UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE

UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ KATEDRA ANALYTICKÉ CHEMIE Diplomová práce Ověření praktické aplikace paralelního SIA stanovení anorganických aniontů v reálných vzorcích povrchové vody Bc. Lukáš Grebeníček Konzultant: PharmDr. Hana Sklenářová, Ph.D. Vedoucí katedry: Prof. RNDr. Petr Solich, CSc. Hradec Králové 2012

Prohlášení Prohlašuji, že diplomovou práci jsem vypracoval samostatně s použitím pramenů uvedených v seznamu literatury a práce předtím nebyla použita k získání jiného, nebo stejného titulu. V Hradci Králové dne 2

Poděkování Chtěl bych poděkovat své konzultantce PharmDr. Haně Sklenářové, Ph. D. za její cenné rady, odborné konzultace a vřelý přístup s jakým mi pomohla tuto diplomovou práci sepsat. Chtěl bych rovněž poděkovat zaměstnancům katedry analytické chemie za jejich přátelský přístup a pomoc při měření mé diplomové práce. 3

Abstrakt Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra Kandidát Školitel Název diplomové práce: Analytická chemie Bc. Lukáš Grebeníček PharmDr. Hana Sklenářová, Ph.D Ověření praktické aplikace paralelního SIA stanovení anorganických aniontů v reálných vzorcích povrchové vody Tato diplomová práce je rozdělena na dvě části. V první části se experimentální stanovení zabývá ověřením praktické aplikace stanovení vybraných aniontů (SiO 3 2, Cl, NO 2, NO 3 ) metodou SIA upravenou podle platných ISO norem pro metodu FIA. Druhá část porovnává stanovení dusitanů a dusičnanů metodou SIA a porovnávací metodou firmy MERCK. Stanovení rozpuštěných křemičitanů bylo provedeno podle České technické normy ČSN EN ISO 16 264. Tato technická norma pro metodu FIA je založena na reakci rozpuštěných křemičitanů ve vzorku s roztokem činidla. Činidlem je kyselý roztok molybdenanu, který reaguje s křemičitany a fosforečnany za vzniku kyseliny molybdátokřemičité a molybdátofosforečné. Kyselina molybdátofosforečná je rozložena roztokem kyseliny šťavelové a kyselina molybdátokřemičitá je redukována roztokem chloridu cínatého na výsledný produkt reakce molybdenovou modř, stanovenou spektrofotometricky při vlnové délce 710 nm. Stanovení chloridů podle platné České technické normy ČSN EN ISO 15 682 je založeno na reakci roztoku činidla thiokyanatanu rtuťnatého s dusičnanem železitým. Thiokyanatanové ionty, které jsou vytěsněny chloridy, reagují s ionty Fe III za vzniku červeně zbarveného komplexu thiokyanatanu železitého. Absorbance tohoto komplexu je měřena při vlnové délce 465 nm. Při stanovení dusitanů a dusičnanů byla použita kadmiová redukční kolona, která sloužila k redukci dusičnanů na dusitany. Dusičnany byly stanoveny společně s dusitany jako jejich suma. Vzorek byl smísen s chromogenním činidlem obsahujícím sulfanylamid a naftylethylendiamin. Výsledný produkt, který vznikl pomocí tzv. Grisseovy reakce, byl měřitelný při vlnové délce 545 nm. V první části experimentálního pokusu byly proměřeny směsné roztoky uvedených aniontů. Byly porovnávány průtokové cely s optickou délkou 10 mm, 20 mm a kapilární průtoková cela (10 mm). 4

V druhé části experimentálního stanovení byly proměřeny kalibrace dusitanů a dusičnanů a opakovatelnost stanovení. Kalibrační křivky vykazovaly linearitu v rozmezí c NO 2 = 110 mg/l s korelačním koeficientem R 2 = 0,992. Kalibrační rozmezí při stanovení NO 3 vykazovalo lineární rozmezí při c = 550 mg/l a korelačním koeficientem R 2 = 0,9943. V této části je popsáno také porovnání stanovení dusitanů a dusičnanů v získaných vzorcích povrchové vody metodou SIA a porovnávací metodou firmy MERCK založenou na testovacích proužcích. Výsledky obou stanovení jsou porovnatelné pouze s určitým omezením daným menší citlivostí porovnávací metody. Stanovení dusitanů a dusičnanů potvrzuje možnost použití metody SIA v rutinní analýze založené na automatizovaném systému, s možností velkého počtu vzorků analyzovaných za relativně krátkou dobu. 5

Abstract Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of: Candidate: Supervisor: Title of Diploma Thesis: Analytical chemistry Bc. Lukáš Grebeníček PharmDr. Hana Sklenářová, Ph.D Verification of practical application of parallel SIA determination of inorganic anions in real samples of surface water This diploma thesis is divided into two parts. In the first one, the experimental determination deals with verification of practical application of chosen anions (SiO 3 2, Cl, NO 2, NO 3 ) by sequential injection (SIA) assay followed by valid ISO norms for flow injection (FIA) assays. The second part compares determination of nitrites and nitrates by the SIA assay and comparative assay from MERCK company. Determination of dissolved silicates was accomplished in accordance with the Czech technical norm ČSN EN ISO 16264. This technical standard for FIA assay is based on reaction of dissolved silicates with reagent solution. Reagent is composed of acidic solution of molybdenite, which reacts with silicates and phosphates generating molybdicsilicate acid and molybdicphosphate acid. Molybdicphosphate acid is decomposed by oxalic acid solution and molybdicsilicate acid is reduced by stannic chloride to molybdic blue the final product of reaction assayed spectrophotometrically at 710 nm. Determination of chlorides by the valid Czech technical norm ČSN EN ISO 15682 is based on reaction of mercuric thiocyanate with iron nitrate. Thiocyanate ions (which were displaced by chlorides) reacts with Fe III ions creating red ferriferous thiocyanate complex. Absorbance of this complex is measured at 465 nm. For assessment of nitrites and nitrates cadmium reducing column was used which reduces nitrates to nitrites. Nitrates were determined together with nitrites as sum. Sample was mixed with chromogenic reagent containing sulphanilamide and naphthylethylene diamine. Final product generated by Grisse s reaction was measured at 545 nm. In the first part of experiment mixedsolutions of listed anions were measured. Flowcells with 10 mm, 20 mm optical length and capillary flowcell (10 mm) were compared. 6

In the second part of experiment calibrations of nitrites, nitrates and repeatability of determination were measured. Calibration curves of NO 2 concentration shown linearity in the interval between 110 mg/l with correlation coefficient R 2 = 0.992. Calibration range in NO 3 determination shown linear interval by c = 550 mg/l with correlation coefficient R 2 = 0.9943. In this part comparison of nitrite and nitrate assessment in samples obtained from surface water by the SIA assay and assay from MERCK company based on testing strips is also described. Results from both assays are comparable only with certain limitation given by assays sensitivities. Determination of nitrites and nitrates confirms applicability of the SIA assay in routine analysis based on automatic system with possibility to analyse a large number of samples in short time. 7

Obsah Obsah...8 Seznam použitých zkratek...10 1. Úvod...11 2. Cíl a popis zadání diplomové práce...12 3. Teoretická část...13 3.1 Analýza vody...13 3.2 Analýza vody s využitím průtokových metod...14 3.2.1 Stanovení vybraných aniontů průtokovými metodami...15 3.2.2 Stanovení vybraných kovů a polokovů průtokovými metodami...16 3.2.3 Stanovení vybraných organických látek průtokovými metodami...17 3.2.4 Stanovení ostatních látek průtokovými metodami...19 3.2.5 Přehled technických norem zabývající se analýzou vody průtokovými metodami...20 4. Experimentální část...21 4.1 Paralelní stanovení vybraných aniontů (SiO 3 2, Cl, NO 2, NO 3 )...21 4.1.1 Použité chemikálie...21 4.1.2 Příprava roztoků...23 4.1.3 Přístrojové vybavení a zapojení systému při paralelním stanovení vybraných aniontů (SiO 3 2, Cl, NO 2, NO 3 )...27 4.1.4 Kalibrační program pro paralelní stanovení dusitanů, dusičnanů, chloridů a křemičitanů metodou SIA...29 4.1.5 Porovnání průtokových cel...34 4.1.6 Kalibrační závislosti...38 4.2 Paralelní stanovení dusitanů a dusičnanů...44 4.2.1 Použité chemikálie...44 8

4.2.2 Příprava roztoků...45 4.2.3 Přístrojové zapojení systému při paralelním stanovení dusitanů a dusičnanů metodou SIA...46 4.2.4 Kalibrační program pro paralelní stanovení dusitanů a dusičnanů metodou SIA...47 4.2.5 Kalibrační závislosti dusitanů a dusičnanů...48 4.2.6 Opakovatelnost paralelního stanovení NO 2 a NO 3...51 4.2.7 Stanovení aniontů v reálných vzorcích povrchové vody...53 4.3 Stanovení aniontů v reálných vzorcích porovnávací metodou...54 4.3.1 Výsledky stanovení vzorků povrchové vody porovnávací metodou...56 5. Vyhodnocení výsledků stanovení reálných vzorků povrchové vody...57 6. Souhrn...59 6.1 Paralelní stanovení vybraných aniontů ( SiO 3 2, Cl, NO 2, NO 3 )...59 6.2 Paralelní stanovení dusitanů a dusičnanů...60 7. Závěr...62 Seznam použité literatury:...63 9

Seznam použitých zkratek SIA WHO Sekvenční injekční analýza Světová zdravotnická organizace SPANDS Disodná sůl 1,8dihydroxy2(psulfofenylazo)3,6naftalendisulfonové kyseliny UV/ VIS EDTA PAU OPA CFA FIA NED RSD LOD LOQ Ultrafialová/ viditelná oblast světla Ethylendiamintetraoctová kyselina Polycyklické aromatické uhlovodíky Ortho Ftalaldehyd Kontinuální průtoková analýza Průtoková injekční analýza N(1naphtyl)ethylendiamin Relativní směrodatná odchylka Detekční limit detektoru Kvantifikační limit detektoru 10

1. Úvod V současné době jsou v analytické chemii vyžadovány analýzy dostatečně přesné, citlivé, spolehlivé, analýzy s minimálním nárokem na lidskou práci, rychlé a ekonomicky příliš nenákladné. Automatické analyzátory, schopné stanovit velký počet vzorků v relativně krátké době, našly uplatnění i v analytické chemii. Průtokové metody byly v průběhu několika let zdokonaleny a automatizovány pro potřeby analytické chemie. Jednoduchost průtokového zařízení, snadné ovládání a vyhodnocení výsledků dělá z průtokových metod cenné analytické metody, které se uplatňují v řadě oborů. 11

2. Cíl a popis zadání diplomové práce Cílem práce bylo prověření automatizovaného systému sekvenční injekční analýzy pro paralelní stanovení vybraných iontů (křemičitanů, chloridů, dusitanů a dusičnanů), seznámení s tímto systémem, provedení optimalizace podmínek pro správné a přesné stanovení a proměření kalibračních závislostí aniontů ve směsných roztocích. Experimentální část práce by proto měla být zaměřena na testování kalibračních závislostí, opakovatelnosti a také porovnání různých průtokových cel a jejich vliv na vlastní stanovení. V závěru bude provedeno stanovení analytů v reálných vodných vzorcích pomocí sekvenční injekční analýzy a srovnání získaných výsledků se zvolenou porovnávací metodou. 12

3. Teoretická část 3.1 Analýza vody Ověřování kvality zejména pitné vody má své počátky ve druhé polovině 19. století. Zejména při rozvoji měst a následném hromadění odpadu docházelo k znečištění povrchových vod. Pitná voda poskytuje efektivní zdroj pro šíření gastrointestinálních patogenů způsobujících vážná onemocnění člověka. Po tomto zjištění byl hygieniky koncem 19. století navržen první ucelený soubor ukazatelů kvality pitné vody a pozornost byla zaměřována hlavně na ukazatele fekálního znečištění (dusičnany, amonné ionty, chloridy, bakterie). V prvních vydaných normách ve 20. století, společně se standardy WHO, byl brán zřetel zejména na laboratorní vyšetření a takzvané místní vyšetření (předběžná analýza vzorku přímo u zdroje výskytu). V současnosti smí rozbor vody provádět a vydávat výsledky jen akreditované laboratoře [1, 2]. V poslední době dochází ke zhoršování kvality zejména podzemních a povrchových vod, velmi důležité je tedy pravidelné sledování parametrů udávajících jejich znečištění. Změny ve složení vody mohou být indikátorem znečištění, nebo kontaminace. Některé parametry jsou přísně kontrolovány, protože mohou mít dopad na lidské zdraví. V rámci analýzy kvality vody jsou stanovovány fyzikálněchemické, mikrobiologické, biologické vlastnosti a také samostatně chemické látky způsobující znečištění, nebo riziko vedoucí ke změně zdravotního stavu lidské populace. Většina, zejména pitné vody, bývá ošetřena pomocí desinfekčních prostředků. To sice vede k lepší bezpečnosti vody, zejména jako ochrana před bakteriemi, ale mohou vznikat vedlejší karcinogenní produkty [1,3]. Sledování kvality vody závisí na účinné rutinní analýze. Analýzu můžeme rozlišit podle způsobu stanovení. Rozlišujeme tři hlavní kategorie stanovení a to stanovení in situ, online stanovení a offline stanovení vzorku. Stanovení in situ, neboli stanovení přímo v původním místě výskytu vzorku a stanovení online, které probíhá v blízkosti vody s přímým vstupem do analytického systému, patří mezi analýzy, u kterých většinou není potřeba odběr vzorku ani jeho případná stabilizace. Stanovení vzorku offline probíhá většinou v laboratořích pomocí vhodných analytických metod. Při samotné analýze se sleduje zejména barva a zákal vzorku, koncentrace analytů a iontová síla. V případě vysoké koncentrace analytu je potřeba daný vzorek naředit tak, aby byla dodržena linearita detekčního systému. Naopak nacházíli se analyt ve vzorku ve stopovém množství je potřeba jeho vhodného zakoncentrování ve vzorku. Různorodost iontové síly ve vzorku může mít vliv na chemické reakce vznikající během stanovení a tudíž na případný analytický signál při detekci analytu. Rovněž zákal ve vzorku může vést k ovlivnění detekce analytů. 13

Z výše uvedeného vyplývá, že správnou úpravou vzorku se dá předejít možným problémům s detekcí a zvýšit spolehlivost výsledků analýzy. Takto lze rovněž posunout mez detekce až k hodnotám stanovení analytu ve vzorku na 1 pg/l. Cílem při analýze a rozboru vody je snížit, anebo úplně vyloučit použití a vznik nebezpečných látek. Další snahou je snižovat množství použitých chemikálií a vyprodukovaného odpadu. Vyřešením tohoto problému mohou přinést průtokové metody [3, 4]. 3.2 Analýza vody s využitím průtokových metod Průtokové metody nabízejí několik výhod pro rutinní analýzu vody. Mezi tyto výhody a přednosti patří zpracování velkého množství vzorků, nízká spotřeba vzorku, činidel, minimální produkce odpadu a výsledky analýzy jsou získány v relativně krátkém čase. V neposlední řadě je jistě výhodou možnost miniaturizace těchto systémů. Rozmanitost průtokových technik výrazněji vzrostla v posledních třech desetiletích. Dříve byly tyto systémy obsluhovány ručně. Dnes díky počítačové technice došlo k automatizaci těchto metod. V současné době byly vyvinuty průtokové systémy, vhodné pro všechny typy vzorků od farmaceutických přípravků až po složité vzorky pocházející z různých půd a potravin. Příkladem takového průtokového systému může být sekvenční injekční analýza (SIA) [3, 5,6]. Sekvenční injekční analýza (SIA) představená v roce 1990 zaznamenala růst v množství článků a publikací zejména díky její široké použitelnosti. SIA metoda umožňuje analýzu širokého spektra vod, neboť se jedná o velmi všestrannou techniku, která umožňuje přímé stanovení různých analytů a napojení různých externích zařízení pro variabilnější analýzu. Vzorky vody společně s farmaceutickými a biologickými vzorky patří k nejčastěji používaným stanovením automatizovaným touto technikou. Sekvenční injekční analýza byla navržena, aby bylo zabráněno některým předešlým nedostatkům průtokových technik. Manipulace se vzorky i činidly přímo v průtokovém systému, nízká spotřeba činidel, to jsou přednosti, které pomohly k zrychlení analýzy. Ovládání pomocí počítače zajišťuje metodě rovněž lepší reprodukovatelnost stanovení a pomohlo k automatizaci této metody. Většina pozitivních vlastností sekvenční injekční analýzy je dána použitím selekčního ventilu a pístového čerpadla. Použití různých činidel a jejich připojení různými porty vícecestného selekčního ventilu umožňuje stanovení více analytů (takzvané multiparametrické stanovení) současně v jednom průtokovém systému. Jako takzvaný pohonný systém může sloužit peristaltická pumpa, nebo častěji pístové čerpadlo. Sekvenční injekční analýza je známá rovněž možností širokého výběru detekčních systémů. Mezi nejpoužívanější metody detekce patří spektrometrie ve viditelné nebo UV oblasti. Používání složitějších metod detekce může přinést citlivější a 14

selektivnější stanovení, ale představuje vysoké náklady na údržbu a většinou nemožnost miniaturizace. Možnost fluorescence a luminiscence má své výhody, ale nepatří k nejpoužívanějším technikám. Detekce založená na elektroanalytických technikách má své výhody v možnosti použití in situ stanovení [3,6]. 3.2.1 Stanovení vybraných aniontů průtokovými metodami Sekvenční injekční analýza kromě již zmíněných vzorků sleduje ve vzorcích vody hladiny aniontů, kovů a dalších látek. Stanovení chloridů ve vodě se provádí zejména kvůli detekci soli v přírodních vodách. Reakce chloridů s dusičnanem stříbrným se spektrofotometrickou detekcí patří k nejpoužívanějším metodám jejich stanovení sekvenční injekční analýzou. Potenciometrická detekce iontově selektivní elektrodou je vhodná rovněž ke stanovení zakalených, nebo barevných vzorků. Obě metody detekce lze použít k analýze povrchových i odpadních vod obsahující chloridy v koncentraci od 1 mg/l až 1000 mg/l. Přítomnost síranu, dusitanů a dusičnanů může mít vliv na acidifikaci vody, nebo eutrofizaci způsobenou výskytem dusíkatých látek. Sírany bývají hlavní součástí povrchové vody. Všeobecně se sloučeniny síry vyskytují ve vodě z důvodu používání uhlí, olejů a paliv. Jejich stanovení je většinou založeno na reakci síranu s chloridem barnatým, probíhající v průtokovém systému, a následné spektrofotometrické detekci, která splňuje možnost analýzy většího množství vzorků. Sírany nepředstavují bezprostřední ohrožení veřejného zdraví, ale podle doporučení WHO by se měly nacházet ve vzorcích povrchové vody do koncentrace 3 mg/l. Dusičnany se ve vodě rozkládají na dusitany. Dusitany mohou v lidském těle reagovat se sekundárními, nebo terciárními aminy za vzniku karcinogenních nitrosaminů. Při vysoké koncentraci dusitanů v krvi, může rovněž vznikat methemoglobin. Ten vzniká reakcí dusitanů s dvojmocným železem a není schopen přenosu kyslíku. Dusitany jsou tudíž indikátorem fekálního znečištění podzemních vod a jejich hladina musí být pravidelně kontrolována. Maximální možná koncentrace dusitanů v pitné vodě je 3 mg/l a koncentrace dusičnanů 50 mg/l. Zvláštní nároky jsou brány u kojenecké vody, kde koncentrace dusičnanů nesmí přesáhnout 15 mg/l a koncentrace dusitanů 0,02 mg/l. U kojenců způsobují dusitany závažnější zdravotní problémy. Dusičnany jsou většinou stanovovány v průtokovém systému pomocí kadmiové redukční kolony a následné diazotační a kopulační reakce, při které vzniká stanovované azobarvivo, kdy dojde k jejich převedení na dusitany v relativně krátkém čase. Tato metoda redukce dusičnanů na dusitany je známa jako Griessova metoda, která patří k nejpoužívanějšímu současnému stanovení dusičnanů a dusitanů [3,59]. 15

Některé anionty se v přírodních vodách vyskytují vzácně. Bromidy, fluoridy, thiokyanatany a sulfidy proto jsou mnohem více stanovovány v odpadních vodách, nebo vzorcích z farmaceutického průmyslu. Fluoridy jsou do pitné vody pravidelně přidávány, ale jejich koncentrace v povrchových vodách může být překročena. Optimální koncentrace v povrchových vodách je od 0,6 do 1,1 mg/l a při jejím překročení hrozí zažívací a metabolické problémy. Při stanovení koncentrace fluoridů ve vodách bylo použito několik druhů detekce, ale jako referenční metoda je brána spektrofotometrie pro svou snadnou automatizaci a spolehlivost. Spektrofotometrická detekce je založena na reakci fluoridů se zirkoničitými ionty a disodnou solí 1,8 dihydroxy2(psulfofenylazo)3,6naftalendisulfonové kyseliny (SPADNS) za vzniku komplexní sloučeniny měřitelné při vlnové délce 570 nm. Rušivý vliv může mít vyšší koncentrace síranů ve vzorku [3,4,10]. 3.2.2 Stanovení vybraných kovů a polokovů průtokovými metodami Stanovení kovů ve vodě souvisí většinou se změnami v životním prostředí, jeho znečištěním a uvolnění kationtů kovů. Takto uvolněné kationty kovů pak mají toxický účinek, který závisí na jejich koncentraci. Koncentrace kationtů kovů ve vodě jsou většinou velmi nízké a k jejich stanovení je potřeba mnohdy velmi citlivých detekčních technik. Sledovány jsou hladiny kationtů: Železa, Chromu, Mědi, Kadmia, Olova, Zinku, Rtuti, Niklu, Kobaltu, Manganu, Stříbra a jiné. U stanovení některých kovů je třeba znát jejich aktuální oxidační stav. Samotná analýza, stejně jako u dusičnanů, pak může být založena na oxidaci, nebo redukci těchto kovů (Fe, Cr, Mn). V poslední době je popsáno stanovení vápníku, sodíku, draslíku, hořčíku a barya pomocí potenciometrické detekce popsané jako takzvaný elektronický jazyk. Detekce je založená na matematickém modelu stanovení různých koncentrací uvedených iontů. Stanovení těchto kovů pomocí potenciometrie představuje levnou a rychlou techniku, srovnatelnou s referenční metodou a není u ní zapotřebí zakoncentrování vzorku před analýzou. Stanovení vápníku a draslíku je možné i v barevných roztocích bez významných interferencí [3,4,11]. Rozpustné sloučeniny stříbra se používají k desinfekci vody. Stanovení stříbra ve vodách, pomocí průtokových systémů se spektrofotometrickou detekcí, je založeno na redukční reakci stříbrných iontů tetrahydroboritanem sodným (NaBH 4 ) a následnému stanovení při vlnové délce 390 nm. Současné stanovení Fe II a Fe III v životním prostředí je důležité zejména ve sledování biologické dostupnosti těchto kationtů. Flexibilita průtokových metod umožňuje mnoho možností stanovení, přitom nejpoužívanější je spektrofotometrická detekce ve UV/ VIS oblasti. Stanovení obou kationtů současně 16

v průtokovém systému je možné pomocí činidla obsahujícího kyselinu sulfosalicylovou a 110 fenantrolin. Tyto sloučeniny tvoří s trojmocnými a dvojmocnými kationty železa komplexy, které jsou stanoveny spektrofotometrií při vlnové délce 530 nm [12,13]. Jiná metoda stanovení kationtů železa spektrofotometrickou detekcí je popsána jako stanovení rozpuštěného a celkového železa v přírodních vodách. U této metody je zapotřebí zakoncentrování kationtů okyselením vzorku, aby došlo k rozložení komplexů železa hydroxidem. Železité a železnaté kationty jsou poté stanoveny pomocí N,Ndimethyl p fenylendiaminu v přítomnosti peroxidu vodíku. Nárůst absorbance oxidovatelného produktu je stanoven při vlnové délce 514 nm [14]. Dalším indikátorem znečištění vod, který se dá sledovat s využitím průtokových metod je polokov arsen. Vyskytuje se ve vodě nejčastěji v anorganické formě jako trojmocný, nebo pětimocný kationt. I když se nachází v nízkých koncentracích, tak zejména v trojmocné formě je poměrně toxický a proto je nutný pravidelný rozbor vody. Hladina celkového arsenu by měla být nižší než 10 μg/l. Vysoké koncentrace arsenu ve vodě se mohou vyskytovat v přítomnosti železa, nebo jiných těžkých kovů. Byl vyvinut automatizovaný systém pro stanovení arsenu ve formě AsH 3 a AsH 5. Tyto sloučeniny vznikly během úplného odpaření a následného zakoncentrování ve vzorku. Analýzu může ovlivnit přítomnost těžkých kovů. Přidáním EDTA se minimalizuje tento vliv na samotné stanovení a dojde rovněž k zakoncentrování sloučenin arsenu ve vzorku. Stanovení průtokovými metodami probíhá nejčastěji v kombinaci s molybdenovou modří v přítomnosti manganistanu draselného (KMnO 4 ) s následnou spektrofotometrickou detekcí výsledného produktu při vlnové délce 870 nm [15,16]. 3.2.3 Stanovení vybraných organických látek průtokovými metodami Řada stanovení zejména organických látek ve vodě průtokovými metodami využívá k detekci luminiscenčních metod. Chemiluminiscence je přitom z nich nejpoužívanější. Výhodou luminiscenční detekce je určitě snadná automatizace, možnost rychlé, spolehlivé a dostatečně citlivé analýzy. Luminiscenční metody tudíž vhodně doplňují výhody průtokových metod v oblasti analýzy vod. Některé senzory pro stanovaní insitu využívají luminiscenční detekce v analýzách vod také k měření obecných parametrů vody jako ph vody, slanost, nebo k měření biochemické a chemické spotřeby kyslíku[17]. Polycyklické aromatické uhlovodíky (PAU) jsou vysoce karcinogenní a toxické látky, které vznikají nedokonalým spalováním organických hmot, tuhých a kapalných paliv. Do povrchových vod se mohou dostat splachy asfaltových silnic. Nejzávažnější jsou benzo(a)pyren, benzo(b)fluoranthen, benzo(k)fluoranthen, benzo(ghi)pyrelen, 17

indeno(1,2,3cd)pyren a fluoranthen. Fluorescence a fosforescence vykazují vhodnou citlivost k jejich stanovení. V povrchových vodách se koncentrace polycyklických aromatických uhlovodíků pohybuje v desítkách až stovkách μg/l. Stanovení fenolických sloučenin je rovněž důležité vzhledem k jejich vlivu na kvalitu vody. Fenolické sloučeniny jsou toxické pro vodní organismy a způsobují nepříjemný zápach vody. Hladina fenolických sloučenin v pitné vodě by měla být nižší než 1 μg/l. Díky přirozeným vlastnostem fenolických sloučenin můžeme k detekci použit luminiscenční metody. Bisfenol A, využívaný k výrobě plastů patří k nejčastěji stanovovaným fenolickým látkám. Formaldehyd je plyn štiplavého zápachu, lehce rozpustný ve vodě. Poměrně ve velké míře je vypouštěn do vody v průmyslových odpadech a při oxidačních procesech pro úpravu vody. Stanovení formaldehydu ve vodě se provádí v průtokovém systému nejčastěji pomocí luminiscenční a spektrofotometrické detekce. V průběhu Trautz Schoriginovy reakce formaldehyd reaguje s kyselinou gallovou a peroxidem vodíku v alkalickém prostředí za vyzáření chemiluminiscenčního záření při 643762 nm. Spektrofotometrická metoda stanovení formaldehydu v průtokové injekční analýze je založena na reakci formaldehydu s acetoacetanilidem a amoniakem. Spektrofometrická detekce je velmi jednoduchá, rychlá, citlivá a navíc není interferována jinými látkami a je tedy aplikována v analýzách životního prostředí. Nadměrné používání pesticidů se stává závažným problémem v otázce kontaminace půd, vod a potravin. Detekce a citlivé stanovení pesticidů ve vzorcích životního prostředí je proto velmi důležité. K nejčastěji stanovovaným patří karbamáty, organické pesticidy, imidacloprid, propanil, atrazin a simazin [17 20]. K dalším analytům, stanovujícím se v povrchové a pitné vodě, patří povrchově aktivní látky. Tyto látky se ve vodě mohou objevit při použití dezinfekčních přípravků, nebo jiných prostředků na úpravu vody. Tenzidy jsou látky, které se běžně používají v pracích a čisticích prostředcích. Stanovení aniontových tenzidů v průtokovém systému je založeno na reakci s methylenovou modří a následné spektrofotometrické detekci při vlnové délce 620 nm. Pomocí chemiluminiscence lze v průtokovém systému detekovat neiontové i aniontové povrchově aktivní látky [3,4,17,21]. 18

3.2.4 Stanovení ostatních látek průtokovými metodami Vysoké koncentrace amonných kationtů poskytují obohacení vodních ekosystémů s následným vyšším růstem řas, zákalu, zápachu a zvýšením toxicity. Fluorescenční stanovení je založeno na reakci amonných iontů s ophtalaldehydem. Stanovení anorganického a celkového fosforu má význam v hodnocení celkové kvality vody, neboť společně s dusíkem je ukazatelem nutričního stavu přírodních vod. Anorganický fosfor je nejčastěji přítomný v podobě orthofosforečnanů. Luminiscenční metody se běžně používají k jejich detekci. Organický fosfor se musí nejprve oxidovat na fosfátové ionty. Tyto ionty pak reagují s molybdenanem za vzniku fosfomolybdenanu. Fosfomolybdenan pak tvoří s rhodaminem komplex detekovatelný fluorimetrem. Všestrannost průtokových metod vystihuje další možnost stanovení organického fosforu ve formě fosfatidylcholinu. Fosfolipidy se mohou v povrchových vodách vyskytovat při rozkladu rostlin a těl živočichů. Metod stanovení fosfolipidů, jejichž koncentrace v povrchových vodách je nižší než koncentrace v mořské vodě, je mnoho, ale k analýzám v životním prostředí je potřeba dostatečně citlivá a rychlá analytická metoda. Dostatečně rychlá a citlivá metoda stanovení fosfatidylcholinu ve vodách zahrnuje použití fosfolipázy C, alkalické fosfatázy a cholin monoaminooxidázy. Konečným produktem této enzymatické reakce probíhající v průtokovém systému je peroxid vodíku, který je snadno detekován chemiluminiscenční reakcí katalyzovanou luminolem [17, 22]. Peroxid vodíku je široce používán v průmyslu. Stanovení peroxidu vodíku v životním prostředí a kontrola jeho koncentrace patří k náplním průtokových metod. Chemiluminiscenční detekce je založena nejčastěji na reakcích s luminolem a vzhledem k minimálním interferencím je tato metoda ideální ke kvantifikaci peroxidu vodíku v přírodních vodách [17,23]. K dalším látkám, které je třeba sledovat, patří oxid siřičitý. SO 2 se hromadí v atmosféře zejména při spalování uhlí a má velký vliv na vzniku kyselých dešťů. Oxid siřičitý reaguje s vodou za vzniku siřičitanů (SO 3 2 ). Velmi citlivá metoda ke stanovení různých siřičitanů probíhající v průtokovém systému, je založena na reakci sloučeniny oftalaldehydu (OPA) s přítomnými siřičitany v zásaditém prostředí. Vzniká isoindol, který je snadno detekovaný pomocí fluorescence. Stanovení se používá zejména v analýze potravin, vod a ovzduší. V uhelném průmyslu se takto sleduje účinnost procesu odsíření spalovacího materiálu [24]. 19

3.2.5 Přehled technických norem zabývající se analýzou vody průtokovými metodami Tab. 1: Stanovení založená na neseparačních průtokových metodách EN/ ISO normy. Parametr Číslo normy Průtoková metoda Lineární rozsah (mg/l) Citace Aniontové tenzidy 16265 (2009) 75 7533 Dusík amoniakální 11732 (2005) 75 7454 Dusík celkový 29441 (2010) 75 7526 Dusitanový a dusičnanový dusík 13395 (1996) 75 7456 Fenoly 14402 (1999) 75 7567 Chloridy CFA + FIA 15682 (2000) 75 7421 Chrom (VI) 23913 (2006) 75 7426 Křemičitany rozpuštěné Kyanidy volné a celkové Orthofosforečnany a celkový fosfor 16264 (2004) 75 7482 14403 (2002) 75 7413 15681 (2003) 75 7464 Sírany 22743 (2006) 75 7478 CFA 0,055,0 [21] CFA+FIA 0,110 [25] CFA+FIA 0,220 [26] CFA+FIA 0,011,0 (NO2 ) 0,220 (NO3 ) [27] CFA+FIA 0,011,0 [28] CFA+FIA 1,01000 [7] CFA+FIA 2200 μg/l (CFA) 202000 μg/l (FIA) [29] CFA+FIA 0,220 [30] CFA 10100 μg/l [31] CFA+FIA 0,011,0 orthofosforečnany 0,110 celkový P [32] CFA+FIA 30300 [33] CFA kontinuální průtoková analýza FIA Průtoková injekční analýza Průtokové metody jsou vhodné k analýze vod zejména tam, kde je potřeba zpracovat mnoho analytů ve vodě s vysokým počtem stanovení za určitou časovou jednotku. Při práci s metodou FIA je vzorek vstřikován vstřikovacím ventilem do kontinuálně protékajícího nosného proudu. Jako nosný proud je většinou používána voda. U metody CFA je vzorek čerpán do nosného proudu pomocí peristaltického čerpadla. Technické normy zabývající se analýzou vody průtokovými metodami používají většinou jako metodu detekce spektrofotometrii, nebo potenciometrii [7]. 20

4. Experimentální část 4.1 Paralelní stanovení vybraných aniontů (SiO3 2, Cl, NO2, NO3 ) Přístrojové zařízení SIA systém (FIAlab 3000, FIAlab Instruments, USA) použitý pro stanovení koncentrací jednotlivých aniontů se skládal z následujících částí. Pístová pumpa byla složena ze skleněného rezervoáru opatřeného kovovým pístem s teflonovým zakončením. Pístová pumpa byla schopna aspirovat objem od 5 μl až do 5 ml. Selekční ventil použitý u SIA systému měl osm portů. K příslušným portům byly připojeny teflonové hadičky o vnitřním průměru 0,50 mm, které byly použity pro aspiraci potřebných roztoků, jak bylo uvedeno v řídícím programu. Spojovacím článkem mezi pumpou a selekčním ventilem byla mísící cívka, která byla vytvořena stočením teflonové hadičky na válečku z plexiskla. Její délka (220 cm) byla určena na základě součtu objemů roztoků aspirovaných řídícím programem. Další částí byla průtoková cela, jejíž parametry byly v průběhu experimentální části testovány. Použity byly průtokové cely s optickou délkou 20 mm, 10 mm a kapilární průtoková cela (10 mm). Detektorem zde byl USB 2000 UV VIS CCD detektor pracující pomocí optických vláken OceanOptics o průměru 300 μm. Zdrojem světla byla UV VIS lampa LS1 OceanOptics. Řídící jednotkou byl počítač se softwarem FIAlab for Windows 5.0. 4.1.1 Použité chemikálie Všechny použité chemikálie k přípravě roztoků a činidel byly jakosti vhodné pro stanovení daných iontů. Používána byla demineralizovaná voda. Použité chemikálie pro stanovení křemičitanů Při stanovení rozpustných křemičitanů ve vodě bylo čerpáno z normy ČSN EN ISO 16264 [30]. Chemikálie potřebné pro stanovení křemičitanů jsou uvedeny v Tab. 2 21

Tab. 2: Přehled použitých chemikálii pro stanovení křemičitanů Chemikálie Dodavatel Kyselina sírová, H 2 SO 4 96% ρ= 1,84 g/ml, Lachema, Neratovice Tetrahydrát heptamolybdenanu hexaamonného, (NH 4 ) 6 Mo 7 O 24 x 4H 2 O Dihydrát kyseliny šťavelové, C 2 H 2 O 4 x 2H 2 O Dihydrát chloridu cínatého, SnCl 2 x 2H 2 O Hydrazin sulfát, N 2 H 6 SO 4 Hydroxid sodný, NaOH Chlorid křemičitý, SiCl 4, 99% Dihydrát disodné soli kyseliny ethylendiamintetraoctové, Na 2 EDTA, C 10 H 12 O 8 N 2 Na 2 x 2H 2 O Balex, Pardubice Lach Ner, s.r.o., Neratovice Lach Ner, s.r.o., Neratovice Lach Ner, s.r.o., Neratovice Penta, Praha Aldrich, Steinheim, Německo Lachema, Neratovice Použité chemikálie pro stanovení chloridů Při stanovení chloridů ve vodě bylo čerpáno z normy ČSN EN ISO 15682 [7]. Potřebné chemikálie jsou uvedeny v Tab. 3. Tab. 3: Přehled použitých chemikálii pro stanovení chloridů Chemikálie Thiokyanatan rtuťnatý, Hg(SCN) 2 Methanol, CH 3 OH Kyselina dusičná, HNO 3, ρ= 1,4 g/ml, 65% Nonahydrát dusičnanu železitého, Fe(NO 3 ) 3 x9h 2 O Chlorid sodný, NaCl Dodavatel Aldrich, Německo Penta, Praha LachNer, s.r.o., Neratovice Lachema, Brno Penta, Praha 22

Použité chemikálie pro stanovení dusičnanů a dusitanů Při stanovení dusičnanů a dusitanů ve vodě byly použity chemikálie uvedené v Tab. 4 [6]. Tab. 4: Přehled použitých chemikálii pro stanovení dusitanů a dusičnanů Chemikálie Dodavatel Sulfanilamid Léčiva a.s., Praha N (1naphtyl) ethylendiamin dichlorid Loba Feinchemie, Německo Kyselina fosforečná 85 % Kyselina chlorovodíková, 35%, c (HCl)= 1M Síran měďnatý, c (CuSO 4 ) = 20g/ l Dusičnan sodný, NaNO 3 Dusitan sodný, NaNO 2 Chlorid amonný, NH 4 Cl LachNer, s.r.o., Neratovice Penta, Praha Balex, Pardubice Penta, Praha Penta, Praha Penta, Praha 4.1.2 Příprava roztoků Pro stanovení vybraných aniontů metodou SIA byla použita činidla, která byla uvedena v příslušných normách pro jejich stanovení. Použita byla demineralizovaná voda. Stanovení křemičitanů Použitá činidla, standardy křemičitanů a roztok k čištění průtokové sestavy byly připraveny podle pokynů v uvedené normě (ČSN EN ISO16264) [30]. Připravené roztoky byly stálé při laboratorní teplotě po dobu šesti měsíců. Roztok činidla chloridu cínatého (R3) byl stálý při teplotě 24 C, uchováván byl v lednici. Objemy připravených roztoků byly menší, než vykazuje norma. Objemy byly vztaženy a potřebné chemikálie byly přepočítány na celkový objem 100 ml, místo původních 1000 ml. 23

Roztok molybdenanu (R1): V odměrné baňce na 100 ml byl v 80 ml vody rozpuštěn tetrahydrát heptamolybdenanu hexaamonného (přibližně 3 g). Bylo přidáno 1,5 ml kyseliny sírové a objem byl doplněn vodou. Roztok kyseliny šťavelové (R2): V 80 ml vody bylo rozpuštěno 4,4 g dihydrátu kyseliny šťavelové a objem byl doplněn do 100 ml vodou. Roztok chloridu cínatého (R3): K 80 ml vody bylo pomalu přidáno 2,8 ml kyseliny sírové. V tomto roztoku bylo rozpuštěno 0,024 g dihydrátu chloridu cínatého a 0,2 g hydrazinsulfátu. Potřebný objem byl doplněn vodou. Roztok byl stálý jeden měsíc při uchovávání v lednici. Alkalický roztok křemičitanů: Alkalický roztok byl připraven pomocí chloridu křemičitého. K přibližně 90 ml hydroxidu sodného o c = 0,1 mol/l bylo pomalu přidáno 40 μl chloridu křemičitého. Objem byl doplněn po rysku ve 100 ml odměrné baňce opět hydroxidem sodným. Kalibrační roztoky: Kalibrační roztoky byly připraveny zředěním alkalického roztoku křemičitanů vodou. Kalibrační rozsah byl od c = 5 mg/l až 20 mg/l. Roztok k čištění průtokové sestavy: V 50 ml vody bylo rozpuštěno přibližně 6,5 g hydroxidu sodného a přidáno 0,6 g dihydrátu disodné soli kyseliny ethylendiamintetraoctové (chelaton). Stanovení chloridů Použitá činidla a standardy chloridů byly připraveny podle uvedené normy (ČSN EN ISO 15682) [7]. Roztok činidla pro stanovení chloridů byl stálý tři měsíce, pokud byl chráněn před světlem. Roztoky standardů chloridů byly stálé jeden rok. Objemy připravených roztoků byly menší, než vykazuje norma, díky lepší manipulaci s roztoky v SIA systému a šetření potřebných chemikálii. 24

Roztok činidla (R Cl ): Nejprve byl připraven roztok A, kdy bylo v 50 ml vody rozpuštěno 3,1 g nonahydrátu dusičnanu železitého. Výsledný roztok byl připraven v odměrné baňce na 100 ml. K 15 ml methanolu bylo za stálého míchání přidáno a rozpuštěno 0,062 g thiokyanatanu rtuťnatého. Dále bylo přidáno 10 ml vody a 0,34 ml kyseliny dusičné a výše zmíněný roztok A. Zbývající objem byl doplněn vodou po rysku a roztok byl 2 hodiny míchán pomocí magnetické míchačky a poté byl roztok přefiltrován pomocí filtračního papíru. Zásobní roztok NaCl: V odměrné baňce na 100 ml bylo rozpuštěno přibližně 16,5 mg NaCl a objem byl doplněn po rysku vodou. Kalibrační roztoky: Použité kalibrační roztoky byly připraveny zředěním zásobního roztoku vodou. Použitý pracovní rozsah byl od c = 5 mg/l až c = 30 mg/l. Stanovení dusičnanů a dusitanů Použitá činidla, zásobní roztoky pro stanovení dusičnanů a dusitanů a pufr byly připraveny z chemikálií vhodné jakosti [6]. Byl použit nižší objem (100 ml). Činidlo R (NO 2, NO 3 ) bylo vhodné jak pro stanovení dusitanů tak i dusičnanů. Roztoky byly uchovávány v temnu a v lednici. Roztok činidla (R NO 2, NO 3 ): 1 g sulfanilamidu a 0,1 g N(1naphtyl)ethylendiamin dichloridu byly rozpuštěny v přibližně 50 ml vody a pomalu přidáno 10 ml 85% kyseliny fosforečné. Objem byl doplněn vodou po rysku (100 ml). Zásobní roztok dusitanů: Přibližně 15 mg dusičnanu sodného bylo rozpuštěno v 50 ml vody. Objem byl doplněn vodou do 100 ml odměrné baňky. Zásobní roztok dusičnanů: Přibližně 13,7 mg dusitanu sodného bylo rozpuštěno v 50 ml vody a potřebný objem byl doplněn po rysku vodou. 25

Kalibrační roztoky: Kalibrační roztoky dusitanů a dusičnanů byly připravovány zředěním zásobních roztoků vodou. Použitý kalibrační rozsah byl od c = 5 mg/l do 20 mg/l u dusitanů i dusičnanů. Amonný pufr: Pufr sloužil pro uchovávání vlastností redukční kolony a byl připraven rozpuštěním přibližně 8,5 g chloridu amonného v 50 ml vody a doplněn po rysku ve 100 ml odměrné baňce. ph takto připraveného pufru bylo 7,5. Směsné roztoky Směsné roztoky byly připravovány do 100 ml odměrných baněk. Vycházelo se ze zásobních roztoků jednotlivých aniontů, uvedených výše. Koncentrace jednotlivých aniontů v použitých směsných roztocích vycházely z kalibračního rozmezí uvedeného v jednotlivých normách. Použité směsné roztoky a koncentrace jednotlivých aniontů jsou uvedeny v následujících tabulkách. Tab. 5: Použité směsné roztoky pro paralelní stanovení vybraných aniontů 1 Směsný roztok Koncentrace jednotlivých aniontů v mg/ l 2 SiO 3 Cl NO 2 1. 10 20 5 10 2. 5 30 20 15 3. 20 5 10 5 4. 15 10 15 20 NO 3 Směsný roztok 4 uvedený v tabulce 5 byl použit při porovnávání průtokových cel. Tab. 6: Použité směsné roztoky pro paralelní stanovení vybraných aniontů 2 Směsný roztok Koncentrace jednotlivých aniontů v mg/ l 2 SiO 3 Cl NO 2 1. 5 10 20 15 2. 10 20 15 10 3. 15 5 17 17 4. 17 8 10 8 5. 8 17 5 20 6. 20 15 8 5 NO 3 26

4.1.3 Přístrojové vybavení a zapojení systému při paralelním stanovení vybraných aniontů (SiO3 2, Cl, NO2, NO3 ) Pro paralelní stanovení vybraných iontů bylo použito přístrojového vybavení uvedené výše SIA systém I. Jako nosný proud byla použita demineralizovaná voda. Zapojení osmicestného selekčního ventilu popisuje následující obrázek. Obr.1: Schéma zapojení průtokové injekční sestavy pro paralelní stanovení dusitanů, dusičnanů chloridů a křemičitanů metodou SIA [34]. ( R= Činidla) 27

Příprava Kadmiové redukční kolony Kadmiová redukční kolona byla připravena pomocí kadmiových granulí o průměru 0,3 1,0 mm. Tyto granule byly promyty v 1M HCl a následně potaženy mědí ponořením na 1 minutu do roztoku síranu měďnatého (CuSO 4 ) o c= 20 g/l. Po promytí destilovanou vodou byly granule pomocí vakua naplněny do polypropylenové hadičky. Délka takto vzniklé kolony byla okolo 5 centimetrů o vnitřním průměru 2 milimetry. Oba konce hadičky byly utěsněny vatou. Kadmiová redukční kolona byla uchovávána v pufru uvedeném v přípravě roztoků [6]. Princip stanovení křemičitanů metodou SIA s fotometrickou detekcí Principem stanovení je reakce vzorku obsahujícího křemičitany s kyselým roztokem heptamolybdenanu (R1), který reaguje s křemičitany a fosforečnany za vzniku kyseliny molybdátokřemičité a kyseliny molybdátofosforečné. Kyselina molybdátofosforečná je rozložena roztokem kyseliny šťavelové (R2) a kyselina molybdátokřemičitá je redukována roztokem chloridu cínatého (R3) na molybdenovou modř. Výsledný produkt je měřitelný při vlnové délce 710 nm [30]. Princip stanovení chloridů metodou SIA s fotometrickou detekcí Principem stanovení chloridů ve vzorku je reakce roztoku činidla (R Cl) thiokyanatanu rtuťnatého s dusičnanem železitým. Thiokyanatanové ionty, které jsou vytěsněny chloridy, reagují s ionty Fe III za vzniku červeně zbarveného komplexu thiokyanatanu železitého. Absorbance tohoto komplexu je měřena při vlnové délce 465 nm [7]. Princip stanovení dusičnanů a dusitanů metodou SIA s fotometrickou detekcí Při stanovení dusičnanů a dusitanů byla použita kadmiová redukční kolona, která sloužila k redukci dusičnanů na dusitany. Dusičnany byly stanoveny společně s dusitany jako jejich suma. Princip stanovení dusitanů a dusičnanů byl odlišný, než byl uváděn v technických normách. Vzorek byl smísen s chromogenním činidlem sulfanylamidu a NED (R NO 2, NO 3 ). Výsledný produkt, který vznikl pomocí tzv. Grisseovy reakce, byl měřitelný při vlnové délce 540 nm [6]. 28

4.1.4 Kalibrační program pro paralelní stanovení dusitanů, dusičnanů, chloridů a křemičitanů metodou SIA Kalibrační program pro stanovení uvedených iontů byl podobný, jako v rigorózní práci Mgr. Anety Dundové Vývoj automatizovaného SIA systému pro paralelní stanovení vybraných aniontů [35]. Program byl postupně upraven, aby se předešlo chybám v odečítání dat pro stanovení jednotlivých iontů, které vznikaly během optimalizace paralelního stanovení. Proměřeno bylo několik směsných roztoků, které obsahovaly různé koncentrace měřených aniontů. Dle již výše uvedených ISO norem bylo dodrženo přibližně stejné kalibrační rozmezí, kde by hodnoty absorbance konečných produktů měly odpovídat lineárnímu rozmezí použitého spektrofotometru. Každý směsný roztok byl měřícím programem proměřen třikrát a jako výchozí absorbance byl hodnocen průměr těchto tří měření. Hodnota RSD (%) byla vyhodnocena programem FIAlab for Windows 5.0. Tab. 7: Kalibrační program pro paralelní stanovení dusitanů, dusičnanů, chloridů a křemičitanů v SIA systému Příkaz Parametr Vysvětlení pojmu Syringe Pump Command (?) KOR Základní nastavení pístové pumpy Hardware Settings Scan Rate (Hz) 20 Nastavení scanovací frekvence Loop Start (#) 3 Opakování celého cyklu třikrát po příkazu Loop End Syringe Pump Valve In Nastavení ventilu na pozici aspirace nosného proudu Syringe Pump Flowrate (microliter/sec) 150 Nastavení průtokové rychlosti aspirace pístovou pumpou Syringe Pump Aspirate (microliter) 2000 Aspirace nosného proudu Syringe Pump Valve Out Nastavení ventilu na pozici aspirace dalších zón Valve port analyt 1 Nastavení pozice portu pro aspiraci standardu (dusičnany) Syringe Pump Flowrate (microliter/sec) 30 Nastavení průtokové rychlosti aspirace standardu Syringe Pump Aspirate (microliter) nitrate 50 Aspirace standardu (dusičnany) Valve port kolona 7 Nastavení pozice portu pro redukční kolonu Syringe Pump Flowrate (microliter/sec) 15 Nastavení průtokové rychlosti toku do redukční kolony Syringe Pump Dispense (microliter) 70 Transport vzorku do redukční kolony 29

Delay (sec) 5 Doba setrvání vzorku v redukční koloně Valve port {spacer} 1 Nastavení pozice portu pro aspiraci spaceru Syringe Pump Flowrate (microliter/sec) 20 Nastavení průtokové rychlosti aspirace spaceru Syringe Pump Aspirate (microliter) 250 Aspirace spaceru Valve port 7 Nastavení pozice portu pro redukční kolonu Syringe Pump Flowrate (microliter/sec) 20 Nastavení průtokové rychlosti aspirace z redukční kolony Syringe Pump Aspirate (microliter) 40 Aspirace vzorku z redukční kolony Valve port nitrate reagent 2 Nastavení pozice portu pro aspiraci činidla (R NO 2, NO 3 ) Syringe Pump Flowrate (microliter/sec) 15 Nastavení průtokové rychlosti aspirace činidla (R NO 2, NO 3 Syringe Pump Aspirate (microliter) 20 Aspirace činidla (R NO 2, NO 3 ) ) Valve port 7 Nastavení pozice portu pro redukční kolonu Syringe Pump Flowrate (microliter/sec) 15 Nastavení průtokové rychlosti aspirace vzorku z redukční kolony Syringe Pump Aspirate (microliter) 50 Aspirace vzorku z redukční kolony Valve port {spacer} 1 Nastavení pozice portu pro aspiraci spaceru Syringe Pump Flowrate (microliter/sec) 10 Nastavení průtokové rychlosti aspirace spaceru Syringe Pump Aspirate (microliter) 250 Aspirace spaceru Valve port silicate 1 Nastavení pozice portu pro aspiraci standardu (křemičitany) Syringe Pump Flowrate (microliter/sec) 10 Nastavení průtokové rychlosti aspirace standardu Syringe Pump Aspirate (microliter) 60 Aspirace standardu Valve port reagent R1 4 Nastavení pozice portu pro aspiraci činidla R1 (křemičitany) 30

Syringe Pump Flowrate (microliter/sec) 15 Nastavení průtokové rychlosti aspirace činidla R1 Syringe Pump Aspirate (microliter) 40 Aspirace činidla R1 Valve port reagent R2 5 Nastavení pozice portu pro aspiraci činidla R2 (křemičitany) Syringe Pump Flowrate (microliter/sec) 15 Nastavení průtokové rychlosti aspirace činidla R2 Syringe Pump Aspirate (microliter) 50 Aspirace činidla R2 Valve port reagent R3 6 Nastavení pozice portu pro aspiraci činidla R3 (křemičitany) Syringe Pump Flowrate (microliter/sec) 15 Nastavení průtokové rychlosti aspirace činidla R3 Syringe Pump Aspirate (microliter) 65 Aspirace činidla R3 Valve port 8 Nastavení pozice portu průchodu zón přes detektor Loop Start (#) 2 Nastavení dvojnásobného mísení aspirovaných zón Syringe Pump Flowrate (microliter/sec) 15 Nastavení průtokové rychlosti mísení roztoků Syringe Pump Dispense (microliter) 65 Nastavení objemu pro mísení zón Syringe Pump Aspirate (microliter) 65 Nastavení aspirace objemu pro mísení zón Loop End Konec opakované akce Valve port {spacer} 1 Nastavení pozice portu pro aspiraci spaceru Syringe Pump Flowrate (microliter/sec) 15 Nastavení průtokové rychlosti aspirace spaceru Syringe Pump Aspirate (microliter) 250 Aspirace spaceru Valve port nitrite reagent 2 Nastavení pozice portu pro aspiraci činidla (R NO 2, NO 3 ) Syringe Pump Flowrate (microliter/sec) 15 Nastavení průtokové rychlosti aspirace činidla (R NO 2, NO 3 Syringe Pump Aspirate (microliter) 30 Aspirace činidla (R NO 2, NO 3 ) ) 31

Valve port nitrite 1 Nastavení pozice portu pro aspiraci standardu (dusitany) Syringe Pump Flowrate (microliter/sec) 20 Nastavení průtokové rychlosti aspirace standardu Syringe Pump Aspirate (microliter) nitrite 50 Aspirace standardu (dusitany) Valve port {spacer} 1 Nastavení pozice portu pro aspiraci spaceru Syringe Pump Flowrate (microliter/sec) 15 Nastavení průtokové rychlosti aspirace spaceru Syringe Pump Aspirate (microliter) 250 Aspirace spaceru Valve port chloride 1 Nastavení pozice portu pro aspiraci standardu (chloridy) Syringe Pump Flowrate (microliter/sec) 15 Nastavení průtokové rychlosti aspirace standardu Syringe Pump Aspirate (microliter) 50 Aspirace standardu (chloridy) Valve port chloride reagent 3 Nastavení pozice portu pro aspiraci činidla (chloridy) Syringe Pump Flowrate (microliter/sec) 20 Nastavení průtokové rychlosti aspirace činidla Syringe Pump Aspirate (microliter) 25 Aspirace činidla Valve port {spacer} 1 Nastavení pozice portu pro aspiraci spaceru Syringe Pump Flowrate (microliter/sec) 10 Nastavení průtokové rychlosti aspirace spaceru Syringe Pump Aspirate (microliter) 250 Aspirace spaceru Hardware Settings Wavelength 1 (nm) 710 Nastavení vlnové délky Hardware Settings Wavelength 2 (nm) 465 Nastavení vlnové délky Hardware Settings Wavelength 3 (nm) 540 Nastavení vlnové délky Analyte New Sample Analyte Name chloride+nitrite Označení vzorku Nastavení názvu zkoumaného vzorku Valve port 8 Nastavení pozice portu průchodu zón přes detektor Syringe Pump Flowrate (microliter/sec) 20 Nastavení průtokové rychlosti detektorem Syringe Pump Dispense (microliter) 750 Transport vzorku (chloridy + dusitany) přes detektor 32

Spectrometer Absorbance Scanning Analyte New Sample Analyte Name silicate+suma Nastavení snímání absorbance Označení vzorku Nastavení názvu zkoumaného vzorku Valve port 8 Nastavení pozice portu průchodu zón přes detektor Syringe Pump Empty Spectrometer Stop Scanning Valve port kolona Průchod všech zón v systému přes detektor při vypuštění celého objemu pístu Zastavení snímání absorbance 7 Nastavení pozice portu pro aspiraci přes redukční kolonu Syringe Pump Flowrate (microliter/sec) 20 Nastavení průtokové rychlosti aspirace přes redukční kolonu Syringe Pump Aspirate (microliter) 600 Aspirace vzorku (pufr) do redukční kolony Valve port 8 Nastavení pozice portu průchodu zón přes detektor Syringe Pump Flowrate (microliter/sec) 70 Nastavení průtokové rychlosti detektorem Syringe Pump Empty Syringe Pump Valve In Průchod všech zón v systému přes detektor při vypuštění celého objemu pístu Nastavení ventilu na pozici aspirace nosného proudu Syringe Pump Flowrate (microliter/sec) 150 Nastavení průtokové rychlosti aspirace pístové pumpy Syringe Pump Aspirate (microliter) 1000 Aspirace nosného proudu Syringe Pump Valve Out Nastavení ventilu na pozici aspirace dalších zón Valve port 8 Nastavení pozice portu průchodu přes detektor Syringe Pump Empty Loop End Průchod přes detektor při vypuštění celého objemu pístu Konec opakujícího se cyklu 33

Jako takzvaný spacer, byla použita analyzovaná voda, která sloužila k oddělení jednotlivých reakčních produktů. Použitý standard pro paralelní stanovení vždy obsahoval všechny stanovované ionty. 4.1.5 Porovnání průtokových cel V průběhu měření směsných roztoků, které obsahovaly různé koncentrace měřených aniontů, se vyskytovaly chyby v odečítání dat, které bylo třeba odstranit. Po mnoha optimalizacích a změnách podmínek ať už v měřícím programu, či v nastavení spektrofotometru, nebyly výsledné absorbance a tudíž ani koncentrace aniontů ve směsných roztocích stanoveny správně. Průtoková cela použita na začátku optimalizace měla optickou délku 10 mm. Byl vybrán směsný roztok 4 (viz. Tab. 5) k porovnání různých průtokových cel. Směsný roztok 4 byl proměřen měřícím programem třikrát a výsledné hodnoty absorbance, průměr měření a relativní směrodatné odchylky jsou uvedeny v odpovídajících tabulkách níže. K porovnání byly použity průtokové cely s optickou délkou 10 mm, průtoková cela kapilární 10 mm a průtoková cela s optickou délkou 20 mm. Při detekci v různých průtokových celách bylo potřeba upravit nastavení spektrofotometru. Úpravy obnášely změnu integračního času (dále jen IT), nebo změnu referenčního spektra pomocí zastínění lampy tmavým sklíčkem. Podle výsledků měření byla vybrána průtoková cela, která byla nejvíce vhodná k dalšímu měření směsných roztoků. Porovnávalo se rozlišení jednotlivých aniontů v grafickém zobrazení záznamu detektoru. Měřící program pro stanovení aniontů byl stejný, jak již byl uvedený výše. Po porovnání výsledků a grafů byla jako nejvhodnější vybrána průtoková cela s optickou délkou 20 mm. Během měření s touto průtokovou celou byl zkrácen Integrační čas z původních IT = 120 ms, na IT = 60 ms. Výsledné hodnoty absorbance byly při dalším měření menší a byla tak dodržena linearita pracovního rozsahu spektrofotometru. 34

Průtoková cela s optickou délkou 10 mm Nastavení spektrofotometru IT = 30 ms. Tab. 8: Výsledky měření směsného roztoku 4 průtokovou celou s optickou délkou 10 mm. Měření Absorbance (λ = 710 nm, 540 nm, 465 nm) 2 SiO 3 Cl NO 2 NO 3 1. 1,289 0,548 0,626 2,295 2. 0,871 0,302 0,226 2,306 3. 0,758 2,275 Průměr 0,973 0,425 0,426 2,292 RSD (%) 23,506 12,300 20,000 0,574 Obr. 2: Grafické zobrazení měření směsného roztoku 4 průtokovou celou s optickou délkou 10 mm (kanál 1 = stanovení SiO 3 2 při 710 nm, kanál 2 = stanovení Cl při 465nm a kanál 3 = stanovení NO 2 a NO 3 při 540 nm). 35

Kapilární průtoková cela (10 mm) Nastavení spektrofotometru IT = 30 ms. Tab. 9: Výsledky měření směsného roztoku 4 Kapilární průtokovou celou (10 mm). Měření Absorbance (λ = 710 nm, 540 nm, 465 nm) 2 SiO 3 Cl NO 2 NO 3 1. 0,916 0,825 0,161 1,996 2. 1,026 0,860 0,311 2,248 3. 1,004 0,818 0,280 2,092 Průměr 0,982 0,834 0,251 2,112 RSD (%) 4,812 2,166 24,874 4,916 Obr. 3: Grafické zobrazení měření směsného roztoku 4 kapilární průtokovou celou (10 mm) (kanál 1 = stanovení SiO 3 2 při 710 nm, kanál 2 = stanovení Cl při 465nm a kanál 3 = stanovení NO 2 a NO 3 při 540 nm). 36

Průtoková cela s optickou délkou 20 mm Nastavení spektrofotometru IT = 120 ms, nastavení referenčního spektra pomocí tmavého sklíčka na výstupu zdroje světelného záření. Tab. 10: Výsledky měření směsného roztoku 4 průtokovou celou s optickou délkou 20 mm. Měření Absorbance (λ = 710 nm, 540 nm, 465 nm) 2 SiO 3 Cl NO 2 NO 3 1. 0,996 0,492 0,741 2,559 2. 1,104 0,410 0,739 2,435 3. 1,124 0,400 0,699 2,596 Průměr 1,075 0,434 0,726 2,530 RSD (%) 5,254 4,122 1,935 1,256 Obr. 4: Grafické zobrazení měření směsného roztoku 4 průtokovou celou s optickou délkou 20 mm(kanál 1 = stanovení SiO 3 2 při 710 nm, kanál 2 = stanovení Cl při 465nm a kanál 3 = stanovení NO 2 a NO 3 při 540 nm). 37

4.1.6 Kalibrační závislosti K měření kalibračních závislostí bylo připraveno několik směsných roztoků, jejichž příprava a výsledné koncentrace jsou uvedeny v kapitole 4.1.2 Příprava roztoků. Kalibrační program pro měření iontů proměřil každý roztok třikrát a výsledná hodnota absorbance daného iontu byla brána z průměru těchto tří měření. Naměřené hodnoty jsou uvedeny v následujících tabulkách. Po porovnání jednotlivých průtokových cel byla použita průtoková cela s optickou délkou 20 mm, IT 120 ms a nastavení referenčního spektra pomocí tmavého sklíčka ve viditelné lampě. Paralelní stanovení vybraných aniontů 1 Tab. 11: Výsledné hodnoty absorbance směsného roztoku 1 Aniont Koncentrace (mg/ l) Průměrná Absorbance RSD (%) 2 SiO 3 10 0,781 9,068 Cl 20 1,460 6,991 NO 2 5 0,622 12,394 NO 3 10 1,665 3,593 Tab. 12: Výsledné hodnoty absorbance směsného roztoku 2 Aniont Koncentrace (mg/ l) Průměrná Absorbance RSD (%) 2 SiO 3 5 0,687 10,928 Cl 30 1,788 4,808 NO 2 20 0,781 11,393 NO 3 15 2,066 1,742 Tab. 13: Výsledné hodnoty absorbance směsného roztoku 3 Aniont Koncentrace (mg/ l) Průměrná Absorbance RSD (%) 2 SiO 3 20 0,974 17,643 Cl 5 1,615 9,635 NO 2 10 0,708 4,351 NO 3 5 1,943 4,295 38

Tab. 14: Výsledné hodnoty absorbance směsného roztoku 4 Aniont Koncentrace (mg/ l) Průměrná Absorbance RSD (%) 2 SiO 3 15 0,828 6,650 Cl 10 1,586 7,991 NO 2 15 0,749 10,071 NO 3 20 2,120 9,097 Po proměření průtokovou celou 20 mm docházelo k vychýlení některých hodnot absorbance vzhledem k patřičné koncentraci aniontů ve směsných roztocích. Naměřené hodnoty absorbance křemičitanů (SiO 3 2 ) a dusitanů (NO 2 ) nejlépe odpovídaly koncentracím ve směsných roztocích. Jejich grafické vyjádření uvádím níže (jako zkrácené kalibrační závislosti). Obr. 5: Kalibrační závislost křemičitanů ( c= 520 mg/ l) 39

Obr. 6: Kalibrační závislost dusitanů ( c= 520 mg/ l) Naměřené hodnoty absorbance, při použití průtokové cely s optickou délkou 20 mm, byly poměrně vysoké. Původní integrační čas IT = 120 ms, byl zkrácen na IT = 60 ms. Nastavení referenčního spektra bylo provedeno opět pomocí tmavého sklíčka v lampě. Následně byl proměřen směsný roztok 4 a porovnány výsledné hodnoty absorbance při použití těchto dvou integračních časů. Tab. 15: Výsledné hodnoty absorbance směsného roztoku 4 při měření průtokovou celou s optickou délkou 20 mm, IT = 120 ms a IT = 60 ms Aniont Koncentrace (mg/ l) Průměrná Absorbance při IT = 120 ms RSD (%) Průměrná Absorbance při IT = 60 ms RSD (%) 15 1,107 7,782 0,656 2,285 Cl 10 1,858 3,278 1,084 0,361 NO 2 15 0,597 9,344 0,294 4,338 NO 3 20 2,010 1,471 1,443 1,234 SiO 3 2 Po srovnání a snížení hodnot maximální absorbance, byly připraveny nové směsné roztoky (viz Tab. 6) 40

Paralelní stanovení vybraných aniontů 2 K měření byla použita průtoková cela s optickou délkou 20 mm, IT = 60 ms, nastavení referenčního spektra proběhlo pomocí tmavého sklíčka v lampě. Použité směsné roztoky jsou uvedeny v Tab. 5. Tab. 16: Výsledné hodnoty absorbance směsného roztoku 1 Aniont Koncentrace (mg/ l) Průměrná Absorbance RSD (%) 2 SiO 3 5 0,534 7,858 Cl 10 1,139 4,976 NO 2 20 0,170 12,621 NO 3 15 1,616 3,509 Tab. 17: Výsledné hodnoty absorbance směsného roztoku 2 Aniont Koncentrace (mg/ l) Průměrná Absorbance RSD (%) 2 SiO 3 10 0,626 2,137 Cl 20 0,953 5,379 NO 2 15 0,252 8,850 NO 3 10 1,551 0,611 Tab. 18: Výsledné hodnoty absorbance směsného roztoku 3 Aniont Koncentrace (mg/ l) Průměrná Absorbance RSD (%) 2 SiO 3 15 0,636 0,932 Cl 5 1,087 5,626 NO 2 17 0,271 12,403 NO 3 17 1,669 3,688 Tab. 19: Výsledné hodnoty absorbance směsného roztoku 4 Aniont Koncentrace (mg/ l) Průměrná Absorbance RSD (%) 2 SiO 3 17 0,552 3,962 Cl 8 0,769 1,530 NO 2 10 0,215 17,678 NO 3 8 1,492 5,872 41

Tab. 20: Výsledné hodnoty absorbance směsného roztoku 5 Aniont Koncentrace (mg/ l) Průměrná Absorbance RSD (%) 2 SiO 3 8 0,430 7,961 Cl 17 0,529 0,729 NO 2 5 0,248 5,742 NO 3 20 1,342 5,096 Tab. 21: Výsledné hodnoty absorbance směsného roztoku 6 Aniont Koncentrace (mg/ l) Průměrná Absorbance RSD (%) 2 SiO 3 20 0,632 4,643 Cl 15 0,492 29,795 NO 2 8 0,146 12,231 NO 3 5 1,520 3,752 42

Tab. 22: Porovnání naměřených absorbancí se skutečnou koncentrací jednotlivých aniontů ve směsných roztocích pro paralelní stanovení 2. SiO 3 2 Koncentrace (mg/ l) Průměrná Absorbance RSD (%) 5 0,534 7,858 8 0,529 7,961 10 0,626 2,137 15 0,636 0,932 17 0,552 3,962 20 0,632 4,643 Cl 5 1,087 5,626 8 0,769 1,530 10 1,139 4,976 15 0,492 29,795 17 0,430 0,729 20 0,953 5,379 NO 2 5 0,248 5,742 8 0,146 12,231 10 0,215 17,678 15 0,252 8,850 17 0,271 12,403 20 0,170 12,621 NO 3 5 1,520 3,752 8 1,492 5,872 10 1,551 0,611 15 1,616 3,509 17 1,669 3,688 20 1,342 5,096 Z uvedených hodnot vyplývá, že naměřené hodnoty absorbance neodpovídaly skutečným koncentracím aniontů. Tudíž ani grafické vyjádření závislosti absorbance na koncentraci nebylo správné a proto jej zde neuvádím. Jednotlivé anionty obsažené ve směsných roztocích navzájem neumožňovaly jejich správné stanovení. Paralelní stanovení aniontů metodou SIA proto bylo zúženo na stanovení dusitanů a dusičnanů. 43

4.2 Paralelní stanovení dusitanů a dusičnanů Přístrojové zařízení SIA systém II (FIAlab 3000, FIAlab Instruments, USA) použitý pro stanovení koncentrací dusitanů a dusičnanů byl stejný jako přístrojové vybavení uvedené výše. Při měření byla navíc využita i peristaltická pumpa. Tato pumpa sloužila k dávkování diazotačního a kopulačního činidla. Sestava obsahovala také Kadmiovou redukční kolonu. 4.2.1 Použité chemikálie Všechny použité chemikálie k přípravě roztoků, činidla a nosného proudu byly jakosti vhodné pro stanovení daných iontů. Tab. 23: Přehled použitých chemikálií pro stanovení dusičnanů a dusitanů Chemikálie Dodavatel Sulfanilamid Léčiva a.s., Praha N (1naphtyl) ethylendiamin dichlorid Loba Feinchemie, Německo Kyselina fosforečná 85 % Kyselina chlorovodíková, 35%, c(hcl) = 1M Síran měďnatý, c (CuSO 4 ) = 20g/ l Dusičnan sodný, NaNO 3 Dusitan sodný, NaNO 2 Chlorid Amonný, NH 4 Cl Dihydrát disodné soli kyseliny ethylendiamintetraoctové, Na 2 EDTA Tetraboritan sodný, Na 2 B 4 O 7 LachNer, s.r.o., Neratovice Penta, Praha Balex, Pardubice Penta, Praha Penta, Praha Penta, Praha Penta, Praha Penta, Praha 44

4.2.2 Příprava roztoků K přípravě činidla, nosného proudu a zásobních roztoků dusičnanů a dusitanů byly použity chemikálie uvedeny výše. Pro doplnění objemů byla použita demineralizovaná voda. Diazotační a kopulační činidlo Činidlo pro stanovení dusičnanů i dusitanů bylo připraveno rozpuštěním 5 g sulfanilamidu a 0,5 g N(1naphtyl)ethylendiamin dichloridu v 50 ml 85% kyseliny fosforečné. Tento roztok byl následně doplněn demineralizovanou vodou do 500 ml. Činidlo bylo uchováváno v tmavé lahvi a v lednici. Stálost činidla byla 1 měsíc. Nosný proud Nosný proud byl připraven rozpuštěním 16 g chloridu amonného (NH 4 Cl), rozpuštěním 3 g tetraboritanu sodného (Na 2 B 4 O 7 ) a 0,8 g chelatonu 3 (Na 2 EDTA) v destilované vodě. Roztok byl doplněn do 1000 ml destilovanou vodou a přefiltrován pomocí filtračního papíru. Uchováván byl v tmavé lahvi v lednici. Zásobní roztok dusitanů Přibližně 15 mg dusičnanu sodného bylo rozpuštěno v 50 ml vody. Objem byl doplněn vodou do 100 ml odměrné baňky. Zásobní roztok dusičnanů Přibližně 13,7 mg dusitanu sodného bylo rozpuštěno v 50 ml vody a potřebný objem byl doplněn po rysku vodou do 100 ml odměrné baňky. Kalibrační roztoky Kalibrační roztoky byly připravovány ze zásobních roztoků dusičnanů a dusitanů. Potřebný objem byl doplněn demineralizovanou vodou. Použitý kalibrační rozsah byl u dusitanů od c = 1 až 10 mg/l a u dusičnanů od c = 5 až 50 mg/l. 45

4.2.3 Přístrojové zapojení systému při paralelním stanovení dusitanů a dusičnanů metodou SIA Přístrojové vybavení použité při paralelním stanovení dusitanů a dusičnanů je uvedeno výše. SIA systém II obsahoval navíc peristaltickou pumpu a kadmiová redukční kolona byla zapojena odlišným způsobem než v SIA systému I. Také mísící cívka použita v tomto systému byla jiné délky (200 cm), než v systému I. Jako nosný proud byl použit roztok uvedený v kapitole 4.2.2 Příprava roztoků. Popis přípravy kadmiové redukční kolonky, stejně jako princip stanovení dusitanů a dusičnanů je uveden v kapitole 4.1.3. Přístrojové vybavení a zapojení systému při paralelním stanovení vybraných aniontů (SiO 2 3, Cl, NO 2, NO 3 ). Přístrojové vybavení odpovídá systému při paralelním stanovení vybraných aniontů (SiO 2 3, Cl, NO 2, NO 3 ) Zapojení jednotlivých portů je uvedeno na obr. 7. Obr. 7: Schéma přístrojového zapojení SIA systému při paralelním stanovení dusitanů a dusičnanů [36]. 46

4.2.4 Kalibrační program pro paralelní stanovení dusitanů a dusičnanů metodou SIA Kalibrační a směsné roztoky byly měřícím programem proměřeny třikrát. Jako výchozí absorbance byl hodnocen průměr těchto tří měření. Hodnota RSD (%) byla vyhodnocena programem FIAlab for Windows 5.0. Tab. 24: Kalibrační program pro paralelní stanovení dusitanů a dusičnanů metodou SIA Příkaz Parametr Vysvětlení pojmu Syringe Pump Command KOR Základní nastavení pístové pumpy Loop Start 3 Počet opakování celého cyklu Syringe Pump Valve In Nastavení ventilu na pozici aspirace nosného proudu Syringe Pump Flowrate (µl/sec) 100 Nastavení průtokové rychlosti aspirace pístové pumpy Syringe Pump Aspirate (µl) 2000 Aspirace nosného proudu Syringe Pump Valve Out Nastavení ventilu na pozici aspirace dalších zón Valve port 5 Nastavení pozice portu pro aspiraci vzorku (dusitany i dusičnany) Analyte New Sample Označení vzorku Syringe Pump Flowrate (µl/sec) 25 Nastavení průtokové rychlosti aspirace vzorku Syringe Pump Aspirate (µl) 50 Aspirace vzorku Valve port 7 Nastavení pozice portu pro aspiraci činidla (R NO 2, NO 3 ) Analyte New Sample Analyte Name dusicnan Označení vzorku Nastavení názvu zkoumaného vzorku Syringe Pump Flowrate (µl/sec) 50 Nastavení průtokové rychlosti aspirace činidla (R NO 2, NO 3 ) Peristaltic Pump On Zapnutí peristaltické pumpy Peristaltic Pump CounterClockwise 40% Nastavení maximální rychlosti peristaltické pumpy Syringe Pump Empty Průchod všech zón v systému přes detektor při vypuštění celého objemu pístu Delay (sec) 3 Doba pobytu vzorku v spektrofotometru Spectrometer Reference Scan Nastavení snímání referenčního spektrra 47

Spectrometer Absorbance Scanning Peristaltic Pump Off Spectrometer Stop Scanning Loop End Nastavení snímání absorbance Vypnutí peristaltické pumpy Zastavení snímání absorbance Konec opakujícího se cyklu V měřícím programu bylo měněno nastavení portů podle toho, zda byly měřeny dusitany, nebo dusičnany. Dusitany byly měřeny přes port č. 7 a neprocházely kadmiovou redukční kolonou. Dusičnany (suma dusitanů a dusičnanů) byly měřeny pomocí portu č. 8 a procházely přes kadmiovou redukční kolonu, jak vyplývá z obr. 7. 4.2.5 Kalibrační závislosti dusitanů a dusičnanů K zjištění kalibrační závislosti byly použity roztoky, kde c NO 2 = 110 mg/ l a c NO 3 = 5 50 mg/ l. Optimální vlnová délka pro měření výsledných produktů dusitanů a dusičnanů byla 545 nm. Nastavení referenčního spektra spektrofotometru bylo provedeno pomocí tmavého sklíčka v lampě a Integrační čas byl IT = 10 ms. Po optimalizaci měření metodou SIA byly proměřeny kalibrační roztoky v uvedených koncentracích kalibračním programem třikrát. Průměrná absorbance a hodnoty RSD (%) jsou uvedeny v následujících tabulkách. Kalibrační závislost dusitanů a dusičnanů je uvedena v jednotlivých grafických vyjádřeních. Detekční limit detektoru (LOD) při stanovení dusitanů bez průchodu vzorku kadmiovou kolonou byl 0,7472 mg/l. Kvantifikační limit detektoru (LOQ) byl 2,4911 mg/l. Detekční limit detektoru při stanovení dusitanů a při průchodu vzorku kadmiovou redukční celou byl 0,4286 mg/l. Kvantifikační limit detektoru byl 1,4290 mg/l. Detekční limit detektoru při stanovení dusičnanů byl 1,6753 mg/l. Kvantifikační limit při stanovení dusičnanů byl 5,5840 mg/l. Kalibrační závislost dusitanů Roztoky k měření kalibrační závislosti dusitanů byly proměřeny v kalibračním měřícím programu bez průchodu kadmiovou redukční kolonou. Pro porovnání byly tyto roztoky dusitanů proměřeny kalibračním programem i s průchodem kadmiovou redukční kolonou, aby bylo ověřeno, jaká koncentrace dusitanů by v reálných vzorcích se současným obsahem dusičnanů způsobila změnu signálu odpovídajícího sumě dusitanů a dusičnanů. Potom by bylo nutné použít obě kalibrační závislosti pro správné určení obsahu dusičnanů. 48

Tab. 25: Výsledné hodnoty kalibrační závislosti dusitanů bez průchodu kalibračních roztoků kadmiovou redukční kolonou Koncentrace NO 2 (mg/ l) Průměrná Absorbance RSD (%) 1 0,091 5,688 2 0,129 4,810 5 0,444 2,438 8 0,693 2,051 10 0,834 1,298 Obr. 8: Kalibrační závislost dusitanů (c = 1 10 mg/l) Tab. 26: Výsledné hodnoty kalibrační závislosti dusitanů při průchodu kalibračních roztoků kadmiovou redukční kolonou Koncentrace NO 2 (mg/ l) Průměrná Absorbance RSD (%) 1 0,048 11,707 2 0,112 2,891 5 0,225 1,974 8 0,424 2,614 10 0,528 4,375 49

Obr. 9: Kalibrační závislost dusitanů (c = 1 10 mg/l) Kalibrační závislost dusičnanů Kalibrační závislosti dusičnanů byly proměřeny v kalibračním měřícím programu při průchodu kadmiovou redukční kolonou jako suma dusičnanů a dusitanů. Tab. 27: Výsledné hodnoty kalibrační závislosti dusičnanů Koncentrace NO 3 (mg/ l) Průměrná Absorbance RSD (%) 5 0,132 4,008 10 0,285 2,413 15 0,416 3,911 25 0,569 4,423 50 1,201 1,019 50

Obr. 10: Kalibrační závislost dusičnanů (c = 5 50 mg/l) 4.2.6 Opakovatelnost paralelního stanovení NO2 a NO3 Pro měření opakovatelnosti byly vybrány roztoky o c NO 2 = 5 mg/l a c NO 3 = 25 mg/l. Tyto roztoky byly proměřeny kalibračním programem v jedné sérii opakování desetkrát za optimálních podmínek. Hodnoty absorbance, její průměr a RSD jsou uvedeny v následující tabulce. Tab. 28: Opakovatelnost měření dusitanů (c NO 2 = 5 mg/l ) a dusičnanů (c NO 3 = 25 mg/l) Měření Absorbance (545 nm) NO 2 51 NO 3 1. 0,366 0,722 2. 0,440 0,615 3. 0,435 0,615 4. 0,430 0,579 5. 0,443 0,592 6. 0,417 0,586 7. 0,432 0,573 8. 0,417 0,579 9. 0,458 0,543 10. 0,442 0,536 Průměr 0,428 0,594 RSD (%) 5,532 8,282

Obr. 11: Záznam opakovatelnosti paralelního stanovení NO 2 (c = 5 mg/l) Obr. 12: Záznam opakovatelnosti paralelního stanovení NO 3 (c = 25 mg/l) 52