UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ KATEDRA ANALYTICKÉ CHEMIE DIPLOMOVÁ PRÁCE

Transkript

1 UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ KATEDRA ANALYTICKÉ CHEMIE DIPLOMOVÁ PRÁCE STANOVENÍ DUSIČNANŮ A DUSITANŮ METODOU SIA VEDOUCÍ DIPLOMOVÉ PRÁCE: RNDr. Dalibor Šatínský, PhD. Hradec Králové 2009 Helena Kymlová

2 Prohlašuji, ţe tuto diplomovou práci jsem vypracovala samostatně a ţe veškeré uvedené zdroje jsou řádně citované a uvedené v seznamu pouţité literatury. 2

3 Ráda bych poděkovala vedoucímu mé diplomové práce RNDr. Daliborovi Šatínskému, PhD. za odborné vedení, ochotu a pomoc při vypracování a sepisování této diplomové práce a dále bych chtěla poděkovat i celému kolektivu katedry analytické chemie. 3

4 ABSTRAKT Byla vyvinuta nová metoda SIA pro současné stanovení dusitanů a dusičnanů. Dusitany byly analyzovány pouţitím Griessovy reakce. Dusičnany byly stanoveny po jejich redukci na dusitany v kadmiové koloně. Absorbance byla měřena při absorpčním maximu při 540 nm. Optimální podmínky pro analýzu: rychlost peristaltické pumpy pro stanovení dusitanů i dusičnanů 40 % maximální rychlosti pumpy; rychlost pístové pumpy pro dusitany i dusičnany 50 µl.s -1 ; dávkovaný objem dusitanů i dusičnanů 150 µl. Optimální čas redukce dusičnanů je při 0 s, tedy prostém průtoku dusičnanů redukční kolonou. Metoda byla pouţita pro analýzu dusitanů a dusičnanů ve vzorcích vod Fromin, Bonaqua, Rajec, Mattoni, hradecká voda. Hodnoty byly porovnány s hodnotami deklarovanými výrobci. Vyvinutá metoda SIA pro současné stanovení dusitanů a dusičnanů je pouţívána jako nová praktická úloha v předmětu Speciální metody instrumentální analýzy. 4

5 ABSTRACT New SIA method was developed for simultaneous determination of nitrites and nitrates. Nitrites were analyzed by Griess reaction. Nitrates were determined after their reduction to nitrites in cadmium column. Absorbance was measured at maximum of absorption 540 nm. Optimal conditions for analysis: speed of peristaltic pump is 40 % of its maximal speed, speed of syringe pump is 50 µl.s -1, sample volume of nitrites and nitrates is 150 µl. Optimal time for reduction of nitrates is 0 sec, it means during their flow through cadmium column. Method was used for analysis of nitrites and nitrates in samples of waters: Fromin, Bonaqua, Rajec, Mattoni and tap water in Hradec Králové. Obtained values were compared with values declared by producers. New SIA method for simultaneous determination of nitrites and nitrates is used in subject Special methods of instrumental analysis as a new practical task. 5

6 OBSAH ABSTRAKT 4 ABSTRACT 5 SEZNAM OBRÁZKŮ 8 SEZNAM TABULEK 9 SEZNAM ZKRATEK ÚVOD A CÍL PRÁCE ÚVOD PRÁCE CÍL PRÁCE TEORETICKÁ ČÁST PRŮTOKOVÉ ANALYTICKÉ METODY Průtoková injekční analýza Sekvenční injekční analýza DUSIČNANY A DUSITANY Metody stanovení dusičnanů a dusitanů EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST POUŢITÉ PŘÍSTROJE CHEMIKÁLIE PŘÍPRAVA ROZTOKŮ PŘÍPRAVA KOLONY POSTUP VÝSLEDKY A DISKUSE OPTIMALIZACE PARAMETRŮ Optimalizace rychlosti peristaltické pumpy při stanovení dusitanu Optimalizace rychlosti pístové pumpy při stanovení dusitanu Optimalizace dávkovaného objemu roztoku dusitanu Optimalizace rychlosti pístové pumpy při stanovení dusičnanu Optimalizace dávkovaného objemu roztoku dusičnanu Optimalizace času redukce dusičnanu sodného Vliv pohybu vzorku v redukční koloně STANOVENÍ LINEARITY ODEZVY Kalibrační křivka dusitanu sodného 46 6

7 Kalibrační křivka dusičnanu sodného OPAKOVATELNOST MĚŘENÍ PRO RŮZNÉ KONCENTRACE STANOVENÍ LIMITU DETEKCE STUDIUM INTERFERENCÍ ÚČINNOST REDUKTORU ANALÝZA VOD STANOVENÍ DUSITANŮ A DUSIČNANŮ V REÁLNÝCH VZORCÍCH ZÁVĚR LITERATURA 57 7

8 SEZNAM OBRÁZKŮ Obrázek 1: Průtoková injekční analýza 16 Obrázek 2: Průtokový injekční kontinuální tok 16 Obrázek 3: Sekvenční injekční analýza 18 Obrázek 4: Schéma zapojení průtokového systému SIA analyzátoru 26 Obrázek 5: Záznam měření dusitanu sodného a dusičnanu sodného 3x se opakujícím měřícím cyklem 29 Obrázek 6: Záznam měření optimalizace rychlosti peristaltické pumpy při stanovení dusitanu 32 Obrázek 7: Záznam měření optimalizace rychlosti pístové pumpy při stanovení dusitanu 34 Obrázek 8: Záznam měření optimalizace dávkovaného objemu roztoku dusitanu 36 Obrázek 9: Záznam měření optimalizace rychlosti pístové pumpy při stanovení dusičnanu 38 Obrázek 10: Záznam měření optimalizace dávkovaného objemu roztoku dusičnanu 40 Obrázek 11: Záznam měření optimalizace času redukce dusičnanu sodného 42 Obrázek 12: Záznam měření vlivu pohybu vzorku v redukční koloně 44 Obrázek 13: Kalibrační křivka pro dusitan sodný 46 Obrázek 14: Kalibrační křivka pro dusičnan sodný 47 Obrázek 15: Vzorec použitý pro výpočet relativní směrodatné odchylky 48 Obrázek 16: Limit detekce 50 Obrázek 17: Vzorec pro výpočet míry interference 51 Obrázek 18: Vzorec pro výpočet účinnosti reduktoru 53 8

9 SEZNAM TABULEK Tabulka 1: Schéma programu analýzy převzaté z přístroje FIAlab 3000 automatický SIA systém (FIAlab Instruments, USA), Software FIAlab for Windows Tabulka 2: Hodnoty měření optimalizace rychlosti peristaltické pumpy při stanovení dusitanu 31 Tabulka 3: Hodnoty měření optimalizace rychlosti pístové pumpy při stanovení dusitanu 33 Tabulka 4: Hodnoty měření optimalizace dávkovaného objemu roztoku dusitanu 35 Tabulka 5: Hodnoty měření optimalizace rychlosti pístové pumpy při stanovení dusičnanu 37 Tabulka 6: Hodnoty měření optimalizace dávkovaného objemu roztoku dusičnanu 39 Tabulka 7: Hodnoty měření optimalizace času redukce dusičnanu sodného 41 Tabulka 8: Hodnoty měření vlivu pohybu vzorku v redukční koloně 43 Tabulka 9: Naměřené hodnoty pro kalibrační křivku dusitanu sodného 46 Tabulka 10: Data pro kalibrační křivku dusitanu sodného 46 Tabulka 11: Naměřené hodnoty pro kalibrační křivku dusičnanu sodného 47 Tabulka 12: Data pro kalibrační křivku dusičnanu sodného 47 Tabulka 13: Výsledky opakovatelnosti měření dusitanu sodného 48 Tabulka 14: Výsledky opakovatelnosti měření dusičnanu sodného 49 Tabulka 15: Hodnoty měření interference na Cd koloně 51 Tabulka 16: Hodnoty měření interference na Zn koloně 52 Tabulka 17: Porovnání deklarovaných a naměřených hodnot koncentrací dusitanů a dusičnanů 54 9

10 SEZNAM ZKRATEK A AAS FIA FRVŠ GC Hb HPLC ICP-AES ICP-MS IR methb NED PTFE RSD SIA UV/VIS absorbance atomová absorpční spektrometrie průtoková injekční analýza (Flow Injection Analysis) fond rozvoje vysokých škol plynová chromatografie (Gas chromatography) hemoglobin vysokoúčinná kapalinová chromatografie (High Performance Liquid Chromatography) atomová emisní spektrometrie s indukčně vázaným plazmovým budícím zdrojem (Inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy) hmotnostní spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem (Inductively coupled plasma mass spectroscopy) infračervená detekce (infrared) methemoglobin N-(1-naftyl)ethylendiamindichlorid polytetrafluoroethylen relativní směrodatná odchylka sekvenční injekční analýza (Sequential Injection Analysis) ultrafialová/viditelná detekce (ultraviolet/visible) 10

11 1. ÚVOD A CÍL PRÁCE 11

12 1.1. ÚVOD PRÁCE Stanovení dusitanů a dusičnanů ve vodě hraje významnou roli především z toxikologického hlediska. Tyto ionty mají velký vliv na vznik methemoglobinémie, coţ má za následek neschopnost hemoglobinu přenášet kyslík. Často pouţívanou metodou pro stanovení dusitanů a dusičnanů je sekvenční injekční analýza (SIA). Tato metoda je jednoduchá, rychlá, všestranná, citlivá a plně automatizovaná s nízkou spotřebou vzorků a činidel. V této diplomové práci jsem vycházela z práce Automated simultaneous monitoring of nitrate and nitrite in surface water by sequential injection analysis autorů Zlatuše Legnerové, Petra Solicha, Hany Sklenářové, Dalibora Šatínského a Rolfa Karlíčka s cílem zdokonalit jimi pouţitou a popsanou metodu SIA pro současné stanovení dusičnanů a dusitanů ve vodě. Zdokonalení spočívalo v jednodušším zapojení jednotlivých součástí systému a následné optimalizaci jednotlivých parametrů měření. 12

13 1.2. CÍL PRÁCE Cílem této diplomové práce bylo vyvinout novou SIA metodu pro současné stanovení dusitanů a dusičnanů. Tato práce byla součástí výzkumného projektu FRVŠ, jehoţ cílem bylo vytvořit novou praktickou úlohu do předmětu Speciální metody instrumentální analýzy. 13

14 2. TEORETICKÁ ČÁST 14

15 2.1. PRŮTOKOVÉ ANALYTICKÉ METODY Průtoková injekční analýza a sekvenční injekční analýza jsou dvě související analytické techniky zaloţené na mikroprůtokovém zpracování vzorků a činidel. Vzorky jsou injikovány do nosného/reakčního roztoku, který transportuje zónu vzorku do detektoru, zatímco probíhá ţádaná (bio)chemická reakce. Odezva detektoru (absorbance, fluorescence, hmotnostní spektrometrie atd.) přináší kalibrační křivku kvantifikující výsledný analyt. [ 1 ] PRŮTOKOVÁ INJEKČNÍ ANALÝZA FIA (Průtoková injekční analýza) byla definována Růţičkou a Hansenem v roce [ 2 ] Jedná se o první generaci FIA techniky a pravděpodobně nejpouţívanější metodu. Ve své nejjednodušší formě je zóna vzorku injikována do toku nosného proudu činidla. Zatímco se injikovaná zóna pohybuje po proudu, roztok vzorku je dispergován do činidla, coţ způsobuje vznik produktu. Tok detektorem umístěným po proudu, zaznamenává poţadované fyzikální parametry, jako jsou kolorimetrická absorbance nebo fluorescence. Typické FIA zařízení se skládá z vysoce kvalitní multikanálové peristaltické pumpy, injekčního ventilu, reakční cívky, detektoru, jako je například fotometrická průtoková cela, automatického dávkovače a hadičkového zařízení. [ 1, 2 ] Pumpa pohání jeden či více toků detektorem prostřednictvím úzkých (0,5 0,8 mm vnitřního průměru) hadiček. Tyto toky mohou být činidla, rozpouštědla nebo nějaké jiné medium jako například pufr. Injekční ventil je pouţit k periodickému zavedení malého objemu (obvykle < 100 µl) vzorku do nosného toku. Zatímco je vzorek unášen do detektoru, měnící se dynamika toku skrz úzké hadičky mísí vzorek a činidlo, coţ vede k chemické reakci a vzniku detekovatelného produktu. Produkt je snímán detektorem jako pík. Výška a plocha píku jsou úměrné koncentraci a jsou pouţívány ke kvantifikaci koncentrace sloučeniny stanovené porovnáním se vzorkem o známé koncentraci (kalibrační křivka). Detekce je nejčastěji fotometrická (UV/VIS a poslední dobou IR). Na poli vědy získávají popularitu různé luminiscenční techniky. Elektrochemické techniky jako amperometrie a potenciometrie dosahují oţivení spojením s průtokovými technikami, 15

16 jako jsou FIA a SIA. Stejně AAS, ICP-MS a ICP-AES a GC mohou být spojeny se zařízeními FIA a SIA. [ 2 ] Obrázek 1: Průtoková injekční analýza Obrázek 2: Průtokový injekční kontinuální tok 16

17 SEKVENČNÍ INJEKČNÍ ANALÝZA Sekvenční injekční analýza (SIA) je nová generace FIA a byla definována Růţičkou a Marshallem v roce SIA je obvykle sloţena z jednokanálové vysoce přesné dvousměrné pumpy, mísící cívky, vícecestného ventilu a průtokového detektoru. Systém je nejprve plněn nosným proudem, ve kterém jsou zóny vzorku a činidel odděleně aspirovány do mísící cívky, tvořící lineární zásobník. Tyto zóny jsou překrývány díky parabolickému profilu indukovanému rozdíly mezi průtokovými rychlostmi sousedních toků. Zpětný tok a zrychlující tok dále podporují smíchání. To vede k chemismu, kterým vzniká detekovatelný produkt před dosaţením detektoru. Vícecestné ventily jsou pak přepnuty do detekční pozice a směr toku je obrácen, pohánějíce zónu vzorek/činidlo skrz průtokovou celu. [ 1, 2 ] Detektory v SIA nejsou systémově omezeny, jejich volba záleţí na druhu pouţité analytické reakce. Vyuţívají se zejména spektrofotometrické, fluorescenční a elektrochemické detektory s příslušnými průtokovými celami. U spektrofotometrických detektorů se nejčastěji vyskytuje Z-cela s optickou délkou 10 mm a vnitřním průměrem 1,5 mm. Nezbytnou součástí SIA systému musí být vhodný mikroprocesor (nejlépe PC) s příslušným programovým vybavením, který řídí kroky měřícího cyklu a současně sbírá, uchovává a vyhodnocuje výstupní data. [ 3 ] Hlavní výhody SIA jsou: jednodušší hardware neţ FIA jedna pumpa, jeden ventil, jeden nosný proud efektivní pouţití činidel a minimalizace odpadu jednoduché a univerzální zařízení, do něhoţ mohou být implementovány různé chemické procesy. [ 2 ] 17

18 Obrázek 3: Sekvenční injekční analýza 18

19 2.2. DUSIČNANY A DUSITANY Dusičnany a dusitany jsou přirozeně se vyskytující ionty, které jsou součástí koloběhu dusíku. Dusičnan je nejvíce vyuţíván jako anorganické hnojivo. Je také pouţíván jako oxidační činidlo a ve výrobě výbušnin, a čištěný dusičnan draselný je pouţíván při výrobě skla. Dusitan sodný je pouţíván jako potravinové konzervans, především u konzervovaného masa. Koncentrace dusičnanu v podzemní a povrchové vodě je normálně nízká, ale můţe dosáhnout vysokých hladin, jako výsledek prosáknutí nebo odtoku ze zemědělské půdy, nebo kontaminací z lidského či zvířecího odpadu, jako důsledek oxidace amoniaku a podobných zdrojů. [ 4, 5 ] Primární zdravotnický zájem týkající se dusičnanu a dusitanu je vznik methemoglobinémie, nazývané také blue-baby syndrom. Dusičnan je redukován na dusitan v ţaludku kojence a dusitan je schopen oxidovat hemoglobin (Hb) na methemoglobin (methb), který není schopen transportovat kyslík. Redukovaný kyslíkový transport se klinicky manifestuje, kdyţ koncentrace methb dosáhne 10 % nebo více normální koncentrace Hb; stav nazývaný methemoglobinémie způsobuje cyanózu a vyšší koncentrace asfyxii. Normální hladina methb u dětí pod 3 měsíce věku je niţší neţ 3 %. Hb malých kojenců je citlivější k tvorbě methb neţ u starších dětí a dospělých; je to důsledek velkého mnoţství fetálního Hb, který se snadněji oxiduje na methb, stále přítomného v krvi kojenců. Navíc je u kojenců deficit methb reduktázy, enzymu odpovědného za redukci methb na Hb. Redukce dusičnanu na dusitan ţaludečními bakteriemi je u kojenců také vyšší kvůli nízké ţaludeční kyselosti. Hladina dusičnanů v mateřském mléce je relativně nízká; nicméně při umělé výţivě jsou kojenci v ohroţení kvůli potenciální expozici dusičnanům/dusitanům z pitné vody a relativně vysokému přísunu vody ve vztahu k tělesné hmotnosti. [ 5 ] 19

20 METODY STANOVENÍ DUSIČNANŮ A DUSITANŮ Dle normy ČSN EN ISO je limit dusitanového dusíku ve vodě v rozmezí 0,01 1 mg.l -1 a limit dusitanového a dusičnanového dusíku ve vodě v rozmezí 0,2 20 mg.l -1. [ 6 ] V současné době je zde velké mnoţství metod pro analýzu dusitanu a dusičnanu v povrchové vodě a i v jiných dalších oblastech. [ 7 ] Tyto metody zahrnují: Voltametrii [ 7 ] Iontovou chromatografii [ 7, 8 ] Amperometrii [ 7, 9 ] HPLC [ 7, 10 ] Diferenční pulsní polarografii [ 11 ] Kapilární elektroforézu [ 7, 12 ] AAS [ 7, 13 ] FIA [ 7, 14, 15, 16 ] SIA [ 7, 17, 18, 19 ] 20

21 3. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 21

22 3.1. POUŽITÉ PŘÍSTROJE FIAlab 3000 automatický SIA systém (FIAlab Instruments, USA), Software FIAlab for Windows 5.0 pístová pumpa (objem pumpy 2,5 ml) selekční ventil s 8 porty optický spektrofotometr S 2000FL (Ocean Optics, Inc., USA) 1 cm teflonová průtoková cela VIS wolframová lampa LS-1 (Ocean Optics, Inc., USA) program FIAlab pro Windows 5,0 PTFE hadičky 0,76 mm vnitřního průměru (= i.d.) zahrnující mísící cívku (délky 150 cm) redukční kolona - připravena pouţitím kadmiových granulí (Cd - Merck, Germany) průměr 0,3 1,0 mm analytické váhy A&D HR120 ultrazvuková lázeň Tenson 1 22

23 3.2. CHEMIKÁLIE Všechny pouţité chemikálie byly analytického stupně kvality činidel a všechny roztoky byly připraveny z deionizované destilované vody. dusitan sodný (Lachema, Brno) dusičnan sodný (Lachema, Brno) deionizovaná voda čištěná Milli - Q systém (Millipore Corp., Bedford, MA) sulfanilamid (Lachema, Brno) N-(1-naftyl)ethylendiamindichlorid (NED) (Luba Feinchemie, Austria) kyselina fosforečná 85 % (Merck, Praha) chlorid amonný (Lachema, Brno) hydroxid sodný (Lachema, Brno) síran sodný (Lachema, Brno) tetraboritan sodný (Lachema, Brno) chlorid draselný (Lachema, Brno) bromid draselný (Lachema, Brno) jodid draselný (Lachema, Brno) thiokyanatan draselný (Lachema, Brno) thiosíran sodný (Lachema, Brno) 23

24 3.3. PŘÍPRAVA ROZTOKŮ Zásobní roztok dusičnanu sodného byl připraven v 500 ml odměrné baňce rozpuštěním 500,0 mg NaNO 3 v destilované vodě a jejím doplněním po rysku. Zásobní roztok dusitanu sodného byl připraven v 500 ml odměrné baňce rozpuštěním 500,0 mg NaNO 2 v destilované vodě a jejím doplněním po rysku. Pracovní standardní roztoky byly ředěny ze zásobních roztoků destilovanou vodou dle potřeby. Barevné činidlo bylo připraveno rozpuštěním 5,0 g sulfanilamidu a 0,5 g N-(1- naftyl)ethylendiamindichloridu (NED) v dostatečném mnoţství destilované vody, přidáním 50,0 ml 85% kyseliny fosforečné a doplněním do 500,0 ml destilovanou vodou (to bylo povaţováno za 100% barevné činidlo). Pufr byl připraven rozpuštěním 85,0 g chloridu amonného v 1000,0 ml vody; ph bylo upraveno na 7,5 pouţitím 1 mol.l -1 hydroxidu sodného. Jako nosný proud byl pouţit připravený pufr. Standardy dusitanu a dusičnanu, barevné činidlo a pufr byly připraveny podle Evropského standardu EN ISO 13395:

25 3.4. PŘÍPRAVA KOLONY Redukční kolona byla připravena pouţitím kadmiových granulí (Cd - Merck, Germany) s průměrem 0,3 1,0 mm. Tyto granule byly nejprve promyty 1 mol.l -1 HCl a postupně pokryty mědí dvojitým namáčením v roztoku CuSO 4 (20 g.l -1 ) po dobu 1 min. Poměděné kadmiové granule byly nakonec promyty destilovanou vodou, přeplněny do polypropylenové hadičky (délka 50 mm a vnitřní průměr 2,0 mm) a uzavřeny skelnou vatou na obou koncích. Pro dlouhodobou stabilitu reduktoru je kolonu nutné drţet v roztoku pufru zmíněném v části Příprava roztoků. Alternativní Zn kolona byla připravena z hrubě práškovaného zinku stejným způsobem. 25

26 3.5. POSTUP Průtokový systém byl konstruován podle Obrázku 4. Dusitany byly analyzovány pouţitím Griessovy reakce. Vzorek byl smíchán s barevným činidlem (sulfanilamid a NED) za vzniku (diazotační a kopulační reakcí) vysoce zbarveného produktu, který byl unášen tokem nosného proudu pufru do detektoru průtokovou rychlostí 50 µl.s -1. Absorbance byla měřena v absorpčním maximu barevného produktu reakce při 540 nm. Dusičnan byl stanoven jako celkový obsah dusitanu po jeho přímé redukci na dusitan pouţitím poměděné kadmiové kolony. Obrázek 4: Schéma zapojení průtokového systému SIA analyzátoru 26

27 Tabulka 1: Schéma programu analýzy převzaté z přístroje FIAlab 3000 automatický SIA systém (FIAlab Instruments, USA), Software FIAlab for Windows 5.0 SyringePump Command (?) KOR Loop Start (#) 3 SyringePump Valve In SyringePump Delay Until Done SyringePump Flowrate (µl/sec) 100 SyringePump Aspirate (µl) 2000 SyringePump Delay Until Done SyringePump Valve Out Valve port 5 Analyte New Sample SyringePump Flowrate (µl/sec) 10 SyringePump Delay Until Done SyringePump Aspirate (µl) 150 SyringePump Delay Until Done Peristaltic Pump On Peristaltic Pump CounterClockwise(%) 40 Valve port 7 Analyte New Sample Analyte Name dusitan SyringePump Flowrate (µl/sec) 50 SyringePump Empty Delay (sec) 3 Spectrometer Reference Scan Spectrometer Absorbance Scanning Syringe Pump Delay Until Done Spectrometer Stop Scanning Peristaltic Pump Off SyringePump Valve In SyringePump Delay Until Done SyringePump Flowrate (µl/sec) 100 SyringePump Aspirate (µl)

28 SyringePump Delay Until Done SyringePump Valve Out Valve port 4 Analyte New Sample SyringePump Flowrate (µl/sec) 10 SyringePump Delay Until Done SyringePump Aspirate (µl) 150 SyringePump Delay Until Done Peristaltic Pump On Peristaltic Pump CounterClockwise(%) 40 Valve port 8 Analyte New Sample Analyte Name dusicnan SyringePump Flowrate (µl/sec) 50 SyringePump Empty Delay (sec) 3 Spectrometer Reference Scan Spectrometer Absorbance Scanning Syringe Pump Delay Until Done Spectrometer Stop Scanning Peristaltic Pump Off Loop End Byly zaznamenány 2 píky v důsledku vytvoření azobarviva s oběma vzorky. První pík korespondoval s neredukovaným (NO ) a druhý s redukovaným ( NO NO 3 ) stavem. Kaţdý vzorek byl analyzován 3x se opakujícím měřícím cyklem. 28

29 Obrázek 5: Záznam měření dusitanu sodného a dusičnanu sodného 3x se opakujícím měřícím cyklem 29

30 4. VÝSLEDKY A DISKUSE 30

31 4.1. OPTIMALIZACE PARAMETRŮ Hlavním úkolem optimalizace procesu bylo najít citlivé a reprodukovatelné měřící podmínky pro stanovení obou iontů plně automatizovanou analýzou OPTIMALIZACE RYCHLOSTI PERISTALTICKÉ PUMPY PŘI STANOVENÍ DUSITANU Pro optimalizaci rychlosti peristaltické pumpy byl pouţíván roztok dusitanu sodného o koncentraci 5 mg.l -1. Dávkovaný objem roztoku dusitanu byl 50 µl. Náplň pístové pumpy byla 1750 µl a rychlost pístové pumpy byla 40 µl.s -1. Absorbance byla měřena v absorpčním maximu při vlnové délce 540 nm. Měření byla prováděna ve 3 opakováních. Jako optimální bylo zvoleno 40 % maximální rychlosti pumpy. Tabulka 2: Hodnoty měření optimalizace rychlosti peristaltické pumpy při stanovení dusitanu [% maximální rychlosti pumpy] Absorbance 5 0,197 7,5 0, , , , , , , , , , , ,474 31

32 Absorbance Obrázek 6: Záznam měření optimalizace rychlosti peristaltické pumpy při stanovení dusitanu 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0, [% maximální rychlosti pumpy] 32

33 OPTIMALIZACE RYCHLOSTI PÍSTOVÉ PUMPY PŘI STANOVENÍ DUSITANU Pro optimalizaci rychlosti pístové pumpy byl pouţíván roztok dusitanu sodného o koncentraci 5 mg.l -1. Dávkovaný objem roztoku dusitanu byl 50 µl. Náplň pístové pumpy byla 1750 µl. Rychlost peristaltické pumpy byla 40 %. Absorbance byla měřena v absorpčním maximu při vlnové délce 540 nm. Měření byla prováděna ve 3 opakováních. Jako optimální byla zvolena rychlost 50 µl.s -1. Tabulka 3: Hodnoty měření optimalizace rychlosti pístové pumpy při stanovení dusitanu Rychlost [µl.s -1 ] Absorbance 10 0, , , , , , , , , ,371 33

34 Absorbance Obrázek 7: Záznam měření optimalizace rychlosti pístové pumpy při stanovení dusitanu 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0, Rychlost [µl.s -1 ] 34

35 OPTIMALIZACE DÁVKOVANÉHO OBJEMU ROZTOKU DUSITANU Pro optimalizaci dávkovaného objemu roztoku dusitanu byl pouţíván roztok dusitanu sodného o koncentraci 5 mg.l -1. Náplň pístové pumpy byla 1750 µl. Rychlost pístové pumpy byla 50 µl.s -1 a rychlost peristaltické pumpy byla 40 %. Absorbance byla měřena v absorpčním maximu při vlnové délce 540 nm. Měření byla prováděna ve 3 opakováních. Jako optimální byl zvolen objem 150 µl. Tabulka 4: Hodnoty měření optimalizace dávkovaného objemu roztoku dusitanu Objem [µl] Absorbance 20 0, , , , , , , , , , , , , ,117 35

36 Absorbance Obrázek 8: Záznam měření optimalizace dávkovaného objemu roztoku dusitanu 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0, Objem [µl] 36

37 OPTIMALIZACE RYCHLOSTI PÍSTOVÉ PUMPY PŘI STANOVENÍ DUSIČNANU Pro optimalizaci rychlosti pístové pumpy byl pouţíván roztok dusičnanu sodného o koncentraci 5 mg.l -1. Dávkovaný objem roztoku dusičnanu byl 50 µl. Náplň pístové pumpy byla 2000 µl. Rychlost peristaltické pumpy byla 40 %. Absorbance byla měřena v absorpčním maximu při vlnové délce 540 nm. Měření byla prováděna ve 3 opakováních. Jako optimální byla zvolena rychlost 50 µl.s -1. Tabulka 5: Hodnoty měření optimalizace rychlosti pístové pumpy při stanovení dusičnanu Rychlost [µl.s -1 ] Absorbance 10 0, , , , , , , , , ,229 37

38 Absorbance Obrázek 9: Záznam měření optimalizace rychlosti pístové pumpy při stanovení dusičnanu 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0, Rychlost [µl.s -1 ] 38

39 OPTIMALIZACE DÁVKOVANÉHO OBJEMU ROZTOKU DUSIČNANU Pro optimalizaci dávkovaného objemu roztoku dusičnanu byl pouţíván roztok dusičnanu sodného o koncentraci 5 mg.l -1. Náplň pístové pumpy byla 2000 µl. Rychlost pístové pumpy byla 50 µl.s -1 a rychlost peristaltické pumpy byla 40 %. Absorbance byla měřena v absorpčním maximu při vlnové délce 540 nm. Měření byla prováděna ve 3 opakováních. Jako optimální byl zvolen objem 150 µl. Tabulka 6: Hodnoty měření optimalizace dávkovaného objemu roztoku dusičnanu Objem [µl] Absorbance 20 0, , , , , , , , , , , , , , , , , , ,336 39

40 Absorbance Obrázek 10: Záznam měření optimalizace dávkovaného objemu roztoku dusičnanu 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0, Objem [µl] 40

41 OPTIMALIZACE ČASU REDUKCE DUSIČNANU SODNÉHO Měření bylo prováděno tak, ţe vzorek byl vţdy ponechán po určitou dobu v redukční koloně, kde docházelo k redukci dusičnanu na dusitan. Byla měřena závislost absorbance na času redukce doba ponechání vzorku v redukční koloně. Pro optimalizaci času redukce byl pouţíván roztok dusičnanu sodného o koncentraci 5 mg.l - 1. Dávkovaný objem roztoku dusičnanu byl 150 µl. Náplň pístové pumpy byla 2000 µl. Rychlost pístové pumpy byla 50 µl.s -1 a rychlost peristaltické pumpy byla 40 %. Absorbance byla měřena v absorpčním maximu při vlnové délce 540 nm. Měření byla prováděna ve 3 opakováních. Největší odezva byla naměřena při čase 0 s, tedy při prostém průchodu vzorku redukční kolonou. Při ponechání vzorku v redukční koloně docházelo pravděpodobně k rozmývání zóny vzorku, a to tím více, čím déle byl vzorek ponechán v koloně. Jako optimální byl zvolen čas redukce 0 s. Tabulka 7: Hodnoty měření optimalizace času redukce dusičnanu sodného Čas [sec] Absorbance 0 0, , , , , , ,373 41

42 Absorbance Obrázek 11: Záznam měření optimalizace času redukce dusičnanu sodného 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0, Čas [sec] 42

43 VLIV POHYBU VZORKU V REDUKČNÍ KOLONĚ Měření bylo prováděno tak, ţe vzorek byl poslán přímým tokem přes redukční kolonu a poté byl tok obrácen. Byla měřena závislost absorbance na počtu obrácení toku vzorku. Pro měření vlivu pohybu vzorku v redukční koloně byl pouţíván roztok dusičnanu sodného o koncentraci 5 mg.l -1. Dávkovaný objem roztoku dusičnanu byl 150 µl. Náplň pístové pumpy byla 2000 µl. Rychlost pístové pumpy byla 50 µl.s -1 a rychlost peristaltické pumpy byla 40 %. Absorbance byla měřena v absorpčním maximu při vlnové délce 540 nm. Měření byla prováděna ve 3 opakováních. Největší odezva byla naměřena při prostém průchodu vzorku redukční kolonou bez obrácení toku. Při obrácení toku docházelo pravděpodobně k rozmývání zóny vzorku, a to tím více, čím častěji byl tok obrácen. Jako optimální byl zvolen prostý průchod vzorku kolonou bez obrácení toku. Tabulka 8: Hodnoty měření vlivu pohybu vzorku v redukční koloně Počet obrácení toku Absorbance 0 0, , ,503 43

44 Absorbance Obrázek 12: Záznam měření vlivu pohybu vzorku v redukční koloně 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0, ,5 1 1,5 2 2,5 Počet obrácení toku 44

45 4.2. STANOVENÍ LINEARITY ODEZVY Linearita odezvy byla stanovena pro roztoky dusitanu sodného a dusičnanu sodného, které byly připraveny ředěním zásobních roztoků. Měření bylo prováděno za podmínek, které byly zvoleny jako optimální při optimalizaci parametrů. Kaţdá koncentrace byla měřena třikrát a do výpočtu byl zařazen průměr všech 3 výsledků. Pro linearitu odezvy je rozhodující korelační koeficient přímky, který má být minimálně 0,99. Výsledky měření tomuto poţadavku vyhovovaly. 45

46 Y KALIBRAČNÍ KŘIVKA DUSITANU SODNÉHO Pro dusitan sodný byla změřena lineární odezva absorbance v intervalu koncentrací 0,25 mg.l mg.l -1. Korelační koeficient byl 0, a reziduální odchylka byla 0, Tabulka 9: Naměřené hodnoty pro kalibrační křivku dusitanu sodného Koncentrace [mg.l -1 ] Absorbance 0,25 0,050 0,5 0, ,168 2,5 0, , ,721 Tabulka 10: Data pro kalibrační křivku dusitanu sodného Statistické parametry pro regresi : y = k x + q Počet bodů n = 6 Odhad chyby Směrnice k = 0, Abs. člen q = -0, Korelační koef. r = 0, Reziduální odch. s = 0, _ +_ 0, , Obrázek 13: Kalibrační křivka pro dusitan sodný 2 1,5 1 0, X 46

47 Y KALIBRAČNÍ KŘIVKA DUSIČNANU SODNÉHO Pro dusičnan sodný byla změřena lineární odezva absorbance v intervalu koncentrací 0,25 mg.l mg.l -1. Korelační koeficient byl 0,99946 a reziduální odchylka byla 0, Tabulka 11: Naměřené hodnoty pro kalibrační křivku dusičnanu sodného Koncentrace [mg.l -1 ] Absorbance 0,25 0,035 0,5 0, ,126 2,5 0, , ,261 Tabulka 12: Data pro kalibrační křivku dusičnanu sodného Statistické parametry pro regresi : y = k x + q Počet bodů n = 6 Odhad chyby Směrnice k = 0,12655 Abs. člen q = 0, Korelační koef. r = 0,99946 Reziduální odch. s = 0, _ +_ 0, , Obrázek 14: Kalibrační křivka pro dusičnan sodný 1,5 1 0, X 47

48 4.3. OPAKOVATELNOST MĚŘENÍ PRO RŮZNÉ KONCENTRACE Bylo provedeno opakované měření v sérii 7 cyklů pro dusitan sodný a 7 cyklů pro dusičnan sodný. Koncentrace byly pro NaNO 2 i pro NaNO 3 1 mg.l -1, 5 mg.l -1 a 10 mg.l -1. Z odezvy signálu píků jednotlivých látek byla vypočtena relativní směrodatná odchylka (RSD) pro stanovení jednotlivých koncentrací. Obrázek 15: Vzorec použitý pro výpočet relativní směrodatné odchylky yy i RSD % y n 1 RSD Relativní směrodatná odchylka y Průměr absorbancí n Počet měření y i Hodnoty absorbancí jednotlivých paralelních stanovení VÝSLEDKY OPAKOVATELNOSTI MĚŘENÍ Tabulka 13: Výsledky opakovatelnosti měření dusitanu sodného Koncentrace [mg.l -1 ] Počet měření Průměr hodnot absorbancí RSD [%] 1 7 0,245 2, ,913 2, ,740 1,25 48

49 Tabulka 14: Výsledky opakovatelnosti měření dusičnanu sodného Koncentrace [mg.l -1 ] Počet měření Průměr hodnot absorbancí RSD [%] 1 7 0,144 5, ,700 1, ,286 1,96 49

50 4.4. STANOVENÍ LIMITU DETEKCE Limit detekce byl stanoven pro roztoky dusitanu sodného a dusičnanu sodného, které byly připraveny postupným ředěním zásobních roztoků. Měření bylo prováděno za podmínek, které byly zvoleny jako optimální při optimalizaci parametrů. Experimentálně byly zjištěny hodnoty koncentrací, jejichţ pík byl zřetelně třikrát vyšší neţ šum základní linie (3 S/N). Hodnoty zvolené jako limit detekce byly 0,3 mg.l -1 pro NaNO 2 a 0,5 mg.l -1 pro NaNO 3. Obrázek 16: Limit detekce 50

51 4.5. STUDIUM INTERFERENCÍ Ke studiu interferencí byl pouţit roztok dusičnanu sodného o koncentraci 5 mg.l - 1 a anionty o koncentraci 0,1 mol.l -1. Měření bylo prováděno na kadmiové a zinkové koloně za podmínek, které byly zvoleny jako optimální při optimalizaci parametrů. Obrázek 17: Vzorec pro výpočet míry interference % = A(X x- ). 100 / A(NO 3 - ) A( X x- ) Absorbance dusičnanu sodného v přítomnosti aniontu A(NO 3 - ) Absorbance dusičnanu sodného Bylo zjištěno, ţe anionty ve velké míře ruší signál dusičnanu. Výsledek byl pravděpodobně způsoben vysokou koncentrací aniontů. Thiosíran sodný nevykazoval ţádný signál a obě kolony jím byly zničeny. Nepodařilo se dohledat z jakého důvodu docházelo k likvidaci kolon tímto aniontem. VÝSLEDKY STUDIA INTERFERENCÍ Tabulka 15: Hodnoty měření interference na Cd koloně Název aniontu Absorbance dusičnanu sodného v přítomnosti aniontu Absorbance NO 3 - [%] SO 4-0,696 0, ,6 S 2 O ,647 - B 4 O 2-7 0,677 0,982 * 68,94 Cl - 0,666 0,982 67,82 Br - 0,632 0,982 64,36 I - 0,304 0,994 30,58 SCN - 0,637 1,02 62,45 * Jiná absorbance v důsledku likvidace staré kolony S 2 O 3 2- a nutnosti měření na nové. 51

52 Tabulka 16: Hodnoty měření interference na Zn koloně Název aniontu Absorbance dusičnanu sodného v přítomnosti aniontu Absorbance NO 3 - [%] SO 4-2- S 2 O 3 2- B 4 O 7 0,551 0,755 72,98-0,755-0,476 0,755 63,05 Cl - 0,518 0,755 68,61 Br - 0,489 0,755 64,77 I - 0,214 0,755 28,34 SCN - 0,247 0,755 32,72 52

53 4.6. ÚČINNOST REDUKTORU Účinnost reduktoru byla provedena nástřikem roztoků dusitanu sodného a dusičnanu sodného o stejné molární koncentraci. Byl připraven zásobní roztok s obsahem 111 mg NaNO 2 v 1 litru vody. Vlastní porovnávací roztok byl připraven zředěním 10,0 ml zásobního roztoku do 100,0 ml vodou (= 0,161 mmol.l -1 ). Výška píku po nástřiku porovnávacího roztoku byla porovnána s výškou píku pro roztok s obsahem 10 mg.l -1 NO - 3 (= 0,161 mmol.l -1 ). Účinnost reduktoru byla měřena pro kadmiovou a zinkovou kolonu a byla vypočtena pomocí následujícího vzorce. Obrázek 18: Vzorec pro výpočet účinnosti reduktoru účinnost = A(NO 3 - ). 100 / A(NO 2 - ) A(NO 3 - ) A(NO 2 - ) Absorbance dusičnanu sodného Absorbance dusitanu sodného Hodnoty absorbance na Cd koloně byly pro NO 2-1,617 a pro NO 3 - Reduktor měl účinnost 96,10%. 1,554. Hodnoty absorbance na Zn koloně byly pro NO 2 - Reduktor měl účinnost 80,99%. 1,594 a pro NO 3-1,

54 4.7. ANALÝZA VOD STANOVENÍ DUSITANŮ A DUSIČNANŮ V REÁLNÝCH VZORCÍCH Byla provedena analýza dusitanů a dusičnanů ve vzorcích vod Fromin, Bonaqua, Rajec, Mattoni a v hradecké vodě. Naměřené hodnoty byly porovnány s hodnotami deklarovanými výrobci a uvedenými na etiketách. Koncentrace byly zjištěny pouţitím programu pro výpočet hodnot z kalibračních křivek. Hodnoty pro kalibrační křivky dusitanu a dusičnanu byly naměřeny těsně před vlastní analýzou vod. Měřením bylo zjištěno, ţe naměřené hodnoty byly vyšší neţ hodnoty deklarované výrobci. Tabulka 17: Porovnání deklarovaných a naměřených hodnot koncentrací dusitanů a dusičnanů Název vody Deklarovaná c(no 2 - ) [mg.l -1 ] Naměřená c(no 2 - ) [mg.l -1 ] Deklarovaná c(no 3 - ) [mg.l -1 ] Naměřená c(no 3 - ) [mg.l -1 ] Fromin - 0,183 5,9 14,136 Bonaqua < 0,01 0,212 8,9 15,75 Rajec < 0,01 0,227 11,4 15,38 Mattoni - 1,188-1,054 hradecká voda - 0,193-26,6 54

55 5. ZÁVĚR 55

56 Byla vyvinuta nová metoda SIA pro současné stanovení dusitanů a dusičnanů. Dusitany byly analyzovány pouţitím Griessovy reakce. Dusičnany byly stanoveny po jejich redukci na dusitany v kadmiové koloně. Absorbance byla měřena při absorpčním maximu při 540 nm. Optimální podmínky pro analýzu: rychlost peristaltické pumpy pro stanovení dusitanů i dusičnanů 40 % maximální rychlosti pumpy; rychlost pístové pumpy pro dusitany i dusičnany 50 µl.s -1 ; dávkovaný objem dusitanů i dusičnanů 150 µl. Optimální čas redukce dusičnanů je při 0 s, tedy prostém průtoku dusičnanů redukční kolonou. Metoda vykazovala tyto validační parametry: kalibrační křivka byla lineární v intervalu koncentrací 0,25 10,0 mg.l -1 pro dusitan i dusičnan, korelační koeficient byl 0, pro dusitan a 0,99946 pro dusičnan; opakovatelnost měření absorbance u 7 cyklů pro dusitan při koncentracích 1 mg.l -1, 5 mg.l -1 a 10 mg.l -1 vykazovala relativní směrodatnou odchylku (RSD) do 2,81% a u 7 cyklů pro dusičnan při koncentracích 1 mg.l -1, 5 mg.l -1 a 10 mg.l -1 do 5,32%; limit detekce byl 0,3 mg.l -1 pro dusitan a 0,5 mg.l -1 pro dusičnan; účinnost kadmiové redukční kolony byla 96,10% a zinkové kolony 80,99%. Při studiu interferencí bylo zjištěno, ţe všechny anionty ruší ve vysoké míře. Nejvyšší interferenci způsoboval I - na kadmiové i zinkové redukční koloně. Obě kolony byly zničeny S 2 O 2-3. Metoda byla pouţita pro analýzu dusitanů a dusičnanů ve vzorcích vod Fromin, Bonaqua, Rajec, Mattoni, hradecká voda. Hodnoty byly porovnány s hodnotami deklarovanými výrobci. Vyvinutá metoda SIA pro současné stanovení dusitanů a dusičnanů je pouţívána jako nová praktická úloha v předmětu Speciální metody instrumentální analýzy. 56

57 6. LITERATURA 57

58 [ 1 ] - FIA/SIA Principles - 03/2009 [ 2 ] - Tutorial - Lesson 1 - An Introduction to FIA and SIA - 03/2009 [ 3 ] Paseková, H., Polášek, M., Solich, P.: Sekvenční injekční analýza, Chemické Listy 93, , 1999 [ 4 ] pdf - 03/2009 [ 5 ] /2009 [ 6 ] ČSN EN ISO [ 7 ] Legnerová, Z., Solich, P., Sklenářová, H., Šatínský, D., Karlíček, R.: Automated simultaneous monitoring of nitrate and nitrite in surface water by sequential injection analysis, Water Research 36, , 2002 [ 8 ] Tirumalesh, K.: Simultaneous determination of bromide and nitrate in contaminated waters by ion chromatography using amperometry and absorbance detectors, Talanta 74, , 2008 [ 9 ] Carpenter, N.G., Pletcher, D.: Amperometric method for the determination of nitrate in water, Analitica Chimica Acta 317, , 1995 [ 10 ] Ferreira, I.M.P.L.V., Silva, S.: Quantification of residual nitrite and nitrate in ham by reverse-phase high performance liquid chromatography/diode array detektor, Talanta 74, , 2008 [ 11 ] Yilmaz, U.T., Somer, G.: Determination of trace nitrite by direct and indirect methods using differential pulse polarography and application, Journal Of Electroanalytical Chemistry 624, 59-63, 2008 [ 12 ] Xu, ZQ., Doi, T., Timerbaev, A.R., Hirokawa, T.: Sensitive determination of anions in saliva using capillary electrophoresis after transient isotachophoretic preconcentration, Talanta 77, , 2008 [ 13 ] Yilmaz, F., Islimyeli, S., Ozgur, M., Canlica, M.: Indirect determination of nitrate ions in vegetables by atomic absorption spectrophotometry, Reviews In Analytical Chemistry 26, 43-53, 2007 [ 14 ] Ruiz-Capillas, C., Jimenez-Colmenero, F.: Determination of preservatives in meat products by flow injection analysis (FIA), Food Addittives And 58

59 Contaminants Part A - Chemistry Analysis Control Exposure & Risk Assessment 25, , 2008 [ 15 ] Carrasco, E., Bautista, J.A.G., Mateo, J.V.G.: Automated sequential monitoring of ammonium, phosphate, and nitrite in wastewater by multi-commutated peristaltic and solenoid pumped flow system - a comparative study, Chemia Analityczna 52, , 2007 [ 16 ] Joichi, Y., Lenghor, N., Takayanagi, T., Oshima, M., Motomizu, S., Ura, N.: Development of computer-controlled flow injection instruments and its application to determination of nitrate, nitrite, and ammonium ions in environmental symplex, Bunseki Kagaku 55, , 2006 [ 17 ] Lima, M.J.R., Fernandes, S.M.V., Rangel, A.O.S.S.: Determination of nitrate and nitrite in dairy samples by sequential injection using an in-line cadmiumreducing column, International Dairy Journal 16, , 2006 [ 18 ] Baeza, M., Bartroli, J., Alonso, J.: Autoadaptative sequential injection system for nitrite determination in wastewaters, Talanta 68, , 2005 [ 19 ] Lapa, R.A.S., Lima, J.L.F.C., Pinto, I.V.O.S.: Simultaneous determination of nitrite, nitrate, sulphate and phenolic compounds, by sequential injection analysis, in wastewaters, Analusis 28, ,