Téma KULTIVACE IN VITRO. Praktikum fyziologie rostlin

Transkript

1 Téma KULTIVACE IN VITRO Praktikum fyziologie rostlin

2 Teoretický úvod: KULTIVACE IN VITRO Rostlinný materiál lze krom pirozených podmínek pstovat také v rzných umlých podmínkách. Jednou z tchto možností je kultivace za specifických podmínek v uzavených (nejastji sklenných) nádobách umožující mimo pstovaní celistvých rostlin také pstovat jejich oddlené ásti. Odtud pocházejí i názvy tchto kultur: kultury in vitro (ve skle) anebo kultury rostlinných explantát (Obr.1). Podle stupn organizovanosti lze rozdlit kultury na orgánové (kultivované koeny, stonky, listy, ásti kvtenství), tkáové (soubory bunk) a bunné (jednotlivé buky, bunné suspenze, s uritými výhradami lze píp. zaadit i protoplasty buky zbavené bunné stny). Obr.1: Typy rostlinných explantát a,b/ kultury celistvých rostlin a rostlinných ástí, c/ kultury rostlinných pletiv - kalus, d/ bunné kultury- mikrospory, e/ protoplastové kultury Možnost takto kultivovat rostlinný materiál vychází z faktu, že rostliny disponují vysokou regeneraní schopností, která souvisí s možností obnovit bunné dlení i u bunk somatických. Díky tmto vlastnostem se mohou rostliny vegetativn množit a nebo nahrazovat poškozené orgány. Tato schopnost je založena na tzv. totipotenci rostlinné buky. Tém každá živá buka rostlinného tla (i buka pln diferencovaná) totiž obsahuje kompletní genetickou informaci, kterou je potenciáln schopná realizovat.

3 5.1. Složení kultivaního média a kultivaní podmínky Rostlinné explantáty vyžadují pro kultivaci speciální podmínky. Pedevším je nutné zajistit vhodné kultivaní médium, které musí obsahovat všechny potebné minerální živiny, které vyžaduje i celistvá rostlina. asto je teba do kultivaního média pidat i látky, které si bžn rostlina syntetizuje sama, patí sem hlavn aminokyseliny a vitamíny. Velmi dležitou složkou kultivaních médií jsou sacharidy. Nkteré explantátové kultury mohou být totiž nezelené, ale i kultury s kompletním fotosyntetickým aparátem nejsou asto schopny samy zajistit dostatené množství asimilát pro uspokojivý rst a vývoj. Kultivaní média obsahující organické složky na druhé stran pedstavují velmi vhodnou živnou pdu pro mikroorganismy, a proto je nutné médium i kulturu udržovat sterilní a pi manipulaci dodržovat zásady aseptické práce (Obr.2,3). Obr.2: Laminární box Laminární box (flowbox) umožuje zachovat materiál sterilní pi manipulaci mimo kultivaní nádobu. Obr.3: Kontaminace in vitro kultury Pítomnost sacharid v médiu vyžaduje práci za sterilních podmínek Významnou souástí kultivaních médií explantátových kultur jsou rstové regulátory, nejastji auxiny a cytokininy. Použitý typ a koncentrace tchto látek v médiu mže mít zásadní vliv na vývojový program daného explantátu. Pro demonstraci regulaních vlastností rstových regulátor lze použít tzv. auxincytokininový model regenerace stonkových segment tabáku vytvoený Skoogem a Millerem již v roce 1957: Stonkové segmenty byly vystaveny psobení rzných kombinací koncentrací auxin a cytokinin v kultivaním médiu: I. médium obsahovalo vysokou koncentraci auxinu pro segment bylo letální II. médium obsahovalo vysokou koncentraci cytokininu - bylo také letální

4 III. médium obsahovalo takovou koncentraci auxinu a cytokininu, že oba rstové regulátory byly v rovnováze (tato rovnováha je pro každý rostlinný materiál specifická a rozhodn to neznamená rovnost koncentrací) - docházelo k produkci kalusu - hojivého pletiva (obrázek 4b). Pokud je zachován stejný pomr auxinu a cytokininu v médiu jako byl ten, který tvorbu kalusu vyvolal, pak je možné udržet tento typ rstu in vitro neomezen dlouho. IV. pokud byla posunuta rovnováha auxinu a cytokininu oproti situaci III. ve prospch cytokininu - na segmentu se tvoily pupeny- tedy základy prýt (obrázek 4a). V. pokud byla posunuta rovnováha oproti situaci III. ve prospch auxin - na segmentu se tvoily koenové základy (obrázek 4c). a b c b c koen cytokinin : auxin cytokinin auxin cytokinin : auxin Obr.4: Organogeneze de novo auxin-cytokininový model podle Skooga a Millera (1957), stonkové segmenty tabáku a b c Využití kultur rostlinných explantát: Nástroj studia fyziologie rostlin Vegetativní množení Ozdravování rostlin Výroba umlých semen (obr.5) Produkce sekundárních metabolit Šlechtní rostlin-fúze protoplast, penos organel, chromozom -transformace pímým a vektorovým (Agrobacterium) penosem DNA proliferace zrání klíení udržování tkáové kultury se vývoj embryoid pemna embrya v rostlinku základy embryoid a b c Obr.5: Somatická embryogeneze prbh embryogenního procesu u smrku vetn konverze na klíící rostlinu

5 Zadání praktických úloh k tématu: KULTIVACE IN VITRO Pehled úloh k vypracování: Úkol 1: Množení rostlin in vitro 1a) Namnožte rostliny bramboru metodou pstování stonkových ízk in vitro Úkol 2: Kultivace tkáových kultur 2a) Peokujte tkáovou kulturu tabáku a stanovte viabilitu barvením trypanovou modí Úkol 3: Subkultivace rostlin, penos do podmínek ex vitro 3a) Peokujte masožravou rostlinu na erstvé médium. Pevete rostlinu do podmínek ex vitro.

6 Praktické úlohy: KULTIVACE IN VITRO Úkol. 1: Množení rostlin in vitro Cíl: Demonstrovat možnosti mikropropagace (množení rostlin v in vitro podmínkách). Hypotéza, kterou v prbhu práce ovíme: Kultury rostlinných explantát je možné vegetativn množit. Pi práci za aseptických podmínek ovíme možnost množení cestou prosté reprodukce i regenerace de novo. 1a) Namnožte rostliny bramboru metodou pstování stonkových ízk in vitro Princip: Pi množení rostlin in vitro (mikropropagaci) se využívá zejména dvou zpsob: reprodukce (schéma - ást A), kdy se nový prýt rostliny vyvíjí z dormantního úžlabního pupene, a regenerace de novo (schéma - ást B), kdy se nová rostlina vytváí ze somatických diferencovaných bunk, a to bu cestou organogeneze (asov i prostorov oddlený vývoj nadzemní ásti a koen, viz. auxin-cytokininový model) nebo cestou somatické embryogeneze (somatické buky dávají vznik embryoidu, tedy útvaru, který je tvarem i funkcí obdobou zygotického embrya). Obr. 6: Schéma mikropropagace rostlin. A reprodukce, B regenerace de novo

7 Laboratorní postup: Poteby: rostliny bramboru na agarovém médiu (pstované 3 týdny in vitro z nodálního segmentu), baka s agarovým médiem bez rstových regulátor a s rstovými regulátory, box pro práci v aseptickém prostedí (laminární flowbox), sterilní nástroje, kultivaní box s teplotou 20 o C. Provedení úkolu: 1. Seznámíte se se zpsobem a podmínkami práce v aseptickém prostedí. 2. V aseptickém boxu odeberte z rostlin bramboru nodální (obsahují úžlabní pupen) a internodální stonkové segmenty a penesete je na médium: nodální segment s úžlabním pupenem a listem a internodální stonkový segment vždy na takové médium, jež povede ke zdárnému vývoji explantátu. 3. Zdvodnte výbr kultivaního média pro daný typ explantátu. 4. Postup a oekávané výsledky popište do protokolu. Otázky: Kolik rostlin bramboru je možné maximáln získat cestou reprodukce v podmínkách in vitro za pl roku? Subkultivaní interval (doba mezi jednotlivými pesazeními) je obvykle 3 týdny. Pokuste se odhadnout, co by se stalo se segmentem, který by byl umístný na nevhodné médium, pípadn v nevhodné orientaci. Úkol. 2: Kultivace tkáových kultur Cíl: Zaokovat tkáovou kulturu a stanovit viabilitu nov založené a starší kultury. Hypotéza, kterou v prbhu práce ovíme: Jakým zpsobem je možné množit a udržovat nediferencované rostlinné pletivo. Princip: U rostlin v míst poranní dochází k obnov bunného dlení a dedifrenciaci (tedy ztrát organizovanosti), což vede k vytvoení hojivého pletiva (závalu, kalusu). V podmínkách in vitro lze podobnou situaci vyvolat psobením vhodné kombinace rstových regulátor - auxin a cytokinin. Vytvoený kalus (neorganizovan rostoucí masu bunk) je možné po

8 penesení na živné médium o podobném i stejném složení jako médium, které tvorbu kalusu vyvolalo, pstovat po neomezen dlouhou dobu. V nkterých pípadech lze v tkáové kultue vhodnou zmnou kultivaního média (pedevším zmnou i vynecháním rstových regulátor) a dalších kultivaních podmínek znovu navodit diferenciaci žádaných rostlinných pletiv a orgán. 2a) Peokujte tkáovou kulturu tabáku a stanovte viabilitu barvením trypanovou modí Princip viabilního barvení: Povrchové struktury živých bunk pedstavují aktivní bariéru pro vstup látek do buky, a obsah živých bunk tedy zstává narozdíl od obsahu mrtvých bunk nezbarvený. K tomuto rozlišení živých a odumelých bunk budete používat trypanovou mod. Pracujte opatrn, BARVIVO JE KARCINOGENNÍ!! Poteby: Tkáové kultury tabáku (Nicotiana tabacum) rzného stáí (liší se délkou poslední subkultivace), médium s rstovými regulátory (auxiny a cytokininy) pro kultivaci tkáových kultur, roztok trypanové modi, pomcky pro pípravu nativních preparát. Pracovní postup: 1. Pi dodržení podmínek práce v aseptickém prostedí peneste ást mladé tkáové kultury tabáku na erstvé medium. 2. Další ást pletiva odeberte do kádinky a pipravte bunnou suspenzi (aseptická práce již není nutná). Obdobn pipravte bunnou suspenzi ze starší kultury. 3. Kapku suspenze peneste na podložní sklíko, odsajte vodu kouskem buniiny, pidejte malou kapku trypanové modi a obarvenou suspenzi pozorujte pod mikroskopem. 4. Odhadnte % živých a mrtvých bunk ve vzorcích z kultur pstovaných s rzným subkultivaním intervalem. 5. Povšimnte si odlišností ve tvaru a upoádání bunk v tkáové kultue oproti bukám v rostlinných pletivech. Výsledek pozorování schématicky zakreslete, pípadn piložte odpovídající fotografii. Vyhodnocení experiment: Komentujete viabilitu bunk kultury. Navrhnte zpsob(y), jak lze dosáhnout zvýšení viability vybrané kultury.

9 Úkol. 3: Subkultivace rostlin, penos do podmínek ex vitro Cíl: Seznámit se s manipulací a možnostmi udržování rostlin in vitro a požadavky rostlin na pevod do ex vitro podmínek. Hypotéza, kterou v prbhu práce ovíme: Rostliny lze dlouhodob udržovat v podmínkách in vitro a následn pevést do pirozených podmínek. 3a) Peokujte masožravou rostlinu na erstvé médium. Pevete rostlinu do podmínek ex vitro. Úvod: Penos do bžných kultivaních podmínek (rostliny rostou v zemin v neaseptických podmínkách) je závrenou fází jakékoliv práce s rostlinnými explantáty, která má mít praktický výstup. Nkdy však tento krok pedstavuje dosti vážný problém. Rostliny rostoucí v podmínkách in vitro jsou totiž adaptovány na odlišné podmínky výživy (snadno dostupné živiny, mén rozvinutý koenový systém), na nepítomnost patogen a zejména na vysokou relativní vlhkost uvnit kultivaních nádob. Nemají proto dostaten vyvinuté ty povrchové struktury, které regulují výdej vody do prostedí (na povrchu list chybí vosky, kutikula je velmi tenká a prduchy zstávají trvale oteveny). Proto je teba pomrn dlouho po penesení do pdy mimo kultivaní box rostliny chránit ped vadnutím a relativní vlhkost okolního prostedí snižovat postupn (i nkolik týdn). Poteby: kultura Drosera capillaris (nebo Pinguicula primuliflora), baky s kultivaním médiem, sterilní nástroje. Pracovní postup: 6. Rozdlte rostliny rosnatky (tunice) na erstvá media. Pracujte peliv v aseptických podmínkách, na provedení vaší práce závisí další úspch pstování. 7. Na jedné z rostlin si budete moci ovit výsledek, odnesete si totiž baku s masožravou rostlinou dom. 8. Pokud pozdji zjistíte infekci na médiu (rozvoj pípadných bakterií a plísní se projeví asi do 10 dn), okamžit pesate rostlinu do rašeliny (ph asi 4,5). 9. Abyste zajistili vysokou vzdušnou vlhkost, postavte nádobu s pesazenou rostlinou do vtší nádoby (zavaovaky apod.), na dno nalijte asi 1 cm vody a nádobu zakryjte (nap.

10 alobalem). Odkrývejte postupn asi dva týdny, aby se rostlina mohla na podmínky ex vitro dobe adaptovat. 10. I když kultura roste in vitro dobe a bez infekce, nejpozdji po 3-4 msících pevete vyvinuté rostliny popsaným zpsobem do rašeliny (živiny v médiu se vyerpají). Vyhodnocení experiment: Zhodnote úspšnost vaší práce z hlediska sterility a životaschopnosti rostliny po pevedení do ex vitro podmínek. Otázky: Rostliny je nutné pi pesunu z in vitro do ex vitro podmínek adaptovat. Pro?

11