1 2014 Rostlinné hormony brasinosteroidy a jejich úloha ve vývoji a růstu rostlin Hayat S, Ahmad A (2011) Brassinosteroids: a class of plant hormone. Springer, Berlin
2 Vývoj organismu regulují signály (faktory) Receptor R Vnitřní genetická info metabolismus hormony Vnější světlo teplota vlhkost plyny gravitace Signál Receptor Zesilovač Reakce (např. exprese genů)
3 Obecné schéma přenosu signálu Signál Receptor Zesilovač (secondary messenger) Vnější (světlo, teplota, gravitace, vlhkost) Vnitřní (hormony, metabolity, genetická informace) Intracelulární (pro lipofilní hormony => snadno difundující membránou) Membránové (povrchové) (pro hormony rozpustné ve vodě => neschopné procházet membránou) Cyklický AMP a GMP, diacylglycerol, inositol-trifosfát, Ca 2+ ionty Reakce Exprese genů, indukce aktivity kanálů a pump, atd.
4 Genetické studie - snaha definovat molekulární mechanizmy účinků steroidních hormonů Brasinosteroidy - Arabidopsis thaliana (26 tisíc genů) Detailní popis biosyntézy brasinosteroidů Znalost signálních drah Steroidy savci, hmyz - Drosophila melanogaster (12 tisíc genů) Detailní popis transkripce genů aktivované 20E hydroxyecdysone Znalost biosyntézy ecdysteroidu
5 Biosyntéza brasinosteroidů (BR) a homeostáza Rostliny 1 miliarda let Živočichové Hormony - polyhydroxylované steroidní molekuly BR a steroidy kontrolují: - regulaci genové exprese - buněčné dělení - expanzi buněk - diferenciaci buněk - PCD - homeostázu
6 1979 brasinolid (BL) koncový produkt biosyntetické dráhy - stimuluje prodlužování stonku - stimuluje prodlužování kořene (nízké koncentrace) - inhibuje prodlužování kořene (vysoké koncentrace) - stimuluje klíčení semen a růst listů HO Brasinolid OH OH Prodlužování 2. internodu stonku fazole HO H O O Brasinosteroidy a auxiny mají synergické účinky. Stimulace: - tvorby laterálních kořenů - prodlužování stonku - růstu pylové láčky - ohýbaní listů a epinastie - aktivity protonové pumpy - diferenciace xylému Ohýbání listů Auxin rychlý účinek Brasinolid pomalý účinek Update 2010 Kang B et al. (2010) Molecular Plant 3: 260-268 Interakce signálních drah auxinů a brassinosteroidů
7 Použití brasinosteroidů v zemědělství: - zvyšování výnosů - stimulace rezistence ke stresům Výskyt: - ve všech testovaných pletivech - nejvíce v apikálních částech stonků Brasinosteroidy nejsou pravděpodobně transportovány na dlouhé vzdálenosti Symons GM et al. (2008) J Exp Botany 59: 17-24 Review o transportu brassinosteroidů
8 Existence BR a biologická aktivita velké množství literatury Fungování a signální dráhy objeveny nedávno Genetický přístup fyziologická, biochemická a molekulární charakterizace mutantů Selekce mutantů s redukovanou biosyntézou BR (rajče, hrách, rýže, Arabidopsis) Výrazný fenotyp mutantů; Arabidopsis pleiotropický efekt mutací Tma: krátký vzrůst, tlustý hypokotyl, otevřené zvětšené dělohy, přítomnost primárních listových pupenů cpd WT Světlo: trpasličí vzrůst, tmavozelená barva, Redukovaná apikální dominance, pylová sterilita, narušené fotoperiodické reakce, zpožděná senescence chloroplastů a listů, redukované množství xylému, změny v reakci ke světlu. bri1 WT det2 det2 WT WT
9 Aplikace exogenních BR vede k normalizaci mutantních fenotypů CL - campesterol CT - cathasterone TE - teasterone DT - dehydroteasterone TY - typhasterol CS - castasterone BL - brassinolide
Výrazný fenotyp mutanta 10 Identifikace genů zapojených v syntéze BR Porozumění mechanizmu homeostáze Porozumění mechanizmu signalizace Signalizace Biosyntéza Mutanti v signálních drahách mají vyšší hladinu endogenních hormonů Homeostáza BR-mutanti Cytokinin-mutanti Auxin-mutanti
11 Kontrolní mechanizmy regulující hladinu BR: - regulace biosyntézy - inaktivace BR - zpětná vazba od signální dráhy Dvě biosyntetické dráhy BR ranná C-6 oxidace pozdní C-6 oxidace Rostliny Campesterol BR Živočichové Cholesterol Steroidy Klíčové kroky syntézy BR a steroidů jsou vysoce konzervované přítomnost 5 -reduktázy Hmyz přítomnost 5 -reduktázy nebyla zatím prokázána
12 Biosyntetické dráhy BR Taiz L, Zeiger E (2006) Plant Physiology, 4th. ed., str. 617-634
Přenos signálu brasinosteroidů 13 Fyziologické studie Identifikace BR jako růstových regulátorů Genetické studie Identifikace BR jako růstových hormonů Identifikace BR receptoru na plazmatické membráně + dalších elementů dráhy Update 2011-2012 Choudharz SP et al. (2012) TIPS 17: 594/605 Shan X et al. (2012) Current Opinion in Plant Biology 15: 84-91 Clouse SD (2011) Plant Cell 23: 1219-1230 Yang C-J et al. (2011) Mol Plant 4: 588-600 Ye H et al. (2011) J Integrative Plant Biol 53: 455-468 Nejnovější review o signálních drahách brasinosteroidů Obrovský nárůst znalostí mol. základů účinků BR Enormní nárůst publikací o BR
Identifikace BR-insensitivních mutantů 14 Mutovaná populace rostlin 0 BL Vysoká konc. BR BR-insensitivní mutanti Mutant bri1 (brassinosteroid-insensitive1) Wild type a brd2 mutant rýže BR-insensitivní mutanti jsou podobní mutantům s defektem v syntéze BR. Jejich fenotyp však nelze změnit exogenními BR.
15 Laboratoř J. Chory identifikace dalších trpasličích alel bri1 Plně funkční BRI1 je pozitivním regulátorem signálních drah BR Další geny této skupiny: BRL1, BRL2 a BRL3 BRL1 a BRL3 váží BR. Ektopická exprese těchto genů řízená promotorem BRI1 je schopna zrušit účinek mutace bri1. BRL1 a BRL3 se specificky exprimují ve vaskulárním systému => mutace brl1 a brl3 vedou k abnormálnímu poměru v diferenciaci floému a xylému. Trojitý mutant bri1brl1brl3 - zesílený trpasličí vzrůst a vaskulární fenotyp bri1 bri1brl1brl3 Vazebné studie: vysoká specificita vazby BL k BRI1 proteinu WT brl1 brl3 BRI1 je receptorem brasinosteroidů
N-terminal signal peptide Cysteine pair Struktura receptoru BRI1 Putative leucine zipper 16 70-amino acid island LRR22 Leucine-rich repeats (LRR) BL-binding site Transmembrane region PM BRI1 kóduje leucin-rich repeat (LRR) transmembránovou receptor-like kinázu (RLK) (LRR-RLK) (poziční klonování) Lokalizace: plazma membrána (exprese BRI1-GFP) Ser/Thr kinase domain (KD) C-terminal tail Juxtamembrane domain Cytoplazma
17 LRR-LRK největší skupina receptorů v Arabidopsis genomu: ~230 členů 70 amino+lrr obecný proteinový motiv, který se vyskytuje u rodiny proteinů zvaných LRR-R (LRR-Receptor-like) s velmi odlišnými funkcemi u všech druhů organizmů. BRI1 CLV1 Cf-9 Toll Unikátní znak BRI1: obsahuje 70 amino acid island a zároveň KD Jiné LRR-R neobsahují KD a přenáší signál prostřednictvím intracelulární protein-protein interakce (CLV1, Cf-9). Receptor Xa21 je zapojen v rezistenci k patogenům, má KD, ale neobsahuje 70 amino acid island. Toll receptor u Drosophily obsahuje intracelulární protein (interleucin doménu), který po aktivaci receptoru váže protein podobný KD.
18 Fosforylace receptoru BRI1 Analýza mutantů s defekty v BRI1 Identifikace domén nutných pro přenos signálu Update 2012 Oh M-H et al. (2012) Frontiers in Plant Science 3: 1-14 Oh M-H et al. (2012) PNAS 109: 327-332 BRI1 je nejen serine/threonine kináza, ale funguje i jako tyrosine kináza (obvyklé u živočichů) => BRI1 je duální specifická kináza. BL-binding site 70-amino acid island LRR22 Juxtamembrane domain P P Ser/Thr kinase domain (KD) P P C-terminal tail P P Hothorn M et al. (2011) Nature 474: 467-471
19 Buněčná stěna Přítomnost BL = vazba BL k receptoru Cytozol Plazm. membrána Aktivovaný BRI1/BAK1 heterodimer inhibuje aktivitu BIN2 kinázy prostřednictvím BSK (Brassinosteroid-Signaling Kinases) a BSU1 (bri1 SUpressor 1) + Přímá aktivita BSU1 Akumulace defosforylované formy BES1 a BZR1 v jádře BES1 (bri1-ems-suppressor 1) BZR1 (brassinazole-resistant 1) BES1 a BZR1 transkripční faktory BR-indukovaných genů; krátká životnost; degradace 26S proteasome Jádro Represe nebo aktivace BR-responzivních genů Represe nebo aktivace BR biosyntetických genů Aktivace či potlačení genové exprese
Buněčná stěna 20 Plazm. membrána Absence BR: Fosforylace proteinů BES1 a BZR1 konstitutivně lokalizovaných v jádře. Cytozol Fosforylované BES1 a BZR1 se nemohou vázat k DNA a jsou degradovány BR-indukované geny nejsou exprimovány Jádro Represe nebo aktivace BR-responzivních genů Represe nebo aktivace BR biosyntetických genů
21 Regulace genové exprese transkripčními faktory BES1 a BZR1 Sekvenování Arabidopsis genomu Nové metody exprese genů - mikroaray Identifikace stovek BR-indukovaných genů Up-regulované a down-regulované geny zapojené pravděpodobně v: - syntéze a modifikaci buněčné stěny - formaci cytoskeletu - biosyntéze BR - signálních dráhách - transportu BR BES1 a BZR1 jsou z 90% identické, ale regulují odlišné skupiny genů.
Identifikace nových transkripčních faktorů interagujících s BES1 22 Cytozol BES1 + BIM1 (BES1-interacting Myclike 1) BES1/BIM1 heterodimer Aktivace genové exprese vazbou k E-boxu Jádro Represe nebo aktivace BR-responzivních genů Represe nebo aktivace BR biosyntetických genů Update 2011 Yu X et al. (2011) Plant Journal 65: 634-646 Identifikace 1609 genů, které jsou regulovány transkripčním faktorem BES1
23 Update 2009 Yu et al. (2008) PNAS 105: 7618-7623 BES1 reguluje transkripční faktory ELF6 a REF6, které regulují expresi terčových genů a koordinují BR reakce s dalšími vývojovými procesy. Li et al. (2009) Plant J 58: 275-286 Identifikace TF AtMYB30. Pomáhá zesilovat expresi BR-indukovaných genů. BES1 jednak přímo ovlivňuje AtMYB30, jednak se AtMYB30 přímo váže na E-box promotoru regulovaných genů. Update 2010 Li et al. (2010) PNAS 107: 3918-3923 Identifikace proteinu ISW1 (Interact With Spt6), který je zapojen v procesech aktivace RNA polymerázy II. Spt6 transkripční elongační faktor Model fungování AtISW1 v regulaci genové exprese zprostředkované BES1 Za přítomnosti BR se BES1 váže k ISW1, kterého směřuje k promotoru BR-responsivního genu. Zde se ISW1 váže k elongačnímu faktoru Spt6. Spt6 interaguje přímo s RNA polymerázou II.
Buněčná stěna 24 Plazm. membrána BZR1 vazba k BRRE (BRresponsive element) Cytozol Inhibice exprese BR-biosyntetických genů Zpětnovazebná regulace biosyntetické dráhy BR Jádro Represe nebo aktivace BR-responzivních genů Represe nebo aktivace BR biosyntetických genů
25 Update 2007 Geldner et al. (2007) Genes and Development 21: 1598-1602 Gendron and Wang (2007) Current Opinion in Plant Biology 10: 436-441 Endozomální lokalizace BRI1 Endocytóza běžná u živočichů a kvasinek Plazma membrána Endozom - inaktivace receptoru (např. BOR1) - aktivace signálu BRI1 BRI1 Transport k cíli nebo transport do lysozomu a degradace - distribuce BRI1 v PM či endozomech není změněna v BR-deficientních mutantech či po ovlivnění BR => endocytóza není závislá na aktivačním stavu BRI1 - endozomální BRI1 je konstitutivně aktivní Důvody existence signální dráhy BRI1 prostřednictvím endozomů: - doplňkový k PM BRI1 (nedostatek místa na PM) - degradace BRI1 utlumení signální dráhy
Brasinosteroidy kontrolují vlastní signalizaci. Update 2011 Wu G et al. (2011) ScienceSignaling 4: ra29 Di Rubbo S et al. (2011) ScienceSignaling 4: pe25 26 PP2A Receptor BRI1 cykluje mezi membránou a endozomem. Když je BRI1 aktivován = fosforylován, tak v endozomální formě stimuluje expresi SBI1 (Suppressor of bri1). SBI1 kóduje leucine carboxylmethyltransferázu (LCMT), a proto metyluje protein fosfatázu PP2A. Tím se usnadňuje asociace PP2A s aktivím BRI1. To vede k defosforylaci a degradaci receptoru BRI1. Tím dochází k inhibici signálu. Brasinosteroidy tak kontrolují vlastní signalizaci.
Pěkné Vánoce