MIKROSVĚT - VIRY, BAKTERIE, SINICE NEBUNĚČNÍ a) Viry - poprvé pozorovány ve 41. letech 20. století pomocí elektronového mikroskopu - nejjednodušší biologická struktura, která nedosahuje buněčné úrovně - schopné rozmnožovat se pouze v hostitelských 1 buňkách (rozmnožování vázané na buňky = biotropie) = nitrobuněční (intercelulární) parazité - bývají také označováni jako infekční nukleová kyselina - neschopni samostatného života (nemají vlastní aparát pro syntézu bílkovin ani metabolický aparát) - virologie - věda zabývající se viry - mikroskopická velikost (20-30 nm) - mají vysokou frekvenci mutací - většinou postrádají mechanismy, které by ty mutace opravily - antibiotika jsou proti nim neúčinná - tvar: tyčinkovitý (virus tabákové mozaiky), tvar mnohostěnu - nejasná evoluce: a) vznik souběžně s buňkou b) osamostatnění části genetického aparátu buňky 1 hostitelskou buňkou mohou být - bakterie, sinice, rostliny, houby, živočichové 1
c) vznik redukcí parazitických bakterií - virion - jedna infekční částice schopna infikovat buňku a množit se v ní - tvoří ji: a) nukleová kyselina b) bílkovinný obal (kapsida 2 ) - tvořen z podjednotek tvořených makromolekulami bíkovin - kapsomer - obaluje nukleovou kyselinu - jedno nebo vícevrstvý - nukleová kyselina + kapsid= nukleokapsid c) vnější (membránový) obal - vytváří se z cytoplazmatické či jaderné membrány hostitelské buňky - tvořen fosfolipidy a bíkovinami - jen u některých virů - obalených (např. virus chřipky) d) enzymy (polymerázy NK) - zahajují autoreprodukci viru ( spouštěcí enzymy ) e) přídavné součásti - bičík, vlákna - Virová infekce - proniknutí viru respektive jeho nukleové kyseliny do hostitelské buňky. formy: Perzistence - virus (virový genom) v buňce přetrvává, aniž by se replikoval Aperentní (zjevná) infekce - vede k zániku buňky rychlým pomnožením viru Latentní (skrytá) infekce - virus se nepatrně pomnožuje bez negativních následků pro buňku 1. adsorpce - přichycení viru (virionu) k buňce 2. penetrace - vniknutí virové částice (virionu) do buňky 3. změna metabolitických procesů v buňce vlivem viru 2 může být opatřen proteinovými hroty nebo výběžky 2
integrace (včlenění informace) do genomu (do jádra) - přetrvává v buňce bez škodlivých následků pro buňku; virová DNA, která se stala součástí DNA hostitelské buňky = provirus 3 4. aktivace proviru - po určité době se provirus vyváže z buněčné DNA a přechází v reprodukční lytický cyklus 4 5. replikace 6. uvolnění Lytický cyklus - virus je buňkou pomnožován v takové míře, že buňka praská a zaniká - nejčastější formu virové infekce. - z jednoho viru, který do buňky pronikl vzniknou stovky virů 1. adsorpce - přichycení viru (virionu) k buňce 2. penetrace - vniknutí virové částice (virionu) do buňky 3. změna metabolitických procesů v buňce vlivem viru 4. replikace (množení viru) - hostitelská buňka začne vytvářet kopie virové DNA nebo RNA a syntetizovat bílkoviny, které tvoří kapsid viru 5. uvolnění - vytváří se nové viry, které pak opouští hostitelskou buňku - viróza - onemocnění, kdy viry vstupují do organismu a poškozují jen - ložisko infekce - místo napadnutí organismu, šíření infekce dál (krví, mízou, nervovými vlákny) - Hromadná onemocnění: 3 provirus se může v buňce udržovat několik generací bez projevení, může být přenášen pohlavními buňkami rodičů na potomky i po řadu generací 4 může přitom způsobit zásadní změnu - transformaci buňky 4 (např. nádorovou) 3
a) epidemie (epificie u rostlin; epizoócie u živočichů) - rozšíření v určité oblasti b) pandemie - postihuje rozsáhlou oblast - interferony - bílkoviny, které zvyšují odolnost (rezistenci) buněk vůči virům a brání rozšíření infekce (využívané při léčbě rakoviny) - očkování (vakcinace) - založená na schopnosti imunitního systému tvořit protilátky proti cizorodým bílkovinám - očkovací látka (vakcína) - oslabený původce onemocnění nebo jeho určitá část => vpraví se do organismu a tam stimuluje imunitní systém k tvorbě protilátek - poprvé - 18. století (očkování proti pravým neštovicím) Systematické dělení virů: 1) podle typu nukleové kyseliny (nikdy neobsahují oba typy současně) DNA-viry - lineární nebo cyklická většinou dvouvláknová RNA-viry - lineární většinou jednovláknová 2) podle přítomnosti vnějšího obalu obalené - nukleokapsid má vnější obal neobalené - nukleokapsid nemá vnější obal 3) podle hostitele - každý typ viru může infikovat pouze určité buňky - viry rozpoznají své hostitelské buňky na základě specifického typu bílkovin, jež mají v kapsidu, a příslušných bílkovin (receptorů), které jsou na povrchu hostitelské buňky viry prokaryotické: - bakteriofágy (viry bakterií) - cyanofágy (viry sinic) viry eukaryotické: - viry živočišné a rostlinné - mykoviry a) BAKTERIOFÁGY VIRY PROKARYOTICKÉ 4
- význam: - struktura: lékařství (léčení bakteriálních chorob možnost jak nahradit antibiotika) modelové objekty pro výzkum a) hlavička složena z nukleokapsidu; tvar mnohostěnu b) stažitelný krček c) bičík d) bičíková vlákna - rozmnožování: Lytický cyklus (infekce bakteriální buňky virulentním fágem) - bakteriofág se připojí na specifický receptor bakteriální buňky - buněčná stěna se proděraví a DNA je z hlavičky fágu vypuzena do buňky (obal zůstává venku) - fágová DNA přepíše do specifické virové mrna (transkripce) a na ribozomech se začne tvořit specifická virová bílkovina na tvorbu kapsidu (translace) - proběhne replikace fágové DNA, ta se kondenzuje do klubíčka - rozpadnutí buňky - vnikne více než 100 nových vironů Lyzogenní cyklus (infekce bakteriální buňky fágem) - fágová DNA nereplikuje, ale začlení se do chromozomu baktérie - přenáší se do dceřiných buněk a označuje se jako profág - bakteriální buňka obsahující profága je imunní vůči infekci stejným fágem a označuje se jako lyzogenní - buď spontánně nebo vlivem indukčních činitelů (fyz.,chem.) přejde do lytického cyklu - profág se vyčlení z chromozomu a replikuje se jako v lytickém cyklu a bakterie vyzuje (rozpadne se) - typy bakteriofágů: virulentní fágy - v bakteriální buňce se silně pomnožují a úplně ji zničí (=zlyzují). - navozují vždy na lytický cyklus. mírné fágy (temperované) - mohou vyvolat lytický cyklus nebo nemusí a pak vstupují do lyzogenního cyklu. 5
VIRY EUKARYOTICKÉ FYTOVIRY (ROSTLINÉ VIRY) - většinou viry s jednořetězcovou segmentovanou RNA MYKOVIRY (VIRY HUB) - přenášené hmyzem, hlísty, houbami, semeny - změna tvaru, skvrny, deformace a odumírání orgánů - virus tabákové mozaiky, v. žluté mozaiky tulipánu, v. mozaiky květáku ZOOVIRY (ŽIVOČIŠNÉ VIRY) - nejprobádánější skupina, nejvíce druhů, stále se objevují nové, původci mnoha vážných chorob člověka - přenáší se vzduchem, vodou a potravinami, hmyzem, přímým kontaktem s nemocným - zoonózy - virózy přenosné z živočichů na člověka RNA viry: 1) virus dětské obrny (poliomyelitida) - akutní zasažení CNS => obrna 2) virus rýmy - napadá respirační cesty - množí se v buňkách nosní sliznice a nosohltanu 3) virus chřipky (influenza) - typ a, b, c - akutní onemocnění dýchacích cest - horečka, zimnice, bolesti hlavy, svalů; celková únava - epidemický až pandemický charakter (virion snadno vytváří nové antigenní varianty => není imunita) - v případě nevyléčení => latentní fáze => vir se dostává do jiných orgánů 4) virus klíšťové encefalitidy - poškození CNS; přenáší klíště - vyvolává zánětlivá onemocnění (zánět mozkových blan) 5) virus příušnic (parotitida) - horečnaté postižení příušních žláz, mohou být napadeny jiné žlázy s vnější sekrecí a CNS 6) spalniček - puchýřky na kůži, horečka, rýma, kašel, zánět spojivek 7) virus vztekliny (lysa)- bolest hlavy a krku, slinění, křeče svalů => smrt zadušením, přenašečem je infikovaná šelma 6
8) virus slintavky a kulhavky - nemoc hovězího dobytka a prasat; napadá CNS (mozkovou tkáň); horečky a puchýřky na ústní sliznici 9) virus žluté zimnice, zarděnek - horečka, zduření mízních uzlin, nebezpečí v těhotenství (poškozuje plod) 10) onkoviry - jsou schopny vyvolat nádorovou transformaci buňky pomocí virogenního cyklu - patří sem některé herpesviry, adenoviry, retroviry - virus HTLV je původce leukémie 11) virus HIV- AIDS (získané selhání imunity) - dlouhá inkubační doba - virus napadá a ničí T-lymfocyty (jsou důležité pro tvorbu protilátek) => zhroucení imunitního systému (únava,horečka,zánět dýchacích cest, nechutenství) => člověk umírá na infekce, které by pro zdravého člověka nebyly nebezpečné - přenos krví, spermatem, poševním sekretem, přenos z matky na ceru - nakažení HIV => akutní fáze infekce (objevení v buňkách) => klidová fáze bez příznaků => AIDS * virus HIV a onkoviry patří mezi retroviry - pomocí enzymu reverzní transkriptázy jsou schopné přepsat svou genetickou informaci z RNA do DNA, ta se potom začlení do genomu hostitelské buňky (HIV, T-lymfoptropní virus) DNA viry: 1) adenoviry - záněty dýchacích cest a očních spojivek 2) herpes simplex - opary rtů; napadá krycí tkáň 3) virus pásového oparu - virus proniká k míšním kořenům (velmi bolestivě) 4) virus Epsteina a Baarové (EB) - infekční mononukleóza - napadení mízní soustavy a lymfocytů - první prokázaný původce zhoubného bujení u člověka rakovina nosohltanu -nepřenosný vzduchem 5) viros neštovic (variola) - horečnaté onemocnění s typickými puchýřky a jizvami 6) virus hepatitidy B - infekční zánět jater (žloutenka) 7) virus bradavice (papilom) - kožní nádorky 8) myxomatózy - u králíků 7
b) Viroidy - jednodušší a menší než viry - = krátké cyklické molekuly RNA, které nejsou obaleny bílkovinami - parazité rostlinných buněk - zastavení či omezení růstu - viroidové infekce brambor, citrusů, chmelu - nitrobuněční parazité živočichů - částice bílkoviné povahy c) Priony (nekonvenční viry) - vytváří se (aktivací latentního genu) a hromadí v mozkové kůře - jsou chybnou variantou jednoho normálního proteinu, jenž se tvoří v mozkových buňkách, ale mají jiný tvar a vlastnosti 5 => po infikaci buňky, prion donutí ke změně tvaru ostatní bíkoviny => stávají se z nich také priony - způsobují pomalou degeneraci nervové soustavy => smrt jedince - inubační doba je dlouhá až několik let - př. nemoc šílených krav Creutzfeld-Jakobova nemoc (CJD) - porucha spánu, svalový třes, postupná demence BUNĚČNÉ ŽIVÉ SOUSTAVY: Nadříše: Prokaryota (Procacryotae) 1. Říše: ARCHEBAKTÉRIE (Archebacteria) - buněčná stěna tvořena pseudomureinem nebo je tvořena bílkovinami - některé nahé - bez buněčné stěny - blíže eukaryotickým b. než eubakteriím - tvar tyčinek, koků nebo vláken - nevytváří spory ani klidová stádia - aerobní i anaerobní - - Dělení dle metabolismu: 5 odolné vůči teplotám, enzymům => mohou pronikat do nového jedince potravou 8
1. Metanové archebaktérie - anaerobní, redukují CO 2 na CH 4 (metan) - výskyt v půdě, odpadních vodách, trávících traktech živočichů - výroba bioplynu 2. Extrémně halofilní (slanomilné) archébaktérie - zdrojem uhlíku AMK a cukry - aerobní - žijí v prostředí s vysokou koncentrací NaCl - až kolem 20% - slaná jezera, moře, nasolené maso 3. Haloalkafilní archebakterie - aerobní - žijí v prostředí NaCl (až 30%) s Na 2 CO 3 a s vyšším ph (kolem 9) - solná jezera 4. Termacidofilní archebakterie - snáší vysoké teploty (60-100 C - aerobní i anaerobní 2. Říše: EUBAKTÉRIE (Eubacteria) - nukleoid ani jiné organely nejsou ohraničeny membránou - nedělí se mitózou - ribozomy volně rozptýleny v cytoplazmě Podříše:Baktérie (Bacteria) - jednobuněčné organismy s prokaryotickou buňkou (patří mezi prokaryota) - mnohem menší než živočišná či rostlinná buňka (1-10 mikrometrů) - zásobní látkou glykogen nebo kys. poly-β-hydromáselná - v nepříznivých podmínkách vytváří spory => ztráta vody, vznik silného obalu, odolávají od +100 do 190 0C). - rozšíření: kosmopolitní (voda, vzduch, půda, na povrchu i uvnitř těl organismů) - vytváří kolonie 9
Struktura buňky: 1) Buněčná stěna - chrání a udržuje tvar - složena z peptidoglykenu 6 (dusíkatý polysacharid typický pro bakterie) -mureinu - zabraňuje nabobtnání a prasknutí buńky - chrání před pronikáním virů 2) Vrstva slizu - obklopuje buňku a vytváří slizové pouzdro (=kapsula) - chrání před viry a protilátkami 3) Cytoplazmatická membrána - stejná jako membrána eukaryontních buněk 4) Vnější cytoplazmatická membrána tvořená lipopolysacharidy(některé bakterie) =>gram-negativní baktérie (rychle ztrácí barvu) 5) Cytosol 6) Jádro - kružnicová (cirkuálníú molekula DNA představující jediný chromozom - molekula DNA je hustě zbalena => nukleotid{zaujímá místo ve středu buňky a je přichycen k cytoplazmatické membráně na jednom nebo dvou místech 7) Ribozómy - meší než eukaryontní ribozomy 8) Chromatografy (=váčky s chlorofylem) - u fotosyntetických bakterií 9) Plazmidy - do kružnice uzavřené molekuly DNA - nese doplňkovou genetickou informaci, která není pro buňku nepostradatelná 10) Fimbrie - krátká a jemná vlákna na povrchu (přilnavost) 11) Bičík - jeden nebo dva - rychle rotuje jako lodní šroub => pohání buňku vpřed Tvar buňky: koky - kulovitý tvar diplokoky - 2 bakterie zůstávají po rozdělení spojeny stafylokoky - bakterie vytváří hroznovité útvary 6 peptidoglykany jsou moleuly, které jsou tvořeny sacharidy a peptidy; vytváří dlouhé rozvětvené řetězce, jež jsou souběžně uloženy podél povrchu buňky a jsou vzájemně pospojovány => tvoří velmi pevnou síť 10
streptokoky - bakterie vytváří řetázky bacily - tyčinkovité bakterie - mohou uvnitř obsahovat spory (=kulovitá tělíska odolná vůči nepříznivým vlivům) tyčinky - tyčinkovitý tvar; mohou vytvářet dvojice nebo řetízky vibria - tvar zakřivené tyčinky mykobakterie - podlouhlé a částečně rozvětvené aktinomycety - podlouhlé a úplně rozvětvené spirily - několikrát zvlněné bakterie Dělení bakterií podle tvarů: pnemokoky zápal plic streptokoky angíny, spála, růže, záněty hltanu, patrových mandlí stafylokoky hnisavá onemocnění-vředy gonokoky kapavka, při neléčení poškozuje klouby, šlachy, sterilita meningokoky hnisavý zánět mozkových blan - smrtelné salmonely průjmová onemocnění, břišní tyfus vibria cholera-průjmy, dehydratace, smrt mykobakterie TBC, malomocenství borreli limská borelióza - postižení kloubů, svalů a nerv. soustavy(ochrnutí) spirochety syfilis=přijíce=lues, nebezpečná pohlavní choroba, při neléčení se dostává až do CNS (progresivní paralýza - smrt) Rozmnožování bakterií: - v příznivém prostředí se rozmnožují velmi rychle => schopnost bakterií rychle se dělit a růst v krátkém čase umožňuje rychlý vývoj a schopnost využívat nových zdrojů potravy a odolnost (rezistenci) proti působení antibiotik a jiných chemických látek 1) příčné dělení - nepohlavní 11
- zdvojení (duplikace) bakteriálního chromozomu - chromozómy přejdou na opačné póly buňky =>ta začíná růst - plazmatická membrána se vchlípí dovnitř =>2 dceřiné buňky{každá dceřiná buňka obsahuje stejnou genetickou informaci, jako měla buňka mateřská 2) pohlavní rozmnožování (konjugace) - dva jedinci se spojí úzkým můstkem a dojde k přesun části DNA z buňky do buňky (vždy jednosměrný přesun) Výživa bakterií: - každý organismus potřebuje pro tvorbu svých bílkovin, cukrů, tuků a nukleových kyselin energii a zdroj uhlíku Typ výživy a metabolismus Zdroj energie Zdroj uhlíku Zdroj vodíku Organismy Autotrofní fotoautotrofní chemoautotrofní světlo (fotosyntéza) CO 2 H 2 O Sinice, zelené rostliny světlo (fotosyntéza) CO 2 H 2 S, H 2 fotoautotrofní bakterie 7 oxidace anorg. látek CO 2 H 2 O chemoauto- trofní bakterie Heterotrofní fotoheterotrofní chemoheterotrof ní světlo (fotosyntéza) oxidace anorg. látek org. látky org. látky org. látky org. látky fotohetero- trofní bakterie chemoheterotrofní bakterie, houby, živočichové, člověk Vztah ke kyslíku: aerobní - potřebují k životu kyslík, nemohou žít v prostředí, kde se kyslík nevyskytuje anaerobní - mohou žít v prostředí bez vzdušného kyslíku - energii získávají kvašením (fermentací) organických látek (nejčastěji cukrů) = glykolýza 7 elektrony potřebné pro fotosyntézu získávají místo z vody ze sirovodíku nebo plynného vodíku a neuvolňují do ovzduší kyslík; nemají chlorofyl a, ale obsahují bakteriochlorofyl 12
-př. mléčné bakterie obligátně anaerobní bakterie - kyslík je pro ně jedovatý fakultativně (částečně) anaerobní - mohou žít s kyslíkem i bez něho Rozdělení dle stavby buněčné stěny a její barvitelnosti Gramovou matodou grampozitivní G + - barví se do fialova grampozitivní G - - barví se červěně Příklady baktérií: Bakterie žijící v půdě a ve vodě: saprofytické (reducenti) - nejvýznamnější - rozkládají organické a přeměňují je na organické (mineralizace) - umožňují koloběh látek (C, N, S), zúrodňují půdu, podílí se na samočištění vod - některé mohou být patogenní nitrifikační - přeměňují amonné soli na dusitany až dusičnany (chemoautotrofní) sirné bakterie - oxidují síru nebo sirovodík na sírany (chemoautotrofní) denitrifakční - rozkládají dusičnany a dusitany až na molekulární dusík (ochuzují půdu o dusík) hlízkové - symbióza s bobovitými rostlinami, obohacující půdu o dusík, vazači dusíku (absorbují dusík) asimilace vzdušného kyslíku = hlízkové bakterie tvoří hlísky (nádorky) na kořenech bobovitých rostlin (vojtěška, hrách) zelené hnojení kvasné zkvašují sacharidy kvašení octové, mléčné, propionové, máselné, hnilobné - rozkládají bílkoviny hnití Bakterie žijící ve vzduchu: - do vzduchu se bakterie dostávají druhotně s vířeným prachem nebo v kapénkách slin, hlenu, potu - jsou to saprofytiké nebo parazitické druhy parazitické - získávají organické látky potřebné pro svou výživu z tělních tekutin živých organismů (hostitelů) - chemoheterotrofní 13
Bakterie žijící v organismech: 1. Symbióza živočichů a člověka - nachází se nejčastěji v dutině ústní, zažívacím traktu, vylučovací soustavě (=mikroflóra) r. Lactobacillus - trávící, pohlavní soustava - produkje kyselinu mléčnou a vytváří kyselé prostředí Escherichia coli - střevní bakterie, může se stát patogenní (průjmy), modelový organismus (genetika) 2. Parazité živočichů a člověka = patogenní (choroboplodné) pneumokoky - zápal plic streptokoky - angína, spála, záněty stafylokoky - hnisavá onemocnění, vředy meningokok - zánět mozkových blan salmonely - průjmová onemocnění vibria - cholera - průjmy => dehydratace => smrt mykobakterie -TBC, malomocenství bacily - sněť slezinná Obrana proti patogenním baktériím: - tělo se brání tzv. imunitní reakci (tvorba protilátek) - rozlišují se imunity: 1) přirozená: aktivní - prodělání choroby pasivní očkování 2) umělá: injekce hotových protilátek (např. protitetanová injekce) léčení bakteriálních nemocí (antibiotika, sulfonamidy) Cesta nákazy: 1. vzduchem TBC, angína, spála, záškrt, zápal plic 2. alimentární cestou (jídlem) břišní tyfus, paratyfus, salmonelóza, úplavice, cholera 14
3. kůží tetanus, lepra 4. pohlavní cestou syfilis, kapavka 5. zvířaty sněti (slezinná=antrax), mor, vlnivá horečka, limská borelióza Význam baktérií: rozklad látek - mineralizace organických látek (reducenti, destruenti,dekompozitoři 8 ) lékařství - výroba antibiotik potravinářský průmysl - využití v biotechnologiích (výroba octa, siláže, bioplynu, kysaných mléčných výrobků, enzymů, antibiotik, hormonů, aminokyselin, čistění odpadních vod, ) původci chorob rostlin, živočichů a člověka (patogenní baktérie) Podříše: Sinice (Cyanobacteria=Cyanophyty) - prokaryotní fotoautotrofní organismy staré více než 3 mld roků - počátek vývoje ve starohorách - produkce kyslíku - spolu s baktériemi nejstarší organismy na Zemi - modrozelená barva - jednobuněčné organismy, kolonie nebo mnohobuněčné organismy - v tylakoidech chlorofyl Α; β - karoten, fykocyanin (modrozelený), fykoerytrin (červený) - podle zastoupení jednotlivých barviv můžou být sinice zelené, modré, hnědočervené i červené - zásobní látkou je sinicový škrob - nemají bičík => pohybují se klouzáním po povrchu - podíl na vzniku lišejníků (symbióza s houbami), symbióza s kořeny cykasů, kapraďorostů a jiných rostlin 9 - výskyt: slané i sladké vody, půda, skály, kůra stromů, sněhová pole, pouště, horké prameny - rozmnožování: - přímé dělení buňky - rozpad vláken 8 rozkládají odumřelá pletiva rostlin a tkáně živočichů na anorganické látky při procesu mineralizace (=proces přeměny látek organických na anorganické) 9 zvláště těsné soužití bylo popsáno u některých zelených řas, bičíkovců a kořenonožců 15
- stavba: - význam: - vytváří: - tvoří se spory (=akinety) - umožní přežít nepříznivé podmínky - cytoplazmatická membrána - buněčná stěna - ribozomy - cirkulární molekula DNA ležící volně v cytosolu - slizové pouzdro - plynové vakuoly - tylakoidy produkce kyslíku (dýchání vodních organismů) součást planktonu (potrava pro jiné organismy) tvorba travertinu fixace plynného dusíku v rýžových polích (heterocysta) výroba léků akineta - tlustostěnná buňka - vzniká splynutím několika vegetativních buněk - schopni přežít v nepříznivých podmínkách heterocysta - tlustostěnné buňky, téměř bezbarvý obsah - vznikají z vegetativních buněk v podmínkách dusíkového hladovění - význam: dodatečné zásobování rýže dusíkem vodní květ - význačná složka fytoplanktonu - v buňkách sinic fytoplanktonu jsou hojné plynné vezikuly (zádržky), které usnadňují vznášení v povrchových vodách - u nás častý v letních měsících - je to neviditelný jev způsobený eutrofizací vody - znesnadňuje využití vodních nádrží - živé sinice produkují i některé toxické látky - znik vodního květu <= v nádrži prudce poklesne koncentrace kyslíku (hnilobní procesy) 16