (b) nevypínejte čerpadlo, pokud je v pufru! Vždy čerpadlo promyjte vodou nebo směsí vody s organickým rozpouštědlem, přídavek organického rozpouštědla je velmi vhodný především pokud bude čerpadlo odstaveno po delší dobu, protože je tak zabráněno případnému růstu mikroorganizmů v mobilní fázi. DALŠÍ TYPY HPLC ČERPADEL Ve speciálních případech může být píst kompletně izolován od čerpané kapaliny. Píst se pohybuje v komoře naplněné olejem a olej i píst je zcela izolován od čerpané kapaliny kovovou membránou. Tento způsob může být aplikován při čerpání agresivních kapalin a umožňuje také úplně vyloučit kontaminaci čerpané kapaliny drobnými uvolněnými částečkami z těsnění pístu. Pro velmi malé průtoky lze také použít pístové čerpadlo, které je svou konstrukcí shodné s injekční stříkačkou. Pomalu se pohybující píst dodává do HPLC kapalinu přímo ze stříkačky. Tento tok je bezpulzní. Stříkačka má omezený objem, např. 10 ml, a s tím musí být počítano při jejím provozu. Pokud má systém pracovat kontinuálně po delší dobu je třeba mít dvě stříkačky a během dodávky kapaliny jednou stříkačkou naplnit druhou stříkačku mobilní fází a jejich činnost synchronizovat. 64
Pneumatická čerpadla jsou většinou užívana k plnění kolon a nebo pokud jsou třeba tlaky přes 50 MPa. V tomto uspořádání se využívá toho, že na jedné straně je na píst s velkou plochou působeno poměrné malou silou a na druhé straně, která je v kontaktu s čerpanou kapalinou a kde je píst s malou plochou, se generuje vysoký tlak. Tlaky jsou v poměru plochám pístů. Zesílení tlaků může být až sedmdesáti násobné, takže tlak 1 MPa může být zesílen na 70 MPa. Pro preparativní HPLC existují komerční čerpadla poskytující průtoky 300 ml/min při tlaku asi 30 MPa. 65