BIOTECHNOLOGIE a genové inženýrství rostlin U3V Zdeněk OPATRNÝ Katedra experimentální biologie rostlin, Přírodovědecká fakulta UK Praha Letní semestr 2014
Teoretické a metodické základy biotechnologického zemědělství - experimentální průkaz hypotézy o funkční totipotenci somatické rostlinné buňky - vývoj technik in vitro kultivace rostliných explantátů - vývoj technik parasexuálního genového přenosu
Na počátku bylo slovo aneb buněčná teorie o funkční totipotenci somatických buněk mnohabuněčných organizmů SCHLEIDEN 1838 rostliny SCHWANN 1839 převzal pro živočichy
Gottlieb HABERLANDT 1854-1946 otec oboru in vitro kultivace rostlinných buněk, pletiv a orgánů realizátor prvých pokusů sběratel prvých zklamání
P.R.WHITE 1901-1968 bez hormonů to nejde buď vlastní kořenové kultury rajče 1935 hybridi N.glauca x N.langsdorfii, kalus 1938 nebo nutno přidat IAA Gautheret, Noubécourt 1938 dalších dvacet práce jen s auxiny a rostlinnými extrakty či tekutými endospermy
České biotechnologie a svět 1 - Petrů, 2 - Street, 3 - Karstens, 4 - Vasil, 5 Reinert (Pensylvania State University 1963)
Zřejmě první rostlinně-biotechnologická disertace v Československu Ústav experimentální botaniky ČSAV Praha 1971 To máme téměř 40 let
Explantátově metodický dávnověk vesměs vlastní konstrukce
TREPKA (Vicia faba L.) Ještě dodnes vlastně unikát kalusové a suspensní kultury Vicia faba 1967 dvouletá tkáňová kultura
Od buňky k rostlině či od buňky k buněčné linii a zpět?? brambor tabák buněčná linie tabáku VBI- 0 Opatrný a Opatrná 1976
Mutageneze in vitro vliv gama záření na buněčnou linii tabáku VBI-0 vliv N-nitrosometyl močoviny na primární dřeňové explantáty tabáku
Explantátové laboratoře Ústav experimentální botaniky AVČR Praha únor 2014
Objev cytokininů a jejich interakcí s auxiny zásadní rozšíření regenerační kuchařky pro rostlinně biotechnologické využití Ale také zásadní přínos pro obecné studium biologie rostlin od ONTOGENEZE po FOTOSYNTÉZU
Buněčná teorie po 100 letech experimentálně potvrzena
Folke SKOOG od kokosového mléka po sledí jikry CYTOKININY
ORGANOGENEZE AUXIN : CK kořeny AUXIN : CK kalus AUXIN : CK pupeny Skoog a Miller (1965): poměr auxinů a cytokininů určuje morfogenní odpověď
Příběh podobný objevu penicilinu náhoda přeje připraveným
Regenerace de novo organogeneze Nicotiana tabacum L. odrůdová specifita
Následuje rychlý rozvoj aplikací: - explantátové ozdravování - explantátové množení - explantátové šlechtění
Zdeněk Landa 11.5.1934 18.12.1975
EXPLANTÁTOVÉ OZDRAVOVÁNÍ (eradikace): prof. Morrel (Francie) 60-tá léta shoot tip cultures jiřiny, brambor izolovaný meristem uniká virové infekci thermoinkubace, RIBAVIRIN bezvirozní satba vegetativně množených plodin v ČR ovocné dřeviny,brambor
EXPLANTÁTOVÉ MNOŽENÍ (mikropropagace) základem jsou regenerační protokoly: - organogeneze - somatické a pylové embryogeneze
ORGANOGENEZE in vitro Restituce in vitro protokormy Cymbidium Multiplikace preexistujících vzrostných vrcholů Medium jen s auxinem (2,4-D) nebo auxin + cytokinin
REGENERACE de novo Stonkový řízek (5mm) bramboru, půda A+CK zřetelná polarita reakce, preferenčně regeneruje baze
Protokol regeneračního postupu
Odrůdová specifita regenerační kompetence
Regenerující pupenové základy brambor
DE NOVO regenerace bramboru : možnost vniku žádoucí i nechtěné somaklonální variability 4 týdny 8 týdnů
Příčiny vzniku somaklonální variability : spontánní či in vitro kultivací vyvolaná mutageneze a selekce * šance pro šlechtění zejména vegetativně množených plodin? * možnost kvalitativně nových typů genetických odchylek (somatický crossingover aj.)?? Dvacet let práce a nadějí žádný zásadně nový přínos (snad u třtiny cukrové, ananasů) Aplikace mutagenů (šlechtění banánů??)
Mikropropagace bramboru somaklony mikrohlízky
EMBRYOGENEZE in vitro: * zygotická (zejm. oplození in vitro) * pylová * somatická účel: - překonání bariér nekřižitelnosti - produkce haploidů/dihaploidů - mikropropagace - umělá semena
Somatická embryogeneze (SE) od mrkve přes pšenici po smrk * 2,4-D klíčový morfogenní faktor, součinnost s CK, ABA * rychle stoupá počet druhů vykazujících schopnost SE * poměrně nízký výskyt genotypů realizujících jak organogenezi tak i SE. Některé klasické regenerační modely (tabák, brambor) v realizaci SE neúspěšné. * často striktní limit regenerační kompetence souvisí s orgánovou specifitou, stářím
Somatická embryogeneze Larix decidua, agarové medium katalog firmy
Somatická embryogeneze Picea abies regenerační specifita různých klonů AFO C 111 Vágner, Vondráková, Opatrná 1998
Schwarzerová et al. 2009 submitted BMC PB úloha aktinového cytoskeletu v somatické embryogenezi smrku vliv antiaktinových drog
Somaticko - embryogenní linie vinné révy Exot nebo budoucnost šlechtění?
Grape Line PIXIE Trpasličí, stále plodící mutant vinné révy?? Produkt somaklonální variability v embryogenní kultuře?
Somatická embryogeneze Cucumis sativus, tekuté medium katalog firmy
ARTICIFIAL SEEDS mrkev modřín
Drum Type Automatic Bioreactor, working volume 5000L each, (Republic of South Korea)
SERK geny v somatické embryogenezi bramboru?
DIHAPLOIDNÍ ŠLECHTĚNÍ regenerace nových jedinců z buněk zárodečné linie : alternativní cesty embryogeneze samičí (různé typy apomixe), samčí
Alternativní cesty embryogeneze samičí (různé typy apomixe), Domain: Food & Agriculture The Biological Function of Organisms Human Nutrition and Food Chain Agriculture as a Human Activity Agriculture and Environment
Pylová embryogeneze (PE) od durmanu, tabáku po křížaté či obiloviny * přítomnost fytohormonů často není nutná, * vysoce autonomní proces (u tabáku pro úvodní fázi stačí agar, voda, později Fe, Havránek, Vagera 1975) * stres jako indukční faktor * významná role genotypu * klíčový význam má vývojové stadium mikrospor
Prašníkové kultury tabák Opatrný et al. 1974
Mikrosporové kultury řepka izolace pylových zrn různého vývojového stupně Opatrný et al. 1985
útvar má dočasně charakter syncytia, přepážky nedokončeny
Pozdní fáze pylové embryogeneze: tvorba peridermu dermatogenové stadium? řepka šikmé světlo různé optické roviny Opatrný 1985 pracovní protokol
PROTOPLASTOVÉ KULTURY a somatická hybridizace cybridizace překonání bariér nekřižitelnosti
Od Purkyně-ho ke Cockingovi: protoplasty = rostlinné buňky dočasně zbavené buněčné stěny Cocking umožnily : - tvorbu somatických hybridů - přenášení genoforů (organel) - vnášení samotné cizorodé DNA (jedna z technik přípravy GMO) Lorz Melchers
Protoplastová kultura česnek brambor inokulum inokulum 3. den 3. den Opatrný et al. 1976
Protoplast - cytoplast fuze Brassica oleracea.
TOMOFFEL / POMATO, Melchers 1982
Somatičtí hybridi kulturního bramboru a planých lilků přenos resistence vůči patogenům, zejména virům
Somatická hybridizace N.plumbaginifolia x N. sylvestris chromosomální přestavby výrazně odlišných genomů
Indikace chromosomálních přestaveb somatických hybridů pomocí techniky GISH
Asymetrické hybridizace MUTABREEDS a genové přenosy jako nástroj a genové přenosy jako nástroj inzerční mutageneze.
Sem stručně obsah článku!!! Supertuberizing insertion mutant D 69 / Lada Transgene : enhancer Insertion: non-coding area Fischer, Lipavska Opatrny, 2010
Czech Presidency of EU 2008-20092009 AIM: to affect existing rigid European biotechnological legislative by official document based mostly on the authentic results of the Czech research Academy of Science Universities Agricultural Research Institutes Agricultural Cooperatives Research,Education, Dissemination