Jihočeská univerzita v Českých Budějovicích Biologická fakulta

Jihočeská univerzita v Českých Budějovicích Biologická fakulta Bakalářská práce Mykorhizní infekce semenáčků Plantago lanceolata na obhospodařované louce. Martina Lokvencová Školitel: RNDr. Marie Šmilauerová, PhD. České Budějovice 2007

Lokvencová M. (2007): Mykorhizní infekce semenáčků Plantago lanceolata na obhospodařované louce. [Mycorrhizal infection of Plantago lanceolata seedlings in a managed grassland.] - 46 p., Faculty of Biological Sciences, University of South Bohemia, České Budějovice, Czech Republic. Annotation: Development of arbuscular mykorrhizal infection was monitored in root systems of Plantago lanceolata seedlings. Two experiments were established: one in two different parts of a seminatural grassland and another in a glasshouse, both run simultaneously in spring and in autumn. Substrate for the glasshouse experiment was taken from the experimental site. Mycorrhizal colonization was increasing with the length of seedling exposure. Pattern of colonization differed on the meadow between spring and autumn. Mycorrhizal infection of seedlings was higher in autumn than in spring. The seedlings on meadow had higher level of mycorrhizal infection than the seedlings in glasshouse. Density of spores in the two parts of meadow was similar, but the distribution of spore types was partly different. Poděkování Předně děkuji svojí školitelce Majce Šmilauerové za velkou ochotu, laskavost a hlavně trpělivost mi vždy pomoci a poradit. Také velké poděkování patří jejímu manželovi Petrovi za čas, rady a připomínky, Blance Divišové za pomoc při zpracovávání semenáčků a také děkuji za rady Tomáši Havlíkovi. A na závěr děkuji své rodině za psychickou podporu. Prohlášení Prohlašuji, že jsem tuto diplomovou práci vypracovala samostatně, pouze s použitím citované literatury. V Českých Budějovicích dne 5.1.2007... Martina Lokvencová

Obsah 1 Úvod... 5 2 Metodika... 8 2.1 Pokus na louce... 8 2.1.1 Popis lokality... 8 2.1.2 Uspořádání pokusu na louce... 9 2.2 Skeníkový pokus... 10 2.2.1 Uspořádání skleníkového pokusu... 10 2.3 Zpracování odebraných semenáčků z louky i ze skleníku... 11 2.3.1 Postup barvení (Vierheilig et al., 2005).... 11 2.3.2 Vyhodnocování intenzity mykorhizní infekce... 12 2.3.3 Charakteristika semenáčků... 13 2.4 Extrakce spor z půdy... 13 2.4.1 Výpočet morfologické diverzity vzorku spor... 14 2.5 Chemická analýza půdy... 14 2.5.1 Stanovení dusičnanového a amonného dusíku... 14 2.5.2 Stanovení ph půdy... 14 2.5.3 Stanovení reaktivního fosforu... 14 2.5.4 Stanovení celkového dusíku a uhlíku na C/N poměr... 16 2.6 Charakteristika druhu... 16 2.7 Statistické zpracování dat... 16 3 Výsledky... 19 3.1 Vegetace kolem semenáčků... 19 3.2 Růst semenáčků Plantago lanceolata... 21 3.3 Výsledky chemických analýz... 25 3.4 Mykorhizní infekce semenáčků v půdě z dolní a horní části louky... 27

3.5 Mykorhizní infekce semenáčků na louce a ve skleníku... 28 3.6 Mykorhizní infekce semenáčků na jaře a na podzim... 29 3.7 Diverzita spor na jaře... 33 4 Diskuze... 35 4.1 Metoda určování mykorhizní intenzity... 35 4.2 Rozdíly mezi dolní a horní částí louky... 35 4.3 Rozdíl mezi loukou a skleníkem... 37 4.4 Vliv okolního společenstva... 39 4.5 Spory v obou částech louky... 40 5 Závěr... 41 6 Literatura... 42 7 Přílohy... 47

1 Úvod Dospělý jitrocel kopinatý (Plantago lanceolata) v lučním porostu najdeme celkem běžně. Než však taková rostlina jitrocele vyroste, musí k tomu napomoci několik faktorů. Podle Grubba (1977) bývá každá vzniklá mezera v rostlinném společenstvu rychle využita, obvykle semenáčky. Ty zde vyklíčí za vhodných podmínek ze semen, která jsou rozptylována, nebo z těch, která jsou v semenné bance v půdě (Begon et al., 1997). Mezi klíčové podmínky patří teplota, vlhkost nebo délka dne. Při uchycení semenáčků hrají také významnou roli vlastnosti půdy. Záleží na dostupnosti živin, na mikrobiální složce a také na přítomnosti mykorhizních arbuskulárních hub v půdě. Arbuskulární mykorhizní houby (dále pod zkratkou AMF) tvoří charakteristickou symbiózu s kořeny cévnatých rostlin. AMF se vyznačují tím, že jejich hyfy pronikají do vnitřního prostoru buněk hostitelské rostliny. Tam vytvářejí v mezibuněčných prostorách útvary zvané vesikuly, a v apoplastu buňky hostitele vytvářejí dichotomicky větvené útvary arbuskuly. Předpokládá se, že se tato symbióza vyskytuje až u 95 % druhů cévnatých rostlin (Trappe, 1987, sec. Gryndler et al., 2004). Je tedy nejrozšířenějším a také vývojově nejstarším typem mykorhizní symbiózy (viz např. Brundrett, 2002). AMF hrály klíčovou roli v přechodu rostlin na souš, protože tyto rostliny měly jen primitivní kořenový systém a houby jim pomáhaly dobýt potřebné minerální látky k životu. I v dnešní době AMF přispívají rostlinám hlavně příjmem fosforu, ale i dusíku, draslíku a zinku (Smith a Read, 1997). Mimokořenové hyfy jsou tenčí než kořen, a proto se mohou lépe dostat do půdních kapilár ke zdrojům, ke kterým by se kořen těžko dostával. Rostlina tak využívá externí mycelium k přísunu živin. Při infekci kořene mykorhizní houbou dochází v hostitelské rostlině k fyziologickým a biochemickým reakcím, které chrání kořen před ostatními patogenními houbami (Newsham et al., 1995b, sec. Hart a Kliromonos, 2002). Rostlina zase dodává AMF potřebný uhlík fixovaný v organických sloučeninách, bez kterého by houba nemohla existovat. Odhaduje se, že rostlina odevzdává houbě až 20% fixovaného uhlíku (Jakobson et al., 2002). Tento výdaj může rostlinu vyčerpávat nebo se může kompenzovat větším přísunem fosforu a jeho kladným vlivem na růst. Proto se symbiotický vztah mezi AMF a rostlinou pohybuje mezi vztahem mutualistickým a parazitickým (Johnson et al., 1997). Vliv jednoho druhu AMF na růst rostlin velmi závisí na genotypu samotné hostitelské rostliny (Klironomos, 2003) a přínos různých druhů AMF se může lišit i pro stejný hostitelský genotyp (Cavagnaro et al., 2005). 5

Van der Heijden (2004) zjistil, že odezva na stejný taxon AMF se liší i v tom, jestli je rostlina ještě semenáček nebo už v dospělém stádiu. Pro některé z fakultativních i obligátních mykotrofních rostlin jsou AMF důležité právě v začátcích jejich života. Mykorhizní symbióza podpořila růst i přežití semenáčků většiny zkoumaných tropických druhů (Janos, 1980) a také v lučním porostu mírného pásma AMF ovlivňuje uchycování a následný růst rostlin (van der Heijden, 2004). Po vyklíčení se semenáček rychle včlení do myceliální sítě, která je udržována okolní vegetací. Většina druhů AMF dokáže kolonizovat většinu potenciálně mykorhizních druhů rostlin a také jednotlivé rostliny hostí několik různých druhů AMF najednou (Gollotte et al., 2004), takže myceliální síť se vyskytuje skoro v celém společenstvu. Je nepravděpodobné, že by kořeny malých semenáčků byly schopny efektivně soutěžit s dospělými rostlinami o živiny bez podpory hyfálního spojení (van der Heijden, 2004). Některé hypotézy předpokládaly, že myceliální síť by mohla sloužit jako potrubí pro přenos živin mezi dospělou rostlinou a jejím semenáčkem, to se však zatím nikdy nepotvrdilo (Eissenstat a Newman, 1990). S největší pravděpodobností arbuskulární mycelium zvětšuje schopnost kořene přijímat živiny (Smith a Read, 1997) a tím zvýší schopnost mladé rostlinky přežít v konkurenci okolních rostlin. Pokusy ukázaly, že velká diverzita AMF podporuje i velkou diverzitu rostlinného společenstva (van der Heijden, 2004) a i naopak velká diversita druhů rostlin většinou podporuje větší diversitu AMF (Johnson et al., 2003). AMF ovlivňují složení rostlinného společenstva, avšak ne tím, že by pokaždé stimulovaly růst mykorhizní rostliny. Jsou to přirozené paraziticko-mutualistické interakce mezi rostlinou a AMF a velká druhově-specifická mykorhizní citlivost jednotlivých rostlinných druhů, které mohou být hlavními faktory udržujícími složení vegetace (Klironomos, 2003). Během roku se mění intensita kolonizace kořene arbuskulárními houbami (např. Sanders a Fitter, 1992; Ruotsalainen et al., 2002; Šmilauer, 2001). Některé taxony AMF se častěji objevují v kořenech na jaře, jiné v létě či na podzim. Intezita mykorhizní infekce v kořeni kolísá i podle životního cyklu rostliny (kvetení, dozrávání plodů). Také jednotlivé kolonie AMF prochází určitým vývojovým cyklem. Houbové útvary, jako jsou arbuskuly, se objevují většinou v počátečním stádiu vývoje mykorhizní kolonie nebo ve fázi aktivního růstu kořene (Jakobsen et al., 2002). Arbuskuly slouží k výměně látek mezi rostlinou a houbou. Houba v nich předává rostlině fosfor a rostlina houbě cukry. Proto jsou arbuskuly tak důležité v počátečních stádiích mykorhizní infekce. Naopak vesikuly 6

sloužící houbě k ukládání zásob se vytvářejí v pozdějších stadiích vývoje (Jakobsen et al., 2002). Ve své práci jsem se zabývala počátečním průběhem mykorhizní infekce u semenáčků Plantago lanceolata. Pokus probíhal v přirozených podmínkách na obhospodařované louce a zároveň v umělém prostředí ve skleníku, a to ve dvou obdobích roku, kdy jitrocel v přirozených podmínkách nejčastěji klíčí, na jaře a na podzim. Kladla jsem si následující otázky: 1. Liší se vývoj mykorhizní infekce semenáčků jitrocele na jaře a na podzim? 2. Probíhá vývoj mykorhizní infekce stejně ve dvou částech louky lišících se složením vegetace, pravděpodobně pod vlivem rozdílné živinové bohatosti půdy? 3. Liší se vývoj mykorhizní infekce v terénu a ve skleníku? 4. Jaký je vztah mezi zjištěnou intenzitou mykorhizní infekce a množstvím spor AMF v půdě? 7

2 Metodika 2.1 Pokus na louce 2.1.1 Popis lokality Terénní pokus byl uskutečněn na louce blízko obce Zvíkov (10 km východně od Českých Budějovic, 48º 59 s.š, 14º 36 v.d.). Tato louka je dlouhodobě tradičně obhospodařovaná (jednou ročně kosena). Louka se mírně svažuje, z horní strany navazuje na pole a dolní část hraničí s potokem, z jedné strany hraničí s lesem, na druhé straně ji od sousední louky odděluje několik vzrostlých stromů. Splachy živin z pole mohou způsobovat rozdílnou živinovou bohatost v různých částech louky (Haraštová, 1999). 2.1.1.1 Charakteristika vegetace Vegetace na louce podle Zürich-Montpellierské klasifikace zahrnuje typy společenstva od vlhké mesotrofní louky ze svazu Alopecurion pratensis PASSARGE, přes mesotrofní sečenou louku ze svazu Arrhenatherion KOCH, až po oligotrofní pastvinu ze svazu Violion caninae SCHWICKERATH (Moravec et al., 1995; sec. Šmilauer a Šmilauerová, 2000). 2.1.1.2 Klimatické podmínky Průměrná klimatická data pro rok 2005, stanice České Budějovice, pocházejí z Hydrometerologického ústavu v Českých Budějovicích. Roční úhrn srážek byl 798,3 mm, roční průměrná teplota vzduchu byla 8,8ºC. Průměrné teploty vzduchu a úhrn srážek v měsících, ve kterých pokus probíhal, jsou uvedeny v tabulce 1. Botanická nomenklatura je sjednocena podle Kubáta et al. (2002). průměrná teplota vzduchu úhrn srážek duben 9,9ºC září 14,8ºC duben 65,3 mm září 98,3 mm květen 14,4ºC říjen 9,7ºC květen 64,7 mm říjen 8,4 mm červen 17,7ºC listopad 2,9ºC červen 68,3 mm listopad 35,6 mm červenec 19ºC červenec 162,3 mm Tabulka 1 Průměrné hodnoty teploty vzduchu a úhrnu srážek pro České Budějovice v měsících probíhajícího pokusu. 8

2.1.2 Uspořádání pokusu na louce Na louce byl založen pokus v polovině dubna 2005 a opakovaně začátkem září 2005. Nejprve jsem vytyčila dva bloky obdélníkového tvaru (0,5 m* 5 m). Jeden blok jsem založila v dolní části louky, druhý v horní části svahu pod polem. Do každého bloku bylo rozvrženo střídavě 5 ploch o velikosti 50*50 cm 2 na jarní pokus a 5 ploch o stejné velikosti na podzimní pokus (obr.1a). Měla jsem tedy na jaře i na podzim vždy 10 ploch. Do každé z nich jsem zasadila 10 semenáčků Plantago lanceolata. Tyto semenáčky byly zhruba týden staré a vyklíčily na Petriho misce se sterilizovaným pískem umístěné v klimaboxu. Vysazovala jsem tímto způsobem: nejprve jsem vyměřila plochu 50*50 cm 2 pomocí dřevěného čtverce. V její středové části bylo dráty vymezeno 2*5 buněk o velikosti 10*10 cm 2 (obr.1b). Doprostřed každé buňky jsem zasadila jeden semenáček. Každý semenáček byl označen tak, že byl vsazen doprostřed kroužku volného gumového těsnění a byla u něj zapíchnuta špejle. Rohy obdélníku (20*50 cm 2 ), který ohraničoval všech 10 semenáčků, byly vyznačeny zatlučenými kovovými zátkami. Z okrajových pásů vegetace na každé ploše 50*50 cm 2 bylo odebráno kovovou sondou o průměru 4,5 cm 10 vzorků půdy pro skleníkový pokus a pro extrakci spor z půdy (viz 2.2.Skleníkový pokus a 2.4.Extrakce spor z půdy). Odebírala se hlína do hloubky 10 cm. Díry po vrtech byly zasypány hlínou z místních krtin. (b) (a) Obrázek 1 (a) Schéma uspořádání ploch v jednom bloku, bílé čtverce- plochy pro jarní pokus, černé čtverce-plochy pro podzimní pokus (b) plocha s buňkami k výsadbě semenáčků. 9

Na začátku jarního i podzimního pokusu jsem zaznamenala složení a pokryvnost vegetace v obdélníku 20*50 cm 2 (viz příloha č.1a, 1b). Po dvou týdnech od založení pokusu jsem náhodně odebrala po jednom semenáčku (včetně celého kořenového systému) z každé plochy a zaznamenala okolní druhy rostlin a jejich četnost kolem něj v kruhu o poloměru 5 cm. Četnost rostlin jsem zaznamenávala stupni r (jedna rostlina), 1 (více rostlin z jednoho druhu) a 2 (velký trs jednoho druhu). Odebraný semenáček jsem si označila číslem plochy, na které vyrůstal. Pro srovnání jsem u každého bloku odebrala jeden vzrostlý (nevysazený) jitrocel. Popsaný odběr semenáčků proběhl ještě 3., 5., 7. a 11. týden po vysazení semenáčků (tabulka 2). Poslední odběr v podzimním pokusu byl až 8. prosince, protože v 11. týdnu ležel na louce sníh. týdny od založení pokusu data jarních odběrů data podzimních odběrů zasazení semenáčků 18.4.2005 9.9.2005 2. týden 3.5.2005 26.9.2005 3. týden 9.5.2005 3.10.2005 5. týden 23.5.2005 17.10.2005 7. týden 6.6.2005 31.10.2005 11. týden 4.7.2005 8.12.2005 Tabulka 2 Data odběrů semenáčků na jaře a na podzim. 2.2 Skeníkový pokus 2.2.1 Uspořádání skleníkového pokusu Z louky jsem odebrala z ploch 1 až 10 půdu, pro každou plochu jsem ji měla uchovanou zvlášť. Z půdy jsem odstranila větší oddenky, půda se rozmělnila, 100 g půdy pro každou plochu se odebralo na extrakci spor a zbytek se smíchal se sterilizovaným pískem v poměru 1:1. Zemina z každé plochy byla rozdělena do sedmi květináčů o objemu 0,73 litrů, které byly označeny číslem plochy, ze které byla půda odebrána. Z deseti ploch takto vzniklo celkem 70 květináčů. Do květináčů jsem zasadila týden staré semenáčky Plantago lanceolata. Semenáčky vyklíčily na sterilizovaném písku v Petriho miskách v klimaboxu. Květináče s půdou z jedné plochy byly ve skleníku uspořádány do jedné řady. 10

Stůl s květináči byl shora i ze stran obehnán řídkou bílou tkaninou, která jednak semenáčky stínila, a jednak minimalizovala možnost kontaminace sporami mykorhizních hub (přinesených např. ptáky). Semenáčky byly dle potřeby zavlažovány odstátou vodovodní vodou. Při odběru jsem z každé řady náhodně vybrala jeden semenáček. Odebírala jsem pětkrát (2., 3., 5., 7. a 11. týden po založení skleníkového pokusu). Tento pokus probíhal současně s terénním pokusem na jaře i na podzim. 2.3 Zpracování odebraných semenáčků z louky i ze skleníku Kořenové soustavy odebraných rostlin byly opatrně pod vodou očištěny od zeminy. Kořeny a listy byly rozloženy na sklo a jejich obraz nasnímán pomocí scanneru do počítače pro pozdější zjištění listové plochy (v programu Photoshop) a délky kořenů (pomocí programu WinRhizo 2003b, Anonymous 2003). Obraz listů a kořenů dospělých jedinců jsem nezaznamenávala. K obarvení arbuskulární mykorhizy jsem používala barvivo Chlorazol Black E. 2.3.1 Postup barvení (Vierheilig et al., 2005). Kořínky jsem při laboratorní teplotě ponechala 16 hodin v 10% roztoku KOH. Kořenové systémy semenáčků odebraných z louky jsem nechávala vcelku. U skleníkových kořenů, které byly o dost delší a rozvětvenější, jsem nastříhala reprezentativní vzorky kořenových segmentů dlouhých asi 1,5 cm z různých částí kořenového systému. Po 16 hodinách se KOH slil přes nerezové sítko a kořeny uchycené na sítku se promyly pod tekoucí vodou. Na malých Petriho miskách se ponechaly kořeny asi 2 minuty v 1% HCl. Následně se kořínky umístěné ve zkumavkách zalily roztokem barviva Chlorazol Black E (ve směsi 35 ml kyseliny mléčné s 2,5 ml glycerolu a 2,5 ml destilované vody se rozmíchala špetka barviva) a hodinu se udržovaly ve vodní lázni při teplotě 90 C. Po hodině se kořeny přemístily do malých lahviček s odbarvovacím roztokem (35 ml kyseliny mléčné s 2,5 ml glycerolu a 2,5 ml destilované vody) na pročištění a uložily se do ledničky nejméně na dva dny. Obarvené kořeny byly použity na zhotovení polotrvalých preparátů. Kořeny se rozložily na podložním skle v kapce odbarvovacího roztoku a překryly krycím sklíčkem. Obvod krycího sklíčka byl dvakrát přetřen bezbarvým lakem na nehty. 11

2.3.2 Vyhodnocování intenzity mykorhizní infekce Přítomnost arbuskul a vesikul jsem zjišťovala mikroskopováním při zvětšení 200x nebo 400x. Při mikroskopování při 40x zvětšení jsem v každém zorném poli odhadla podíl délky kořene s houbovými útvary (hyfy, arbuskuly, vesikuly) p. Pro celý kořen o délce x zorných polí to bylo P = ( p) /x, a pro všechny kořeny odebrané z jednoho semenáčku a rozložené na jednom podložním skle P sem =( P j *x j )/ x j. Hodnota P sem představuje kteroukoliv ze tří charakteristik studovaných v této práci: intenzitu mykorhizní infekce představující zastoupení hyf, intenzitu arbuskulární infekce (s houbovými koloniemi obsahující arbuskuly) nebo vesikulární intezitu pro podíl délky kořene obsahující houbové kolonie s vesikuly. Navíc jsem také určovala celkovou délku kořenů s mykorhizními útvary (hyfy, arbuskuly) tak, že jsem odhadnutou délku kořenového systému násobila odhadnutou intenzitou mykorhizní (arbuskulární) infekce. Pro semenáčky ze skleníku mohou být hodnoty pro mykorhizní infekci zkreslené, protože jsem nehodnotila celý kořenový systém, ale jen 10 vybraných kousků kořene, které se vešly na jedno podložní sklíčko. Délku úseků kořene s vesikuly jsem u semenáčků neurčovala, protože se vesikuly vyskytují v kořeni ve shlucích, a u skleníkových kořenů by tak mohlo dojít k velké odchylce od skutečných hodnot v celém kořenovém systému. 12

2.3.3 Charakteristika semenáčků Jako charakteristiku relativní investice do nadzemní vs. podzemní biomasy jsem zvolila poměr RLA (Root length Leaf Area). Poměr RLA je podíl délky kořene a plochy listů. Poskytuje vyjádření poměrných velikostí povrchů, které slouží k zachytávání světla a k absorpci živin. Podle poměru RLA můžeme posuzovat, jakou strategii rostlina používá při kompetici (Mortimer, 1992). 2.4 Extrakce spor z půdy Půdu určenou ke zjišťování přítomnosti spor jsem odebrala při zakládaní skleníkového pokusu (viz 2.2.1 Uspořádání skleníkového pokusu). Na podzim 2006 jsem extrahovala spory podle metody Walkera (1991). Nejprve jsem promývala půdní vzorek proudem vody přes soustavu sít. Na nejhrubším sítu o velikosti ok 500 µm zůstaly kořínky a větší kamínky, zatímco spory s půdou a dalšími drobnými částicemi se zachytávaly na spodním sítu o velikosti ok 45 µm. Zachycenou půdu na spodním sítu jsem několikrát promývala proudem vody, dokud nebyla promývací voda čistá. Poté jsem všechen materiál z jemného síta přenesla do centrifugačních zkumavek, které jsem vyvážila destilovanou vodou a centrifugovala 5 minut při 1 800 otáčkách za minutu. Odstranila jsem supernatant. Usazeninu na dně centrifugační zkumavky jsem rozmíchala v roztoku sacharosy (440 g/l) a celou směs jsem opět centrigugovala, dokud centrifuga nedosáhla 1 800 otáček za minutu. V sacharosovém supernantu se nacházejí vyextrahované spory a další částečky z půdy. Proto jsem supernant vylila na síto o velikosti ok 45 µm a důkladně promyla vodou. Se sporami v sachorosovém roztoku jsem se snažila pracovat co nejrychleji, abych zabránila zbytečnému poškození spor vlivem hypertonického prostředí, ve kterém se v dané chvíli vyskytovaly. Zachycené částečky a spory jsem přenesla do Petriho misky s vodou. Pod binokulární lupou jsem při zvětšení 100x vybírala spory pomocí ultrajemné pinzety, třídila je do typů podle morfologické podobnosti, spočítala a pokusila se určit, k jakému vyššímu taxonu patří podle druhové identifikace na internetové adrese http://invam.caf.wvu.edu/fungi/taxonomy/speciesid. Spory představující rozlišné morfologické typy jsem dokumentovala pomocí CCD kamery a v programu Quick Photo (Olympus) jsem provedla jejich měření. 13

2.4.1 Výpočet morfologické diverzity vzorku spor Ze vzorku půdy jsem zjistila počet spor jednotlivých typů a počet spor celkem. Z celkového počtu spor jsem odečetla všechny černé spory. Z těchto údajů jsem určila diverzitu spor Shannonovým indexem diverzity H, ve kterém je Pi podíl počtu spor jednoho typu a celkového počtu mimo černých spor. H = - P i ln P i 2.5 Chemická analýza půdy 2.5.1 Stanovení dusičnanového a amonného dusíku (postup extakce půdy v roztoku KCl převzat z ÚKZÚZ Brno, Zbíral et al., 2004) Půdu z deseti vzorků z bloku v dolní části louky a deseti vzorků z horní části louky jsem přesila přes síto o velikosti ok 1 mm. Z každého vzorku jsem navážila 5 g půdy. Navážku jsem umístila do uzavíratelné plastové lahvičky a přidala k ní 25 ml 1-M roztoku chloridu draselného (KCl). Dvě lahvičky s roztokem KCl jsem ponechala bez půdy pro určení pozadí amonného a dusičnanového iontu. Roztok s půdou se 1 hodinu třepal na třepačce. Poté jsem roztok přefiltrovala přes filtrační papír nejméně dvakrát promytý před filtrací horkou destilovanou vodou. Přefiltrovaný roztok jsem uchovala v sérovkách. Na katedře ekologie a hydrobiologie mně stanovili koncentraci amonných a dusičnanových iontů v roztoku pomocí analyzátoru FIAstar 5012 (Shaw et al., 1988). 2.5.2 Stanovení ph půdy Do uzavíratelné nádobky jsem odvážila 5 g z každého půdního vzorku a přidala jsem 25 ml destilované vody. Za pomoci třepačky se směs intenzivně míchala 5 minut. Po dvou hodinách stání jsem provedla měření na ph-metru. Kalibraci ph-metru jsem prováděla pomocí IEC flavátového pufru o ph 4 a fosfátového pufru o ph 7 (Thomas, 1996). 2.5.3 Stanovení reaktivního fosforu Na katedře Ekologie a hydrobiologie jsem nejprve zkusila stanovení reaktivního fosforu v oxalátovém extraktu. Pro znečištění chemikálií se mi reaktivní fosfor nepodařilo stanovit. Zbylá půda byla proto poslána na stanovení reaktivního fosforu do Botanického ústavu AVČR, Průhonice. 14

Metoda stanovení reaktivního fosforu v oxalátovém extraktu (Houba, 1989) Nejprve jsem připravila extrakční činidla a standardy. Příprava činidel: Reakční činidlo: rozpustit 16,1 g (COONH 4 ) 2. H 2 O a 10,9 g (COOH) 2. H 2 O a doplnit vodou do 1000 ml. Činidlo A: rozpustit 2,4 g (NH 4 )Mo 7 O 24. 4 H 2 O a 0,058 KSbO. C 4 H 4 O 6. Přidat 28 ml koncentrované kyseliny sírové a doplnit vodou do 400 ml. Činidlo B: Ve 100 ml činidla A jsem rozpustila 0.53 g kyseliny askorbové. Roztok molybdenu diamonného: 2,5 g (NH 4 )Mo 7 O 24. 4 H 2 O jsem rozpustila v destilované vodě a doplnila na 100 ml Příprava standardů: Zásobní roztok: 0,10984 g KH 2 PO 4 rozpustit v destilované vodě a doplnit do 100 ml Pracovní roztok: 4 ml zásobního roztoku jsem doplnila na 100 ml zředěného extrakčního roztoku (1 díl extrakčního činidla a 9 dílů vody). Naměřila jsem 0,5, 2,5, 5, 25, 50 ml pracovního roztoku a doplnila do 50 ml zředěným extrakčním činidlem, čímž jsem vytvořila standardy o koncentracích 0,1, 0,5, 1, 5, 10 mg P/l 2,5 g půdy jsem navážila do 100 ml NTS lahve a přidala 50 ml extrakčního činidla. Vzorky se třepaly 120 minut v temnu. Extrakt jsem přefiltrovala a poté použila pro stanovení. Pro slepé stanovení jsem použila přefiltrované extrakční činidlo. Pro stanovení jsem do zkumavky odměřila 1 ml zředěného extraktu (nebo standardů a blanku) a přidala 2 ml roztoku molybdenanu amonného, 1 ml činidla B a 6 ml destilované vody. Vše jsem promíchala a nechala odstát 30 minut v temnu. Po 30 minutách jsem měřila absorbanci při 660 nm. Koncentraci fosforu se jsem odečetla z kalibrační křivky. V BÚ AVČR Průhonice stanovili koncentraci výměnných fosforečnanů v půdě fotometrickou metodou podle Olsena (Olsen, 1982). 15

2.5.4 Stanovení celkového dusíku a uhlíku na C/N poměr V třecí misce jsem rozetřela suchou půdu o hmotnosti 2 g. Na katedře ekologie a hydrobiologie byl stanoven celkový dusík a celkový uhlík na CN analýzátoru (NC 2100 Soil Analyzer). 2.6 Charakteristika druhu Plantago lanceolata L.- jitrocel kopinatý Plantago lanceolata je rostlina, která je hodně mykorhizní, a provádějí se s ní často pokusy na mykorhizní symbiózu (viz např. Sanders a Fitter, 1992; Ayres et al., 2006). Vytrvalé trsnaté byliny s krátkým, často větveným oddenkem a zpravidla s několika přízemními růžicemi. Kořeny tenké, četné, nepřesahující 1 mm v průměru. Listy přízemní růžice vystoupavé až vzpřímené, čepel úzce kopinatá, úzce eliptická až obkopinatá, (2-)5-15(-30) cm dl., 0,5-2,0(-4,5) cm šir., na vrcholu pozvolna špičatá, na bázi znenáhla v řapík zúžená, 3-5(-7) žilná, celokrajná až nepravidelně oddáleně mělce zubatá, olysalá až hustě chlupatá. Stvoly přímé až obloukovitě prohnuté, 3-7(-15) na jedné rostlině, (3-)7-30(-70) cm vysoké. Klasy husté, válcovité, mnohdy až kulovité, (0,5-)1,0-3,0(-5,0) cm dlouhé. Tobolky ± elipsoidní, (2,5-)3,0-4,0 mm dl., (1)2semenné. Ekologie a cenologie: Travnaté porosty, louky, meze, pastviny, výslunné stráně, trávníky v obcích, podél komunikací, lomy, úhory, ruderální stanoviště, písčiny, zahrady, parky, slané půdy, polní plevel apod. Roste nejčastěji ve společenstvech svazů Cynosurion, Polygonion avicularis, Veronico-Taraxacion (diagnostický druh pro uvedené svazy), dále např. ve svazích Plantagini-Festucion ovinae, Arrhenatherion, Bromion erecti. (Slavík et al., 2000) 2.7 Statistické zpracování dat Data o intenzitě mykorhizní infekce (nabývající hodnot od 0 do 1) jsem pro přiblížení Gausově distribuci transformovala arcsinovou transformací P sem =arsin( P sem ) (Lepš,1996). Pro hodnoty délky úseků infikovaného kořene jsem použila logaritmickou transformaci, tak aby se přiblížily normálnímu rozložení dat a zlepšila se homogenita variance. 16

Při statistickém zpracování jsem odhadovanou stupnici užitou pro popis okolní vegetace převedla tak, že stupeň r byl změněn na hodnotu 0,5. Druhy, které se vyskytly ve všech popisech okolí semenáčků méně než třikrát, jsem ze statistického hodnocení vyloučila. Výsledky byly zpracovány v programech Statistica 7 a Canoco for Windows 4.5. V programu Statistika 7 jsem použila metodu analýzy variance (faktoriální ANOVA). Vyhodnocovala jsem vliv čtyř faktorů (místo provedení pokusu: louka nebo skleník; pozice, ve které byly semenáčky vysazeny nebo ze které pocházela hlína pro skleníkový pokus: dolní a horní část louky; období roku: jaro nebo podzim, a stáří: počet týdnů od zahájení pokusu) a také vzájemné interakce jejich vlivu na intenzitu mykorhizní infekce v kořenech semenáčků (vyjádřenou jako celkovou, arbuskulární nebo vesikulární), na délku infikovaného kořene a na poměr RLA (délka kořene[cm]/plocha listu [mm 2 ]). Cílem prováděných chemických analýz půdy bylo zjistit, zda je koncentrace živin na louce ovlivněna pozicí (horní vs. dolní část) a ročním obdobím (jaro vs. podzim). Výsledky testů byly posuzovány na 5% hladině významnosti. Chybové úsečky v grafech ukazují 95% konfindenční interval. Pomocí programu Canoco for Windows (ter Braak a Šmilauer 2002) jsem zjišťovala korelaci pozice, stáří semenáčků (kodované jako dummy variables) a intenzity mykorhizní infekce semenáčků se složením rostlinného společenstva v jejich okolí. Metodou DCA (Dentrended Correspondence Analysis) jsem nejprve sumarizovala variabilitu v druhovém složení a pak jsem do ordinačního diagramu promítnula vliv jednotlivých faktorů. Vzhledem k délce gradientu a heterogenitě dat jsem následně použila unimodální metodu CCA (Canonical Correspondence Analysis). Pro test vlivu polohy na louce na složení společenstva kolem semenáčků, ve kterém byla doba odběru (jednotlivé jarní a podzimní týdny odběru) použita jako kovariáta, jsem použila permutační test Monte Carlo pro 1. kanonickou osu s neomezenými permutacemi. Změnu ve složení vegetace kolem semenáčků během sezóny jsem testovala permutačním testem Monte Carlo pro všechny kanonické osy. V této analýze byla pozice na louce použita jako kovariáta, dummy proměnné pro jednotlivé týdny jako vysvětlující proměnné. V testu, ve kterém jsem studovala korelaci mezi složením společenstva kolem semenáčků a velikostí mykorhizní intenzity u semenáčků, byly intenzita mykorhizní infekce 17

a stáří semenáčků v této analýze použity jako vysvětlující proměnné a složení okolního společenstva jako vysvětlované proměnné, ačkoliv směr příčiny a následku by byl opačný (tj. složení společenstva může ovlivňovat intenzitu mykorhizní infekce). Tuto záměnu je třeba brát v úvahu při hodnocení výsledků. Údaje o týdnech odběru byly v analýze použity jako kovariáty, abych odstranila vliv času na velikost mykorhizní intenzity. Korelace mezi intenzitou infekce a složením okolního společenstva byla testována pomocí Monte Carlo permutačního testu (s použitím typu permutace založeného na modelu, ter Braak a Šmilauer 2002). 18

3 Výsledky 3.1 Vegetace kolem semenáčků Z výsledků DCA (obr.2) vyplývá, že složení společenstva může být ovlivněno polohou bloků (v dolní a horní části louky). V jednotlivých odběrových týdnech se však složení vegetace kolem odebíraných semenáčků výrazně neměnilo. To potvrzují i výsledky z metod CCA. Obrázek 2 Ordinační diagram DCA. První dvě osy vysvětlují 17,8 % variability v datech. Trojúhelníky představují jednotlivé jarní a podzimní týdny. Zkratky druhů jsou uvedeny v příloze 2. Test vlivu polohy na louce na složení společenstva, ve kterém byly v CCA jednotlivé týdny odběru použity jako kovariáty, vyšel průkazně (p=0,001). Kanonická osa vysvětluje 7,1 % variability v datech druhů. V dolní části louky převažují dvouděložné rostliny (Rumex acetosa, Plantago lanceolata, Pimpinella saxifraga) a v horní části se vyskytují více traviny (širokolisté trávy, Elytrigia repens, Carex spp. - zejména Carex hirta) (obr.3). 19

Obrázek 3 Ordinační diagram CCA. Ukazuje složení vegetace v dolní a horní části louky. Zkratky druhů jsou uvedeny v příloze 2. Z analýzy CCA, ve které je pozice na louce použita jako kovariáta a vysvětlujícími proměnnými jsou jednotlivé jarní a podzimní týdny, vyplývá, že se složení vegetace kolem odebíraných semenáčků v jednotlivých týdnech neměnilo výrazně (p=0,058). Všechny kanonické osy dohromady vysvětlovaly 10,64 % variability dat. Lze předpokládat, že semenáčky obklopené vysoce mykorhizními rostlinami, budou mít samy větší procento mykorhizní infekce v kořenech, než semenáčky obklopené rostlinami, o kterých je známo, že mají nízkou nebo žádnou symbiózu s arbuskulárními houbami. Proto mě zajímalo, dá-li se korelovat složení společenstva s nějakou proměnnou popisující intenzitu mykorhizní infekce. V analýze metodou CCA, s užitím postupného výběru (stepwise selection) používající Monte Carlo permutační test, vždy s 499 permutacemi a α= 0,05, se ukázalo, že procentické zastoupení arbuskul (intenzita arbuskulární infekce) a délka úseků kořenů s arbuskuly jsou se složením společenstva korelovány nejvíce (obr. 4). 20

Obrázek 4 Ordinační diagram CCA. Složení společenstva nejvíce korelovalo s intenzitou arbuskulární infekce (AMinfArb) a s délkou úseků kořenů s arbuskuly (DelArb) u zkoumaných semenáčků. 3.2 Růst semenáčků Plantago lanceolata Podmínky pro růst semenáčků na louce a ve skleníku byly zcela jiné. Na louce semenáčky čelily nižším teplotám, větším teplotním výkyvům, kompetici okolních rostlin a herbivorům. Ve skleníku byly bez kompetice a v relativně stálých podmínkách. Proto na louce ke konci pokusu vytvořily nanejvýš dva malé pravé listy a jejich průměrná délka kořenů u posledního odběru na jaře byla 13,24 cm, na podzim 10,67 cm. Ve skleníku ke konci pokusu tvořily listy semenáčků růžici a na jaře už i některé rostliny začínaly kvést. Průměrná délka kořenů semenáčků při posledním odběru ve skleníku na jaře byla 1446,58 cm a na podzim 165,36 cm. Délku kořenů a listovou plochu semenáčků na louce a ve skleníku během jarního a podzimního pokusu ukazují obrázky 5 až 8. 21

18000 SKLENÍK 16000 14000 plocha listů[mm 2 ] 12000 10000 8000 6000 4000 2000 0-2000 týden: 3 2 5 7 dolní pùda 11 týden: 2 3 5 7 horní půda 11 jaro podzim Obrázek 5 Plocha listů jarních a podzimních semenáčků pěstovaných ve skleníku v půdě z horní a dolní části louky. 160 LOUKA 140 120 plocha listů [mm 2 ] 100 80 60 40 20 0-20 -40 týden: 3 2 7 5 dolní část 11 týden: 2 3 7 5 horní část 11 jaro podzim Obrázek 6 Plocha listů jarních a podzimních semenáčků v dolní a horní části louky. 22

2500 SKLENÍK 2000 délka kořenů [cm] 1500 1000 500 0-500 týden: 2 3 7 5 dolní pùda 11 týden: 2 3 7 5 horní půda 11 jaro podzim Obrázek 7 Délka kořenů jarních a podzimních semenáčků pěstovaných ve skleníku v půdě z horní a dolní části louky. 22 LOUKA 20 18 16 délka kořenů [cm] 14 12 10 8 6 4 2 0-2 týden: 2 3 5 dolní část 7 11 týden: 2 3 5 7 horní část 11 jaro podzim Obrázek 8 Délka kořenů jarních a podzimních semenáčků v dolní a horní části louky. 23

U poměru RLA, který vyjadřuje podíl délky kořene a plochy listů, nebyl rozdíl mezi loukou a skleníkem průkazný (F 1,163 = 0,05, n.s.). Celkový rozdíl poměru RLA (skleníkové a luční hodnoty semenáčků dohromady mezi dolní a horní částí louky byl průkazný (F 1,163 = 13,85, p <0,001). V dolní části louky měly semenáčky hodnotu RLA větší než v horní části louky, a to i v odebrané půdě ve skleníku (obr. 9). 0,36 0,34 0,32 0,30 RLA 0,28 0,26 0,24 0,22 0,20 0,18 dolní část pozice horní část LOUKA SKLENÍK Obrázek 9 Poměr RLA u skleníkových a lučních semenáčků pěstovaných v půdě z horní nebo dolní části louky. Interakce pozice (dolní nebo horní část louky) *umístění (louka vs. skleník) (F 1,163 = 0,02, n.s.) Obrázek 10 ukazuje průměrný poměr RLA jarních a podzimních semenáčků na louce a ve skleníku. RLA 0,36 0,34 0,32 0,30 0,28 0,26 0,24 0,22 0,20 0,18 jaro obdobi podzim LOUKA SKLENÍK Obrázek 10 Poměr RLA jarních a podzimních semenáčků pěstovaných na louce nebo ve skleníku. Interakce období (jaro vs podzim)*umístění (louka nebo skleník) (F 1,163 = 5,33, p=0,022). 24

Při pohledu na časový průběh vývoje poměru RLA vidíme (obr. 11), že u semenáčků pěstovaných ve skleníku byl tento poměr na jaře v počátečních týdnech vyšší než na podzim (průměrně 0,45) a postupem času klesal pod úroveň zaznamenanou u stejně starých semenáčků na podzim (až po průměrnou hodnotu 0,15). Na podzim se průměrná hodnota poměru RLA pohybovala mezi hodnotami 0,2 a 0,3. Poměr RLA u semenáčků rostoucích na louce byl podobný na jaře i na podzim v jednotlivých týdnech. 0,6 0,5 0,4 RLA 0,3 0,2 0,1 0,0 týden: 3 2 5 LOUKA 7 11 týden: 2 3 5 SKLENÍK 7 11 jaro podzim Obrázek 11 Změny poměru RLA semenáčků na jaře a na podzim v odběrových týdnech na louce a ve skleníku. Vliv interakce faktorů období*týden pro luční semenáčky F 4,79 = 1,44 (n.s.), pro semenáčky ze skleníku F 4,80 = 12,03 (p<0,001). 3.3 Výsledky chemických analýz Pro porovnání živinové bohatosti půdy z horní a dolní části jsem na jaře i na podzim zjišťovala koncentraci reaktivního fosforu, amonných a dusičnanových iontů, C/N poměr a ph půdy. C/N poměr a koncentrace dusičnanových iontů se mezi dolní a horní částí nelišily a jejich hodnoty se průkazně nelišily ani mezi jarem a podzimem (tabulka 3). Průměrná koncentrace dusičnanů na louce je 0,04 mg na 100 g suché půdy a průměrná hodnota C/N 25

+ poměru na louce byla 11,57. Test mnohonásobných porovnání ukázal, že koncentrace NH 4 v horní části louky se průkazně lišila na jaře a na podzim (F 1,8 = 8,53, p = 0,019; viz obr.12). Obrázek 13 ukazuje, že koncentrace reaktivního fosforu se měnila mezi oběma obdobími v obou částech louky protichůdně, v horní části byla vyšší na podzim, v dolní na jaře. ph půdy se průkazně lišilo mezi dolní a horní částí louky (tabulka 3). V dolní části louky bylo průměrné ph 6,23 a v horní části 5,87. pozice období pozice*období - NO F = 0,80, n.s. F = 0,08, n.s. 3 F = 0,13, n.s. + NH4 F = 1,03, n.s. F = 3,98, n.s. F = 6,80, p = 0,019 reaktivní P F = 3,44, n.s. F = 0,04, n.s. F = 27,53, p < 0,001 C/N F = 2,84, n.s F = 0,08, n.s. F = 0,23, n.s. ph F = 7,91, p = 0,012 F = 0,03, n.s. F = 1,11, n.s. Tabulka 3 Porovnávání hodnot živin v půdě: pozice - mezi půdou z dolní a horní částí louky, období - mezi půdou odebranou na jaře a na podzim, pozice*období - interakce pozice a období. Pro všechny testy jsou odpovídající stupně volnosti pro F statistiku rovny (1,16). 1,6 1,4 1,2 NH4mg/100gsus 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 jaro období podzim dolní část louky horní část louky + Obrázek 12 Koncentrace NH v mg na 100 g suché půdy z dolní a horní části louky na jaře a 4 26

na podzim. 1,6 1,4 1,2 Pmg/100gsus 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 jaro období podzim dolní část louky horní část louky Obrázek 13 Koncentrace reaktivního fosforu v mg na 100g suché půdy z dolní a horní části louky na jaře a na podzim. 3.4 Mykorhizní infekce semenáčků v půdě z dolní a horní části louky U semenáčků rostoucích (na louce i ve skleníku) v půdě dolní nebo horní části louky se intenzita celkové mykorhizní infekce průkazně nelišila, zatímco intenzity arbuskulární a vesikulární infekce se lišily (tabulka 4). Intenzita arbuskulární infekce je vyšší v půdě z horní části, naopak intenzita vesikulární infekce je vyšší v půdě z dolní části (obr.14 a obr.15). Tento trend je patrný jak u skleníkového, tak i u terénního pokusu. F 1,163 p intenzita celkové mykorhizní infekce F=2,14 n.s. intenzita arbuskulární infekce F=5,49 0,020 intenzita vesikulární infekce F=24,16 <0,001 délka úseků kořene s mykorhizou F=0,60 n.s. délka úseků kořene s arbuskuly F=0,82 n.s. Tabuka 4 Porovnání mykorhizní infekce v půdě z dolní a horní části louky 27

0,76 0,74 intenzita arbuskulární infekce 0,72 0,70 0,68 0,66 0,64 0,62 0,60 0,58 0,56 dolní část horní část pozice Obrázek 14 Intenzita arbuskulární infekce v kořenech pozorovaných semenáčků v půdě z dolní a horní části louky 0,34 0,32 0,30 intenzita vesikulární infekce 0,28 0,26 0,24 0,22 0,20 0,18 0,16 0,14 0,12 0,10 dolní část pozice horní část Obrázek 15 Intenzita vesikulární infekce v kořenech pozorovaných semenáčků v půdě z horní a dolní části louky. 3.5 Mykorhizní infekce semenáčků na louce a ve skleníku Odhadnutá délka úseků kořene obsahujících mykorhizní houby je ve skleníku větší než na louce (F 1,176 = 137,77, p < 0,001; obr.16), avšak intenzita (procento) celkové mykorhizní infekce v kořeni je průkazně větší na louce než ve skleníku (F 1,176 = 26,97, p<0,001;obr.17). 28

1,8 [log] délka úseku kořene s myk. infekcí 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 louka misto skleník Obrázek 16 Porovnání délky úseků kořene s mykorhizní infekcí u semenáčků pěstovaných na louce a ve skleníku 0,90 0,85 intenzita mykorhizní infekce 0,80 0,75 0,70 0,65 0,60 0,55 louka misto skleník Obrázek 17 Porovnání intenzity celkové mykorhizní infekce u semenáčků pěstovaných na louce a ve skleníku. 3.6 Mykorhizní infekce semenáčků na jaře a na podzim Intenzita celkové mykorhizní infekce i intenzita arbuskulární infekce byly průkazně větší na podzim než na jaře ( F 1,176 = 12,74, p = 0,001; F 1,163 = 13,8, p<0,001), zatímco intenzita vesikulární infekce se mezi jarem a podzimem průkazně nelišila (F 1,176 = 0,47, n.s.). Časový průběh mykorhizní infekce pozorovaný na louce se mezi oběma obdobími lišil 29

(obr. 18). Na jaře byla infekce první týdny nízká, ale postupně stoupala, až ke konci pokusu byly kořeny více mykorhizní, než na konci pokusu podzimního. Na podzim byla celková mykorhizní infekce hned první týdny třikrát větší než na jaře, avšak v dalších týdnech stoupala již velmi pomalu. Mezi sedmým a jedenáctým týdnem v obou obdobích byla intenzita mykorhizní infekce již ustálená. Ve skleníku probíhal vývoj mykorhizní infekce podobně na jaře i na podzim, jen v prvních podzimních týdnech byla infekce kořenů poněkud vyšší než na jaře. Arbuskulární mykorhizní infekce se vyvíjela velmi podobně jako celková mykorhizní infekce, jenom v případě semenáčků z jarního pokusu na louce rostla až do posledního pozorování. Obrázek 19 ukazuje vesikulární infekci v jednotlivých jarních a podzimních týdnech na louce a ve skleníku. Na jaře byla celkově intezita vesikulární infekce větší než na podzim. 1,2 intenzita celkové myk. infekce 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 týden: 2 3 5 louka 7 11 týden: 2 3 5 skleník 7 11 jaro podzim Obrázek 18 Průběh celkové mykorhizní infekce u jarních a podzimních semenáčků na louce a ve skleníku. Interakce období*týden pro louku: F 4,79 = 7,22, p < 0,001, pro skleník: F 4,80 = 1,54, n.s. 30

0,9 0,8 intenzita vesikulární infekce 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0-0,1-0,2 týden: 2 3 5 louka 7 11 týden: 2 3 5 skleník 7 11 jaro podzim Obrázek 19 Průběh vesikulární infekce u jarních a podzimních semenáčků na louce a ve skleníku. Interakce období*týden pro louku: F4,79 = 5,32, p < 0,001, pro skleník: F 4,80 = 1,97, n.s. 31

Obrázek 20 ukazuje intenzitu celkové mykorhizní infekce pro pokusy ve skleníku i na louce, a také v porovnání s mykorhizní infekcí starších jitrocelů. celková AMF infekce 1,5 1,4 1,3 1,2 1,1 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 2 3 5 7 11 týden podzimst.jitrocele jarost.jitrocel obdobi jaro obdobi podzim Obrázek 20 Mykorhizní infekce zkoumaných semenáčků v odběrových týdnech na jaře a na podzim. Kolečka a obdelníčky ukazují mykorhizní infekci starších jitrocelů, pro porovnání, jakou v té době mohl mít dospělý jitrocel mykorhizní infekci. Vliv interakce týden*období na celkovou intenzitu mykorhizní infekce F 1,176 = 7,61, p < 0,001. 32

3.7 Diverzita spor na jaře Z jarní půdy jsem vyextahovala spory u dvou vzorků z dolní a dvou vzorků z horní části louky. Celkem jsem ve všech čtyřech půdních vzorcích našla 18 typů spor. Černé neživé spory, které mohly představovat jakýkoli typ, jsem počítala zvlášť (tabulka 5). Spory typu G0 patří do podřádu Gigasporineae a ostatní typy do podřádu Glomineae. Typ M jsem pro charakteristický sporokarp určila jako druh Glomus sinuosum. I když počet opakování není dostačující, z dosavadních výsledků vyplývá, že diverzita spor v horní a dolní části je podobná. Zastoupení některých typů spor v částech louky však bylo různé (tabulka 6). Např. typ E3b se vyskytoval jenom v půdě z dolní části a typy G0 a H1 v horní části. vzorek počet spor celkem počet spor bez černých spor Shanonův index diverzity dolní 1109 584 2,173 dolní 1337 519 1,713 horní 1256 641 2,161 horní 835 309 1,856 Tabulka 5 Počet spor (nebo u typu M počet sporokarpů) celkem nebo bez černých spor ve 100 g půdy z horní nebo dolní části louky a diverzita typu spor v jednotlivých vzorcích. 33

dolní část plocha č.1 dolní část plocha č.2 horní část plocha č.1 horní část plocha č.2 Typ M 6 32 18 12 Typ A1 100 0 8 0 Typ A3 8 0 0 0 Typ B1 62 137 126 37 Typ C1 14 0 61 0 Typ C2 46 27 119 105 Typ C3 6 0 8 0 Typ C4 4 1 5 5 Typ D1 150 0 42 5 Typ D2 73 96 132 76 Typ E1 5 1 15 3 Typ E3a 20 0 6 0 Typ E3b 8 0 0 0 Typ F1 7 87 5 0 Typ F2 73 133 77 6 Typ G0 0 2 13 13 Typ H1 0 0 4 37 Typ H2 0 0 0 9 černé spory 525 818 615 526 Tabulka 6 Počet jednotlivých typů spor ve zkoumaných vzorcích z dolní a horní části louky 34

4 Diskuze 4.1 Metoda určování mykorhizní intenzity Přesnost odhadu mykorhizní intenzity pod mikroskopem může být ovlivněna špatnou viditelností hyf a arbubuskul. Tato špatná viditelnost může být způsobena nízkým obarvením arbuskulárních mykorhizních hub nebo špatným projasněním vzorků. Používané barvivo Chlorazol Black E v testu Gangeho et al. (1999) pro mykorhizní infekci Plantago lanceolata nezkreslovalo viditelnost arbuskulární mykorhizní infekce v kořeni o nic víc, než jiná barviva. Se špatnou viditelností (zakaleností) jsem se potýkala u čtyř vzorků z třetího jarního odběru (pátý týden po vysazení) u semenáčků z louky, proto data z těchto vzorků mohou obsahovat zkreslenou informaci a mohou být podhodnocená. U lučních semenáčků jsem barvila a vyhodnocovala vždy celý kořínek, u semenáčků ze skleníku jsem ale kvůli velikosti kořenového systému obarvila a vyhodnotila jen deset náhodně vybraných kořenů. Proto mohou být odhady intenzity mykorhizní infekce u skleníkových semenáčků méně přesné. 4.2 Rozdíly mezi dolní a horní částí louky Výsledky chemických analýz naznačují sezónní proměnlivost v koncentraci živin v různých částech louky, hlavně reaktivního fosforu a amonného iontu. Pro jarní i podzimní analýzu bohatosti živin jsem provedla vždy jeden jednorázový odběr půdy. Na stejné louce byla v květnu 1998 provedena analýza dostupného fosforu, C/N poměru, amonného iontu a dusičnanového iontu (Haraštová, 1999) a byl zjištěn gradient fosforu a vlhkosti. Změna vlhkosti šla rovnoběžně s jednotlivými pokusnými plochami (ze středu louky směrem k lesu), takže by na výsledek neměla mít vliv. Ve výsledcích Haraštové (1999) byla nejnižší koncentrace dostupného fosforu v horní části louky a směrem k dolní části se zvyšovala. V mých analýzách půdy byla na jaře zjištěna větší koncentrace reaktivního fosforu také v dolní části louky. Na podzim se ale situace změnila a větší koncentrace fosforu byla v části horní. Rozvoj mykorhizní infekce souvisí s koncentrací živin v půdě. Intenzita mykorhizní infekce se může snižovat se zvyšující se koncentrací fosforu v půdě (Parádi et al., 2003). Na stejné lokalitě, jakou jsem použila ve své práci, zjistili Šmilauer a Šmilauerová (2000), že se při přidávání fosforu do půdy snižovalo zastoupení arbuskul v mykorhizních kořenech 35

jitrocelů. V mém pokusu se ale nelišily intenzity mykorhizní infekce a arbuskulární infekce způsobem, odpovídajícím rozdílným koncentracím reaktivního fosforu mezi dolní a horní částí louky v jednotlivých obdobích. Hodnoty poměru RLA u semenáčků přesto naznačují, že větší dostupnost živin je v horní části louky, protože semenáčky v této části louky mají nižší hodnoty RLA, a investovaly tedy relativně méně do růstu kořenů ve srovnání s nadzemními částmi (Fitter, 1997). Ke konci jarního pokusu měly semenáčky rostoucí v půdě horní části louky (ve skleníku i na louce) plochu listů i délku kořenů o dost větší než semenáčky rostoucí v půdě dolní části louky a než všechny semenáčky z podzimního pokusu. To může být způsobeno lepší dostupností amonných iontů v horní části louky v období jarního pokusu. Menší plocha listů na podzim může být také vysvětlena značným poškozením listové plochy herbivory. Dolní a horní část louky se lišila stejně v obou obdobích hodnotou ph. Růst některých arbuskulárních hub může být stimulován zvýšením či snížením ph půdy, zatímco na další arbuskulární houby nemusí mít ph vliv (Siqueira et al., 1984; Wang et al., 1993). Intenzita mykorhizní infekce Plantago lanceolata ve vápenaté půdě o ph = 7 byla o dost větší s porovnáním kolonizace mykorhizní houbou v kyselé půdě o ph = 4 (Aarle et al., 2003). Avšak v tomto pokusu kyselá půda obsahovala více reaktivního fosforu, a možná proto nebyl v jejich pokusu druh Plantago lanceolata v kyselé půdě tolik mykorhizní. Na louce u Zvíkova je rozdíl průměrných hodnot ph dole a nahoře jen o půl jednotky, takže ph nebude hrát v mykorhizní infekci tak významnou roli. Větší zastoupení arbuskul v mykorhizách vytvořených v půdě v horní části a vesikul v dolní části louky může být zapříčiněno výskytem zčásti odlišných druhů arbuskulárních hub v obou místech. Podle morfologie spor typ G0, který se nachází hlavně v půdě z horní části louky (tabulka 6), patří do podřádu Gigasporineae, zato ostatní typy patří do podřádu Glomineae. Glomineae mají schopnost vytvářet arbuskuly i vesikuly. Mykorhizní houby z řádu Gigasporineae nevytvářejí vesikuly a vytvářejí na myceliu mimo kořen auxilární buňky, které mají obdobnou strukuru jako vesikuly (Smith a Read, 1997). Menší zastoupení vesikul v horní části odpovídá převládajícímu výskytu typu spor G0 v této části. Protože arbuskuly slouží především k výměně fosforu mezi houbou a rostlinou, není vyloučeno, že výsledek menšího poměru RLA u semenáčků v půdě z horní části louky je 36

ovlivněn snadnějším příjmem živin s pomocí mykorhizních hub, které pomocí většího zastoupení arbuskul více odevzdávají živiny a tím prospívají rostlinám. 4.3 Rozdíl mezi loukou a skleníkem Odlišnost podmínek na louce a ve skleníku se projevila v růstu semenáčků i v průběhu mykorhizní infekce. Semenáčky na louce měly obtížnější podmínky pro růst než semenáčky ukryté ve skleníku. Například luční semenáčky musely čelit větším výkyvům teploty a vlhkosti a nižším teplotám. Semenáčky na louce kompetovaly s okolním společenstvem. Rozdíl mezi skleníkem a loukou byl také v dostupnosti vody ve skleníku byla voda pravidelně doplňována, takže ani při vysokých teplotách v červnu, červenci a na začátku září netrpěly semenáčky jejím nedostatkem, na rozdíl od terénních podmínek. Luční půda odebíraná pro skleníkový pokus obsahovala přetrhané kořínky a další organický materiál. Ten se postupně v květináčích rozkládal a zvyšoval tím množství živin ve skleníkové půdě. Při zakládání skleníkového pokusu se luční půda smíchala s pískem, aby se tento nárůst koncentrace dostupných živin oproti situaci v terénu snížil, ale toto zředění nemuselo být dostačující. Kořenové systémy semenáčků ve skleníku byly rozsáhlejší než kořenové systémy lučních semenáčků. Proto, ačkoliv procentuální zastoupení mykorhizní infekce semenáčků bylo větší na louce než ve skleníku, byla ve skleníku délka kořene obsahujícího mykorhizní houby větší. Menší relativní zastoupení mykorhizní infekce v kořenech semenáčků ve skleníku může být způsobeno už samotným zpracováním půdy odebrané z louky. Při odebírání, homogenizaci a promíchávání půdy s pískem se inokulační částice hub (spóry, mycelium) mohly poškodit a nebyly by pak schopny infikovat kořen semenáčku. Půda ve skleníku byla pravděpodobně živinově bohatší (viz druhý odstavec v této kapitole). Většinou je intenzita mykorhizní infekce v živinově bohaté půdě omezována (viz např. Parádi et al., 2003), protože rostlina "nepotřebuje" mykorhizní houbu k zpřístupnění živin. Menší relativní kolonizace kořenů ve skleníku může být zapříčiněna také jejich rychlým růstem, protože infekce není ovlivněna jen schopností hub inokulovat kořen a dále se v něm rozšiřovat, ale i rychlostí růstu vlastního kořenového systému (Sanders a Sheik, 1983). Průběh začínající mykorhizní infekce má dvě fáze. V období po inokulaci je to fáze prudkého vzestupu mykorhizní infekce, během které je rozšiřování mykorhizní infekce 37

v kořeni rychlejší než růst kořene, po ní následuje ustalující fáze, ve které jsou rozšiřování houby a růst kořene ve vzájemné shodě (Smith a Read, 1997). Fáze postupného šíření mykorhizní infekce a jejího ustálení jsou rozpoznatelné v mých výsledcích ze skleníku i z louky, v obou ročních obdobích. Arbuskulární infekce měla vždy větší zastoupení než vesikulární, vesikuly se začínaly objevovat většinou později. To odpovídá jejich předpokládané funkci - uložení zásob, které si houba za dobu kolonizace mohla nahromadit. Nižší procentickou intenzitu vesikulární infekce ve srovnání s arbuskulární infekcí zaznamenali také Ruotsalainen et al. (2002) u čtyř sledovaných druhů dospělých rostlin. K většímu zastoupení vesikulů (ve srovnání s arbuskuly) došlo v průběhu mykorhizní infekce až ke konci vegetační sezony u nově vytvořeného kořene Ranunculus adoneus (Mullen a Smidt, 1993). Na louce se průběh mykorhizní infekce semenáčků Plantago lanceolata lišil mezi jarem a podzimem. Významné faktory pro intenzitu mykorhizní infekce jsou hustota inokulačních částic, teplota, světlo a dostupnost živin, především fosforu (Smith a Read, 1997). Velký vliv na odlišný průběh mykorhizní infekce na jaře a na podzim měla určitě teplota. Vliv teploty na rychlost a intenzitu mykorhizní infekce je komplikovaný, reakce na ni závisí jak na hostitelské rostlině, tak na druhu arbuskulární houby (Smith a Read, 1997). Zvýšení teploty stimuluje rozvoj a růst arbuskulární mykorhizní symbiózy (Rilling et al., 2002), u většiny pozorovaných arbuskulárních hub rozvoj končil teplotou kolem 30ºC (Smith a Read, 1997). Při pokusu Baona et al. (1994) se ukázalo, že Glomus etunicatum přestává infikovat ječmen při poklesu teploty na 10ºC a začne ho intenzivněji kolonizovat až při teplotě 15ºC. Dá se říci, že na jaře se stoupající teplotou stoupala i mykorhizní infekce. Na podzim se rozvíjela v počátečních týdnech rychle při relativně příznivých teplotách, ale v listopadu už stagnovala. V průběhu mykorhizní infekce na louce na jaře a na podzim se taky odrážejí roční cykly společenstva. Ve většině studií je největší intenzita mykorhizní infekce v období vrcholu vegetační sezony, v časovém intervalu od poloviny jara do konce léta (Sanders a Fitter, 1992, Ruotsalainen et al., 2002). U starších jitrocelů v tomto pokusu je ale největší mykorhizní intenzita na podzim (obr.20). I když hodnoty intenzity mykorhizní infekce dospělých jedinců nemusejí spolehlivě vypovídat o obecné intezitě mykorhizní infekce ve starších jitrocelích, protože vždy byly odebráni jenom dva jedinci při každém odběru, může to naznačovat, že obecně největší kolonizace mykorhizními houbami je právě ke konci vegetační sezony. 38

Celková mykorhizní infekce semenáčků na jaře dosáhla ustalující fáze, ale arbuskuly a vesikuly měly na jaře vzestupnou tendenci po celou dobu pokusu. Na podzim byly kořeny na začátku pokusu kolonizovány rychleji. Asi proto je celková mykorhizní a arbuskulární infekce na podzim větší než na jaře. To může svědčit o větší početnosti inokulačních částic a/nebo jejich větší schopnosti kolonizovat kořen na začátku podzimu. Pokusy s jednoletkami ukázaly, že produkce spor vzrůstá, jakmile rostliny dozrávají na konci růstové sezóny (Giovannetti, 1985; sec.smith a Read). Pokusy na AMF se většinou uskutečňují ve skleníku, protože tam můžeme pozorovat například jen jediný, pro nás známý isolát druhu AMF, a zabránit kontaminaci jinými AMF, které studovat nechceme. Podle výsledků v této práci se hodně studovaných parametrů mykorhizní infekce shodovalo s chováním symbiózy na louce, i přes odlišnosti v růstu semenáčků a dalších podmínek. Na rozdíl od pokusu na louce nebyl ve skleníku zaznamenán velký rozdíl v průběhu mykorhizní infekce mezi jarem a podzimem, protože mykorhizní infekce nebyla tolik ovlivněna venkovními podmínkami. Rozdíl jsem také zaznamenala u celkové mykorhizní infekce, která ve skleníku byla průkazně větší v půdě z horní části louky. V datech z pokusu na louce byl tento trend také vidět, ale nebyl průkazný. 4.4 Vliv okolního společenstva Předpokládala jsem, že semenáčky obklopené vysoce mykorhizními rostlinami budou mít samy větší procento mykorhizní infekce v kořeni, než semenáčky obklopené rostlinami, o kterých je známo, že tvoří nízkou nebo žádnou symbiózu s arbuskulárními houbami, a získané výsledky potvrzují vliv okolního společenstva na intenzitu mykorhizní infekce. Některé druhy rostlin nevytvářejí s arbuskulárními houbami symbiózu, zejména zástupci čeledí Cruciferae, Caryophylaceae, Chenopodiaceae a Polygonaceae (Francis a Read, 1994). Arbuskulární mykorhiza semenáčků se podle ordinačního diagramu CCA (obr. 4) nejvíce rozvíjela v blízkosti rostlin druhů Poa pratensis, Rumex acetosa, Centaurea jacea. Opačný efekt je vidět u semenáčků v blízkosti Clinopodium vulgare, Trisetum flavescens. K přesnější interpretaci těchto výsledků mi ale bohužel chybí znalost rozdílů v intenzitě mykorhizní infekce jednotlivých druhů, jejichž vliv byl v analýze identifikován. 39

4.5 Spory v obou částech louky Hustota a diverzita spor je v různých lokalitách velmi variabilní, na některých lokalitách je největší sezónní maximum 1-5 spor na 1 gram půdy, jinde se najde 9 až 89 spor v 1 gramu půdy (Smith a Read, 1997). Na naší louce jsem v průměru našla 11,4 spor na 1 g půdy, když počítám i odumřelé černé spory, a 5,13 spor na 1 g půdy bez černých spor. Podle morfologických podobností jsem vytřídila spory do 18 typů. Počet spor není vždy odpovídající parametr k určení složení společenstva na lokalitě. Některé houby vytvářejí spor hodně, zatímco jiné málo, například typ zvaný fine endophyte (Thippayarugs et al., 1999), nebo možná spory vůbec nevytvářejí. Jiné je v době odběru ještě nevytvořily, a vytvoří je během roku (Moreira et al., 2006). I přesto rozdělení spor do typů udává důležitou orientační informaci o diverzitě hub ve společenstvu, aniž bychom museli druhy hub vyhodnocovat molekulárními metodami. 40

5 Závěr Celková mykorhizní intenzita v kořenech semenáčků byla na podzim v průměru větší než na jaře. Vlastní průběh mykorhizní infekce byl odlišný na jaře a na podzim jen u semenáčků rostoucích na louce. Na podzim kolonizovaly mykorhizní inokulační části kořen v prvních dvou týdnech s větší intenzitou než na jaře. Poté však mykorhizní infekce stoupala velmi pomalu. Na jaře byla její intenzita v počátečních týdnech nízká, postupně stoupala, a na konci jarního pokusu byla větší než na podzim. Zajímalo mě také, jak se bude lišit mykorhizní infekce ve dvou částech louky (dolní a horní část louky), na kterých je odlišné složení vegetace. V chemických analýzách půdy se mi nepodařilo jednoznačně určit, která z částí louky je bohatší na živiny. Růst semenáčků ale naznačuje lepší dostupnost živin v horní části louky. Ve skleníku byla celková intenzita mykorhizní infekce v půdě z horní části louky větší. Nejspíše kvůli odlišnosti druhů AMF v obou částech, patrné z rozdílného zastoupení typů spor v půdě, byla arbuskulární infekce na louce i ve skleníku větší v horní části, zatímco intenzita vesikulární infekce byla větší v dolní části louky. Diversita typů spor byla v obou částech louky podobná. Moje výsledky také ukázaly vliv složení vegetace v bezprostředním okolí semenáčku na intenzitu jeho mykorhizní infekce. Intenzita mykorhizní infekce byla větší na louce. Protože ale ve skleníku byl kořenový systém rozrostlejší, délka úseků kořenů s mykorhizní infekci byla větší ve skleníku. 41

6 Literatura van Aarle IM, Sőderstrőm B, Olsson PA. 2003. Growth and interaction of arbuscular mycorhizal fungi in soils from limestone and acid rock habitats. Soil Biology & Biochemistry 35: 1557-1564. Ayres RL, Gange AL, Aplin DM..2006. Interactions between arbuscular mycorrhizal fungi and intraspecific composition affect size, and size inequality, of Plantago lanceolata L. Journal of Ekology 94: 285-294. Baon JB, Smith SE, Alston AM. 1994. Phosphorus uptake and growth of barley as affected by soil temperature and mycorrhizal infection. Journal of Plant Nutrition 17: 479-492. Begon M, Harper JL, Townsend CR. 1997. Ekologie: jedinci, populace a společenstva. Olomouc, ČR: vydavatelství Univerzity Palackého. Brundrett MC. 2002. Coevolution of roots and mycorrhizas of land plants. New Phytologist 154: 275-304. Cavagnaro TR, Smith FA, Smith SE, Jakobsen I. 2005. Functional diversity in arbuscular mycorrhizas: exploitation of soil pathes with different phosphate enrichment differs among fungal species. Plant, Cell and Environment 28: 642-650. Eissenstat DM, Newman EI. 1990. Seedling establishment near large plants: effects of vesicular-arbuscular mycorrhizas on the intensity of plant competition. Functional Ecology 4: 95-99. Fitter A. 1997. Nutrient acquisition. In: Crawley MJ,eds. Plant ecology.2nd ed. Oxfort, UK: Blackwell Science, 51-72. Francis R, Read DJ. 1994. The contributions of mycorrhizal fungi to the determination of plant community structure. Plant and Soil 159: 11-25. Gange AC, Bower E, Stagg PG, Aplin DM, Gillam AE, Bracken M. 1999. A comparison of visualization techniques for recording arbuscular mycorrhizal colonization. New Phytologist 142: 123-132. Gollotte A, van Tuinen D, Atkinson D. 2004. Diversity of arbuscular mycorrhizal fungi colonising roots of the grass species Agrostis capillaris and Lolium perenne in a field experiment. Mycorrhiza 14: 111-117. 42

Giovannetti M. 1985. Seasonal variations of vesicular-arbuscular mycorrhizas and endogonaceous spores in a maritime sand dune. Transacations of the British Mycological Society 84: 679-684 non vidi Grubb P. 1977. The maintenance of species richness in plant communities: the importance of the regeneration niche. Biological Reviews 52: 107-145. Gryndler M, Baláž M, Hršelová H, Jansa J, Vosátka M. 2004. Mykorhizní symbióza: o soužití hub s kořeny rostlin. Praha, ČR: Academia. Haraštová M. 1999. Odraz gradientů prostředí ve vegetaci měřítko a prostorové uspořádání. magisterská diplomová práce, Biologická fakulta Jihočeské univerzity v Českých Budějovicích, Česká republika. Hart MM, Kliromonos JN. 2002. Diversity of arbuscular mycorrhizal fungi and ecosystem functioning. In: van der Heijden MGA, Sanders lan R, eds. Mycorrhizal ecology. Berlin, Německo: Springer, 225-239. van der Heijden MGA. 2004. Arbuscular mycorrhizal fungi as support systems for seedling establishment in grassland. Ecology Letters 7: 293-303. Houba VJG. 1989. Soil and plant analysis, part 5- Soils analysis procedures.wageningen, the Nederlands: Wangeningen Agricultural University. Jakobsen I, Smith SE, Smith FA. 2002. Function and diversity of arbuscular mycorrhizae in carbon and mineral nutrition. In: van der Heijden MGA, Sanders lan R, eds. Mycorrhizal ecology. Berlin, Německo: Springer, 75-88. Janos DP. 1980. Vesicular-arbuscular mycorrhizae affect lowland tropical rain forest plant growth. Ecology 61: 151-162. Johnson D, Vandenkoornhuyse PJ, Leake JR, Gilbert L, Booth RE, Grime JP, Young JPW, Read DJ. 2003. Plant communities affect arbuscular mykorrhizal fungal diversity and community composition in grassland microcosms. New Phytologist 161: 503-515. Johnson NC, Graham JH, Smith FA. 1997. Functioning of mycorrhizal associations along the mutualism-parasitism continuum. New Phytologist 135: 575-585. Moravec J. et al. 1995. Rostlinná společenstva České republiky a jejich ohrožení. Ed.2 Severočeskou Přírodou, Příloha 1995 non vidi 43

Moreira M, Baretta D, Tsai SM, Cardoso EJBN. 2006. Spore density and root colonization by arbuscular mycorrhizal fungi in preserved or disturbed Aracaria angustifolia (Bert.) O.Ktze ecosystems. Scientia Agricola (Piracicaba, Braz.) 63: 380-385. Mortimer SR. 1992. Root lenght/ leaf area ratios of chalk grassland perennials and their importance for competitive interactions. Journal of Vegetation Science 3: 665-672. Mullen RB, Schmidt SK. 1993. Mycorrhizal infection, phosphorus uptake, and phenology in Ranunculus adoneus: implication for the functioning of mykorrhizae in alpine systems. Oecologia 94: 229-234. Newsham KK, Fitter AH, Watkinson AR. 1995 b. Arbuscular mycorrhiza protect an annual grass from root pathogenic fungi in the field. Journal of Ecology 83: 991-1000. non vidi Klironomos JN. 2003. Variation in plant response to native and exotic arbuscular mycorrhizal fungi. Ecology 84: 2292-2301. Kubát K, Hrouda L, Chrtek J jun., Kaplan Z, Kirschner J, Štěpánek J.(eds.). 2002. Klíč ke květeně České republiky. Praha, ČR: Academia Lepš J. 1996. Biostatistika. České Budějovice, ČR: Biologická fakulta Jihočeské university v ČB Olsen RS. 1982. Phosphorus. In: Page AL,eds. Methods in soil analysis, part 2, Agronomy series 9. ASA, Madison, Wisconsis 403-430 Parádi I, Bratek Z, Láng F. 2003. Influence of arbuscular mycorrhiza and phosphorus supply on polyamine content, growth and photosynthesis of Plantago lanceolata. Biologia Plantarum 46: 563-569. Rilling MC, Treseder KK, Allen MF. 2002. Global change and mycorrhizal fungi. In: van der Heijden MGA, Sanders lan R, eds. Mycorrhizal ecology. Berlin, Německo: Springer, 135-153. Ruotsalainen AL, Väre H, Vestberg M. 2002. Seasonality of root fungal colonization in low-alpine herbs. Mycorrhiza 12: 29-36. Sanders FE, Sheikh NA. 1983. The development of vesicular-arbuscular mycorrhizal infection in plant root systems. Plant and Soil 71: 223-246. 44

Sanders IR., Fitter AH. 1992. The ecology and functioning of vesikular-arbuscular mycorrhizas in co-existing grassland species. II. Nutrient uptake and growth of vesiculararbuscular mycorrhizal plants in semi-natural grassland. New Phytologist 120: 525-533. Shaw A, Karlsson CH, Moller J. 1988. An introduction to the use of flow injection analysis. Tecator, Sweden. 72pp. Siqueira JO, Hubbell DH, Mahmud AW. 1984. Effect of liming on spore germination, germ tube growth and root colonization by vesicular arbuscular mycorrhizal fungi. Plant and Soil 76: 115-124. Slavík B, eds. 2000. Květena 6 České republiky. Praha, ČR: Academia. Smith SE, Read DJ. 1997. Mycorrhizal symbiosis. Ed 2. London, UK: Academic press. Šmilauer P. 2001. Communities of arbuscular mycorrhizal fungi in grassland: seasonal variability and effects of environment and host plants. Folia Geobotanica 36: 243-263. Šmilauer P, Šmilauerová M. 2000. Effect of AM symbiosis exclusion on grassland community composition. Folia Geobotanica 35: 13-25. Thippayarugs S, Bansal M, Abbott LK. 1999. Morphology and infectivity of fine endophyte in a mediterranean environment. Mycorrhiza 103: 1369-1379. Thomas GW. 1996. ph and soil acidity. In: Bigham JM. Methods of soil analysis, part 3-chemical methods. Madison, Winsconsin American Society of Agronomy, Wisconsin, 475-490 Trappe JM. 1987. Phylogenetic and ecologic aspect of mycotraphy in the angiosperms from an avolutionary standpoint. In: Safir GR., eds. Ecophysiology of VA Mycorrhizal plants. Boca Raton, USA: CRC Press, 5-25 non vidi Vierheilig H, Schweiger P, Brundrett M. 2005. An overview of methods for the detection and observation of arbuscular mycorrhizal fungi in roots. Physiologia Plantarum 125: 393-404. 45

Walker C. 1999. Method sheets given out at a workshop presented by Morton JB (IVAM), Koske RE and Gemma JN (University of Rhode Island) and Walker C (BEG) at the 3rd European conference on mycorrhizal fungi 1991. Agricultural Science in Finland. In: Techniques in arbuscular mycorrhizal research: laboratory manual. The University of York. Wang GM, Stribley DP, Tinker PB, Walker C. 1993. Effects of ph on arbuscular mykorrhiza Ι. Field observation on the long term liming experiments at Rothamsted and Woburn. New Phytologist 124: 465-472. Zbíral J, Honsa I, Malý S, Čížmár D. 2004. Jednotné pracovní postupy Analýza půd III. Brno, ČR: Ústřední kontrolní a zkušební ústav zemědělský Brno. 46

7 Přílohy 47

plocha 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 celková pokryvnost (%) 50 60 65 70 50 80 50 60 80 75 Siroliste, nechlupate travy 11 8 6 10 5 7 2 35 65 65 Avenula pubescens 2 15 1 2 2 Carex sp. 1 2 0,5 2 3 2 0,5 Deschampsia cespitosa 16 Dactylis glomerata 15 Elytrigia repens 0,5 6 3 Festuca rubra 0,5 0,5 1 Holcus lanatus 1 15 4 2 1 Luzula campestris 10 5 15 10 6 Poa pratensis 0,5 3 6 6 1 3 2 13 3 5 ssp.angustifolia Trisetum flavescens 4 0,5 3 10 2 Achillea millefolium 2 6 6 1 3 10 Alchemilla vulgaris agg. 8 12 18 2 12 1 Betonica officinalis 5 7 Campanula patula 1 0,5 1 Cardamine pratensis 1 Carum carvi 3 Centaurea jacea 3 3 Cerastium holosteoides ssp. triviale 1 2 1 0,5 Cirsium arvense 1 1 Clinopodium vulgare 25 Galium boreale 1 0,5 2 5 2 8 2 Lathyrus pratensis 1 Pimpinella saxifraga 0,5 Plantago lanceolata 2 2 0,5 Ranunculus acris 0,5 Ranunculus bulbosus 1 Rumex acetosa 2 1 1 0,5 0,5 2 0,5 2 1 0,5 Sanguisorba officinalis 1 1 0,5 1 0,5 1 Scorzonera humilis 2 8 Veronica chamaedrys 0,5 0,5 1 6 Vicia cracca 1 0,5 2 2 1 0,5 Příloha 1a Záznamy složeni vegetace na experimentálních plochách na začátku jarního pokusu Plochy 1 až 5 patří do dolní části louky, plochy 6 až 10 do horní části louky. Širokolisté, nechlupaté trávy zahrnují druhy Alopecurus pratensis, Agrostis capillaris, Arrhenatherum elatius. 48

plocha 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 celková pokryvnost (%) 60 50 50 50 70 85 80 50 45 50 Siroliste, nechlupate travy 2 0,5 10 15 10 20 20 25 35 30 Avenula pubescens 0,5 15 10 Carex sp. 0,5 8 1 5 10 13 Deschampsia cespitosa Dactylis glomerata 3 2 Festuca pratensis 4 Festuca rubra 1 32 2 6 15 11 Holcus lanatus 6 6 8 10 10 20 15 22 Luzula campestris 0,5 4 5 Poa pratensis ssp.angustifolia 4 1 7 1 4 5 5 8 8 3 Trisetum flavescens Elytrigia repens 1 Achillea millefolium 1 1 1 3 Alchemilla vulgaris agg. 15 3 5 3 15 1 Betonica officinalis 1 8 Campanula patula 1,5 1 1 Cardamine pratensis Carum carvi 7 1 0,5 Centaurea jacea 1 Cerastium holosteoides ssp. triviale 0,5 Cirsium arvense 2 8 Clinopodium vulgare Galium boreale 1 1 1 1 Lathyrus pratensis 0,5 Pimpinella saxifraga 0,5 Plantago lanceolata 15 16 8 6 4 Ranunculus acris Ranunculus bulbosus Rumex acetosa 1 1 1 1 3 1 1 1 Sanguisorba officinalis 1 3 1 1 2 Scorzonera humilis Veronica chamaedrys 8 7 1 5 10 15 Vicia cracca 0,5 1 1 0,5 1 Příloha 1b Záznamy složeni vegetace na experimentálních plochách na začátku podzimního pokusu Plochy 11 až 15 patří do dolní části louky, plochy 16 až 20 do horní části louky. Širokolisté trávy zahrnují druhy Alopecurus pratensis, Agrostis capillaris, Arrhenatherum elatius. 49

Širolisté, nechlupaté trávy+ Avenula pubescens Carex sp. Deschampsia cespitosa Dactylis glomerata Elytrigia repens Festuca rubra Holcus lanatus Luzula campestris Poa pratensis ssp.angustifolia Trisetum flavescens Achillea millefolium Alchemilla vulgaris agg. Betonica officinalis Campanula patula Cardamine pratensis Carum carvi Centaurea jacea Cerastium holosteoides ssp. triviale Cirsium arvense Clinopodium vulgare Galium boreale Lathyrus pratensis Pimpinella saxifraga Plantago lanceolata Rumex acetosa Sanguisorba officinalis Scorzonera humilis Veronica chamaedrys Vicia cracca SIROL AvenPube Carex sp DeschCes DactGlom ElytRepe FestRubr HolcLana LuzuCamp PoaPrate TrisFlav AchilMil AlcheVul BetoOffi CampPatu CardPrat CarumCar CentJace CeraHolo CirsiArv ClinoVul GaliBore LathPrat PimpSaxi PlanLanc RumeAcet SangOffic ScorHumi VeroCham ViciCracc Příloha 2 Vysvětlené zkratky názvů rostlin v ordinačních diagramech. Širokolisté trávy zahrnují druhy Alopecurus pratensis, Agrostis capillaris, Arrhenatherum elatius. 50

Příloha 4 Popis typů spor TYP M /rod Glomus tvoří sporokarp, barva: rubínově červené až černé TYP C4 tvar: kulovitý barva: žlutavé dozelena TYP A1 tvar: kulovitý barva: hnědé, čevenočerné se širokou růžovou stopkou, která je TYP A3 tvar: kulovitý barva: hnědé, čevenočerné bez stopky TYP B1 tvar: kulovitý až obvejčitý barva: žluté, žlutohnědé, hnědé(některé narůžovělé) TYP C1 tvar: kulovitý barva: odstíny hnědé, některé s černými flíčky na povrchu, prosvítající TYP C2 tvar: kulovitý bílé) TYP D1 tvar: kulovitý až obvejčitý barva: žluté, žlutohnědé, hnědé se stopkou TYP D2 tvar: kulovité, obvejčité barva: červené nebo červenohnědé neprůsvitné TYP E1 tvar: kulovité barva: bílá povrch matný TYP E3a tvar: kulovitý barva: hnědé(některé světle hnědé až TYP E3b tvar: kulovitý až hněda barva: různé odstíny žluté, do oranžova na povrchu matná barva: bílé povrch s dolíčky, s většími odestupy než u typu E3a 51

TYP C3 tvar: oválný, někdy nepravidelný barva: žlutá TYP F2 tvar: kulovité až jehlancovité barva: žluté se stopkou TYP H1 tvar: kulovitý barva: červenohnědý až červenočerné TYP F1 tvar: kulovitý,obvejčitý barva: hnědé až hnědožluté TYP G0 tvar: oválný někdy kulovitý barva: žlutá lesklá, povch hladký TYP H2 tvar: kulovitý barva: bílé s hnědým fíčkem uvnitř TYP M 52

TYP B1 TYP A1 TYP C2 53

TYP E3a TYP F2 TYP GO TYP G2 54