VLIV OTUŽOVÁNÍ ROSTLIN NA ZMĚNY JEJICH TERMICKÝCH VLASTNOSTÍ PŘI KRYOPREZERVACI

VLIV OTUŽOVÁNÍ ROSTLIN NA ZMĚNY JEJICH TERMICKÝCH VLASTNOSTÍ PŘI KRYOPREZERVACI Miloš Faltus A, Eva Žižková B, Alois Bilavčík A, Jiří Zámečník A A Výzkumný ústav rostlinné výroby, Praha 6 Ruzyně B Výzkumný ústav lesního hospodářství a myslivosti, v.v.i., Strnady

Osnova: 1) Co je kryoprezervace? 2) Fyzikální princip kryoprezervace 3) Metody kryoprezervace 4) Biologické limity kryoprezervace 5) Otužování rostlin pro kryoprezervaci 6) Využití termické analýzy 7) Příklady metod

Co je kryoprezervace? Dlouhodobé uchování živých organizmů nebo jejich částí při velmi nízké teplotě.

Fyzikální princip kryoprezervace Změna skupenství z kapaliny na pevnou hmotu = zvýšení viskozity. Kapalina umožňuje změny (metabolismus) Pevná látka omezuje změny (metabolismus) Krystalická při krystalizaci vzniká nové uspořádání Amorfní při skelném přechodu je zachována stávající struktura

Fyzikální princip kryoprezervace Změna skupenství z kapaliny na pevnou hmotu. Kapalina umožňuje změny Pevná látka omezuje změny krystal sklo kapalina

Fyzikální princip kryoprezervace Teploty bodu tání a skelného přechodu v závislosti na koncentraci roztoku sacharosy teplota bodu tání ( C) 100 50 0-50 -100 roztok led a roztok sklo přesycený roztok -150 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 tání Polynomická (tání) skelný_přechod Polynomická (skelný_přechod) hmotnostní podíl kryoprotektantu (g. g -1)

Fyzikální princip kryoprezervace zvýšit podíl rozpuštěných látek ve vodě = snížit podíl vody snížení rozdílu mezi teplotou mrznutí a teplotou skelného přechodu Snížit teplotu bod teplotu skelného přechodu bez významné krystalizace

Fyzikální princip kryoprezervace Teploty bodu tání a skelného přechodu v závislosti na koncentraci roztoku sacharosy teplota bodu tání ( C) 100 50 0-50 -100 roztok neotužené led a roztok sklo přesycený roztok -150 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 tání Polynomická (tání) skelný_přechod Polynomická (skelný_přechod) hmotnostní podíl kryoprotektantu (g. g -1)

Fyzikální princip kryoprezervace Teploty bodu tání a skelného přechodu v závislosti na koncentraci roztoku sacharosy teplota bodu tání ( C) 100 50 0-50 -100 roztok led a roztok otužování sklo přesycený roztok -150 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 tání Polynomická (tání) skelný_přechod Polynomická (skelný_přechod) hmotnostní podíl kryoprotektantu (g. g -1)

Fyzikální princip kryoprezervace Teploty bodu tání a skelného přechodu v závislosti na koncentraci roztoku sacharosy teplota bodu tání ( C) 100 50 0-50 -100 roztok led a roztok otužené sklo přesycený roztok -150 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 tání Polynomická (tání) skelný_přechod Polynomická (skelný_přechod) hmotnostní podíl kryoprotektantu (g. g -1)

Metody kryoprezervace Snižování obsahu vody pomocí: 1) Mrznutí 2) Sušení 3) Osmotická dehydratace

Biologické limity kryoprezervace Působení nízké teploty zmrznutí Působení dehydratace - uschnutí

PŮSOBENÍ NÍZKÉ TEPLOTY ŽIVÁ BUŇKA

PŮSOBENÍ NÍZKÉ TEPLOTY ŽIVÁ BUŇKA PŮSOBENÍ NÍZKÉ TEPLOTY -196 C

PŮSOBENÍ NÍZKÉ TEPLOTY INTRA-BUNĚČNÉ MRZNUTÍ ŽIVÁ BUŇKA vysoký obsah vody PŮSOBENÍ NÍZKÉ TEPLOTY POŠKOZENÍ BUŇKY LEDEM

Biologické limity kryoprezervace Působení nízké teploty zmrznutí Působení dehydratace - uschnutí

VLIV DEHYDRATACE NA ŽIVOTNOST BUNĚK ŽIVÁ BUŇKA PŮSOBENÍ SILNÉ DEHYDRATACE

VLIV DEHYDRATACE NA ŽIVOTNOST BUNĚK ŽIVÁ BUŇKA SILNÁ DEHYDRATACE POŠKOZENÍ BUŇKY DEHYDRATACÍ

Biologické limity kryoprezervace Působení nízké teploty zmrznutí Působení dehydratace uschnutí Překonání biologických limitů kryoprezervace pomocí otužování působení mírného stresu vyvolává nárůst odolnosti.

Otužování rostlin pro kryoprezervaci nízkou teplotou osmoticky vede ke snížení příjmu vody rostlinou vyvolává akumulaci osmoticky aktivních látek = osmotické přizpůsobení vede ke snížení bodu mrznutí

Otužování = snížení obsahu vody ŽIVÁ BUŇKA vysoký obsah vody SNÍŽENÍ OBSAHU VODY NEPOŠKOZENÍ BUŇKY LEDEM

Otužování rostlin pro kryoprezervaci Teploty bodu tání a skelného přechodu v závislosti na koncentraci roztoku sacharosy teplota bodu tání ( C) 100 50 0-50 -100 roztok led a roztok otužené sklo přesycený roztok -150 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 tání Polynomická (tání) skelný_přechod Polynomická (skelný_přechod) hmotnostní podíl kryoprotektantu (g. g -1)

OTUŽOVÁNÍ ROSTLIN NÍZKOU TEPLOTOU ŽIVÁ BUŇKA PŮSOBENÍ NÍZKÉ TEPLOTY (+1 C)

OTUŽOVÁNÍ ROSTLIN NÍZKOU TEPLOTOU EXTRA-BUNĚČNÉ MRZNUTÍ AFP AFP AFP SACHAROSA SACHAROSA AFP AFP ŽIVÁ BUŇKA PŮSOBENÍ NÍZKÉ TEPLOTY (+1 C) SACHAROSA AFP OTUŽENÍ BUŇKY VŮČI MRAZU (-30 C)

OTUŽOVÁNÍ ROSTLIN VŮČI DEHYDRATACI ŽIVÁ BUŇKA MÍRNÁ DEHYDRATACE

OTUŽOVÁNÍ ROSTLIN VŮČI DEHYDRATACI SACHAROSA SACHAROSA SACHAROSA SACHAROSA SACHAROSA ŽIVÁ BUŇKA MÍRNÁ DEHYDRATACE OTUŽENÍ BUŇKY VŮČI DEHYDRATACI

KRYOPROTEKCE ROSTLIN TOLERUJÍCÍCH DEHYDRATACI ŽIVÁ BUŇKA KRYOPROTEKCE POMOCÍ PVS3

KRYOPROTEKCE ROSTLIN TOLERUJÍCÍCH DEHYDRATACI SACHAROSA GLYCEROL SACHAROSA GLYCEROL GLYCEROL GLYCEROL SACHAROSA GLYCEROL GLYCEROL GLYCEROL GLYCEROL SACHAROSA GLYCEROL GLYCEROL SACHAROSA GLYCEROL SACHAROSA SACHAROSA ŽIVÁ BUŇKA KRYOPROTEKCE POMOCÍ PVS3 OTUŽENÍ BUŇKY VŮČI KRYOPREZERVACI GLYCEROL

Využití termické analýzy pro kryoprezervaci TA Instrument Q2OOO + RCS rozsah měření -90 ºC až +30 ºC rychlost chlazení a ohřevu 10 ºC/min. plyn He hliníkové hermeticky uzavřené pánvičky měření: onset teploty tání a enthalpie tání výpočet podílu krystalické vody

KRYOPREZERVACE RÉVY VINNÉ = OTUŽOVÁNÍ OSMOTICKÝMI ROZTOKY

KRYOPREZERVACE TOPOLU ŠEDÉHO = OTUŽOVÁNÍ OSMOTICKÝMI ROZTOKY A NÍZKOU TEPLOTOU teplota tání ( C) 0-5 -10-15 -20-25 -30-35 -40-45 -50 předkult ivace 0,3 M sacharosa Varianta A Varianta B Varianta C syt ící roztok 50% PVS3 80% PVS3 120 min 80% PVS3 150 min 80% PVS3 240 min

KRYOPREZERVACE TOPOLU ŠEDÉHO = OTUŽOVÁNÍ OSMOTICKÝMI ROZTOKY A NÍZKOU TEPLOTOU podíl zmrzlé vody (%) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 předkult ivace 0,3 M sacharosa Varianta A Varianta B Varianta C syt ící roztok 50% PVS3 80% PVS3 120 min 80% PVS3 150 min 80% PVS3 240 min

KRYOPREZERVACE TOPOLU ŠEDÉHO = OTUŽOVÁNÍ OSMOTICKÝMI ROZTOKY A NÍZKOU TEPLOTOU Varianta A: bez otužení životnost regenerace životnost segmentů (%) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0,3 M sacharosa syt ící roztok 50% PVS3 80% PVS3 120 min 80% PVS3 150 min 80% PVS3 240 min

KRYOPREZERVACE TOPOLU ŠEDÉHO = OTUŽOVÁNÍ OSMOTICKÝMI ROZTOKY A NÍZKOU TEPLOTOU Varianta B: bez aplikace sacharózy životnost regenerace životnost a regenerace segmentů (%) 100 80 60 40 20 0 0,3 M sacharosa syt ící roztok 50% PVS3 80% PVS3 120 min 80% PVS3 150 min 80% PVS3 240 min

KRYOPREZERVACE TOPOLU ŠEDÉHO = OTUŽOVÁNÍ OSMOTICKÝMI ROZTOKY A NÍZKOU TEPLOTOU Varianta C: s aplikací sacharózy životnost regenerace 100 životnost a regenerace segmentů (%) 80 60 40 20 0 0,3 M sacharosa syt ící roztok 50% PVS3 80% PVS3 120 min 80% PVS3 150 min 80% PVS3 240 min

VLIV OTUŽOVÁNÍ ROSTLIN NA ZMĚNY JEJICH TERMICKÝCH VLASTNOSTÍ PŘI KRYOPREZERVACI otužování rostlin je spojeno s poklesem obsahu vody dochází k poklesu bodu tání/mrznutí dochází k poklesu podílu krystalického ledu otužování rostlin vede ke zvyšování odolnosti vůči silné dehydrataci při kryoprezervaci otužování osmotickým působením a nízkou teplotou má aditivní účinek otužené rostliny topolu šedého tolerují po otužení velmi nízký podíl volné vody

Děkuji za pozornost!