Masarykova univerzita Přírodovědecká fakulta Ústav chemie a NCBR Zadání 1. série 3. ročník (2012/2013)
ViBuCh probíhá v rámci veřejné zakázky Pilotní ověření systému popularizace technických a přírodovědných oborů vytvářením vazeb vysokých škol na školy nižších stupňů, která je součástí IPN Podpora technických a přírodovědných oborů (PTP), reg. č. CZ.1.07/4.2.00/06.005. Financováno Evropským sociálním Recenze úloh: Miroslav Krepl, Jaromír Literák, Lukáš Pravda a Tomáš Šolomek. c 2012 Miroslav Brumovský, Tomáš Fiala, Jaromír Literák, Lukáš Mikulů, Jan ppelt a Petr Stadlbauer c 2012 Masarykova univerzita
Úvodník Milí čtenáři, řešitelé, první série úloh dalšího ročníku ViBuChu je tady! ViBuCh vás opět zasvětí do tajů skutečné vědy, dozvíte se spoustu nových a zajímavých informací z chemie a jí příbuzných oborů a dokonce se postaráme o to, aby vás to bavilo! Poznejte, jak vypadá výzkum na světové úrovni a získejte jiný pohled na přírodní vědy než ten, který vám zatím nabídla školní lavice. Slyšeli jste už o molekulárních strojích, personalizované medicíně, DNA kvadruplexech nebo o synchrotronech? V letošním ročníku ViBuChu se dozvíte více! Jak už možná víte, 3. ročník kurzu bude tématicky zaměřen na bioinformatiku a nástroje, které využívá, na známé i neznámé struktury DNA, supramolekulární chemii a také studium látek pomocí Roentgenova záření, které je v současné době hlavní metodou pro určování struktury molekul. Z každého tématu na vás čekají tři úlohy a v každé sérii narazíte samozřejmě i na jednu doplňkovou úlohu věnovanou jiné oblasti. Během celého ročníku na vás opět čekají čtyři série úloh, které budou vycházet v asi dvouměsíčních intervalech. Pokud budete pilně řešit všechny série, odměna v podobě praktického soustředění vás jistě nemine. Úspěšní řešitelé kurzu mají navíc možnost požádat o prominutí přijímacího řízení na obory programu Chemie a obor Chemoinformatika a bioinformatika na Přírodovědecké fakultě MU. Změnou oproti předchozím ročníkům jsou nové webové stránky kurzu. Doufáme, že se vám líbí a brzy si na ně zvyknete. Za nové stránky vděčíme velkou měrou kolegům z Korespondenčního semináře z informatiky (KSI), podobnost stránek s tímto seminářem je tedy čistě náhodná. Dále jsme se také po zkušenosti z předchozího ročníku rozhodli trochu polevit na obtížnosti úloh, takže by letos měly být jednodušší (ale nebojte, stejně se u jejich řešení zapotíte ;-)). Během celého ročníku doporučujeme ke každé úloze sledovat studijní materiály v příloze. Podívejte se také do záložky Články, kde najdete spoustu užitečných informací, například pokyny k psaní řešení. Pokud vám cokoliv nebude jasné, neváhejte se obrátit na organizátory nebo na autory konkrétní úlohy. Přestože se vám některé úlohy možná budou zdát ze začátku složité, nepropadejte ihned panice, prostudujte si studijní materiály a vyřešte úkoly, které zvládnete. Budeme moc rádi, když nám budete posílat i částečně zpracovaná řešení. Další čas probdělých nocí právě nastává, držíme palce při řešení ViBuChu! Za celý bláznivý tým Mira 3
A1 Supramolekulární skopičiny Autoři: Tomáš Fiala (e-mail: tom.fiala90@gmail.com) 12 bodů Lukáš Mikulů (e-mail: lukas.mikulu@seznam.cz) <vtipny uvod> Milí přátelé! V následujících několika měsících se stanete svědky nevídaného. Série úloh skrytá pod písmenem A vás v letošním ročníku zavede do oblasti chemie, kde kovalentní vazby jsou trapnou samozřejmostí. Supramolekulární chemie se zabývá interakcemi, které jsou nadstavbou ke klasickým vazbám, ale jak budete mít možnost sami zjistit, jsou neméně důležité. Dlužno podotknout, že v názvu úlohy bylo slovo interakce pro marketingové účely nahrazeno slovem skopičiny, ale nebojte se, i na hračky se dostane. V první úloze série vás čeká seznámení se základními typy nekovalentních interakcí, se zvláštním důrazem na vodíkové vazby. Dozvíte se také něco o crown etherech významných to makrocyklických ligandech. Na závěr se dostaneme ke slíbenému skotačení se supramolekulární hračkou. </vtipny uvod> Exkurze do nekovalentních interakcí Síla nekovalentních interakcí se do značné míry projevuje v pevné fázi, kde se jednotlivé molekuly/ionty v krystalové mřížce přitahují. Při zjednodušeném pohledu je síla interakce mezi nimi úměrná teplotě tání (pochopitelně jsou zde další faktory, např. hmotnost molekuly). Pokud se ale soustředíme pouze na interakce, teplota tání roste s jejich silou. Úkol 1: Přiřad te k sobě následující sloučeniny, jejich teploty tání a nejsilnější interakci, která drží pohromadě krystalovou mřížku dané látky. Sloučenina Teplota tání / C Interakce benzen diethylether ethylenglykol mravenčan sodný pentan Teploty tání: 13 C; 116 C; 6 C; 253 C; 130 C Interakce: dipól-dipól; ion-ion; Londonova disperzní; stacking; vodíkový můstek Pokud jste vyřešili výše uvedenou tabulku, jste nyní dostatečně způsobilí na to, abychom vám na hlavu nasadili korunu. Nebo spíše do hlavy... Crown ethery ( korunové ethery ) jsou makrocyklické ligandy, které byly poprvé připraveny v roce 1967 C. J. Pedersenem. Jako mnoho dalších významných objevů, i crown ethery byly objeveny náhodou. C. J. Pedersen se pokoušel připravit ligand pro komplexaci vanadylového kationtu následující reakcí: + Cl Cl 1. Na, Bu 2. +, 2 Naštěstí byla jeho výchozí látka pyrokatechol částečně chráněný tetrahydropyranem znečištěná malým množstvím nechráněného pyrokatecholu. Úkol 2: Doplňte vedlejší produkt, který Pedersen omylem získal reakcí pyrokatecholu (ve výtěžku pouhých 0,4 %) a navrhněte reakční mechanismus: 4
+ Cl Cl Na, Bu? Crown ethery jsou schopné vázat mj. ionty alkalických kovů. Kationt je v těchto komplexech vázaný v kavitě obklopené atomy kyslíku, které poskytují pro interakci volné elektronové páry. Ve výsledku tak kolem kladného iontu vzniká záporně nabitý polštář. Sílu vazby iontu v kavitě ovlivňuje několik faktorů: 1. míra shody velikosti poloměru kavity a iontového poloměru hosta 2. počet donorových atomů ligandu (hostitele) 3. solvatace kationtu a ligandu 4. velikost chelátového kruhu. Protentokrát se soustředíme toliko na bod 1. Poloměr kavity [18]crown-6 etheru a jeho derivátů se pohybuje od 2,60 do 3,20 Å, což je vhodné pro draselný kationt (iontový poloměr 2,66 Å). proti tomu sodný kationt (iontový poloměr 1,90 Å) je lépe komplexován [15]crown-5 etherem, který má poloměr kavity 1,70 2,20 Å. Cis-syn-cis-dicyklohexyl[18]crown-6 je schopen komplexovat draselné kationty a slaběji také sodné. Rovnováhu níže uvedené vytěsňovací reakce můžeme vyjádřit takzvaným koeficientem selektivity: K K,Na = [Na(crown)+ ] [K + ] [K(crown) + ] [Na + ] K + + Na+ Na + + K+ Úkol 3: Za předpokladu, že pro uvedený crown ether (ve vodě při 25 C) K K,Na = 0,16, vypočítejte, kolik gramů NaCl je potřeba přidat k roztoku 1,0 g komplexu [K(crown)]Cl, abychom vytěsnili 99 % K + iontů z kavity ligandu. My name is Bond, -Bond Musíme si přiznat, že bez existence vodíkových můstků byste tuhle vysoce zajímavou úlohu nikdy nemohli řešit. Proč? Například proto, že by vlákna DNA nemohla držet pohromadě, voda by byla plynná už od nějakých 80 C a mnoho dalších katastrofických důsledků, které by znamenaly nemožnost existence života. Zůstaňme tedy na okamžik u zmíněné deoxyribonukleové kyseliny. Na níže uvedeném obrázku můžete vidět dva komplementární páry dusíkatých bází. N N R N N N R N N N N N R N N N N N N R A B 5
Úkol 4: ba páry A i B obsahují jednu pyrimidinovou a jednu purinovou bázi. bě purinové báze (a stejně tak i pyrimidinové) jsou vůči sobě izomerní. jaký druh izomerie se jedná? Úkol 5: Zkuste vysvětlit, proč je jeden z těchto párů vázaných vodíkovými můstky stabilnější (a tedy se vyskytuje v DNA) než ten druhý. Nyní se pust me do d ábelské úvahy. Mějme 666 ml 100% kyseliny octové (ρ = 1,05 g ml 1 ; Mr = 60,05). Úkol 6: Jaký objem plynu by se uvolnil odpařením tohoto množství kyseliny při teplotě 120 (teplota varu kys. octové) a tlaku 1,00 bar? Vzniklý plyn považujte za ideální. Ve skutečnosti však bude objem získaného plynu mnohem menší. Molekuly kyseliny octové totiž i v plynné fázi tvoří dimerní částice. Podstatou tohoto jevu je existence dvou vodíkových vazeb mezi karboxylovými skupinami obou molekul. 3 C C 3 Úkol 7: Jaký objem plynu byste očekávali za předpokladu, že by se kompletně všechny molekuly účastnily těchto skopičin? Nyní budeme tak hodní a prozradíme vám skutečný objem plynu, který byste získali odpařením výše zmíněného démonického množství C 3 C. Bylo by to 347,4 litru. Úkol 8: Pokuste se tuto informaci využít k výpočtu konstanty stability dimeru kyseliny octové. Mějte na paměti, že konstanta stability libovolného komplexu je pouze rovnovážná konstanta reakce vzniku komplexu, v tomto případě dimeru: 2 3 C 3 C C 3 Nápověda: Koncentrace plynu se dá spočítat stejně jako koncentrace látky v roztoku, tedy c = n/v. Supramolekulární hračička č. 1 Společnost často považuje šílené vědce za podivíny, společenské vyvrhele a kulturní barbary. Není však pravdou, že by se tito intelektuálové neuměli, ba dokonce odmítali bavit. Je to přesně naopak. Akorát místo diskoték, divadel a oper chodí do laboratoře a místo konvenčních makroskopických hraček mají své nanohračičky (tedy o velikosti molekul). My vám v každé ze tří částí této úlohy představíme jednu supramolekulární hračičku. Zapnuto/vypnuto. Dva stavy, se kterými se setkáváme dnes a denně, když vypínáme budík, startujeme počítač, chceme rozsvítit, atd. V těchto případech se většinou jedná pouze o to, že nějaký spotřebič vodivě spojíme (nebo odpojíme) se zdrojem napětí centrální sítě. Přepínače však mohou vypadat i úplně jinak. Velkým hitem mezi supramolekulárními chemiky je konstrukce tzv. molekulárních přepínačů (anglicky molecular switch ). Cucurbit[n]urily (CBn) jsou makrocyklické sloučeniny, které mohou tvořit supramolekulární komplexy s množstvím látek. Jedná se o prstencovité struktury tvořené glykolurilovými monomery, které jsou vzájemně spojené methylenovými můstky. Jak je vidět na níže uvedeném obrázku, karbonylové skupiny glykolurilových jednotek směřují dovnitř kavity a vytváří tak zápornou vstupní bránu. Z tohoto důvodu jsou cucurbiturily vhodnými receptory kladně nabitých částic (např. amoniových nebo pyridiniových solí), zatímco záporné částice jsou z kavity vypuzovány. Dnes se seznámíte s CB7, který je schopný se navléknout na následující tyčinku na bázi bipyridinia. 6
Cl - Cl - C N + N + C tyčinka Při nízkém p jsou obě karboxylové skupiny tyčinky plně protonované. V tomto stavu tvoří s CB7 komplex, ve kterém makrocyklus obklopuje střídavě oba dva alifatické řetězce tyčinky a doslova pendluje z její jedné strany na druhou (černý obdélník představuje CB7): C N + N + C C N + N + C V nadbytku CB7 je tyčinka dokonce schopna tvořit s makrocyklem komplex v poměru 1:2, ve kterém jsou na ni navlečeny dva cucurbiturily na každém konci jeden: C N + N + C Zvýšením p na hodnotu 9 však dojde ke kompletní deprotonaci karboxylových skupin a výše uvedené komplexy přestávají být stabilní díky repulzi záporných karboxylátových skupin tyčinky a karbonylových skupin CB7. Makrocyklus pak tvoří s tyčinkou výhradně komplex 1:1 a zakrývá bipyridiniový střed tyčinky: 7
- C N + N + C - Jak tedy vidíte, CB7 zde funguje jako pohyblivá část stroje, která v závislosti na podmínkách pendluje mezi různými částmi molekuly. Uvedené tři komplexy můžeme rozeznat podle množství UV záření (o vlnové délce 260 nm), které absorbují. Za tento jev je zodpovědný především aromatický střed tyčinky, který v případě interakce s CB7 přestává při této vlnové délce absorbovat. Úkol 9: Seřad te uvedené tři komplexy podle vzrůstající schopnosti absorbovat UV záření. 8
B1 Predikce struktury a vlastností proteinů za pomoci bioinformatických nástrojů Autor: Jan ppelt (e-mail: jan.oppelt@gmail.com) 13 bodů V dnešní době dochází k exponenciálnímu nárůstu množství dat a informací, které je spojeno se zvyšováním výpočetních výkonů počítačů. Tyto data je však potřeba nějakým způsobem zpracovat. Způsob a efektivita zpracování těchto dat je stále velkou výzvou pro mnoho výzkumných týmů. Toto platí samozřejmě i v oblasti přírodních věd. Analytické přístroje se stále zlepšují a poskytují nám více přesnějších informací o zkoumaných tématech. Jedním z vědních oborů, který se těmito údaji zabývá, je bioinformatika. Využívá síly počítačů k urychlení a snížení ceny analýzy a umožňuje nám podstatně rychleji získat informace o tom, co nás zajímá než poměrně nákladné a pomalejší experimentální řešení. Je to mladý obor, který se stává stále atraktivnější a potřebnější. Výsledky z bioinformatické analýzy se dají využít v medicíně, biologii, chemii a jiných přírodovědeckých oborech a jejich kombinacích. Důležitou roli hraje bioinformatika jako most mezi jednotlivými vědními obory. Díky tomuto spojení dokáže efektivně využívat informace ze všech odvětví. V našich úlohách se zaměříme na aplikaci bioinformatických nástrojů pří získávání údajů o proteinech, předpovědi jejich vlastností a struktury. Ukážeme si, co vše již dokážeme predikovat a k čemu se takové vědomosti dají využít. Proteiny jsou jednou z nejdůležitějších součástí všech organismů. Není to jen řádek nutričního obsahu na obalu potravin. Jsou jedním ze základních prvků, které se podílí na běhu organismu, jeho regulaci a stavbě, transportu látek... jednoduše mají prsty skoro ve všem. Tyto molekuly se studují již po mnoho desetiletí a s postupem času se využívají novější a modernější metody. V následujících sériích úkolů, které budete vypracovávat, se seznámíte s využitím počítačů při získávaní informací o těchto molekulách a to hlavně o struktuře a funkci. V první části úloh nejprve zjistíme, kolik toho o proteinech víte. Protein je velký celek, který se skládá z mnoha menších částí, které se spojují dohromady. Zjednodušeně by se schéma dalo popsat takto: aminokyseliny oligopeptidy polypeptidy proteiny Navíc se docela často se také objevují v proteinech nepeptidové složky. Těmi mohou být sacharidy, ionty kovů, apod. Kdyby to bylo takto jednoduché, nemuseli bychom vlastně nic zkoumat. Představte si, že protein je jedna velká stavba. Ta je složena z více součástí, jako jsou stěny, okna, střechy, atd. Tyto součásti jsou zase složeny z dalších menších součástí, jako jsou řady cihel, rámy oken a střešní tašky. Všechny tyto prvky jsou složeny ještě z menších částí, kterými jsou jednotlivé cihly nebo tašky. Ty by se při troše snahy daly rozložit ještě na menší části (můžeme si teoreticky představit hlínu, ze které se cihly nebo tašky pálí). Tohle je vlastně obrácené schéma, které je popsáno o něco výše. Pro lepší představu je to ale dostačující. Není to ale vše. Tyto prvky se nespojují dohromady jen lineárně, ale tvoří i prostorové celky a složitější struktury. d cihel až k hotové stavbě to vypadá následovně (proč je kvartérní struktura šedě si řekneme o něco níže): primární struktura sekundární struktura terciární struktura kvartérní struktura Primární struktura je čistě pořadí aminokyselin za sebou. Jaké pořadí bude, je uloženo v samotné DNA, která se během procesu zvaného transkripce přepíše do mediátorové RNA a ta se potom za pomoci ribozomů přeloží do proteinové sekvence. Sekundární strukturou rozumíme již složitější uspořádání řetězce aminokyselin. Ke vzniku těchto struktur dochází při procesu nazývaném folding (skládání). V tom je i rozdíl mezi polypeptidem a proteinem. Polypeptid je řetězec aminokyselin, který ještě není složený. Protein je již složená struktura. Nejzákladnějšími sekundárními strukturami jsou alfa šroubovice (alpha 9
helix) a beta listy (beta sheet). Dále pak ještě rozeznáváme kombinace a různé uspořádání těchto prvků. Ty se dále spojují pomocí různých smyček a přesmyků do terciární struktury, která již může tvořit celkovou finální 3D strukturu proteinu. Poté však ještě může následovat struktura kvartérní, která se skládá z více terciárních podjednotek. Dalo by se říci, že to jsou samostatné proteiny spojené dohromady tvořící funkční komplex. Důležitá poznámka je, že funkční protein se může vyskytovat již na úrovní struktury terciární. Pro lepší představu vám uvedu příklad. Představovaný protein je zelený fluorescenční protein (anglicky green fluorescent protein nebo také někdy označován jen jako GFP). Tento protein pochází z medůzy Aequorea victori. Vzhledem k tomu, že krásně svítí pod UV zářením, tak se s ním hojně setkáme při sledování exprese proteinů v molekulární a buněčné biologii. Protein se skládá z 238 aminokyselin. bsahuje 11 beta listů, které jsou stočené do soudkovitého tvaru (tzv. beta barell) a jedné alfa šroubovice, která vede do nitra soudku. Ta drží chromofor, což je ta část proteinu, která je zodpovědná za jeho fluorescenční vlastnosti. Celkově se ovšem protein vyskytuje v homodimeru obsahuje dvě totožné části, které jsou spojeny dohromady. Primární struktura: ASKGEELFTG VVPILVELDG DVNGKFSVS GEGEGDATYG KLTLKFICTT GKLPVPWPTL VTTFSYGVQC FSRYPDMKR DFFKSAMPE GYVQERTIFF KDDGNYKTRA EVKFEGDTLV NRIELKGIDF KEDGNILGK LEYNYNSNV YIMADKQKNG IKVNFKIRN IEDGSVQLAD YQQNTPIGD GPVLLPDNY LSTQSALSKD PNEKRDMVL LEFVTAAGIT GMDELYK Sekundární struktura: Primární a sekundární struktura dohromady: 10
Terciární struktura: Kvartérní struktura: Struktura proteinu je většinou mnohem důležitější parametr pro jeho vlastnosti a funkci než jeho samotné složení. Toto si zapamatujte! Později se tomu budeme věnovat více. Pro dobrou stavbu je ale zapotřebí všechno pořádně spojit. Na to je potřeba malta, hřebíky nebo izolepa. Stejně tak to platí i u proteinů. A to bude váš první úkol. Úkol 1: Napište, co drží proteiny pohromadě (čím jsou stabilizovány) na úrovni struktury a) primární, b) sekundární, c) terciární, d) kvartérní a zkuste ke každému nakreslit jednoduché schéma. U bodu a) nakreslete i reakční schéma, jakým se spojují aminokyseliny, a název reakce. Stačí použít obecné schéma aminokyseliny. Když tedy už víme, jak proteiny vypadají, z čeho se skládají a jak jsou spojeny, můžeme se zaměřit na to, jaké jsou mezi nimi rozdíly. Rozdíly proteinů na primární úrovni jsou dané geneticky. Jednotlivé odchylky na této úrovni jsou dané bud samou podstatou proteinu, nebo chybami v procesu zpracování informace někde mezi DNA 11
RNA protein. Rozdíly v sekundární struktuře jsou již mnohem důležitější a ovlivňují interakce proteinů s dalšími proteiny, DNA nebo RNA. Terciární struktura (a případně kvartérní) potom určuje, jak se celý protein bude chovat, kde budou jeho aktivní místa, které části budou vystaveny okolí, jaké budou jeho vlastnosti a podobně. Až do nedávna se dala 3D struktura proteinů zjišt ovat pouze experimentálně. V dnešní době a s rozmachem využití počítačů se však možnosti rozšířily. A nejen to. Také se vše mnohem zlevnilo a urychlilo. To ovšem neubírá nic na významu a důležitosti experimentů. Bez nich by se ani naše predikce dělat nedaly. Struktura proteinů se dá experimentálně zjistit několika základními způsoby rentgenová krystalografie, nukleární magnetická rezonance, elektronová mikroskopie a hybridní metody. Tímto jsme se dostali k dalšímu úkolu. Úkol 2: Zjistěte, kolik je v současnosti a) známých aminokyselinových sekvencí proteinů (jedno číslo), b) vyřešených struktur proteinů, c) a jakým způsobem byly struktury získány (pět čísel a prosím vyjádřete je i percentuálně). U obou podúkolů uved te kde a kdy jste údaje získali. Nápověda zkuste hledat statistiky databází. Jak jsme již na začátku řekli když máme informaci o struktuře proteinu, tak můžeme studovat mechanismus procesů, můžeme provádět mutagenezní studie (změníme určitou část proteinu a sledujeme, co se stane), můžeme provádět drug design (návrhy nových léčiv) nebo zkoušet proteinové inženýrství (vytváření lepších proteinů). Struktura proteinu je v zásadě dána jeho primární strukturou. Ta však není tak homogenní. Co to znamená? Že proteiny se stejným tvarem mohou mít různou sekvenci aminokyselin. Příroda má omezený počet možností, do kterých se protein může složit. Toto je ovlivněno hlavně velikostí vazebné energie a obecně je preferován stav s co nejnižší energií. brovský rozdíl mezi počtem známých aminokyselinových sekvencí proteinů a počtem zjištěných 3D struktur nám mohou pomoci snížit počítačové predikce a modelování. Vychází právě z podobnosti sekvencí různých proteinů. Třemi nejpoužívanějšími metodami jsou ab initio (dalo by se přeložit jako od počátku ), homology modeling (homologní/podobnostní modelování) a threading (něco jako navlékání ). Všechny metody pracují na trochu jiném principu. Tyto výpočetní metody se nedají použít, aniž by byly známé reálné struktury. Čím více bude experimentálně zjištěných struktur, tím přesnější modelování a predikce bude. Ab initio metody jsou časově i výpočetně nejnáročnější, protože se snaží vytvořit strukturu čistě ze sekvence bez větší známosti podobných 3D struktur. Používanějšími metodami jsou tedy homology modeling nebo threading. omology modeling vychází z podobností mezi známou primární sekvencí a strukturou proteinu/ů a vytváří podobnostní model kombinací více parametrů. Nejpodobnější protein s vyřešenou strukturou se pak použije jako vzor. Threading vychází více z podobnosti aminokyselinových sekvencí. Nejlepším řešením bývá kombinace těchto metod (například homology modeling a ab initio). Na vytvoření základního modelu se použije homology modeling a potom se struktura vyšperkuje pomocí ab-initio metod. Predikce struktury proteinů by se daly označit jako svatý grál bioinformatiky. Každoročně se vypisuje řada soutěží o správnou predikci proteinů. Většinou se to dělá tak, že se jako úkol zadá protein, u kterého je struktura již experimentálně vyřešena, ale ještě nebyla publikována. Tým, který se dostane svou předpovědí nejblíže reálné struktuře, dostane většinou velice pěknou finanční odměnu. A to nás zavedlo k dalšímu a poslednímu úkolu první série. Úkol 3: Zkuste navrhnout vlastní schéma, jak byste postupovali při zjišt ování neznámé struktury proteinu pomocí podobnostního modelování, když znáte pouze jeho sekvenci (tj. začínáte se sekvencí a končíte s predikcí 3D struktury). Příště si povíme něco bližšího o programech, které nám slouží k jednotlivým předpovědím a simulacím a rozšíříme trochu znalosti jak praktické tak teoretické. 12
C1 Struktura nukleových kyselin Autor: Petr Stadlbauer (e-mail: silchemix@centrum.cz) 9 bodů Když se řekne slovo nukleová kyselina, každý z nás si okamžitě vybaví známou dvoušroubovici DNA, nositelku dědičné informace. Nukleové kyseliny se zcela nepochybně řadí mezi základní biomakromolekuly. Vedle již zmíněné DNA je v každé buňce hojně zastoupena též RNA, která může plnit nejrůznější funkce, například obstarává syntézu bílkovin, genovou regulaci, obrannu proti patogenním vlivům a dokonce sama může nést genetickou informaci. Podle jedné z teorií byla RNA dokonce na počátku veškerého života na naší planetě. Velká škála funkcí nukleových kyselin vyžaduje velkou strukturní variabilitu a stěží si lze představit, že by to všechno dokázala ona dvoušroubovice. Ale pěkne popořádku. Nukleové kyseliny se podobně jako jiné makromolekuly skládají ze základních stavebních kamenů. V našem případě se jedná o nukleotidy a těch se bude týkat i následující sada otázek. Úkol 1: Nakreslete nukleotid adenosin-5 -monofosfát a do obrázku vyznačte jednotlivé části: adenin, ribosa, fosfát, nukleosid. Vyznačte hydroxylovou skupinu, která chybí v 2 -deoxyribose, tedy v DNA. Úkol 2: Adenin samozřejmě není jedinou bází, která se v nukleotidech vyskytuje. Nakreslete a pojmenujte další čtyři základní báze, které se vyskytují v DNA nebo RNA, a též je označte jednopísmenkovými značkami, kterými se běžně pojmenovávají jejich příslušné nukleosidy. Úkol 3: Vedle výše zmíněných bází se objevují i některé další, tzv. minoritní, které většinou vznikají modifikací základních a mají často neznámé funkce. Známý je jejich hojný výskyt v trna. Nakreslete a pojmenujte libovolných pět minoritních bází, které se vyskytují v živých organismech. Jednotlivé nukleotidy se mohou navzájem spojovat pomocí fosfodiesterových vazeb mezi 3 jednoho nukleotidu a 5 následujícího nukleotidu a tím vznikají oligo- až polynukleotidové sekvence. Samotná sekvence nám ale neříká nic o tvaru molekuly. K tomu potřebujeme informaci o prostorovém uspořádání atomů a u nukleových kyselin se běžně používají torzní (dihedrální) úhly v jednotlivých nukleotidech. Úkol 4: Nakreslete dinukleotid 5 -papa-3. Vyznačte v něm torzní úhly páteře α, β, γ, δ, ε, ζ a glykosidické torzní úhly χ podle zvyklosti u obou nukleotidů. Nelekněte se toho, že některé úhly na koncích páteře chybí. Na charakteru prostorové struktury nukleových kyselin se podílí spousta interakcí, jmenujme stacking bází nebo repulzi fosfátů. Mezi významné se řadí vodíkové vazby, kdy interagují donory a akceptory vodíkových vazeb. Na nich se podílí báze nebo hydroxylová skupina ribosy. Je též možná i interakce s fosfáty. Interakce mezi jednotlivými bázemi se klasifikují podle strany, kterou mezi sebou nukleotidy interagují. Úkol 5: V následujícím obrázku vyznačte, která červená čára symbolizuje Watson-Crickovu hranu, oogsteenovu hranu a sacharidovou hranu. 13
Na závěr první úlohy, po zvládnutí základů popisu struktury, se již lehce podíváme na samotnou DNA. Na začátku jsme se zmiňovali o dvoušroubovici a té se bude věnovat i poslední otázka. Úkol 6: Dvojitá šroubovice není vůbec rigidní struktura. Může existovat v několika konformacích, které mezi sebou za určitých okolností mohou přecházet. Které jsou tři základní biologické typy dvoušroubovice DNA? Nakreslete základní páry bází, které se v nich vyskytují, vyznačte vodíkové vazby mezi bázemi a napište, které hrany bází se účastní této interakce. Srovnejte v tabulce každy typ dvoušroubovice z pohledu toho, zda je levotočivá či pravotočivá a dalšími třemi libovolnými geometrickými parametry. Glykosidické torzní úhly χ se většinou v nukleových kyselinách vyskytují v poloze označované anti. Povšimněte si, že u jedné z typů dvoušroubovice tomu tak není a obsahuje i nukleotidy v poloze syn, u kterého? Doufám, že vás problematika struktury nukleových kyselin zaujala a těšíte se na nové úkoly. Příště se podíváme na další struktury molekul DNA, a hlavně nahlédneme pod pokličku RNA. Při práci si vyzkoušíte i počítačové programy pro vizualizaci molekul a kreslení schematických struktur. Úkol 7: Napište prosím, který operační systém běžně používáte (Windows XP/Vista/7, Mac S X, Linux, jiný), a jestli máte reálnou možnost pracovat na strojích s unixovým prostředím (Mac S X, Linux). Toto samozřejmě není bodovaná otázka, ale umožníte nám, abychom mohli cíleněji napsat návody pro další úlohy. 14
W Aromatické sloučeniny (první doplňková úloha) Autor: Jaromír Literák (e-mail: literak@chemi.muni.cz) 10 bodů Pokud se laikovi nebo dítěti dostane do rukou učebnice organické chemie, nejspíše jej v knize zaujmou obrázky zachycující strukturní vzorce aromatických sloučenin, které jsou vystavěny z pravidelných šestiúhelníků. Polykondenzované aromatické uhlovodíky pak téměř automaticky vyvolávají asociaci s včelími plástvemi, které se tak stávají častým motivem pro obálky učebnic organické chemie. Úkol 1: Vzorce aromatických uhlovodíků poskládané z pravidelných šestiúhelníků možná připadají krásné laikům. Zasvěcený člověk ale ví, že se tyto struktury pojí s často velmi problematickými vlastnostmi. Dokážete uvést, o jaké vlastnosti se jedná? Úkol 2: Spisovatel Karel Čapek se ve svých dílech velmi často odkazoval na poznatky přírodních věd, při čtení jeho knih zjistíme, že své znalosti čerpal pravděpodobně jen z encyklopedií. V jednom z jeho slavných románů se asociace chemických vzorců a včelích pláství také objevuje. Vzpomenete si, o který román se jedná? rdina tohoto románu mohl být zneuznaným chemikem. bjev struktury benzenu Benzen, základní představitel skupiny aromatických uhlovodíků, byl v čisté podobě poprvé izolován v roce 1825 Michaelem Faradayem. Tehdejší věda dokázala stanovit sumární vzorec nové sloučeniny (C 6 6 ), popis vnitřní struktury molekuly však přesahovalo možnosti soudobé strukturní teorie. Vývoj představ o vnitřním uspořádání molekuly benzenu může proto sloužit jako názorná ilustrace vývoje samotné strukturní teorie organických sloučenin. Největší podíl na objevu cyklické struktury benzenu je tradičně přisuzován německému chemikovi s českými kořeny Augustu Kekulému. Nejdříve v práci z roku 1858 zveřejnil své představy o způsobu uspořádání atomů v molekulách organických sloučenin, které jsou ve své podstatě platné dodnes (čtyřvazný atom uhlíku, vzájemné poutání atomu uhlíku jednoduchými nebo násobnými vazbami, stálá valence atomů určitého druhu) 1. Představu, že atomy v molekule benzenu tvoří uzavřenou smyčku, zveřejnil až v roce 1865 ve francouzském časopise 2. Jak se můžeme přesvědčit na následujícím obrázku, tento první návrh ještě neměl podobu šestiúhelníku, jak jej známe dnes, navíc ani způsob spojení atomů uhlíku a vodíku neodpovídá současným představám. Na obrázku si také můžeme prohlédnout, jak si Kekulé představoval strukturu chlorbenzenu a dichlorbenzenu (benzin byl tehdejší název benzenu). Až o rok později, v práci psané německy, se objevuje známá šestiúhelníková struktura 3 : 1 Kekulé F. A.: Annalen der Chemie und Pharmacie 1858, 106 (2), 129. doi:10.1002/jlac.18581060202 2 Kekulé F. A.: Bulletin de la Societe Chimique de Paris, N.S. 1865, 3, 98. 3 Kekulé F. A.: Liebigs Annalen der Chemie und Pharmacie 1866, 137 (2), 129. doi:10.1002/jlac.18661370202. 15
V roce 1890, při příležitosti pětadvacátého výročí publikování své první práce o struktuře benzenu, proslovil Kekulé přednášku k historii objevu. V přednášce zmiňuje, že k návrhu struktury jej vedl sen, v němž se mu zjevil had zakusující se do vlastního ocasu 4. istorka o snu se od té doby dále traduje v učebnicích, skutečnost však může být daleko prozaičtější. V roce 1861 vyšla ve Vídni útlá kniha napsná Josefem Loschmidtem, rodákem z Počeran u Karlových Varů, který je dnes znám spíše díky svým pracem z oblasti fyziky. Loschmidt zde navrhuje strukturní uspořádání přes 300 chemických látek 5. Atomy ve strukturních vzorcích byly reprezentovány kruhy, jejichž překryv značil vazbu. Loschmidt ve vzorcích poprvé použil čáry znázorňující jednoduchou, dvojnou a trojnou vazbu. Kniha obsahuje celkem 121 struktur aromatických látek, z nichž se mnoho struktur blíží dnes známé konstituci. Na následujícím obrázku si můžeme prohlédnout Loschmidtem navrženou cyklickou strukturu benzenu osazenou atomy vodíku, a také například strukturu kyseliny skořicové. Kekulé knihu napsanou Loschmidtem znal, sám se na ní ostatně ve své práci z roku 1865 odkazuje, a proto nebyl jistě sen o hadovi jediným jeho inspiračním zdrojem. Srovnáním obou návrhů zjistíme, že ani jeden nepostihuje zcela strukturu benzenu, každému z nich se však podařilo vystihnout určitou stránku věci, bylo by proto spravedlivé prvenství přiřknout oběma vědcům. Elektronová struktura aromatických sloučenin Vlastnosti benzenu však dále způsobovaly chemikům potíže, chyběla stále uspokojivá teorie pro jejich vysvětlení. Kekulého struktura benzenu s lokalizovanými dvojnými vazbami (tedy vlastně cyklohexa- 1,3,5-trien) musel vést k předpokladu existence většího počtu isomerních derivátů benzenu, než bylo známo. Podle těchto vazebných teorií by například měly existovat dva 1,2-disubstituované benzeny, což neodpovídalo skutečnosti. R R R R Samotný Kekulé postuloval, že v benzenu dochází k velmi rychlému posunu dvojných vazeb, což znemožňuje izolaci jednotlivých isomerů. d počátků organické chemie bylo zřejmé, že aromatické uhlovodíky představují zvláštní skupinu mezi ostatními nenasycenými uhlovodíky, nejen pro svou nezvyklou vůni (odtud také jejich název), ale také pro své odlišné fyzikálně-chemické vlastnosti. Jako jednu z nejdůležitějších odlišností můžeme uvést netečnost aromátů k adičním reakcím (adice halogenů, katalytická hydrogenace), které jsou typické pro ostatní nenasycené uhlovodíky. 4 V anglickém překladu je přednáška přístupná v článku: Wilcox Jr. D.., Greenbaum F. R.: Journal of Chemical Education 1965, 42 (5), 266. doi:10.1021/ed042p266 5 Loschmidt J.: Chemische Studien, A. Constitutions-Formeln der organischen Chemie in geographischer Darstellung, B. Das Mariotte sche Gesetz, Carl Gerold s Sohn, Wien 1861. 16
Cl 2 Cl Cl adice Naopak aromatické uhlovodíky podstupují substituční reakce, při kterých dochází k výměně atomů nebo skupin atomů poutaných k aromatickému jádru, ale celý systém konjugovaných násobných vazeb zůstává po reakci zachován. Cl 2 bez reakce adice Cl 2 AlCl 3 Cl + Cl substituce Ještě lépe neobvyklá stabilita benzenu vysvitne ze srovnání reakčních entalpií hydrogenačních reakcí. Alkeny za katalýzy například kovovou platinou adují vodík, reakce je exothermní, reakce vede ke stabilnějšímu produktu. Jako příklad uved me cyklohexen: 2 = -118 kj mol -1 U benzenu, pokud by to skutečně byl cyklohexa-1,3,5-trien, bychom očekávali reakční entalpii blízkou trojnásobku hodnoty cyklohexenu, tedy 354 kj mol 1. Ve skutečnosti je entalpie hydrogenace benzenu výrazně nižší: 2 = -204 kj mol -1 Rozdíl těchto dvou reakčních entalpií (150 kj mol 1 ) ukazuje přibližnou hodnotu stabilizační (rezonanční) energie spojené s výhodným uspořádáním násobných vazeb, se kterým se setkáme právě v benzenu nebo jiných aromatických sloučeninách. Jak jsme viděli, již v devatenáctém století se objevují strukturní teorie chemických sloučenin, které předpokládají existenci chemické vazby mezi atomy v molekule. První fyzikální teorie vysvětlující podstatu chemické vazby však mohly vzniknout až po oběvu struktury atomu (1897 objev elektronu, 1911 objev existence elektronového obalu a kladně nabitého jádra atomu). V roce 1916 Gilbert N. Lewis vyslovil představu, že kovalentní vazba mezi atomy vzniká sdílením elektronového páru. V roce 1927 Walter eitler a Fritz London popsali pomocí kvantové mechaniky vznik kovalentní vazby v molekule vodíku. V roce 1930 německý fyzik Erich ückel na základě symetrických argumentů postuluje existenci σ a π vazeb, které se liší rozložením elektronové hustoty. σ vazba π vazba ückel také ztotožňuje jednoduchou vazbu se σ vazbou a dvojnou vazbu vidí jako kombinaci σ a π vazby 6. rok později publikuje ückel přelomovou práci o elektronové strukuře molekuly benzenu, ve které odvodil, že uzavřený cyklický systém konjugovaných π vazeb je spojen do jednoho systému a elektronová hustota je v molekule rovnoměrně rozprostřena. Molekula benzenu je tímto uspořádáním výrazně stabilizována je aromatická 7. Proto benzen můžeme nejlépe reprezentovat následujícím vzorcem. 6 ückel E.: Zeitschrift für Physik 1930, 60 (7 8), 423. doi:10.1007/bf01341254.. 7 ückel E.: Zeitschrift für Physik 1931, 70 (3 4), 204. doi:10.1007/bf01339530. 17
I jiné cyklicky konjugované nenasycené sloučeniny mohou dosáhnout podobné stabilizace, podmínkou však je, aby konjugovaný π sytém obsahoval právě 4n + 2 elektronů, kde n je celé kladné číslo. Naopak ückel odvodil, že konjugovaný π sytém obsahující 4n elektronů je vysoce nestabilní (antiaromatický), což se například projeví vysokou nestabilitou sloučeniny nebo její reaktivitou. Je potřeba si uvědomit, že podmínkou aromaticity (antiaromaticity) je kromě přítomnosti definovaného počtu elektronů také existence planárního cyklu s konjugovaným π systémem. Přestože existují kriteria aromaticity, neexistuje přesně definovaná hranice mezi aromatickými a nearomatickými cyklickými nenasycenými sloučeninami, například u cyklického polyenu splňujícího jinak kritérium počtu elektronů může díky konformačnímu pohybu dojít k částečnému porušení konjugace a poklesu stabilizační energie. U polycyklických aromatických uhlovodíků také klesá stabilizační (rezonanční) energie vztažená na jedno aromatické jádro, proto mohou začít vykazovat reakce typické pro nearomatické sloučeniny. ückelova teorie umožňuje také vysvětlit existenci aromatických iontů. Aromatický v této souvislosti znamená vysoce stabilní ve srovnání s ionty podobného druhu. Například cyklopenta-1,3-dien vykazuje mimořádně vysokou kyselost ve srovnání s jinými alkeny s C vazbou v allylové pozici. Kyselost cyklopenta-1,3-dienu, tedy snadnost odštěpení + z vazby C, je přibližně o 28 řádů vyšší než kyselost propenu, což je skutečnost, kterou nelze vysvětlit prostou konjugací vzniklého elektronového páru s násobnou vazbou. Po odštěpení protonu z C vazby zůstane atomu uhlíku elektronový pár, který se nachází v orbitalu typu p. Pokud se nacházela C vazba v allylové pozici, může dojít ke konjugaci p orbitalu se sousedící π vazbou a vzniku jednoho π systému. C C + pka ~ 43 + pka = 15,5 V případě propenu je stabilizace touto konjugací relativně malá, naopak u cyklopenta-1,3-dienu vzniká aromatický systém, který je sice tvořen pouze pěti p orbitaly, splňuje však ückelovo pravidlo, což se projeví stabilitou aniontu. Stabilizace konjugované báze nevyhnutelně znamená zvýšení kyselosti konjugované kyseliny, jak vidíme v rozdílných hodnotách pka. Aromatické sloučeniny s Möbiovou topologií Aromatický systém benzenu a jiných monocyklických aromatických sloučenin je tvořen konjugovaným systémem p orbitalů, které jsou kolmé na rovinu molekuly a jsou uspořádány v cyklu. Můžeme si představit, že p orbitaly tvoří pás, který byl za účelem vzniku cyklického uspořádání na koncích spojen do podoby prstence. a a' b b' a-a' b-b' Přesněji řečeno, došlo ke spojení vrcholů a a a b b. Pokud bychom na sebe přiložili vrcholy a a b, b a, získali bychom tzv. Möbiovu pásku, útvar který má neobvyklé vlastnosti, například má pouze jednu 18
stranu, nemá tedy rub a líc. V pásu tvořeném p orbitaly by tato topologie vyžadovala jejich následující uspořádání. a a' b b' a-b' b-a' Takovéto uspořádání očividně znamená zhoršení překryvu p orbitalů, ale existence cyklického konjugovaného systému s touto topologií není vyloučená. Teoreticky bychom mohli dosáhnout podobné topologie například v benzenu s jednou C=C vazbou v trans-konfiguraci. Aromaticitou cyklických konjugovaných polyenů s Möbiovou topologií se poprvé zabýval Edgar eilbronner v roce 1964 8. Dlouhou dobu byla aromaticita systémů s Möbiovou topologií považována pouze za teoretickou zajímavost. Určitého využití našla například v Zimmermannových (vyslovte anglicky!) výběrových pravidlech pro pericyklické reakce 9. Pokusy o přípravy sloučeniny s Möbiovou aromaticitou přinášely dlouhou dobu zklamání. Malé cyklické molekuly se nedařilo připravit, protože byly destabilizovány vnitřním pnutím a díky malému počtu atomů v cyklu bylo také obtížné dosáhnout účinného překryvu p orbitalů. Naopak větší molekuly vykazovaly menší vnitřní pnutí, ale díky své velikosti byly flexibilní a měly tendenci se překlápět a unikat tak z Möbiovy topologie, která je ze své podstaty vratká. Až v roce 2003 se týmu kolem Rainera ergese, který působí na univerzitě v Kielu, podařilo připravit první aromatickou sloučeninu s Möbiovou topologií π systému. Strukturu tohoto uhlovodíku vidíme na obrázku vpravo. Látka skutečně vykazovala předpovězené vlastnosti aromatické sloučeniny 10. Úkol 3: Podle ückelova pravidla jsou cyklické konjugované systémy s 4n + 2 elektrony aromatické a s 4n elektrony antiaromatické. Pokuste se odhadnout, jaký počet elektronů musí zahrnovat aromatický konjugovaný systém s Möbiovou topologií π systému. Úkol 4: Určete, které z částic reprezentovaných následujícími strukturami jsou aromatické a které antiaromatické. a) b) c) d) e) f) g) h) i) N N 8 eilbronner E.: Tetrahedron Letters 1964, 5 (29), 1923. doi:10.1016/s0040-4039(01)89474-0. 9 Zimmerman. E.: Journal of the American Chemical Society 1966, 88 (7), 1564. doi:10.1021/ja00959a052. 10 Ajami D., eckler., Simon A., erges R.: Nature 2003, 426, 819. doi:10.1038/nature02224. 19
Předpokládejte, že všechny molekuly jsou planární. Pyridin a pyrrol obsahují v cyklu heteroatomy s volným elektronovým párem, v těchto případech je potřeba uvědomit si, zda se volné elektronové páry zapojují do cyklického konjugovaného π systému. N N N N pyridin pyrrol Úkol 5: Je thiofen aromatickou sloučeninou? S thiofen Reakce aromatických sloučenin Typické pro aromatické sloučeniny jsou elektrofilní aromatické substituce (S E Ar). becný mechanismus této reakce představuje následující obrázek. + E E E + E E π-komplex σ-komplex π-komplex Přehled různých druhů elektrofilních aromatických substitucí lze nalézt v každé učebnici organické chemie 11. Elektrofilní aromatické substituce jsou většinou nezvratné reakce, jen některé (sulfonace, bromace, některé alkylace) jsou zvratné. V jednom z reakčních kroků S E Ar dochází k adici elektrofilu na jednu násobnou vazbu a vzniku tzv. σ komplexu, což je spojeno se zánikem aromatického charakteru. Nepřekvapí jistě proto, že tento krok bývá obvykle nejobtížnějším a nejpomalejším. Následná reakce vede k rearomatizaci sloučeniny a probíhá naopak velice snadno. Proto v mechanismu elektrofilní aromatické substituce je vznik σ komplexu krokem určujícím celkovou rychlost, což znamená, že určuje celkovou rychlost a produkt nemůže vznikat rychleji, než probíhá tato dílčí reakce. Můžeme to ukázat na následujícím obecném obrázku. Pokud přeměna výchozí látky A na produkt P probíhá ve více krocích, jež se liší svými rychlostními konstantami, pak výrazně nejpomalejší přeměna B C je krokem určujícím rychlost reakce. Velice pěknou pomůckou pro pochopení jevu může být představa několika přesýpacích hodin nad sebou, kdy nejuzší část bude určovat, jak rychle písek bude propadat na samé dno. k A 1 k 2 k 3 B C pomalu P k 1 >> k 2 << k 3 11 Lze doporučit on-line přístupnou učebnici Svoboda J., Liška F., Stibor I., Kvíčala J., Lhoták P., Dvořák D.: rganická chemie I, VŠCT, Praha 2005. 20
V případě substituovaného aromatického uhlovodíku, který může S E Ar poskytnout více isomerních produktů, bude velikost aktivační energie pro vznik jednotlivých σ komplexů určovat pozici, do které bude elektrofil přednostně vstupovat. Uvažujme nitraci fenolu do meta a para pozic. Jak vyplývá z obrázku, tranzitní stav nastává na reakční koordinátě blíže σ komplexu než výchozím látkám (díky nevýhodnosti reakce), proto se mu bude také svou strukturou více podobat a uplatní se u něj podobné stabilizující (případně destabilizující) efekty substituentů. Pro přehlednost je vynechán π komplex: E 2 N + N 2 2 N R. K. V případě příchodu elektrofilu do para-pozice fenolu vzniká σ komplex, v němž je kladný náboj konjugován s M+ (kladný náboj stabilizující) hydroxylovou skupinou, v σ komplexu vzniklého napadením meta-pozice se tato stabilizující interakce neuplatní. 2 N 2 N 2 N 2 N 2 N 2 N 2 N vlivu jednotlivých druhů substituentů na rozložení elektronové hustoty naleznete více infomací v doporučené učebnici organické chemie. Úkol 6: Planární cyklooktatetraen by byl antiaromatický, jak se můžeme přesvědčit jednoduchým výpočtem. Proto jistě nepřekvapí, že molekula reálného cyklooktatetraenu není planární, ale zaujímá tvar vaničky, aby se tak vyhnula antiaromatickému stavu. Pokud však na cyklooktatetraen působíme draslíkem v suchém tetrahydrofuranu, dochází k jeho dvouelektronové redukci a vzniká planární dianiont. Pokuste se vysvětlit tuto relativně snadnou dvouelektronovou redukci a s tím spojenou změnu tvaru molekuly. 2 + 2 K TF 2 K 21
Úkol 7: Bromace naftalenu poskytuje 1-bromnaftalen a Br, reakce však nevyžaduje přítomnost Lewisovy kyseliny jako katalyzátoru. Reakce navíc neprobíhá klasickým mechanismem S E Ar, ale adičně- -eliminačním mechanismem. Produkt adice bromu lze dokonce z reakční směsi za snížené teploty izolovat. Br Br Br 2 adice eliminace + Br Br Pokuste se vysvětlit relativní snadnost adice Br 2 na jedno jádro naftalenu. Proč na rozdíl od benzenu probíhá adičně-eliminační reakce? Úkol 8: Pokuste se předpovědět hlavní produkt(y) mononitrace 1-naftolu. N 3 nitrace 22