Aplikační rozsah chromatografie

Rozměr: px

Začít zobrazení ze stránky:

Download "Aplikační rozsah chromatografie"

Radomír Miloslav Čermák
před 7 lety
Počet zobrazení:

1 Chromatografické metody II.

2 Aplikační rozsah chromatografie

3 Chromatografie

4 Kapalinová chromatografie rozdělení Nízkotlaká (atmosferický tlak) LPC Střednětlaká (4 Mpa) FPLC Vysokotlaká (40 Mpa) HPLC Ultravysokotlaká (100 Mpa) UPLC

5 Kapalinová chromatografie využití LPC preparativní FPLC semipreparativní a analytická HPLC analytická UPLC analytická

6 Kapalinová chromatografie doba trvání LPC hodiny FPLC desítky minut HPLC minuty UPLC - sekundy

7 Zařízení pro LPC

8 Zařízení pro LPC

9 Zařízení pro LPC

10 Zařízení pro LPC

11 Instrumentace pro LPC Pumpa peristaltická nebo gravitace Gradient mísič gradientu Dávkování přímo pumpou na kolonu Kolony skleněné Detekce spektrofotometrická 254, 280 nm Vyhodnocování zapisovač Sběrač frakcí programovatelný

12 LPC

13 Instrumentace pro FPLC a HPLC

14 Zařízení pro FPLC a HPLC

15 Zařízení pro FPLC

16 Zařízení pro HPLC

17 Zařízení pro UPLC

18 UPLC x HPLC kratší doba analýzy = vyšší průchodnost vzorků (vyšší produktivita) snížení nákladů = menší spotřeba HPLC rozpouštědel (ekologie) zvýšení separační účinnosti snížení meze detekce zvýšení citlivosti více kvalitativních informací

19 UPLC x HPLC

20 UPLC x HPLC

21 Příprava mobilní fáze

22 filtrace Příprava mobilní fáze

23 Odplynění mobilní fáze přechod varem za nízkého tlaku ozvučení ultrazvukem vakuová filtrace in-line membránové odplynění probublávání inertním plynem

24 Pumpy

25 Pumpy pracující za konstantního tlaku

26 Tlaková pumpa

27 Pumpy pracující za konstantního průtoku

28 Lineární dávkovače

29 Pumpa jednopístová

30 Pumpa dvoupístová

31 Pumpa dvoupístová

32 Pumpa dvoupístová

33 Tlumení pulsů

34 Tlumení pulsů

35 Gradient nízkotlaký

36 Gradient vysokotlaký

37 Dávkování septum

38 Dávkování dávkovací ventil

39 Dávkování dávkovací ventil

40 Dávkovací ventil Load

41 Dávkovací ventil Inject

42 Kolony pro FPLC

43 Kolona 1. kovový plášť 2. Porézní kovová frita 3. Stacionární fáze 4. Převlečný ochranný kroužek 5. Koncová hlavice 6. vstup pro kapiláru se šroubem

44 Předkolona

45 Kolony pro HPLC a UPLC

46 Kolony pro nano- a kapilární HPLC

47 Částicový sorbent tvar: : sférický (bez povrchových vad) rozměr pro kolony: analytické 1 8 μm preparativní > 10 μm povrchové rozrůznění póry polymerní částice

48 Monolitický sorbent makropóry: : ~1500 nm; mezopóry: : < 50 nm, mikropóry < 2 nm pórovitost monolitické stacionární fáze až 85 %; oproti částicové s pórovitostí max 60 % vysoké průtoky za nízkých tlaků; velká efektivní plocha rychlá separace: vysoké rozlišení a vysoká kapacita

49 monomer + polymerační činidlo + porogen ML-SF na bázi siliky tetramethoxysilan (TMOS) tetraethoxysilan (TEOS) + kyselina octová + polyethylenglykol (PEG) ML-SF na bázi organických materiálů styren-divinylbenzen (S-DVB) izooktan metakryláty tetrahydrofuran vinyl-deriváty (vinylpyrrolidon,, vinylacetát) dekanol nevýhoda: : obtížná výroba provedení: : disk, trubička, plněná kapilára

Molekuly biopolymerů unášené konvektivním prouděním mobilní fáze se těmito póry lehce dostávají do

50 Perfúzní chromatografie Využívá médií - POROS média, jejichž částice (10, 20,50 mm) m) mají velké příčné póry nm. Molekuly biopolymerů unášené konvektivním prouděním mobilní fáze se těmito póry lehce dostávají do nitra částic. Příčné póry jsou navíc vzájemně propojeny krátkými difuzními póry nm. Vytváří se tak síťová struktura s rozsáhlým vnitřním prostorem pro interakci nosiče s biopolymerem.

51 Perfúzní chromatografie - princip Průtokem mobilní fáze vytváří napříč každou částicí média rozdíl tlaku, který indukuje konvektivní tok příčnými póry (perfúze). Biomakromolekuly ve vzorku se tak dostávají do kontaktu jak s povrchem částic, tak i s vazebnými místy v jejich nitru.

52 Perfúzní chromatografie K efektu perfúze dochází jen při určité průtokové rychlosti. Moderní HPLC a FPLC systémy mohou zajistit podmínky perfúze pouze u malých analytických POROS kolon (4.6 x 100 mm, objem 1.7 ml, při průtokové rychlosti kolem 10 ml.minmin - 1 ). Výhody ve srovnání s chromatografií konvenční: Kapacita je vysoká, nezávisí na průtokové rychlosti. Rozlišení je vysoké, nezávisí na průtokové rychlosti. Rychlost separace je obvykle x větší než u konvenčních médií, řádově se pohybuje v minutách.

53 Perfúzní chromatografie - princip

54 UPLC stacionární fáze Waters

55 UPLC stacionární fáze Waters

56 Chipová chromatografie struktury vyleptané do křemíkové (Si) destičky doprava MF: : pumpa, odstředivá síla, el. staticky výhody: : rychlost analýzy, velikost, malá spotřeba vzorku (< nl!) nevýhody: : práce s malými objemy (povr.. napětí, elektrostatické interakce)

57 Chipová chromatografie Agilent

58 Detektory

59 Detektory

60 Refraktometrický detektor index lomu šum 10-7 dyn. rozsah 10 4 citlivost 10-7 g/ml

61 Refraktometrický detektor

62 Refraktometrický detektor

63 Refraktometrický detektor

64 Light scattering detektor Rozptyl šum 10-8 dyn. rozsah 10 4 citlivost 10-9 g/ml

65 Light scattering detektor

66 UV VIS detektor detekční cela Absorbance šum 10-4 dyn. rozsah 10 4 citlivost g/ml

67 UV VIS detektor detekční cela

68 UV VIS detektor s fixní vlnovou délkou

69 UV VIS detektor s proměnlivou vlnovou délkou

70 UV VIS detektor s diodovým polem

71 Fluorescenční detektor Fluorescence citlivost 10-9 g/ml

72 Fluorescenční detektor

73 Elektrochemický detektor elektrický proud citlivost 10-9 g/ml

74 Elektrochemický detektor

75 Konduktometrický detektor Vodivost šum 10-3 dyn. rozsah 10 6 citlivost 10-8 g/ml

76 Konduktometrický detektor

77 Aerosolový detektor nabitých částic

78 LC-MS počet iontů citlivost g/ml

79 LC-MS

80 Electrospray

81 Ionizace

82 Ion Trap

83 Kvadrupol

84 Šum a drift detektoru > 3 Mez detekce S/N > 3 Mez stanovitelnosti S/N > 10

85 Lineární rozsah detektoru

86 Derivatizace zvýšení citlivosti nebo umožnění detekce vůbec zvýšení rozlišení nebo umožnění separace vůbec zamezení nežádoucí sorpce látek na koloně

87 Požadavky na deriváty chemické individuum stabilní reakce kvantitativní, rychlá, selektivní bez vedlejších produktů za mírných reakčních podmínek (ph, teplota) činidlo musí být dobře separovatelné od svých produktů na koloně jiné fyzikálně- chemickévlastnosti

88 Derivatizace pre-column - před vlastní analýzou post-column za kolonou po analýze

89 Derivatizace

90 Vyhodnocení Zapisovače Integratory Integrační software + PC

91 Zjištění plochy píků u zapisovačů vážením

92 Zjištění plochy píků u zapisovačů planimetrem

93 Zjištění plochy píků u zapisovačů výpočtem plocha = základna x výška

94 Integrator

95 Provedení Analytické Preparativní

96 Analýza kvalitativní Srovnání retenčních časů (objemů) píků u vzorku a standardů spiking přidání standardu do vzoru nárůst výšky píků Specifická detekce UV-VIS, VIS, fluorescence, elektrochemická MS

97 Analýza kvantitativní Plocha (výška) píku

98 Analýza kvantitativní Metoda externího standardu

99 Analýza kvantitativní Metoda vnitřního standardu

100 Analýza kvantitativní Metoda standardního přídavku

101 Problémy při LC analýze

102 LC analýza

Podobné dokumenty

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) Příprava předmětu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253 Kapalinová chromatografie (LC) 1.1. Teorie kapalinové