Vztahy mezi jarovizací, mrazuvzdorností a expresí dehydrinů u ječmene (Hordeum vulgare L.) Shrnutí Ph.D. práce

Vztahy mezi jarovizací, mrazuvzdorností a expresí dehydrinů u ječmene (Hordeum vulgare L.) Shrnutí Ph.D. práce RNDr. Klára Kosová Školitel: RNDr. Ilja Tom Prášil, CSc. Katedra fyziologie rostlin, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Karlova v Praze Odbor genetiky a šlechtění rostlin, Výzkumný ústav rostlinné výroby, Praha - Ruzyně 2008

Čestné prohlášení Prohlašuji, že jsem disertační práci zpracovala samostatně na základě svých vlastních výsledků kromě případů zvláště uvedených a řádně citovaných. Dále prohlašuji, že tuto práci ani její část nepředkládám za účelem získání jiného akademického titulu. V Praze, dne 25. září 2008 Klára Kosová Poděkování Nejprve bych chtěla poděkovat svému školiteli, RNDr. Iljovi Tomovi Prášilovi, CSc., za jeho stálou péči, liberální styl vedení a podnětné připomínky v průběhu celého mého Ph.D. studia. Chci také poděkovat ostatním členům naší laboratoře - Ing. Pavle Prášilové za praktické rady ohledně kultivace rostlinného materiálu, Mgr. Pavlu Vítámvásovi, Ph.D. za praktické rady týkající se elektroforézy a dalších molekulárně-biologických technik, Ing. Evě Vlasákové a Ing. Zbyňkovi Škodáčkovi za jejich dobrou náladu a Mgr. Lucii Davidové za její pečlivou technickou práci při kultivaci pokusných rostlin. Dále chci poděkovat RNDr. Ludmile Holkové z Ústavu pěstování a šlechtění rostlin a rostlinolékařství na Agronomické fakultě Mendlovy zemědělské a lesnické univerzity v Brně za dobrou spolupráci a za zajištění analýzy dehydrinových transkriptů. Děkuji také RNDr. Věře Čapkové, CSc., z Ústavu experimentální botaniky Akademie věd ČR za cenné rady ohledně technik SDS-PAGE a imunoblotů. Jsem velmi vděčná též Prof. Timothy J. Close z Department of Botany and Plant Sciences, University of California at Riverside, USA, za jeho za bezplatné poskytnutí primární protilátky proti dehydrinům. V neposlední řadě bych chtěla poděkovat svým rodičům Janě a Milanovi, své sestře Květě a svému příteli Zdeňkovi za podporu v průběhu celého studia. Experimentální část práce byla prováděna v laboratoři fyziologie stresu rostlin na Odboru genetiky a šlechtění ve Výzkumném ústavu rostlinné výroby, Praha - Ruzyně. Práce byla podpořena granty COST FA 0603, GA CR 522/08/1290, MZe 0002700602, MZe QF3191 a MZe 1G57060.

Obsah Úvod 1 Cíle disertační práce 3 Výsledky a diskuse 4 1. Zjišťování možnosti využití chladově indukovaných dehydrinů (proteinů) pro odlišení odrůd ječmene s rozdílnou úrovní dosažené mrazuvzdornosti 4 2. Dynamika vývoje, dosažené úrovně mrazuvzdornosti a akumulace proteinu DHN5 v podmínkách dlouhodobého otužení 5 2.1. Počáteční stadia otužení (0-14 dnů) 5 2.2. Pozdější stadia otužení (14-112 dnů) 7 3. Vztah mezi akumulací proteinu DHN5 a dosaženou úrovní mrazuvzdornosti 12 Závěry 14 Citovaná literatura 16 Seznam publikací 18 Rukopisy, které jsou součástí disertační práce 20 Rukopis 1 (Abstrakt) 21 Rukopis 2 (Abstrakt) 22 Rukopis 3 (Abstrakt) 23 Rukopis 4 (Abstrakt) 24

Úvod Ječmen (Hordeum vulgare L.) je vedle pšenice (Triticum aestivum (L.) em Thell.) jednou z ekonomicky nejvýznamnějších obilovin pěstovaných v oblastech mírného klimatického pásma včetně České republiky. Navzdory mírným zimám v posledních několika letech představuje poškození mrazem pro pěstování ječmene stále vážnou hrozbu. Navíc je známo, že ozimé kultivary ječmene jsou obecně méně odolné vůči mrazu ve srovnání s ozimými kultivary pšenice, žita a tritikale (Fowler a Carles, 1979; Fowler, 2008). Proto je testování dosažené úrovně mrazuvzdornosti důležitou součástí šlechtitelských programů. V poslední době probíhá bouřlivý rozvoj technik strukturní i funkční genomiky (transkriptomiky, proteomiky a metabolomiky), který vede k objevu nových metod využitelných ve šlechtění. Tyto techniky umožnily identifikaci specifických DNA markerů spojených s hledanými znaky a rozvoj technik tzv. MAS (marker-assisted selection; selekce spojená s využitím DNA markerů). Využívané markery mohou být buď náhodně detekované jedinečné sekvence DNA jen volně spojené s hledaným genem (takové markery jsou používány již od 90. let; viz markery RFLP, AFLP, RAPD, SCAR, SNP, SSR, STS a další typy) anebo mohou být jako markery využity jedinečné sekvence v přímé vazbě s hledaným genem (takové druhy markerů se nazývají rovněž diagnostické markery) (Andersen a Lübberstedt, 2003). Z hlediska funkční genomiky se ukazuje, že kvantitativní úroveň exprese určitého transkriptu (mrna) anebo proteinu může korelovat s dosahovanou úrovní určitého znaku kvantitativní povahy (např. mrazuvzdornost). Proto může být úroveň exprese určité mrna anebo proteinu také považována za marker (Houde et al., 1992). Mrazuvzdornost není u mnoha odolných rostlin včetně obilovin neměnným znakem; naopak, ukazuje se, že vyšší úroveň mrazuvzdornosti lze indukovat dlouhodobým působením nízkých teplot nad bodem mrazu (tzv. otužování neboli chladová aklimace; chlad je nejčastěji definován jako teploty v rozsahu +12 C - 0 C; Sakai a Larcher, 1985; Guy, 1990; Thomashow, 1999). Jelikož je mrazuvzdornost kvantitativní znak, nemůže být spojena s přítomností či nepřítomností jediné alely, která by mohla být použitelná jako molekulární marker. Bylo zjištěno, že změny v úrovni dosažené mrazuvzdornosti za podmínek chladové aklimace poměrně dobře korelují se změnami v expresi a akumulaci některých chladově indukovaných strukturních proteinů. Významnou skupinou chladově indukovaných strukturních proteinů jsou COR/LEA proteiny, jejichž hromadění v rostlinných pletivech je spojeno s buněčnou 1

dehydratací. Buněčná dehydratace je důležitou součástí některých fyziologických procesů - např. zrání rostlinných embryí - anebo výsledkem působení různých abiotických stresových faktorů včetně chladu a mrazu. Jedna skupina COR/LEA proteinů se proto nazývá dehydriny (LEA II proteiny). V roce 1992 Houde et al. popsali u pšenice chladově indukovaný dehydrin WCS120 a navrhli tento protein jako možný marker dosažené úrovně mrazuvzdornosti. Tato hypotéza byla ověřována i v naší laboratoři, kde Vítámvás et al. (2007) rozlišili po třech týdnech otužování dvě různě odolné odrůdy ozimé pšenice (Mironovská 808 a Bezostá) na základě různé úrovně akumulace dehydrinu WCS120 v listových pletivech. U ječmene byl popsán ortolog pšeničného genu Wcs120 a pojmenován jako gen Dhn5 (Close et al., 1995). Akumulace proteinu DHN5 v podmínkách chladu byla prokázána několika výzkumnými skupinami (Van Zee et al., 1995; Bravo et al., 1999; Zhu et al., 2000). Souvislost mezi kvantitativní akumulací dehydrinu DHN5 a dosaženou úrovní mrazuvzdornosti nicméně u ječmene dosud prokázána nebyla. Proto bylo jedním z cílů mé disertační práce studium vztahu mezi kvantitativní akumulací dehydrinu DHN5 a dosaženou úrovní mrazuvzdornosti. 2

Cíle disertační práce Hlavním cílem disertační práce bylo studium vztahů mezi vývojem (jarovizací), dosaženou úrovní mrazuvzdornosti a akumulací dehydrinů (případně dalších COR proteinů) u ječmene v podmínkách chladové aklimace (otužení). K vyřešení tohoto hlavního cíle jsem si stanovila několik dílčích cílů: Prostudovat literární poznatky o vztahu mezi regulací vývoje a mrazuvzdorností u ječmene a pšenice za podmínek chladové aklimace (publikace 1). Prostudovat literární poznatky o vlastnostech dehydrinů a jejich úloze v procesu chladové aklimace (publikace 2). Detekovat chladově indukované dehydriny u ječmene a zvolit vhodnou metodu jejich detekce a kvantifikace. Zjistit, zda může být některý dehydrin (resp. kvantitativní úroveň akumulace tohoto dehydrinu) použit pro rozlišení odrůd s různou úrovní mrazuvzdornosti. (Předpokládá se využití proteinu DHN5, jehož akumulace za podmínek chladu již byla popsána v literatuře). Sledovat dynamiku vývoje mrazuvzdornosti a exprese genu Dhn5 a akumulace proteinu DHN5 v souboru odrůd různého geografického původu a růstového typu - přesívky, ozimé a jarní odrůdy (publikace 3). Zjistit, zda existuje vztah mezi kvantitativní akumulací dehydrinu DHN5 a dosaženou úrovní mrazuvzdornosti v určité fázi chladového otužení (publikace 3). Sledovat dynamiku vývoje mrazuvzdornosti a akumulace proteinu DHN5 u odrůd Atlas 68 (jarní odrůda) a Igri (ozimá odrůda) v průběhu dlouhodobého otužování (publikace 4). Zjistit, zda existuje vztah mezi přechodem z vegetativní fáze vývoje do reproduktivní fáze vývoje a mezi změnami ve vývoji mrazuvzdornosti a akumulace dehydrinu DHN5 u odrůd Atlas 68 a Igri (publikace 4). Objasnit vztah mezi růstovým typem, dosaženou úrovní mrazuvzdornosti a akumulací dehydrinu DHN5 u sady vybraných dihaploidních (DH) linií odvozených z křížení mezi odrůdami Atlas 68 a Igri (publikace 4). 3

Výsledky a diskuse 1. Zjišťování možnosti využití chladově indukovaných dehydrinů (proteinů) pro odlišení odrůd ječmene s rozdílnou úrovní dosažené mrazuvzdornosti Na základě údajů z literatury jsem se zabývala možností využití dehydrinů (na proteinové úrovni) k rozlišení odrůd ječmene s rozdílnou úrovní dosažené mrazuvzdornosti. Na transkripční úrovni byla u ječmene za podmínek chladové aklimace popsána exprese genů Dhn5, Dhn8 a Dhn11 (Choi et al., 1999; Zhu et al., 2000). Na úrovni proteinové exprese byla popsána výrazná akumulace jednoho vysokomolekulárního dehydrinu - podle elektroforeogramů označovaného jako protein o molekulové hmotnosti 80-90 kda, čemuž dle údajů ze sekvenčních databází (databáze NCBI) odpovídá jedině protein DHN5 (molekulová hmotnost vypočtená na základě znalosti proteinové sekvence je 66,5 kda) (Van Zee et al., 1995; Bravo et al., 1999; Zhu et al., 2000). Zatímco Van Zee et al. (1995) nenalezli v podmínkách chladové aklimace významné kvantitativní rozdíly v akumulaci proteinu DHN5 mezi jarní odrůdou Morex a vysoce odolnou přesívkou Dicktoo, Zhu et al. (2000) naopak kvantitativní rozdíly v akumulaci DHN5 u stejných odrůd (Morex a Dicktoo), avšak pěstovaných za poněkud odlišných podmínek, nalezli. Proto jsem nejprve testovala možnost využití proteinu DHN5 nebo jiného dehydrinu pro rozlišení odrůd s různou úrovní dosažené mrazuvzdornosti. Srovnávala jsem akumulaci teplotně stabilních proteinů (dehydriny patří mezi teplotně stabilní proteiny, které zůstávají ve vodných roztocích rozpuštěny i po varu) u jarní odrůdy Atlas 68 (odrůda citlivá na chlad) a ozimé odrůdy Igri (relativně odolná odrůda) a nalezla jsem v průběhu dlouhodobého otužování (0-16 týdnů otužování) kvantitativní rozdíly v akumulaci proteinu DHN5. Identitu proteinu DHN5 jsem potvrdila na imunoblotech za použití specifické primární protilátky. Proto jsem mohla dospět k závěru, že protein DHN5 mohu použít k rozlišení odrůd s různou úrovní mrazuvzdornosti. K dalším pokusům jsem pak používala metodu jednorozměrné elektroforézy (1D SDS-PAGE; Laemmli, 1970) spojenou s detekcí dehydrinů na imunoblotech pomocí specifické primární protilátky proti specifické dehydrinové sekvenci, tzv. K-segmentu (Close et al., 1993). Dosaženou úroveň mrazuvzdornosti jsem stanovovala jako hodnoty LT 50 (letální teplota, kterou 50 % vzorku nepřežije) pomocí metody přímého mrazového testu podle Janáčka a 4

Prášila (1991) spojené s následným konduktometrickým hodnocením stupně poškození listových segmentů podle Prášila a Zámečníka (1998). 2. Dynamika vývoje, dosažené úrovně mrazuvzdornosti a akumulace proteinu DHN5 v podmínkách dlouhodobého otužení 2.1. Počáteční stadia otužení (0-14 dnů) V počátečních stadiích otužení byla sledována exprese genu Dhn5, akumulace proteinu DHN5 a vývoj dosažené úrovně mrazuvzdornosti u sady dvaceti jedna odrůd zastupujících všechny růstové typy - jarní, ozimý a přesívka (Tab. 1). Exprese genu Dhn5 byla stanovována dr. Holkovou z MZLU Brno pomocí metody kvantitativní PCR (tzv. real-time PCR). Gen Dhn5 není v listech ječmene pěstovaného za optimálních teplot (20 C a vyšší) exprimován. Po vystavení rostlin podmínkám chladové aklimace je Dhn5 exprimován u všech růstových typů. Kvantitativní exprese genu Dhn5 vykazuje typický průběh: nejprve rychlý a výrazný nárůst exprese s dosažením maxima po 3-7 dnech otužení a pak následný pokles a dosažení nízké ustálené (steady-state) hladiny exprese ve stabilních kultivačních podmínkách (nepřerušená chladová aklimace). Na úrovni exprese genu Dhn5 nebyly mezi jednotlivými růstovými typy (přesívky, jarní a ozimé odrůdy) zjištěny žádné statisticky významné rozdíly (Obr. 1A). 5

Obdobně jako u genu Dhn5 nebyla zjištěna přítomnost v neotužených listových pletivech ani u proteinu DHN5. Po vystavení chladu se začal protein DHN5 akumulovat u všech tří růstových typů. S postupující délkou chladového působení se rozdíly v akumulaci proteinu DHN5 mezi jednotlivými růstovými typy zvyšovaly s tím, že množství naakumulovaného proteinu DHN5 přestalo narůstat u jarních odrůd, zatímco u ozimých odrůd a přesívek množství naakumulovaného proteinu DHN5 i nadále rostlo (Obr. 1B). Po vystavení rostlin podmínkám chladové aklimace se rovněž začala u všech odrůd zvyšovat úroveň dosažené mrazuvzdornosti. Počáteční nárůst indukované mrazuvzdornosti byl velký u všech odrůd, avšak postupně se začaly projevovat rozdíly mezi jednotlivými růstovými typy. U jarních odrůd se nárůst chladově indukované mrazuvzdornosti po zhruba 7 dnech otužování výrazně zpomalil, zatímco u přesívek a ozimých odrůd se indukovaná mrazuvzdornost zvyšovala výrazně ještě po 14 dnech otužování (Obr. 1C). Tyto výsledky, tj. rychlý nárůst indukované mrazuvzdornosti, hladiny Dhn5 mrna i akumulace proteinu DHN5 na počátku otužování a následné zpomalení tohoto trendu, jsou v souladu s výsledky obdobných studií prováděných na ozimých a jarních odrůdách pšenice (např. Danyluk et al., 2003; Kane et al., 2005; Ganeshan et al., 2008). Tyto rozdíly v dynamice vývoje mrazuvzdornosti mohou být vysvětleny pomocí výsledků získaných Monroy et al. (2007) v transkriptomické studii provedené na jednom ozimém a jednom jarním kultivaru pšenice s velkým rozdílem v mrazuvzdornosti (9 C). Monroy et al. zjistili, že chlad vedl k prudké indukci exprese mnoha chladově indukovaných transkriptů (mrna) u obou odrůd, ale pouze ozimá odrůda si dokázala udržet zvýšenou hladinu těchto transkriptů po delší dobu. Ve svých experimentech jsem obdobnou dynamiku zjistila v případě hodnot dosažené úrovně mrazuvzdornosti a akumulace proteinu DHN5, avšak nikoliv v případě exprese genu Dhn5. V tomto případě je nutno zdůraznit, že dynamika exprese určitého genu na transkripční úrovni a na proteinové úrovni spolu vždy si nemusí vždy navzájem odpovídat, a také, že dynamika akumulace proteinu odpovídá lépe dynamice vývoje indukované mrazuvzdornosti ve srovnání s expresí genu Dhn5 na transkripční úrovni. Lze tedy dospět k závěru, že rozdíly mezi odrůdami s různou úrovní mrazuvzdornosti lze pozorovat pouze na úrovni akumulace proteinu DHN5, nikoliv na úrovni exprese genu Dhn5 (transkripční úroveň). 6

Tabulka 1. 21 odrůd ječmene, jejich geografický původ, růstový typ (J - jarní; O - ozimý; P - přesívka), počet řad v klasu a jejich mrazuvzdornost stanovená jako LT 50 po 3 týdnech otužení. Odrůdy jsou seřazeny sestupně podle jejich hodnot. Zkratky: CZE Česká republika, DEU Německo, DNK Dánsko, FRA Francie, GBR Velká Británie, NLD Nizozemí, NOR Norsko, RUS Rusko, USA Spojené Státy Americké Zkratka Růstový typ LT 50 Odrůda Původ Počet řad ( C) v klasu Lunet Ln CZE P šestiřadý -15,6 Dicktoo Dc USA P šestiřadý -15,3 Luxor Lx CZE O šestiřadý -15,2 Okal Ok CZE O šestiřadý -15,1 Hutorok Hu RUS O šestiřadý -14,8 Tiffany Ti DEU O dvouřadý -14,5 Luran Lr CZE O šestiřadý -14,4 Kromir Ko CZE P šestiřadý -14,3 Kromoz Km CZE O šestiřadý -14,3 Campill Ca DEU O šestiřadý -14,2 Vilna Vi NLD O dvouřadý -13,8 Jolante Jl DEU O dvouřadý -13,5 Igri Ig DEU O dvouřadý -13,4 Duet Du GBR O dvouřadý -13,1 Atlas 68 At USA J šestiřadý -11,5 Prestige Pr FRA J dvouřadý -11,2 Jotun Jt NOR J šestiřadý -11,0 Braemar Br GBR J dvouřadý -10,9 Diamant Da CZE J dvouřadý -10,9 Sebastian Se DNK J dvouřadý -10,9 Amulet Am CZE J dvouřadý -10,0 2.2. Pozdější stadia otužení (14-112 dnů) Experimenty týkající se pozdějších stadií otužování byly prováděny na jarní odrůdě Atlas 68, ozimé odrůdě Igri a sadě dvaceti jedna vybraných dihaploidních (DH) linií odvozených z křížení mezi odrůdami Atlas 68 a Igri. Vybrané DH linie buď vykazovaly jarovizační požadavek (ozimé linie) anebo žádnou jarovizaci neměly (jarní linie). 7

Prodloužení doby kultivace v podmínkách chladové aklimace vedlo u ozimých linií k výraznému zkrácení následné doby kultivace za optimálních teplotních podmínek nutné k vymetání rostlin. Tímto způsobem byl zjištěn jarovizační požadavek rostlin. U Igri byl stanoven jarovizační požadavek na cca 63 dnů otužení při kultivaci při 3 C a 12 hodinové fotoperiodě. U jarních linií vliv délky otužení na dobu následné kultivace za optimálních teplotních podmínek nezbytnou pro vymetání rostlin zjištěn nebyl (Obr. 2A). Tato doba se shoduje se stadiem dvojitých hrbolků u vzrostného vrcholu. Stadium dvojitých hrbolků indikuje nevratný přechod do reproduktivní fáze vývoje rostlin (Hay a Ellis, 1998). Danyluk et al. (2003) zjistili, že exprese vernalizačního genu VRN-1, která je nezbytná k přechodu rostlin do reproduktivního stadia vývoje (Shitsukawa et al., 2007), časově předchází stadium dvojitých hrbolků. Otužení také vedlo k nárůstu hodnot dosažené mrazuvzdornosti u odrůd Atlas 68 i Igri (Obr. 2B). V počátečních stadiích otužení byl nárůst mrazuvzdornosti u obou odrůd rychlý, v pozdějších stadiích se však začaly mezi nimi objevovat rozdíly. U odrůdy Atlas 68 přestala mrazuvzdornost dále růst (přestaly klesat hodnoty LT 50 ), zatímco u Igri klesaly hodnoty LT 50 výrazně delší dobu. Minimální hodnoty LT 50 byly u odrůdy Atlas 68 výrazně vyšší (cca -13 C) než u odrůdy Igri (cca -17 C) a bylo jich dosaženo výrazně dříve (cca 35 dnů otužení pro maximální hodnotu LT 50 u odrůdy Atlas 68 ve srovnání s cca 70 dny otužení pro maximální hodnotu LT 50 u odrůdy Igri). Po dosažení maximálních hodnot indukované mrazuvzdornosti (minimálních hodnot LT 50 ) došlo v dalších stadiích otužení u odrůdy Atlas 68 k poklesu mrazuvzdornosti, zatímco u odrůdy Igri mrazuvzdornost výrazně neklesla až do konce otužení (112 dnů). Obdobné výsledky jsem získala i u DH linií (Obr. 3B), kde míra přežití rostlin po mrazovém testu dosáhla u jarních linií maxima po 21 dnech otužení a v pozdějších stadiích otužení míra přežití rostlin v případě 8

jarních linií klesala, zatímco u ozimých linií naopak míra přežití rostlin dále rostla až do doby 63 dnů otužení. I po 84 dnech otužení zůstala u ozimých linií úroveň přežití rostlin po přímém mrazovém testu (pro test byla ve všech případech použita sada tří teplot -10 C, -12 C a -14 C) vysoká, zatímco u jarních odrůd byla ve stejné fázi otužení úroveň přežití rostlin relativně nízká. Úroveň akumulace proteinu DHN5 v průběhu prvních 25 dnů otužení u odrůdy Atlas 68 i odrůdy Igri rostla a mezi odrůdami jsem nezjistila statisticky významné rozdíly (Obr. 2C a Obr. 4). Za 25 dnů otužení dosáhla odrůda Atlas 68 maximální akumulace proteinu DHN5, pak následoval u této odrůdy významný pokles hladiny naakumulovaného proteinu DHN5. Obdobně byla u jarních DH linií zjištěna nejvyšší míra akumulace proteinu DHN5 po 21 dnech otužení. Naproti tomu u odrůdy Igri akumulace proteinu DHN5 stále rostla až do 63 dnů otužení (splnění jarovizačního požadavku). Teprve v pozdějších stadiích otužení (63-112 dnů) hladina akumulace proteinu DHN5 u Igri klesala. Obdobné výsledky jsem získala i u ozimých DH linií; největší rozdíl v akumulaci proteinu DHN5 mezi ozimými a jarními DH liniemi jsem nalezla při 63 dnech otužení (Obr. 3C a Obr. 5). Po 112 dnech otužení byla již akumulace DHN5 u odrůdy Igri relativně nízká a výrazně se nelišila od odrůdy Atlas 68. Zjistila jsem, že splnění jarovizačního požadavku vede k poklesu akumulace proteinu DHN5. Tento výsledek odpovídá tzv. vývojové teorii (developmental theory) formulované Fowlerem et al. (1999), kteří přišli s myšlenkou, že přechod z vegetativního stadia vývoje do reproduktivního stadia vývoje vede k poklesu schopnosti rostlin indukovat mrazuvzdornost a akumulovat COR proteiny za podmínek chladové aklimace. Já jsem však pozorovala, že Igri a ozimé DH linie si dokázaly udržet zvýšenou úroveň mrazuvzdornosti i po splnění jarovizačního požadavku (prakticky až do konce otužování). Množství naakumulovaného proteinu DHN5 však u Igri i u ozimých DH linií po splnění jarovizačního 9

požadavku klesalo. Významný rozdíl mezi dynamikou indukované mrazuvzdornosti a akumulace dehydrinu (na proteinové úrovni) zjistili Vítámvás a Prášil (2008) při sledování akumulace proteinu WCS120 u ozimé odrůdy pšenice Mironovská 808 po splnění jarovizačního požadavku. Tento jev naznačuje, že akumulace dehydrinů na proteinové úrovni může být používána jako marker dosažené úrovně mrazuvzdornosti jen u těch rostlin ječmene či pšenice, které jsou ve vegetativní fázi vývoje. Naopak využití akumulace dehydrinů jako markerů dosažené úrovně mrazuvzdornosti v reproduktivní fázi vývoje rostlin se jeví jako značně problematické. Mohu tedy shrnout, že studium vlivu dlouhodobého otužení na sadu rostlin ječmene tvořenou odrůdami Atlas 68, Igri a vybranými DH liniemi ukázalo, že vztah mezi růstovým typem rostlin a dosaženou úrovní mrazuvzdornosti a akumulace proteinu DHN5 je v počátečních stadiích otužení poměrně nevýznamný, tj. křížením lze získat jarní DH linie s relativně vysokou úrovní dosažené mrazuvzdornosti a obráceně (ozimé DH linie s relativně nízkou úrovní dosažené mrazuvzdornosti). Jedno z možných vysvětlení tohoto jevu může spočívat ve skutečnosti, že v geonomu ječmene bylo kromě hlavního lokusu mrazuvzdornosti (lokus Fr-H1) nacházejícího se v těsné vazbě s hlavním lokusem pro jarovizaci (lokus Vrn- H1) identifikováno více lokusů majících vliv na mrazuvzdornost. Jde především o lokus Fr- H2, do něhož již byl lokalizován klastr CBF genů (Choi et al., 2002; Francia et al., 2004; Skinner et al., 2005), které jsou známy ze studií prováděných na Arabidopsis thaliana jako významné chladově indukované transkripční faktory, které mimo jiné aktivují expresi různých Cor genů (Jaglo-Ottosen et al., 1998). Aktivace Cor genů za chladu prostřednictvím CBF transkripčních faktorů byla prokázána i u Triticeae (pšenice a ječmen). Nedávno pak publikovali Badawi et al. (2007; pšenice) a Stockinger et al. (2007; ječmen) práce, v nichž ukazují, že se různě odolné odrůdy (jarní a ozimé odrůdy) liší úrovní exprese řady CBF genů nejen za chladu, ale i za optimálních teplotních podmínek. Stockinger et al. (2007) ve své práci potvrdili významný vliv lokusu Vrn-H1/Fr-H1 na úroveň exprese mnoha HvCBF genů 10

(především genů HvCBF2 a HvCBF4) lokalizovaných v oblasti Fr-H2. Knox et al. (2008) dokonce detekovali alelickou variabilitu u jednoho genu TmCBF (gen TmCBF12 lokalizovaný ve střední části klastru TmCBF genů v lokusu Fr-A m 2) u pšenice jednozrnky (Triticum monococcum). Tito vědci zjistili, že citlivá jarní linie má v geonomu zastoupenu nefunkční alelu genu TmCBF12, která se v důsledku dalece v oblasti domény AP2 nedokáže vázat do CRT/DRE oblastí v promotorech Cor genů a nedokáže tudíž indukovat jejich expresi. Výsledky získané u sady odrůd Atlas 68, Igri a DH linií tudíž mohou být interpretovány na základě existence a vzájemné výměny dalších Fr lokusů kromě lokusu Vrn-H1/Fr-H1 mezi jarními a ozimými liniemi. Tyto výměny pak mohou vést ke snížení rozdílů v dosažené úrovni mrazuvzdornosti a akumulaci proteinu DHN5 mezi jarními a ozimými DH liniemi. Nicméně ani poměrně odolné jarní linie nejsou schopny dosáhnout takových maximálních hodnot indukované mrazuvzdornosti (minimálních hodnot LT 50 ) a maximálních hodnot akumulace proteinu DHN5, které by byly srovnatelné s ozimými liniemi. Důvodem je odlišná časová dynamika vývoje mrazuvzdornosti u jarních a ozimých linií za stejných podmínek chladové aklimace, která je podmíněna jejich odlišným vývojem. U jarních DH linií vede absence jarovizačního požadavku k rychlému přechodu do reproduktivní fáze vývoje rostlin, což je spojeno se poklesem mrazuvzdornosti. U ozimých DH linií naopak jarovizační požadavek brání předčasnému přechodu do reproduktivní fáze vývoje spojenému s poklesem mrazuvzdornosti. Mohu tedy tvrdit, že růstový typ nemá rozhodující vliv na úroveň dosažené mrazuvzdornosti a akumulace proteinu DHN5 u rostlin ječmene v počátečních stadiích otužení, avšak růstový typ zásadně ovlivňuje schopnost rostlin ječmene udržet si (angl. 11

maintenance) si zvýšenou úroveň mrazuvzdornosti a akumulace proteinu DHN5 v pozdějších stadiích dlouhodobého otužení. 3. Vztah mezi akumulací proteinu DHN5 a dosaženou úrovní mrazuvzdornosti Od doby publikace práce Houde et al. (1992) je známo, že chladově indukovaný dehydrin WCS120 (resp. míra jeho akumulace na proteinové úrovni) může být využíván jako marker dosažené úrovně mrazuvzdornosti u pšenice. U ječmene byl identifikován ortolog pšeničného genu Wcs120 a nazván Dhn5 (Close et al., 1995). Chladově indukovaná exprese genu Dhn5 byla popsána na transkripční i proteinové úrovni (Van Zee et al., 1995; Bravo et al., 1999; Choi et al., 1999; Zhu et al., 2000), avšak dosud nebyl publikován nějaký vztah mezi kvantitativní úrovní exprese proteinu DHN5 a dosaženou úrovní mrazuvzdornosti u ječmene. Ve svém experimentu jsem použila sadu dvaceti jedné odrůd ječmene různého geografického původu, v níž byly zastoupeny všechny růstové typy - jarní a ozimé linie i přesívky. Jednotlivé odrůdy se lišily rovněž maximální dosaženou úrovní mrazuvzdornosti (Tab. 1). Ve 21 dnech otužení byla u většiny odrůd dosažena dostatečně vysoká úroveň mrazuvzdornosti, takže již byly zjištěny výrazné rozdíly mezi odrůdami. V čase jsem rovněž analyzovala úroveň akumulace proteinu DHN5 v listových pletivech a zjistila jsem statisticky významnou (r = 0,9) korelaci mezi kvantitativní akumulací proteinu DHN5 a dosaženou úrovní mrazuvzdornosti (Obr. 6). Musím však zdůraznit, že tuto korelaci jsem získala jen tehdy, když jsem hodnotila relativně velký soubor odrůd s výraznými rozdíly v hodnotách dosažené mrazuvzdornosti. Když jsem počítala např. pouze s jarními liniemi anebo pouze s ozimými liniemi a s přesívkami, 12

statisticky významnou korelaci mezi akumulací proteinu DHN5 a dosaženou úrovní mrazuvzdornosti jsem nezískala. Jak jsem již zmínila v oddíle 2.2., úroveň akumulace proteinu DHN5 a dosažená úroveň mrazuvzdornosti korelují pouze u rostlin ve vegetativním stadiu vývoje. Po přechodu do reproduktivního stadia jsem zjistila rozdíly v dynamice vývoje indukované mrazuvzdornosti a akumulace proteinu DHN5, které omezují využití proteinu DHN5 jako markeru indukované mrazuvzdornosti pouze na vegetativní stadia vývoje rostlin. 13

Závěry V tomto oddíle shrnuji hlavní výsledky, které jsem získala v publikacích 3 a 4. Na základě poznatků z literatury a na základě vlastních experimentů jsem prokázala, že protein DHN5 může být používán k rozlišení odrůd ječmene s různou úrovní dosažené mrazuvzdornosti. Pro detekci rozdílů v akumulaci proteinu DHN5 jsem se rozhodla použít metodu 1D SDS-PAGE spojenou s detekcí proteinu DHN5 na imunoblotech pomocí specifické primární protilátky. Chlad vede k indukci zvýšené úrovně mrazuvzdornosti a k indukci exprese genu Dhn5 a proteinu DHN5 u odrůd ječmene patřících ke všem růstovým typům - přesívky, ozimé i jarní odrůdy. V průběhu otužení se však objevují rozdíly spojené s různým růstovým typem, které jsou pravděpodobně podmíněny různým vývojem rostlin. Jarní odrůdy, které nemají jarovizaci, ustávají ve zvyšování indukované mrazuvzdornosti a akumulace proteinu DHN5 dříve než odrůdy ozimé a přesívky (přesívky sice také nemají jarovizaci, ale dokáží indukovat mrazuvzdornost srovnatelnou s ozimými odrůdami v důsledku obdobného vývoje - schopnosti setrvat poměrně dlouhou dobu ve vegetativní fázi vývoje za podmínek krátkodenního světelného režimu). Akumulace proteinu DHN5 je indukována chladem a míra akumulace proteinu DHN5 je u různě odolných odrůd odlišná. U sady 21 odrůd byla zjištěna statisticky významná korelace mezi akumulací proteinu DHN5 a dosaženou úrovní mrazuvzdornosti po 21 dnech otužení. Nutno však připomenout, že tato korelace byla zjištěna především proto, že v souboru odrůd použitém v tomto pokuse byly zjištěny velké rozdíly v dosažené úrovni mrazuvzdornosti. Po vystavení rostlin chladovému působení se jak u jarní odrůdy Atlas 68, tak i u ozimé odrůdy Igri zvýšila úroveň dosažené mrazuvzdornosti. U obou odrůd se rovněž začal akumulovat protein DHN5. V průběhu otužení se však mezi oběma odrůdami objevily rozdíly, které souvisely s odlišnou dynamikou jejich vývoje. Zatímco u odrůdy Atlas 68 začala úroveň dosažené mrazuvzdornosti a akumulace proteinu DHN5 klesat již po 3 týdnech otužení, u rostlin odrůdy Igri se úroveň indukované mrazuvzdornosti a akumulace proteinu DHN5 zvyšovala až do doby splnění jarovizačního požadavku (9 týdnů otužení). U odrůdy Atlas 68 jsem totiž prokázala jsem výrazně časnější přechod do reproduktivního stadia vývoje ve srovnání s odrůdou Igri. 14

Na základě souběžného sledování dynamiky indukované mrazuvzdornosti, akumulace proteinu DHN5 a vývoje vzrostného vrcholu mohu tvrdit, že přechod do reproduktivního stadia vývoje (indikovaný tvorbou dvojitých hrbolků) předchází pokles dosažené úrovně mrazuvzdornosti a akumulace proteinu DHN5 u odrůdy Atlas 68 i u odrůdy Igri. Dále mohu na základě svých výsledků tvrdit, že vzájemný vztah mezi akumulací proteinu DHN5 a dosaženou úrovní mrazuvzdornosti je závislý na vývojovém stadiu rostlin. Korelaci mezi akumulací proteinu DHN5 a dosaženou úrovní mrazuvzdornosti jsem nalezla pouze u rostlin ve vegetativním stadiu vývoje. Naopak u rostlin v reproduktivním stadiu vývoje jsem nalezla výrazné rozdíly v dynamice vývoje dosažené mrazuvzdornosti a akumulace proteinu DHN5. Tyto rozdíly mohou být vysvětleny tím, že mrazuvzdornost je kvantitativní znak determinovaný mnoha faktory a úroveň akumulace dehydrinů je pouze jedním z nich. Studium vlivu otužení na sadu odrůd Atlas 68, Igri a soubor dihaploidních linií ukázalo, že růstový typ nemá rozhodující vliv na akumulaci proteinu DHN a na dosaženou úroveň mrazuvzdornosti v počátečních stadiích otužení, avšak rozhodujícím způsobem ovlivňuje dlouhodobé udržení (angl. maintenance) zvýšené úrovně indukované mrazuvzdornosti a akumulace proteinu DHN5 v průběhu dlouhodobého otužení. 15

Citovaná literatura Andersen, J.R., Lübberstedt, T.: Functional markers in plants. - Trends Plant Sci. 8: 554-560, 2003. Ba dawi, M., Danyluk, J., Boucho, B., Houde, M., Sarhan, F.: The CBF gene family in hexaploid wheat and its relationship to the phylogenetic complexity of cereal CBFs. - Mol. Genet. Genomics 277: 533-554, 2007. Bravo, L.A., Close, T.J., Corcuera, L.J., Guy, Ch.L.: Characterization of an 80-kDa dehydrin-like protein in barley responsive to cold acclimation. - Physiol. Plant. 106: 177-183, 1999. Choi, D.W., Zhu, B., Close, T.J.: The barley (Hordeum vulgare L.) dehydrin multigene family: sequences, allele types, chromosome assignments, and expression characteristics of 11 Dhn genes of cv. Dicktoo. - Theor. Appl. Genet. 98: 1234-1247, 1999. Close, T.J., Fenton, R.D., Moonan, F.: A view of plant dehydrins using antibodies specific to the carboxy terminal peptide. - Plant Mol. Biol. 23: 279-286, 1993. Close, T.J., Meyer, N.C., Radik, J.: Nucleotide sequence of a gene encoding a 58.5-kilodalton barley dehydrin that lacks a serine tract. - Plant Gene Register. Plant Physiol. 107: 289-290, 1995. Danyluk, J., Kane, N.A., Breton, G., Limin, A.E., Fowler, D.B., Sarhan, F.: TaVRT-1, a putative transcription factor associated with vegetative to reproductive transition in cereals. - Plant Physiol. 132: 1849-1860, 2003. Fowler, D.B.: Cold acclimation threshold induction temperatures in cereals. - Crop Sci. 48: 1147-1154, 2008. Fowler, D.B., Carles, R.J.: Growth, development, and cold tolerance of fall-acclimated cereal grains. - Crop Sci. 19: 915-922, 1979. Fowler, D.B., Limin, A.E., Ritchie, J.T.: Low-temperature tolerance in cereals: model and genetic interpretation. - Crop Sci. 39: 626-633, 1999. Fra ncia, E., Rizza, F., Cattivelli, L., Stanca, A.M., Galiba, G., Tóth, B., Hayes, P.M., Skinner, J.S., Pecchioni, N.: Two loci on chromosome 5H determine low-temperature tolerance in a Nure (winter) Tremois (spring) barley map. - Theor. Appl. Genet. 108: 670-680, 2004. Ganeshan, S., Vítámvás, P., Fowler, D.B., Chibbar, R.N.: Quantitative expression analysis of selected COR genes reveals their differential expression in leaf and crown tissues of wheat (Triticum aestivum L.) during an extended low temperature acclimation regimen. - J. Exp. Bot. 59: 2393-2402, 2008. Guy, C.L.: Cold acclimation and freezing stress tolerance: role of protein metabolism. - Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 41: 187-223, 1990. Hay, R.K.M., Ellis, R.P.: The control of flowering in wheat and barley: what recent advances in molecular genetics can reveal. - Ann. Bot. 82: 541-554, 1998. Houde, M., Dhindsa, R.S., Sarhan, F.: A molecular marker to select for freezing tolerance in Gramineae. - Mol. Gen. Genet. 234: 43-48, 1992. Jag lo-ottosen, K.R., Gilmour, S.J., Zarka, D.G., Schabenberger, O., Thomashow, M.F.: Arabidopsis CBF1 overexpression induces COR genes and enhances freezing tolerance. - Science 280: 104-106, 1998. Janáček, J., Prášil, I.T.: Quantification of plant frost injury by nonlinear fitting of an S-shaped function. - Cryo-Lett. 12: 47-52, 1991. Ka ne, N.A., Danyluk, J., Tardif, G., Quellet, F., Laliberté, J.F., Limin, A.E., Fowler, D.B., Sarhan, F.: TaVRT-2, a member of the St-MADS-11 clade of flowering repressors, is regulated by vernalization and photoperiod in wheat. - Plant Physiol. 138: 2354-2363, 2005. Knox, A.K., Li, C., Vágújfalvi, A., Galiba, G., Stockinger, E.J., Dubcovsky, J.: Identification of candidate CBF genes for the frost tolerance locus Fr-A m 2 in Triticum monococcum. - Plant Mol. Biol. 67: 257-270, 2008. La emmli, U.K.: Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. - Nature 227: 680-685, 1970. Mo nroy, A.F., Dryanova, A., Malette, B., Oren, D.H., Farajalla, M.R., Liu, W., Danyluk, J., Ubayasena, W.C., Kane, K., Scoles, G.J., Sarhan, F., Gulick, P.J.: Regulatory gene candidates and gene expression analysis of cold acclimation in winter and spring wheat. - Plant Mol. Biol. 64: 409-423, 2007. 16

Prášil, I., Zámečník, J.: The use of a conductivity measurement method for assessing freezing injury. I. Influence of leakage time, segment number, size and shape in a sample on evaluation of the degree of injury. - Environ. Exp. Bot. 40: 1-10, 1998. Sa kai, A., Larcher, W.: Frost survival of plants. Responses and adaptation to freezing stress. Springer Verlag Berlin Heidelberg New York London Paris Tokyo 1985. Sarhan, F., Ouellet, F., Vazquez-Tello, A.: The wheat wcs120 gene family. A useful model to understand the molecular genetics of freezing tolerance in cereals. - Physiol. Plant. 101: 439-445, 1997. Sh itsukawa, N., Ikari, C., Shimada, S., Kitagawa, S., Sakamoto, K., Saito, H., Ryuto, H., Fukunishi, N., Abe, T., Takumi, S., Nasuda, S., Murai, K.: The einkorn wheat (Triticum monococcum) mutant, maintained vegetative phase, is caused by a deletion in the VRN1 gene. - Genes Genet. Syst. 82: 167-170, 2007. Skinner, J.S., von Zitzewitz, J., Szücs, P., Marquez-Cedillo, L., Filichkin, T., Amundsen, K., Stockinger, E.J., Thomashow, M.F., Chen, T.H.H., Hayes, P.M.: Structural, functional, and phylogenetic characterization of a large CBF gene family in barley. - Plant Mol. Biol. 59: 533-551, 2005. Stockinger, E.J., Gilmour, S.J., Thomashow, M.F.: Arabidopsis thaliana CBF1 encodes an AP2 domaincontaining transcriptional activator that binds to the C-repeat/DRE, a cis-acting DNA regulatory element that stimulates transcription response to low temperature and water deficit. - Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 1034-1040, 1997. Stockinger, E.J., Skinner, J.S., Gardner, K.G., Francia, E., Pecchioni, N.: Expression levels of barley Cbf genes at the Frost resistance-h2 locus are dependent upon alleles at Fr-H1 and Fr-H2. - Plant J. 51: 308-321, 2007. Thomashow, M.F.: Plant cold acclimation: Freezing tolerance genes and regulatory mechanisms. - Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 50: 571-599, 1999. Van Zee, K., Chen, F.Q., Hayes, P.M., Close, TJ., Chen, T.H.H.: Cold-specific induction of a dehydrin gene family member in barley. - Plant Physiol. 108: 1233-1239, 1995. Vítámvás, P., Prášil, I.T.: WCS120 protein family and frost tolerance during cold acclimation, deacclimation and reacclimation in winter wheat. - Plant Physiol. Biochem. 46: 970-976, 2008. Vítámvás, P., Saalbach, G., Prášil, I.T., Čapková, V., Opatrná, J., Jahoor, A.: WCS120 protein family and proteins soluble upon boiling in cold-acclimated winter wheat. - J. Plant Physiol. 164: 1197-1207, 2007. Zhu, B., Choi, D.W., Fenton, R., Close, T.J.: Expression of the barley dehydrin multigene family and the development of freezing tolerance. - Mol. Gen. Genet. 264: 145-153, 2000. 17

Seznam publikací Originální práce Kosová, K., Haisel, D., Tichá, I. (2005): Photosynthetic performance of two maize genotypes as affected by chilling stress. Plant, Soil, Environment 51 (5): 206-212. Kosová, K., Holková, L., Prášil, I.T., Prášilová, P., Bradáčová, M., Vítámvás, P., Čapková, V. (2008): Expression of dehydrin 5 during the development of frost tolerance in barley (Hordeum vulgare). Journal of Plant Physiology 165 (11): 1142-1151. Kosová, K., Prášil, I.T., Prášilová, P., Vítámvás, P., Chrpová, J.: The development of frost tolerance and DHN5 protein accumulation in a set of barley (Hordeum vulgare) doubled haploid lines derived from Atlas 68 Igri cross during a long-term cold acclimation. Submitted to Environmental and Experimental Botany. Literární rešerše Kosová, K., Tichá, I. (2005): Vliv chladu na fotosyntézu u rostlin citlivých vůči chladu. Biologické listy 70 (2): 107-128. Kosová, K., Vítámvás, P., Prášil, I.T. (2007): The role of dehydrins in plant response to cold. Biologia Plantarum 51 (4): 601-617. Vítámvás, P. Kosová, K., Prášil, I.T. (2007): Proteome analysis in plant stress research. Czech Journal of Genetics and Plant Breeding 43 (1): 1-6. Kosová, K., Chrpová, J., Šíp, V. to Barley Yellow Dwarf Virus - (1): 1-10. (2008): Recent advances in breeding of cereals for resistance a review. Czech Journal of Genetics and Plant Breeding 44 Kosová, K., Prášil, I.T., Vítámvás, P. (2008): The relationship between vernalization- and photoperiodically-regulated genes and the development of frost tolerance in wheat and barley. Biologia Plantarum 52(4): 601-615. Contributions in proceedings Kosová, K., Vítámvás, P., Prášil, I. T., Prášilová, P., Chrpová, J. (2005): Dehydriny u ječmene (Hordeum vulgare) a jejich funkce v odpovědi rostlin na sucho a chlad V: Vliv abiotických a biotických stresorů na vlastnosti rostlin 2005. Příspěvek na konferenci. Str. 158-163. Výzkumný ústav rostlinné výroby Praha - Ruzyně, 11.5. 2005. Kosová, K., Prášil, I. T., Chrpová, J. (2006): Akumulace dehydrinů u dvou kultivarů ječmene (Hordeum vulgare) Atlas 68 a Igri v závislosti na délce působení chladu a osmotického stresu. V: Vliv abiotických a biotických stresorů na vlastnosti rostlin 2006. Příspěvek na konferenci. Str. 264-269. Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů ČZU v Praze, Praha 17.5. 2006. 18

Kosová, K., Vítámvás, P., Prášil, I. T., Prášilová, P. (2007): The use of dehydrin 5 in screening for frost tolerance in barley (Hordeum vulgare). In: 4th Workshop on Advances in Molecular Biology: New Approaches in Plant Analysis. Pp. 42-48. Crop Research Institute, Prague-Ruzyně 10. 12. 2007. Kosová, K., Vítámvás, P., Prášil, I.T. (2008): Dehydriny - struktura, funkce a využití při studiu stresů vyvolávajících dehydrataci rostlin. V: Vliv abiotických a biotických stresorů na vlastnosti rostlin 2006. Příspěvek na konferenci. Str. 239-244. Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů ČZU v Praze, Praha 12.-13. 2. 2008. Abstracts in proceedings Kosová, K., Vítámvás, P., Prášil, I. T. (2007): Úloha dehydrinů v odolnosti rostlin vůči nízkým teplotám. V: Konference experimentální biologie rostlin. 11. dny fyziologie rostlin. Sborník abstraktů. Str. 57-58. Olomouc, 9.-12. 7. 2007. Kosová, K., Holková, L., Prášil, I. T., Vítámvás, P., Prášilová, P., Chrpová, J., Bradáčová, M. (2007): Vztah akumulace dehydrinu 5 k odolnosti vůči nízkým teplotám u ječmene (Hordeum vulgare L.). V: Konference experimentální biologie rostlin. 11. dny fyziologie rostlin. Sborník abstraktů. Str. 114-115. Olomouc, 9.-12. 7. 2007. (poster) Prášil, I. T., Vítámvás, P., Kosová, K. (2007): Proteins and proteomics, in relation to the frost tolerance (stress physiology) of plants. In: Plant Proteomics in Europe. P. 41. COST FA0603. Munich, Germany, September 2007. Vítámvás, P., Kosová, K., Prášil, I.T., Prášilová, P. (2008): WCS120 and DHN5 similarities and differences in the pattern of accumulation of two cold-regulated dehydrin proteins in wheat and barley. In: Plant Proteomics in Europe. P. 37-38. COST FA0603. Cordoba, Spain, 6.-8. 2. 2008. Kosová, K. (2008): The relationship between development, frost tolerance and accumulation of DHN5 protein in barley (Hordeum vulgare). In: Fresh Insights in Plant Affairs. International conference of PhD students on experimental botany. P. 18. Nové Hrady, 8.-10. 4. 2008. 19

Rukopisy, které jsou součástí disertační práce Rukopis 1: Kosová, K., Prášil, I.T., Vítámvás, P. (2008): The relationship between vernalization- and photoperiodically-regulated genes and the development of frost tolerance in wheat and barley. Biologia Plantarum 52 (4): 601-615. Rukopis 2: Kosová, K., Vítámvás, P., Prášil, I.T. (2007): The role of dehydrins in plant response to cold. Biologia Plantarum 51 (4): 601-617. Rukopis 3: Kosová, K., Holková, L., Prášil, I.T., Prášilová, P., Bradáčová, M., Vítámvás, P., Čapková, V. (2008): Expression of dehydrin 5 during the development of frost tolerance in barley (Hordeum vulgare). Journal of Plant Physiology 165 (11): 1142-1151. Rukopis 4: Kosová, K., Prášil, I.T., Prášilová, P., Vítámvás, P., Chrpová, J.: The development of frost tolerance and DHN5 protein accumulation in a set of barley (Hordeum vulgare) doubled haploid lines derived from Atlas 68 Igri cross during a long-term cold acclimation. Zasláno do Environmental and Experimental Botany. 20

Rukopis 1 The relationship between vernalization- and photoperiodically-regulated genes and the development of frost tolerance in wheat and barley Kosová, K., Prášil, I.T., Vítámvás, P. Biologia Plantarum 52(4): 601-615, 2008 Abstract The review summarizes the level of current knowledge of impacts of vernalization and photoperiod on the induction and maintenance of frost tolerance (FrT) in wheat and barley. The phenomenon of vernalization is briefly described and the major vernalization (VRN) loci are characterised. Vernalization requirement and the three major growth habits of Triticeae (facultative, winter and spring) are defined on the basis of the two-locus VRN-2/VRN-1 epistatic model. Major photoperiodically regulated genes, which influence the transition to flowering, are characterised and their interactions with VRN genes are briefly discussed. The phenomenon of induction of FrT during the process of cold acclimation (CA) is described and the major cold-induced Cor/Lea genes are listed. Important regulatory mechanisms, i.e., CBF pathway, controlling the expression of Cor/Lea genes under cold, are discussed. The major loci affecting the development of FrT in Triticeae, the Fr loci, are characterised. In conclusion, current progress in this research field is summarized and new questions arising in the area are formulated. 21

Rukopis 2 The role of dehydrins in plant response to cold Kosová, K., Vítámvás, P., Prášil, I.T. Biologia Plantarum 51 (4): 601-617, 2007 Abstract Dehydrins present a distinct biochemical group of late embryogenesis abundant (LEA) proteins characterised by the presence of a lysine-rich amino acid motif, the K-segment. They are highly hydrophilic, soluble upon boiling, and rich in glycine and polar amino acids. It is proposed that they can act as emulsifiers or chaperones in the cells, i.e., they protect proteins and membranes against unfavorable structural changes caused by dehydration. Cold usually preceeds freezing in nature and induces many physiological and biochemical changes in the cells of freezing-tolerant plant species (cold-acclimation) that enable them to survive unfavorable conditions. It is demonstrated that the induction of dehydrin expression and their accumulation is an important part of this process in many dicotyledonous both herbaceous and woody species, and also in winter cultivars of cereals, especially wheat and barley. Some mechanisms are discussed which are proposed to be involved in regulation of dehydrin expression, i.e., endogenous content of abscisic acid, homologues of Arabidopsis C-repeat binding factor (CBF) transcriptional activators, the activity of vernalization genes and photoperiodic signals. At the end, we outline some new approaches emerging to the solution of complex mechanisms involved in plant cold-acclimation, especially methods of functional genomics that enable to observe simultaneously changes in the activity of many genes and proteins in one sample. 22

Rukopis 3 Expression of dehydrin 5 during the development of frost tolerance in barley (Hordeum vulgare) Kosová, K., Holková, L., Prášil, I.T., Prášilová, P., Bradáčová, M., Vítámvás, P., Čapková, V. Journal of Plant Physiology 165 (11): 1142-1151, 2008 Abstract Dhn5 gene is the major cold-inducible dehydrin gene in barley. This study deals with the relationship between Dhn5 gene expression and its protein product accumulation and the development of frost tolerance (FT) upon cold acclimation (CA) in ten barley cultivars of different growth habit and geographical origin. The activation of Dhn5 gene expression was determined by qrt PCR, the accumulation of DHN5 protein by protein gel blot analysis using a specific anti-dehydrin antibody and the actual level of FT by direct frost test. During the first two weeks of CA, there was a rapid increase in Dhn5 gene expression, DHN5 protein accumulation and FT in all cultivars examined. After two weeks of CA, the differences in DHN5 accumulation and in FT measured as lethal temperature (LT 50 ) were observed between the cultivars belonging to different growth habits: intermediate (I) and winter (W) cultivars showed a higher level of DHN5 accumulation and LT 50 values than the spring (S) ones which exhibited a lower level of accumulated DHN5 and FT. In contrast, no differences between the cultivars belonging to different growth habits in Dhn5 mrna accumulation have been found. After three weeks of CA, the differences in accumulated DHN5 and FT between the individual growth habits became evident as a consequence of different developmental regulation of FT. The amount of accumulated DHN5 corresponded well with the level of FT of individual cultivars. It can be concluded that the amount of accumulated DHN5 after a certain period of CA differed according to the growth habits of cultivars and can be used as a marker for determination of FT in barley. 23

Rukopis 4 The development of frost tolerance and DHN5 protein accumulation in a set of barley (Hordeum vulgare) doubled haploid lines derived from Atlas 68 Igri cross during a long-term cold acclimation Abstract Kosová, K., Prášil, I.T., Prášilová, P., Vítámvás, P., Chrpová, J. Zasláno do Environmental and Experimental Botany The dynamics of a long-term cold acclimation (CA) process was studied in spring barley cultivar Atlas 68, winter barley cultivar Igri and a set of selected doubled haploid (DH) lines derived from Atlas 68 Igri cross. The aim of the study was to evaluate the effect of the plant development on the ability to induce frost tolerance (FT) and to accumulate dehydrin 5 (DHN5) protein during a long-term CA. The developmental stage of the plants was determined according to the phenological development of shoot apex and by determination of the length of plant cultivation at optimum growth temperature after a certain period of CA which was necessary to heading. The level of acquired FT was determined by direct frost tests in laboratory freezers. The accumulation of DHN5 protein was evaluated by densitometric analysis of the protein gel blots. The CA treatment led to the induction of increased FT level and to the accumulation DHN5 protein in both spring and winter DH lines. However, with the progress of CA treatment, differences between spring and winter DH lines began to occur as the winter DH lines were able to maintain increased FT level and DHN5 level for a significantly longer time than the spring DH lines. The probable cause of this difference was the absence of vernalization in spring lines which led to the much earlier transition into the reproductive growth stage in the spring lines when compared with the winter ones. After the developmental transition into the reproductive stage, a significant decrease in DHN5 accumulation was found in all lines; however, the FT level remained high for quite a long time. This discrepancy between FT level and DHN5 level in barley plants after the developmental transition is discussed. 24